JP4909486B2 - 原核生物または真核生物の細胞溶解または原核生物と真核生物の同時細胞溶解方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は３つの異なる技法、すなわち超音波分解、機械的渦および磁気渦のための、原核生物と真核生物の同時細胞溶解に適した万能溶解方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現状技術を構成する文書には、上述の３つの技法のうち、１つだけしか扱われていない。
超音波分解に関して、出願人は下記の特性を有する音極の能動化方法を記載する特許出願ＦＲ９９／０４２８９を出願した：
・超音波分解時間１０から１５分、
・４０から６０％の間に含まれ、好適には５０％であるサイクル比、
・出力１０から３０Ｗ、
この超音波分解は酵母またはバクテリアなどの微生物の溶解に効果的である。しかしながら、本発明に示すごとく結果の至適化が可能である。このことはバクテリア、すなわちリステリア・イノクアしか記載していないＥＰ−Ａ−０．３３７．６９０などの現状技術の、他の文書にも当てはまる。
【０００３】
機械的渦は出願人の以前の特許出願にすでに記載されている。問題の出願ＷＯ−Ａ−９９／１５６２１はバクテリア型であれ、酵母型であれ、少なくとも１つの微生物を含む、生物標本の溶解のための方法に関するものである。溶解法はビードの直径によって異なり、バクテリアの場合は９０から１５０μｍの間、好適には１００μｍであり、酵母の場合は５００μｍである。なお、この特許出願においては、エピデルミジス・ブドウ状球菌を溶解するために、それぞれのタイプのビードについて５０％の割合で（図１と２手順Ｇ参照）、直径１００μｍから５００μｍのジルコニウム・ビードの混合を使用した。
【０００４】
直径が異なるビードのこれらの比率で得られた結果は、悪くはないが、以下のものに及ばない：
・直径９０から１５０μｍのガラスビードで得られた結果（手順Ｃ）、
・直径１００μｍのガラスビードで得られた結果（手順Ｄ）、あるいは
・直径１００μｍのジルコニウム・ビードで得られた結果（手順Ｅ）。
【０００５】
出願人は磁気渦を用いる微生物溶解装置と方法を既に開示し、請求した。例えば、特許ＷＯ−Ａ−００／０５３３８において、溶解装置は寸法の異なる少なくとも２つのタイプの粉砕手段を備えている：
・磁場の運動に制御される、少なくとも１つの大寸法磁気手段、と
・大寸法粉砕手段によって運動させられる、少なくとも１つの小寸法手段。
【０００６】
大寸法粉砕手段は少なくとも１つの大直径ビードによって構成され、また、小寸法粉砕手段も少なくとも１つの小直径ビードによって構成される。小寸法粉砕手段の寸法と大寸法粉砕手段の寸法の間に存在する比は１／１０から１／１００の間、好適には１／３０から１／６０の間に含まれ、より好適には、この比は１／４０である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、出願人はこの技術分野のこれらの研究を継続し、原核生物（バクテリア）または真核生物（酵母）あるいは原核生物と真核生物の混合物であるかにかかわらず、どんな微生物も溶解する手順を明らかにした。万能と呼ばれる、これらの手順は、上述の現状技術で開発されたような、バクテリアだけ、または酵母だけに関連する溶解と同じように高い効率を可能にする。意外なことに、場合によっては、これらの万能手順はしばしば現状技術の溶解よりも効率が高い。
【０００８】
【発明の実施の形態】
このため、本発明は、大直径溶解ビード、小直径溶解ビード及びこれらの溶解ビードを運動させるガラスビードを使用する機械的渦を、下記のパラメータで実施することをもって成る原核生物または真核生物の細胞溶解あるいは原核生物と真核生物の同時細胞溶解方法に関するものである：
・小直径溶解ビードの直径が９０から１５０μｍ、大直径溶解ビードの直径が４００μｍから６００μｍであり、大直径溶解ビードに対する小直径溶解ビードの質量百分率が５０％未満、
・小直径溶解ビードおよび大直径溶解ビードの混合物を含み、大直径溶解ビード及び小直径溶解ビードの総質量が、処理生物標本の総質量に対して６０％を超える、
・溶解時間が、１１から２０分、および
・大直径溶解ビード及び小直径溶解ビードを運動させるガラスビードの数が７未満。
好適変型実施態様によれば、大直径溶解ビード及び小直径溶解ビードはガラス製である。
【０００９】
もう１つの好適変型実施態様によれば、小直径溶解ビードの直径は、好適には約１００μｍであり、大直径溶解ビードの直径は、好適には約５００μｍである。
【００１１】
本発明の方法は、好ましくは下記のパラメータで溶解を実施することをもって成る：
・溶解時間が、好適には１１から２０分、より好適には１５から２０分、さらに好適には２０分、
・直径１００μｍのビードの百分率が、好適には５０％未満、より好適には３０％未満、さらに好適には２０％である、
・溶解ビードの総質量が、処理生物標本の総質量に対して好適には６０％を超える、より好適には８０％を超える、さらに好適には１００％である、
・ガラスビードの数が、好適には７未満、より好適には１に等しい。
【００１２】
本発明の原核生物および／または真核生物の細胞溶解方法は、使用技法として機械的渦を使用するものに限定される。本明細書における超音波技法及び磁気渦技法についての記載は、本発明が参照するためのものであり、本発明に含まれるものではない。
【００１３】
１．機材と方法
上述の現状技術において説明したごとく、３つの技法が知られている。超音波分解、機械的渦および磁気渦である。それらのそれぞれについて、独立してバクテリアおよび酵母について定義した。このように定義したパラメータは表１に示され、現状技術において正確と判断されたパラメータと関連づけた。なお、処理生物標本の量は、基準手順か本発明による手順かにかかわらず６００μｌである。
【表１】
表１：基準手順と呼ばれる現状技術による溶解手順
【００１４】
「溶解性」とよばれる能動ビードは微生物の溶解を可能にするビードで構成される。それは小直径（１００または５００μｍ）のビードである。なお、直径１００μｍのガラスビードは製品番号Ｖｉａ１でＭａｓｔｅａｕ ｅｔ Ｌａｍａｒｉe，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅから得られ、直径５００μｍのガラスビードは製品番号８７７２のｓｏｃｉeｔe Ｓｉｇｍａ社，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡのものである。
【００１５】
他方で、機械的渦に使用されるその他のガラスビード（直径３ｍｍ）の目的は、撹拌の際に能動ビードを運動させることである。それらは、先に定義した溶解ビードを介する、受動または間接能動ビードと呼ばれる。直径３ｍｍのガラスビードは製品番号００６８００３２でＰｒｏｌａｂｏ（Ｆｏｎｔｅｎａｙ−ｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）で購入した。またＢｅｎｎｋ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｃ（Ｎｏｒｄｅｒｓｔａｄｔ、ドイツ）が製品番号０５０−３３０で、直径２ｍｍの鉄ビードを提供した。
なお、鉄を隔離し、溶解によって遊離した核酸を後から増幅する作業と親和性のないことが多いその塩析を防止するために、プラスチックやガラスなどの、生物的に不活性の材料で被覆された鉄ビードを使用することが参照される。
【００１６】
本発明による方法で得られた結果はつぎに上述の基準方法で得られた結果と比較する。
溶解万能手順の利益は、あらかじめそれが原核生物（バクテリア）あるいは真核生物（酵母）であるかを知ることなしに、無菌生物流体（脳脊髄液、尿および血液）の感染に責任のある微生物を、溶解後に、検出することを可能にすることである。
【００１７】
Ａ）実験研究の方法論
実験研究方法論（ＭＲＥ）による手法は超音波分解と機械的渦を用いた。磁気渦には実験的手法を用いた。
【００１８】
ＭＲＥ研究には２つの段階がある。第１段階で、異なる要因について、酵母に固有の至適区域とバクテリアに固有の至適区域を定義した。この至適区域は基準手順で得られるものと同等以上の溶解効率を与えるものと定義される。第２段階で、可能ならば、バクテリア至適区域と酵母至適区域の交差に対応する、いわゆる妥協区域を定義する。
【００１９】
ＭＲＥは次のようなタイプの数式（多くの場合二次多項式）によって生物現象、この場合は溶解、をモデル化することからなる数学的手法である：
Ｒ＝ａＸ＋ｂＹ＋ｃＸ２＋ｄＹ２＋ｅＸＹ＋ｆ，
この式で
・Ｒは溶解効率を表す実験応答、
・ＸとＹは溶解時間やビードサイズなどの溶解に影響する因子、
・ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆは係数、である。
この式は異なる因子が取る値に応じて応答がどのように変化するかを図示することを可能にするいわゆる等応答曲線の形で表すことができる。
【００２０】
この図によれば、２つの因子が研究される。それは直径が１００と５００μｍの溶解ビードの総重量（Ｘ１）と１００と５００μｍの溶解ビードの合計に対する直径１００μｍのビードの質量百分率（Ｘ２）である；研究された応答は蛍光単位数ＲＬＵ（すなわちＲｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ）に対応する。図示された曲線は同一の応答を与える実験領域の点を結ぶものである。このグラフに見るごとく、実験領域で得られた最大応答は９００ ０００蛍光単位であり、この応答を得るために、Ｘ１は０．２と０．４の間に含まれ、Ｘ２は２０に近くなければならない。
【００２１】
数学モデルを得るためには、下記の文書に明確に記載された、「複合マトリクス」とよばれるマトリクスによって定義される複数の実験を実現する必要がある。
・Ｂｏｘ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ（１９５１）“Ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｔｔｅｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｂ，１３，ｐ．１−４５．
・Ｆｅｎｅｕｉｌｌｅ，Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｐｈａｎ−Ｔａｎ−Ｌｕｎ（１９７８）“Ｍeｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｅｘｐeｒｉｍｅｎｔａｌｅ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｏｕｔｉｌｓ ｍａｔｈeｍａｔｉｑｕｅｓ，eｔｕｄｅｓ ｄｅｓ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｄｅ ｒeｐｏｎｓｅ，ｍａｔｒｉｃｅｓ ｄｅ ｍeｌａｎｇｅ；ｍeｔｈｏｄｅｓ ｄｕ ｓｉｍｐｌｅｘ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔe ‘Ａｉｘ−Ｍａｒｓｃｉｌｌｅ ３−Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｕ ＬＭＲＥ．
【００２２】
Ｂ）研究した応答
溶解効率は化学発光ゾンデとの交雑によって遊離したＡＲＮ １６Ｓと２３Ｓ（バクテリアについて）およびＡＲＮ（酵母について）の量を測定して定量化した。これがＨＰＡ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）である。これは論文Ｎｏｒｍａｎ Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｍａｒｋ Ａ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ Ｌｙｌｅ Ｊ．Ａｍｏｌｄ Ｊｒ：
“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ”Ｎｏｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（１９９５）３９１−４２８に明瞭に記載されたＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社の技法である。この技法に関する情報は特許ＵＳ−Ａ−６，００４，７４５にも見出される。
【００２３】
２つのゾンデを使用し、その１つはＧｅｎ Ｐｒｏｂｅによって開発され、名称Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＮＩ（ＭＴＣ−ＮＩ）で市販されたものである。パンフレット参照：１０４５７４請求。３ページ、“Ｐｅｒｆｏｍａｎｃｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ”に明らかにされているように、このゾンデは、標的真核生物と交差することなしに、グラム陰性およびグラム陽性の、広範囲の微生物の検出を可能にする。
【００２４】
酵母のために第２のゾンデを使用した。
下記に記載されたようなゾンデの使用も可能である。
・Ｊ．Ｆ．Ｈｉｎｄｌｅｒ，Ｓ．Ｋｏｚｅｎ，Ｄ．Ａ．Ｂｒｕｃｋｎｅｒ その論文：“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒＲＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉ ｉｎ Ｒｏｕｔｉｎｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ” Ｎｏ．１５５７および
・Ｄ．Ｄ．Ｆｕｌｌｅｒ，Ｔ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ論文：“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒＲＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｔｒｉｘ ｔｏ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉ Ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ”Ｎｏ．１５５８，ｄｅ ｌａ ｓｅｓｓｉｏｎ１５４．Ｄ，ｐａｇｅ ２２１，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ．
・Ａｓｔｒａｃｔｓ ｂｏｏｋ，ＩＣＡＡＣ−Ｓｅｐｔ．２６−２９，１９９９−Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ−ＵＳＡ−２つのポスターが菌種全体（カビと酵母）の検出を可能にする万能ゾンデの使用を説明している。
【００２５】
Ｃ）研究した因子
研究可能な因子は：
・能動ビードの総重量（ｇ）
・１００μｍの溶解ビードの質量百分率
・溶解時間（分）
・追加３ｍｍガラスビードの数
・追加２ｍｍ鉄ビードの数
【００２６】
Ｄ）使用した酵母とバクテリアの株
研究に採用した酵母の株はｂｉｏＭeｒｉｅｕｘ蒐集番号ＡＰＩ Ｎｏ．９６０４１９１を持つカンジダ・クルセイである。バクテリアの下部は番号：４９４０３でＡＴＣＣに寄託されたミコバクテリウム・フォルチュイツムである。
溶解は０．５Ｍａｃ Ｆｒａｌａｎｄ（ｂｉｏＭeｒｉｅｕｘ密度計）の懸濁６００μｌに対して実施した。
【００２７】
ＩＩ．基準方法による予備結果
Ａ）バクテリアの溶解に対して１００μｍビードが５００μｍビードより効果的であることを示す結果
下記の表２は全ての単位が番号３から１０の下記の表と同様に、ＨＰＡから得られた結果を示している。
【表２】
表２：３つのバクテリア溶解技法についての１００μｍのビードと５００μｍのビードの間の比較研究
３つの技法について、１００μｍのビードが５００μｍのビードより効果的であることが容易に分かる。
【００２８】
Ｂ）酵母の溶解について５００μｍと１００μｍのビードの性能比較結果
下記の表３は得られた結果を示している。
【表３】
表３：３つの酵母溶解技法についての１００μｍのビードと５００μｍのビードの間の比較研究
【００２９】
超音波分解と機械的渦については、酵母を溶解するのに５００μｍのビードのほうが１００μｍのビードよりも効果的である。反対に、磁気渦では、１００μｍのビードのほうが効果的である。
超音波分解と機械的渦については、万能手順は１００と５００μｍのビードの混合を必要とする。反対に、磁気渦では、意外なことにバクテリアについても酵母についても１００μｍのビードのほうが効果的なので、２つの寸法を混合する必要はない。
【００３０】
ＩＩＩ．本発明による超音波分解の溶解の結果
２の因子を使用した、直径１００μｍのビードの百分率と溶解ビードの総質量である。
Ａ）超音波分解と酵母
基準手順（溶解ビード総質量＝０．３グラム（ｇ）、直径１００μｍのビード百分率＝０％）で３つの試験について得られた結果は２ ２６４ ５１５、１ ８２１ １３５と１ ５０５ ８８７で平均１ ８６３ ８４６である。
下記の表４は得られた結果を示している。
【表４】
表４：基準技法と酵母の超音波分解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
【００３１】
最大応答は直径１００μｍのビードの百分率が２０％、溶解ビード総質量０．５ｇで得られた。
図２は等応答曲線を示している。これらの等応答曲線は高い応答（８００ ０００蛍光単位）を得るために０．３から０．５ｇの間に含まれる溶解ビード総質量と２０％に近い直径１００μｍのビードの百分率が必要なことを示している。
【００３２】
Ｂ）超音波分解と酵母
基準手順は溶解ビード総質量０．４ｇ、直径１００μｍのビードの質量百分率１００％を使用する。この手順で得られる値は２６４ ９１５，３０５ ９０７と１９５ １６０で、平均すると２５５ ３２７である。表５は得られた結果全体を表している。
【表５】
表５：基準技法と酵母の超音波分解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
【００３３】
最大応答は直径１００μｍのビードの百分率が２０％、溶解ビード総質量０．３または０．５ｇで得られた。
図３は等応答曲線を示している。これらの等応答曲線は高い応答を得るために０．２ｇを越える溶解ビード総質量と２０％から５０％の間の直径１００μｍのビードの百分率が必要なことを示している。
【００３４】
Ｃ）超音波分解による万能溶解手順の選択
したがって、万能手順は下記のパラメータによって定義される：
・直径１００μｍのビードの百分率＝２０％
・溶解ビード総質量＝０．５ｇ
この条件において、２９９ ８２９のバクテリアについて得られた平均応答は、１００μｍのビードを１００％使用するバクテリアに固有の基準手順で得られる平均値の、２５５ ３２７を越え、これはかなり意外であり、酵母について得られた平均応答が１ ６５０ ２３８、すなわち５００μｍビードを１００％使用する酵母に固有の基準手順で得られる平均値に対応する、値１ ８６３ ８４６にかなり近いだけに意外である。
【００３５】
したがって、この万能溶解手順に関連する方法は、下記のパラメータに従って超音波分解を実施することをもって成る：
・１０から５０％の間に、好適には２０から３０％の間に、より好適には２０％を越える直径１００μｍのビードの百分率、と
・処理される生物標本総質量の５０から１００％の間に含まれる、好適には７５から９０％の間に含まれる、そして好適には８０から８５％の間の溶解ビード総質量。
【００３６】
処理される生物標本総質量に対する溶解ビード総質量の百分率は、６００μｌの標本に０．５ｇの、すなわちほぼ０．６ｇの、溶解ビードを用いて、次のように本章において計算される。したがって、百分率は：（０．５：０．６）×１００＝８３．３３％
【００３７】
ＩＶ．本発明による機械的渦の溶解の結果
４つのパラメータを使用した、直径１００μｍのビードの百分率、追加の３ｍｍのガラスビード数の１００と５００μｍの溶解ビードの総質量と、溶解時間（分）である。
Ａ）機械的渦と酵母
基準手順は０．３ｇの溶解ビード総質量、０％の直径１００μｍのビード百分率、６個のガラスビード、１０個の鉄ビード、ならびに溶解時間１２分を使用する。得られたＨＰＡ値は１ ９４４ １１５、２ ２１３ ４８５、２ １５８ ９５８で平均２ １０５ ５１９である。表６は得られた結果を示している。
【表６】
表６：基準技法と酵母の機械的渦分解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
【００３８】
図４は得られた等応答曲線を示している。曲線を分析すると、応答に対する影響が最も大きい因子は時間であることが分かる。溶解を最大限にするために、２０分の溶解時間、５０％未満の直径１００μｍのビード百分率、０．３５ｇを越える溶解ビード総質量と７（７）未満のガラスビード数が必要である。
総重量０．５ｇ、直径１００μｍのビード百分率が２０％での等応答曲線の例を示した。
応答を上げるためには、１１分超の溶解時間、５０％未満の直径１００μｍのビード百分率、０．３５ｇを越える溶解ビード総質量と７（７）未満のガラスビード数が必要であることが分かる。
【００３９】
Ｂ）機械的渦とバクテリア
基準手順は０．６ｇの溶解ビード総質量、１００％の直径１００μｍのビード百分率、６個のガラスビード、１０個の鉄ビード、ならびに溶解時間２分を使用する；見いだされたＨＰＡ値は１０７ ４０６、１２４ ６０９と１３８ ４０５で平均１２３ ４７３である。表７は得られた結果を示している。
【表７】
表７：基準技法とバクテリアの機械的渦分解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
【００４０】
図５はこのようにして得られた等応答曲線を示している。曲線を分析すると、溶解に最も作用する因子は時間であることが分かる。応答を最大限にするために、２０分の最大溶解時間と少ない数のガラスビードが必要なことが分かる。くわえて、直径１００μｍのビードの百分率が低く、２０％に近いとき、また溶解ビード総質量が０．６ｇに近いとき、これら２つの因子の影響が小さいので、応答が少しよくなる。
溶解ビード総質量を０．６ｇに固定、直径１００μｍのビード百分率を２０％に固定したときの曲線の例を示した。それが図５に示した場合である。
曲線から分かるように、溶解時間が応答に大きな影響があり、最大応答は時間２０分で得られる。ガラスビードの数は溶解に対する影響が小さく、ガラスビードは１個で十分であった。
【００４１】
Ｃ）機械的渦による万能溶解手順の選択
したがって、万能手順は下記のパラメータによって定義される：
・溶解時間２０分
・直径１００μｍのビードの百分率＝２０％
・溶解ビード総質量＝０．５ｇ
この条件において、以下の意外な結果が得られた：
・バクテリアについて得られた平均応答は２２６ ０６３で、１００μｍのビードを１００％使用する基準手順では１２３ ４７３である、
・酵母について得られた平均応答は２ ９５２ ６５６で５００μｍビードを１００％使用する基準手順では２ １０５ ５１９である。
したがって、この万能溶解手順に関連する方法は、下記のパラメータに従って機械的渦を実施することをもって成る：
・１１から２０分の、好適には１５から２０分の、さらに好適には２０分の溶解時間、
・５０％未満、好適には３０％未満、より好適には２０％未満の直径１００μｍのビード百分率、と
・処理される生物標本総質量の６０％を超える、好適には８０％を超える、そしてさらに好適には１００％である溶解ビード総質量、および
・７（７）未満の、好適には１（１）に等しいガラスビードの数。
【００４２】
Ｖ．本発明による磁気渦による溶解の結果
研究されたパラメータと、その影響が限られているために、この場合、ＭＲＥ研究は不要であった。
機械的渦について先に述べた試験はバクテリアと酵母の溶解について、５００μｍのビードよりも１００μｍのビードのほうが効果的であることを示している。目的は、直径１００μｍのビードで、磁気渦での万能溶解手順のための至適条件を定義することである。
試験した条件は：
・直径１００μｍのビードの総量、
・鉄ビード数、と
・溶解時間、である。
【００４３】
Ａ）磁気渦と酵母
基準手順は０．５ｇの溶解ビード総質量、０％の直径１００μｍのビード百分率、すなわち５００μｍのビード１００％、１０個の鉄ビード、ならびに溶解時間１２分を使用する。得られた平均は８５２ ６４８である。
下の表８は得られた結果を示している。
【表８】
表８：基準技法とバクテリアの磁気渦分解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
５００μｍのビードよりも１００μｍのビードの効率が優れていることが確認された：なぜなら、平均値が１ ３２１ １７６である第３の条件での値が基準条件での値を超えているからである。しかしながら、０．５と０．６ｇでは目立った差はない。
鉄ビードの数と溶解時間は影響があり、１０個の鉄ビードと溶解時間２０分を用いるのがよい。
【００４４】
Ｂ）磁気渦とバクテリア
基準手順は０．６ｇの溶解ビード総質量、１００％の直径１００μｍのビード百分率、１０個の鉄ビード、ならびに溶解時間１０分を使用する。得られた平均は７２ ９４２である。
下の表９は得られた結果を再録したものである。
【表９】
表９：基準技法とバクテリアの磁気渦溶解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
溶解ビード総質量は影響が少ない、しかしＨＰＡ値は１００μｍのビードが０．５ｇよりも０．６ｇの方が少し高い。鉄ビード数と溶解時間は影響があり、したがって、１０個の鉄ビードと２０分の溶解を用いるのが好適である。
【００４５】
Ｃ）万能手順の選択
バクテリアと酵母について共通の至適条件は下記の条件に対応する：
・０．６ｇの直径１００μｍのビード
・１０個の鉄ビード、および
・２０分の溶解時間
これらの万能条件は意外なことに、下の表１０に再録したごとく、基準条件よりも効率的である。
【表１０】
表１０：基準技法と酵母とバクテリアの磁気渦による溶解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
この万能溶解手順に関わる方法は、したがって、下記のパラメータで磁気渦を実施することをもって成る：
・１２から２０分、好適には１５から２０分、さらに好適には２０分の溶解時間、
・処理生物標本総質量の８０％超、好適には１００％である溶解ビードの総質量、および
・５（５）から１５（１５）ビードの間に含まれる、好適には１０（１０）個の鉄ビードである鉄ビードの数。
【００４６】
ＶＩ．結論
超音波分解、機械的渦および磁気渦の３つの技法について、万能手順、すなわち基準手順で得られる効率と同一、また多くの場合それを超える効率で原核生物および／または真核生物の細胞溶解が可能な手順を定義することができる。
添付の図面は説明のためのものであり、非制限的性格である。それによって本発明をよりよく理解することができるだろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＭＲＥ法の枠内での等応答曲線の例を示している。
【図２】 酵母超音波分解による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
【図３】 バクテリア超音波分解による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
【図４】 酵母の機械的渦による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
【図５】 バクテリアの機械的渦による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
【発明の属する技術分野】
本発明は３つの異なる技法、すなわち超音波分解、機械的渦および磁気渦のための、原核生物と真核生物の同時細胞溶解に適した万能溶解方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現状技術を構成する文書には、上述の３つの技法のうち、１つだけしか扱われていない。
超音波分解に関して、出願人は下記の特性を有する音極の能動化方法を記載する特許出願ＦＲ９９／０４２８９を出願した：
・超音波分解時間１０から１５分、
・４０から６０％の間に含まれ、好適には５０％であるサイクル比、
・出力１０から３０Ｗ、
この超音波分解は酵母またはバクテリアなどの微生物の溶解に効果的である。しかしながら、本発明に示すごとく結果の至適化が可能である。このことはバクテリア、すなわちリステリア・イノクアしか記載していないＥＰ−Ａ−０．３３７．６９０などの現状技術の、他の文書にも当てはまる。
【０００３】
機械的渦は出願人の以前の特許出願にすでに記載されている。問題の出願ＷＯ−Ａ−９９／１５６２１はバクテリア型であれ、酵母型であれ、少なくとも１つの微生物を含む、生物標本の溶解のための方法に関するものである。溶解法はビードの直径によって異なり、バクテリアの場合は９０から１５０μｍの間、好適には１００μｍであり、酵母の場合は５００μｍである。なお、この特許出願においては、エピデルミジス・ブドウ状球菌を溶解するために、それぞれのタイプのビードについて５０％の割合で（図１と２手順Ｇ参照）、直径１００μｍから５００μｍのジルコニウム・ビードの混合を使用した。
【０００４】
直径が異なるビードのこれらの比率で得られた結果は、悪くはないが、以下のものに及ばない：
・直径９０から１５０μｍのガラスビードで得られた結果（手順Ｃ）、
・直径１００μｍのガラスビードで得られた結果（手順Ｄ）、あるいは
・直径１００μｍのジルコニウム・ビードで得られた結果（手順Ｅ）。
【０００５】
出願人は磁気渦を用いる微生物溶解装置と方法を既に開示し、請求した。例えば、特許ＷＯ−Ａ−００／０５３３８において、溶解装置は寸法の異なる少なくとも２つのタイプの粉砕手段を備えている：
・磁場の運動に制御される、少なくとも１つの大寸法磁気手段、と
・大寸法粉砕手段によって運動させられる、少なくとも１つの小寸法手段。
【０００６】
大寸法粉砕手段は少なくとも１つの大直径ビードによって構成され、また、小寸法粉砕手段も少なくとも１つの小直径ビードによって構成される。小寸法粉砕手段の寸法と大寸法粉砕手段の寸法の間に存在する比は１／１０から１／１００の間、好適には１／３０から１／６０の間に含まれ、より好適には、この比は１／４０である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、出願人はこの技術分野のこれらの研究を継続し、原核生物（バクテリア）または真核生物（酵母）あるいは原核生物と真核生物の混合物であるかにかかわらず、どんな微生物も溶解する手順を明らかにした。万能と呼ばれる、これらの手順は、上述の現状技術で開発されたような、バクテリアだけ、または酵母だけに関連する溶解と同じように高い効率を可能にする。意外なことに、場合によっては、これらの万能手順はしばしば現状技術の溶解よりも効率が高い。
【０００８】
【発明の実施の形態】
このため、本発明は、大直径溶解ビード、小直径溶解ビード及びこれらの溶解ビードを運動させるガラスビードを使用する機械的渦を、下記のパラメータで実施することをもって成る原核生物または真核生物の細胞溶解あるいは原核生物と真核生物の同時細胞溶解方法に関するものである：
・小直径溶解ビードの直径が９０から１５０μｍ、大直径溶解ビードの直径が４００μｍから６００μｍであり、大直径溶解ビードに対する小直径溶解ビードの質量百分率が５０％未満、
・小直径溶解ビードおよび大直径溶解ビードの混合物を含み、大直径溶解ビード及び小直径溶解ビードの総質量が、処理生物標本の総質量に対して６０％を超える、
・溶解時間が、１１から２０分、および
・大直径溶解ビード及び小直径溶解ビードを運動させるガラスビードの数が７未満。
好適変型実施態様によれば、大直径溶解ビード及び小直径溶解ビードはガラス製である。
【０００９】
もう１つの好適変型実施態様によれば、小直径溶解ビードの直径は、好適には約１００μｍであり、大直径溶解ビードの直径は、好適には約５００μｍである。
【００１１】
本発明の方法は、好ましくは下記のパラメータで溶解を実施することをもって成る：
・溶解時間が、好適には１１から２０分、より好適には１５から２０分、さらに好適には２０分、
・直径１００μｍのビードの百分率が、好適には５０％未満、より好適には３０％未満、さらに好適には２０％である、
・溶解ビードの総質量が、処理生物標本の総質量に対して好適には６０％を超える、より好適には８０％を超える、さらに好適には１００％である、
・ガラスビードの数が、好適には７未満、より好適には１に等しい。
【００１２】
本発明の原核生物および／または真核生物の細胞溶解方法は、使用技法として機械的渦を使用するものに限定される。本明細書における超音波技法及び磁気渦技法についての記載は、本発明が参照するためのものであり、本発明に含まれるものではない。
【００１３】
１．機材と方法
上述の現状技術において説明したごとく、３つの技法が知られている。超音波分解、機械的渦および磁気渦である。それらのそれぞれについて、独立してバクテリアおよび酵母について定義した。このように定義したパラメータは表１に示され、現状技術において正確と判断されたパラメータと関連づけた。なお、処理生物標本の量は、基準手順か本発明による手順かにかかわらず６００μｌである。
【表１】
【００１４】
「溶解性」とよばれる能動ビードは微生物の溶解を可能にするビードで構成される。それは小直径（１００または５００μｍ）のビードである。なお、直径１００μｍのガラスビードは製品番号Ｖｉａ１でＭａｓｔｅａｕ ｅｔ Ｌａｍａｒｉe，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅから得られ、直径５００μｍのガラスビードは製品番号８７７２のｓｏｃｉeｔe Ｓｉｇｍａ社，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡのものである。
【００１５】
他方で、機械的渦に使用されるその他のガラスビード（直径３ｍｍ）の目的は、撹拌の際に能動ビードを運動させることである。それらは、先に定義した溶解ビードを介する、受動または間接能動ビードと呼ばれる。直径３ｍｍのガラスビードは製品番号００６８００３２でＰｒｏｌａｂｏ（Ｆｏｎｔｅｎａｙ−ｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）で購入した。またＢｅｎｎｋ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｃ（Ｎｏｒｄｅｒｓｔａｄｔ、ドイツ）が製品番号０５０−３３０で、直径２ｍｍの鉄ビードを提供した。
なお、鉄を隔離し、溶解によって遊離した核酸を後から増幅する作業と親和性のないことが多いその塩析を防止するために、プラスチックやガラスなどの、生物的に不活性の材料で被覆された鉄ビードを使用することが参照される。
【００１６】
本発明による方法で得られた結果はつぎに上述の基準方法で得られた結果と比較する。
溶解万能手順の利益は、あらかじめそれが原核生物（バクテリア）あるいは真核生物（酵母）であるかを知ることなしに、無菌生物流体（脳脊髄液、尿および血液）の感染に責任のある微生物を、溶解後に、検出することを可能にすることである。
【００１７】
Ａ）実験研究の方法論
実験研究方法論（ＭＲＥ）による手法は超音波分解と機械的渦を用いた。磁気渦には実験的手法を用いた。
【００１８】
ＭＲＥ研究には２つの段階がある。第１段階で、異なる要因について、酵母に固有の至適区域とバクテリアに固有の至適区域を定義した。この至適区域は基準手順で得られるものと同等以上の溶解効率を与えるものと定義される。第２段階で、可能ならば、バクテリア至適区域と酵母至適区域の交差に対応する、いわゆる妥協区域を定義する。
【００１９】
ＭＲＥは次のようなタイプの数式（多くの場合二次多項式）によって生物現象、この場合は溶解、をモデル化することからなる数学的手法である：
Ｒ＝ａＸ＋ｂＹ＋ｃＸ２＋ｄＹ２＋ｅＸＹ＋ｆ，
この式で
・Ｒは溶解効率を表す実験応答、
・ＸとＹは溶解時間やビードサイズなどの溶解に影響する因子、
・ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆは係数、である。
この式は異なる因子が取る値に応じて応答がどのように変化するかを図示することを可能にするいわゆる等応答曲線の形で表すことができる。
【００２０】
この図によれば、２つの因子が研究される。それは直径が１００と５００μｍの溶解ビードの総重量（Ｘ１）と１００と５００μｍの溶解ビードの合計に対する直径１００μｍのビードの質量百分率（Ｘ２）である；研究された応答は蛍光単位数ＲＬＵ（すなわちＲｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ）に対応する。図示された曲線は同一の応答を与える実験領域の点を結ぶものである。このグラフに見るごとく、実験領域で得られた最大応答は９００ ０００蛍光単位であり、この応答を得るために、Ｘ１は０．２と０．４の間に含まれ、Ｘ２は２０に近くなければならない。
【００２１】
数学モデルを得るためには、下記の文書に明確に記載された、「複合マトリクス」とよばれるマトリクスによって定義される複数の実験を実現する必要がある。
・Ｂｏｘ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ（１９５１）“Ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｔｔｅｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｂ，１３，ｐ．１−４５．
・Ｆｅｎｅｕｉｌｌｅ，Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｐｈａｎ−Ｔａｎ−Ｌｕｎ（１９７８）“Ｍeｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｅｘｐeｒｉｍｅｎｔａｌｅ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｏｕｔｉｌｓ ｍａｔｈeｍａｔｉｑｕｅｓ，eｔｕｄｅｓ ｄｅｓ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｄｅ ｒeｐｏｎｓｅ，ｍａｔｒｉｃｅｓ ｄｅ ｍeｌａｎｇｅ；ｍeｔｈｏｄｅｓ ｄｕ ｓｉｍｐｌｅｘ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔe ‘Ａｉｘ−Ｍａｒｓｃｉｌｌｅ ３−Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｕ ＬＭＲＥ．
【００２２】
Ｂ）研究した応答
溶解効率は化学発光ゾンデとの交雑によって遊離したＡＲＮ １６Ｓと２３Ｓ（バクテリアについて）およびＡＲＮ（酵母について）の量を測定して定量化した。これがＨＰＡ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）である。これは論文Ｎｏｒｍａｎ Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｍａｒｋ Ａ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ Ｌｙｌｅ Ｊ．Ａｍｏｌｄ Ｊｒ：
“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ”Ｎｏｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（１９９５）３９１−４２８に明瞭に記載されたＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社の技法である。この技法に関する情報は特許ＵＳ−Ａ−６，００４，７４５にも見出される。
【００２３】
２つのゾンデを使用し、その１つはＧｅｎ Ｐｒｏｂｅによって開発され、名称Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＮＩ（ＭＴＣ−ＮＩ）で市販されたものである。パンフレット参照：１０４５７４請求。３ページ、“Ｐｅｒｆｏｍａｎｃｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ”に明らかにされているように、このゾンデは、標的真核生物と交差することなしに、グラム陰性およびグラム陽性の、広範囲の微生物の検出を可能にする。
【００２４】
酵母のために第２のゾンデを使用した。
下記に記載されたようなゾンデの使用も可能である。
・Ｊ．Ｆ．Ｈｉｎｄｌｅｒ，Ｓ．Ｋｏｚｅｎ，Ｄ．Ａ．Ｂｒｕｃｋｎｅｒ その論文：“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒＲＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉ ｉｎ Ｒｏｕｔｉｎｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ” Ｎｏ．１５５７および
・Ｄ．Ｄ．Ｆｕｌｌｅｒ，Ｔ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ論文：“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒＲＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｔｒｉｘ ｔｏ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉ Ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ”Ｎｏ．１５５８，ｄｅ ｌａ ｓｅｓｓｉｏｎ１５４．Ｄ，ｐａｇｅ ２２１，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ．
・Ａｓｔｒａｃｔｓ ｂｏｏｋ，ＩＣＡＡＣ−Ｓｅｐｔ．２６−２９，１９９９−Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ−ＵＳＡ−２つのポスターが菌種全体（カビと酵母）の検出を可能にする万能ゾンデの使用を説明している。
【００２５】
Ｃ）研究した因子
研究可能な因子は：
・能動ビードの総重量（ｇ）
・１００μｍの溶解ビードの質量百分率
・溶解時間（分）
・追加３ｍｍガラスビードの数
・追加２ｍｍ鉄ビードの数
【００２６】
Ｄ）使用した酵母とバクテリアの株
研究に採用した酵母の株はｂｉｏＭeｒｉｅｕｘ蒐集番号ＡＰＩ Ｎｏ．９６０４１９１を持つカンジダ・クルセイである。バクテリアの下部は番号：４９４０３でＡＴＣＣに寄託されたミコバクテリウム・フォルチュイツムである。
溶解は０．５Ｍａｃ Ｆｒａｌａｎｄ（ｂｉｏＭeｒｉｅｕｘ密度計）の懸濁６００μｌに対して実施した。
【００２７】
ＩＩ．基準方法による予備結果
Ａ）バクテリアの溶解に対して１００μｍビードが５００μｍビードより効果的であることを示す結果
下記の表２は全ての単位が番号３から１０の下記の表と同様に、ＨＰＡから得られた結果を示している。
【表２】
３つの技法について、１００μｍのビードが５００μｍのビードより効果的であることが容易に分かる。
【００２８】
Ｂ）酵母の溶解について５００μｍと１００μｍのビードの性能比較結果
下記の表３は得られた結果を示している。
【表３】
【００２９】
超音波分解と機械的渦については、酵母を溶解するのに５００μｍのビードのほうが１００μｍのビードよりも効果的である。反対に、磁気渦では、１００μｍのビードのほうが効果的である。
超音波分解と機械的渦については、万能手順は１００と５００μｍのビードの混合を必要とする。反対に、磁気渦では、意外なことにバクテリアについても酵母についても１００μｍのビードのほうが効果的なので、２つの寸法を混合する必要はない。
【００３０】
ＩＩＩ．本発明による超音波分解の溶解の結果
２の因子を使用した、直径１００μｍのビードの百分率と溶解ビードの総質量である。
Ａ）超音波分解と酵母
基準手順（溶解ビード総質量＝０．３グラム（ｇ）、直径１００μｍのビード百分率＝０％）で３つの試験について得られた結果は２ ２６４ ５１５、１ ８２１ １３５と１ ５０５ ８８７で平均１ ８６３ ８４６である。
下記の表４は得られた結果を示している。
【表４】
【００３１】
最大応答は直径１００μｍのビードの百分率が２０％、溶解ビード総質量０．５ｇで得られた。
図２は等応答曲線を示している。これらの等応答曲線は高い応答（８００ ０００蛍光単位）を得るために０．３から０．５ｇの間に含まれる溶解ビード総質量と２０％に近い直径１００μｍのビードの百分率が必要なことを示している。
【００３２】
Ｂ）超音波分解と酵母
基準手順は溶解ビード総質量０．４ｇ、直径１００μｍのビードの質量百分率１００％を使用する。この手順で得られる値は２６４ ９１５，３０５ ９０７と１９５ １６０で、平均すると２５５ ３２７である。表５は得られた結果全体を表している。
【表５】
【００３３】
最大応答は直径１００μｍのビードの百分率が２０％、溶解ビード総質量０．３または０．５ｇで得られた。
図３は等応答曲線を示している。これらの等応答曲線は高い応答を得るために０．２ｇを越える溶解ビード総質量と２０％から５０％の間の直径１００μｍのビードの百分率が必要なことを示している。
【００３４】
Ｃ）超音波分解による万能溶解手順の選択
したがって、万能手順は下記のパラメータによって定義される：
・直径１００μｍのビードの百分率＝２０％
・溶解ビード総質量＝０．５ｇ
この条件において、２９９ ８２９のバクテリアについて得られた平均応答は、１００μｍのビードを１００％使用するバクテリアに固有の基準手順で得られる平均値の、２５５ ３２７を越え、これはかなり意外であり、酵母について得られた平均応答が１ ６５０ ２３８、すなわち５００μｍビードを１００％使用する酵母に固有の基準手順で得られる平均値に対応する、値１ ８６３ ８４６にかなり近いだけに意外である。
【００３５】
したがって、この万能溶解手順に関連する方法は、下記のパラメータに従って超音波分解を実施することをもって成る：
・１０から５０％の間に、好適には２０から３０％の間に、より好適には２０％を越える直径１００μｍのビードの百分率、と
・処理される生物標本総質量の５０から１００％の間に含まれる、好適には７５から９０％の間に含まれる、そして好適には８０から８５％の間の溶解ビード総質量。
【００３６】
処理される生物標本総質量に対する溶解ビード総質量の百分率は、６００μｌの標本に０．５ｇの、すなわちほぼ０．６ｇの、溶解ビードを用いて、次のように本章において計算される。したがって、百分率は：（０．５：０．６）×１００＝８３．３３％
【００３７】
ＩＶ．本発明による機械的渦の溶解の結果
４つのパラメータを使用した、直径１００μｍのビードの百分率、追加の３ｍｍのガラスビード数の１００と５００μｍの溶解ビードの総質量と、溶解時間（分）である。
Ａ）機械的渦と酵母
基準手順は０．３ｇの溶解ビード総質量、０％の直径１００μｍのビード百分率、６個のガラスビード、１０個の鉄ビード、ならびに溶解時間１２分を使用する。得られたＨＰＡ値は１ ９４４ １１５、２ ２１３ ４８５、２ １５８ ９５８で平均２ １０５ ５１９である。表６は得られた結果を示している。
【表６】
【００３８】
図４は得られた等応答曲線を示している。曲線を分析すると、応答に対する影響が最も大きい因子は時間であることが分かる。溶解を最大限にするために、２０分の溶解時間、５０％未満の直径１００μｍのビード百分率、０．３５ｇを越える溶解ビード総質量と７（７）未満のガラスビード数が必要である。
総重量０．５ｇ、直径１００μｍのビード百分率が２０％での等応答曲線の例を示した。
応答を上げるためには、１１分超の溶解時間、５０％未満の直径１００μｍのビード百分率、０．３５ｇを越える溶解ビード総質量と７（７）未満のガラスビード数が必要であることが分かる。
【００３９】
Ｂ）機械的渦とバクテリア
基準手順は０．６ｇの溶解ビード総質量、１００％の直径１００μｍのビード百分率、６個のガラスビード、１０個の鉄ビード、ならびに溶解時間２分を使用する；見いだされたＨＰＡ値は１０７ ４０６、１２４ ６０９と１３８ ４０５で平均１２３ ４７３である。表７は得られた結果を示している。
【表７】
【００４０】
図５はこのようにして得られた等応答曲線を示している。曲線を分析すると、溶解に最も作用する因子は時間であることが分かる。応答を最大限にするために、２０分の最大溶解時間と少ない数のガラスビードが必要なことが分かる。くわえて、直径１００μｍのビードの百分率が低く、２０％に近いとき、また溶解ビード総質量が０．６ｇに近いとき、これら２つの因子の影響が小さいので、応答が少しよくなる。
溶解ビード総質量を０．６ｇに固定、直径１００μｍのビード百分率を２０％に固定したときの曲線の例を示した。それが図５に示した場合である。
曲線から分かるように、溶解時間が応答に大きな影響があり、最大応答は時間２０分で得られる。ガラスビードの数は溶解に対する影響が小さく、ガラスビードは１個で十分であった。
【００４１】
Ｃ）機械的渦による万能溶解手順の選択
したがって、万能手順は下記のパラメータによって定義される：
・溶解時間２０分
・直径１００μｍのビードの百分率＝２０％
・溶解ビード総質量＝０．５ｇ
この条件において、以下の意外な結果が得られた：
・バクテリアについて得られた平均応答は２２６ ０６３で、１００μｍのビードを１００％使用する基準手順では１２３ ４７３である、
・酵母について得られた平均応答は２ ９５２ ６５６で５００μｍビードを１００％使用する基準手順では２ １０５ ５１９である。
したがって、この万能溶解手順に関連する方法は、下記のパラメータに従って機械的渦を実施することをもって成る：
・１１から２０分の、好適には１５から２０分の、さらに好適には２０分の溶解時間、
・５０％未満、好適には３０％未満、より好適には２０％未満の直径１００μｍのビード百分率、と
・処理される生物標本総質量の６０％を超える、好適には８０％を超える、そしてさらに好適には１００％である溶解ビード総質量、および
・７（７）未満の、好適には１（１）に等しいガラスビードの数。
【００４２】
Ｖ．本発明による磁気渦による溶解の結果
研究されたパラメータと、その影響が限られているために、この場合、ＭＲＥ研究は不要であった。
機械的渦について先に述べた試験はバクテリアと酵母の溶解について、５００μｍのビードよりも１００μｍのビードのほうが効果的であることを示している。目的は、直径１００μｍのビードで、磁気渦での万能溶解手順のための至適条件を定義することである。
試験した条件は：
・直径１００μｍのビードの総量、
・鉄ビード数、と
・溶解時間、である。
【００４３】
Ａ）磁気渦と酵母
基準手順は０．５ｇの溶解ビード総質量、０％の直径１００μｍのビード百分率、すなわち５００μｍのビード１００％、１０個の鉄ビード、ならびに溶解時間１２分を使用する。得られた平均は８５２ ６４８である。
下の表８は得られた結果を示している。
【表８】
５００μｍのビードよりも１００μｍのビードの効率が優れていることが確認された：なぜなら、平均値が１ ３２１ １７６である第３の条件での値が基準条件での値を超えているからである。しかしながら、０．５と０．６ｇでは目立った差はない。
鉄ビードの数と溶解時間は影響があり、１０個の鉄ビードと溶解時間２０分を用いるのがよい。
【００４４】
Ｂ）磁気渦とバクテリア
基準手順は０．６ｇの溶解ビード総質量、１００％の直径１００μｍのビード百分率、１０個の鉄ビード、ならびに溶解時間１０分を使用する。得られた平均は７２ ９４２である。
下の表９は得られた結果を再録したものである。
【表９】
溶解ビード総質量は影響が少ない、しかしＨＰＡ値は１００μｍのビードが０．５ｇよりも０．６ｇの方が少し高い。鉄ビード数と溶解時間は影響があり、したがって、１０個の鉄ビードと２０分の溶解を用いるのが好適である。
【００４５】
Ｃ）万能手順の選択
バクテリアと酵母について共通の至適条件は下記の条件に対応する：
・０．６ｇの直径１００μｍのビード
・１０個の鉄ビード、および
・２０分の溶解時間
これらの万能条件は意外なことに、下の表１０に再録したごとく、基準条件よりも効率的である。
【表１０】
この万能溶解手順に関わる方法は、したがって、下記のパラメータで磁気渦を実施することをもって成る：
・１２から２０分、好適には１５から２０分、さらに好適には２０分の溶解時間、
・処理生物標本総質量の８０％超、好適には１００％である溶解ビードの総質量、および
・５（５）から１５（１５）ビードの間に含まれる、好適には１０（１０）個の鉄ビードである鉄ビードの数。
【００４６】
ＶＩ．結論
超音波分解、機械的渦および磁気渦の３つの技法について、万能手順、すなわち基準手順で得られる効率と同一、また多くの場合それを超える効率で原核生物および／または真核生物の細胞溶解が可能な手順を定義することができる。
添付の図面は説明のためのものであり、非制限的性格である。それによって本発明をよりよく理解することができるだろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＭＲＥ法の枠内での等応答曲線の例を示している。
【図２】 酵母超音波分解による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
【図３】 バクテリア超音波分解による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
【図４】 酵母の機械的渦による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
【図５】 バクテリアの機械的渦による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
Claims (5)
- 原核生物または真核生物の細胞溶解あるいは原核生物と真核生物の同時細胞溶解方法において、
大直径溶解ビード、小直径溶解ビード及びこれらの溶解ビードを運動させるガラスビードを使用する機械的渦を、下記のパラメータで実施することをもって成る方法。
・小直径溶解ビードの直径が９０から１５０μｍ、大直径溶解ビードの直径が４００μｍから６００μｍであり、大直径溶解ビードに対する小直径溶解ビードの質量百分率が５０％未満、
・小直径溶解ビードおよび大直径溶解ビードの混合物を含み、大直径溶解ビード及び小直径溶解ビードの総質量が、処理生物標本の総質量に対して６０％を超える、
・溶解時間が、１１から２０分、および
・大直径溶解ビード及び小直径溶解ビードを運動させるガラスビードの数が７未満。 - 小直径溶解ビードの直径が約１００μｍであり、大直径溶解ビードの直径が約５００μｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 大直径溶解ビード及び小直径溶解ビードがガラス製であることを特徴とする請求項１または２に記載
- 下記のパラメータで機械的渦を実施することをもって成ることを特徴とする請求項１から３のいずれか１つに記載の方法。
・溶解時間が１５から２０分、
・小直径溶解ビードの直径が１００μｍであり、大直径溶解ビードに対する小直径溶解ビードの質量百分率が３０％未満、
・大直径溶解ビード及び小直径溶解ビードの総質量が、処理生物標本の総質量に対して８０％を超える量、および
・ガラスビードの数が１。 - 下記のパラメータで機械的渦を実施することをもって成ることを特徴とする請求項１から４のいずれか１つに記載の方法。
・溶解時間が２０分、
・小直径溶解ビードの直径が１００μｍであり、大直径溶解ビードに対する小直径溶解ビードの質量百分率が２０％、
・大直径溶解ビード及び小直径溶解ビードの総質量が、処理生物標本の総質量に対し１００％、および
・ガラスビードの数が１。
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