-
Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zum Lysieren eines Mikroorganismus, das es allgemein
ermöglicht,
letzteren aufzubrechen, insbesondere die Membran einer oder mehrerer
Zellen, um zumindest ein interessierendes Nukleinmaterial, beispielsweise
später
zu behandelnde Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA),
frei zu setzen, insbesondere zu analysieren.
-
Aus Dokument US-C-5,643,767 ist ein
Lyseverfahren zum Abtrennen von DNA oder RNA von Zellen in einer
flüssigen
Lösung
bekannt. Zu diesem Zweck wird ein Behälter verwendet, der ein Lösungsmittel
zum Extrahieren von RNA oder DNA, eine Vielzahl von Partikeln mit
einem Durchmesser von 0,1 bis 1 mm und zumindest einen größeren Partikel
mit einem Durchmesser von 3 bis 5 mm enthält. Der so gefüllte Behälter wird bewegt,
nämlich
geschüttelt.
In diesem Dokument ist ausdrücklich
angegeben, dass die Bewegung vorzugsweise eine Rotationsbewegung
ist, wie sie mit einem Mischer oder einem anderen Homogenisator
erzeugt wird, da die Zellen sich mit einer Rotationsbewegung nicht
lediglich gleichsinnig drehen und nicht effektiv miteinander und
mit den Kugeln kollidieren, um zwischen den Kugeln zerquetscht zu
werden.
-
Aus Dokument US-C-4,295,613 ist ein
Gerät zum
Zerquetschen von Bakterien bekannt, nach dem die Probe, die die.
Zellen enthält,
sich in einem Röhrchen
in Kontakt mit feinen Kugeln befindet. Die Kugeln mit einem Durchmesser
von 70 bis 110 μm
werden mit der zu behandelnden Probe und jeglicher notwendigen Pufferlösung in
das Röhrchen
eingebracht, anschließend
wird der Behälter
oder das Röhrchen
um eine horizontale Achse oszillierend bewegt, um die subzellulären Bestandteile,
wie Enzyme, Proteine, Kohlenhydrate, ... in Lösung zu erhalten.
-
Aus Dokument FR-A-1576299 ist ein
Verfahren zum Aufbrechen von pflanzlichen und tierischen Zellen bekannt,
nach dem ein partikelartiges Material verwendet wird, wobei dessen
Partikelgröße 0,05 bis
1 mm im Durchmesser beträgt,
wobei die Partikel aus Stahl oder einem anderen ähnlichen Material sein können. Die Mischung
aus biologischer Probe und den Partikeln wird gemäß einer
Laminarströmung
bewegt.
-
Aus Dokument EP-A-0317 803 ist ein
Verfahren zur Herstellung von multilamellaren Liposomen bekannt,
die ein wässriges
Milieu umkapseln. Das Verfahren besteht aus dem Vermischen von Lipiden
und dem zu verkapselnden wässrigen
Milieu, dem Schütteln
der Mischung in einem Behälter
in Gegenwart von Partikeln mit einem Durchmesser von kleiner 3 mm,
wobei die bevorzugte Größe 50 bis
100 μm beträgt, um Liposomen mit
einem Durchmesser von ungefähr
150 bis 3000 Nanometern zu erhalten.
-
Aus Dokument EP-A-07-96 917 ist eine
Vorrichtung bekannt, die Partikel in eine Zellen enthaltende biologische
Probe freisetzt. Die Vorrichtung weist eine Barriere auf, die die
Partikel für
eine ausreichende Zeit zurückhält, wenn
die Probe ge schüttelt
oder sonifiziert wird, und sie anschließend freisetzt und die Zellen
aufbricht, wodurch die Nukleinsäuren
zugänglich
gemacht werden. Die von der Barriere zurückgehaltenen Partikel, die
aus Glas, Plastik oder aus Metall wie bspw. Zirkonium be- stehen
können,
können
verschiedene Formen und einen Durchmesser von ungefähr 0,1 bis
0,15 mm haben. Ein Partikel mit einem Durchmesser von ungefähr 1 bis
4 mm, vorzugsweise von 3 mm, ist vorgesehen, um die Barriere zu
durchbrechen. Ein alternatives Gerät für das Bewegen ist ein Schüttler der
Marke BioSpec®.
-
Aus Dokument EP-A-0288618 ist ein
Verfahren zum zellulären
Lysieren, unter anderem von Mikroorganismen, bekannt, um subzelluläre Bestandteile,
einschließlich
DNA und RNA in Lösung
freizusetzen. Die biologische Probe wird in einen Behälter mit
Partikeln von verschiedener Größe gegeben.
Der Behälter
wird dann einer Sonifizierung unterzogen, bis die Zellen ihre Bestandteile
freisetzen. Der Ultraschall versetzt die Partikeln durch die Probe
hindurch in Vibration, wodurch die Zellen aufgrund der Scherkräfte zerreißen. Bei den
Partikeln handelt es sich um Glaskugeln mit einem Durchmesser von
0,05 bis 1 mm. Die Sonifizierungsdauer beträgt 10 Minuten bei Raumtemperatur.
RNA und DNA werden so freigesetzt, dass diese genetischen Nukleinsonden
zur Hybridisierung zugänglich
sind.
-
Aus Dokument US-C-5,464,773 ist ein
Gerät zum
Lysieren von Zellen, ohne die subzellulären Bestandteile zu zerstören, bekannt,
um insbesondere RNA und DNA zur späteren Hybridisierung freizusetzen. Der
verwendete Behälter
enthält
zwei Größen von
Kugeln aus Zirkonium, Glas, Plastik oder aus anderem Material. In
einer bevorzugten Ausführung
enthält
der Behälter
400 μl Zirkoniumpartikeln
von unterschiedlichen Größen und
unter schiedlichem Gewicht, beispielsweise von 0,7 g und mit einem
Durchmesser von 0,1 mm und von 0,65 g und mit einem Durchmesser
von 0,5 mm. Die an den Behälter
angelegte Bewegung ist eine Bewegung vom vibrierenden, insbesondere
oszillierenden Typ.
-
Aus Dokument US-C-4,666,850 ist ein
Gerät und
ein Verfahren zum Lysieren einer Blutprobe bei deren Zentrifugation
bekannt. Der Behälter,
der die Blutprobe enthält,
enthält
Partikel oder Kugeln aus Plastikmaterial oder aus Glas, die eine
Größe aufweisen
müssen,
die die Sedimentation der Bakterien während der Zentrifugation nach
unten in das Röhrchen
nicht verhindern.
-
Aus Dokument EP-A-0341215 ist ein
Verfahren bekannt, um ausgehend von genetisch transformierten Hefen
heterologe Proteine herzustellen. Um die Quantität der Proteine ermitteln zu
können,
wird klar gestellt, dass zur Lyse der Zellen einfach mechanische
Scherkräfte
angelegt werden, indem die biologische Probe, die die Hefen enthält, mit
den Glaskugeln geschüttelt
wird.
-
Aus Dokument EP-A-0284044 ist ein
Verfahren bekannt, um die Herstellung von Proteinen in Hefen zu
erhöhen.
Es wird betont, dass zur Analyse der Quantität der Proteine die Zellen (Hefen)
vorzugsweise lysiert werden, indem an die biologische Probe mit
Glaskugeln mit einem Durchmesser von 450–500 μm eine Bewegung vom Vortex-Typ
für eine
Minute mit maximaler Geschwindigkeit, und dies dreimal hintereinander,
angelegt wird.
-
Aus Dokument US-C-4,775,622 ist ein
Verfahren zum Exprimieren und Zurückgewinnen von Proteinen, ausgehend
von einer Hefekultur, bekannt.
-
Die Verfahren, die im Allgemeinen
zum Lysieren einer biologischen Probe mit zumindest einem Mikroorganismus
und spezifisch zur Freisetzung von zumindest einem interessierenden
Nukleinmaterial verwendet wurden, bestehen nach dem Stand der Technik
hauptsächlich
darin, dass:
- – in einem Behälter eine
biologische Probe in flüssigem
Milieu bereitgestellt wird, die den zu lysierenden Mikroorganismus
enthält,
- – in
den Behälter
zumindest ein partikelartiges Material gegeben wird, das verhältnismäßig hart
und, bezogen auf das Nukleinmaterial, im Wesentlichen inert ist,
- – und
die Mischung aus der biologischen Probe und dem partikelartigen
Material im Wesentlichen einer alternierenden Bewegung mit variabler
Amplitude und/oder Frequenz, wenn es sich um eine gleichmäßige Bewegung
handelt, gemäß der Technik
oder Einrichtung, die für
das in Bewegung versetzen vorgesehen ist, unterzogen wird.
-
Diese verwendeten Verfahren weisen
bestimmte Nachteile auf. Sie sind nicht effizient genug, insbesondere
erweist sich die Zelllyse als unzureichend, um das Nukleinmaterial
quantitativ und qualitativ freizusetzen.
-
Ferner ermöglichen sie es nicht immer,
Zellen zu lysieren, die als lyseresistent gelten, insbesondere Zellen
von grampositiven Bakterien, beispielsweise Zellen von Mycobakterien.
-
Gleichermaßen erfordert die Durchführung dieser
Verfahren oft den Zusatz von zusätzlichen
Reagenzien, wie beispielsweise Enzymen und/oder Detergenzien.
-
Erfindungsgemäß wurde herausgefunden, dass,
entgegen der Lehre, die in dem Patent
US
5,643,767 bekannt gemacht wurde, eine rotierende Bewegung
vom Vortex-Typ besonders dafür
geeignet ist, um Mikroorganismen zu lysieren und das interessierende
Nukleinmaterial direkt freizusetzen, unter der Bedingung, dass für diese
Bewegung insbesondere in Bezug auf den Behälter bestimmte Parameter ausgewählt werden.
-
Die Erfindung hat also ein Verfahren
zum vollständigen,
effizienten und einfachen Lysieren einer biologischen Probe zum
Gegenstand, die zumindest einen Mikroorganismus enthält, ohne
Reagens und/oder ergänzendem
Verfahrensschritt während
der Durchführung
des Verfahrens.
-
Der erste Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist demnach ein Verfahren zum Lysieren einer biologischen
Probe, die zumindest einen Mikroorganismus vom bakteriellen Typ
enthält,
um zumindest ein zu dem genannten Mikroorganismus gehörendes,
interessierendes Nukleinmaterial freizusetzen, bei dem
-
- – in
einem Behälter
die biologische Probe in einem flüssigen Milieu bereitgestellt
wird,
- – in
den Behälter
zumindest ein partikelartiges Material gegeben wird, das verhältnismäßig hart
und bezogen auf das. Nukleinmaterial im wesentlichen inert ist,
und
- – die
Mischung aus der biologischen Probe und dem partikelartigen Material
einer Bewegung unterworfen wird,
dadurch gekennzeichnet, dass
in Kombination
die gewählte
Bewegung vom Vortex-Typ ist und folgenden Bedingungen entspricht:
- – das
partikelartige Material besteht aus Kugeln mit einem Durchmesser,
der bei 90 bis 150 μm
liegt, und
- – das
apparente Volumen Vb der Kugeln und das Volumen Ve der flüssigen Probe
erfüllen
die Bedingung Ve = αVb,
wobei α bei
1,4 bis 10 liegt, wenn der Behälter
rohrförmig
ist, und α kleiner
oder gleich 2,1 ist, wenn der Behälter scheibenförmig ist
wodurch
ohne Zugabe von Reagens und/oder einem ergänzenden Verfahrensschritt das
Nukleinmaterial direkt in das flüssige
Milieu freigesetzt wird, und zwar in einem nativen Zustand und für jedes
Reagens zugänglich.
-
Ein zweiter erfindungsgemäßer Gegenstand
ist ein Verfahren zum Lysieren einer biologischen Probe, die zumindest
einen Mikroorganismus vom Hefetyp enthält, um zumindest ein zu dem
genannten Mikroorganismus gehörendes,
interessierendes Nukleinmaterial freizusetzen, bei dem
-
- – in
einem Behälter
die biologische Probe in einem flüssigen Milieu bereitgestellt
wird,
- – in
den Behälter
zumindest ein partikelartiges Material gegeben wird, das verhältnismäßig hart
und bezogen auf das Nukleinmaterial im Wesentlichen inert ist, und
- – die
Mischung aus der biologischen Probe und dem partikelartigen Material
einer Bewegung unterworfen wird,
dadurch gekennzeichnet, dass
in Kombination
die gewählte
Bewegung vom Vortex-Typ ist und folgenden Bedingungen entspricht:
- – das
partikelnartige Material besteht aus Kugeln mit einem Durchmesser
von 500 μm,
und
- – das
apparente Volumen Vb der Kugeln und das Volumen Ve der flüssigen Probe
erfüllen
die Bedingung Ve = αVb,
wobei α bei
1,4 bis 10 liegt, wenn der Behälter
rohrförmig
ist, und α kleiner
oder gleich 2,1 ist, wenn der Behälter scheibenförmig ist,
wodurch ohne Zugabe von Reagens und/oder einem ergänzenden
Verfahrensschritt das Nukleinmaterial direkt in das flüssige Milieu
freigesetzt wird, und zwar in einem nativen Zustand und zugänglich für jedes
Reagens.
-
Durch das erfindungsgemäße Verfahren
wird das Nukleinmaterial in nativem Zustand erhalten, was bedeutet,
dass dieses im Wesentlichen nicht beeinträchtigt, beispielsweise nicht
denaturiert, wurde, oder dass praktisch sämtliche Charakteristiken oder
Eigenschaften erhalten bleiben, welche dieses innerhalb der Zelle oder
des Organismus hatte, aus dem es extrahiert wird.
-
Ferner ist das erfindungsgemäße Verfahren
ausreichend effizient, um das Lysieren eines einzigen Mikroorganismus
zu ermöglichen,
was für
viele Verfahren zur biologischen Analyse, insbesondere für Amplifizierungstechniken
oder Techniken zur Analyse durch Hybridisierung einer Nukleinsonde
beziehungsweise von Nukleinsonden, von besonderem Interesse ist.
-
Handelt es sich um Nukleinmaterial,
hat die vorliegende Erfindung den entscheidenden Vorteil, dieses Material
auf direkte und zugängliche
Art und Weise für
jedes spätere
zutreffende Protokoll frei zusetzen, beispielsweise für einen
oder mehrere Amplifizierungsprimer, eine oder mehre Hybridisierungssonden...
-
Folglich kann die erhaltene lysierte
biologische Probe gemäß der vorliegenden
Erfindung direkt behandelt werden, d. h. ohne Zwischenverfahrensschritt,
oder ohne zugegebenes Reagens, nach jeglichem Verfahrensprotokoll
bezüglich
des freigesetzten interessierenden Nukleinmaterials, wie Amplifizierung,
Analyse, etc., mit jeglichen geeigneten Nukleinreagenzien, oder
anderem.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
gemäß dem ersten
Gegenstand der Erfindung besteht das partikelartige Material für ein Mikroorganismus
vom Bakterientyp aus Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm.
-
In einer anderen Ausführungsform
gemäß dem ersten
oder zweiten Gegenstand der Erfindung entspricht die Bewegung vom
Vortex-Typ außerdem
folgender Relationen:
Vb < Ve < Vc, nach der
Vc
= βVe, und
β größer oder
gleich 2,5 ist, wobei Vc das verfügbare Volumen des Behälters ist.
-
Die Behälter, die erfindungsgemäß verwendet
werden können,
können
verschiedene Formate haben, beispielsweise rohrförmig oder scheibenförmig ausgebildet
sein.
-
Der Behälter ist bevorzugt rohrförmig, vorzugsweise
mit einem Boden in Form eines U. In dieser bevorzugten Ausführungsform
ist β eine
Zahl, die bei 2,5 bis 30 liegt.
-
In einer weiteren Ausführungsform
gemäß der Erfindung
sind die Behälter
scheibenförmig
und rohrförmig
mit einem Boden in Form eines U (wie beispielsweise beim Falcon®-Typ) oder
mit einem Boden in Form eines Kegelstumpfes (wie beispielsweise
beim Eppendorf®-Typ).
-
Wenn der Behälter scheibenförmig ist,
ist α eine
Zahl kleiner oder gleich 2,1, vorzugsweise kleiner oder gleich 1,4,
und β ist
eine Zahl größer oder
gleich 9,3.
-
Der Behälter ist vorzugsweise ein Rohr
mit einem kegelstumpfartigen Boden, wie beispielsweise ein Eppendorf-Röhrchen,
wobei α bei
1,4 bis 10, vorzugsweise bei 1,4 bis 3,3 liegt, und β bei 2,5
bis 30, vorzugsweise bei 2,5 bis 15, und weiter vorzugsweise bei
3,75 bis 15 liegt.
-
Ferner ist bevorzugt, dass der Behälter ein
Rohr mit einem Boden in Form eines U ist, wie beispielsweise ein
Falcon-Röhrchen,
wobei α bei
1,4 bis 10, vorzugsweise bei 1,4 bis 3,3 liegt und weiter bevorzugt gleich
3,3 ist, und β bei
3 bis 30, vorzugsweise bei 12 bis 30 liegt, und weiter vorzugsweise
gleich 20 ist.
-
In einer weiteren Ausführungsform
gemäß der Erfindung
umfasst das partikelartige Material weitere Kugeln, die einen größeren Durchmesser
als genannte Kugeln haben. Vorzugsweise umfasst der Behälter bis zu
16, weiter bevorzugt 10 weitere Kugeln. Besonders bevorzugt ist,
wenn die weiteren Kugeln einen Durchmesser von 2 bis 3 mm haben.
-
Diese zusätzliche Eigenschaft des erfindungsgemäßen Verfahrens
ermöglicht
es für
eine entsprechende Effizienz insbesondere die Zeiten zu verringern
oder zu limitieren, die für
das Lysieren der biologischen Probe erforderlich sind.
-
Diese zusätzliche Eigenschaft ermöglicht es
außerdem,
vor der eigentlichen Lysierung komplexe biologische Proben, wie
lebende Gewebe, aufzubrechen.
-
In einer weiteren Ausführungsform
gemäß der Erfindung
kann zu der biologischen Probe ein Antischaum-Mittel in einer Endkonzentration
von 0,01 bis 1%, vorzugsweise von 0,5 bis 1% vom Volumen Ve der flüssigen Probe
zugegeben werden.
-
Ferner kann nach einer weiteren Ausführungsform
der biologischen Probe ein anionisches Detergens in einer Endkonzentration
von 2,5% des Volumens Ve der flüssigen
Probe zugegeben werden.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
gemäß des ersten
erfindungsgemäßen Gegenstands
ist die Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens gemäß Vortex-Typ wenigstens gleich
10 Sekunden, vorzugsweise wenigstens 20 Sekunden, vorteilhafterweise
1 bis 5 Minuten. Die Vortex-Zeitspanne wird derart angepasst, um einen
prozentualen Anteil der Lysierung von zumindest größer oder
gleich 20% zu erhalten.
-
Es ist auch bevorzugt, gemäß der Besonderheiten
des verwendeten Lysierungsprotokolls, insbesondere, wenn Kugeln
mit größerem Durchmesser
zugegeben werden, dass die Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens gemäß Vortex-Typ 2 Minuten beträgt.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
gemäß dem zweiten
Gegenstand der Erfindung liegt die Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens
gemäß Vortex-Typ
bei 8 bis 20 Minuten.
-
Da es das erhaltene Lysat ermöglicht,
direkt das interessierende Nukleinmaterial zu detektieren und/oder
zu quantifizieren und/oder zu amplifizieren, betrifft die vorliegende
Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung einer biologischen
Probe, die einen Mikroorganismus enthält, der ein interessierendes
Nukleinmaterial enthält,
wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
- a)
ein Lyseschritt, nach dem:
- – die
biologische Probe in flüssigem
Milieu in einem Behälter
bereitgestellt wird,
- – in
den Behälter
zumindest ein partikelartiges Material gegeben wird, dass verhältnismäßig hart
und bezogen auf das Nukleinmaterial im Wesentlichen inert ist, und
- – die
Mischung aus der biologischen Probe und dem partikelartigen Material
einer Bewegung vom Vortex-Typ unterworfen wird, wobei in Kombination
- – die
Kugeln einen Durchmesser von 90 bis 150 μm für einen Mikroorganismus vom
Bakterientyp, und von 500 μm
für einen
Mikroorganismus vom Hefetyp aufweisen,
- – das
apparente Volumen Vb der Kugeln und das Volumen Ve der flüssigen Probe
die Bedingung Ve = αVb erfüllen, wobei α bei 1,4
bis 10 liegt, wenn der Behälter
rohrförmig
ist, und α kleiner
oder gleich 2,1 ist, wenn der Behälter scheibenförmig ist,
- b) die lysierte biologische Probe mit oder ohne dem partikelartigen
Material, das der Lyse gedient hat, direkt einem Verfahrensprotokoll
unterzogen wird, das spezifisch das interessierende Nukleinmaterial
betrifft, beispielsweise Nukleinamplifizierung und/oder -detektion
und/oder -quantifizierung.
-
Somit können beispielsweise nach einer
Amplifizierung, zumindest 1 × 102 Zellen/ml detektiert werden.
-
Ein dritter erfindungsgemäßer Gegenstand
betrifft einen Behälter
zur einmaligen Verwendung, um ein zuvor beschriebenes Verfahren
durchzuführen,
dadurch gekennzeichnet, dass er eine Füllung eines partikelartigen
Materials aufweist, das in Abhän gigkeit
eines vorbestimmten Volumens der biologischen Probe an die direkt
Durchführung
des zuvor beschriebenen Verfahrens angepasst ist.
-
Unter „biologischer Probe" wird
jegliche Probe, Entnahme oder Fraktion eines einfachen oder komplexen
biologischen Materials verstanden, beispielsweise ein lebendes Gewebe
oder eine Flüssigkeit
oder Körperflüssigkeit.
Diese biologische Probe enthält
mit oder ohne vorherige Behandlung der Struktur, die diesen Mikroorganismus
aufweist, beispielsweise der Zerstörung der Gewebeorganisation,
zumindest einen zu lysierenden Mikroorganismus.
-
Unter „Mikroorganismus" wird jegliches
biologisches Material verstanden, das natürlicherweise eine Membran oder
geschlossene Hülle,
einen oder mehrere interessierende biologische subzelluläre Bestandteile, die
innerhalb der Membran oder Hülle
enthalten sind, nämlich
Nukleine (DNA oder RNA), aufweist. Selbstverständlich können beispielsweise auch prokaryotische
Mikroorganismen wie Bakterien und Archaebakterien, eukaryotische
Mikroorganismen wie pflanzliche oder tierische Zellen, Hefen und
Pilze und ebenfalls verschiedene lebende Gewebe, einschließlich Viruspartikel,
zitiert werden.
-
Unter dem Begriff „Lysieren"
wird jeder Prozess verstanden, der das Aufbrechen der oben erwähnten Membran
oder Hülle
erlaubt, um das interessierende Nukleinmaterial vollständig oder
partiell freizusetzen.
-
Die folgenden Figuren und Beispiele
ermöglichen
es, den Gegenstand der Erfindung zu illustrieren, ohne jedoch dessen
Umfang zu begrenzen.
-
1 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit
des Durchmessers der Kugeln (auf der Abszisse) und der Zusammensetzung
der Mischung (Art und Verhältnis
der Kugeln).
-
„AL" bedeutet „Ausgangslösung" und
repräsentiert
die Kontrolle, die nicht lysiert wurde.
-
- A: Glaskugeln mit 1 bis 50 μm
- B: Glaskugeln mit 50 bis 100 μm
- C: Glaskugeln mit 90 bis 150 μm
- D: Glaskugeln mit 100 μm
- E: Zirkoniumkugeln mit 100 μm
- F: Zirkoniumkugeln mit 500 μm
- G: 50/50-Mischung von Zirkoniumkugeln mit 100 und 500 μm.
-
2 illustriert
die Menge von detektierten Nukleinsäuren von S. epidermidis (auf
der Ordinate) in Abhängigkeit
des Durchmessers der Kugeln (auf der Abszisse).
-
„AL" bedeutet „Ausgangslösung" und
repräsentiert
die Kontrolle, die nicht lysiert wurde.
-
- A: Glaskugeln mit 1 bis 50 μm
- B: Glaskugeln mit 50 bis 100 μm
- C: Glaskugeln mit 90 bis 150 μm
- D: Glaskugeln mit 100 μm
- E: Zirkoniumkugeln mit 100 μm
- F: Zirkoniumkugeln mit 500 μm
- G: 50/50-Mischung von Zirkoniumkugeln mit 100 und 500 μm.
-
3 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) im Eppendorf-Röhrchen in
Abhängigkeit
des Koeffizienten a (auf der Abszisse).
-
4 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) im Falcon-Röhrchen in
Abhängigkeit
des Koeffizienten a (auf der Abszisse).
-
5 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in einem scheibenförmigen Behälter in
Abhängigkeit
des Koeffizienten a (auf der Abszisse).
-
6 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) im Eppendorf-Röhrchen in
Abhängigkeit
des Koeffizienten b (auf der Abszisse).
-
7 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) im Falcon-Röhrchen in
Abhängigkeit
des Koeffizienten b (auf der Abszisse).
-
8 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in einem scheibenförmigen Behälter in
Abhängigkeit
des Koeffizienten b (auf der Abszisse).
-
9 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit
der Geometrie des Behälters
(auf der Abszisse).
-
- A: Eppendorf-Röhrchen
mit V-förmigem
Boden, Vc = 1,5 ml
- B: Spektrophotometrieküvette
mit ebenem Boden, Vc = 5 ml
- C: Röhrchen
mit ebenem Boden, Vc = 30 ml
- D: Röhrchen
mit ebenem Boden, Vc = 60 ml
- E: Glasfläschchen
mit ebenem Boden, Vc = 8 ml
- F: Glasfläschchen
mit ebenem Boden, Vc = 25 ml
- G: Polysterolröhrchen
mit U-förmigem
Boden, Vc = 6 ml
- H: Polysterolröhrchen
mit U-förmigem
Boden, Vc = 14 ml
- I: Polysterolröhrchen
mit U-förmigem
Boden, Vc = 22 ml
- J: Polysterolröhrchen
mit U-förmigem
Boden, Vc = 6 ml
- K: Polysterolröhrchen
mit U-förmigem
Boden, Vc = 14 ml
- L: Polysterolröhrchen
mit U-förmigem
Boden, Vc = 22 ml
- M: Polysterolröhrchen
mit U-förmigem
Boden, Vc = 4 ml.
-
10 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit
von verschiedenen zugegebenen Kugeln (auf der Abszisse).
-
11 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit
von Kombinationen von verschiedenen zugegebenen Kugeln (auf der
Abszisse).
-
- A: 10 Inox-Kugeln mit 2 mm Durchmesser
- B: 10 Glaskugeln mit 3 mm Durchmesser
- C: 5 Inox-Kugeln und 5 Glaskugeln mit Durchmessern von 2 bzw.
3 mm
- D: 4 Inox-Kugeln und 4 Glaskugeln mit Durchmessern von 2 bzw. 3
mm
- E: 5 Inox-Kugeln und 3 Glaskugeln mit Durchmessern von 2 bzw.
3 mm
- F: 3 Inox-Kugeln und 5 Glaskugeln mit Durchmessern von 2 bzw.
3 mm.
-
12 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit
der Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens
gemäß Vortex-Typ
(auf der Abszisse) für
die Protokolle I und II des Beispiels 5.
-
Die 13 illustriert
den prozentualen Anteil der Lyse (auf der Ordinate) in Abhängigkeit
der Zeitspanne des In-Bewegung-Setzens
gemäß Vortex-Typ
(auf der Abszisse) für
die Protokolle II und III des Beispiels 5.
-
Um die Effizienz des erfindungsgemäßen Lyse-Verfahrens
zu bestimmen, wurde ein allgemeines Testprotokoll zur Analyse des
erhaltenen Lysats ausgearbeitet, wobei der prozentuale Anteil der
Lyse gemessen wird.
-
Das allgemeine Protokoll wird nachfolgend
beschrieben.
-
Staphylococcus-epidermidis-Bakterien
mit grampositiver Wand (bioMérieux,
API-Refferenz Nr. 8149310), kultiviert in flüssigem BCC-Medium (Herz-Hirn-Bouillon),
werden bei 2500 Umdrehungen/min für 10 Minuten bei 25°C zentrifugiert,
bevor diese gleichermaßen
in BCC-Medium oder Lysepuffer auf eine Konzentration von 5 × 109 Zellen/300 μl resuspendiert werden. Die
Zusammensetzung des Lysepuffers ist folgende: 30 mM Tris-HCl, 5
mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,2. 300 μl der Suspension werden in ein Röhrchen gegeben, das
bereits ein definiertes Volumen von Glaskugeln enthält. Das
geschlossene Röhrchen
wird für
2 Minuten bei maximaler Leistung des Geräts (Reax 2000, Heidolph) einer
Bewegung vom Vortex-Typ unterzogen. Die so behandelte Bakteriensuspension
wird vor der Analyse im Eis aufbewahrt.
-
Unmittelbar nach dem Einsammeln der
Probe wird der prozentuale Anteil der Lyse durch Messung der optischen
Dichte bei 550 nm bestimmt. Der prozentuale Anteil der Lyse entspricht
dem Verhältnis
des Wertes der OD bei 550 nm der Bakterienlösung nach dem Vortexen, durch
den Wert der OD bei 550 nm vor dem Vortexen.
-
Die Qualität der durch den Vortex-Schritt
freigesetzten Nukleinsäuren
wird auf dem 0,8%igen Agarosegel verifiziert. In jede Vertiefung
werden 10 μl
Lysat gegeben, die Migration erfolgt bei konstanter Spannung (150V)
und das Gel wird vor der Betrachtung unter ultravioletter Strahlung
mit Ethidium-Bromid (ETB) gefärbt.
-
Die Menge der durch den Vortex-Schritt
frei gesetzten Nukleinsäuren
wird über
spezifische Detektion gemäß der sogenannten
Sandwich-Hybridisierungstechnik bestimmt, in dem ein Vidas®-Gerät verwendet wird,
das bei bioMérieux
(Frankreich) erhältlich
ist. Zum Einfangen und zur spezifischen Detektion von S.epidermidis-Nukleinsäuren (siehe
Patent
EP 0632269 ) wurden
Oligonukleotidsonden ausgewählt.
Die Oligonukleotide zum Einfangen und zur Detektion haben jeweils
als Sequenz:
5'-GACCACCTGTCACTCTGTCCC-3' (SEQ ID Nr. 1) und
5'-GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3'
(SEQ ID Nr. 2). Die Detektionssonde ist über Kopplung mit Alkalischer Phosphatase
(AP) markiert.
-
Die spezifische Hybridisierung dieser
Sonden mit den frei gesetzten Nukleinsäuren in dem Lysat ist abhängig von
der Menge von vorhandenen Nukleinsäuren, aber auch von deren Zugang
für die
verwendeten Sonden.
-
Ausgehend von gesammelten Lysaten
wurden zwei Protokolle zur spezifischen Amplifizierung von DNA-
und RNA-Molekülen
von S. epidermidis durchgeführt,
um zu verifizieren, ob die Nukleinsäuren, die durch das Vortexen
freigesetzt wurden, amplifiziert werden können: Ein PCR-Protokoll zur
Amplifizierung von DNA und ein NASBA-Protokoll zur Amplifizierung
von 16S-rRNA.
-
PCR-Protokoll: Die folgende PCR-Technik
ist jene, die von Goodman in PCR-Strategys, Ed: Innis, Gelford und
Sninsky, Académie
press 1995, S. 17–31,
beschrieben wird. Zwei Amplifizierungsprimer wurden verwendet, und
weisen folgende Sequenzen auf
-
Es wurden folgende Temperaturzyklen
verwendet
-
-
NASBA-Protokoll: Die folgende NASBA-Technik
ist jene, die von Van der Vliet et al., J. Gen. Microbiol. 1993,
139: 2423 be schrieben wird. Zwei Amplifizierungssonden wurden verwendet
und weisen folgende Sequenzen auf:
-
Für
jeden PCR- bzw. NASBA-Assay wurden 10 μl Lysat oder 5 μl Lysat verwendet.
Die mittels PCR hergestellten Amplicons wurden auf einem 0,8%igen
Agarosegel angeschaut und auf Vidas gemäß des oben beschriebenen Protokolls
quantifiziert. Die gemäß NASBA
hergestellten Amplicons wurden auf einer Mikroplatte mittels Hybridisierung
mit einer Fängersonde
und einer Sonde zur spezifischen Detektion von S. epidermidis gemäß dem von
P. Cros et al., Lancet 1992, 240: 870 beschriebenen Verfahren detektiert
und quantifiziert. Die Detektionssonde ist an Meerrettichperoxidase
(HRP) gekoppelt. Die beiden Sonden weisen folgende Sequenzen auf:
-
Beispiel 1: Einfluss
des Durchmessers der Kugeln und des Koeffizienten auf die Effizienz
der Lyse mittels Vortex
-
a- Einfluss des Durchmessers
der Kugeln
-
Das Lyseprotokoll wurde, wie oben
beschrieben, ausgehend von einer Anfangssuspension von Staphylococcus
epidermidis (5 × 109 Zellen/300 μl) in Gegenwart von 90 μl verschiedener
Mischungen von Kugeln, die durch verschiedene Durchmesser charakterisiert
sind, für
zwei Minuten pro Assay durchgeführt.
Die getesteten Durchmesser liegen bei 1 bis 500 μm; die getesteten Mischungen
sind folgende:
-
- A: Mikrokugeln aus Glas mit einem Durchmesser von 1 bis
500 μm,
- B: Mikrokugeln aus Glas mit einem Durchmesser von 50 bis 100 μm,
- C: Mikrokugeln aus Glas mit einem Durchmesser von 90 bis 150 μm
- D: Homogenes Gemisch aus Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm,
- E: Homogenes Gemisch von Zirkoniumkugeln mit einem Durchmesser
von 100 μm,
- F: Homogenes Gemisch von Zirkoniumkugeln mit einem Durchmesser
von 500 μm,
- G: Gemisch (50/50 v/v) von Zirkoniumkugeln mit den Durchmessern
von 100 und 500 μm.
-
Wie in 1 angegeben,
ist die erhaltene Zelllyse in Gegenwart von Kugeln mit einem Durchmesser, der
bei 90 bis 150 μm
liegt, und vorzugsweise 100 μm
beträgt,
am effizientesten. Die Messungen der optischen Dichte bei 550 nm
der gesammelten Proben nach 2-minütigem Vortexen unter diesen
Bedingungen verdeutlichen, dass der prozentuale Anteil der Lyse
von S. epidermidis mit diesem Durchmesser der Kugeln bei 60 bis 70%
liegt. Es werden einzig und allein unbedeutende Unterschiede in
den prozentualen Anteilen der Lyse in Abhängigkeit der Natur der Kugeln
(Glas oder Zirkonium) bei selbem Durchmesser beobachtet. Dagegen
bewirkt die Verwendung von Kugeln mit kleinerem oder größerem Durchmesser
als 90 bis 150 μm,
der Mischungen aus Kugeln mit einem Durchmesser von 1 bis 50 μm, 50 bis
100 μm, 100
bis 500 μm,
oder des homogenen Gemisches aus Kugeln mit einem Durchmesser von
500 μm eine
Abnahme des prozentualen Anteils der Lyse. Die Analyse der in das
Lysat freigesetzten Nukleinsäuren
auf einem 0,8%igen Agarosegel, dargestellt in 2, zeigt, dass die DNA- und rRNA-Moleküle gut erhalten
bleiben, da ihr Migrationsprofil auf dem 0,8%igen Agarosegel das
Gleiche ist, wie jenes der aus Bakterien gereinigten und kommerziell
erhältlichen
DNA- und rRNA-Moleküle. Die ausgesalzten Nukleinsäuren haben
ebenfalls das selbe Migrationsprofil, ungeachtet des Durchmessers
der Kugeln, die für
die Zelllyse verwendet wurden. Die freigesetzten Nukleinsäuren sind
ebenfalls mittels Vidas-Analyse detektierbar, deren Protokoll oben
beschrieben ist. Ebenfalls gemäß 2 gibt die Menge der in
das Lysat freigesetzten Nukleinsäuren,
gemessen mittels Vidas-Analyse,
den prozentualen Anteil der erhaltenen Lyse wieder. Parallel hierzu
wurde demonstriert, dass DNA oder 16S-rRNA aus jedem Lysat mittel
für S.
epidermidis spezifischem PCR- oder NASBA-Protokoll amplifiziert
werden können,
die im obigen Teil zum allgemeinen Testprotokoll beschrieben sind.
-
b- Einfluss
des Koeffizienten α
-
- Eppendorf-Röhrchen
-
In Gegenwart von Kugeln mit 100 μm Durchmesser
wurde das Lyseprotokoll für
zwei Minuten durchgeführt.
Für sämtlich Assays
wurden identische Eppendorf-Röhrchen
verwendet. Das Volumen der Bakteriensuspension wurde für jeden
Assay auf 300 μl/Röhrchen fest
eingestellt, und das Volumen der Kugeln variierte von 1 bis 300 μl/Röhrchen.
Gegeben ist Vb, das apparente Volumen der Kugeln, und Ve, das Volumen
der flüssigen
Probe, mit Vb < Ve
und mit Ve = αVb,
wobei α eine
positive reelle Zahl ungleich 0 ist. Der Koeffizient α variierte
von 1 bis 300. Nach dem Vortex-Schritt werden die gesammelten Proben über die
Messung der optischen Dichte bei 550 nm analysiert, die in das Lysat
freigesetzten Nukleinsäuren
werden auf einem 0,8%igen Agarosegel beobachtet und mittels Vidas-Analyse
quantifiziert.
-
3 verdeutlicht,
dass die Lyse von S. epidermidis für Werte des Koeffizienten α von 1,4
bis 10 effizient ist: Der prozentuale Anteil der Lyse liegt bei
30 bis 70%. Für
Werte von α < 1,4 ist das Volumen
der Kugeln sehr groß,
wobei das Totvolumen der Zellsuspension ansteigt, so dass es unmöglich ist,
das Ausgangsvolumen der Zellsuspension wiederzugewinnen. Für Werte
von α > 10 ist das Volumen
der Kugeln gering und die Wahrscheinlichkeit des Zusammentreffens
und mechanischen Aneinanderstoßens
von Kugeln und Zellen ist verringert. Die Zelllyse ist vorzugsweise
für Werte
von α effizienter,
die bei 1,4 bis 3,3 liegen: Der prozentuale Anteil der Lyse liegt
bei 40 bis 70%. Die Analyse des Lysats auf 0,8%igem Agarosegel zeigt,
dass die Migrationsprofile der freigesetzten Nukleinsäuren, ungeachtet
der Werte von α,
nicht verändert
werden. Die Menge von mittels Vidas-Analyse gemessenen Nukleinsäuren korelliert
direkt mit dem prozentualen Anteil der Lyse.
-
- Falcon-Röhrchen
-
Es wurde eine gleiche Studie durchgeführt, in
der die Eppendorf-Röhrchen
durch Falcon-Röhrchen aus
Polypropylen (Vc = 6 ml) ersetzt wurden. 4 verdeutlicht, dass die Lyse von S.
epidermidis für
Werte des Koeffizienten α bei
1,4 bis 10 effizient ist: Der prozentuale Anteil der Lyse ist größer als
20%. Die Zelllyse ist vorzugsweise für Werte von α effizienter,
die bei 1,4 bis 3,3 liegen: Der prozentuale Anteil liegt bei 65
bis 85%.
-
- Scheibenform
-
Es wurde eine Karte mit den Abmessungen
1 = L = 8,5 cm und h = 0,4 cm verwendet. Es werden ein oder mehrere
als Vertiefungen definierte Löcher
mit konstanter und gleicher Höhe
wie die der Karte (d. h. 0,4 cm) und konstantem Durchmesser hergestellt.
Diese Vertiefungen werden auf jeder Seite mit einem Film bedeckt,
und jede Vertiefung wird mit einer Mischung aus Kugeln mit einem
Durchmesser von 100 μl
apparenten Volumens Vb, 10 Eisenkugeln mit einem Durchmesser von
2 mm und einer Zellsuspension des Volumens Ve gefüllt. Die
so definierte Karte wird auf dem Vortex gehalten.
-
Das Lyseprotokoll wird für 2 Minuten
durchgeführt.
Für jeden
Assay wurden wie oben beschriebene Karten mit einem Durchmesser
von 30 cm (Vc = 2,8 ml/Vertiefung) verwendet. Das Volumen der Bakteriensuspension
wurde auf 700 μl/Vertiefung
fest eingestellt und das Volumen der Kugeln variierte von 90 bis
510 μl/Vertiefung.
Der Koeffizient α variierte
von 1,4 bis 7,8. Nach dem Vortex-Schritt wurde der prozentuale Anteil der
Lyse der gesammelten Proben über
die Messung der optischen Dichte bei 550 nm analysiert, wobei die freigesetzten
Nukleinsäuren
im Agarosegel beobachtet und mittels Vidas-Analyse quantifiziert
wurden.
-
5 verdeutlicht
den prozentualen Anteil der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit
des Koeffizienten α. Die
Lyse von S. epidermidis ist mit einem Behälter im „Karten-" Format für die Werte
des Koeffizienten von kleiner oder gleich 2,1 effizient: Wenn α bei 1,4
bis 2,1 liegt, liegt der prozentuale Anteil der Lyse bei 45 bis 75%.
Der optimale Wert des Koeffizienten müsste vorzugsweise bei kleiner
1,4 sein, denn sogar für
Werte von a, die sich 1,4 annähren,
erreichen die Werte der prozentualen Anteile der Lyse kein Plateau.
Die Analyse des Lysats im 0,8%igen Agarosegel zeigt, dass sich die
Migrationsprofile der freigesetzten Nukleine, ungeachtet der Werte
von α, nicht
verändern.
Die Menge der mittels Vidas-Analyse gemessenen Nukleinsäure korelliert direkt
mit dem prozentualen Anteil der Lyse.
-
Beispiel 2: Einfluss des
Koeffizienten β auf
die Effizienz der Lyse mittels Vortex
-
- Eppendorf-Röhrchen
-
Das Lyseprotokoll wurde in Gegenwart
eines konstanten Verhältnisses
zwischen dem apparenten Volumen der Kugeln und dem Volumen der flüssigen Probe
(α = Ve/Vb
= 3,3) für
2 Minuten durchgeführt.
Das Volumen der Bakteriensuspension variierte von 100 μl bis 1 ml.
Dabei ist Ve das Volumen der flüssigen
Probe und Vc das Nutz- oder verfügbare
Volumen des Behälters
mit Ve < Vc und
Vc = βVe,
wobei β eine
positive reelle Zahl von größer 0 ist,
der Koeffizient β variierte
von 1,5 bis 15. Die Experimente wurden in einem Eppendorf-Röhrchen,
d. h. mit Vc = 1,5 ml, durchgeführt.
Nach dem Vortex-Schritt wurden die gesammelten Proben über die
Messung der optischen Dichte bei 550 nm analysiert, die in dem Lysat
vorhandenen Nukleinsäuren siert,
die in dem Lysat vorhandenen Nukleinsäuren wurden auf dem 0,8%igen
Agarosegel beobachtet und mittels Vidas-Analyse analysiert.
-
In 6 ist
der prozentuale Anteil der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit
des Koeffizienten β angegeben. Die
Lyse von S. epidermidis ist für
Werte des Koeffizienten β effizienter,
die bei 2,5 bis 15 liegen: Der prozentuale Anteil der Lyse ist größer als
30%. Für
Werte von β von < 2,5 sind die Volumina
der Kugeln und der flüssigen
Probe sehr groß;
sie begrenzen die Bewegung der Kugeln in der Probe und das Totvolumen
der Probe steigt an. Für
Werte von β größer als
15 ist das Volumen der Probe zu gering, um für α = 3,3 eine vollständige Rückgewinnung
des Ausgangsvolumens der Zellflüssigkeit
zu ermöglichen.
Die Effizienz der Zelllyse ist vorzugsweise für Werte von β, die bei
3,75 bis 15 liegen, besser: Der prozentuale Anteil der Lyse liegt
bei 35 bis 60%; vorzugsweise für
Werte, die bei 7,5 bis 15 liegen (40 bis 60% Lyse). Die Analyse
des Lysats auf 0,8%igem Agarosegel zeigt, dass die Migrationsprofile
der freigesetzten Nukleinsäuren
ungeachtet der Werte von β gleich
sind. Die Mengen der mittels Vidas-Analyse gemessenen Nukleinsäure korellieren
direkt mit den prozentualen Anteilen der erhaltenen Lyse.
-
- Falcon-Röhrchen
-
Es wurde eine gleiche Studie durchgeführt, in
der anstelle von Eppendorf-Röhrchen
Falcon-Röhrchen aus
Polypropylen (Vc = 6 ml) verwendet wurden. Es wurde derselbe Wert
des Koeffizienten α fest
eingestellt (α =
3,3). Das Volumen der Bakteriensuspension variierte von 200 μl bis 2 ml. β variierte
von 3 bis 30. 7 illustriert
den prozentualen Anteil der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit
des Koeffizienten β.
Die Lyse von S. epidermidis ist effizienter für Werte von β, die bei
6 bis 30 liegen: Der prozentuale Anteil der Lyse ist größer als 50%.
Für Werte
von β > 30 ist das Volumen
der Probe zu gering, um für α = 3, 3 ein
vollständiges
Rückgewinnen
des Ausgangsvolumens der Zellsuspension zu ermöglichen. Die Effizienz der
Zelllyse ist vorzugsweise für Werte
von β besser,
die bei 12 bis 30 liegen: Der prozentuale Anteil der Lyse ist größer als
60%.
-
- Scheibenform
-
Das Lyseprotokoll wurde mit dem selben
Behälter,
der in Beispiel 1 verendet wurde (Durchmesser der Vertiefungen 30
mm, Vc = 2,8 ml), mit einem Wert des Koeffizienten α (α = 3,3) für 2 Minuten
durchgeführt. Das
Volumen der Bakteriensuspension variierte von 300 bis 700 μl/Vertiefung.
Der Koeffizient β variierte
von 4 bis 9,3. Nach dem Vortex-Schritt wurde der prozentuale Anteil
der Lyse der gesammelten Proben über
die Messung der optischen Dichte bei 550 nm analysiert, die freigesetzten
Nukleinsäuren
wurden auf dem Agarosegel beobachtet und mittels Vidas-Analyse quantifiziert.
-
In 8 ist
der prozentuale Anteil der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit
des Koeffizienten α gezeigt. Die
Lyse von S. epidermidis ist in dem „Kartenformat"-Behälter für Werte
von β effizient,
die größer oder
gleich 9,3 sind. Wenn β gleich
9,3 ist und ein nicht optimaler Wert von α vorherrscht (α = 3,3),
werden 60% der Zellen lysiert. Die Analyse des Lysats auf 0,8%igem
Agarosegel zeigt, dass sich die Migrationsprofile der freigesetzten
Nukleinsäuren,
ungeachtet der Werte von β nicht ändern und
zu jenen ähnlich
sind, die für
das Röhrchenformat
beschrieben wurden. Die Menge der mittels Vidas-Analse gemessenen
Nukleinsäuren
korelliert mit dem prozentualen Anteil der Lyse für jeden
Assay.
-
Beispiel 3: Einfluss der
Geometrie des Röhrchens
auf die Effizienz der Lyse mittels Vortex
-
Das Lyseprotokoll wurde in Behältern mit
verschiedenen Geometrien und verschiedenen Volumina (Vc) in Gegenwart
von 300 μl
Zellsuspension und 90 μl
Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm für 2 Minuten durchgeführt (d.
h. α = 3,3
und variablem β).
-
- A: Eppendorf-Röhrchen
aus Polypropylen mit einem Boden in Form eines V, Vc = 1,5 ml
- B: Spektrometrieküvette
aus Polypropylen mit ebenem Boden, Vc = 5 ml
- C: Röhrchen
mit ebenem Boden, Vc = 30 ml
- D: Röhrchen
mit ebenem Boden, Vt = 60 ml
- E = Glasfläschchen
mit ebenem Boden, Vc = 8 ml
- F = Glasfläschchen
mit ebenem Boden, Vc = 25 ml
- G = Polysterolröhrchen
mit einem Boden in Form eines U, Vc = 6 ml
- H = Polysterolröhrchen
mit einem Boden in Form eines U, Vc = 14 ml
- I = Polysterolröhrchen
mit einem Boden in Form eines U, Vc = 22 ml
- J = Polypropylenröhrchen
mit einem Boden in Form eines U, Vc = 6 ml
- K = Polypropylenröhrchen
mit einem Boden in Form eines U, Vc = 14 ml
- L = Polypropylenröhrchen
mit einem Boden in Form eines U, Vc = 22 ml
- M = Polypropylenröhrchen
mit einem Boden in Form eines U, Vt = 4 ml.
-
9 zeigt
den prozentualen Anteil der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit
der Geometrie des verwendeten Behälters. Der prozentuale Anteil
der Lyse liegt im Schnitt bei 60 bis 65% bei Röhrchen mit ebenem Boden oder
mit einem Boden in Form eines V, dagegen liegt dieser für dieselben
Vortex-Zeitspannen und ein und demselben Wert für α im Schnitt bei 70 bis 80% bei
Röhrchen
mit einem Boden in Form eines U. Die Messung der Menge von freigesetzten
Nukleinsäuren
mittels Vidas-Analyse bestätigt
diesen Einfluss.
-
Beispiel 4: Einfluss der
Zugabe von Kugeln mit größerem Durchmesser
auf die Effizienz der Lyse mittels Vortex
-
Das Lyseprotokoll wurde in einem
Eppendorf-Röhrchen
in Gegenwart von 300 μl
Zellsuspension und 90 μl
Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm (d. h. α = 3,3 und β = 5) für 2 Minuten durchgeführt. In
das Milieu wurden verschiedene Kugeln in Kombination zugegeben:
Eisenkugeln mit einem Durchmesser von 2 mm, Glaskugeln mit einem
Durchmesser von 3 mm.
-
10 stellt
den prozentualen Anteil der Lyse von S. epidermidis in Abhängigkeit
von verschiedenen Kombinationen von zuge gebenen Kugeln dar. Die
Zugabe der Eisenkugel oder von Glaskugeln bewirkt eine Erhöhung des
prozentualen Anteils der Lyse. Dieser prozentuale Anteil ist deutlich
besser in Gegenwart von bis zu 10 Kugeln/Röhrchen. Das Vorhandensein dieser
10 Kugeln behindert nicht die Bewegung von Kugeln mit einem Durchmesser
von 100 μm;
dagegen wird bei darüber
hinaus gehenden Werten die Bewegung behindert. Der prozentuale Anteil
der erhaltenen Lyse ist in Gegenwart derselben Anzahl von Glaskugeln
pro Assay höher
als bei Eisenkugeln. Gemäß 11 ermöglicht es die Zugabe der Kombination
von Eisen- und Glaskugeln, für
jede getestete Kombination einen ebenfalls hohen prozentualen Anteil
der Lyse zu erhalten, wie in Gegenwart der Zugabe einer homogenen
Mischung von Kugeln; der prozentuale Anteil der Lyse ist größer als 80%.
Die Analyse der freigesetzten Nukleinsäuren auf dem 0,8%igen Agarosegel
zeigt, dass die DNA- und rRNA-Moleküle ungeachtet
der Kombinationen der verwendeten Kugeln, nach der Lyse das gleiche
Migrationsprofil haben. Die Zugabe von Eisen- und Glaskugeln verschlechtert
die Struktur des freigesetzten Nukleinmaterials nicht. Ferner wurde überprüft, dass
deren Anwesenheit in dem Lysat nicht die PCR- und NASBA-Amplifizierungsreaktionen
stören.
-
Beispiel 5: Einfluss der
Vortex-Zeitspannen auf die Effizienz der Lyse mittels Vortex
-
Es wurden parallel drei Lyseprotokolle
durchgeführt:
- – Protokoll
I: Eppendorf-Röhrchen,
Vc = 1,5 ml; 90 μl
Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm und 300 μl Zellsuspension (α = 3,3 und β = 5).
- – Protokoll
II: Protokoll I mit Zugabe von 3 Glaskugeln mit einem Durchmesser
von 3 mm und 5 Eisenkugeln mit einem Durchmesser von 2 mm.
- – Protokoll
III: Protokoll II im Falcon-Röhrchen
(Vc = 6 ml) anstelle dem Eppendorf-Röhrchen.
-
Für
jedes Protokoll werden verschiedene Vortex-Zeitspannen durchgeführt.
-
12 zeigt
für die
Protokolle I und II die prozentualen Anteile der erhaltenen Lyse
in Abhängigkeit von
Vortex-Zeitspannen.
Die experimentellen Bedingungen des Protokolls I sind nicht optimal.
Es bestätigt sich,
dass nach 2 Minuten des Vortexens nur 60% der S.-epidermidis-Bakterien
lysiert sind. Trotz der nicht optimalen Bedingungen ist es dahingegen
möglich,
die Effizienz des Protokolls zu verbessern, indem die Vortex-Zeitspannen
erhöht
werden: 8 Minuten Vortex, 85% der Bakterien sind lysiert. Die experimentellen
Bedingungen des Protokolls II sind wegen der Zugabe von Kugeln mit
einem Durchmesser von 3 mm optimaler, als jene des Protokolls I:
Unter diesen Bedingungen sind bei 4 Minuten Vortex 85% der S.epidermidis-Bakterien lysiert.
-
13 zeigt
die prozentualen Anteile der erhaltenen Lyse in Abhängigkeit
der Vortex-Zeitspannen für die
Protokolle II und III. Die experimentellen Bedingungen des Protokolls
III sind optimaler als jene des Protokolls II: 88% der S.-epidermidis-Bakterien sind nach
bloß 2
Minuten Vortex lysiert, wohingegen nach 2 Minuten mit dem Protokoll
II bzw. I lediglich 80% bzw. 60% der Bakterien lysiert sind. Die
Messung der freigesetzten Nukleinsäuren mittels Vidas bestätigt diese
Hauptbeobachtungen.
-
Folglich ermöglicht es die Erhöhung der
Vortex-Zeitspannen einen hohen prozentualen Anteil der Lyse zu erhalten,
wenn die experimentellen Ausgangsbedingungen nicht optimal sind.
Parallel hierzu können
die Vortex-Zeitspannen, wenn die Bedingungen optimal sind, kurz
sein (2 Minuten).
-
Beispiel 6: Allgemeingültigkeit
des erfindungsgemäßen Lyseprotokolls
-
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Lysieren kann
für weitere
Zellspezies verwendet werden. Hierfür wurde in einem Eppendorf-Röhrchen ein Protokoll in Gegenwart
von 300 μl
Zellsuspension mit der Konzentration von 1 × 109 Zellen/ml,
90 ml Kugeln mit einem Durchmesser von 100 μm und einer Vortex-Zeitspanne von
8 Minuten durchgeführt.
Es wurden jeweils verschiedene Zellen verwendet (Mycobacterium gordonae, Escherichia
coli, Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae, Bacillus
stearothermophilus, Micrococcus sp., Actinomyces viscosus, Actinomyces
naeslundii, Stomatococcus mucilaginosus, Nocardia asteroides, Rhodococcus
sp.). Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass die prozentualen
Anteile der Lyse für
jeden der analysierten Fälle
bei 80 bis 90% liegt. Die Profile der Migration der in jedes Lysat
freigesetzten Nukleinsäuren
auf dem 0,8%igen Agarosegel sind für jeden getesteten Bakterienstamm
vergleichbar, und sind zu jenen der gereinigten und kommerziell
erhältlichen
DNA und 16S-rRNA von E. coli ähnlich.
-
Beispiel 7: Lysieren von
Hefe
-
Getestete Spezies: Candida albicans
-
Behälter: Falcon-Röhrchen aus
Poypropylen mit Vc = 6 ml
-
Probe eingestellt auf 0,5 McFarland,
d.h. 3 × 106 Hefezellen/ml.
-
Probenvolumen: Ve = 600 μl
-
Apparentes Volumen der Kugeln: Vb
(μl variabel):
60, 90 und 180 μl.
-
Durchmesser der getesteten Glaskugeln
(μ): 100,
500 und 1500 μm.
-
Die Effizienz der Lyse wird gemäß dem prozentualen
Anteil der Lyse gemessen:
% Lyse = OD 550 (vor der Lyse) – OD 550
(nach der Lyse)/OD 550 (vor der Lyse)
-
Vortex-Dauer: 2 bis 20 min
-
Es wird demonstriert, dass ein Durchmesser
von 100 μm
nicht ausreichend ist.
-
-
Es wird demonstriert, dass mit einem
Kugeldurchmesser von 1500 μm,
einem Vb, das bei 60 bis 180 liegt, und mit einer Vortexzeitspanne
von 8 bis 20 min, ein prozentualer Anteil der Lyse von ungefähr 30% erreicht
wird.
-
-
Es wird demonstriert, dass es ein
Durchmesser von 500 μ,
mit einem Vb von 60 bis 180 μl
und einer Vortexzeitspanne von 8 bis 20 min, ermöglicht, einen prozentualen
Anteil der Lyse von größer als
50% zu erreichen.
-
Schlussfolgerung:
-
Zum Lysieren von Hefen sind als Parameter
Kugeln mit einem Durchmesser von 500 μm für eine Vortex-Dauer, die bei
8 bis 20 min liegt, in Kombination mit der Bewegung vom Vortex-Typ
notwendig.
-
Beispiel 8: Sensitivität des erfindungsgemäßen Lyseprotokolls
gemäß der Erfindung
-
DNA- und 16S-rRNA-Nukleinsäure, die
durch Lyse nach dem erfindungsgemäßen Verfahren freigesetzt wurden,
wurden einer Amplifizierung unterzogen. Die Lysebedingungen sind
die Gleichen, wie jene, die in Beispiel 6 angegeben sind. Der verwendete
Bakterienstamm ist S. epidermidis. Zwei für die Amplifizierung von Nukleinsäuren von
S. epidermidis spezifische Protokolle wurden ausgehend von den gesammelten
Lysaten durchgeführt,
entweder ein PCR-Protokoll für
die Amplifizierung von DNA, oder ein NASBA-Protokoll für die Amplifizierung
von 16S-rRNA, wie oben in dem allgemeinen Testprotokoll beschrieben.
-
1)- PCR-Amplifizierung von
freigesetzter DNA
-
Es wurden Ausgangskonzentrationen
von 1 × 109 bis 1 × 102 Zellen/ml verwendet. Für jeden PCR-Assay wurden 10 μl Lysat verwendet.
Die hergestellten Amplicons wurden detektiert und nach spezifischer
Sandwich-Hybridisierung auf dem Vidas quantifiziert, wie in dem
allgemeinen Testprotokoll beschrieben. Die hergestellten Amplicons
sind für
Bakterienausgangskonzentrationen von zumindest größer oder
gleich 1 × 102 Zellen/ml, d. h. für 30 Zellen/300 μl messbar.
Folglich ist das optimierte Protokoll zum Lysieren mittels Vortex
effizient, um zumindest 30 Zellen/300 μl zu lysieren, und um mittels
PCR amplifizierbare DNA-Moleküle
freizusetzen, so dass die Menge der hergestellten Amplicons detektierbar
ist.
-
2)- NASBA-Amplifizierung
von 16S-rRNA
-
Es wurden Ausgangskonzentrationen
von 2 × 109 bis 2 × 102 Zellen/ml verwendet. Für jeden NASBA-Assay wurden
5 ml Lysat verwendet. Die hergestellten Amplicons wurden auf Mikroplatten
mittels Sandwich-Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden detektiert,
die spezifisch sind für
S. epidermidis, wie im allgemeinen Testprotokoll beschrieben. Die
hergestellten Amplicons konnten für Bakterienausgangskonzentrationen
von zumindest größer oder
gleich 2 × 102 Zellen/ml, d. h. 60 Zellen/300 ml detektiert
und gemessen werden. Die Menge der gemessenen Amplicons ist für diese
Ausgangskonzentration entscheidend, was verdeutlicht, dass die hergestellten
Amplicons nach der Lyse der Bakterien mit einer Ausgangskonzentration
von 60 Zellen/300 μl
wahrscheinlich detektierbar und messbar wären.
-
Beispiel 9: Auflösung der
Schaumbildung, die auf das Schütteln
der Kugeln in einer Probe zurückzuführen ist
-
Zum Zwecke der Automatisierung ist
es entscheidend, in den Flüssigkeiten
die Schaumbildung zu bewerkstelligen und zu verhindern, welche die
Transferschritte durch Pipetieren stören oder sogar verhindern. Die „Antischaum"-Agenzien
wurden hinsichtlich Ihrer Fähigkeit
untersucht, diesen Phänomentyp
zu begrenzen. Hierzu wurde ein Protokoll ausgehend von respiratorischen
Proben (Speichel, Auswürfe,
broncho-alviolare Spülungen)
valideriert, die verflüssigt
und gemäß dem Protokoll „NaLc"
inaktiviert wurden. Kurz gesagt, 2 ml der Probe werden zu 2 ml antiseptischer
Lösung
(erhalten durch Auflösung
von 0,75 g N-Acetyl-L-Cystein in 150 ml Natron) zugegeben. Das Gemisch
wird gevortext und unter Schütteln
für 20
min bei Raumtemperatur belassen, anschließend mittels 41 ml Phosphatpuffer
(pH 6,8) neutralisiert. Der gesamte Ansatz wird 15 Sekunden gevortext,
anschließend
bei 4°C
für 25
Minuten bei 4000 g zentrifugiert. Das Pellet wird in verbleibenden
2 ml resuspendiert, nachdem der Überstand
entfernt wurde.
-
Anschließend werden verschiedene Proben
vermischt, um für
die Untersuchung ein homogenes und konstantes Milieu bereitzustellen.
Die Assays wurden auf folgende Art durchgeführt: 260 μl Probe werden in ein 12 × 75 mm
Polypropylen-Röhrchen
mit 90 μl
Glaskugeln mit einem Durchmesser von 100 μm, drei Glaskugeln mit einem
Durchmesser von 2 mm, 5 Eisenkugeln mit einem Durchmesser von 2
mm hinzugegeben. 40 μl
eines anionischen Detergenz werden hinzugegeben, um eine Endkonzentration
von 2,5% zu erhalten. Das Vorhandensein eines Detergens rechtfertigt
sich durch die Tatsache, dass die Nukleinsäuren während des Lyseverfahrens stabilisiert
und geschützt
werden müssen.
-
Der gesamte Ansatz wird in einem
Reax-2000-Vortex (Heidolph) bei maximaler Leistung für 12 Minuten
geschüttelt
(besonders lange Zeitspanne verglichen mit dem Standardprotokoll,
was jedoch die Schaumbildung gegebenenfalls begünstigen sollte). Die Höhe der Flüssigkeit
in dem Röhrchen
wird anfangs anschließend
nach dem Schütteln
gemessen und der prozentuale Anteil des erhaltenen Schaums wird
in den folgenden Ergebnissen ausgedrückt, in dem das Verhältnis der
Schaumhöhe
zu der Ausgangshöhe
gebildet wird.
-
-
Das Antischaum-Agens, insbesondere
Foam Ban MS-575 (Ultra Inc., Charlotte, USA) wird in einem vernachlässigbarem
Volumen zugegeben, um Endkonzentrationen von 0, 01 bis 1% zu erhalten
(Tabelle N).
-
Die Ergebnisse (siehe Tabelle N)
zeigen, dass das Vorhandensein eines Antischaums die Auflösung der
Schaumbildung ermöglicht,
insbesondere ausgehend von klinischen Proben wie beispielsweise
Sedimente. Dessen Verwendung bei einer Konzentration von 0,5 bis
1% ermöglicht
die vollständige
Bewerkstelligung der Schaumbildung, die auf das Schütteln der
flüssigen
Probe in Gegenwart der Kugeln zurückzuführen ist.
-
Die Effizienz des Antischaums wurde
gleichermaßen
ausgehend von individuellen Proben (unvermischt) bei einer Endkonzentration
von 0,6% gemäß dem zuvor
beschriebenen Protokoll verifiziert.
-
Die Ergebnisse (siehe Tabelle N +
1) zeigen, dass die Schaumbildung je nach biologischer Probe variabel
ist, dass aber das Vorhandensein eines Antischaums im Rahmen des
Lyseprotokolls die von verschiedenen respiratorischen Proben ausgehende
Schaumbildung bewerkstelligt und verhindert.
-
-
Beispiel 10: Sensitivität des Protokolls
zum Lysieren von Mikroorganismen in Gegenwart von Antischaumagenzien
-
Die Effizienz des gesamten Lyseprotokolls,
insbesondere in Gegenwart eines Antischaums, wurde in Proben ermittelt,
die sehr geringe Konzentrationen von Bakterien enthielten. Es wurden
Mycobacterium bovis BCG-Bakterien verwendet, denn die Mycobacterium-Gattung
ist dafür
bekannt, dass sie schwierig zu lysieren ist, und dass sie insbesondere
in den respiratorischen Entnahmen erforscht wird.
-
Ausgehend von einer homogenen Ausgangssuspension
von Bakterien, deren Konzentration durch densitometrische Messung
(optische Dichte bei 550 nm) bestimmt wurde, wurde eine Verdünnungsreihe
hergestellt, um bei einem vernachlässigbaren Volumen Fraktionen
von inaktiviertem (Erwärmung
auf 95°C
für 15 Minuten)
Negativ-Sediment
(rekonstituiert durch Mischen von verschiedenen verflüssigten
und dekontaminierten Negativ-Sedimenten) zu inokulieren. Die so
rekonstituierten Proben wurden folgendem Protokoll unterzogen:
- – Verdünnung in
einem Puffer, der ein anionisches Detergens und den Antischaum Foam
Ban MS-575 enthält,
um Endkonzentrationen von 2,5% bzw. 1% zu erhalten.
- – Erwärmung bei
95°C für 15 min
(Inaktivierung der Bakterien).
- – Ein
Volumen von 600 μl
wird in eine 12 × 75
ml Küvette
(Polypropylen) gegeben, die 180 μl
Glaskugeln mit 100 μm, 6
Glaskugeln (2 mm Durchmesser), 10 Eisenkugeln (2 mm Durchmesser)
enthält,
und der gesamte Ansatz wird mit Hilfe eines Vortex für 2 Minuten
bei maximaler Leistung geschüttelt.
-
Parallel dazu werden Versuchskontrollen
hergestellt: Diese durchlaufen dasselbe Protokoll wie vorher beschrieben,
ausgenommen den Schritt des Schüttelns
der Kugeln mittels Vortex.
-
Die so potentiell freigesetzten Nukleinsäuren werden
dann mittels eines spezifischen Einfangschrittes an Magnetkugeln
(Seradyne) gereinigt, die mit einem Fängeroligonukleotid versehen
waren, das komplementär
zu der 16S-RNA von M. tuberculosis BCG war, und zwar gemäß nachfolgendem
Protokoll:
- – 250 μl des erhaltenen Lysats werden
mit einem Fängerpuffer
gemischt, der an magnetische Kugeln (50 μg/Assay) gekoppelte Oligonukleotidsonden
enthält.
Der gesamte Ansatz wird für
20 min bei 60°C,
anschließend
für 10
min bei. Raumtemperatur inkubiert, danach wird nach der Immobilisierung
der Kugeln an den Wänden
der Röhrchen
mittels Magnetisierung der Überstand
entfernt.
- – Die
Kugeln werden mittels 2 Fraktionen von 1 ml Waschpuffer gewaschen
(Resuspendierung, anschließend
Magnetisierung).
- – Nach
der Entfernung des Puffers werden die Kugeln mit 50 μl Wasser
und 25 μl
Amplifizierungsgemisch resuspen diert, das die Oligonukleotidprimer
und Desoxyribonukleotide des Identifizierungskits für M. tuberkulosis
(„Amplified
Mycobacterium Tuberculosis Direct", Gen-Probe Ref. 1001) enthält, basierend
auf der „Transcription-Mediated
Amplification" (TMA), beschrieben von McDonough et al. (Nucleic
Acids Amplification Technologies, 1997, Ed. Lee, Morse & Olsvik, Eaton
Publishing, Natik, USA, S. 113–123),
sowie von Kacian und Fulz (Nucleic Acid Sequences Amplification
Methods, 1995, US-Patent Nr. 5,399,491).
- – Der
gesamte Ansatz wird bei 60°C
für 15
Minuten erhitzt, auf 42°C
für 5 Minuten
abgekühlt,
und es werden 25 μl
der Enzymlösung
des Kits (enthaltend RNA-Polymerase T7 und Reverse Transcriptase)
hinzugegeben.
- – Die
Reaktion wird für
eine Stunde bei 42°C
inkubiert, anschließend
unter Verwendung der Detektionsreagenzien des Kits gemäß der Technik „Hybridization
Protection Assay" (HPA) analysiert, die von Arnold et al. (Clin.
Chem., 1989, Vol. 35, S. 1588–1594)
beschrieben wird.
- – Die
Reaktionen werden anschließend
in einem Luminometer 450 i (Gen-Probe) ausgelesen, und liefern Daten
in relativen Lumineszenzeinheiten (RLU), wobei die Positiv-Grenze
eines Assays 30000 RLUs beträgt.
-
Die erhaltenen Daten sind in Tabelle
N + 2 angegeben und entsprechen 3 experimentellen Assays pro getesteter
Bedingung.
-
-
Die Ergebnisse (siehe Tabelle N +
2) zeigen, dass die Durchführung
des Lyseprotokolls mittels Glaskugeln in Gegenwart von Antischaumagenzien
es ermöglicht,
auf empfindliche Art und Weise in biologischen Proben eine Menge
zu detektieren, die 10–3 Bakterien/Assay entspricht,
d. h. eine Menge, die 1 bis 10 Kopien von Ribosomen entspricht.
Im Vergleich hierzu, kann ohne Lysieren (abgesehen von der anfänglichen
Erwärmung in
Gegenwart von Detergens zur Inaktivierung der Proben) nur ein Äquivalent
10 bis 1000 Bakterien detektiert werden, d. h. 10.000 Mal weniger
als mit der verwendeten Lysemethode.
-
Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit
des Protokolls, das die Lysierung der Bakterien über mechanischen Schock in
Gegenwart von Kugeln (mittels eines Vortex oder anderem) mit der
Verwendung von Antischaumagenzien verbindend kombiniert. Die Kombination
eines Lyseverfahrens durch Schütteln
von Kugeln ist folglich perfekt angepasst.