DE69813848T2

DE69813848T2 - Verfahren zur Lyse von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE69813848T2
Application number: DE69813848T
Authority: DE
Inventors: Lyse Santoro; Bruno Colin; Sophie Lopez; Cecile Paris; Corinne Jay; Ann Kathleen CLARK DICKEY
Original assignee: Biomerieux SA; Gen Probe Inc
Current assignee: Biomerieux SA; Gen Probe Inc
Priority date: 1997-09-23
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2018-09-24
Also published as: AU728694B2; CA2304846C; JP4422782B2; CA2304846A1; WO1999015621A1; DE69813848D1; ATE238411T1; AU9091298A; US6660472B1; EP1017784B1; ES2195383T3; FR2768743A1; FR2768743B1; JP2009131274A; EP1017784A1; JP2002512001A; JP4391017B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Lysieren eines Mikroorganismus, das es allgemein ermöglicht, letzteren aufzubrechen, insbesondere die Membran einer oder mehrerer Zellen, um zumindest ein interessierendes Nukleinmaterial, beispielsweise später zu behandelnde Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA), frei zu setzen, insbesondere zu analysieren.
Aus Dokument US-C-5,643,767 ist ein Lyseverfahren zum Abtrennen von DNA oder RNA von Zellen in einer flüssigen Lösung bekannt. Zu diesem Zweck wird ein Behälter verwendet, der ein Lösungsmittel zum Extrahieren von RNA oder DNA, eine Vielzahl von Partikeln mit einem Durchmesser von 0,1 bis 1 mm und zumindest einen größeren Partikel mit einem Durchmesser von 3 bis 5 mm enthält. Der so gefüllte Behälter wird bewegt, nämlich geschüttelt. In diesem Dokument ist ausdrücklich angegeben, dass die Bewegung vorzugsweise eine Rotationsbewegung ist, wie sie mit einem Mischer oder einem anderen Homogenisator erzeugt wird, da die Zellen sich mit einer Rotationsbewegung nicht lediglich gleichsinnig drehen und nicht effektiv miteinander und mit den Kugeln kollidieren, um zwischen den Kugeln zerquetscht zu werden.
Aus Dokument US-C-4,295,613 ist ein Gerät zum Zerquetschen von Bakterien bekannt, nach dem die Probe, die die. Zellen enthält, sich in einem Röhrchen in Kontakt mit feinen Kugeln befindet. Die Kugeln mit einem Durchmesser von 70 bis 110 μm werden mit der zu behandelnden Probe und jeglicher notwendigen Pufferlösung in das Röhrchen eingebracht, anschließend wird der Behälter oder das Röhrchen um eine horizontale Achse oszillierend bewegt, um die subzellulären Bestandteile, wie Enzyme, Proteine, Kohlenhydrate, ... in Lösung zu erhalten.
Aus Dokument FR-A-1576299 ist ein Verfahren zum Aufbrechen von pflanzlichen und tierischen Zellen bekannt, nach dem ein partikelartiges Material verwendet wird, wobei dessen Partikelgröße 0,05 bis 1 mm im Durchmesser beträgt, wobei die Partikel aus Stahl oder einem anderen ähnlichen Material sein können. Die Mischung aus biologischer Probe und den Partikeln wird gemäß einer Laminarströmung bewegt.
Aus Dokument EP-A-0317 803 ist ein Verfahren zur Herstellung von multilamellaren Liposomen bekannt, die ein wässriges Milieu umkapseln. Das Verfahren besteht aus dem Vermischen von Lipiden und dem zu verkapselnden wässrigen Milieu, dem Schütteln der Mischung in einem Behälter in Gegenwart von Partikeln mit einem Durchmesser von kleiner 3 mm, wobei die bevorzugte Größe 50 bis 100 μm beträgt, um Liposomen mit einem Durchmesser von ungefähr 150 bis 3000 Nanometern zu erhalten.
Aus Dokument EP-A-07-96 917 ist eine Vorrichtung bekannt, die Partikel in eine Zellen enthaltende biologische Probe freisetzt. Die Vorrichtung weist eine Barriere auf, die die Partikel für eine ausreichende Zeit zurückhält, wenn die Probe ge schüttelt oder sonifiziert wird, und sie anschließend freisetzt und die Zellen aufbricht, wodurch die Nukleinsäuren zugänglich gemacht werden. Die von der Barriere zurückgehaltenen Partikel, die aus Glas, Plastik oder aus Metall wie bspw. Zirkonium be- stehen können, können verschiedene Formen und einen Durchmesser von ungefähr 0,1 bis 0,15 mm haben. Ein Partikel mit einem Durchmesser von ungefähr 1 bis 4 mm, vorzugsweise von 3 mm, ist vorgesehen, um die Barriere zu durchbrechen. Ein alternatives Gerät für das Bewegen ist ein Schüttler der Marke BioSpec®.
Aus Dokument EP-A-0288618 ist ein Verfahren zum zellulären Lysieren, unter anderem von Mikroorganismen, bekannt, um subzelluläre Bestandteile, einschließlich DNA und RNA in Lösung freizusetzen. Die biologische Probe wird in einen Behälter mit Partikeln von verschiedener Größe gegeben. Der Behälter wird dann einer Sonifizierung unterzogen, bis die Zellen ihre Bestandteile freisetzen. Der Ultraschall versetzt die Partikeln durch die Probe hindurch in Vibration, wodurch die Zellen aufgrund der Scherkräfte zerreißen. Bei den Partikeln handelt es sich um Glaskugeln mit einem Durchmesser von 0,05 bis 1 mm. Die Sonifizierungsdauer beträgt 10 Minuten bei Raumtemperatur. RNA und DNA werden so freigesetzt, dass diese genetischen Nukleinsonden zur Hybridisierung zugänglich sind.
Aus Dokument US-C-5,464,773 ist ein Gerät zum Lysieren von Zellen, ohne die subzellulären Bestandteile zu zerstören, bekannt, um insbesondere RNA und DNA zur späteren Hybridisierung freizusetzen. Der verwendete Behälter enthält zwei Größen von Kugeln aus Zirkonium, Glas, Plastik oder aus anderem Material. In einer bevorzugten Ausführung enthält der Behälter 400 μl Zirkoniumpartikeln von unterschiedlichen Größen und unter schiedlichem Gewicht, beispielsweise von 0,7 g und mit einem Durchmesser von 0,1 mm und von 0,65 g und mit einem Durchmesser von 0,5 mm. Die an den Behälter angelegte Bewegung ist eine Bewegung vom vibrierenden, insbesondere oszillierenden Typ.
Aus Dokument US-C-4,666,850 ist ein Gerät und ein Verfahren zum Lysieren einer Blutprobe bei deren Zentrifugation bekannt. Der Behälter, der die Blutprobe enthält, enthält Partikel oder Kugeln aus Plastikmaterial oder aus Glas, die eine Größe aufweisen müssen, die die Sedimentation der Bakterien während der Zentrifugation nach unten in das Röhrchen nicht verhindern.
Aus Dokument EP-A-0341215 ist ein Verfahren bekannt, um ausgehend von genetisch transformierten Hefen heterologe Proteine herzustellen. Um die Quantität der Proteine ermitteln zu können, wird klar gestellt, dass zur Lyse der Zellen einfach mechanische Scherkräfte angelegt werden, indem die biologische Probe, die die Hefen enthält, mit den Glaskugeln geschüttelt wird.
Aus Dokument EP-A-0284044 ist ein Verfahren bekannt, um die Herstellung von Proteinen in Hefen zu erhöhen. Es wird betont, dass zur Analyse der Quantität der Proteine die Zellen (Hefen) vorzugsweise lysiert werden, indem an die biologische Probe mit Glaskugeln mit einem Durchmesser von 450–500 μm eine Bewegung vom Vortex-Typ für eine Minute mit maximaler Geschwindigkeit, und dies dreimal hintereinander, angelegt wird.
Aus Dokument US-C-4,775,622 ist ein Verfahren zum Exprimieren und Zurückgewinnen von Proteinen, ausgehend von einer Hefekultur, bekannt.
Die Verfahren, die im Allgemeinen zum Lysieren einer biologischen Probe mit zumindest einem Mikroorganismus und spezifisch zur Freisetzung von zumindest einem interessierenden Nukleinmaterial verwendet wurden, bestehen nach dem Stand der Technik hauptsächlich darin, dass:

– in einem Behälter eine biologische Probe in flüssigem Milieu bereitgestellt wird, die den zu lysierenden Mikroorganismus enthält,
– in den Behälter zumindest ein partikelartiges Material gegeben wird, das verhältnismäßig hart und, bezogen auf das Nukleinmaterial, im Wesentlichen inert ist,
– und die Mischung aus der biologischen Probe und dem partikelartigen Material im Wesentlichen einer alternierenden Bewegung mit variabler Amplitude und/oder Frequenz, wenn es sich um eine gleichmäßige Bewegung handelt, gemäß der Technik oder Einrichtung, die für das in Bewegung versetzen vorgesehen ist, unterzogen wird.

Diese verwendeten Verfahren weisen bestimmte Nachteile auf. Sie sind nicht effizient genug, insbesondere erweist sich die Zelllyse als unzureichend, um das Nukleinmaterial quantitativ und qualitativ freizusetzen.
Ferner ermöglichen sie es nicht immer, Zellen zu lysieren, die als lyseresistent gelten, insbesondere Zellen von grampositiven Bakterien, beispielsweise Zellen von Mycobakterien.
Gleichermaßen erfordert die Durchführung dieser Verfahren oft den Zusatz von zusätzlichen Reagenzien, wie beispielsweise Enzymen und/oder Detergenzien.
Erfindungsgemäß wurde herausgefunden, dass, entgegen der Lehre, die in dem Patent US 5,643,767 bekannt gemacht wurde, eine rotierende Bewegung vom Vortex-Typ besonders dafür geeignet ist, um Mikroorganismen zu lysieren und das interessierende Nukleinmaterial direkt freizusetzen, unter der Bedingung, dass für diese Bewegung insbesondere in Bezug auf den Behälter bestimmte Parameter ausgewählt werden.
Die Erfindung hat also ein Verfahren zum vollständigen, effizienten und einfachen Lysieren einer biologischen Probe zum Gegenstand, die zumindest einen Mikroorganismus enthält, ohne Reagens und/oder ergänzendem Verfahrensschritt während der Durchführung des Verfahrens.
Der erste Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zum Lysieren einer biologischen Probe, die zumindest einen Mikroorganismus vom bakteriellen Typ enthält, um zumindest ein zu dem genannten Mikroorganismus gehörendes, interessierendes Nukleinmaterial freizusetzen, bei dem

– in einem Behälter die biologische Probe in einem flüssigen Milieu bereitgestellt wird,
– in den Behälter zumindest ein partikelartiges Material gegeben wird, das verhältnismäßig hart und bezogen auf das. Nukleinmaterial im wesentlichen inert ist, und
– die Mischung aus der biologischen Probe und dem partikelartigen Material einer Bewegung unterworfen wird, dadurch gekennzeichnet, dass in Kombination die gewählte Bewegung vom Vortex-Typ ist und folgenden Bedingungen entspricht:
– das partikelartige Material besteht aus Kugeln mit einem Durchmesser, der bei 90 bis 150 μm liegt, und
– das apparente Volumen Vb der Kugeln und das Volumen Ve der flüssigen Probe erfüllen die Bedingung Ve = αVb, wobei α bei 1,4 bis 10 liegt, wenn der Behälter rohrförmig ist, und α kleiner oder gleich 2,1 ist, wenn der Behälter scheibenförmig ist wodurch ohne Zugabe von Reagens und/oder einem ergänzenden Verfahrensschritt das Nukleinmaterial direkt in das flüssige Milieu freigesetzt wird, und zwar in einem nativen Zustand und für jedes Reagens zugänglich.

Ein zweiter erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Verfahren zum Lysieren einer biologischen Probe, die zumindest einen Mikroorganismus vom Hefetyp enthält, um zumindest ein zu dem genannten Mikroorganismus gehörendes, interessierendes Nukleinmaterial freizusetzen, bei dem

– in einem Behälter die biologische Probe in einem flüssigen Milieu bereitgestellt wird,
– in den Behälter zumindest ein partikelartiges Material gegeben wird, das verhältnismäßig hart und bezogen auf das Nukleinmaterial im Wesentlichen inert ist, und
– die Mischung aus der biologischen Probe und dem partikelartigen Material einer Bewegung unterworfen wird, dadurch gekennzeichnet, dass in Kombination die gewählte Bewegung vom Vortex-Typ ist und folgenden Bedingungen entspricht:
– das partikelnartige Material besteht aus Kugeln mit einem Durchmesser von 500 μm, und
– das apparente Volumen Vb der Kugeln und das Volumen Ve der flüssigen Probe erfüllen die Bedingung Ve = αVb, wobei α bei 1,4 bis 10 liegt, wenn der Behälter rohrförmig ist, und α kleiner oder gleich 2,1 ist, wenn der Behälter scheibenförmig ist, wodurch ohne Zugabe von Reagens und/oder einem ergänzenden Verfahrensschritt das Nukleinmaterial direkt in das flüssige Milieu freigesetzt wird, und zwar in einem nativen Zustand und zugänglich für jedes Reagens.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird das Nukleinmaterial in nativem Zustand erhalten, was bedeutet, dass dieses im Wesentlichen nicht beeinträchtigt, beispielsweise nicht denaturiert, wurde, oder dass praktisch sämtliche Charakteristiken oder Eigenschaften erhalten bleiben, welche dieses innerhalb der Zelle oder des Organismus hatte, aus dem es extrahiert wird.
Ferner ist das erfindungsgemäße Verfahren ausreichend effizient, um das Lysieren eines einzigen Mikroorganismus zu ermöglichen, was für viele Verfahren zur biologischen Analyse, insbesondere für Amplifizierungstechniken oder Techniken zur Analyse durch Hybridisierung einer Nukleinsonde beziehungsweise von Nukleinsonden, von besonderem Interesse ist.
Handelt es sich um Nukleinmaterial, hat die vorliegende Erfindung den entscheidenden Vorteil, dieses Material auf direkte und zugängliche Art und Weise für jedes spätere zutreffende Protokoll frei zusetzen, beispielsweise für einen oder mehrere Amplifizierungsprimer, eine oder mehre Hybridisierungssonden...
Folglich kann die erhaltene lysierte biologische Probe gemäß der vorliegenden Erfindung direkt behandelt werden, d. h. ohne Zwischenverfahrensschritt, oder ohne zugegebenes Reagens, nach jeglichem Verfahrensprotokoll bezüglich des freigesetzten interessierenden Nukleinmaterials, wie Amplifizierung, Analyse, etc., mit jeglichen geeigneten Nukleinreagenzien, oder anderem.
In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß dem ersten Gegenstand der Erfindung besteht das partikelartige Material für ein Mikroorganismus vom Bakterientyp aus Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm.
In einer anderen Ausführungsform gemäß dem ersten oder zweiten Gegenstand der Erfindung entspricht die Bewegung vom Vortex-Typ außerdem folgender Relationen:
Vb < Ve < Vc, nach der
Vc = βVe, und
β größer oder gleich 2,5 ist, wobei Vc das verfügbare Volumen des Behälters ist.
Die Behälter, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können verschiedene Formate haben, beispielsweise rohrförmig oder scheibenförmig ausgebildet sein.
Der Behälter ist bevorzugt rohrförmig, vorzugsweise mit einem Boden in Form eines U. In dieser bevorzugten Ausführungsform ist β eine Zahl, die bei 2,5 bis 30 liegt.
In einer weiteren Ausführungsform gemäß der Erfindung sind die Behälter scheibenförmig und rohrförmig mit einem Boden in Form eines U (wie beispielsweise beim Falcon®-Typ) oder mit einem Boden in Form eines Kegelstumpfes (wie beispielsweise beim Eppendorf®-Typ).
Wenn der Behälter scheibenförmig ist, ist α eine Zahl kleiner oder gleich 2,1, vorzugsweise kleiner oder gleich 1,4, und β ist eine Zahl größer oder gleich 9,3.
Der Behälter ist vorzugsweise ein Rohr mit einem kegelstumpfartigen Boden, wie beispielsweise ein Eppendorf-Röhrchen, wobei α bei 1,4 bis 10, vorzugsweise bei 1,4 bis 3,3 liegt, und β bei 2,5 bis 30, vorzugsweise bei 2,5 bis 15, und weiter vorzugsweise bei 3,75 bis 15 liegt.
Ferner ist bevorzugt, dass der Behälter ein Rohr mit einem Boden in Form eines U ist, wie beispielsweise ein Falcon-Röhrchen, wobei α bei 1,4 bis 10, vorzugsweise bei 1,4 bis 3,3 liegt und weiter bevorzugt gleich 3,3 ist, und β bei 3 bis 30, vorzugsweise bei 12 bis 30 liegt, und weiter vorzugsweise gleich 20 ist.
In einer weiteren Ausführungsform gemäß der Erfindung umfasst das partikelartige Material weitere Kugeln, die einen größeren Durchmesser als genannte Kugeln haben. Vorzugsweise umfasst der Behälter bis zu 16, weiter bevorzugt 10 weitere Kugeln. Besonders bevorzugt ist, wenn die weiteren Kugeln einen Durchmesser von 2 bis 3 mm haben.
Diese zusätzliche Eigenschaft des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht es für eine entsprechende Effizienz insbesondere die Zeiten zu verringern oder zu limitieren, die für das Lysieren der biologischen Probe erforderlich sind.
Diese zusätzliche Eigenschaft ermöglicht es außerdem, vor der eigentlichen Lysierung komplexe biologische Proben, wie lebende Gewebe, aufzubrechen.
In einer weiteren Ausführungsform gemäß der Erfindung kann zu der biologischen Probe ein Antischaum-Mittel in einer Endkonzentration von 0,01 bis 1%, vorzugsweise von 0,5 bis 1% vom Volumen Ve der flüssigen Probe zugegeben werden.
Ferner kann nach einer weiteren Ausführungsform der biologischen Probe ein anionisches Detergens in einer Endkonzentration von 2,5% des Volumens Ve der flüssigen Probe zugegeben werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß des ersten erfindungsgemäßen Gegenstands ist die Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens gemäß Vortex-Typ wenigstens gleich 10 Sekunden, vorzugsweise wenigstens 20 Sekunden, vorteilhafterweise 1 bis 5 Minuten. Die Vortex-Zeitspanne wird derart angepasst, um einen prozentualen Anteil der Lysierung von zumindest größer oder gleich 20% zu erhalten.
Es ist auch bevorzugt, gemäß der Besonderheiten des verwendeten Lysierungsprotokolls, insbesondere, wenn Kugeln mit größerem Durchmesser zugegeben werden, dass die Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens gemäß Vortex-Typ 2 Minuten beträgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß dem zweiten Gegenstand der Erfindung liegt die Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens gemäß Vortex-Typ bei 8 bis 20 Minuten.
Da es das erhaltene Lysat ermöglicht, direkt das interessierende Nukleinmaterial zu detektieren und/oder zu quantifizieren und/oder zu amplifizieren, betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung einer biologischen Probe, die einen Mikroorganismus enthält, der ein interessierendes Nukleinmaterial enthält, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

a) ein Lyseschritt, nach dem:
– die biologische Probe in flüssigem Milieu in einem Behälter bereitgestellt wird,
– in den Behälter zumindest ein partikelartiges Material gegeben wird, dass verhältnismäßig hart und bezogen auf das Nukleinmaterial im Wesentlichen inert ist, und
– die Mischung aus der biologischen Probe und dem partikelartigen Material einer Bewegung vom Vortex-Typ unterworfen wird, wobei in Kombination
– die Kugeln einen Durchmesser von 90 bis 150 μm für einen Mikroorganismus vom Bakterientyp, und von 500 μm für einen Mikroorganismus vom Hefetyp aufweisen,
– das apparente Volumen Vb der Kugeln und das Volumen Ve der flüssigen Probe die Bedingung Ve = αVb erfüllen, wobei α bei 1,4 bis 10 liegt, wenn der Behälter rohrförmig ist, und α kleiner oder gleich 2,1 ist, wenn der Behälter scheibenförmig ist,
b) die lysierte biologische Probe mit oder ohne dem partikelartigen Material, das der Lyse gedient hat, direkt einem Verfahrensprotokoll unterzogen wird, das spezifisch das interessierende Nukleinmaterial betrifft, beispielsweise Nukleinamplifizierung und/oder -detektion und/oder -quantifizierung.

Somit können beispielsweise nach einer Amplifizierung, zumindest 1 × 10² Zellen/ml detektiert werden.
Ein dritter erfindungsgemäßer Gegenstand betrifft einen Behälter zur einmaligen Verwendung, um ein zuvor beschriebenes Verfahren durchzuführen, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Füllung eines partikelartigen Materials aufweist, das in Abhän gigkeit eines vorbestimmten Volumens der biologischen Probe an die direkt Durchführung des zuvor beschriebenen Verfahrens angepasst ist.
Unter „biologischer Probe" wird jegliche Probe, Entnahme oder Fraktion eines einfachen oder komplexen biologischen Materials verstanden, beispielsweise ein lebendes Gewebe oder eine Flüssigkeit oder Körperflüssigkeit. Diese biologische Probe enthält mit oder ohne vorherige Behandlung der Struktur, die diesen Mikroorganismus aufweist, beispielsweise der Zerstörung der Gewebeorganisation, zumindest einen zu lysierenden Mikroorganismus.
Unter „Mikroorganismus" wird jegliches biologisches Material verstanden, das natürlicherweise eine Membran oder geschlossene Hülle, einen oder mehrere interessierende biologische subzelluläre Bestandteile, die innerhalb der Membran oder Hülle enthalten sind, nämlich Nukleine (DNA oder RNA), aufweist. Selbstverständlich können beispielsweise auch prokaryotische Mikroorganismen wie Bakterien und Archaebakterien, eukaryotische Mikroorganismen wie pflanzliche oder tierische Zellen, Hefen und Pilze und ebenfalls verschiedene lebende Gewebe, einschließlich Viruspartikel, zitiert werden.
Unter dem Begriff „Lysieren" wird jeder Prozess verstanden, der das Aufbrechen der oben erwähnten Membran oder Hülle erlaubt, um das interessierende Nukleinmaterial vollständig oder partiell freizusetzen.
Die folgenden Figuren und Beispiele ermöglichen es, den Gegenstand der Erfindung zu illustrieren, ohne jedoch dessen Umfang zu begrenzen.
1 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit des Durchmessers der Kugeln (auf der Abszisse) und der Zusammensetzung der Mischung (Art und Verhältnis der Kugeln).
„AL" bedeutet „Ausgangslösung" und repräsentiert die Kontrolle, die nicht lysiert wurde.

A: Glaskugeln mit 1 bis 50 μm
B: Glaskugeln mit 50 bis 100 μm
C: Glaskugeln mit 90 bis 150 μm
D: Glaskugeln mit 100 μm
E: Zirkoniumkugeln mit 100 μm
F: Zirkoniumkugeln mit 500 μm
G: 50/50-Mischung von Zirkoniumkugeln mit 100 und 500 μm.

2 illustriert die Menge von detektierten Nukleinsäuren von S. epidermidis (auf der Ordinate) in Abhängigkeit des Durchmessers der Kugeln (auf der Abszisse).
„AL" bedeutet „Ausgangslösung" und repräsentiert die Kontrolle, die nicht lysiert wurde.

3 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) im Eppendorf-Röhrchen in Abhängigkeit des Koeffizienten a (auf der Abszisse).
4 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) im Falcon-Röhrchen in Abhängigkeit des Koeffizienten a (auf der Abszisse).
5 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in einem scheibenförmigen Behälter in Abhängigkeit des Koeffizienten a (auf der Abszisse).
6 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) im Eppendorf-Röhrchen in Abhängigkeit des Koeffizienten b (auf der Abszisse).
7 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) im Falcon-Röhrchen in Abhängigkeit des Koeffizienten b (auf der Abszisse).
8 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in einem scheibenförmigen Behälter in Abhängigkeit des Koeffizienten b (auf der Abszisse).
9 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit der Geometrie des Behälters (auf der Abszisse).

A: Eppendorf-Röhrchen mit V-förmigem Boden, Vc = 1,5 ml
B: Spektrophotometrieküvette mit ebenem Boden, Vc = 5 ml
C: Röhrchen mit ebenem Boden, Vc = 30 ml
D: Röhrchen mit ebenem Boden, Vc = 60 ml
E: Glasfläschchen mit ebenem Boden, Vc = 8 ml
F: Glasfläschchen mit ebenem Boden, Vc = 25 ml
G: Polysterolröhrchen mit U-förmigem Boden, Vc = 6 ml
H: Polysterolröhrchen mit U-förmigem Boden, Vc = 14 ml
I: Polysterolröhrchen mit U-förmigem Boden, Vc = 22 ml
J: Polysterolröhrchen mit U-förmigem Boden, Vc = 6 ml
K: Polysterolröhrchen mit U-förmigem Boden, Vc = 14 ml
L: Polysterolröhrchen mit U-förmigem Boden, Vc = 22 ml
M: Polysterolröhrchen mit U-förmigem Boden, Vc = 4 ml.

10 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit von verschiedenen zugegebenen Kugeln (auf der Abszisse).
11 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit von Kombinationen von verschiedenen zugegebenen Kugeln (auf der Abszisse).

A: 10 Inox-Kugeln mit 2 mm Durchmesser
B: 10 Glaskugeln mit 3 mm Durchmesser
C: 5 Inox-Kugeln und 5 Glaskugeln mit Durchmessern von 2 bzw. 3 mm
D: 4 Inox-Kugeln und 4 Glaskugeln mit Durchmessern von 2 bzw. 3 mm
E: 5 Inox-Kugeln und 3 Glaskugeln mit Durchmessern von 2 bzw. 3 mm
F: 3 Inox-Kugeln und 5 Glaskugeln mit Durchmessern von 2 bzw. 3 mm.

12 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit der Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens gemäß Vortex-Typ (auf der Abszisse) für die Protokolle I und II des Beispiels 5.
Die 13 illustriert den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit der Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens gemäß Vortex-Typ (auf der Abszisse) für die Protokolle II und III des Beispiels 5.
Um die Effizienz des erfindungsgemäßen Lyse-Verfahrens zu bestimmen, wurde ein allgemeines Testprotokoll zur Analyse des erhaltenen Lysats ausgearbeitet, wobei der prozentuale Anteil der Lyse gemessen wird.
Das allgemeine Protokoll wird nachfolgend beschrieben.
Staphylococcus-epidermidis-Bakterien mit grampositiver Wand (bioMérieux, API-Refferenz Nr. 8149310), kultiviert in flüssigem BCC-Medium (Herz-Hirn-Bouillon), werden bei 2500 Umdrehungen/min für 10 Minuten bei 25°C zentrifugiert, bevor diese gleichermaßen in BCC-Medium oder Lysepuffer auf eine Konzentration von 5 × 10⁹ Zellen/300 μl resuspendiert werden. Die Zusammensetzung des Lysepuffers ist folgende: 30 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,2. 300 μl der Suspension werden in ein Röhrchen gegeben, das bereits ein definiertes Volumen von Glaskugeln enthält. Das geschlossene Röhrchen wird für 2 Minuten bei maximaler Leistung des Geräts (Reax 2000, Heidolph) einer Bewegung vom Vortex-Typ unterzogen. Die so behandelte Bakteriensuspension wird vor der Analyse im Eis aufbewahrt.
Unmittelbar nach dem Einsammeln der Probe wird der prozentuale Anteil der Lyse durch Messung der optischen Dichte bei 550 nm bestimmt. Der prozentuale Anteil der Lyse entspricht dem Verhältnis des Wertes der OD bei 550 nm der Bakterienlösung nach dem Vortexen, durch den Wert der OD bei 550 nm vor dem Vortexen.
Die Qualität der durch den Vortex-Schritt freigesetzten Nukleinsäuren wird auf dem 0,8%igen Agarosegel verifiziert. In jede Vertiefung werden 10 μl Lysat gegeben, die Migration erfolgt bei konstanter Spannung (150V) und das Gel wird vor der Betrachtung unter ultravioletter Strahlung mit Ethidium-Bromid (ETB) gefärbt.
Die Menge der durch den Vortex-Schritt frei gesetzten Nukleinsäuren wird über spezifische Detektion gemäß der sogenannten Sandwich-Hybridisierungstechnik bestimmt, in dem ein Vidas®-Gerät verwendet wird, das bei bioMérieux (Frankreich) erhältlich ist. Zum Einfangen und zur spezifischen Detektion von S.epidermidis-Nukleinsäuren (siehe Patent EP 0632269 ) wurden Oligonukleotidsonden ausgewählt. Die Oligonukleotide zum Einfangen und zur Detektion haben jeweils als Sequenz:
5'-GACCACCTGTCACTCTGTCCC-3' (SEQ ID Nr. 1) und
5'-GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3' (SEQ ID Nr. 2). Die Detektionssonde ist über Kopplung mit Alkalischer Phosphatase (AP) markiert.
Die spezifische Hybridisierung dieser Sonden mit den frei gesetzten Nukleinsäuren in dem Lysat ist abhängig von der Menge von vorhandenen Nukleinsäuren, aber auch von deren Zugang für die verwendeten Sonden.
Ausgehend von gesammelten Lysaten wurden zwei Protokolle zur spezifischen Amplifizierung von DNA- und RNA-Molekülen von S. epidermidis durchgeführt, um zu verifizieren, ob die Nukleinsäuren, die durch das Vortexen freigesetzt wurden, amplifiziert werden können: Ein PCR-Protokoll zur Amplifizierung von DNA und ein NASBA-Protokoll zur Amplifizierung von 16S-rRNA.
PCR-Protokoll: Die folgende PCR-Technik ist jene, die von Goodman in PCR-Strategys, Ed: Innis, Gelford und Sninsky, Académie press 1995, S. 17–31, beschrieben wird. Zwei Amplifizierungsprimer wurden verwendet, und weisen folgende Sequenzen auf
Es wurden folgende Temperaturzyklen verwendet
NASBA-Protokoll: Die folgende NASBA-Technik ist jene, die von Van der Vliet et al., J. Gen. Microbiol. 1993, 139: 2423 be schrieben wird. Zwei Amplifizierungssonden wurden verwendet und weisen folgende Sequenzen auf:
Für jeden PCR- bzw. NASBA-Assay wurden 10 μl Lysat oder 5 μl Lysat verwendet. Die mittels PCR hergestellten Amplicons wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel angeschaut und auf Vidas gemäß des oben beschriebenen Protokolls quantifiziert. Die gemäß NASBA hergestellten Amplicons wurden auf einer Mikroplatte mittels Hybridisierung mit einer Fängersonde und einer Sonde zur spezifischen Detektion von S. epidermidis gemäß dem von P. Cros et al., Lancet 1992, 240: 870 beschriebenen Verfahren detektiert und quantifiziert. Die Detektionssonde ist an Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt. Die beiden Sonden weisen folgende Sequenzen auf:
Beispiel 1: Einfluss des Durchmessers der Kugeln und des Koeffizienten auf die Effizienz der Lyse mittels Vortex
a- Einfluss des Durchmessers der Kugeln
Das Lyseprotokoll wurde, wie oben beschrieben, ausgehend von einer Anfangssuspension von Staphylococcus epidermidis (5 × 10⁹ Zellen/300 μl) in Gegenwart von 90 μl verschiedener Mischungen von Kugeln, die durch verschiedene Durchmesser charakterisiert sind, für zwei Minuten pro Assay durchgeführt. Die getesteten Durchmesser liegen bei 1 bis 500 μm; die getesteten Mischungen sind folgende:

A: Mikrokugeln aus Glas mit einem Durchmesser von 1 bis 500 μm,
B: Mikrokugeln aus Glas mit einem Durchmesser von 50 bis 100 μm,
C: Mikrokugeln aus Glas mit einem Durchmesser von 90 bis 150 μm
D: Homogenes Gemisch aus Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm,
E: Homogenes Gemisch von Zirkoniumkugeln mit einem Durchmesser von 100 μm,
F: Homogenes Gemisch von Zirkoniumkugeln mit einem Durchmesser von 500 μm,
G: Gemisch (50/50 v/v) von Zirkoniumkugeln mit den Durchmessern von 100 und 500 μm.

Wie in 1 angegeben, ist die erhaltene Zelllyse in Gegenwart von Kugeln mit einem Durchmesser, der bei 90 bis 150 μm liegt, und vorzugsweise 100 μm beträgt, am effizientesten. Die Messungen der optischen Dichte bei 550 nm der gesammelten Proben nach 2-minütigem Vortexen unter diesen Bedingungen verdeutlichen, dass der prozentuale Anteil der Lyse von S. epidermidis mit diesem Durchmesser der Kugeln bei 60 bis 70% liegt. Es werden einzig und allein unbedeutende Unterschiede in den prozentualen Anteilen der Lyse in Abhängigkeit der Natur der Kugeln (Glas oder Zirkonium) bei selbem Durchmesser beobachtet. Dagegen bewirkt die Verwendung von Kugeln mit kleinerem oder größerem Durchmesser als 90 bis 150 μm, der Mischungen aus Kugeln mit einem Durchmesser von 1 bis 50 μm, 50 bis 100 μm, 100 bis 500 μm, oder des homogenen Gemisches aus Kugeln mit einem Durchmesser von 500 μm eine Abnahme des prozentualen Anteils der Lyse. Die Analyse der in das Lysat freigesetzten Nukleinsäuren auf einem 0,8%igen Agarosegel, dargestellt in 2, zeigt, dass die DNA- und rRNA-Moleküle gut erhalten bleiben, da ihr Migrationsprofil auf dem 0,8%igen Agarosegel das Gleiche ist, wie jenes der aus Bakterien gereinigten und kommerziell erhältlichen DNA- und rRNA-Moleküle.Die ausgesalzten Nukleinsäuren haben ebenfalls das selbe Migrationsprofil, ungeachtet des Durchmessers der Kugeln, die für die Zelllyse verwendet wurden. Die freigesetzten Nukleinsäuren sind ebenfalls mittels Vidas-Analyse detektierbar, deren Protokoll oben beschrieben ist. Ebenfalls gemäß 2 gibt die Menge der in das Lysat freigesetzten Nukleinsäuren, gemessen mittels Vidas-Analyse, den prozentualen Anteil der erhaltenen Lyse wieder. Parallel hierzu wurde demonstriert, dass DNA oder 16S-rRNA aus jedem Lysat mittel für S. epidermidis spezifischem PCR- oder NASBA-Protokoll amplifiziert werden können, die im obigen Teil zum allgemeinen Testprotokoll beschrieben sind.
b- Einfluss des Koeffizienten α
- Eppendorf-Röhrchen
In Gegenwart von Kugeln mit 100 μm Durchmesser wurde das Lyseprotokoll für zwei Minuten durchgeführt. Für sämtlich Assays wurden identische Eppendorf-Röhrchen verwendet. Das Volumen der Bakteriensuspension wurde für jeden Assay auf 300 μl/Röhrchen fest eingestellt, und das Volumen der Kugeln variierte von 1 bis 300 μl/Röhrchen. Gegeben ist Vb, das apparente Volumen der Kugeln, und Ve, das Volumen der flüssigen Probe, mit Vb < Ve und mit Ve = αVb, wobei α eine positive reelle Zahl ungleich 0 ist. Der Koeffizient α variierte von 1 bis 300. Nach dem Vortex-Schritt werden die gesammelten Proben über die Messung der optischen Dichte bei 550 nm analysiert, die in das Lysat freigesetzten Nukleinsäuren werden auf einem 0,8%igen Agarosegel beobachtet und mittels Vidas-Analyse quantifiziert.
3 verdeutlicht, dass die Lyse von S. epidermidis für Werte des Koeffizienten α von 1,4 bis 10 effizient ist: Der prozentuale Anteil der Lyse liegt bei 30 bis 70%. Für Werte von α < 1,4 ist das Volumen der Kugeln sehr groß, wobei das Totvolumen der Zellsuspension ansteigt, so dass es unmöglich ist, das Ausgangsvolumen der Zellsuspension wiederzugewinnen. Für Werte von α > 10 ist das Volumen der Kugeln gering und die Wahrscheinlichkeit des Zusammentreffens und mechanischen Aneinanderstoßens von Kugeln und Zellen ist verringert. Die Zelllyse ist vorzugsweise für Werte von α effizienter, die bei 1,4 bis 3,3 liegen: Der prozentuale Anteil der Lyse liegt bei 40 bis 70%. Die Analyse des Lysats auf 0,8%igem Agarosegel zeigt, dass die Migrationsprofile der freigesetzten Nukleinsäuren, ungeachtet der Werte von α, nicht verändert werden. Die Menge von mittels Vidas-Analyse gemessenen Nukleinsäuren korelliert direkt mit dem prozentualen Anteil der Lyse.
- Falcon-Röhrchen
Es wurde eine gleiche Studie durchgeführt, in der die Eppendorf-Röhrchen durch Falcon-Röhrchen aus Polypropylen (Vc = 6 ml) ersetzt wurden. 4 verdeutlicht, dass die Lyse von S. epidermidis für Werte des Koeffizienten α bei 1,4 bis 10 effizient ist: Der prozentuale Anteil der Lyse ist größer als 20%. Die Zelllyse ist vorzugsweise für Werte von α effizienter, die bei 1,4 bis 3,3 liegen: Der prozentuale Anteil liegt bei 65 bis 85%.
- Scheibenform
Es wurde eine Karte mit den Abmessungen 1 = L = 8,5 cm und h = 0,4 cm verwendet. Es werden ein oder mehrere als Vertiefungen definierte Löcher mit konstanter und gleicher Höhe wie die der Karte (d. h. 0,4 cm) und konstantem Durchmesser hergestellt. Diese Vertiefungen werden auf jeder Seite mit einem Film bedeckt, und jede Vertiefung wird mit einer Mischung aus Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μl apparenten Volumens Vb, 10 Eisenkugeln mit einem Durchmesser von 2 mm und einer Zellsuspension des Volumens Ve gefüllt. Die so definierte Karte wird auf dem Vortex gehalten.
Das Lyseprotokoll wird für 2 Minuten durchgeführt. Für jeden Assay wurden wie oben beschriebene Karten mit einem Durchmesser von 30 cm (Vc = 2,8 ml/Vertiefung) verwendet. Das Volumen der Bakteriensuspension wurde auf 700 μl/Vertiefung fest eingestellt und das Volumen der Kugeln variierte von 90 bis 510 μl/Vertiefung. Der Koeffizient α variierte von 1,4 bis 7,8. Nach dem Vortex-Schritt wurde der prozentuale Anteil der Lyse der gesammelten Proben über die Messung der optischen Dichte bei 550 nm analysiert, wobei die freigesetzten Nukleinsäuren im Agarosegel beobachtet und mittels Vidas-Analyse quantifiziert wurden.
5 verdeutlicht den prozentualen Anteil der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit des Koeffizienten α. Die Lyse von S. epidermidis ist mit einem Behälter im „Karten-" Format für die Werte des Koeffizienten von kleiner oder gleich 2,1 effizient: Wenn α bei 1,4 bis 2,1 liegt, liegt der prozentuale Anteil der Lyse bei 45 bis 75%. Der optimale Wert des Koeffizienten müsste vorzugsweise bei kleiner 1,4 sein, denn sogar für Werte von a, die sich 1,4 annähren, erreichen die Werte der prozentualen Anteile der Lyse kein Plateau. Die Analyse des Lysats im 0,8%igen Agarosegel zeigt, dass sich die Migrationsprofile der freigesetzten Nukleine, ungeachtet der Werte von α, nicht verändern. Die Menge der mittels Vidas-Analyse gemessenen Nukleinsäure korelliert direkt mit dem prozentualen Anteil der Lyse.
Beispiel 2: Einfluss des Koeffizienten β auf die Effizienz der Lyse mittels Vortex
- Eppendorf-Röhrchen
Das Lyseprotokoll wurde in Gegenwart eines konstanten Verhältnisses zwischen dem apparenten Volumen der Kugeln und dem Volumen der flüssigen Probe (α = Ve/Vb = 3,3) für 2 Minuten durchgeführt. Das Volumen der Bakteriensuspension variierte von 100 μl bis 1 ml. Dabei ist Ve das Volumen der flüssigen Probe und Vc das Nutz- oder verfügbare Volumen des Behälters mit Ve < Vc und Vc = βVe, wobei β eine positive reelle Zahl von größer 0 ist, der Koeffizient β variierte von 1,5 bis 15. Die Experimente wurden in einem Eppendorf-Röhrchen, d. h. mit Vc = 1,5 ml, durchgeführt. Nach dem Vortex-Schritt wurden die gesammelten Proben über die Messung der optischen Dichte bei 550 nm analysiert, die in dem Lysat vorhandenen Nukleinsäuren siert, die in dem Lysat vorhandenen Nukleinsäuren wurden auf dem 0,8%igen Agarosegel beobachtet und mittels Vidas-Analyse analysiert.
In 6 ist der prozentuale Anteil der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit des Koeffizienten β angegeben. Die Lyse von S. epidermidis ist für Werte des Koeffizienten β effizienter, die bei 2,5 bis 15 liegen: Der prozentuale Anteil der Lyse ist größer als 30%. Für Werte von β von < 2,5 sind die Volumina der Kugeln und der flüssigen Probe sehr groß; sie begrenzen die Bewegung der Kugeln in der Probe und das Totvolumen der Probe steigt an. Für Werte von β größer als 15 ist das Volumen der Probe zu gering, um für α = 3,3 eine vollständige Rückgewinnung des Ausgangsvolumens der Zellflüssigkeit zu ermöglichen. Die Effizienz der Zelllyse ist vorzugsweise für Werte von β, die bei 3,75 bis 15 liegen, besser: Der prozentuale Anteil der Lyse liegt bei 35 bis 60%; vorzugsweise für Werte, die bei 7,5 bis 15 liegen (40 bis 60% Lyse). Die Analyse des Lysats auf 0,8%igem Agarosegel zeigt, dass die Migrationsprofile der freigesetzten Nukleinsäuren ungeachtet der Werte von β gleich sind. Die Mengen der mittels Vidas-Analyse gemessenen Nukleinsäure korellieren direkt mit den prozentualen Anteilen der erhaltenen Lyse.
- Falcon-Röhrchen
Es wurde eine gleiche Studie durchgeführt, in der anstelle von Eppendorf-Röhrchen Falcon-Röhrchen aus Polypropylen (Vc = 6 ml) verwendet wurden. Es wurde derselbe Wert des Koeffizienten α fest eingestellt (α = 3,3). Das Volumen der Bakteriensuspension variierte von 200 μl bis 2 ml. β variierte von 3 bis 30. 7 illustriert den prozentualen Anteil der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit des Koeffizienten β. Die Lyse von S. epidermidis ist effizienter für Werte von β, die bei 6 bis 30 liegen: Der prozentuale Anteil der Lyse ist größer als 50%. Für Werte von β > 30 ist das Volumen der Probe zu gering, um für α = 3, 3 ein vollständiges Rückgewinnen des Ausgangsvolumens der Zellsuspension zu ermöglichen. Die Effizienz der Zelllyse ist vorzugsweise für Werte von β besser, die bei 12 bis 30 liegen: Der prozentuale Anteil der Lyse ist größer als 60%.
- Scheibenform
Das Lyseprotokoll wurde mit dem selben Behälter, der in Beispiel 1 verendet wurde (Durchmesser der Vertiefungen 30 mm, Vc = 2,8 ml), mit einem Wert des Koeffizienten α (α = 3,3) für 2 Minuten durchgeführt. Das Volumen der Bakteriensuspension variierte von 300 bis 700 μl/Vertiefung. Der Koeffizient β variierte von 4 bis 9,3. Nach dem Vortex-Schritt wurde der prozentuale Anteil der Lyse der gesammelten Proben über die Messung der optischen Dichte bei 550 nm analysiert, die freigesetzten Nukleinsäuren wurden auf dem Agarosegel beobachtet und mittels Vidas-Analyse quantifiziert.
In 8 ist der prozentuale Anteil der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit des Koeffizienten α gezeigt. Die Lyse von S. epidermidis ist in dem „Kartenformat"-Behälter für Werte von β effizient, die größer oder gleich 9,3 sind. Wenn β gleich 9,3 ist und ein nicht optimaler Wert von α vorherrscht (α = 3,3), werden 60% der Zellen lysiert. Die Analyse des Lysats auf 0,8%igem Agarosegel zeigt, dass sich die Migrationsprofile der freigesetzten Nukleinsäuren, ungeachtet der Werte von β nicht ändern und zu jenen ähnlich sind, die für das Röhrchenformat beschrieben wurden. Die Menge der mittels Vidas-Analse gemessenen Nukleinsäuren korelliert mit dem prozentualen Anteil der Lyse für jeden Assay.
Beispiel 3: Einfluss der Geometrie des Röhrchens auf die Effizienz der Lyse mittels Vortex
Das Lyseprotokoll wurde in Behältern mit verschiedenen Geometrien und verschiedenen Volumina (Vc) in Gegenwart von 300 μl Zellsuspension und 90 μl Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm für 2 Minuten durchgeführt (d. h. α = 3,3 und variablem β).

A: Eppendorf-Röhrchen aus Polypropylen mit einem Boden in Form eines V, Vc = 1,5 ml
B: Spektrometrieküvette aus Polypropylen mit ebenem Boden, Vc = 5 ml
C: Röhrchen mit ebenem Boden, Vc = 30 ml
D: Röhrchen mit ebenem Boden, Vt = 60 ml
E = Glasfläschchen mit ebenem Boden, Vc = 8 ml
F = Glasfläschchen mit ebenem Boden, Vc = 25 ml
G = Polysterolröhrchen mit einem Boden in Form eines U, Vc = 6 ml
H = Polysterolröhrchen mit einem Boden in Form eines U, Vc = 14 ml
I = Polysterolröhrchen mit einem Boden in Form eines U, Vc = 22 ml
J = Polypropylenröhrchen mit einem Boden in Form eines U, Vc = 6 ml
K = Polypropylenröhrchen mit einem Boden in Form eines U, Vc = 14 ml
L = Polypropylenröhrchen mit einem Boden in Form eines U, Vc = 22 ml
M = Polypropylenröhrchen mit einem Boden in Form eines U, Vt = 4 ml.

9 zeigt den prozentualen Anteil der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit der Geometrie des verwendeten Behälters. Der prozentuale Anteil der Lyse liegt im Schnitt bei 60 bis 65% bei Röhrchen mit ebenem Boden oder mit einem Boden in Form eines V, dagegen liegt dieser für dieselben Vortex-Zeitspannen und ein und demselben Wert für α im Schnitt bei 70 bis 80% bei Röhrchen mit einem Boden in Form eines U. Die Messung der Menge von freigesetzten Nukleinsäuren mittels Vidas-Analyse bestätigt diesen Einfluss.
Beispiel 4: Einfluss der Zugabe von Kugeln mit größerem Durchmesser auf die Effizienz der Lyse mittels Vortex
Das Lyseprotokoll wurde in einem Eppendorf-Röhrchen in Gegenwart von 300 μl Zellsuspension und 90 μl Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm (d. h. α = 3,3 und β = 5) für 2 Minuten durchgeführt. In das Milieu wurden verschiedene Kugeln in Kombination zugegeben: Eisenkugeln mit einem Durchmesser von 2 mm, Glaskugeln mit einem Durchmesser von 3 mm.
10 stellt den prozentualen Anteil der Lyse von S. epidermidis in Abhängigkeit von verschiedenen Kombinationen von zuge gebenen Kugeln dar. Die Zugabe der Eisenkugel oder von Glaskugeln bewirkt eine Erhöhung des prozentualen Anteils der Lyse. Dieser prozentuale Anteil ist deutlich besser in Gegenwart von bis zu 10 Kugeln/Röhrchen. Das Vorhandensein dieser 10 Kugeln behindert nicht die Bewegung von Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm; dagegen wird bei darüber hinaus gehenden Werten die Bewegung behindert. Der prozentuale Anteil der erhaltenen Lyse ist in Gegenwart derselben Anzahl von Glaskugeln pro Assay höher als bei Eisenkugeln. Gemäß 11 ermöglicht es die Zugabe der Kombination von Eisen- und Glaskugeln, für jede getestete Kombination einen ebenfalls hohen prozentualen Anteil der Lyse zu erhalten, wie in Gegenwart der Zugabe einer homogenen Mischung von Kugeln; der prozentuale Anteil der Lyse ist größer als 80%. Die Analyse der freigesetzten Nukleinsäuren auf dem 0,8%igen Agarosegel zeigt, dass die DNA- und rRNA-Moleküle ungeachtet der Kombinationen der verwendeten Kugeln, nach der Lyse das gleiche Migrationsprofil haben. Die Zugabe von Eisen- und Glaskugeln verschlechtert die Struktur des freigesetzten Nukleinmaterials nicht. Ferner wurde überprüft, dass deren Anwesenheit in dem Lysat nicht die PCR- und NASBA-Amplifizierungsreaktionen stören.
Beispiel 5: Einfluss der Vortex-Zeitspannen auf die Effizienz der Lyse mittels Vortex
Es wurden parallel drei Lyseprotokolle durchgeführt:

– Protokoll I: Eppendorf-Röhrchen, Vc = 1,5 ml; 90 μl Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm und 300 μl Zellsuspension (α = 3,3 und β = 5).
– Protokoll II: Protokoll I mit Zugabe von 3 Glaskugeln mit einem Durchmesser von 3 mm und 5 Eisenkugeln mit einem Durchmesser von 2 mm.
– Protokoll III: Protokoll II im Falcon-Röhrchen (Vc = 6 ml) anstelle dem Eppendorf-Röhrchen.

Für jedes Protokoll werden verschiedene Vortex-Zeitspannen durchgeführt.
12 zeigt für die Protokolle I und II die prozentualen Anteile der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit von Vortex-Zeitspannen. Die experimentellen Bedingungen des Protokolls I sind nicht optimal. Es bestätigt sich, dass nach 2 Minuten des Vortexens nur 60% der S.-epidermidis-Bakterien lysiert sind. Trotz der nicht optimalen Bedingungen ist es dahingegen möglich, die Effizienz des Protokolls zu verbessern, indem die Vortex-Zeitspannen erhöht werden: 8 Minuten Vortex, 85% der Bakterien sind lysiert. Die experimentellen Bedingungen des Protokolls II sind wegen der Zugabe von Kugeln mit einem Durchmesser von 3 mm optimaler, als jene des Protokolls I: Unter diesen Bedingungen sind bei 4 Minuten Vortex 85% der S.epidermidis-Bakterien lysiert.
13 zeigt die prozentualen Anteile der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit der Vortex-Zeitspannen für die Protokolle II und III. Die experimentellen Bedingungen des Protokolls III sind optimaler als jene des Protokolls II: 88% der S.-epidermidis-Bakterien sind nach bloß 2 Minuten Vortex lysiert, wohingegen nach 2 Minuten mit dem Protokoll II bzw. I lediglich 80% bzw. 60% der Bakterien lysiert sind. Die Messung der freigesetzten Nukleinsäuren mittels Vidas bestätigt diese Hauptbeobachtungen.
Folglich ermöglicht es die Erhöhung der Vortex-Zeitspannen einen hohen prozentualen Anteil der Lyse zu erhalten, wenn die experimentellen Ausgangsbedingungen nicht optimal sind. Parallel hierzu können die Vortex-Zeitspannen, wenn die Bedingungen optimal sind, kurz sein (2 Minuten).
Beispiel 6: Allgemeingültigkeit des erfindungsgemäßen Lyseprotokolls
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Lysieren kann für weitere Zellspezies verwendet werden. Hierfür wurde in einem Eppendorf-Röhrchen ein Protokoll in Gegenwart von 300 μl Zellsuspension mit der Konzentration von 1 × 10⁹ Zellen/ml, 90 ml Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm und einer Vortex-Zeitspanne von 8 Minuten durchgeführt. Es wurden jeweils verschiedene Zellen verwendet (Mycobacterium gordonae, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae, Bacillus stearothermophilus, Micrococcus sp., Actinomyces viscosus, Actinomyces naeslundii, Stomatococcus mucilaginosus, Nocardia asteroides, Rhodococcus sp.). Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass die prozentualen Anteile der Lyse für jeden der analysierten Fälle bei 80 bis 90% liegt. Die Profile der Migration der in jedes Lysat freigesetzten Nukleinsäuren auf dem 0,8%igen Agarosegel sind für jeden getesteten Bakterienstamm vergleichbar, und sind zu jenen der gereinigten und kommerziell erhältlichen DNA und 16S-rRNA von E. coli ähnlich.
Beispiel 7: Lysieren von Hefe
Getestete Spezies: Candida albicans
Behälter: Falcon-Röhrchen aus Poypropylen mit Vc = 6 ml
Probe eingestellt auf 0,5 McFarland, d.h. 3 × 10⁶ Hefezellen/ml.
Probenvolumen: Ve = 600 μl
Apparentes Volumen der Kugeln: Vb (μl variabel): 60, 90 und 180 μl.
Durchmesser der getesteten Glaskugeln (μ): 100, 500 und 1500 μm.
Die Effizienz der Lyse wird gemäß dem prozentualen Anteil der Lyse gemessen:
% Lyse = OD 550 (vor der Lyse) – OD 550 (nach der Lyse)/OD 550 (vor der Lyse)
Vortex-Dauer: 2 bis 20 min
Es wird demonstriert, dass ein Durchmesser von 100 μm nicht ausreichend ist.
Es wird demonstriert, dass mit einem Kugeldurchmesser von 1500 μm, einem Vb, das bei 60 bis 180 liegt, und mit einer Vortexzeitspanne von 8 bis 20 min, ein prozentualer Anteil der Lyse von ungefähr 30% erreicht wird.
Es wird demonstriert, dass es ein Durchmesser von 500 μ, mit einem Vb von 60 bis 180 μl und einer Vortexzeitspanne von 8 bis 20 min, ermöglicht, einen prozentualen Anteil der Lyse von größer als 50% zu erreichen.
Schlussfolgerung:
Zum Lysieren von Hefen sind als Parameter Kugeln mit einem Durchmesser von 500 μm für eine Vortex-Dauer, die bei 8 bis 20 min liegt, in Kombination mit der Bewegung vom Vortex-Typ notwendig.
Beispiel 8: Sensitivität des erfindungsgemäßen Lyseprotokolls gemäß der Erfindung
DNA- und 16S-rRNA-Nukleinsäure, die durch Lyse nach dem erfindungsgemäßen Verfahren freigesetzt wurden, wurden einer Amplifizierung unterzogen. Die Lysebedingungen sind die Gleichen, wie jene, die in Beispiel 6 angegeben sind. Der verwendete Bakterienstamm ist S. epidermidis. Zwei für die Amplifizierung von Nukleinsäuren von S. epidermidis spezifische Protokolle wurden ausgehend von den gesammelten Lysaten durchgeführt, entweder ein PCR-Protokoll für die Amplifizierung von DNA, oder ein NASBA-Protokoll für die Amplifizierung von 16S-rRNA, wie oben in dem allgemeinen Testprotokoll beschrieben.
1)- PCR-Amplifizierung von freigesetzter DNA
Es wurden Ausgangskonzentrationen von 1 × 10⁹ bis 1 × 10² Zellen/ml verwendet. Für jeden PCR-Assay wurden 10 μl Lysat verwendet. Die hergestellten Amplicons wurden detektiert und nach spezifischer Sandwich-Hybridisierung auf dem Vidas quantifiziert, wie in dem allgemeinen Testprotokoll beschrieben. Die hergestellten Amplicons sind für Bakterienausgangskonzentrationen von zumindest größer oder gleich 1 × 10² Zellen/ml, d. h. für 30 Zellen/300 μl messbar. Folglich ist das optimierte Protokoll zum Lysieren mittels Vortex effizient, um zumindest 30 Zellen/300 μl zu lysieren, und um mittels PCR amplifizierbare DNA-Moleküle freizusetzen, so dass die Menge der hergestellten Amplicons detektierbar ist.
2)- NASBA-Amplifizierung von 16S-rRNA
Es wurden Ausgangskonzentrationen von 2 × 10⁹ bis 2 × 10² Zellen/ml verwendet. Für jeden NASBA-Assay wurden 5 ml Lysat verwendet. Die hergestellten Amplicons wurden auf Mikroplatten mittels Sandwich-Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden detektiert, die spezifisch sind für S. epidermidis, wie im allgemeinen Testprotokoll beschrieben. Die hergestellten Amplicons konnten für Bakterienausgangskonzentrationen von zumindest größer oder gleich 2 × 10² Zellen/ml, d. h. 60 Zellen/300 ml detektiert und gemessen werden. Die Menge der gemessenen Amplicons ist für diese Ausgangskonzentration entscheidend, was verdeutlicht, dass die hergestellten Amplicons nach der Lyse der Bakterien mit einer Ausgangskonzentration von 60 Zellen/300 μl wahrscheinlich detektierbar und messbar wären.
Beispiel 9: Auflösung der Schaumbildung, die auf das Schütteln der Kugeln in einer Probe zurückzuführen ist
Zum Zwecke der Automatisierung ist es entscheidend, in den Flüssigkeiten die Schaumbildung zu bewerkstelligen und zu verhindern, welche die Transferschritte durch Pipetieren stören oder sogar verhindern. Die „Antischaum"-Agenzien wurden hinsichtlich Ihrer Fähigkeit untersucht, diesen Phänomentyp zu begrenzen. Hierzu wurde ein Protokoll ausgehend von respiratorischen Proben (Speichel, Auswürfe, broncho-alviolare Spülungen) valideriert, die verflüssigt und gemäß dem Protokoll „NaLc" inaktiviert wurden. Kurz gesagt, 2 ml der Probe werden zu 2 ml antiseptischer Lösung (erhalten durch Auflösung von 0,75 g N-Acetyl-L-Cystein in 150 ml Natron) zugegeben. Das Gemisch wird gevortext und unter Schütteln für 20 min bei Raumtemperatur belassen, anschließend mittels 41 ml Phosphatpuffer (pH 6,8) neutralisiert. Der gesamte Ansatz wird 15 Sekunden gevortext, anschließend bei 4°C für 25 Minuten bei 4000 g zentrifugiert. Das Pellet wird in verbleibenden 2 ml resuspendiert, nachdem der Überstand entfernt wurde.
Anschließend werden verschiedene Proben vermischt, um für die Untersuchung ein homogenes und konstantes Milieu bereitzustellen. Die Assays wurden auf folgende Art durchgeführt: 260 μl Probe werden in ein 12 × 75 mm Polypropylen-Röhrchen mit 90 μl Glaskugeln mit einem Durchmesser von 100 μm, drei Glaskugeln mit einem Durchmesser von 2 mm, 5 Eisenkugeln mit einem Durchmesser von 2 mm hinzugegeben. 40 μl eines anionischen Detergenz werden hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 2,5% zu erhalten. Das Vorhandensein eines Detergens rechtfertigt sich durch die Tatsache, dass die Nukleinsäuren während des Lyseverfahrens stabilisiert und geschützt werden müssen.
Der gesamte Ansatz wird in einem Reax-2000-Vortex (Heidolph) bei maximaler Leistung für 12 Minuten geschüttelt (besonders lange Zeitspanne verglichen mit dem Standardprotokoll, was jedoch die Schaumbildung gegebenenfalls begünstigen sollte). Die Höhe der Flüssigkeit in dem Röhrchen wird anfangs anschließend nach dem Schütteln gemessen und der prozentuale Anteil des erhaltenen Schaums wird in den folgenden Ergebnissen ausgedrückt, in dem das Verhältnis der Schaumhöhe zu der Ausgangshöhe gebildet wird.
Tabelle N
Das Antischaum-Agens, insbesondere Foam Ban MS-575 (Ultra Inc., Charlotte, USA) wird in einem vernachlässigbarem Volumen zugegeben, um Endkonzentrationen von 0, 01 bis 1% zu erhalten (Tabelle N).
Die Ergebnisse (siehe Tabelle N) zeigen, dass das Vorhandensein eines Antischaums die Auflösung der Schaumbildung ermöglicht, insbesondere ausgehend von klinischen Proben wie beispielsweise Sedimente. Dessen Verwendung bei einer Konzentration von 0,5 bis 1% ermöglicht die vollständige Bewerkstelligung der Schaumbildung, die auf das Schütteln der flüssigen Probe in Gegenwart der Kugeln zurückzuführen ist.
Die Effizienz des Antischaums wurde gleichermaßen ausgehend von individuellen Proben (unvermischt) bei einer Endkonzentration von 0,6% gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll verifiziert.
Die Ergebnisse (siehe Tabelle N + 1) zeigen, dass die Schaumbildung je nach biologischer Probe variabel ist, dass aber das Vorhandensein eines Antischaums im Rahmen des Lyseprotokolls die von verschiedenen respiratorischen Proben ausgehende Schaumbildung bewerkstelligt und verhindert.
Tabelle N + 1
Beispiel 10: Sensitivität des Protokolls zum Lysieren von Mikroorganismen in Gegenwart von Antischaumagenzien
Die Effizienz des gesamten Lyseprotokolls, insbesondere in Gegenwart eines Antischaums, wurde in Proben ermittelt, die sehr geringe Konzentrationen von Bakterien enthielten. Es wurden Mycobacterium bovis BCG-Bakterien verwendet, denn die Mycobacterium-Gattung ist dafür bekannt, dass sie schwierig zu lysieren ist, und dass sie insbesondere in den respiratorischen Entnahmen erforscht wird.
Ausgehend von einer homogenen Ausgangssuspension von Bakterien, deren Konzentration durch densitometrische Messung (optische Dichte bei 550 nm) bestimmt wurde, wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt, um bei einem vernachlässigbaren Volumen Fraktionen von inaktiviertem (Erwärmung auf 95°C für 15 Minuten) Negativ-Sediment (rekonstituiert durch Mischen von verschiedenen verflüssigten und dekontaminierten Negativ-Sedimenten) zu inokulieren. Die so rekonstituierten Proben wurden folgendem Protokoll unterzogen:

– Verdünnung in einem Puffer, der ein anionisches Detergens und den Antischaum Foam Ban MS-575 enthält, um Endkonzentrationen von 2,5% bzw. 1% zu erhalten.
– Erwärmung bei 95°C für 15 min (Inaktivierung der Bakterien).
– Ein Volumen von 600 μl wird in eine 12 × 75 ml Küvette (Polypropylen) gegeben, die 180 μl Glaskugeln mit 100 μm, 6 Glaskugeln (2 mm Durchmesser), 10 Eisenkugeln (2 mm Durchmesser) enthält, und der gesamte Ansatz wird mit Hilfe eines Vortex für 2 Minuten bei maximaler Leistung geschüttelt.

Parallel dazu werden Versuchskontrollen hergestellt: Diese durchlaufen dasselbe Protokoll wie vorher beschrieben, ausgenommen den Schritt des Schüttelns der Kugeln mittels Vortex.
Die so potentiell freigesetzten Nukleinsäuren werden dann mittels eines spezifischen Einfangschrittes an Magnetkugeln (Seradyne) gereinigt, die mit einem Fängeroligonukleotid versehen waren, das komplementär zu der 16S-RNA von M. tuberculosis BCG war, und zwar gemäß nachfolgendem Protokoll:

– 250 μl des erhaltenen Lysats werden mit einem Fängerpuffer gemischt, der an magnetische Kugeln (50 μg/Assay) gekoppelte Oligonukleotidsonden enthält. Der gesamte Ansatz wird für 20 min bei 60°C, anschließend für 10 min bei. Raumtemperatur inkubiert, danach wird nach der Immobilisierung der Kugeln an den Wänden der Röhrchen mittels Magnetisierung der Überstand entfernt.
– Die Kugeln werden mittels 2 Fraktionen von 1 ml Waschpuffer gewaschen (Resuspendierung, anschließend Magnetisierung).
– Nach der Entfernung des Puffers werden die Kugeln mit 50 μl Wasser und 25 μl Amplifizierungsgemisch resuspen diert, das die Oligonukleotidprimer und Desoxyribonukleotide des Identifizierungskits für M. tuberkulosis („Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct", Gen-Probe Ref. 1001) enthält, basierend auf der „Transcription-Mediated Amplification" (TMA), beschrieben von McDonough et al. (Nucleic Acids Amplification Technologies, 1997, Ed. Lee, Morse & Olsvik, Eaton Publishing, Natik, USA, S. 113–123), sowie von Kacian und Fulz (Nucleic Acid Sequences Amplification Methods, 1995, US-Patent Nr. 5,399,491).
– Der gesamte Ansatz wird bei 60°C für 15 Minuten erhitzt, auf 42°C für 5 Minuten abgekühlt, und es werden 25 μl der Enzymlösung des Kits (enthaltend RNA-Polymerase T7 und Reverse Transcriptase) hinzugegeben.
– Die Reaktion wird für eine Stunde bei 42°C inkubiert, anschließend unter Verwendung der Detektionsreagenzien des Kits gemäß der Technik „Hybridization Protection Assay" (HPA) analysiert, die von Arnold et al. (Clin. Chem., 1989, Vol. 35, S. 1588–1594) beschrieben wird.
– Die Reaktionen werden anschließend in einem Luminometer 450 i (Gen-Probe) ausgelesen, und liefern Daten in relativen Lumineszenzeinheiten (RLU), wobei die Positiv-Grenze eines Assays 30000 RLUs beträgt.

Die erhaltenen Daten sind in Tabelle N + 2 angegeben und entsprechen 3 experimentellen Assays pro getesteter Bedingung.
Tabelle N + 2
Die Ergebnisse (siehe Tabelle N + 2) zeigen, dass die Durchführung des Lyseprotokolls mittels Glaskugeln in Gegenwart von Antischaumagenzien es ermöglicht, auf empfindliche Art und Weise in biologischen Proben eine Menge zu detektieren, die 10^–3 Bakterien/Assay entspricht, d. h. eine Menge, die 1 bis 10 Kopien von Ribosomen entspricht. Im Vergleich hierzu, kann ohne Lysieren (abgesehen von der anfänglichen Erwärmung in Gegenwart von Detergens zur Inaktivierung der Proben) nur ein Äquivalent 10 bis 1000 Bakterien detektiert werden, d. h. 10.000 Mal weniger als mit der verwendeten Lysemethode.
Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit des Protokolls, das die Lysierung der Bakterien über mechanischen Schock in Gegenwart von Kugeln (mittels eines Vortex oder anderem) mit der Verwendung von Antischaumagenzien verbindend kombiniert. Die Kombination eines Lyseverfahrens durch Schütteln von Kugeln ist folglich perfekt angepasst.

Claims

Verfahren zum Lysieren einer biologischen Probe, die zumindest einen Mikroorganismus vom bakteriellen Typ enthält, um zumindest ein zu dem genannten Mikroorganismus gehörendes, interessierendes Nukleinmaterial freizusetzen, bei dem – in einem Behälter die biologische Probe in einem flüssigen Milieu bereitgestellt wird, – in den Behälter zumindest ein partikelartiges Material gegeben wird, das verhältnismäßig hart und bezogen auf das Nukleinmaterial im wesentlichen inert ist, und – die Mischung aus der biologischen Probe und dem partikelartigen Material einer Bewegung unterworfen wird, dadurch gekennzeichnet, dass in Kombination die gewählte Bewegung vom Vortex-Typ ist und folgenden Bedingungen entspricht: – das partikelartige Material besteht aus Kugeln mit einem Durchmesser, der zwischen 90 und 150 μm liegt, und – das apparente Volumen Vb der Kugeln und das Volumen Ve der flüssigen Probe erfüllen die Bedingung Ve = αVb, wobei α zwischen 1,4 und 10 liegt, wenn der Behälter rohrförmig ist, und α kleiner oder gleich 2,1 ist, wenn der Behälter scheibenförmig ist, wodurch ohne Zugabe von Reagens und/oder einem ergänzenden Verfahrensschritt das Nukleinmaterial direkt in das flüssige Milieu freigesetzt wird, und zwar in einem nativen Zustand und zugänglich für jedes Reagens einer nachfolgenden Verarbeitung.
Verfahren zum Lysieren einer biologischen Probe, die zumindest einen Mikroorganismus vom Hefetyp enthält, um zumindest ein zu dem genannten Mikroorganismus gehörendes, interessierendes Nukleinmaterial freizusetzen, bei dem – in einem Behälter die biologische Probe in einem flüssigen Milieu bereitgestellt wird, – in den Behälter zumindest ein partikelartiges Material gegeben wird, das verhältnismäßig hart und bezogen auf das Nukleinmaterial im Wesentlichen inert ist, und – die Mischung aus der biologischen Probe und dem partikelartigen Material einer Bewegung unterworfen wird, dadurch gekennzeichnet, dass in Kombination die gewählte Bewegung vom Vortex-Typ ist und folgenden Bedingungen entspricht: – das partikelartige Material besteht aus Kugeln mit einem Durchmesser von 500 μm, und – das apparente Volumen Vb der Kugeln und das Volumen Ve der flüssigen Probe erfüllen die Bedingung Ve = αVb, wobei α zwischen 1,4 und 10 liegt, wenn der Behälter rohrförmig ist, und α kleiner oder gleich 2,1 ist, wenn der Behälter scheibenförmig ist, wodurch ohne Zugabe von Reagens und/oder einem ergänzenden Verfahrensschritt das Nukleinmaterial direkt in das flüssige Milieu freigesetzt wird, und zwar in einem nativen Zustand und zugänglich für jedes Reagens einer nachfolgenden Verarbeitung.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das partikelartige Material aus Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm besteht.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung vom Vortex-Typ der folgenden Beziehung gehorcht: Vb < Ve < Vc, bei der Vc = βVe und β größer oder gleich 2,5 ist, wobei Vc das verfügbare Volumen des Behälters ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter rohrförmig ist, vorzugsweise mit einem Boden in Form eines U.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass β eine Zahl ist, die bei 2,5 bis 30 liegt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter ein Rohr mit einem kegelstumpfartigen Boden ist und dass α eine Zahl ist, die bei 1,4 bis 3,3 liegt, und dass β eine Zahl ist, die bei 2,5 bis 15, vorzugsweise bei 3,75 bis 15 liegt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 4 und 2 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter ein Rohr mit einem Boden in Form eines U ist, und dass α eine Zahl ist, die bei 1,4 und 3,3 liegt und vorzugsweise gleich 3,3 ist, und dass β eine Zahl ist, die bei 3 bis 30, vorzugsweise bei 12 bis 30 liegt und beispielsweise gleich 20 ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, und 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter scheibenförmig ist und dass α kleiner oder gleich 1,4 ist und β größer oder gleich 9,3 ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das partikelartige Material weitere Kugeln mit einem Durchmesser enthält, der größer als der Durchmesser der genannten Kugeln ist.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter einen Durchmesser von gleich 2 mm bis gleich 3 mm hat, solange er sechzehn andere Kugeln, vorzugsweise solange er zehn andere Kugeln enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Antischaum-Mittel in einer Endkonzentration von 0,01 bis 1%, vorzugsweise von 0,5 bis 1% vom Volumen Ve der flüssigen Probe zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass unter anderem ein anionisches Detergens in einer Endkonzentration von 2,5% des Volumens Ve der flüssigen Probe zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens gemäß Vortex-Typ wenigstens gleich 10 Sekunden, vorzugsweise wenigstens gleich 20 Sekunden ist und beispielsweise bei 1 bis 5 Minuten liegt.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens gemäß Vortex-Typ 2 Minuten beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens gemäß Vortex-Typ bei 8 bis 20 Minuten liegt.
Verfahren zur Behandlung einer biologischen Probe, die zumindest einen Mikroorganismus vom Bakterien- oder Hefetyp enthält, der ein interessierendes Nukleinmaterial enthält, bei dem – eine Lyse der genannten Probe gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 durchgeführt wird, – die lysierte biologische Probe mit oder ohne dem partikelartigen Material, das der Lyse gedient hat, direkt einem Verarbeitungsprotokoll unterworfen wird, das spezifisch das interessierende Nukleinmaterial betrifft, beispielsweise einer Nuklein-Amplifikation oder -Detektion.