DE10149803A1

DE10149803A1 - Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Bakterienzellen

Info

Publication number: DE10149803A1
Application number: DE2001149803
Authority: DE
Inventors: Stefan Miller; Thomas Zander; Renate Grasl; Ingrid Robl; Michael Schuetz
Original assignee: Profos AG
Current assignee: Profos AG
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2001-10-09
Publication date: 2003-04-24
Also published as: ES2367478T3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Bakterienzellen mittels kationischer Polymere und magnetischer Träger.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Bakterienzellen mittels kationischer Polymere und magnetischer Träger.
Ausgangspunkt fast jeder Weiterverarbeitung, Analyse oder Isolierung von Zellbestandteilen ist die Anreicherung der Zellen, die "Zellernte". Diese wird üblicherweise mittels Zentrifugation durchgeführt. Dieser Zentrifugationsschritt stellt das Hauptproblem bei der vollständigen Automatisierung von Verfahren, wie der Plasmidaufreinigung dar, da neben dem hohen technischen Aufwand zur Integration einer Zentrifuge in einem entsprechenden Verarbeitungsroboter eine extrem hohe Präzision bei Start- und Stop-Position des Zentrifugationsvorganges benötigt wird. Automatische Verfahren der Weiterverarbeitung, Analyse oder Isolierung von Zellbestandteilen beginnen daher in der Regel mit bereits ausserhalb des Verarbeitungsroboters angereicherten, abzentrifugierten oder sedimentierten Zellen. Jedoch ist zum Beispiel für eine schnelle Analyse von vollständigen Genomen, Proteomen, aber auch der raschen Struktur- und Funktionsaufklärung in Hochdurchsatzverfahren eine möglichst vollständige Automatisierung der dabei relevanten Verfahren essentiell. Dabei ist die Automatisierung von Teilschritten z. B. in der Genomanalyse bereits weit fortgeschritten: Sowohl die Bakterienanzucht, als auch die Plasmidisolierung können automatisch durchgeführt werden. Eine einfache, kostengünstige, vollständige Automatisierung des Verfahrens einschließlich der Zellernte ist bisher jedoch nicht durchführbar.
Das Standardverfahren der Zellernte ist die Abzentrifugation der Bakterienkulturen. Dazu ist gerade bei Verfahren, die für höheren Durchsatz ausgelegt werden sollen, eine Mikrotiterplattenzentrifuge nötig.
Ein alternatives Verfahren bedient sich der Anreicherung der kultivierten Zellen über Filtermembranen siehe z. B. WO 01/51206, 3M Innovative Properties Co (US) und US 5,464,541, Diagen Inst. f Molekularbiologie, jedoch ist das Verfahren bei hochangereicherten Zellsuspensionen und der damit einhergehenden hohen Viskosität der Lösungen sehr störanfällig bezüglich Verstopfungen. Ähnliches gilt für ionenaustauscher-ähnliche Bindung an eine poröse Matrix kombiniert mit Filtrations- oder Vakuumtechniken (WO 92/07863, Qiagen). Dies kann gerade automatische Verfahren vor große Probleme stellen.
Eine Anreicherung von Mikroorganismen mittels Magnetpartikel-basierten Verfahren ist prinzipiell zur Automatisierung geeignet. Bislang wurden drei Anreicherungsverfahren für Bakterien beschrieben, die allerdings deutliche Nachteile in punkto Stammspezifität und Herstellungskosten aufweisen.
EP 1 118 676 A2, Chemagen AG und WO 01/53525 A2, Genpoint AS beschreiben ein Verfahren zur Anreicherung von Mikroorganismen an einer Festphase über einen nichtspezifischen Liganden, der an dieser Festphase kovalent oder nicht-kovalent immobilisiert ist. Festphasen im Sinne dieses Verfahrens sind Polyvinylalkoholbeads die magnetisch oder nicht magnetisch sein können. Als Liganden werden im Sinne dieses Verfahrens Moleküle betrachtet, die den Mikroorganismen als Nährstoffe dienen können. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass man bestimmte Liganden an einem Träger immobilisieren muss, was zu einer deutlichen Erhöhung der Herstellungskosten führt. Ein weiterer Nachteil besteht darin, das für verschiedene Stämme unter Umständen verschiedene Liganden immobilisiert werden müssen, die Magnetbeads und somit das Verfahren nicht universell einsetzbar sind.
In einer weiteren Anmeldung, nämlich WO 98/51693, Genpoint, werden zur Anreicherung von Bakterien an Magnetpartikel Gemische aus Salzen, Alkoholen und Polyethylenglykol oder mit Polyethylenglykol vergleichbaren Polymere beschrieben. Das in WO 98/51693 beschriebene Verfahren benötigt 5-20 Minuten und Polymerzugaben von 2-50% (w/v). Diese hohen Konzentrationen von Salzen oder Polymeren bereiten Probleme in der Weiterverarbeitung der Bakterien, da z. B. Polyethylenglykol bei 30% sehr zähflüssig ist, oder hohe Salzkonzentrationen bei SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese störend wirken.
WO 00/29562, Merck Patent GmbH, beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid- DNA aus Mikroorganismen durch a) Ansäuern der Mikroorganismenkultur, Inkubation und Mischung mit den Festphasenkörpern (Silica-Magnetpartikeln) und b) anschliessende Plasmidaufreinigung. Dieses Verfahren ist jedoch nicht für alle E. coli-Stämme ohne z. T. drastische Ausbeuteverluste durchführbar. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens liegt in der benötigten Beadmenge, da die Beadkosten den Schwerpunkt der Bakterienanreicherungskosten ausmachen und insbesondere Silica-Beads relativ teuer sind. Da Silica-Beads auch prinzipiell DNA binden können, können auch Ausbeuteverluste bei der Plasmidisolierung mit Silicabeads beobachtet werden.
Eine Reihe von Untersuchungen hatte gezeigt, das kationische Polymere mit Bakterien interagieren können. Experimente hatten z. B. ergeben, das kationische Polymere wie z. B. Chitosan (Chitosan ist deacetyliertes Chitin) sich gut zum Verkapseln oder "Eingiessen" lebender mikrobieller Zellen für Einzelzellexperimente eignen (siehe z. B. Methods Enzymol. 1987, Vol. 135, 259-268, oder US 5,489,401). Chitosan findet auch Verwendung für die Verkapselung von aktiven Biomaterialien in Beadpolymeren (US 4,647,536 und WO 01/46266). Chitosan findet auch - gegebenenfalls auch in modifizierter Form - Verwendung als Beschichtung von Artikeln oder Testkits für Immunoassays (US 5,208,166).
Veröffentlichungen zum Einfluß kationischer Polymere auf die Hydrophobizität von mikrobiellen Zellwänden hatten jedoch gezeigt, das die Adhäsion an hydrophobe Oberflächen bei pH-Werten oberhalb von 3 zwar deutlich zunahm, bei pH-Werten kleiner 3 jedoch auf fast 0% abnahm (Ref.: Goldberg, S., Doyle, R. J. und Rosenberg, M., 1990, J. Bacteriol. Vol. 172, 5650-5654).
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass ein einfaches Verfahren zur effizienten, schnellen, kostengünstigen Anreicherung von Bakterienzellen, das ohne einen Zentrifugationsschritt auskommt, und das gleichzeitig für ein breites Spektrum von Bakterien verwendet werden kann, nicht zur Verfügung steht. Daher besteht die Aufgabe der Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur unspezifischen Anreicherung von Bakterienzellen, das ohne Zentrifugationsschritt auskommt.
Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert:
Fig. 1 zeigt das Ergebnis der Ausbeute der Zellernte mit verschiedenen Magnetpartikeln. Ernte der E. coli Stämme LE392 und TG2. Dazu wurden je 200 µl Zellen mit 20 µl Chitosan working solution und 10 µl der jeweiligen Beads (je 1%) gemischt, 5 min bei RT inkubiert und die Zell-Bead-Komplexe auf dem Magnetseparator abgetrennt. Die Ausbeute wurde aus dem Verhältnis der optischen Dichte (OD) des Überstands und der OD der eingesetzten Zellsuspension bestimmt. Silica: MagPrep Silica Beads der Firma MERCK. NH2: Amino- Polystyrol-Beads der Firma Estapor. COOH: Carboxy-Polystyrol-Beads der Firma Estapor. PS: Polystyrol-Beads der Firma Spherotech. PVA: Polyvinylalkohol-Beads der Firma Chemagen.
Fig. 2 zeigt das Ergebnis der Ausbeute der Zellernte bei saurem pH-Wert mit Silica-Beads (dunkler Balken) und Chitosan/Amino-Polystyrolbeads (heller Balken). In Fig. 2 wird die Zellernte-Ausbeute des erfindungsgemäßen Verfahrens (heller Balken) mit dem Verfahren aus WO 00/29562 (dunkler Balken) verglichen. Die Zellausbeuten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind dabei auf 100% gesetzt, die Ausbeuten nach WO 00/29562 wurden relativ dazu bestimmt. Alle Werte sind Mittelwerte aus mehreren Experimenten mit Standardabweichungen. Die Zellernte nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde wie im Anwendungsbeispiel 3 durchgeführt. Für WO 00/29562/MERCK wurde die Vorschrift des Herstellers befolgt.
Fig. 3 zeigt das Ergebnis der Ernte verschiedener Bakterienarten. Fig. 3 zeigt, dass das erfindungsgemäße Zellerntesystem für ein breites Spektrum von Bakterien mehrerer Gruppen (sowohl gram-negativer als auch gram-positiver) angewandt werden kann. Aufgetragen ist jeweils die Ausbeute der Zellernte. Die Zellen wurden wie im Anwendungsbeispiel 7 aufgeführt geerntet. E. faecalis: Enterococcus faecalis, B. vallismortis: Bacillus vallismortis, P. mirabilis: Proteus mirabilis, M. luteus: Micrococcus luteus, S. haemolyticus: Staphylococcus haemolyticus, C. freundii: Citrobacter freundii.
Fig. 4 zeigt das Ergebnis der Ausbeute-Effizienz anhand einer Auswahl von 15 E. coli Klonierungsstämmen. Es wurden je 200 µl Zellen mit 20 µl Chitosan working solution und 10 µl Amino-Polystyrol Beads (1%) gemischt, 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und die Zell- Beads-Komplexe auf dem Magnetseparator abgetrennt. Die Ausbeute wurde aus dem Verhältnis der optischen Dichte des Überstands und der OD der eingesetzten Zellsuspension bestimmt. Aufgetragen sind Mittelwerte und dazugehörige Standardabweichungen aus mehreren verschiedenen Experimenten (n = 27; ausser Stamm InvaF (n = 9) und Top10 (n = 12)).
Fig. 5 zeigt das Ergebnis der Ausbaute für den Stamm JM83 bei Verwendung Polylysin/Säure im Vergleich zu Säure. Es wurden je 200 µl Zellen mit 20 µl Polylysin working solution bzw. 20 µl 0.5 N HCl und 10 µl Amino-Polystyrol Beads (1%) gemischt, 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und die Zell-Beads-Komplexe auf dem Magnetseparator abgetrennt.
Der hier verwendete Ausdruck "Aufreinigung" oder "Anreicherung" bedeutet das Trennen von Bakterienzellen oder Zellbestandteilen von der wässrigen Lösung, z. B. dem Kulturmedium, in der sich die Bakterienzellen oder Zellbestandteile befinden. Das Aufreinigen oder Anreichern wird dabei mit Hilfe von Magnetpartikeln durchgeführt.
Der hier verwendete Ausdruck "unspezifische Anreicherung" bedeutet, dass die Anreicherung unter den gewählten Bedingungen unabhängig von Art, Stamm, Gattung etc. der Bakterien durchgeführt wird.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur unspezifischen Aufreinigung von Bakterienzellen, umfassend die folgenden Schritte:

a) In Kontakt bringen von einer Bakterienzellen enthaltenden Probe mit kationischen Polymeren bei einem sauren pH-Wert oder anionischen Polymeren bei einem basischen pH-Wert,
b) Zugabe eines magnetischen Trägers,
c) Abtrennen des magnetischen Trägers mit den daran gebundenen Bakterienzellen von der Probe.

Im Einzelnen ist das Verfahren durch die folgenden Schritte näher gekennzeichnet:
Die Bakterienkultur wird mit kationischen oder anionischen Polymeren versetzt, insbesondere mit unverzweigten kationischen Polymeren, vorzugsweise mit Chitosan (z. B. FLUKA-Art. Nr. 22741, 22742 oder 22743, Sigma C-3646 oder Roth 5375.1) oder Polylysin (z. B. Sigma P2636). Bevorzugte anionische Polymere sind Dextransulfat, Chondroitinsulfat, Polyglutamat, Polymalat, Polygalacturonsäure, Polyphosphate und sulfatierte Oligosaccharide.
Die Bakterienkultur/Polymer-Mischung muß einen entsprechend den eingesetzten Polymeren bestimmten pH-Wert haben. Der pH-Wert ist bei kationischen Polymeren kleiner oder gleich 3, bei anionischen Polymeren größer oder gleich 8. Der pH-Wert kann entweder vor Zugabe der Polymere durch Einstellen der Bakterienkultur mittels Zugabe von Pufferlösungen oder direkt von Säure oder Base auf den gewünschten pH-Wert gebracht werden. Der pH-Wert kann ferner dadurch eingestellt werden, dass die Polymere in einer entsprechenden Pufferlösung oder direkt in Säure oder Base gelöst sind. Der pH-Wert kann ferner dadurch eingestellt werden, dass nach Zugabe der Polymere durch Einstellen der Bakterienkultur/Polymer-Mischung mittels Zugabe von Pufferlösungen oder direkt von Säure oder Base auf den gewünschten pH-Wert gebracht werden.
Die kationischen Polymere können in saurem Puffer oder direkt in Säure gelöst sein. Die Lösung ist so eingestellt, das die Mischung aus Bakterienkultur und kationischen Polymeren den für das Verfahren gewünschten pH-Wert ergibt. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist ein saurer pH-Wert der Bakterienkultur/Polymer-Mischung bevorzugt, besonders ein pH- Wert kleiner oder gleich 3, insbesondere ein pH-Wert im Bereich von 2-3. Der pH-Wert kann mit beliebigen Puffer oder Säure eingestellt werden, bevorzugt mit 0,5N HCl/25% HAc oder 0,5N HCl. Der gewünschte pH-Wert ist dabei abhängig von der Art der Weiterverarbeitung der Bakterien bzw. dem anschließenden Verfahren. So darf ein pH-Wert z. B. bei einer anschließenden Plasmidaufreinigung nicht kleiner als 1,8 sein, da ansonsten die DNA hydrolysiert wird.
Die kationischen Polymere liegen in einem Konzentrationsbereich vor, in dem eine ausreichende Aufreinigung der Bakterien gewährleistet ist. Polylysin wird für die Fällung mit einer Konzentration im Bereich von 12,5 µg/ml Kultur bis 150 µg/ml Kultur eingesetzt, vorzugsweise mit einer Konzentration im Bereich von 25 µg/ml bis 150 µg/ml, insbesondere mit einer Konzentration im Bereich von 40 µg/ml bis 75 µg/ml, besonders bevorzugt mit einer Konzentration von 50 µg/ml. Die optimale Konzentration hängt dabei neben der Bakterienart bzw. dem Bakterienstamm ferner auch von der Bezugsquelle oder dem Molekulargewicht des verwendeten Polylysins ab.
Chitosan wird für die Fällung mit einer Konzentration im Bereich von 0,05 µg/ml Kultur bis 20 µg/ml Kultur eingesetzt, vorzugsweise mit einer Konzentration im Bereich von 0,25 µg/ml bis 10 µg/ml, insbesondere mit einer Konzentration im Bereich von 0,5 µg/ml bis 5 µg/ml, ferner insbesondere mit einer Konzentration im Bereich von 1 µg/ml bis 5 µg/ml, besonders bevorzugt mit einer Konzentration von 2,5 µg/ml. Die optimale Konzentration hängt dabei neben der Bakterienart bzw. dem Bakterienstamm ferner auch von der Bezugsquelle oder dem Molekulargewicht des verwendeten Chitosans und dem Deacetylierungsgrad des Chitosans ab. Eine Übersicht der bevorzugten Chitosan-Konzentrationen findet sich in der nachstehenden Tabelle.
Nach Zugabe der Polymere sollte die Bakterienkultur/Polymer-Lösung vorzugsweise durch Auf- und Abpippettieren oder Schütteln gemischt werden. Durch das Mischen werden alle beteiligten Komponenten schneller und unmittelbar miteinander in Kontakt gebracht.
Die angesäuerte oder basische Polymer/Bakterienmischung kann sofort weiterverarbeitet werden. Die Mischung kann jedoch auch für einen kurzen Zeitraum, vorzugsweise 3-10 Minuten, insbesondere bevorzugt für 5 Minuten inkubiert werden. Die Inkubationstemperatur kann Raumtemperatur bis 40°C, bevorzugt werden 37°C, insbesondere bevorzugt Raumtemperatur betragen.
Die angesäuerte oder basische Polymer/Bakterienmischung wird mit einem magnetischen Träger versetzt. Vorzugsweise sind die magnetischen Träger Magnetpartikel (im weiteren auch Magnetbead genannt), besonders Polystyrol-Magnetbeads. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden bevorzugt oberflächenfunktionalisierte Polystyrolbeads, insbesondere mit NH2-, COOH- oder OH-Oberflächen, wobei die NH2- Oberfläche besonders bevorzugt ist, eingesetzt. Als funktionalisierte Partikel werden bevorzugt käuflich erhältliche Beads z. B. Amino-Beads (EM2 100/40, Durchmesser 1,43 µm) oder Carboxy-Beads (EM1 100/40, (23710) Durchmesser 1,3 µm) der Firma Estapor eingesetzt, die deutlich effizienter in der Zellanreicherung als einfache Polystyrolbeads sind. Der bevorzugte Durchmesser der Beads liegt im Bereich von 0,5 µm bis 2 µm, bevorzugt ist ein Durchmesser von im Bereich von 1 µm bis 1,43 µm, besonders bevorzugt von etwa 1 µm.
Die Polystyrolbeads liegen in einem Konzentrationsbereich vor, in dem eine ausreichende Aufreinigung der Bakterien gewährleistet ist, die Kosten der Aufreinigung jedoch in einem vertretbaren Rahmen liegen. Vorzugsweise werden die Polystyrolbeads mit einer 1% Polystyrolbead-Lösung in einer Konzentration von etwa 1/10 bis 1/70 des Bakterienkulturvolumens zugesetzt. Besonders bevorzugt ist eine Konzentration von etwa 1/20 bis 1/50, insbesondere von 1/20 oder 1/50. Die Konzentration hängt dabei von der Größe des Volumens der Bakterienkultur ab. Beträgt das Volumen der Bakterienkultur z. B. 0,2 oder 1 oder 1,5 ml, so ist eine Konzentration der 1% Polystyrolbead-Lösung von 1/20 bevorzugt, bei einem Volumen der Bakterienkultur von z. B. 10 ml ist eine Konzentration der 1% Polystyrolbead-Lösung von 1/50 bevorzugt. Je größer das Volumen der Bakterienkultur, so geringer kann die Konzentration der Polystyrolbeads sein.
Nach Zugabe der Polystyrolbeads sollte die Bakterienkultur/Polymer/Polystyrolbead-Lösung vorzugsweise durch Auf- und Abpippettieren, Schütteln oder mittels des Magneten gemischt werden. Durch das Mischen werden alle beteiligten Komponenten schneller und unmittelbar miteinander in Kontakt gebracht.
Die Mischung kann sofort weiterverarbeitet werden. Die Mischung kann jedoch auch für einen kurzen Zeitraum, vorzugsweise 3-10 Minuten, insbesondere bevorzugt für 5 Minuten inkubiert werden. Die Inkubationstemperatur kann Raumtemperatur bis 40°C, bevorzugt werden 37°C, insbesondere bevorzugt Raumtemperatur betragen.
Anschließend werden die an die magnetischen Träger gebundenen Bakterien von der Probe abgetrennt. Dabei wird das Gemisch aus Bakterien/Polymer/Magnetpartikeln in ein magnetisches Feld eingebracht und der Komplex abgeschieden.
Die durch den vorhergehenden Verfahrensschritt an die Bakterien gebundenen Magnetpartikel können je nach Art des folgenden Weiterverarbeitungschrittes - z. B. Plasmidpräparation, Präparation von RNA oder genomischer DNA - von den Bakterien abgetrennt und verworfen oder in den Weiterverarbeitungschritten mit den Bakterien zusammen weiterverwendet werden. Sollen die Bakterien von den Magnetpartikeln getrennt werden, können die Bakterien/Polymer/Magnetpartikel nach Abtrennen von der Probe erneut in entsprechendem Puffer aufgenommen und bei gleichzeitigem Zurückhalten der Magnetpartikel mittels des Magneten abgenommen und z. B. in eine neues Reaktionsgefäß überführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren können in allen üblichen Reaktionsgefäßen durchgeführt werden, vorzugsweise in Eppendorf-Reaktionsgefäßen aller Art oder Mikrotiterplatten.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren angereicherten Bakterien können alle Arten von Bakterien, vorzugsweise Eubacteria und Archaebakteria, besonders E. coli, insbesondere BL21, JM109, E. coli B, DH1, LE392, E. coli K12, DH5α, NM522, E. coli C, DH10b, Sure, GM2163, TG2, HB101, Top10, InvaF', XL1Blue, JM83, Micrococcus spec. insbesondere Micrococcus luteus, Proteus spec. insbesondere Proteus mirabilis, Enterococcus spec. insbesondere Enterococcus faecalis, Citrobacter spec. insbesondere Citrobacter freundii, Bacillus spec. insbesondere Bacillus vallismortis, Staphylococcus spec. insbesondere Staphylococcus haemolyticus sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann als Zentrifugationsersatz verwendet werden, und somit die automatische Aufreinigung von Bakterienzellen ermöglichen. Mit dem beschriebenen Verfahren können Bakterien aus einer Kultur innerhalb von etwa 5-10 Minuten unspezifisch angereichert werden. Da die Konzentration der verwendeten kationischen Polymere mit deutlich unter 1% sehr gering ist, können die Anreicherungen wesentlich kostengünstiger als bei Verfahren nach dem Stand der Technik durchgeführt werden. Ferner werden beim erfindungsgemäßen Verfahren wesentlich geringere Bead-Mengen von 5-15 Beads pro Bakterium statt 30-50 Beads pro Bakterium z. B. bei der WO 00/29562 eingesetzt.
Die folgenden Beispiele dienen nur der Erläuterung und beschränken in keiner Weise den Umfang der Erfindung.

1. Herstellung der Chitosanlösung

Chitosan wurde eingewogen, in 0.5N HCl/25%HAc aufgenommen, auf 25 µg/ml in 0.5N HCl/25%HAc (= working solution) eingestellt. Die Lösung wurde solange erhitzt (ca. 80-90°C) bis sich das Chitosan vollständig gelöst hatte. Die working solution (25 µg/ml) bleibt bei Raumtemperatur stabil in Lösung und wurde so gelagert.

2. Herstellung der Polylysinlösung

Polylysin wurde eingewogen, in 0.5N HCl aufgenommen, auf 0.5 mg/ml in 0.5N HCl (= working solution) eingestellt. Die working solution wurde bei -20°C gelagert bis zum Gebrauch.

3. Bakterienernte im Maßstab 0,2 ml Kultur

Die Anzucht der E. coli JM83 erfolgte in einer 0.5 ml 96Well Polypropylen-Mikrotiterplatte mit 0.2 ml Kultur pro Well. Nach der Übernacht-Kultur wurde 20 µl Chitosan working solution zugegeben. Danach wurde 10 µl einer 1%igen Amino-Polystyrolbead-Lösung zugegeben. Anschliessend wurde die Lösung im Well durch einmaliges Auf- und Abpippettieren gemischt. Es folgte eine Inkubation bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Anschließend erfolgte eine Inkubation der Mikrotiterplatte für 3 Minuten auf einem Magnetseparator (Bilatec AG, Mannheim) zur Sedimentation der Bakterien/Bead-Komplexe. Der Überstand wurde verworfen. Die Bakterienzellen wurden direkt weiterverarbeitet.

4. Bakterienernte im Maßstab 1,5 ml Kultur

Die Anzucht von E. coli JM83 erfolgte in einer 96er Deepwellplatte über Nacht mit 1,5 ml Kultur pro Well. Nach der Übernacht-Kultur wurde 150 µl (1/10 Volumen) Chitosan working solution zugegeben und durch einmaliges Auf- und Abpippettieren gemischt. Danach wurde 75 µl einer 1%igen Amino-Polystyrolbead-Lösung zugegeben. Anschliessend wurde die Lösung im Well durch Auf- und Abpippettieren (2 fach) gemischt. Es folgte eine Inkubation bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Die Mikrotiterplatte wurde 5 Minuten auf einem Magnetseparator (Bilatec AG, Mannheim) zur Sedimentation der Bakterien/Bead-Komplexe inkubiert. Der Überstand wurde verworfen und die Bakterienzellen direkt weiterverarbeitet.

5. Bakterienernte im Maßstab 10 ml Kultur

Die Anzucht von E. coli JM83 erfolgte in einem Polypropylenröhrchen über Nacht mit 10 ml Kulturvolumen. Nach der Übernacht-Kultur wurde 1 ml (1/10 Volumen) Chitosan working solution zugegeben und durch zweimaliges Auf- und Abpippettieren gemischt. Danach wurde 0,2 ml einer 1%igen Amino-Polystyrolbead-Lösung zugegeben. Anschliessend wurde die Lösung durch Auf- und Abpippettieren (2 fach) gemischt. Es folgte eine Inkubation bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Das Röhrchen wurde 10 Minuten in das Magnetfeld eines Permanentmagneten (Bilatec AG, Mannheim) zur Sedimentation der Bakterien/Bead- Komplexe gebracht. Der Überstand wurde verworfen und die Bakterienzellen direkt weiterverarbeitet.

6. Anzucht der E. coli Kulturen

E. coli Kulturen wurden in Standardmedien wie LB, 2xYT, SOB oder SOC (Maniatis, 1987) ohne Modifikationen der Ernteprozedur angezogen. Bei Verwendung anderer Medien kann gegebenenfalls eine Anpassung der Konzentrationen von working-Solution und Beads nötig sein.

7. Bakterienernte im Maßstab 0,2 ml Kultur

Die Anzucht je 0,2 ml Kulturen von Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Staphylococcus haemolyticus erfolgte in einer 96er Mikrowellplatte über Nacht bei 37°C. Die Anzucht je 0,2 ml Kulturen von Bacillus vallismortis, Micrococcus luteus, Citrobacter freundii erfolgte in einer 96er Mikrowellplatte über Nacht bei 30°C. Nach der Übernacht-Kultur wurde 20 µl (1/10 Volumen) Chitosan working solution zugegeben und durch ein- oder zweimaliges Auf- und Abpippettieren gemischt. Danach wurde 10 µl einer 1%igen Amino-Polystyrolbead- Lösung zugegeben. Anschliessend wurde die Lösung im Well durch Auf- und Abpippettieren (1 oder 2 fach) gemischt. Es folgte eine Inkubation bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Die Mikrotiterplatte wurde 5 Minuten auf einem Magnetseparator (Bilatec AG, Mannheim) zur Sedimentation der Bakterien/Bead-Komplexe inkubiert. Der Überstand wurde verworfen und die Bakterienzellen direkt weiterverarbeitet.

Claims

1. Verfahren zur unspezifischen Aufreinigung von Bakterien, umfassend die folgenden Schritte:

a) In Kontakt bringen von einer Bakterienzellen enthaltenden Probe mit einem kationischen Polymer bei einem sauren pH-Wert,

b) Zugabe eines magnetischen Trägers,

c) Abtrennen des magnetischen Trägers mit den daran gebundenen Bakterienzellen von der Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei nach Schritt a) und/oder Schritt b) ein Inkubationsschritt eingefügt wird.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das kationische Polymer Chitosan oder Polylysin ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Chitosan mit einer Konzentration im Bereich von 0,05 bis 20 µg/ml Kultur und Polylysin mit einer Konzentration im Bereich von 12,5 bis 150 µg/ml Kultur zugegeben wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der pH-Wert kleiner oder gleich 3 ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der magnetische Träger ein magnetisches Polystyrolbead, insbesondere mit einer NH2-, COOH- oder OH-Oberfläche ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die aufgereinigten Bakterien E. coli, Bacillus spec, Proteus spec, Micrococcus spec, Staphylococcus spec oder Citrobacter spec sind.