JP3093164B2 - 抗酸菌の細胞溶解方法及び核酸の抽出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は培養した抗酸菌や血
液、尿、髄液、痰、精液、細胞、組織、生検標本に存在
する抗酸菌の細胞を簡単にかつ効率よく溶解する細胞溶
解方法並びに当該細胞溶解方法を用いて抗酸菌から核酸
を効率よく抽出する核酸の抽出方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】近年、核酸プローブや遺伝子増幅法を用
いた抗酸菌の研究や診断が急速に進歩し、抗酸菌からの
核酸抽出がますます重要になってきた。しかし、抗酸菌
が他の微生物に比べて細胞に脂質を多く含むことから、
従来の核酸抽出方法では細胞を十分に溶解することがで
きないため、高い回収率で核酸を抽出することが出来な
かった。

【０００３】核酸の抽出を行なうには通常基本的に４つ
の操作を行う必要がある。すなわち、細胞の溶解、
除蛋白と脱炭水化物、分離濃縮、洗浄精製の４つの
操作である。細胞の溶解にはリゾチーム、アクロモペ
プチダーゼなどの細胞壁溶解酵素やプロテインナーゼＫ
等の蛋白分解酵素を用いたり、アルカリやＳＤＳ等の界
面活性剤を用いて細胞を破壊する。

【０００４】また結核菌やぶどう球菌等強固な細胞壁を
持つ微生物の場合、ビーズや超音波を用いて物理的に破
壊させたりする。場合によってはこれに併用して細胞壁
溶解酵素や蛋白分解酵素を作用させたり、アルカリや界
面活性剤添加を組合わせて行う。

【０００５】の除蛋白と脱炭水化物については従来よ
りフェノール・クロロホルム法による抽出が最も多く使
用されている。しかしこのフェノール・クロロホルム法
は毒性が強いうえ時間と手間がかかるため大変扱いにく
いという問題があった。そこで、本願出願人は生物材料
から核酸を溶出するための前処理を行ったのち、この前
処理した生物材料にチキソトロピック増粘剤を含む非親
水性の高比重有機液体と水性液体を加えて混合し、遠心
分離後、上層と下層の境界面に非流動性の凝集層を形成
し、上層の核酸を分離抽出するようにした核酸の抽出方
法、即ち相分配抽出法を提案し、特許を得ている（特許
第２５４８４９４号）。

【０００６】の後に分離濃縮操作においては、核酸
を含む水性液体から１００％のイソプロピルアルコール
又は１００％のエタノール等で核酸（DNA またはRNA ）
を沈殿させて分離濃縮するが、従来の分離濃縮操作で
は、核酸を含む水性液体の塩濃度が高いため、この段階
でイソプロピルアルコール（終濃度が５０％）又はエタ
ノール（終濃度が７０％）等を加えても、核酸の沈殿物
が無色透明であるため確認できず、この段階で核酸沈殿
物を捨ててしまうことがあり、十分に核酸を回収するこ
とができなかった。

【０００７】核酸の抽出効率と抽出の正確度は、第一
に、この分離濃縮操作時の核酸と共沈剤をいかにもれな
く回収するかに起因する。そこで、本願出願人は、イソ
プロピルアルコールやエタノール等によるアルコール沈
殿による核酸を含む水性液体からの核酸の分離濃縮操作
の過程において、核酸と親和性を有し、逆転写反応と競
合せず、PCR 反応を阻害しないで、テクニカルエラーを
最小限に抑えるべく、白い沈殿物または青い沈殿物とし
て目視を可能にすると同時に核酸の回収率を確実にする
共沈剤及びその共沈剤を用いた核酸の抽出方法について
も既に提案した（国際公開番号第Ｗ０９７／０７２０７
号）。

【０００８】洗浄精製においては、通常７０％エタノ
ールを用いて、分離濃縮された核酸から不純物を取り除
き精製する。

【０００９】特に、抗酸菌から核酸を抽出するために
は、その細胞壁の溶解を目的に軽質石油などの有機溶剤
処理による脂質除去やリゾチーム等の細胞溶解酵素を用
いた方法、又は煮沸処理等があるが、いずれの方法でも
抗酸菌の細胞を完全に溶解することができないため、時
間がかかり、核酸の回収率も低かった。また、超音波発
生機を用いた超音波処理による細胞破砕では、抽出した
核酸の分解と実施者への飛沫感染等の問題があった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来の抗酸菌の細胞溶解処理における問題点に鑑みて発明
されたもので、有機溶剤処理や超音波処理による細胞破
砕を行わずに、脂質分解酵素を用いることにより抗酸菌
の細胞壁に存在する脂質を可溶化させて細胞を容易に溶
解することができる抗酸菌の細胞溶解方法並びにこの方
法を用いて高い回収率で、しかも簡便、迅速、安全に核
酸を抽出することができる核酸の抽出方法を提供するこ
とを目的とするものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに、本発明の抗酸菌の細胞溶解方法は、抗酸菌を予め
蛋白質分解活性を含む酵素剤で処理して抗酸菌自身が保
有するリパーゼインヒビターの活性を阻害または失活さ
せた後、脂質分解活性を含む酵素剤を作用させることに
より抗酸菌の細胞壁に存在する脂質を分解させ、細胞を
溶解することを特徴とする。

【００１２】上記した蛋白質分解活性を含む酵素剤とし
ては、トリプシン、プロナーゼ、キモトリプシン、プラ
スミン及びズブチリシンからなる群から選ばれた１又は
２以上の酵素剤を用いることができる。上記した脂質分
解活性を含む酵素剤としては、リパーゼが好適である。

【００１３】本発明の核酸の抽出方法は、上記した抗酸
菌の細胞溶解方法を用いて核酸を抽出することを特徴と
する。具体的には、上記抗酸菌の細胞溶解方法によって
細胞壁に存在する脂質を分解させた抗酸菌を界面活性剤
及び変性剤又は細胞壁溶解酵素で処理することによって
抗酸菌から核酸を抽出することができる。

【００１４】本発明の最も好適な態様は、リパーゼの作
用を増強させるために、抗酸菌を予めトリプシンやプロ
ナーゼ等の蛋白分解活性を含む酵素剤で処理し、抗酸菌
自身が保有するリパーゼの作用を阻害するリパーゼイン
ヒビターの活性を阻害または失活させたのち、リパーゼ
を使用して抗酸菌の細胞壁に存在する脂質を可溶化し、
細胞を溶解する方法である。この方法によれば、抗酸菌
の細胞をさらに効率よく溶解することができ、したがっ
て、抗酸菌からの核酸抽出を容易に行なうことが可能と
なる。

【００１５】本発明の抗酸菌の細胞溶解方法は、好まし
くは、抗酸菌からの核酸の抽出操作の前の段階、すなわ
ち抗酸菌の細胞を溶解する操作において、脂質分解活性
及び蛋白質分解活性を含む酵素剤、もしくは予め蛋白質
分解活性を含む酵素剤で処理した後、脂質分解活性を含
む酵素剤を、培養した抗酸菌や抗酸菌が存在する血液、
尿、髄液、痰、精液、細胞、組織、生検標本等の生物材
料に添加することによって行なわれる。

【００１６】本発明において使用する脂質分解活性及び
蛋白質分解活性を含む酵素剤としては、リパーゼＡ〔天
野製薬（株）〕、リパーゼＭ〔天野製薬（株）〕、リパ
ーゼＦ〔天野製薬（株）〕、リパーゼＡＹ〔天野製薬
（株）〕、リパーゼＰＳ〔天野製薬（株）〕、リパーゼ
Ｆ−ＡＰ１５〔天野製薬（株）〕を使用することができ
る。培養した抗酸菌や抗酸菌が存在する生物材料を予め
０．１％〜１０．０％（Ｗ／Ｖ）の範囲の濃度の陰イオ
ン性界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤等を含む緩
衝液（ｐＨ５〜９）中で前処理したのち、上記した酵素
剤を１単位／ml〜１００００００単位／ml、好ましくは
１００単位／ml〜１００００単位／mlの濃度で使用する
のが好適である。

【００１７】脂質分解活性を含む酵素剤を用いる場合
は、培養した抗酸菌や抗酸菌が存在する生物材料を予め
０．１％〜１０．０％（Ｗ／Ｖ）の範囲の濃度の陰イオ
ン性界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤等を含む緩
衝液（ｐＨ５〜９）中で前処理したのち、１単位／ml〜
１００００００単位／ml、好ましくは１００単位／ml〜
１００００単位／mlの濃度の脂質分解酵素で処理するの
が好適である。

【００１８】最も好適には、上記した脂質分解活性を含
む酵素剤を加える前に、培養した抗酸菌や抗酸菌が存在
する生物材料に０．１mg／ml〜１０００mg／mlの濃度の
蛋白質分解活性を含む酵素剤の１又は２以上で処理した
のち、１単位／ml〜１００００００単位／ml、好ましく
は１００単位／ml〜１００００単位／mlの濃度の脂質分
解活性を含む酵素剤で処理する。

【００１９】本発明の核酸の抽出方法は、上記した抗酸
菌の細胞溶解方法を細胞の溶解操作に適用するものであ
る。この細胞溶解方法により抗酸菌の細胞壁に存在する
脂質を可溶化したのち、抗酸菌から核酸を抽出するため
には、キレート剤を含む緩衝液（ｐＨ５〜９）中で前処
理したのち、細胞膜または細胞壁等を破壊するために通
常は約０．１％〜２０．０％（Ｗ／Ｖ）の範囲の濃度の
陰イオン界面活性剤や非イオン性界面活性剤等の膜溶解
剤と約１Ｍ〜５Ｍのグアニジンチオシネートまたは約１
Ｍ〜５Ｍの塩酸グアニジン等の蛋白変性剤で処理する。
場合によっては、細胞膜や細胞壁等を破壊するための酵
素によって処理してもよい。

【００２０】上記した細胞膜や細胞壁等を破壊するため
の酵素として好適に用いられるものは、約１mg／mlから
５０mg／mlの濃度のリゾチーム、アクロモペプチダー
ゼ、リゾスタフィン、リチカーセ、ムタノリシン等の膜
溶解剤、もしくは約１０μｇ／mlから２０mg／mlの濃度
の蛋白変性剤、たとえばプロテアーゼｋ、プロナーゼ、
ペプシン、パパイン等がある。

【００２１】上記したような前処理を行うと、抗酸菌や
抗酸菌が存在する生物材料は上記したキレート剤、膜溶
解剤、蛋白変性剤等を含む水溶液に溶解し、この水溶液
中には核酸と各種の生物物質が可溶化する。次に、抗酸
菌の核酸と各種の生物物質が可溶化しているこの水溶液
から、核酸を抽出するためには、フェノール／クロロホ
ルム抽出やチキソトロピック増粘剤を用いる相分配抽出
法（特許第２５４８４９４号）、又はガラス等のシリカ
表面上への固相吸着等の方法を適用することができる。
また、分離濃縮操作時において前記した共沈剤を用いる
方法（国際公開番号第Ｗ０９７／０７２０７号）を適用
することもできる。

【００２２】本発明でいう抗酸菌としては、マイコバク
テリウム・アフリカ，マイコバクテリウム・アビウム，
マイコバクテリウム・アビウム亜種アビウム，マイコバ
クテリウム・アビウム亜種パラツベルクロシス，マイコ
バクテリウム・アビウム亜種シルバティカム，マイコバ
クテリウム・ボビス，マイコバクテリウム・ケローネ，
マイコバクテリウム・クキイイ，マイコバクテリウム・
フラベッセンス，マイコバクテリウム・フォーチュイタ
ム，マイコバクテリウム・フォーチュイタム亜種アセタ
ミドリチカム，マイコバクテリウム・ガストリ，マイコ
バクテリウム・ゴルドネ，マイコバクテリウム・ヘモフ
ィルム，マイコバクテリウム・イントラセルラー，マイ
コバクテリウム・カンサシイ，マイコバクテリウム・レ
プレ（癩菌），マイコバクテリウム・レプレムリウム
（鼠癩菌），マイコバクテリウム・マルモエンセ，マイ
コバクテリウム・マリナム，マイコバクテリウム・ミク
ロティ，マイコバクテリウム・モリオカエンセ，マイコ
バクテリウム・ノンクロモジェニカム，マイコバクテリ
ウム・フレイ（チモテ菌），マイコバクテリウム・ポリ
フェレ，マイコバクテリウム・スクロフラセウム，マイ
コバクテリウム・シミエ，マイコバクテリウム・スメグ
マチス（スメグマ菌），マイコバクテリウム・シュルガ
イ，マイコバクテリウム・テラエ，マイコバクテリウム
・トリビアーレ，マイコバクテリウム・ツベルクローシ
ス（結核菌），マイコバクテリウム・ウルセランス，マ
イコバクテリウム・バッカエ，マイコバクテリウム・ゼ
ノピから選ばれる。

【００２３】本発明で用いられる脂質分解活性を含む酵
素剤としては、グリセロールエステルを加水分解し、脂
肪酸を遊離する酵素、膵リパーゼ、リポプロテインリパ
ーゼ、ヘパティックリパーゼ、ホルモンセンシティブリ
パーゼ、モノグリセリドリパーゼ、トリアシルグリセロ
ールリパーゼ等のリパーゼやリパーゼ活性を持つエステ
ラーゼ等を指す。

【００２４】本発明で用いられる蛋白分解活性を含む酵
素剤としては、プロテアーゼ、プロナーゼ、トリプシ
ン、キモトリプシン、プラスミン、ズブチリシン、ナガ
ーゼ等がある。

【００２５】脂質分解活性を含む酵素剤と蛋白分解活性
を含む酵素剤を溶解する適当な水溶液には、０．１％〜
１０．０％（Ｗ／Ｖ）の範囲の濃度の陰イオン性界面活
性剤、又は非イオン性界面活性剤等を含む蒸留水、また
は、Ｔ・Ｅｂｕｆｆｅｒ（一般的には５０ｍＭのトリス
ヒドロキシメチルアミノエタン−塩酸緩衝液ｐＨ８．０
・２０ｍＭのＥＤＴＡ）等の緩衝液や塩化ナトリウム，
塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，酢
酸ナトリウム，塩化アンモニウム，酢酸アンモニウム，
硫酸アンモニウム等の無機塩およびその混合物があり、
通常、約０．１Ｍ〜１０．０Ｍの範囲の濃度で使用す
る。

【００２６】上記した陰イオン界面活性剤には、ラウリ
ル硫酸ナトリウム，Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウ
ム，リン酸ラウリル，カプリレート塩，コレート塩，ス
ルフォン酸デカン塩，デオキシコレート塩，グリココレ
ート塩，グリコデオキシコレート塩，タウロコレート
塩，タウロデオキシコレート塩等がある。

【００２７】上記した適切な非イオン性界面活性剤に
は、Ｓｐａｎ２０，Ｓｐａｎ４０，Ｓｐａｎ６０，Ｓｐ
ａｎ６５，Ｓｐａｎ８０，Ｓｐａｎ８５等のｄ−ソルビ
トールの脂肪酸エステル類、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｗｅｅ
ｎ２１，Ｔｗｅｅｎ４０，Ｔｗｅｅｎ６０，Ｔｗｅｅｎ
６５，Ｔｗｅｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ８１，Ｔｗｅｅｎ８
５等のポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキ
ルエステル類、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等のポリオキシ
エチレングリコールｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル
類等がある。

【００２８】

【実施例】以下に、本発明の実施例を挙げて説明する
が、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないこ
とは勿論である。

【００２９】実施例１ 小川培地にて２週間培養したマイコバクテリウム・アビ
ウムを４．０mlのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＥＤＴＡ、２
５ｍＭのトリス−塩酸：ｐＨ８．０）に懸濁し、クレッ
ト吸収試験管に１．０×１０⁹ cells ／mlとなるように
調製して被験菌液とした。この被験菌液に０．２％のTr
itonX-100 を含む同緩衝液で調製した１０mg／mlのリパ
ーゼＭ〔天野製薬（株）製〕を０．５ml加え、５０℃、
６０分間反応させた後、０．５mlの５Ｍのグアニジンチ
オシネート、５％のラウロイル・サルコシン・ナトリウ
ム、２５ｍＭのクエン酸ナトリウムの溶液を加えて６０
℃、６０分間の処理を行い、クレット光電光度計（富士
工業株式会社製）を使って濁度を測定し、表１に示し
た。

【００３０】対照には、リパーゼＭ〔天野製薬（株）
製〕を含まない同緩衝液を用いて同様の方法で実験し
た。結果は、リパーゼＭ〔天野製薬（株）製〕を作用さ
せた実施例１の方が対照に比べて濁度が低かった。細胞
が溶解することによって溶液の透明度が増し、濁度は低
下する。即ち、濁度が低い程細胞溶解が進んでいること
を示す。実施例１の濁度の数値は細胞溶解が充分に行わ
れたことを示している。

【００３１】比較例１ 上記実施例１と比較するために、リパーゼＭ〔天野製薬
（株）〕の代わりにブタ膵リパーゼを用いて同様の方法
で実験した。また、対照には、リパーゼＭ〔天野製薬
（株）〕を含まない同緩衝液を用いて同様の方法で実験
した。結果を表１に示した。比較例１の場合、対照に比
較して濁度が多少低下しているが、実施例１に比較すれ
ばはるかに高い濁度であり、細胞溶解が多少あったにし
ても充分に行われたとはいえない。

【００３２】

【表１】

【００３３】実施例２ 小川培地にて２週間培養したマイコバクテリウム・イン
トラセルラーを滅菌生理食塩水等で１．２×１０⁹ cell
s ／mlに調製し被験菌液とした。この被験菌液１mlをマ
イクロチューブ（１．５ml〜２．０ml）に移し、１２０
００回転、５分間の遠心分離で上清を除去して、菌体を
５００μｌの５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭのトリスー塩酸（ｐＨ８．
０）の緩衝液に懸濁し、５分間室温に放置した。放置
後、５０mg／mlの濃度のプロテアーゼで３７℃、６０分
間の処理を行ったのち、１２０００回転、５分間の遠心
分離で上清を除去した。

【００３４】続いて、４００μｌの０．２％のTritonX-
100 を含む上記の緩衝液で再懸濁し、５０μｌの１００
０単位／mlのリポプロテインリパーゼと５０μｌの１mg
／mlの濃度のリゾチームを加え、３７℃、６０分間の処
理を行い細胞壁を溶解した。

【００３５】次に、細胞膜と蛋白質を変性させるために
５Ｍのグアニジンチオシネート、５％のラウロイル・サ
ルコシン・ナトリウム、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム
の溶液を１００μｌ加えて６０℃、６０分間の処理を行
ったのち、フェノール・クロロホルム・イソアミルアル
コール（２５：２４：１，Ｖ／Ｖ）６００μｌ加え激し
く振とうした後、１２０００回転で１５分間遠心分離す
る。

【００３６】核酸は水性液体層（上層）に、変性蛋白質
は水性液体層と有機液体層（下層）との中間層に綿状の
白い層をつくるので、その白い層を吸い込まないように
ＤＮＡ層を注意深く口の広いピペットを用いて静かに吸
い取り、新しいマイクロチューブに移した。６００μｌ
の冷イソプロピルアルコールを加えよく混合した後、１
２０００回転で１５分間遠心して核酸を沈殿させ上清を
除去した後、ペレットに１mlの７０％のエタノールを加
え１２０００回転で５分間遠心して上清を除去した。

【００３７】この７０％のエタノールによる核酸の沈殿
操作を２回行ったのち、沈殿を乾燥させ、０．１×ＳＳ
Ｃを加えて核酸を溶解した。このときに抽出・精製した
核酸の回収率と純度は分光光度計（HITACHIU-3200 Spec
trophotometer)を使って、波長２６０ｎｍの吸光度を測
定してＤＮＡ量を計算（ＯＤ₂₆₀ １．０のとき、５０μ
ｇ／mlのＤＮＡ量に相当する）して回収率を求めた。

【００３８】また純度試験として波長２８０ｎｍと波長
２３４ｎｍの吸光度を測定し、ＯＤ ₂₆₀ ／ＯＤ₂₈₀ の比
率が１．６５〜１．８５の範囲にあれば蛋白質等の混在
はほとんどないものと判定し、ＯＤ₂₃₄ ／ＯＤ₂₆₀ の比
率が０．９以下であれば多糖類等の混在は少ないものと
判定した。この時抽出・精製した核酸の回収率と純度の
測定結果を表２に示した。表２から明らかなように、実
施例２の回収率は比較例２の軽質石油を用いた方法に比
べて約３倍となり極めて優れており、また純度において
もほぼ同等といえるものであった。

【００３９】比較例２ 上記実施例２と比較するために、以下に記した従来公知
の軽質石油を用いた方法で実験した。

【００４０】小川培地にて２週間培養したマイコバクテ
リウム・イントラセルラーを滅菌生理食塩水等で１．２
×１０⁹ cells ／mlに調製し被験菌液とした。この被験
菌液１mlをマイクロチューブ（１．５ml〜２．０ml）に
移し、１２０００回転、５分間の遠心分離で上清を除去
したのち、菌体を５００μｌの軽質石油：クロロホル
ム：緩衝液（３：１：１）に懸濁し、ボルテックスミキ
サーを用いて１５分間懸濁した。懸濁後、１mlの緩衝液
を加えよく混和させたのち、１２０００回転、５分間の
遠心分離で上清を除去した。

【００４１】次いで、１０mg／mlのナガーゼを加えて３
７℃、４時間の処理を行ったのち、５０mg／mlのリゾチ
ームを加えて５０℃、４時間の処理を行った。

【００４２】次に、１％のラウリル硫酸ナトリウムと３
mg／mlのプロナーゼを加えて３７℃、１２時間の処理を
行ったのち、フェノール・クロロホルム・イソアミルア
ルコール（２５：２４：１，Ｖ／Ｖ）６００μｌ加え激
しく振とうした後、１２０００回転で１５分間遠心分離
する。核酸は水性液体層（上層）に、変性蛋白質は水性
液体層と有機液体層（下層）との中間層に綿状の白い層
をつくるので、その白い層を吸い込まないようにＤＮＡ
層を注意深く口の広いピペットを用いて静かに吸い取
り、新しいマイクロチューブに移した。

【００４３】６００μｌの冷イソプロピルアルコールを
加えよく混合した後、１２０００回転で１５分間遠心し
て核酸を沈殿させ上清を除去した後、ペレットに１mlの
７０％のエタノールを加え１２０００回転で５分間遠心
して上清を除去した。この７０％のエタノールによる核
酸の沈殿操作を２回行ったのち、沈殿を乾燥させ、０．
１×ＳＳＣを加えて核酸を溶解した。この時抽出・精製
した核酸の回収率と純度を実施例２と同様に測定し、表
２に示した。

【００４４】

【表２】

【００４５】実施例３ 小川培地にて２週間培養したマイコバクテリウム・アビ
ウムを減菌生理食塩水等で６．４×１０⁸ cells ／mlに
調製し被験菌液とした。この被験菌液１mlをマイクロチ
ューブ（１．５ml〜２．０ml）に移し、１２０００回
転、５分間の遠心分離で上清を除去して、菌体を５００
μｌの１００ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ
のトリス−塩酸（ｐＨ８．０）の緩衝液に懸濁し、５分
間室温に放置した。放置後、５０mg／mlの濃度のトリプ
シンで３７℃、６０分間の処理を行ったのち、１２００
０回転、５分間の遠心分離で上清を除去した。

【００４６】続いて、４００μｌの０．２％のＴｗｅｅ
ｎ−２０を含む上記の緩衝液で再懸濁し、５０μｌの１
００００単位／mlのリパーゼと５０μｌの１mg／mlの濃
度のリゾチームを加え、４５℃、３０分間の処理を行
い、細胞壁を溶解した。

【００４７】次に、細胞膜と蛋白質を変性させるために
５Ｍのグアニジンチオシネート、１０％のラウロイル・
サルコシン・ナトリウム、２５ｍＭのクエン酸ナトリウ
ムの溶液を１００μｌ加えて６０℃、６０分間の処理を
行ったのち、２．７％（Ｗ／Ｖ）のＢＥＮＴＯＮＥ Ｓ
Ｄ−３を含むクロロホルム：イソアミルアルコール（２
４：１，Ｖ／Ｖ）６００μｌを加え激しく振とうした
後、１２０００回転で１５分間遠心分離した。

【００４８】遠心分離後、上層（水性液体層）と下層
（高比重有機液体層）の境界面に非流動凝集層が形成さ
れるので、マイクロチューブを傾斜（デカンテーショ
ン）させて上層のＤＮＡを含む水性液体層を新しいマイ
クロチューブに移した。

【００４９】水性液体層の１／１０量に相当する量の３
Ｍの酢酸ナトリウムを加え、さらに同量のイソプロピル
アルコールを加え軽く攪拌した後、１２０００回転で１
５分間遠心して核酸を沈殿させ、デカンテーションで静
かに上清を除去した後、ペレットに７０％のエタノール
１mlを静かに加え１２０００回転で５分間遠心してデカ
ンテーションで静かに上清を除去し、乾燥させた後、
０．１×ＳＳＣを加えて核酸を溶解した。

【００５０】この時抽出・精製した核酸の回収率と純度
を実施例２と同様に測定し、表３に示した。この時抽出
・精製した核酸の回収率と純度は、表３から明らかなよ
うに比較例３の煮沸・超音波法を用いた方法と同等の成
績であった。

【００５１】比較例３ 上記実施例３と比較するために、以下に記した従来公知
の煮沸・超音波法を用いた方法で実験した。

【００５２】小川培地にて２週間培養したマイコバクテ
リウム・アビウムを滅菌生理食塩水等で６．４×１０⁸
cells ／mlに調製し被験菌液とした。この被験菌液１ml
をマイクロチューブ（１．５ml〜２．０ml）に移し、１
００℃で１０分間煮沸したのち、４０μｇのプロテイネ
ースＫと０．５％のTween ２０、及びガラスビーズを加
え、３７℃、３０分間の処理を行った。

【００５３】続いて、６０℃で２０分間の超音波処理を
行ったのち、フェノール・クロロホルム・イソアミルア
ルコール（２５：２４：１，Ｖ／Ｖ）６００μｌを加え
激しく振とうした後、１２０００回転で１５分間遠心分
離する。核酸は水性液体層（上層）に、変性蛋白質は水
性液体層と有機液体層（下層）との中間層に綿状の白い
層をつくるので、その白い層を吸い込まないようにＤＮ
Ａ層を注意深く口の広いピペットを用いて静かに吸い取
り、新しいマイクロチューブに移した。

【００５４】６００μｌの冷イソプロピルアルコールを
加えよく混合した後、１２０００回転で１５分間遠心し
て核酸を沈殿させ上清を除去した後、ペレットに１mlの
７０％のエタノールを加え１２０００回転で５分間遠心
して上清を除去した。この７０％のエタノールによる核
酸の沈殿操作を２回行ったのち、沈殿を乾燥させ、０．
１×ＳＳＣを加えて核酸を溶解した。この時抽出・精製
した核酸の回収率と純度を実施例２と同様に測定し、表
３に示した。

【００５５】

【表３】

【００５６】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、回
収率の低い有機溶剤処理を用いた方法や実験者への感染
の恐れがある超音波処理による細胞破砕を行わずに、脂
質分解酵素を有効に用いることにより抗酸菌の細胞壁に
存在する脂質を可溶化させて細胞を容易に溶解し、高い
回収率で、しかも簡便・迅速・安全に核酸を抽出すると
いう大きな効果が達成される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 浅井 義征 埼玉県与野市上落合神明494−４ (56)参考文献 特開 平６−319527（ＪＰ，Ａ) 特公 昭46−3109（ＪＰ，Ｂ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗酸菌を予め蛋白質分解活性を含む酵素
   剤で処理して抗酸菌自身が保有するリパーゼインヒビタ
   ーの活性を阻害または失活させた後、脂質分解活性を含
   む酵素剤を作用させることにより抗酸菌の細胞壁に存在
   する脂質を分解させ、細胞を溶解することを特徴とする
   抗酸菌の細胞溶解方法。
2. 【請求項２】 蛋白質分解活性を含む酵素剤として、ト
   リプシン、プロナーゼ、キモトリプシン、プラスミン及
   びズブチリシンからなる群から選ばれた１又は２以上の
   酵素剤を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 脂質分解活性を含む酵素剤として、リパ
   ーゼを用いることを特徴とする請求項１又は２記載の方
   法。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項記載の抗酸
   菌の細胞溶解方法を用いて核酸を抽出することを特徴と
   する核酸の抽出方法。
5. 【請求項５】 細胞壁に存在する脂質を分解させた抗酸
   菌を界面活性剤及び変性剤又は細胞壁溶解酵素で処理す
   ることによって抗酸菌から核酸を抽出することを特徴と
   する請求項４記載の方法。