WO2003066893A1 - Verfahren zum spezifischen schnellnachweis pathogener lebensmittelrelevanter bakterien - Google Patents

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WO2003066893A1
WO2003066893A1 PCT/EP2003/001092 EP0301092W WO03066893A1 WO 2003066893 A1 WO2003066893 A1 WO 2003066893A1 EP 0301092 W EP0301092 W EP 0301092W WO 03066893 A1 WO03066893 A1 WO 03066893A1
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bacteria
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Jiri Snaidr
Claudia Beimfohr
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Vermicon Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of pathogenic food-relevant bacteria, in particular a method for the simultaneous specific detection of bacteria of the genus Listeria and the species Listeria monocytogenes by in situ hybridization and a method for the specific detection of bacteria of the species Staphylococcus aureus by in situ hybridization and a method for the specific detection of bacteria of the genus Campylobacter and the species C. coli and C. jejuni by in situ hybridization, as well as corresponding oligonucleotide probes and kits with which the methods according to the invention can be carried out.
  • Listeria are gram-positive, short, movable sticks.
  • the genus Listeria (L.) includes six species: L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. monocytogenes, L. seeligeri and L. welshimeri.
  • L. grayi L. grayi
  • L. innocua L. innocua
  • L. ivanovii L. monocytogenes
  • L. seeligeri L. welshimeri.
  • the worldwide distribution of these ubiquitous bacteria extends to aquatic areas as well as to the soil and vegetation.
  • listeriosis which has a very variable incubation period of a few days to two months, is caused by the species L. monocytogenes, although L. ivanovii, L. seeligeri and L. welshimeri have also been detected in some diseases.
  • Listeria infection can manifest itself in serious clinical pictures such as sepsis, meningitis or encephalitis. Especially in newborns who can be infected via the placenta or during birth, and in the elderly, there is a high health risk in the case of listeriosis. The mortality rate in the case of newborn listeriosis is up to 50%.
  • the fetus may also abort.
  • the occurrence of listeriosis in elderly or otherwise defenseless people can be fatal in up to 30% of those affected.
  • the transmission usually takes place through the consumption of contaminated food.
  • Dairy products in particular are a common source of infection. But almost all other foods are potential sources of Listeria infections. So in the past, in addition to milk and various
  • Dairy products such as cheese, butter or ice cream also identify other foods as the source of listeriosis. These include various products such as coleslaw, mussels, pork, chicken, fish, corn flour or rice salad. In many cases, outbreaks of listeriosis caused by consumption of the foods mentioned have been accompanied by deaths.
  • Listeria are still capable of reproduction at 4 ° C (in milk even at -0.3 ° C). This means that despite refrigerated storage of food, listeria can multiply and accumulate in it. Even after cooking, roasting or smoking, listeria can accumulate in the food in question as a result of inadequate treatment or secondary contamination.
  • Staphylococcal intoxications are among the most common bacterial and foodborne diseases worldwide. These are triggered in particular by strains of Staphylococcus (S.) aureus.
  • S. aureus is a gram-positive, immobile coagulase-positive bacterium and occurs on the skin, the mucous membrane of the nasopharynx, in stool, feces, abscesses and pustules.
  • S. aureus is also widespread in the healthy population: Half of all healthy people have S. aureus in the nasopharynx.
  • S. aureus is usually also transmitted through the consumption of contaminated food, although the spectrum of possible sources of infection is quite broad.
  • the following foods were involved in diseases: ready-made meat dishes, pies, cooked ham, raw ham, milk and milk products, egg-containing preparations, salads, creams, cake fillings, ice cream, pasta. Routine detection nowadays mostly takes place via the culture and confirmation tests of suspect colonies, since the detection of enterotoxins is quite difficult to carry out. If culture is detected, the sample to be examined is first incubated for 48 h on a suitable selective medium (eg Baird) at 37 ° C. If this first cultivation step was carried out in liquid medium, a second one closes
  • a suitable selective medium eg Baird
  • Campylobacter Only for over 20 years has a previously underestimated germ played a greater role than food poisoner: Campylobacter. Unlike salmonella, for example, it rarely reproduces in food, but a few hundred bacterial cells are sufficient for infection with this pathogen.
  • Campylobacter (C.) genus comprises 20 species and subspecies. These bacteria, which have so far been difficult to cultivate, are gram-negative, slim, curved to spirally wound rods that require microaerophilic conditions for their growth.
  • the species C. jejuni, C. coli and C. laris are medically relevant. They colonize the small and large intestines and cause acute gastroenteritis accompanied by the following symptoms: diarrhea, abdominal pain, fever, nausea, vomiting. These symptoms are difficult to distinguish from those of a stomach ulcer. A careful differential diagnosis is therefore essential. Routine detection is currently carried out via multi-stage cultivation, starting with an 18-hour enrichment in selective liquid medium (Campylobacter-selective medium according to Preston), followed by twice 48 h on two different fixed media (Karmali agar followed by Columbia blood agar). These five-day cultivations are followed by biochemical or serological identification.
  • nucleic acid-based detection methods are therefore available.
  • PCR the polymerase chain reaction
  • a characteristic piece of the respective bacterial genome is amplified with specific primers. If the primer finds its destination, a piece of the genetic material multiplies millions of times.
  • a qualitative assessment can take place. In the simplest case, this leads to the statement that the target sites for the primers used were present in the examined sample. No further statements are possible; these target sites can originate from a living bacterium as well as from a dead bacterium or from naked DNA. A differentiation is not possible here. Since the PCR reaction is positive even in the presence of a dead bacterium or naked DNA, false positive results often occur.
  • a further development of this technique is quantitative PCR, in which an attempt is made to establish a correlation between the amount of bacteria present and the amount of amplified DNA.
  • the advantages of PCR lie in its high specificity, ease of use and in a short amount of time.
  • Significant disadvantages are their high susceptibility to contamination and thus false positive results as well as the already mentioned lack Possibility to differentiate between living and dead cells or naked DNA.
  • FISH fluorescence in situ hybridization method
  • the FISH technique is based on the fact that there are certain molecules in bacterial cells that, due to their vital function, have undergone only little mutation in the course of evolution: the 16S and the 23S ribosomal ribonucleic acid (rRNA). Both are components of the ribosomes, the sites of protein biosynthesis, and due to their ubiquitous distribution, their size, and their structural and functional constancy, they can serve as specific markers (Woese, CR, 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, p. 221 -271). Based on a comparative sequence analysis, phylogenetic relationships can be established based solely on this data. To do this, this sequence data must be aligned. In the alignment, which is based on knowledge of the secondary structure and tertiary structure of these macromolecules, the homologous positions of the ribosomal nucleic acids are reconciled.
  • rRNA ribosomal ribonucleic acid
  • phylogenetic calculations can be carried out.
  • the use of the latest computer technology makes it possible to carry out large-scale calculations quickly and effectively, and to create large databases that contain the alignment sequences of the 16S rRNA and 23S rRNA. Thanks to the quick access to this data material newly obtained sequences can be analyzed phylogenetically in a short time.
  • These rRNA databases can be used to construct species- and genus-specific gene probes. Here, all available rRNA sequences are compared with each other and probes designed for specific sequence sites that specifically detect a bacterial species, genus or group.
  • these gene probes which are complementary to a specific region on the ribosomal target sequence, are introduced into the cell.
  • the gene probes are usually small, 16-20 base long, single-stranded deoxyribonucleic acid pieces and are directed against a target region, which is typical for a type or group of bacteria. If the fluorescence-labeled gene probe finds its target sequence in a bacterial cell, it binds to it and the cells can be detected in the fluorescence microscope due to their fluorescence.
  • the FISH analysis is fundamentally carried out on a slide, and the evaluation visualizes the bacteria by irradiating them with high-energy light, that is, makes them visible.
  • This is one of the disadvantages of the classic FISH analysis: since only relatively small volumes can naturally be analyzed on a slide, the sensitivity of the method can be unsatisfactory and not sufficient for a reliable analysis.
  • the present invention therefore combines the advantages of classic FISH analysis with those of cultivation.
  • a comparatively short cultivation step ensures that the bacteria to be detected are present in sufficient numbers before the bacteria are detected using specific FISH.
  • cultivation is understood to mean the multiplication of the bacteria contained in the sample in a suitable cultivation medium.
  • the cultivation can be carried out, for example, in V_ Fraser broth for 24 h at 30 ° C.
  • S Aureus can be cultivated, for example, as a blood culture (for example BACTEC 9240, Becton Dickinson Instruments) for 8 h to 48 h at 35 ° C.
  • cultivation can be carried out, for example, in Preston selective medium for 24 h at 42 ° C.
  • the person skilled in the art can in any case find the suitable cultivation methods from the prior art.
  • fixing the bacteria is understood to mean a treatment with which the bacterial envelope is made permeable to nucleic acid probes. Ethanol is usually used for fixing. If the cell wall cannot be penetrated by the nucleic acid probes with these measures, the person skilled in the art will know Sufficient other measures are known which lead to the same result, for example methanol, mixtures of alcohols, a low-percentage paraformaldehyde solution or a dilute formaldehyde solution, enzymatic treatments or the like.
  • the fixed bacteria are incubated for the “hybridization” with fluorescence-labeled nucleic acid probes.
  • nucleic acid probes which consist of an oligonucleotide and a marker attached to it, can then penetrate the cell envelope and adhere to the target sequence corresponding to the nucleic acid probe inside the cell
  • the binding is to be understood as the formation of hydrogen bonds between complementary pieces of nucleic acid.
  • the nucleic acid probe can be complementary to a chromosomal or episomal DNA, but also to an mRNA or rRNA of the microorganism to be detected. It is advantageous to choose a nucleic acid probe that is complementary to an area that is present in the number of copies of more than 1 in the microorganism to be detected.
  • the sequence to be detected is preferably 500-100,000 times per cell, particularly preferably 1,000-50,000 times.
  • the rRNA is preferably used as the target site, since the ribosomes in the cell as sites of protein biosynthesis are present thousands of times in each active cell.
  • the nucleic acid probe in the sense of the invention is a DNA or RNA probe, which will generally comprise between 12 and 1000 nucleotides, preferably between 12 and 500, more preferably between 12 and 200, particularly preferably between 12 and 50 and between 15 and 40, and most preferably between 17 and 25 nucleotides.
  • the nucleic acid probes are selected on the basis of whether a complementary sequence is present in the microorganism to be detected. By selecting a defined sequence, a bacterial species, a bacterial genus or an entire bacterial group can be recorded. Complementarity should exist for a probe of 15 nucleotides over 100% of the sequence. With oligonucleotides with more than 15 nucleotides, one or more mismatching sites are allowed.
  • the nucleic acid probe molecules according to the invention have the following lengths and sequences:
  • the detection method for Listeria and L. monocytogenes is carried out, for example, as follows:
  • the oligonucleotide SEQ ID No. 1 is specifically labeled, for example with a green fluorescent dye, and is used for the specific detection of all bacteria of the genus Listeria.
  • the oligonucleotide SEQ ID No. 2 remains unlabeled and, as a competitor, prevents the labeled oligonucleotide SEQ ID No. 1 from binding to bacteria that do not belong to the Listeria genus.
  • the oligonucleotide of SEQ ID No. 3 is also specific, but unlike the oligonucleotide SEQ ID No.
  • the ohgonucleotides SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6 again remain unlabeled and, as competitors, prevent the labeled oligonucleotide SEQ ID No. 3 from binding to bacteria that do not belong to the species L. monocytogenes. In this way, the simultaneous and highly specific detection of bacteria possible belonging to the genus Listeria or to the species L. monocytogenes.
  • the different markers for example a green fluorescent dye on the one hand and a red fluorescent dye on the other hand, are easily distinguishable from one another, for example by using different filters in fluorescence microscopy.
  • nucleic acid probe molecules according to the invention have the following lengths and sequences:
  • the detection method for S. aureus is carried out as follows, for example:
  • the ohgonucleotides SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 10 are specifically labeled, for example with a red fluorescent dye, and are used for the specific detection of all bacteria of the species Staphylococcus aureus.
  • the ohgonucleotides SEQ ID No. 8 and 9 and SEQ ID No. 11, 12 and 13, on the other hand, remain unmarked and prevent competitors from binding the labeled ohgonucleotides to bacteria that do not belong to the species S. aureus. In this way, highly specific detection of bacteria belonging to the species S. aureus is possible.
  • the intensity of the signals obtained can be increased by using so-called "helper probes".
  • helper probes are unlabeled ohgonucleotides that have the following sequence:
  • helper probes are not mandatory, but optional.
  • the helper probes facilitate the binding of the marked probes to their target sites and thus improve the signal intensity. The detection method works very well even without these helper probes.
  • nucleic acid probe molecules according to the invention have the following lengths and sequences:
  • the detection method for the genus Campylobacter or the species C. coli and C. jejuni is carried out as follows:
  • the ohgonucleotides SEQ ID No. 16 to SEQ ID No. 19 and the ohgonucleotides SEQ ID No. 24 to SEQ ID No. 28 and the oligonucleotide SEQ ID No. 30 and the ohgonucleotides SEQ ID No. 32 to 34 are specifically labeled, for example with a green fluorescent dye, and are used for the specific detection of all bacteria of the genus Campylobacter.
  • the ohgonucleotides SEQ ID No. 20 to 23 and the oligonucleotide SEQ ID No. 29 and the oligonucleotide SEQ ID No. 31 remain unlabeled and prevent as
  • Competitors bind the abovementioned labeled ohgonucleotides specific for the genus Campylobacter to bacteria which do not belong to the genus Campylobacter.
  • the ohgonucleotides SEQ ID Nos. 35 and 36 and the oligonucleotide SEQ ID No. 39 are also specific, but different from the ohgonucleotides SEQ ID Nos. 16 to 19, 24 to 28, 30 and 32 to 34, i.e. distinguishable from them, e.g. marked with a blue fluorescent dye and are used for the specific detection of all bacteria of the species Campylobacter coli.
  • the ohgonucleotides SEQ ID No. 37, 38 and 40 to 42 again remain unlabeled and, as competitors, prevent the labeled, for C. coli specific, ohgonucleotides from binding to bacteria which do not belong to the C. coli species.
  • the ohgonucleotides SEQ ID Nos. 43 and 48 are also specific, but again different from the aforementioned ohgonucleotides, that is to say distinguishable from them again, for example with a red fluorescent dye, and are used for the specific detection of all bacteria of the species Campylobacter jejuni.
  • the ohgonucleotides SEQ ID Nos. 44 to 47 and 49 in turn remain unlabeled and, as competitors, prevent the labeled ohgonucleotides specific for C. jejuni from binding to bacteria which do not belong to the C. jejuni species. In this way, the simultaneous and highly specific detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter or to the species C. coli or C. jejuni is possible.
  • the intensity of the signals received can optionally be increased by using so-called helper probes.
  • the helper probes are also unlabeled, but make it easier to bind the labeled probes to their target locations and thus improve the signal intensity. This is only an amplification of the signal intensity, the detection procedure naturally also works without these helper probes.
  • the intensity of the signals obtained with the oligonucleotide SEQ ID No. 24 can be increased by using the following unlabelled ohgonucleotides as helper probes:
  • Competitors in the context of the present invention are understood to mean, in particular, ohgonucleotides which have a higher specificity for genus or species not to be detected than the marked ohgonucleotides which are specific for the genus or species to be detected.
  • the invention also relates to modifications of the above oligonucleotide sequences which, despite the deviations in the sequence and / or length, result in a specific hybridization with target nucleic acid sequences of the particular Show bacterium and are therefore suitable for use in a method according to the invention.
  • sequence region of the nucleic acid molecule in at least 60%, 65%, preferably in at least 70%, 75%, more preferably in at least 80 %, 84%, 87% and particularly preferably in at least 90%, 94%, 96%, of the bases agree (whereby the sequence region of the nucleic acid molecule is to be considered which corresponds to the sequence region of one of the above-mentioned ohgonucleotides (SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 51) corresponds to, and not approximately the entire sequence of a nucleic acid molecule which may be in the
  • Hybridization techniques known hybridization conditions bind only the ribosomal RNA of the target organisms, but not the rRNA of non-target organisms to the oligonucleotide.
  • SEQ ID NO. 51 is complementary, hybridize under stringent conditions.
  • Nuclemic acid molecules that have an ohgonucleotide sequence of SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 51 or the sequence of a nucleic acid molecule according to a) or b) and in addition to the sequences mentioned or their Modifications according to a) or b) have at least one further nucleotide and enable specific hybridization with nucleic acid sequences of target organisms.
  • the degree of sequence identity of a nucleic acid molecule with the probes SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 51 can be determined using conventional algorithms.
  • the program for determining the sequence identity is suitable here, which is available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (on this page e.g. the link "Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]").
  • the specific oligonucleotide probes preferably correspond to the oligonucleotides SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 3.
  • modifications are also possible, as long as a specific hybridization between the probes is nevertheless possible and target sequence takes place. It may be sufficient that the oligonucleotide probe used in 15, preferably 16 and 17 and particularly preferably 18 and 19 successive nucleotides matches SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 3. The same applies to the ogonucleotides serving as competitors with regard to the sequences SEQ ID No. 2, 4, 5 and 6.
  • the specific oligonucleotide probes preferably have a sequence which in 13 and 14 and preferably 15, 16 or 17 consecutive nucleotides corresponds to those of SEQ ID No. 7 or 10.
  • the specific oligonucleotide probes preferably have a sequence which is in 13 or 14, preferably 15 or 16 and particularly preferably 17 or 18 consecutive Nucleotides with SEQ ID Nos. 16-19, 24-28, 30, 32-36, 39, 43 and 48.
  • the nucleic acid probe molecules according to the invention can be used with various hybridization solutions as part of the detection method.
  • Various organic solvents can be used in concentrations of 0 - 80%.
  • Compliance with stringent hybridization conditions ensures that the nucleic acid probe molecule actually hybridizes with the target sequence.
  • Moderate conditions in the sense of the invention are e.g. 0% formamide in a hybridization buffer as described below.
  • Stringent conditions in the sense of the invention are, for example, 20-80% formamide in the hybridization buffer.
  • a typical hybridization solution contains 0% - 80% formamide, preferably 20% - 60% formamide, particularly preferably 40% formamide. It also has a salt concentration of 0.1 mol / 1 - 1.5 mol / 1, preferably 0.5 mol / 1 - 1.0 mol / 1, more preferably 0.7 mol / 1 - 0.9 mol / 1 , particularly preferably of 0.9 mol / 1, the salt preferably being sodium chloride.
  • the hybridization solution usually comprises a detergent, such as sodium dodecyl sulfate (SDS), in a concentration of 0.001% - 0.2%, preferably in a concentration of 0.005 - 0.05%, more preferably 0.01 - 0.03%, particularly preferably in a concentration of 0.01%.
  • a detergent such as sodium dodecyl sulfate (SDS)
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Various compounds such as Tris-HCl, sodium citrate, PIPES or HEPES can be used to buffer the hybridization solution, which are usually used in concentrations of 0.01-0.1 mol / 1, preferably from 0.01 to 0.05 mol / 1, in a pH range of 6.0-9.0, preferably 7.0 to 8.0.
  • the particularly preferred invention the execution of the hybridization solution contains 0.02 mol / 1 Tris-HCl, pH 8.0.
  • a typical hybridization solution contains 0% -80% formamide, preferably 20% -60% formamide, particularly preferably 20% formamide. It also has a salt concentration of 0.1 mol / 1 - 1.5 mol / 1, preferably 0.7 mol / 1 - 0.9 mol / 1, particularly preferably 0.9 mol / 1, where it is the salt is preferably sodium chloride. Furthermore, the hybridization solution usually comprises a detergent, such as e.g.
  • Various compounds such as Tris-HCl, sodium citrate, PIPES or HEPES can be used to buffer the hybridization solution, which are usually used in concentrations of 0.01-0.1 mol / 1, preferably from 0.01 to 0.05 mol / 1, in a pH range of 6.0-9.0, preferably 7.0 to 8.0.
  • the particularly preferred embodiment of the hybridization solution according to the invention contains 0.02 mol / 1 Tris-HCl, pH 8.0.
  • a typical hybridization solution contains 0% -80% formamide, preferably 20% -60% formamide, particularly preferably 20% formamide. It also has a salt concentration of 0.1 mol / 1 - 1.5 mol / 1, preferably 0.7 mol / 1 - 0.9 mol / 1, particularly preferably 0.9 mol / 1, where it is the salt preferably around
  • the hybridization solution usually comprises a detergent, such as sodium dodecyl sulfate (SDS), in a concentration of 0.001% - 0.2%, preferably in a concentration of 0.005-0.05%, more preferably 0.01-0.03%, particularly preferably in a concentration of 0.01%.
  • a detergent such as sodium dodecyl sulfate (SDS)
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Various compounds such as tris HC1, sodium citrate, PIPES or HEPES are used, which are usually used in concentrations of 0.01-0.1 mol / 1, preferably from 0.01 to 0.05, in a pH range of 6, 0 - 9.0, preferably 7.0 to 8.0.
  • the particularly preferred embodiment of the hybridization solution according to the invention contains 0.02 mol / 1 Tris-HCl, pH 8.0.
  • the person skilled in the art can select the stated concentrations of the constituents of the hybridization buffer in such a way that the desired stringency of the hybridization reaction is achieved.
  • Particularly preferred embodiments reflect stringent to particularly stringent hybridization conditions. Using these stringent conditions, the person skilled in the art can determine whether a specific nucleic acid molecule enables specific detection of nucleic acid sequences of target organisms and thus was used reliably in the context of the invention. The person skilled in the art is able, by changing the parameters of the hybridization buffer, to increase or decrease the stringency if necessary or depending on the probe or target organism.
  • the concentration of the nucleic acid probe in the hybridization buffer depends on the type of its labeling and the number of target structures. In order to enable rapid and efficient hybridization, the number of nucleic acid probe molecules should exceed the number of target structures by several orders of magnitude. However, with fluorescence in situ hybridization (FISH) care must be taken to ensure that an excessively large amount of fluorescence-labeled nucleic acid probe molecules leads to increased background fluorescence.
  • the concentration of the nucleic acid probe molecules should therefore be in a range between 0.5-500 ng / ⁇ l, preferably between 1.0-100 ng / ⁇ l and particularly preferably between 1.0-50 ng / ⁇ l.
  • the preferred concentration in the context of the method according to the invention is 1-10 ng of each nucleic acid probe molecule used per ⁇ l of hybridization solution.
  • the volume of the hybridization solution used should be between 8 ⁇ l and 100 ml, in a particularly preferred embodiment of the method according to the invention it is 30 ⁇ l.
  • the duration of the hybridization is usually between 10 minutes and 12 hours; hybridization is preferably carried out for about 1.5 hours.
  • the hybridization temperature is preferably between 44 ° C. and 48 ° C., particularly preferably 46 ° C., the parameter of the hybridization temperature, as well as the concentration of salts and detergents in the hybridization solution, depending on the nucleic acid probes, in particular their lengths and the degree of complementarity can be optimized for the target sequence in the cell to be detected.
  • the person skilled in the art is familiar with the relevant calculations here.
  • this washing solution can contain 0.001-0.1% of a detergent such as SDS, preferably 0.005-0.05%, particularly preferably 0.01%, as well as Tris-HCl in a concentration of 0.001-0.1 mol / 1. preferably 0.01 - 0.05 mol / 1, particularly preferably 0.02 mol / 1, the pH of Tris-HCl in the range from 6.0 to 9.0, preferably at 7.0 - 8, 0, particularly preferably 8.0.
  • a detergent may be included, but is not essential.
  • the washing solution usually also contains NaCl, the concentration depending on the stringency required being from 0.003 mol / 1 to 0.9 mol / 1, preferably from 0.01 mol / 1 to 0.9 mol / 1.
  • a NaCl concentration of 0.07 mol / l (method for the simultaneous specific detection of bacteria of the genus Listeria and the species L. monocytogenes) or 0.215 mol / 1 (method for the specific detection of bacteria of the species S) is particularly preferred. aureus) or from 0.215 mol / 1 (process for simultaneous specific Detection of bacteria of the genus Campylobacter and the species C. coli and C. jejuni).
  • the washing solution can contain EDTA, the concentration preferably being 0.005 mol / 1.
  • the washing solution can also contain preservatives known to the person skilled in the art in suitable amounts.
  • buffer solutions are used in the washing step, which in principle may look very similar to hybridization buffers (buffered sodium chloride solution), except that the washing step is usually carried out in a buffer with a lower salt concentration or at a higher temperature.
  • hybridization buffers buffered sodium chloride solution
  • Td dissociation temperature in ° C
  • the "washing off" of the unbound nuclear acid probe molecules usually takes place at a temperature in the range from 44 ° C. to 52 ° C., preferably from 44 ° C to 50 ° C and particularly preferably at 46 ° C for a period of 10 to 40 minutes, preferably for 15 minutes.
  • the nucleic acid molecules according to the invention are used in the so-called Fast FISH method for the specific detection of the specified target organisms.
  • the Fast FISH method is known to the person skilled in the art and e.g. described in patent applications DE 199 36 875 and WO 99/18234. Reference is hereby expressly made to these documents with regard to their disclosure in order to carry out the detection methods described there.
  • the specifically hybridized nucleic acid probe molecules can then be detected in the respective cells.
  • the prerequisite for this is that the nucleic acid probe molecule is detectable, e.g. in that the nucleic acid probe molecule is linked to a marker by covalent binding.
  • detectable markers e.g. fluorescent groups such as CY2 (available from Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3 (also available from Amersham Life Sciences), CY5 (also available from Amersham Life Sciences), FITC (Molecular Probes Inc., Eugene, USA), FLUOS (available from Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), TRITC (available from
  • nucleic acid probe molecules so that at their 5 'or 3' end there is another nucleic acid suitable for hybridization. sequence is present.
  • This nucleic acid sequence in turn comprises approximately 15 to 1,000, preferably 15-50 nucleotides.
  • This second nucleic acid region can in turn be recognized by a nucleic acid probe molecule which can be detected by one of the means mentioned above.
  • Another possibility is to couple the detectable nucleic acid probe molecules with a hapten, which can then be brought into contact with an antibody that recognizes the hapten.
  • Digoxigenin can be cited as an example of such a hapten. The skilled worker is also well known about the examples given.
  • the final evaluation is possible depending on the type of marking of the probe used with a light microscope, epifluorescence microscope, chemiluminometer, fluorometer etc.
  • Another advantage is the simultaneous detection of bacteria of the genus Listeria and the species L. monocytogenes. So far, only bacteria of the species L. monocytogenes have been detected with more or less reliability. However, epidemiological studies have shown that in addition to L. monocytogenes, other species of the genus Listeria also can trigger dangerous listeriosis. The sole evidence of
  • Another advantage is the ability to distinguish between bacteria of the genus Listeria and those of the species L. monocytogenes. This is easily and reliably possible through the use of different labels for the respective genus or species-specific nucleic acid probe molecules.
  • the nucleic acid probe molecules used can be used to specifically detect and visualize all species of the genus Listeria, but also highly specifically only the species L. monocytogenes.
  • the species S. aureus is just as reliable and all species of the genus Campylobacter, but also highly specifically only the species C. coli and C. jejuni are detected.
  • Another advantage is the ability to differentiate between bacteria of the genus Campylobacter and those of the species C. coli or C. jejuni. This is due to the use of different markings for the respective genus or. Species-specific nucleic acid probe molecules easily and reliably possible.
  • Another advantage of the method according to the invention is that it is easy to handle.
  • the method can be used to easily test large quantities of samples for the presence of the bacteria mentioned.
  • the methods according to the invention can be used in a variety of ways.
  • food samples e.g. poultry, fresh meat, milk, cheese, vegetables, fruits, fish, etc.
  • environmental samples can also be examined for the presence of the bacteria to be detected. These samples can e.g. taken from the ground or also be parts of plants.
  • the method according to the invention can also be used for the investigation of wastewater samples or silage samples.
  • the method according to the invention can also be used to examine medical samples, e.g. of stool samples, blood cultures, sputum, tissue samples (including sections), wound material, urine, samples from the respiratory tract, implants and catheter surfaces are used.
  • medical samples e.g. of stool samples, blood cultures, sputum, tissue samples (including sections), wound material, urine, samples from the respiratory tract, implants and catheter surfaces are used.
  • the food samples are taken from milk or milk products (yoghurt, cheese, curd cheese, butter, buttermilk), drinking water, beverages (lemonades, beer, juices), baked goods or meat products.
  • Another area of application for the method according to the invention is the examination of pharmaceutical and cosmetic products, e.g. Ointments, creams, tinctures, juices, solutions, drops etc.
  • pharmaceutical and cosmetic products e.g. Ointments, creams, tinctures, juices, solutions, drops etc.
  • kits for carrying out the corresponding methods are also made available.
  • the hybridization arrangement contained in these kits is described, for example, in German patent application 100 61 655.0. On the disclosure in this document regarding the in situ hybridization arrangement is hereby expressly incorporated by reference.
  • kits comprise, as the most important constituent, the respective hybridization solution with the nucleic acid probe molecules (VIT solution) which are described above for the microorganisms to be detected.
  • VIT solution the nucleic acid probe molecules
  • the corresponding hybridization buffer (Solution C) and a concentrate of the corresponding washing solution (Solution D) are also included.
  • Fixation solutions (Solution A (50% ethanol) and Solution B are also included
  • a sample is appropriately cultured for 20-44 hours.
  • cultivation can be carried out, for example, in V_ Fraser broth for 24 h at 30 ° C.
  • S. aureus the cultivation can be carried out, for example, as a blood culture (for example BACTEC 9240, Becton Dickinson Instruments) for 8 h to 48 h at 35 ° C respectively.
  • cultivation can be carried out, for example, in Preston selective medium for 24 h at 42 ° C.
  • a suitable aliquot of the fixed cells (preferably 40 ⁇ l) is applied to a slide and dried (46 ° C., 30 min or until completely dry).
  • the cells can also be applied to other carrier materials (e.g. a microtite latte or a filter).
  • the dried cells are then completely dehydrated by adding the fixing solution again (Solution B, preferably 40 ⁇ l).
  • the slide is dried again (room temperature, 3 min or until completely dry).
  • the hybridization solution (VIT solution) with the nucleic acid probe molecules described above for the microorganisms to be detected is then applied to the fixed, dehydrated cells.
  • the preferred volume is 40 ul.
  • the slide is then incubated in a chamber moistened with hybridization buffer (Solution C, corresponds to the hybridization solution without probe molecules), preferably the VIT reactor (46 ° C., 90 min).
  • the slide is then removed from the chamber, the chamber is filled with washing solution (Solution D, 1:10 diluted in distilled water) and the slide is incubated in it (46 ° C, 15 min).
  • the chamber is then filled with distilled water, the slide is briefly immersed and then air-dried in the lateral position (46 ° C, 30 min or until completely dry).
  • the slide is then embedded in a suitable medium (finisher).

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis pathogener lebensmittelrelevanter Bakterien, insbesondere ein Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria und der Spezies Listeria monocytogenes durch in situ-Hybridisierung sowie ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies Staphylococcus aureus durch in situ-Hybridisierung sowie ein Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Campylobacter und der Spezies C. coli und/oder C. jejuni durch in situ-Hybridisierung sowie entsprechende Oligonukleotidsonden und Kits, mit denen die erfindungsgemässen Verfahren durchgeführt werden können.

Description

Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis pathogener lebensmittelrelevanter
Bakterien
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis pathogener lebensmittelrelevanter Bakterien, insbesondere ein Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria und der Spezies Listeria monocytogenes durch in situ-Hybridisierung sowie ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies Staphylococcus aureus durch in situ- Hybridisierung sowie ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Campylobacter und der Spezies C. coli und C. jejuni durch in situ- Hybridisierung sowie entsprechende Oligonukleotidsonden und Kits, mit denen die erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden können.
Listerien sind grampositive kurze bewegliche Stäbchen. Zur Gattung Listeria (L.) gehören sechs Arten: L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. monocytogenes, L. seeligeri und L. welshimeri. Die weltweite Verbreitung dieser ubiquitären Bakterien erstreckt sich sowohl auf aquatische Bereiche als auch auf den Boden und die Vegetation.
Besondere medizinische Bedeutung erlangen Listerien aufgrund der beim Menschen sowie bei Haus- und Wildtieren verursachten fektionskrankheit, die als Listeriose bezeichnet wird. Beim Menschen wird die Listeriose, die eine sehr variable Inkubationszeit von wenigen Tagen bis zu zwei Monaten aufweist, durch die Art L. monocytogenes hervorgerufen, wobei bei einigen Erkrankungen auch L. ivanovii, L. seeligeri und L. welshimeri nachgewiesen wurden. Eine Listerien-Infektion kann sich in schwerwiegenden Krankheitsbildern wie Sepsis, Meningitis oder Enzephalitis manifestieren. Vor allem bei Neugeborenen, die über die Plazenta oder während der Geburt infiziert werden können, sowie bei älteren Menschen besteht im Falle einer Listeriose ein hohes gesundheitliches Risiko. Die Letalitätsrate im Falle der Neugeborenen-Listeriose liegt bei bis zu 50 %. hn Falle einer Infektion vor der Geburt kann es auch zu einem Abort des Fötus kommen. Das Auftreten einer Listeriose bei älteren oder anderweitig abwehrgeschwächten Menschen kann bei bis zu 30 % der Erkrankten einen tödlichen Verlauf nehmen. Die Übertragung erfolgt in der Regel durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln. Vor allem Milchprodukte sind eine häufige Infektionsquelle. Aber auch nahezu alle anderen Lebensmittel sind potentielle Quellen von Listerien- infektionen. So wurden in der Vergangenheit neben Milch und diversen
Milchprodukten, wie Käse, Butter oder Speiseeis auch andere Lebensmittel als Quelle einer Listeriose identifiziert. Darunter so verschiedene Produkte wie Krautsalat, Muscheln, Schweinefleisch, Hähnchen, Fisch, Maismehl oder Reissalat. In vielen Fällen waren Listeriose- Ausbrüche, die durch den Verzehr der genannten Lebensmittel hervorgerufen wurden, von Todesfällen begleitet.
Von besonderer Bedeutung ist in diesem Zusammenhang, dass Listerien auch noch bei 4 °C (in Milch sogar bei -0,3 °C) zur Vermehrung befähigt sind. Dies bedeutet, dass sich trotz gekühlter Lagerung von Lebensmitteln, Listerien in diesen vermehren und anreichern können. Auch nach dem Garen, Braten oder Räuchern können sich in den betreffenden Lebensmitteln in Folge einer unzureichenden Behandlung oder einer Sekundärkontamination Listerien anreichern.
Daher ist eine ständige Kontrolle von Lebensmitteln auf das Vorkommen von Listerien wichtiger Bestandteil sowohl der Qualitätssicherung in den produzierenden Betrieben, als auch der täglichen Routine in den Hygieneinstituten.
Das klassische Verfahren zum Nachweis von L. monocytogenes ist hierbei sehr zeitaufwendig. Hierbei erfolgt zunächst eine Anreicherung in einem selektiven Flüssigmedium, der so genannten lA Fraser-Bouillon, bei 30 °C für 24 h. Es folgt ein zweiter Anreicherungsschritt, nunmehr in Fraser-Bouillon, bei 37 °C für 48 h. Anschließend werden beide Anreicherungen auf selektiven Agar-Medien (Oxford- Agar und PALCAM- Agar) plattiert und diese bei 30 °C oder 37 °C für 24 h bis 48 h inkubiert. Zur Bestätigung, dass es sich bei so gewachsenen Kolonien um Listeria bzw. L. monocytogenes handelt, erfolgen weitere Subkultivierungen (auf Trypton- Soja-Hefe- Agar bzw. auf Schafblut- Agar) für die Dauer von mindestens 24 h, längstens fünf Tagen. Die Gesamtdauer des klassischen Nachweisverfahrens liegt also bei fünf bis zehn Tagen.
Zu den weltweit häufigsten bakteriell bedingten und durch Lebensmittel übertragenen Erkrankungen gehören Staphylokokken-Intoxikationen. Diese werden insbesondere durch Stämme von Staphylococcus (S.) aureus ausgelöst. S. aureus ist ein gram-positives, unbewegliches Koagulase-positives Bakterium und kommt auf der Haut, der Schleimhaut des Nasen-Rachenraums, in Stuhl, Kot, Abszessen und Pusteln vor. Hierbei ist S. aureus auch in der gesunden Bevölkerung weit verbreitet: Bei der Hälfte aller gesunden Menschen lässt sich S. aureus im Nasen-Rachenraum nachweisen.
Die Lebensmittelvergiftung als Folge einer h fektion mit S. aureus wird durch die von diesen Bakterien im Lebensmittel produzierten Enterotoxine verursacht und ist gekennzeichnet durch Erbrechen und Durchfall. Am stärksten wirkt Enterotoxin A mit einer emetischen Dosis unter 1 μg. Bereits 0,1 - 0,2 μg Enterotoxin führen zur Lebensmittelvergiftung. Hervorzuheben ist weiterhin das Toxin F, welches zu einem Schocksyndrom führt und deshalb auch als "Toxic-Shock-Syndrom-Toxin" (TSST-1) bezeichnet wird. Kennzeichen des durch Toxin F hervorgerufenen Schocksyndroms sind Lungenödem, endotheliale Zelldegenerationen, Nierenversagen und Schock.
Die Übertragung von S. aureus erfolgt in der Regel ebenfalls durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln, wobei das Spektrum der möglichen Infektionsquellen recht breit ist. Folgende Lebensmittel waren u.a. bei Erkrankungen beteiligt: Fertige Fleischgerichte, Pasteten, gekochter Schinken, Rohschinken, Milch und Milcherzeugnisse, eihaltige Zubereitungen, Salate, Cremes, Kuchenfüllungen, Speiseeis, Teigwaren. Der Routinenachweis erfolgt heutzutage meist über die Kultur und Bestätigungstests verdächtiger Kolonien, da der Enterotoxmnachweis recht schwierig zu führen ist. Bei Kulturnachweis wird die zu untersuchende Probe zunächst für 48 h auf einem geeigneten Selektivmedium (z.B. Baird) bei 37 °C inkubiert. Sofern dieser erste Kultivierungsschritt in Flüssigmedium erfolgt ist, schließt sich ein zweiter
(wiederum für 48 h) auf Festmedium (z.B. Baird-Parker) an. Im nächsten Schritt werden nun verdächtige Kolonien auf die Anwesenheit von Koagulase getestet. Hierfür stehen zwei unterschiedliche Verfahren zur Verfügung. In der Regel wird zunächst der so genannte „Röhrchen-Test auf Anwesenheit des Klumpungsfaktors" durchgeführt, was etwa sechs bis acht Stunden in Anspruch nimmt. Sofern dieser Test negativ ausfällt, muss das Ergebnis durch den so genannten „Röhrchen-Test unter Verwendung von Kaninchen-Plasma" bestätigt werden. Dieser Test dauert bis zu 24 h. Die Gesamtdauer des klassischen Nachweisverfahrens liegt somit zwischen 54 h und fünf Tagen.
Erst seit gut 20 Jahren spielt ein bislang unterschätzter Keim eine größere Rolle als Lebensmittelvergifter: Campylobacter. Anders als beispielsweise Salmonellen vermehrt er sich selten in Lebensmitteln, allerdings reichen für eine Infektion mit diesem Erreger schon wenige hundert Bakterienzellen aus.
Der Genus Campylobacter (C.) umfasst 20 Arten und Unterarten. Es handelt sich bei diesen bislang nur schwer zu kultivierenden Bakterien um gramnegative, schlanke, gekrümmte bis spiralig gewundene Stäbchen, die für ihr Wachstum mikroaerophile Bedingungen benötigen.
Medizinisch relevant sind die Arten C. jejuni, C. coli und C. laris. Sie besiedeln den Dünn- und Dickdarm und verursachen eine akute Gastroenteritis begleitet von folgenden Symptomen: Diarrhöe, Bauchschmerzen, Fieber, Übelkeit, Erbrechen. Diese Symptome sind nur schwer von denen eines Magengeschwürs zu unter- scheiden. Eine sorgfältige Differentialdiagnose ist daher essentiell. Der Routinenachweis erfolgt derzeit über mehrstufige Kultivierung, beginnend mit einer 18stündigen Anreicherung in selektivem Flüssigmedium (Campylobacter- Selektiv-Medium nach Preston), gefolgt von zweimal 48 h auf zwei unterschied- liehen Festmedien (Karmali- Agar gefolgt von Columbia-Blut- Agar). Auf diese fünftägigen Kultivierungen folgt dann noch die biochemische oder serologische Identifizierung.
Als logische Konsequenz aus den Schwierigkeiten, insbesondere der Langwierigkeit, welche die oben genannten Verfahren beim Nachweis von Listerien, S. aureus und Campylobacter haben, bieten sich daher Nachweisverfahren auf Nukleinsäurebasis an.
Bei der PCR, der Polymerase-Kettenreaktion, wird mit spezifischen Primern ein charakteristisches Stück des jeweiligen Bakteriengenoms amplifiziert. Findet der Primer seine Zielstelle, so kommt es zu einer millionenfachen Vermehrung eines Stücks der Erbsubstanz. Bei der anschließenden Analyse, z.B. mittels eines DNA- Fragmente auftrennenden Agarose-Gels, kann eine qualitative Bewertung stattfinden. Im einfachsten Fall führt dies zu der Aussage, dass die Zielstellen für die verwen- deten Primer in der untersuchten Probe vorhanden waren. Weitere Aussagen sind nicht möglich; diese Zielstellen können sowohl von einem lebenden Bakterium, als auch von einem toten Bakterium oder von nackter DNA stammen. Eine Differenzierung ist hier nicht möglich. Da die PCR-Reaktion auch bei Anwesenheit eines toten Bakteriums oder nackter DNA positiv ausfällt, kommt es hier häufig zu falsch positiven Ergebnissen. Eine Weiterführung dieser Technik stellt die quantitative PCR dar, bei der versucht wird, eine Korrelation zwischen Menge an vorhandenen Bakterien und der Menge an amplifizierter DNA herzustellen. Vorteile der PCR liegen in ihrer hohen Spezifität, leichten Anwendbarkeit und im geringen Zeitaufwand. Wesentliche Nachteile sind ihre hohe Anfälligkeit für Kontaminationen und damit falsch positive Ergebnisse sowie die bereits erwähnte fehlende Möglichkeit zwischen lebenden und toten Zellen bzw. nackter DNA zu unterscheiden.
Einen einzigartigen Ansatz, die Spezifität der molekularbiologischen Methoden wie der PCR mit der Möglichkeit der Bakterienvisualisierung, wie sie die Antikörper- Methoden ermöglichen, zu verbinden, bietet die Methode der Fluoreszenz-In-Situ- Hybridisierung (FISH; R. I. Amann, W. Ludwig und K.-H. Schleifer, 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbial. Rev. 59, S. 143-169). Hierbei können Bakterienarten, -gattungen oder -gruppen hochspezifisch identifiziert und visualisiert werden.
Die FISH-Technik basiert auf der Tatsache, dass es in Bakterienzellen bestimmte Moleküle gibt, die aufgrund ihrer lebenswichtigen Funktion im Laufe der Evolution nur wenig mutiert wurden: Die 16S und die 23S ribosomale Ribonukleinsäure (rRNS). Beide sind Bestandteile der Ribosomen, den Orten der Proteinbiosynthese, und können aufgrund ihrer ubiquitären Verbreitung, ihrer Größe, und ihrer strukturellen und funktionellen Konstanz als spezifische Marker dienen (Woese, C. R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, S. 221-271). Ausgehend von einer vergleichenden Sequenzanalyse können phylogenetische Beziehungen allein aufgrund dieser Daten aufgestellt werden. Dazu müssen diese Sequenzdaten in ein Alignment gebracht werden. Im Alignment, welches sich auf Kenntnisse über die Sekundär Struktur und Tertiärstruktur dieser Makromoleküle stützt, werden die homologen Positionen der ribosomalen Nukleinsäuren in Einklang miteinander gebracht.
Ausgehend von diesen Daten können phylogenetische Berechnungen durchgeführt werden. Der Einsatz modernster Computertechnologie macht es möglich, auch großangelegte Berechnungen schnell und effektiv auszuführen, sowie große Datenbanken, welche die Alignment-Sequenzen der 16S-rRNA und 23S-rRNA beinhalten, anzulegen. Durch den schnellen Zugriff auf dieses Datenmaterial können neu erhaltene Sequenzen in kurzer Zeit phylogenetisch analysiert werden. Diese rRNA-Datenbanken können dazu verwendet werden, art- und gattungsspezifische Gensonden zu konstruieren. Hierbei werden alle verfügbaren rRNA-Sequenzen miteinander verglichen und für bestimmte Sequenzstellen Sonden entworfen, die spezifisch eine Bakterienart, -gattung oder -gruppe erfassen.
Bei der FISH (Fluoreszenz-rn-Situ-Hybridisierung)-Technik werden diese Gensonden, die zu einer bestimmten Region auf der ribosomalen Zielsequenz komplementär sind, in die Zelle geschleust. Die Gensonden sind i.d.R. kleine, 16-20 Basen lange, einzelsträngige Desoxyribonukleinsäurestücke und richten sich gegen eine Zielregion, welche typisch für eine Bakterienart oder eine Bakteriengruppe ist. Findet die fluoreszenzmarkierte Gensonde in einer Bakterienzelle ihre Zielsequenz, so bindet sie daran und die Zellen können aufgrund ihrer Fluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop detektiert werden.
Die FISH- Analyse wird grundsätzlich auf einem Objektträger durchgefulirt, dabei der Auswertung die Bakterien durch Bestrahlung mit einem hochenergetischen Licht visualisiert, also sichtbar gemacht werden. Hierin liegt allerdings einer der Nachteile der klassischen FISH- Analyse: da auf einem Objektträger naturgemäß nur relative kleine Volumina analysiert werden können, kann die Sensitivität der Methode unbefriedigend und für eine verlässliche Analyse nicht ausreichend sein. Mit der vorliegenden Erfindung werden daher die Vorteile der klassischen FISH- Analyse mit denen der Kultivierung verknüpft. Durch einen vergleichsweise kurzen Kultivierungsschritt wird sichergestellt, dass die nachzuweisenden Bakterien in aus- reichender Zahl vorliegen, bevor der Nachweis der Bakterien mittels spezifischer FISH durchgeführt wird.
Die Durchführung der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verfahren zum gleichzeitigen und spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria sowie der Spezies L. monocytogenes oder zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies S. aureus oder zum gleichzeitigen und spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Campylobacter sowie der Spezies C. coli und C. jejuni umfasst somit die folgenden Schritte:
- Kultivierung der in der untersuchten Probe enthaltenen Bakterien - Fixierung der in der Probe enthaltenen Bakterien
- Inkubation der fixierten Bakterien mit Nukleinsäuresondenmolekülen, um eine Hybridisierung herbeizuführen,
- Entfernen bzw. Abwaschen der nicht hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle und - Detektieren der mit den Nukleinsäuresondenmolekülen hybridisierten Bakterien.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Kultivieren" die Vermehrung der in der Probe enthaltenen Bakterien in einem geeigneten Kultivierungsmedium verstanden. Zum Nachweis von Listerien kann die Kultivierung z.B. in V_ Fraser- Bouillon für 24 h bei 30 °C erfolgen. Zum Nachweis von S. aureus kann die Kultivierung z.B. als Blutkultur (z.B. BACTEC 9240, Becton Dickinson Instruments) für 8 h bis 48 h bei 35 °C erfolgen. Zum Nachweis von Campylobacter kann die Kultivierung z.B. in Selektivmedium nach Preston für 24 h bei 42 °C erfolgen. Der Fachmann kann die geeigneten Kultivierungsverfahren in jedem Fall dem Stand der Technik entnehmen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Fixieren" der Bakterien eine Behandlung verstanden, mit der die Bakterienhülle für Nukleinsäuresonden durchlässig gemacht wird. Zur Fixierung wird üblicherweise Ethanol verwendet. Kann die Zellwand mit diesen Maßnahmen nicht von den Nukleinsäuresonden penetriert werden, so sind dem Fachmann ausreichend weitere Maßnahmen bekannt, die zu demselben Ergebnis führen. Dazu zählen beispielsweise Methanol, Mischungen von Alkoholen, eine niederprozentige Paraformaldehydlösung oder eine verdünnte Formaldehydlösung, enzymatische Behandlungen oder ähnliches. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden für die „Hybridisierung" die fixierten Bakterien mit fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuresonden inkubiert. Diese Nukleinsäuresonden, die aus einem Oligonukleotid und einem daran gebundenen Marker bestehen, können dann die Zellhülle penetrieren und sich an die der Nuklein- säuresonde entsprechenden Zielsequenz im Zellinneren binden. Die Bindung ist als Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Nukleinsäurestücken zu verstehen.
Die Nukleinsäuresonde kann dabei komplementär zu einer chromosomalen oder episomalen DNA sein, aber auch zu einer mRNA oder rRNA des nachzuweisenden Mikroorganismus. Von Vorteil ist es, eine Nukleinsäuresonde zu wählen, die zu einem Bereich komplementär ist, der in einer Kopiezahl von mehr als 1 im nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Die nachzuweisende Sequenz liegt bevorzugt 500 - 100.000 mal pro Zelle vor, besonders bevorzugt 1.000 - 50.000 mal. Aus diesem Grunde wird bevorzugt die rRNA als Zielstelle verwendet, da die Ribosomen in der Zelle als Orte der Proteinbiosynthese vieltausendfach in jeder aktiven Zelle vorliegen.
Bei der Nukleinsäuresonde im Sinne der Erfindung kami es sich um eine DNA- oder RNA-Sonde handeln, die in der Regel zwischen 12 und 1000 Nukleotide umfassen wird, bevorzugt zwischen 12 und 500, bevorzugter zwischen 12 und 200, besonders bevorzugt zwischen 12 und 50 und zwischen 15 und 40, und am meisten bevorzugt zwischen 17 und 25 Nukleotide. Die Auswahl der Nukleinsäuresonden geschieht nach den Gesichtspunkten, ob eine komplementäre Sequenz in dem nachzu- weisenden Mikroorganismus vorliegt. Durch diese Auswahl einer definierten Sequenz kann dadurch eine Bakterienart, eine Bakteriengattung oder eine ganze Bakteriengruppe erfasst werden. Komplementarität sollte bei einer Sonde von 15 Nukleotiden über 100% der Sequenz gegeben sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt. Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria und der Spezies L. monocytogenes haben die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmoleküle die folgenden Längen und Sequenzen:
SEQ ID Nr. 1 : 5λ- ggc ttg cac egg cag tea et
SEQ ID Nr. 2: 5"- egg ctt aca ccg gca gtc act
SEQ ID Nr . 3 : 5 - cec ttt gta eta tec att gta
SEQ ID Nr. 4: 5"- cec ttt gta cca tec att gta
SEQ ID Nr. 5: 5"- cec ttt gta tta tec att gta g
SEQ ID Nr. 6 : 5 Λ - cec ttt gta ctg tec att gta
Das Nachweisverfahren für Listeria und L. monocytogenes wird dabei beispielsweise wie folgt durchgeführt: Das Oligonuldeotid SEQ ID Nr. 1 wird spezifisch, zum Beispiel mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff, markiert und dient zum spezifischen Nachweis aller Bakterien der Gattung Listeria. Das Oligonukleotid SEQ ID Nr. 2 bleibt unmarkiert und verhindert als Kompetitor das Binden des markierten Oligo- nukleotids SEQ ID Nr. 1 an Bakterien, die nicht zur Gattung Listeria gehören. Das Oligonukleotid der SEQ ID Nr. 3 wird ebenfalls spezifisch, aber anders als das Oligonukleotid SEQ ID Nr. 1, also z.B. mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff markiert und dient zum spezifischen Nachweis aller Bakterien der Spezies Listeria monocytogenes. Die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 bleiben wiederum unmarkiert und verhindern als Kompetitoren das Binden des markierten Oligonukleotids SEQ ID Nr. 3 an Bakterien, die nicht zur Spezies L. monocytogenes gehören. Auf diese Weise ist der gleichzeitige und hoch- spezifische Nachweis von Bakterien möglich, die zur Gattung Listeria bzw. zur Spezies L. monocytogenes gehören. Die verschiedenen Marker, z.B. ein grüner Fluoreszenzfarbstoff einerseits und ein roter Fluoreszenzfarbstoff andererseits, sind voneinander auf einfache Weise unterscheidbar, z.B. durch den Einsatz ver- schiedener Filter in der Fluoreszenzmikroskopie.
Im Rahmen des erfmdungsgemäßen Verfahrens zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies S. aureus haben die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- sondemnoleküle die folgenden Längen und Sequenzen:
SEQIDNr.7: 5'- GAAGCAAGC TTC TCGTCC G
SEQIDNr.8: 5'- GGAGCAAGC TCC TCGTCC G
SEQIDNr.9: 5'- GAAGCAAGC TTC TCGTCATT
SEQ ID Nr.10: 5'- CTAATG CAG CGC GGATCC
SEQ ID Nr.11: 5'- CTAATG CAC CGC GGATCC
SEQ ID Nr.12: 5*- CTAATG CGG CGC GGATCC
SEQID Nr.13: 5'- CTAATG CAGCGC GGGTCC
Das Nachweisverfahren für S. aureus erfolgt beispielsweise wie folgt: Die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 10 werden spezifisch, zum Beispiel mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff, markiert und dienen zum spezifischen Nachweis aller Bakterien der Spezies Staphylococcus aureus. Die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 8 und 9 sowie SEQ ID Nr. 11, 12 und 13 bleiben dagegen unmarkiert und verhindern als Kompetitoren das Binden der markierten Ohgonukleotide an Bakterien, die nicht zur Spezies S. aureus gehören. Auf diese Weise ist der hochspezifische Nachweis von Bakterien möglich, die zur Spezies S. aureus gehören.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Intensität der erhaltenen Signale durch den Einsatz von so genannten "Helfersonden" verstärkt werden. Bei diesen Helfersonden handelt es sich um unmarkierte Ohgonukleotide, die folgende Sequenz aufweisen:
SEQ ID Nr. 14: TCG CTC GAC TTG CAT GTA TTA GGC A
SEQ JD Nr. 15 : ACC CGT CCG CCG CTA AC A TC A G
Die Verwendung der Helfersonden ist nicht zwingend, sondern optional. Die Helfer- sonden erleichtern das Binden der markierten Sonden an ihre Zielstellen und verbessern so die Signalintensität. Das Nachweisverfahren funktioniert aber sehr gut auch ohne diese Helfersonden.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum gleichzeitigen spezifischen
Nachweis von Bakterien der Gattung Campylobacter und der Spezies C. coli und C. jejuni haben die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmoleküle die folgenden Längen und Sequenzen:
SEQ ID Nr.16 5' CTG CCT CTC CCT CAC TCT AG
SEQ ID Nr.17 5' CTG CCT CTC CCTTAC TCT AG
SEQIDNr.18 5' CTGCCT CTC CCC TAC TCTAG SEQ ID Nr. 19 5 ' CTG CCT CTC CCC C AC TCT AG
SEQ ID Nr. 20 5 ' CCT ACC TCT CCC ATA CTC TAG A
SEQ ID Nr. 21 5 ' CCA TCC TCT CCC ATA CTC TAG C
SEQ ID Nr. 22 5 ' CCT ACC TCT CCA GTA CTC TAG T
SEQ ID Nr. 23 5 ' CCT GCC TCT CCC ACA CTC TAG A
SEQ ID Nr. 24 5 ' CGC TCC GAA AAG TGT CAT CCT C
SEQ ID Nr. 25 5 ' CTA AAT ACG TGG GTT GCG
SEQ ID Nr. 26 5 ' CTA AAC ACG TGG GTT GCG
SEQ ID Nr. 27 5 ' AGC AGA TCG CCT TCG CAA T
SEQ ID Nr. 28 5 ' AGC AGA TCG CTT TCG CAA T
SEQ ID Nr. 29 5 ' AGT AGA TCG CCT TCG CAA T
SEQ ID Nr. 30 5' TCG AGT GAA ATC AAC TCC C
SEQ ID Nr. 31 5 ' TCG GGT GAA ATC AAC TCC C
SEQ ID Nr. 32 5 ' CGT AGC ATG GCT GAT CTA C
SEQ ID Nr. 33 5 ' CGT AGC ATA GCT GAT CTA C SEQ ID Nr. 34 5 ' CGT AGC ATT GCT GAT CTA C
SEQ ID Nr. 35 5 ' GCC CTG ACT AGC AGA GCA A
SEQ ID Nr. 36 5 ' TTC TTG GTG ATC TCT ACG G
SEQ ID Nr. 37 5 ' TTC CTG GTG ATC TCT ACG G
SEQ ID Nr. 38 5 ' TTC TTG GTG ATA TCT ACG G
SEQ ID Nr. 39 5 ' TTG AGT TCT AGC AGA TCG C
SEQ ID Nr. 40 5 ' TTG AGT TCC AGC AGA TCG C
SEQ ID Nr. 41 5' TTG AGT TCT AGC AGA TAG C
SEQ ID Nr. 42 5 ' TTG AGT TCC AGC AGA TAG C
SEQ ID Nr. 43 5 ' CGC GCC TTA GCG TCA GTT GAG
SEQ ID Nr. 44 5 ' CAC GCC TTA GCG TCA GTT GAG
SEQ ID Nr. 45 5 ' CGC GCC TTA GCG TCA GTT AAG
SEQ ID Nr. 46 5 ' CAC GCA TTA GCG TCA GTT GAG
SEQ ID Nr. 47 5 ' CGA GCA TTA GCG TCA GTT GAG
SEQ ID NR. 48 5 ' TAC ACT AGT TGT TGG GGT GG SEQ ID NR. 49 5 ' TTC GCG CCT CAG CGT CAG TTA CAG
Das Nachweisverfahren für die Gattung Campylobacter bzw. die Spezies C. coli und C. jejuni wird dabei wie folgt durchgeführt: Die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 16 bis SEQ ID Nr. 19 sowie die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 24 bis SEQ ID Nr. 28 sowie das Oligonukleotid SEQ ID Nr. 30 sowie die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 32 bis 34 werden spezifisch, zum Beispiel mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff, markiert und dienen zum spezifischen Nachweis aller Bakterien der Gattung Campylobacter. Die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 20 bis 23 sowie das Oligonukleotid SEQ ID Nr. 29 sowie das Oligonukleotid SEQ ID Nr. 31 bleiben unmarkiert und verhindern als
Kompetitoren das Binden der vorstehend genannten für die Gattung Campylobacter spezifischen, markierten Ohgonukleotide an Bakterien, die nicht zur Gattung Campylobacter gehören.
Die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 35 und 36 sowie das Oligonukleotid SEQ ID Nr. 39 werden ebenfalls spezifisch, aber anders als die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 16 bis 19, 24 bis 28, 30 sowie 32 bis 34, also davon unterscheidbar, z.B. mit einem blauen Fluoreszenzfarbstoff, markiert und dienen zum spezifischen Nachweis aller Bakterien der Spezies Campylobacter coli. Die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 37, 38 sowie 40 bis 42 bleiben wiederum unmarkiert und verhindern als Kompetitoren das Binden der markierten, für C. coli spezifischen Ohgonukleotide an Bakterien, die nicht zur Spezies C. coli gehören.
Die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 43 und 48 werden ebenfalls spezifisch, aber wiederum anders als die vorgenannten Ohgonukleotide, also wiederum davon unterscheidbar, z.B. mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff, markiert und dienen zum spezifischen Nachweis aller Bakterien der Spezies Campylobacter jejuni. Die Ohgonukleotide SEQ ID Nr. 44 bis 47 und 49 bleiben wiederum unmarkiert und verhindern als Kompetitoren das Binden der markierten, für C. jejuni spezifischen Ohgonukleotide an Bakterien, die nicht zur Spezies C. jejuni gehören. Auf diese Weise ist der gleichzeitige und hochspezifische Nachweis von Bakterien möglich, die zur Gattung Campylobacter bzw. zu den Spezies C. coli oder C. jejuni gehören.
Die Intensität der erhaltenen Signale kann optional durch den Einsatz so genannter Helfersonden verstärkt werden. Die Helfersonden sind ebenfalls unmarkiert, erleichtern aber das Binden der markierten Sonden an ihre Zielstellen und verbessern so die Signalintensität. Hierbei handelt es sich lediglich um eine Verstärkung der Signalintensität, das Nachweisverfaliren funktioniert selbstverständlich auch ohne diese Helfersonden.
So kann die Intensität der mit dem Oligonukleotid SEQ ID Nr. 24 erhaltenen Signale durch den Einsatz der nachfolgend genannten unmarkierten Ohgonukleotide als Helfersonden verstärkt werden:
SEQ TO Nr.50: 5' CAC GCG GCGTTG CTGCTG/T C
SEQ ID Nr. 51 : 5 ' TCT TTT [C/T]CC [A/C/T][G/A]A [A/C/T]AA AAG GAG TTA CG
Unter Kompetitoren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere Ohgonukleotide verstanden, die eine höhere Spezifität für nicht nachzuweisende Gattungen bzw. Spezies aufweisen als die markierten, für die nachzuweisenden Gattungen bzw. Spezies spezifischen Ohgonukleotide.
Gegenstand der Erfindung sind auch Abwandlungen der obigen Oligonukleotid- sequenzen, die trotz der Abweichungen in der Sequenz und/oder Länge eine spezifische Hybridisierung mit Ziel-Nukleinsäuresequenzen des jeweiligen Bakteriums zeigen und somit für den Einsatz in einem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind. Hierunter fallen insbesondere a) Nuklemsäuremoleküle, die (i) mit einer der obigen Ohgonukleotidsequenzen (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 51) in mindestens 60%, 65%, bevorzugt in mindestens 70%, 75%, bevorzugter in mindestens 80%, 84%, 87% und besonders bevorzugt in mindestens 90%, 94%, 96%, der Basen übereinstimmen (wobei der Sequenzbereich des Nukleinsäuremoleküls zu betrachten ist, der dem Sequenzbereich eines der oben angegebenen Ohgonukleotide (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 51) entspricht, und nicht etwa die gesamte Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls, das u.U. im
Vergleich zu den oben angegebenen Oligonukleotiden (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID NO. 51) um eine bis zahlreiche Basen verlängert ist) oder (ii) sich von obigen Ohgonukleotidsequenzen (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 51) durch eine oder mehrere Deletionen und/oder Additionen unterscheiden und die eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von
Bakterien der Gattung Listeria und der Spezies L. monocytogenes, von Bakterien der Spezies S. aureus oder von Bakterien der Gattung Campylobacter und der Spezies C. coli und C. jejuni ermöglichen. Dabei bedeutet „spezifische Hybridisierung", dass unter den hier beschriebenen oder den dem Durchschnittsfachmann im Zusammenhang mit in situ-
Hybridisierungstechniken bekannten Hybridisierungsbedingungen nur die ribosomale RNA der Ziel-Organismen, nicht aber die rRNA von Nicht-Ziel- Organismen an das Oligonukleotid bindet. b) Nuklemsäuremoleküle, die mit einer Sequenz, die zu einem der unter a) genannten Nuklemsäuremoleküle oder zu einer der Sonden SEQ ID No. 1 bis
SEQ ID NO. 51 komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren. c) Nuklemsäuremoleküle, die eine Ohgonukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 51 oder die Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls nach a) oder b) umfassen und zusätzlich zu den genannten Sequenzen bzw. deren Abwandlungen nach a) oder b) mindestens ein weiteres Nukleotid aufweisen, und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von Ziel- Organismen ermöglichen.
Der Grad der Sequenzidentität eines Nukleinsäuremoleküls mit den Sonden SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 51 kann mit üblichen Algorithmen bestimmt werden. Geeignet ist hier beispielsweise das Programm zur Bestimmung der Sequenzidentität, das unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (auf dieser Seite z.B. der Link „Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]") zugänglich ist.
Im Falle des Nachweises von Bakterien der Gattung Listeria bzw. der Spezies L. monocytogenes entsprechen die spezifischen Oligonukleotidsonden bevorzugt den Oligonukleotiden SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3. Es sind aber auch Abwandlungen möglich, solange trotzdem eine spezifische Hybridisierung zwischen Sonde und Targetsequenz stattfindet. Dabei kann es ausreichen, dass die verwendete Oligo- nukleotidsonde in 15, bevorzugt 16 und 17 und besonders bevorzugt 18 und 19 aufeinander folgenden Nukleotiden mit SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 übereinstimmt. Gleiches gilt für die als Kompetitoren dienenden Ohgonukleotide im Hinblick auf die Sequenzen SEQ ID Nr. 2, 4, 5 und 6.
Für den Nachweis von S. aureus gilt das Gleiche. Hier weisen die spezifischen Oligonukleotidsonden bevorzugt eine Sequenz auf, die in 13 und 14 und bevorzugt 15, 16 oder 17 aufeinander folgenden Nukleotiden mit denen der SEQ ID Nr. 7 bzw. 10 übereinstimmt. Gleiches gilt für die als Kompetitoren dienenden Ohgonukleotide im Hinblick auf die Sequenzen SEQ ID Nr. 8, 9 und 11 - 13.
Entsprechendes gilt für den Nachweis von Bakterien der Gattung Campylobacter und der Spezies Campylobacter coli und Campylobacter jejuni. Auch hier weisen die spezifischen Oligonukleotid-Sonden bevorzugt eine Sequenz auf, die in 13 oder 14, bevorzugt 15 oder 16 und besonders bevorzugt 17 oder 18 aufeinander folgenden Nukleotiden mit den SEQ ID Nr. 16 - 19, 24 - 28, 30, 32 - 36, 39, 43 und 48 übereinstimmt. Gleiches gilt für die als Kompetitoren dienenden Ohgonukleotide im Hinblick auf die Sequenzen SEQ ID Nr. 20 - 23, 29, 31, 37, 38, 40 - 42, 44 - 47 und 49.
Die erfindungsgemäßen Nuklemsäuresondenmoleküle können im Rahmen des Nachweisverfahrens mit verschiedenen Hybridisierungslösungen eingesetzt werden. Verschiedene organische Lösungsmittel können hierbei in Konzentrationen von 0 - 80 % eingesetzt werden. Durch das Einhalten von stringenten Hybridisierungs- bedingungen wird gewährleistet, dass das Nukleinsäuresondenmolekül auch tatsächlich mit der Zielsequenz hybridisiert. Moderate Bedingungen im Sinne der Erfindung sind z.B. 0 % Formamid in einem Hybridisierungspuffer wie er nachfolgend beschrieben ist. Stringente Bedingungen im Sinne der Erfindung sind beispielsweise 20-80 % Formamid im Hybridisierungspuffer.
Im Rahmen des erfmdungsgemäßen Verfahrens zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria und der Spezies L. monocytogenes enthält eine typische Hybridisierungslösung 0 % - 80 % Formamid, bevorzugt 20 % - 60 % Formamid, besonders bevorzugt 40 % Formamid. Sie hat außerdem eine Salzkonzentration von 0,1 mol/1 - 1,5 mol/1, bevorzugt 0,5 mol/1 - 1,0 mol/1, bevorzugter von 0,7 mol/1 - 0,9 mol/1, besonders bevorzugt von 0,9 mol/1, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um Natriumchlorid handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens, wie z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer Konzentration von 0,001 % - 0,2 %, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,005 - 0,05 %, bevorzugter von 0,01 - 0,03 %, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 %. Zum Puffern der Hybridisierungslösung können verschiedene Verbindungen wie Tris-HCl, Natrium-Citrat, PIPES oder HEPES verwendet werden, die üblicherweise in Konzentrationen von 0,01-0,1 mol/1 eingesetzt werden, bevorzugt von 0,01 bis 0,05 mol/1, in einem pH-Wert- Bereich von 6,0 - 9,0, bevorzugt 7,0 bis 8,0. Die besonders bevorzugte erfindungs- gemäße Ausführung der Hybridisierungslösung beinhaltet 0,02 mol/1 Tris-HCl, pH 8,0.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies S. aureus enthält eine typische Hybridisierungslösung 0 % - 80 % Formamid, bevorzugt 20 % - 60 % Formamid, besonders bevorzugt 20 % Formamid. Sie hat außerdem eine Salzkonzentration von 0,1 mol/1 - 1,5 mol/1, bevorzugt von 0,7 mol/1 - 0,9 mol/1, besonders bevorzugt von 0,9 mol/1, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um Natriumchlorid handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens, wie z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer Konzentration von 0,001 % - 0,2 %, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,005 - 0,05 %, bevorzugter 0,01 - 0,03 %, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 %. Zum Puffern der Hybridisierungslösung können verschiedene Verbindungen wie Tris-HCl, Natrium-Citrat, PIPES oder HEPES verwendet werden, die üblicherweise in Konzentrationen von 0,01 -0, 1 mol/1 eingesetzt werden, bevorzugt von 0,01 bis 0,05 mol/1, in einem pH- Wert-Bereich von 6,0 - 9,0, bevorzugt 7,0 bis 8,0. Die besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung der Hybridisierungslösung beinhaltet 0,02 mol/1 Tris-HCl, pH 8,0.
hn Rahmen des erfmdungsgemäßen Verfahrens zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Campylobacter und der Spezies C. coli und C. jejuni enthält eine typische Hybridisierungslösung 0 % - 80 % Formamid, bevorzugt 20 % - 60 % Formamid, besonders bevorzugt 20 % Formamid. Sie hat außerdem eine Salzkonzentration von 0,1 mol/1 - 1,5 mol/1, bevorzugt von 0,7 mol/1 - 0,9 mol/1, besonders bevorzugt von 0,9 mol/1, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um
Natriumchlorid handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens, wie z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer Konzentration von 0,001 % - 0,2 %, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,005 - 0,05 %, bevorzugter 0,01 - 0,03 %, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 %. Zum Puffern der Hybridisierungslösung können verschiedene Verbindungen wie Tris- HC1, Natrium-Citrat, PIPES oder HEPES verwendet werden, die üblicherweise in Konzentrationen von 0,01-0,1 mol/1 eingesetzt werden, bevorzugt von 0,01 bis 0,05, in einem pH- Wert-Bereich von 6,0 - 9,0, bevorzugt 7,0 bis 8,0. Die besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung der Hybridisierungslösung beinhaltet 0,02 mol/1 Tris-HCl, pH 8,0.
Es versteht sich, dass der Fachmann die angegebenen Konzentrationen der Bestandteile des Hybridisierungspuffers derart auswählen kann, dass die gewünschte Stringenz der Hybridisierungsreaktion erzielt wird. Besonders bevorzugte Ausführungsfoπnen geben stringente bis besonders stringente Hybridisierungs- bedingungen wieder. Unter Einsatz dieser stringenten Bedingungen kann der Fachmann feststellen, ob ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül einen spezifischen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen von Ziel-Organismen ermöglicht und somit im Rahmen der Erfindung zuverlässig eingesetzt werden kam . Der Fachmann ist in der Lage durch Veränderung der Parameter des Hybridisierungspuffers die Stringenz im Bedarfsfall bzw. je nach Sonde oder Zielorganismus zu erhöhen oder zu erniedrigen.
Die Konzentration der Nukleinsäuresonde im Hybridisierungspuffer ist abhängig von der Art ihrer Markierung und der Anzahl der Zielstrukturen. Um eine schnelle und effiziente Hybridisierung zu ermöglichen, sollte die Anzahl der Nuklemsäuresondenmoleküle die Anzahl der Zielstrukturen um mehrere Größenordnungen überschreiten. Allerdings ist bei der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) darauf zu achten, dass eine zu hohe Menge an fluoreszenzmarkierten Nuklein- säuresondenmolekülen zu erhöhter Hintergrundfluoreszenz führt. Die Konzentration der Nuklemsäuresondenmoleküle sollte deshalb in einem Bereich zwischen 0,5 - 500 ng/μl, bevorzugt zwischen 1,0 - 100 ng/μl und besonders bevorzugt zwischen 1,0 - 50 ng/μl liegen. Die im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugte Konzentration beträgt 1 - 10 ng jedes verwendeten Nukleinsäuresondemnoleküls pro μl Hybridisierungslösung. Das verwendete Volumen der Hybridisierungslösung sollte zwischen 8 μl und 100 ml liegen, bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungs gemäßen Verfahren beträgt es 30 μl.
Die Dauer der Hybridisierung beträgt üblicherweise zwischen 10 Minuten und 12 Stunden; bevorzugt erfolgt die Hybridisierung für etwa 1,5 Stunden. Die Hybridisierungstemperatur beträgt bevorzugt zwischen 44 °C und 48 °C, besonders bevorzugt 46 °C, wobei der Parameter der Hybridisierungstemperatur, wie auch die Konzentration an Salzen und Detergenzien in der Hybridisierungslösung in Abhängigkeit von den Nukleinsäuresonden, insbesondere deren Längen und dem Grad der Komplementarität zur Zielsequenz in der nachzuweisenden Zelle optimiert werden kann. Der Fachmann ist mit hier einschlägigen Berechnungen vertraut.
Nach erfolgter Hybridisierung sollten die nicht hybridisierten und überschüssigen Nuklemsäuresondenmoleküle entfernt bzw. abgewaschen werden, was üblicherweise mittels einer herkömmlichen Waschlösung erfolgt. Diese Waschlösung kann, falls gewünscht, 0,001-0,1 % eines Detergens wie SDS, bevorzugt 0,005 - 0,05 %, besonders bevorzugt 0,01 %, sowie Tris-HCl in einer Konzentration von 0,001- 0,1 mol/1, bevorzugt 0,01 - 0,05 mol/1, besonders bevorzugt 0,02 mol/1 enthalten, wobei der pH- Wert von Tris-HCl im Bereich von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise bei 7,0 - 8,0, besonders bevorzugt bei 8,0 liegt. Ein Detergens kann enthalten sein, ist aber nicht zwingend erforderlich. Weiter enthält die Waschlösung üblicherweise NaCl, wobei die Konzentration je nach benötigter Stringenz von 0,003 mol/1 bis 0,9 mol/1, bevorzugt von 0,01 mol/1 bis 0,9 mol/1, beträgt. Besonders bevorzugt ist eine NaCl- Konzentration von 0,07 mol/1 (Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria und der Spezies L. monocytogenes) bzw. von 0,215 mol/1 (Verfahren zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies S. aureus) bzw. von 0,215 mol/1 (Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Campylobacter und der Spezies C. coli und C. jejuni). Des Weiteren kann die Waschlösung EDTA enthalten, wobei die Konzentration vorzugsweise 0,005 mol/1 beträgt. Ferner kann die Waschlösung auch dem Fachmann geläufige Konservierungsmittel in geeigneten Mengen enthalten.
Allgemein kommen bei dem Waschschritt Pufferlösungen zum Einsatz, die prinzipiell sehr ähnlich aussehen kömien, wie Hybridisierungspuffer (gepufferte Natriumchloridlösung), nur dass der Waschschritt in der Regel in einem Puffer mit niedrigerer Salzkonzentration, bzw. bei höherer Temperatur durchgeführt wird. Zur theoretischen Abschätzung der Hybridisierungsbedingungen kann folgende Formel verwendet werden:
Td = 81,5 + 16,6 lg[Na+] + 0,4 x (% GC) - 820/n - 0,5 X (% FA)
Td = Dissoziationstemperatur in °C
[Na+] = Molarität der Natriumionen
% GC = Anteil der Guanin- und Cytosinnukleotide an der Anzahl der Basen n = Länge des Hybrids
% FA= Formamidgehalt
Mit Hilfe dieser Formel kann z.B. der Formamidanteil (der wegen der Toxizität des
Formamids möglichst gering sein sollte) des Waschpuffers ersetzt werden durch einen entsprechend niedrigeren Natriumchloridgehalt. Allerdings ist dem Fachmann aus der umfangreichen Literatur zu in situ-Hybridisierungsmethoden bekannt, dass und aufweiche Weise die genannten Bestandteile variiert werden können. Bezüglich der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen gilt das oben im Zusammenhang mit dem Hybridisierungspuffer Gesagte.
Das „Abwaschen" der nicht gebundenen Nuklemsäuresondenmoleküle erfolgt üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 44 °C bis 52 °C, bevorzugt von 44 °C bis 50 °C und besonders bevorzugt bei 46 °C für eine Dauer von 10 bis 40 Minuten, vorzugsweise für 15 Minuten.
In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle im sog. Fast-FISH- Verfahren zum spezifischen Nachweis der angegebenen Ziel-Organismen eingesetzt. Das Fast- FISH- Verfahren ist dem Fachmann bekannt und z.B. in den Patentanmeldungen DE 199 36 875 und WO 99/18234 beschrieben. Auf diese Dokumente wird hinsichtlich deren Offenbarung zur Durchführung der dort beschriebenen Nachweis- verfahren hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Die spezifisch hybridisierten Nuklemsäuresondenmoleküle können anschließend in den jeweiligen Zellen detektiert werden. Voraussetzung hierfür ist, dass das Nukleinsäuresondenmolekül nachweisbar ist, z.B. dadurch dass das Nuklein- säuresondenmolekül durch kovalente Bindung mit einen Marker verknüpft ist. Als detektierbare Marker werden z.B. fluoreszierende Gruppen wie z.B. CY2 (erhältlich von Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3 (ebenfalls erhältlich von Amersham Life Sciences), CY5 (ebenfalls zu beziehen von Amersham Life Sciences), FITC (Molecular Probes Inc., Eugene, USA), FLUOS (erhältlich von Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), TRITC (erhältlich von
Molecular Probes ie. Eugene, USA), 6-FAM oder FLUOS-PRTME verwendet, die dem Fachmann alle wohlbekannt sind. Auch chemische Marker, radioaktive Marker oder enzymatische Marker wie Meerrettich-Peroxidase, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, können verwendet werden. Für jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die anstelle des natürlichen Substrates umgesetzt werden können, und entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können. Beispiele für solche Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben: Tabelle
Enzyme Cl romogen
1. Alkalische Phosphatase und 4-Methylumbelliferylphosphat (*), saure Phosphatase Bis(4-Methyiumbelliferylphosρhat), (*) 3-O- Methylfluoreszein, Flavon-3- Diphosphattriammoniumsalz (*), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz
2. Peroxidase Tyraminhydrochlorid (*), 3-(p-Hydroxyphenyl)- Propionsäure (*), p-Hydroxyphenethyl- alkohol(*),
2,2'-Azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure (ABTS), ortho-Phenylendiamindihydrochlorid, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, p-Ucresol(*),
3,3'-dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2- benzothiazolinhydrazon, Tetramethylbenzidin 3. Meerrettichperoxidase H2O + Diammoniumbenzidin H2O + Tetramethylbenzidin
4. ß-D-Galaktosidase o-Nitrophenyl-ß-D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-ß-D-galaktosid
5. Glukoseoxidase ABTS, Glukose und Thiazolylblau
*Fluoreszenz
Schließlich ist es möglich, die Nukleinsäuresondenmoleküle so zu gestalten, dass an ihrem 5 '- oder 3 '-Ende eine weitere zur Hybridisierung geeignete Nukleinsäure- sequenz vorhanden ist. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst wiederum ca. 15 bis 1.000, bevorzugt 15 - 50 Nukleotide. Dieser zweite Nukleinsäurebereich kann wiederum von einem Nukleinsäuresondenmolekül erkannt werden, welches durch eines der oben erwähnten Mittel nachweisbar ist.
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der nachweisbaren Nukleinsäuresondenmoleküle mit einem Hapten, das anschließend mit einem das Hapten erkennenden Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Als Beispiel für solch ein Hapten kann Digoxigenin angeführt werden. Dem Fachmann sind über die angegebenen Beispiele auch noch weitere wohlbekannt.
Die abschließende Auswertung ist abhängig von der Art der Markierung der verwendeten Sonde möglich mit einem Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer u.a.
Ein wichtiger Vorteil der in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria und der Spezies L. monocytogenes oder zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies S. aureus oder zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Campylobacter und der Spezies C. coli und C. jejuni gegenüber den weiter oben beschriebenen Nachweismethoden ist die außergewöhnliche Schnelligkeit. Im Vergleich zu herkömmlichen Kultivierungsverfahren, die bis zu zehn Tagen benötigen, liegt das Ergebnis bei Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren innerhalb von 24 - 48 Stunden vor.
Ein weiterer Vorteil liegt im gleichzeitigen Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria und der Spezies L. monocytogenes. Mit bislang geläufigen Verfahren werden lediglich Bakterien der Spezies L. monocytogenes mit mehr oder weniger großer Zuverlässigkeit nachgewiesen. Epidemiologische Untersuchungen haben aber gezeigt, dass neben L. monocytogenes auch andere Spezies der Gattung Listeria die gefährliche Listeriose auslösen können. Der alleinige Nachweis von
L. monocytogenes ist daher nach dem heutigen Kenntnisstand nicht ausreichend.
Ein weiterer Vorteil liegt in der Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Bakterien der Gattung Listeria und denen der Spezies L. monocytogenes. Diese ist durch die Verwendung unterschiedlicher Markierungen für die jeweiligen Gattungs- bzw. Spezies-spezifischen Nukleinsäuresondenmoleküle leicht und zuverlässig möglich.
Ein weiterer Vorteil liegt in der Spezifität dieser Verfahren. Durch die verwendeten Nukleinsäuresondenmoleküle können sowohl spezifisch sämtliche Arten der Gattung Listeria, aber auch hochspezifisch nur die Spezies L. monocytogenes nachgewiesen und visualisiert werden. Ebenso zuverlässig wird die Spezies S. aureus und werden sämtliche Arten der Gattung Campylobacter, aber auch hochspezifisch nur die Spezies C. coli bzw. C. jejuni nachgewiesen.
Ein weiterer Vorteil liegt in der Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Bakterien der Gattung Campylobacter und denen der Spezies C. coli bzw. C. jejuni. Diese ist durch die Verwendung unterschiedlicher Markierungen für die jeweiligen Gattungsbzw. Spezies-spezifischen Nukleinsäuresondenmoleküle leicht und zuverlässig möglich.
Durch die Visualisierung der Bakterien kann eine gleichzeitige visuelle Kontrolle stattfinden. Falsch positive Ergebnisse, wie sie häufig bei der Polymerase-Ketten- Reaktion auftreten, sind somit ausgeschlossen.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren liegt in der leichten Handhabbarkeit. So können durch die Verfahren leicht große Mengen an Proben auf das Vorhandensein der genannten Bakterien getestet werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können vielfältig angewendet werden. So können beispielsweise Lebensmittelproben (z.B. Geflügel, Frischfleisch, Milch, Käse, Gemüse, Früchte, Fisch u.a.) auf die Anwesenheit der nachzuweisenden Bakterien untersucht werden.
Auch können beispielsweise Umweltproben auf das Vorhandensein der nachzuweisenden Bakterien untersucht werden. Diese Proben können hierzu z.B. aus dem Boden entnommen oder auch Teile von Pflanzen sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter zur Untersuchung von Abwasserproben oder Silageproben eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter zur Untersuchung medizinischer Proben, z.B. von Stuhlproben, Blutkulturen, Sputum, Gewebeproben (auch Schnitte), Wundmaterial, Urin, Proben aus dem Respirationstrakt, Implantate und Katheter- oberflächen eingesetzt werden.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Kontrolle von Lebensmitteln. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Lebensmittelproben aus Milch oder Milchprodukten (Joghurt, Käse, Quark, Butter, Buttermilch), Trinkwasser, Getränken (Limonaden, Bier, Säfte), Backwaren oder Fleischwaren entnommen.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Untersuchung pharmazeutischer und kosmetischer Produkte, z.B. Salben, Cremes, Tinkturen, Säfte, Lösungen, Tropfen etc.
Erfindungsgemäß werden weiterhin Kits zur Durchführung der entsprechenden Verfahren zur Verfügung gestellt. Die in diesen Kits enthaltene Hybridisierungs- anordnung ist z.B. in der deutschen Patentanmeldung 100 61 655.0 beschrieben. Auf die in diesem Dokument enthaltene Offenbarung bezüglich der in situ-Hybridi- sierungsanordnung wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Außer der beschriebenen Hybridisierungsanordnung (als VIT-Reaktor bezeichnet) umfassen die Kits als wichtigsten Bestandteil die j eweilige Hybridisierungslösung mit den weiter oben beschriebenen für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Nukleinsäuresondenmolekülen (VIT-Lösung). Weiterhin ist jeweils enthalten der entsprechende Hybridisierungspuffer (Solution C) und ein Konzentrat der entsprechenden Waschlösung (Solution D). Weiterhin sind enthalten gegebenenfalls Fixierungslösungen (Solution A (50% Ethanol) und Solution B
(Ethanol absolut)) sowie gegebenenfalls eine Einbettlösung (Finisher). Finisher sind im Handel erhältlich, sie verhindern u.a. das rasche Ausbleichen fluoreszierender Sonden unter dem Fluoreszenzmikroskop. Gegebenenfalls sind Lösungen zur parallelen Durchführung einer Positivkontrolle (Positive Control) sowie einer Negativkontrolle (Negative Control) enthalten.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, ohne sie einzuschränken. Die verwendeten Puffer und Lösungen haben die oben angegebenen Zusammensetzungen.
Beispiel
Spezifischer Schnellnachweis pathogener lebensmittelrelevanter Bakterien in einer Probe
Eine Probe wird in geeigneter Weise 20 - 44 h kultiviert. Zum Nachweis von Listerien kann die Kultivierung z.B. in V_ Fraser-Bouillon für 24 h bei 30 °C erfolgen. Zum Nachweis von S. aureus kann die Kultivierung z.B. als Blutkultur (z.B. BACTEC 9240, Becton Dickinson Instruments) für 8 h bis 48 h bei 35 °C erfolgen. Zum Nachweis von Campylobacter kann die Kultivierung z.B. in Selektivmedium nach Preston für 24 h bei 42 °C erfolgen.
Zu einem Aliquot der Kultur wird dasselbe Volumen Fixierungslösung (Solution B) zugegeben. Alternativ kann auch ein Aliquot der Kultur zentrifugiert werden
(4.000 g, 5 min, Raumtemperatur) und, nach Verwerfen des Überstandes, das Pellet in 4 Tropfen Fixierungslösung aufgenommen werden.
Zur Durchführung der Hybridisierung wird ein geeignetes Aliquot der fixierten Zellen (bevorzugt 40 μl) auf einen Objektträger aufgebracht und getrocknet (46 °C, 30 min oder bis vollständig trocken). Alternativ können die Zellen auch auf andere Trägermaterialien (z. B. eine Mikrotite latte oder einen Filter) aufgebracht werden. Anschließend werden die getrockneten Zellen vollständig dehydratisiert durch erneuten Zusatz der Fixierungslösung (Solution B, bevorzugt 40 μl). Der Objekt- träger wird erneut getrocknet (Raumtemperatur, 3 min oder bis vollständig trocken).
Anschließend wird auf die fixierten, dehydratisierten Zellen die Hybridisierungslösung (VIT-Lösung) mit den weiter oben beschriebenen für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Nukleinsäuresondenmolekülen aufgebracht. Das bevorzugte Volumen beträgt 40 μl. Der Objektträger wird anschließend in einer mit Hybridisierungspuffer (Solution C, entspricht der Hybridisierungslösung ohne Sondenmoleküle) befeuchteten Kammer, bevorzugt dem VIT-Reaktor, inkubiert (46°C, 90 min).
Anschließend wird der Objektträger aus der Kammer entnommen, die Kammer mit Waschlösung befüllt (Solution D, 1:10 verdünnt in destilliertem Wasser) und der Objektträger in dieser inkubiert (46 °C, 15 min). Anschließend wird die Kammer mit destilliertem Wasser befüllt, der Objektträger kurz eingetaucht und anschließend in seitlicher Stellung luftgetrocknet (46 °C, 30 min oder bis vollständig trocken).
Anschließend wird der Objektträger in einem geeigneten Medium (Finisher) eingebettet.
Abschließend wird die Probe mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops analysiert.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Oligonukleotid zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria und der Spezies L. monocytogenes mit einer Nukleinsäure- sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (sämtliche Sequenzen in 5'->3'-Richtung): i)
SEQ ID Nr. 1 5"- ggc ttg cac egg cag tea et SEQ DO Nr. 2 5'- egg ctt aca ccg gca gtc act
SEQ ID Nr. 3 5 Λ - cec ttt gta eta tec att gta
SEQ ID Nr. 4 5λ- cec ttt gta cca tec att gta
SEQ ID Nr. 5 5 ' - cec ttt gta tta tec att gta g
SEQ ID Nr. 6 5'- cec ttt gta ctg tec att gta
ii) Oligonukleotiden, die mit einem der Ohgonukleotide unter i) in mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80 % und besonders bevorzugt mindestens 90 %, 92 %, 94 %, 96 % der Basen übereinstimmen und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von Bakterien der Gattung Listeria und/oder der Spezies L. monocytogenes ermöglichen, iii) Oligonukleotiden, die sich von einem der Ohgonukleotide unter i) und ii) dadurch unterscheiden, dass sie um mindestens ein Nukleotid verlängert sind, iv) Oligonukleotiden, die mit einer Sequenz, die zu einem Oligonukleotid unter i), ii) und iii) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
2. Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies S. aureus mit einer Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (sämtliche Sequenzen in 5 '->3' -Richtung): i) SEQ ID Nr.7: 5'- GAA GCAAGC TTC TCGTCC G SEQ ID Nr. 8: 5>''- GGA GCA AGC TCC TCGTCC G
SEQ ID Nr. 9: 5>''- GAA GCAAGC TTC TCG TCA TT
SEQ ID Nr. 10: 5>''- CTA ATG CAG CGC GGA TCC
SEQ TD Nr. 11: 5>''- CTA ATG CAC CGC GGA TCC
SEQ ID Nr. 12: 5>''- CTAATG CGG CGC GGATCC
SEQ ID Nr. 13: 5>''- CTA ATG CAG CGC GGG TCC
ii) Oligonukleotiden, die mit einem der Ohgonukleotide unter i) in mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80 % und besonders bevorzugt mindestens 90 %, 92 %, 94 %, 96 % der Basen übereinstimmen und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen der Spezies S. aureus ermöglichen, iii) Oligonukleotiden, die sich von einem der Ohgonukleotide unter i) und ii) dadurch unterscheiden, dass sie um mindestens ein Nukleotid verlängert sind, iv) Oligonukleotiden, die mit einer Sequenz, die zu einem Oligonukleotid unter i), ii) und iii) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
3. Oligonukleotid zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Campylobacter und der Spezies C. coli und/oder C. jejuni mit einer Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (sämtliche Sequenzen in 5 ' ->3 ' -Richtung) :
SEQ JD NR.16 5' CTG CCT CTC CCT CAC TCT AG SEQ ID NR.17 5' CTG CCT CTC CCT TAC TCT AG SEQ JD NR.18 5' CTG CCT CTC CCC TAC TCT AG SEQ ID NR.19 5' CTG CCT CTC CCC CAC TCT AG SEQ ID NR.20 5' CCT ACC TCT CCC ATA CTC TAGA SEQ ID NR.21 5' CCA TCC TCT CCC ATA CTC TAG C SEQ ID NR.22 5' CCT ACC TCT CCA GTA CTC TAGT SEQ ID NR.23 5' CCT GCC TCT CCC ACA CTC TAGA SEQ ID NR.24 5' CGC TCC GAAAAG TGT CAT CCT C SEQ ID NR.25 5' CTA AAT ACG TGG GTT GCG
SEQ ID NR.26 5' CTA AAC ACG TGG GTT GCG
SEQ ID NR.27 5' AGC AGA TCG CCT TCG CAA T
SEQ ID NR.28 5' AGC AGA TCG CTT TCG CAA T SEQ ID NR.29 5' AGT AGA TCG CCT TCG CAA T
SEQ ID NR.30 5' TCG AGT GAA ATC AAC TCC C
SEQ ID NR.31 5' TCG GGT GAA ATC AAC TCC C
SEQ ID NR.32 5' CGT AGC ATG GCT GAT CTA C
SEQ ID NR.33 5' CGT AGC ATA GCT GAT CTA C SEQ ID NR.34 5' CGT AGC ATT GCT GAT CTA C
SEQ ID NR.35 5' GCC CTG ACT AGC AGA GCA A
SEQ ID NR.36 5' TTC TTG GTG ATC TCT ACG G
SEQ ID NR.37 5' TTC CTG GTG ATC TCT ACG G
SEQ ID NR.38 5' TTC TTG GTG ATA TCT ACG G SEQ JX) NR.39 5' TTG AGT TCT AGC AGA TCG C
SEQ LD NR.40 5' TTG AGT TCC AGC AGA TCG C
SEQ LD NR.41 5' TTG AGT TCT AGC AGA TAG C
SEQ ID NR.42 5' TTGAGT TCC AGC AGA TAG C
SEQ ID NR.43 5' CGC GCC TTA GCG TCA GTT GAG SEQ ID NR.44 5' CAC GCC TTA GCG TCA GTT GAG
SEQ LD NR.45 5' CGC GCC TTA GCG TCA GTT AAG
SEQ LD NR.46 5' CAC GCA TTA GCG TCA GTT GAG
SEQ ID NR.47 5' CGA GCA TTA GCG TCA GTT GAG
SEQ ID NR.48 5' TAC ACT AGT TGT TGG GGT GG SEQ ID NR.49 5' TTC GCG CCT CAG CGT CAG TTA CAG
ii) Oligonukleotiden, die mit einem der Ohgonukleotide unter i) in mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80 % und besonders bevorzugt mindestens 90 %, 92 %, 94 %, 96 % der Basen übereinstimmen und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von Bakterien der Gattung Campylobacter und/oder der Spezies C. coli und/oder C. jejuni ermöglichen, iii) Oligonukleotiden, die sich von einem der Ohgonukleotide unter i) und ii) dadurch unterscheiden, dass sie um mindestens ein Nukleotid verlängert sind, iv) Oligonukleotiden, die mit einer Sequenz, die zu einem Oligonukleotid unter i), ii) und iii) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
4. Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria und der Spezies L. monocytogenes in einer Probe, umfassend die Schritte: a) Kultivieren der in der Probe enthaltenen pathogenen lebensmittelrelevanten Bakterien, b) Fixieren der in der Probe enthaltenen pathogenen lebensmittelrelevanten Bakterien, c) Inkubieren der fixierten Bakterien mit mindestens einem Oligonukleotid nach Anspruch 1, um eine Hybridisierung herbeizuführen, d) Entfernen nicht hybridisierter Ohgonukleotide, e) Detektieren und Visualisieren sowie gegebenenfalls Quantifizieren der pathogenen lebensmittelrelevanten Bakterienzellen mit den hybridisierten Oligonukleotiden.
5. Verfahren zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies S. aureus in einer Probe, umfassend die Schritte: a) Kultivieren der in der Probe enthaltenen pathogenen lebensmittelrelevanten Bakterien, b) Fixieren der in der Probe enthaltenen pathogenen lebensmittelrelevanten Bakterien, c) Inkubieren der fixierten Bakterien mit mindestens einem Oligonukleotid nach Anspruch 2, um eine Hybridisierung herbeizuführen, d) Entfernen nicht hybridisierter Ohgonukleotide, e) Detektieren und Visuahsieren sowie gegebenenfalls Quantifizieren der pathogenen lebensmittelrelevanten Bakterienzellen mit den hybridisierten Oligonukleotiden.
6. Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Campylobacter und der Spezies C. coli und/oder C. jejuni in einer Probe, umfassend die Schritte: a) Kultivieren der in der Probe enthaltenen pathogenen lebensmittelrelevanten Bakterien, b) Fixieren der in der Probe enthaltenen pathogenen lebensmittelrelevanten Bakterien, c) Inkubieren der fixierten Bakterien mit mindestens einem Oligonukleotid nach Anspruch 3, um eine Hybridisierung herbeizuführen, d) Entfernen nicht hybridisierter Ohgonukleotide, e) Detektieren und Visuahsieren sowie gegebenenfalls Quantifizieren der pathogenen lebensmittelrelevanten Bakterienzellen mit den hybridisierten Oligonukleotiden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Probe eine Lebensmittelprobe ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei das Detektieren mittels Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer, Durchflusszytometer erfolgt.
9. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 4, enthaltend mindestens ein Oligonukleotid nach Anspruch 1.
10. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 5, enthaltend mindestens ein Oligonukleotid nach Anspruch 2.
11. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 6, enthaltend mindestens ein Oligonukleotid nach Anspruch 3.
12. Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , in dem das mindestens eine Oligonukleotid in einer Hybridisierungslösung enthalten ist.
13. Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 12, weiter enthaltend eine Waschlösung und ggf. eine oder mehrere Fixierungslösungen.
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