JP2004504833A - 原核生物または真核生物の細胞溶解または原核生物と真核生物の同時細胞溶解方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】超音波分解、・機械的渦、または磁気渦の使用技法に応じて下記の3つのパラメータを適合させることをもって成る:・50%以下の大直径能動ビードに対する小直径能動ビードの質量百分率、および/または・処理生物標本の総質量に対して50から100%の間に含まれる、小直径ビードおよび/または大直径ビードの混合物を含むか否かにかかわらず、溶解ビードの総質量、および/または・10から20分の間に含まれる溶解時間、および/または・7(7)未満の非溶解であるが溶解ビードを随伴するガラスビードの数、および/または・5(5)から15(15)の間に含まれる非溶解であるが溶解ビードを随伴する鉄ビードの数。
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は3つの異なる技法、すなわち超音波分解、機械的渦および磁気渦のための、原核生物と真核生物の同時細胞溶解に適した万能溶解方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
現状技術を構成する文書には、上述の3つの技法のうち、1つだけしか扱われていない。
超音波分解に関して、出願人は下記の特性を有する音極の能動化方法を記載する特許出願FR99/04289を出願した:
・超音波分解時間10から15分、
・40から60%の間に含まれ、好適には50%であるサイクル比、
・出力10から30W、
この超音波分解は酵母またはバクテリアなどの微生物の溶解に効果的である。しかしながら、本発明に示すごとく結果の至適化が可能である。このことはバクテリア、すなわちリステリア・イノクアしか記載していないEP−A−0.337.690などの現状技術の、他の文書にも当てはまる。
【0003】
機械的渦は出願人の以前の特許出願にすでに記載されている。問題の出願WO−A−99/15621はバクテリア型であれ、酵母型であれ、少なくとも1つの微生物を含む、生物標本の溶解のための方法に関するものである。溶解法はビードの直径によって異なり、バクテリアの場合は90から150μmの間、好適には100μmであり、酵母の場合は500μmである。なお、この特許出願においては、エピデルミジス・ブドウ状球菌を溶解するために、それぞれのタイプのビードについて50%の割合で(図1と2手順G参照)、直径100μmから500μmのジルコニウム・ビードの混合を使用した。
【0004】
直径が異なるビードのこれらの比率で得られた結果は、悪くはないが、以下のものに及ばない:
・直径90から150μmのガラスビードで得られた結果(手順C)、
・直径100μmのガラスビードで得られた結果(手順D)、あるいは
・直径100μmのジルコニウム・ビードで得られた結果(手順E)。
【0005】
出願人は磁気渦を用いる微生物溶解装置と方法を既に開示し、請求した。例えば、特許WO−A−00/05338において、溶解装置は寸法の異なる少なくとも2つのタイプの粉砕手段を備えている:
・磁場の運動に制御される、少なくとも1つの大寸法磁気手段、と
・大寸法粉砕手段によって運動させられる、少なくとも1つの小寸法手段。
【0006】
大寸法粉砕手段は少なくとも1つの大直径ビードによって構成され、また、小寸法粉砕手段も少なくとも1つの小直径ビードによって構成される。小寸法粉砕手段の寸法と大寸法粉砕手段の寸法の間に存在する比は1/10から1/100の間、好適には1/30から1/60の間に含まれ、より好適には、この比は1/40である。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、出願人はこの技術分野のこれらの研究を継続し、原核生物(バクテリア)または真核生物(酵母)あるいは原核生物と真核生物の混合物であるかにかかわらず、どんな微生物も溶解する手順を明らかにした。万能と呼ばれる、これらの手順は、上述の現状技術で開発されたような、バクテリアだけ、または酵母だけに関連する溶解と同じように高い効率を可能にする。意外なことに、場合によっては、これらの万能手順はしばしば現状技術の溶解よりも効率が高い。
【0008】
【発明の実施の形態】
このため、本発明は少なくとも下記の3つのパラメータを適合させることから成る原核生物または真核生物の細胞溶解あるいは原核生物と真核生物の同時細胞溶解方法に関するものである:
・50%以下の大直径能動ビードに対する小直径能動ビードの質量百分率、および/または
・処理生物標本の総質量に対して50から100%の間に含まれる、小直径ビードおよび/または大直径ビードの混合物を含むか否かにかかわらず、溶解ビードの総質量、および/または
・10から20分間に含まれる溶解時間、および/または
・7(7)未満の非溶解であるが溶解ビードを随伴するガラスビードの数、および/または
・5(5)と15(15)の間に含まれる非溶解であるが溶解ビードを随伴する鉄ビードの数、
使用技法に応じて:
・超音波分解、
・機械的渦、または
・磁気渦。
好適変型実施態様によれば、溶解ビードはガラスである。
【0009】
もう1つの好適変型実施態様によれば、小直径溶解ビードの直径は90から150μmの間に含まれ、好適には約100μmであり、大直径溶解ビードの直径は400μmから600μmの間に含まれ、好適には約500μmである。
【0010】
超音波分解を使用する場合、該方法は下記のパラメータで溶解を実施することをもって成る:
・9から20分、好適には12から18分、さらに好適には15分の溶解時間、
・10から50%の間、好適には20から30%の間に含まれる、さらに好適には20%である直径100μmのビードの百分率、および
・処理生物標本の総質量に対して50から100%の間に含まれる、好適には75から90%の間に含まれる、より好適には80から85%の間に含まれる溶解ビードの総質量。
【0011】
機械的渦技法を使用したとき、該方法は下記のパラメータで溶解を実施することをもって成る:
・11から20分、好適には15から20分、さらに好適には20分の溶解時間、
・50%未満、好適には30%未満、さらに好適には20%である直径100μmのビードの百分率、
・処理生物標本の総質量に対して60%を超える、好適には80%を超える、より好適には100%の溶解ビードの総質量、および
・7(7)未満、好適には1(1)に等しいガラスビードの数。
【0012】
磁気渦技法を使用したとき、該方法は下記のパラメータで溶解を実施することをもって成る:
・12から20分、好適には15から20分、さらに好適には20分の溶解時間、
・80%超、好適には100%である100μmのビードの総質量、および
・5(5)と15(15)の間に含まれる、好適には10(10)である鉄ビードの数。
【0013】
1.機材と方法
上述の現状技術において説明したごとく、3つの技法が知られている。超音波分解、機械的渦および磁気渦である。それらのそれぞれについて、独立してバクテリアおよび酵母について定義した。このように定義したパラメータは表1に示され、現状技術において正確と判断されたパラメータと関連づけた。なお、処理生物標本の量は、基準手順か本発明による手順かにかかわらず600μlである。
【表1】
表1:基準手順と呼ばれる現状技術による溶解手順
【0014】
「溶解性」とよばれる能動ビードは微生物の溶解を可能にするビードで構成される。それは小直径(100または500μm)のビードである。なお、直径100μmのガラスビードは製品番号Via1でMasteau et Lamarie,Paris,Franceから得られ、直径500μmのガラスビードは製品番号8772のsociete Sigma社,Saint Louis,Missouri,USAのものである。
【0015】
他方で、機械的渦および磁気渦に使用されるその他のガラスビード(直径3mm)および鉄ビード(直径2mm)の目的は拡販の際に能動ビードを運動させることである。それらは、先に定義した溶解ビードを介する、受動または間接能動ビードと呼ばれる。直径3mmのガラスビードは製品番号00680032でProlabo(Fontenay−sous−Bois,France)で購入した。またBennk Elektronic(Norderstadt、ドイツ)が製品番号050−330で、直径2mmの鉄ビードを提供した。
なお、鉄を隔離し、溶解によって遊離した核酸を後から増幅する作業と親和性のないことが多いその塩析を防止するために、プラスチックやガラスなどの、生物的に不活性の材料で被覆された鉄ビードを使用することも可能である。
【0016】
本発明による方法で得られた結果はつぎに上述の基準方法で得られた結果と比較する。
溶解万能手順の利益は、あらかじめそれが原核生物(バクテリア)あるいは真核生物(酵母)であるかを知ることなしに、無菌生物流体(脳脊髄液、尿および血液)の感染に責任のある微生物を、溶解後に、検出することを可能にすることである。
【0017】
A)実験研究の方法論
実験研究方法論(MRE)による手法は超音波分解と機械的渦を用いた。磁気渦には実験的手法を用いた。
【0018】
MRE研究には2つの段階がある。第1段階で、異なる要因について、酵母に固有の至適区域とバクテリアに固有の至適区域を定義した。この至適区域は基準手順で得られるものと同等以上の溶解効率を与えるものと定義される。第2段階で、可能ならば、バクテリア至適区域と酵母至適区域の交差に対応する、いわゆる妥協区域を定義する。
【0019】
MREは次のようなタイプの数式(多くの場合二次多項式)によって生物現象、この場合は溶解、をモデル化することからなる数学的手法である:
R=aX+bY+cX2+dY2+eXY+f,
この式で
・Rは溶解効率を表す実験応答、
・XとYは溶解時間やビードサイズなどの溶解に影響する因子、
・a、b、c、d、e、fは係数、である。
この式は異なる因子が取る値に応じて応答がどのように変化するかを図示することを可能にするいわゆる等応答曲線の形で表すことができる。
【0020】
この図によれば、2つの因子が研究される。それは直径が100と500μmの溶解ビードの総重量(X1)と100と500μmの溶解ビードの合計に対する直径100μmのビードの質量百分率(X2)である;研究された応答は蛍光単位数RLU(すなわちRelative Light Unit)に対応する。図示された曲線は同一の応答を与える実験領域の点を結ぶものである。このグラフに見るごとく、実験領域で得られた最大応答は900 000蛍光単位であり、この応答を得るために、X1は0.2と0.4の間に含まれ、X2は20に近くなければならない。
【0021】
数学モデルを得るためには、下記の文書に明確に記載された、「複合マトリクス」とよばれるマトリクスによって定義される複数の実験を実現する必要がある。
・Box and Wilson(1951)“On the experimental atteignment of optimal conditions” Journal of the Royal Statistical Society,B,13,p.1−45.
・Feneuille,Mathieu,Phan−Tan−Lun(1978)“Methodologie de la Recherche Experimentale.Introduction,outils mathematiques,etudes des surfaces de reponse,matrices de melange;methodes du simplex:Universite ‘Aix−Marscille 3−Publication du LMRE.
【0022】
B)研究した応答
溶解効率は化学発光ゾンデとの交雑によって遊離したARN 16Sと23S(バクテリアについて)およびARN(酵母について)の量を測定して定量化した。これがHPA(Hybridization Protection Assay)である。これは論文Norman C.Nelson,Mark A.Reynolds et Lyle J.Amold Jr:
“Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence”Nonisotropic probing,Blotting and Sequencing(1995)391−428に明瞭に記載されたGen−Probe社の技法である。この技法に関する情報は特許US−A−6,004,745にも見出される。
【0023】
2つのゾンデを使用し、その1つはGen Probeによって開発され、名称Mycoplasma Tissue Culture NI(MTC−NI)で市販されたものである。パンフレット参照:104574請求。3ページ、“Perfomance Characteristics”に明らかにされているように、このゾンデは、標的真核生物と交差することなしに、グラム陰性およびグラム陽性の、広範囲の微生物の検出を可能にする。
【0024】
酵母のために第2のゾンデを使用した。
下記に記載されたようなゾンデの使用も可能である。
・J.F.Hindler,S.Kozen,D.A.Bruckner その論文:“Application of rRNA Probe Matrix for Rapid Identification of Bacteria and Fungi in Routine Blood Cultures” No.1557および
・D.D.Fuller,T.E.Davis論文:“Comparison of rRNA Probe Matrix to Conventional Methods for Rapid Identification of Clinically Significant Bacteria and Fungi Recovered from Blood Cultures Specimens”No.1558,de la session154.D,page 221,Laboratory Tests for Diagnosing Infections;Methods for susceptibility testing.
・Astracts book,ICAAC−Sept.26−29,1999−San Francisco−USA−2つのポスターが菌種全体(カビと酵母)の検出を可能にする万能ゾンデの使用を説明している。
【0025】
C)研究した因子
研究可能な因子は:
・能動ビードの総重量(g)
・100μmの溶解ビードの質量百分率
・溶解時間(分)
・追加3mmガラスビードの数
・追加2mm鉄ビードの数
【0026】
D)使用した酵母とバクテリアの株
研究に採用した酵母の株はbioMerieux蒐集番号API No.9604191を持つカンジダ・クルセイである。バクテリアの下部は番号:49403でATCCに寄託されたミコバクテリウム・フォルチュイツムである。
溶解は0.5Mac Fraland(bioMerieux密度計)の懸濁600μlに対して実施した。
【0027】
II.基準方法による予備結果
A)バクテリアの溶解に対して100μmビードが500μmビードより効果的であることを示す結果
下記の表2は全ての単位が番号3から10の下記の表と同様に、HPAから得られた結果を示している。
【表2】
表2:3つのバクテリア溶解技法についての100μmのビードと500μmのビードの間の比較研究
3つの技法について、100μmのビードが500μmのビードより効果的であることが容易に分かる。
【0028】
B)酵母の溶解について500μmと100μmのビードの性能比較結果
下記の表3は得られた結果を示している。
【表3】
表3:3つの酵母溶解技法についての100μmのビードと500μmのビードの間の比較研究
【0029】
超音波分解と機械的渦については、酵母を溶解するのに500μmのビードのほうが100μmのビードよりも効果的である。反対に、磁気渦では、100μmのビードのほうが効果的である。
超音波分解と機械的渦については、万能手順は100と500μmのビードの混合を必要とする。反対に、磁気渦では、意外なことにバクテリアについても酵母についても100μmのビードのほうが効果的なので、2つの寸法を混合する必要はない。
【0030】
III.本発明による超音波分解の溶解の結果
2の因子を使用した、直径100μmのビードの百分率と溶解ビードの総質量である。
A)超音波分解と酵母
基準手順(溶解ビード総質量=0.3グラム(g)、直径100μmのビード百分率=0%)で3つの試験について得られた結果は2 264 515、1 821 135と1 505 887で平均1 863 846である。
下記の表4は得られた結果を示している。
【表4】
表4:基準技法と酵母の超音波分解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
【0031】
最大応答は直径100μmのビードの百分率が20%、溶解ビード総質量0.5gで得られた。
図2は等応答曲線を示している。これらの等応答曲線は高い応答(800 000蛍光単位)を得るために0.3から0.5gの間に含まれる溶解ビード総質量と20%に近い直径100μmのビードの百分率が必要なことを示している。
【0032】
B)超音波分解と酵母
基準手順は溶解ビード総質量0.4g、直径100μmのビードの質量百分率100%を使用する。この手順で得られる値は264 915,305 907と195 160で、平均すると255 327である。表5は得られた結果全体を表している。
【表5】
表5:基準技法と酵母の超音波分解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
【0033】
最大応答は直径100μmのビードの百分率が20%、溶解ビード総質量0.3または0.5gで得られた。
図3は等応答曲線を示している。これらの等応答曲線は高い応答を得るために0.2gを越える溶解ビード総質量と20%から50%の間の直径100μmのビードの百分率が必要なことを示している。
【0034】
C)超音波分解による万能溶解手順の選択
したがって、万能手順は下記のパラメータによって定義される:
・直径100μmのビードの百分率=20%
・溶解ビード総質量=0.5g
この条件において、299 829のバクテリアについて得られた平均応答は、100μmのビードを100%使用するバクテリアに固有の基準手順で得られる平均値の、255 327を越え、これはかなり意外であり、酵母について得られた平均応答が1 650 238、すなわち500μmビードを100%使用する酵母に固有の基準手順で得られる平均値に対応する、値1 863 846にかなり近いだけに意外である。
【0035】
したがって、この万能溶解手順に関連する方法は、下記のパラメータに従って超音波分解を実施することをもって成る:
・10から50%の間に、好適には20から30%の間に、より好適には20%を越える直径100μmのビードの百分率、と
・処理される生物標本総質量の50から100%の間に含まれる、好適には75から90%の間に含まれる、そして好適には80から85%の間の溶解ビード総質量。
【0036】
処理される生物標本総質量に対する溶解ビード総質量の百分率は、600μlの標本に0.5gの、すなわちほぼ0.6gの、溶解ビードを用いて、次のように本章において計算される。したがって、百分率は:(0.5:0.6)×100=83.33%
【0037】
IV.本発明による機械的渦の溶解の結果
4つのパラメータを使用した、直径100μmのビードの百分率、追加の3mmのガラスビード数の100と500μmの溶解ビードの総質量と、溶解時間(分)である。
A)機械的渦と酵母
基準手順は0.3gの溶解ビード総質量、0%の直径100μmのビード百分率、6個のガラスビード、10個の鉄ビード、ならびに溶解時間12分を使用する。得られたHPA値は1 944 115、2 213 485、2 158 958で平均2 105 519である。表6は得られた結果を示している。
【表6】
表6:基準技法と酵母の機械的渦分解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
【0038】
図4は得られた等応答曲線を示している。曲線を分析すると、応答に対する影響が最も大きい因子は時間であることが分かる。溶解を最大限にするために、20分の溶解時間、50%未満の直径100μmのビード百分率、0.35gを越える溶解ビード総質量と7(7)未満のガラスビード数が必要である。
総重量0.5g、直径100μmのビード百分率が20%での等応答曲線の例を示した。
応答を上げるためには、11分超の溶解時間、50%未満の直径100μmのビード百分率、0.35gを越える溶解ビード総質量と7(7)未満のガラスビード数が必要であることが分かる。
【0039】
B)機械的渦とバクテリア
基準手順は0.6gの溶解ビード総質量、100%の直径100μmのビード百分率、6個のガラスビード、10個の鉄ビード、ならびに溶解時間2分を使用する;見いだされたHPA値は107 406、124 609と138 405で平均123 473である。表7は得られた結果を示している。
【表7】
表7:基準技法とバクテリアの機械的渦分解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
【0040】
図5はこのようにして得られた等応答曲線を示している。曲線を分析すると、溶解に最も作用する因子は時間であることが分かる。応答を最大限にするために、20分の最大溶解時間と少ない数のガラスビードが必要なことが分かる。くわえて、直径100μmのビードの百分率が低く、20%に近いとき、また溶解ビード総質量が0.6gに近いとき、これら2つの因子の影響が小さいので、応答が少しよくなる。
溶解ビード総質量を0.6gに固定、直径100μmのビード百分率を20%に固定したときの曲線の例を示した。それが図5に示した場合である。
曲線から分かるように、溶解時間が応答に大きな影響があり、最大応答は時間20分で得られる。ガラスビードの数は溶解に対する影響が小さく、ガラスビードは1個で十分であった。
【0041】
C)機械的渦による万能溶解手順の選択
したがって、万能手順は下記のパラメータによって定義される:
・溶解時間20分
・直径100μmのビードの百分率=20%
・溶解ビード総質量=0.5g
この条件において、以下の意外な結果が得られた:
・バクテリアについて得られた平均応答は226 063で、100μmのビードを100%使用する基準手順では123 473である、
・酵母について得られた平均応答は2 952 656で500μmビードを100%使用する基準手順では2 105 519である。
したがって、この万能溶解手順に関連する方法は、下記のパラメータに従って機械的渦を実施することをもって成る:
・11から20分の、好適には15から20分の、さらに好適には20分の溶解時間、
・50%未満、好適には30%未満、より好適には20%未満の直径100μmのビード百分率、と
・処理される生物標本総質量の60%を超える、好適には80%を超える、そしてさらに好適には100%である溶解ビード総質量、および
・7(7)未満の、好適には1(1)に等しいガラスビードの数。
【0042】
V.本発明による磁気渦による溶解の結果
研究されたパラメータと、その影響が限られているために、この場合、MRE研究は不要であった。
機械的渦について先に述べた試験はバクテリアと酵母の溶解について、500μmのビードよりも100μmのビードのほうが効果的であることを示している。目的は、直径100μmのビードで、磁気渦での万能溶解手順のための至適条件を定義することである。
試験した条件は:
・直径100μmのビードの総量、
・鉄ビード数、と
・溶解時間、である。
【0043】
A)磁気渦と酵母
基準手順は0.5gの溶解ビード総質量、0%の直径100μmのビード百分率、すなわち500μmのビード100%、10個の鉄ビード、ならびに溶解時間12分を使用する。得られた平均は852 648である。
下の表8は得られた結果を示している。
【表8】
表8:基準技法とバクテリアの磁気渦分解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
500μmのビードよりも100μmのビードの効率が優れていることが確認された:なぜなら、平均値が1 321 176である第3の条件での値が基準条件での値を超えているからである。しかしながら、0.5と0.6gでは目立った差はない。
鉄ビードの数と溶解時間は影響があり、10個の鉄ビードと溶解時間20分を用いるのがよい。
【0044】
B)磁気渦とバクテリア
基準手順は0.6gの溶解ビード総質量、100%の直径100μmのビード百分率、10個の鉄ビード、ならびに溶解時間10分を使用する。得られた平均は72 942である。
下の表9は得られた結果を再録したものである。
【表9】
表9:基準技法とバクテリアの磁気渦溶解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
溶解ビード総質量は影響が少ない、しかしHPA値は100μmのビードが0.5gよりも0.6gの方が少し高い。鉄ビード数と溶解時間は影響があり、したがって、10個の鉄ビードと20分の溶解を用いるのが好適である。
【0045】
C)万能手順の選択
バクテリアと酵母について共通の至適条件は下記の条件に対応する:
・0.6gの直径100μmのビード
・10個の鉄ビード、および
・20分の溶解時間
これらの万能条件は意外なことに、下の表10に再録したごとく、基準条件よりも効率的である。
【表10】
表10:基準技法と酵母とバクテリアの磁気渦による溶解のための本発明の基準を満たすことのできる技法の比較研究
この万能溶解手順に関わる方法は、したがって、下記のパラメータで磁気渦を実施することをもって成る:
・12から20分、好適には15から20分、さらに好適には20分の溶解時間、
・処理生物標本総質量の80%超、好適には100%である溶解ビードの総質量、および
・5(5)から15(15)ビードの間に含まれる、好適には10(10)個の鉄ビードである鉄ビードの数。
【0046】
VI.結論
超音波分解、機械的渦および磁気渦の3つの技法について、万能手順、すなわち基準手順で得られる効率と同一、また多くの場合それを超える効率で原核生物および/または真核生物の細胞溶解が可能な手順を定義することができる。
添付の図面は説明のためのものであり、非制限的性格である。それによって本発明をよりよく理解することができるだろう。
【図面の簡単な説明】
【図1】
MRE法の枠内での等応答曲線の例を示している。
【図2】
酵母超音波分解による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
【図3】
バクテリア超音波分解による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
【図4】
酵母の機械的渦による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
【図5】
バクテリアの機械的渦による溶解の枠内での等応答曲線を示している。
Claims (6)
- 原核生物または真核生物の細胞溶解あるいは原核生物と真核生物の同時細胞溶解方法において、
使用技法:
・超音波分解、
・機械的渦、または
・磁気渦、
に応じて少なくとも下記の3つのパラメータ:
・50%以下の大直径能動ビードに対する小直径能動ビードの質量百分率、および/または
・処理生物標本の総質量に対して50から100%の間に含まれる、小直径ビードおよび/または大直径ビードの混合物を含むか否かにかかわらず、溶解ビードの総質量、および/または
・10から20分の間に含まれる溶解時間、および/または
・7(7)未満の非溶解であるが溶解ビードを随伴するガラスビードの数、および/または
・5(5)から15(15)の間に含まれる非溶解であるが溶解ビードを随伴する鉄ビードの数、
を適合させることをもって成る方法。 - 溶解ビードはガラス製であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 小直径溶解ビードの直径は90から150μmの間に含まれ、好適には約100μmであり、大直径溶解ビードの直径は400μmから600μmの間に含まれ、好適には約500μmであることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- ・9から20分、好適には12から18分、さらに好適には15分の溶解時間、
・10から50%の間、好適には20から30%の間に含まれる、さらに好適には20%である直径100μmのビードの百分率、および
・処理生物標本の総質量に対して50から100%の間に含まれる、好適には75から90%の間に含まれる、より好適には80から85%の間に含まれる溶解ビードの総質量の各パラメータで超音波分解を実施することをもって成ることを特徴とする請求項1から3のいずれか1つに記載の方法。 - ・11から20分、好適には15から20分、さらに好適には20分の溶解時間、
・50%未満、好適には30%未満、さらに好適には20%である直径100μmのビードの百分率、
・処理生物標本の総質量に対して60%を超える、好適には80%を超える、より好適には100%の溶解ビードの総質量、および
・7(7)未満、好適には1(1)に等しいガラスビードの数のパラメータで機械的渦を実施することをもって成ることを特徴とする請求項1から3のいずれか1つに記載の方法。 - ・12から20分、好適には15から20分、さらに好適には20分の溶解時間、
・処理生物標本の総質量に対して80%超、好適には100%である溶解ビードの総質量、および
・5(5)から15(15)個のビードの間に含まれる、好適には10(10)個の鉄ビードである鉄ビードの数のパラメータで磁気渦を実施することをもって成ることを特徴とする請求項1から3のいずれか1つに記載の方法。
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WO2000005338A1 (fr) * | 1998-07-23 | 2000-02-03 | Bio Merieux | Dispositif perfectionne et procede de lyse de micro-organismes |
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