JPH0528599B2 - - Google Patents
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
- C12N1/066—Lysis of microorganisms by physical methods
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Description
本出願はKohne，D.E.により1983年１月10日出
願された米国特許出願456729号、名称「非ウイル
ス性微生物の検出、同定及び定量法」、Kohne，
D.E.により1984年９月４日出願された米国特許出
願6553655号、名称「微生物及びウイルスの検出、
同定及び定量法」、Kohne，D.E.により1984年７
月５日出願された米国特許出願627795号、名称
「核酸再結合促進法」及びKohne、D.E.らにより
1986年１月７日出願された米国特許出願、名称
「核酸再結合促進法」に関係するものである。こ
れらの全ての開示は本明細書の記載内容中で参照
される。 本発明の技術分野 本発明は細胞破砕（disrupting）とそれにより
細胞成分を溶液中へ遊離させる（release）方法
に関するものである。特に、本発明は様々な組成
の小ビーズを含む容器内に入れた微生物溶液中で
微生物からRNA及びDNAを遊離させるための方
法に関するものである。この容器を次いで、細胞
が破砕し細胞成分が遊離されるまで超音波浴中に
設置する。前記溶液中には、緩衝液、洗剤、遺伝
プローブ、抗体、酵素、キレート化剤、塩、有機
化合物等の様々な添加物を入れることができる。
本発明方法の結果、開放又は閉鎖容器中の臨床的
又は生物学的試料中に存在するMycobacterium
tuberculosisのような他の方法では不応性の完全
な微生物も破砕することができ、RNA及びDNA
を含む細胞成分を遊離させ、試料中で検出、同
定、定量又は遺伝プローブや抗体検出法を用いた
その他の診断法を行なうことができる。 先行技術の説明 バイオテクノロジー革命によつて細胞の遺伝的
成分に大きな関心が生じた。その結果、微生物内
からのRNA及びDNA遊離を促進させる方法を決
定するための大規模な努力が過去25年間に費やさ
れてきた。例えば、微生物内に含まれるRNAお
よびDNAは、その微生物の臨床的又は生物学的
試料中の存在の有無を同定するために有用な価値
ある情報を与えることができる。遺伝プローブを
含むハイブリダイゼーシヨン反応は遺伝プローブ
上の相補的な核酸配列とのハイブリダイゼーシヨ
ンを促進させるため細胞内からの遺伝情報の遊離
に依存している。このようなハイブリダイゼーシ
ヨン反応は生物学的試料中に存在する微生物の分
離、検出、同定及び／又は定量に用いることがで
きる。 ある種の細胞は容易に破砕され、細胞成分を遊
離するが、他の種類で細胞を破砕しにくいものも
ある。その細胞の１例であるMycobacterium
tuberculosisは結核の原因となり、破砕が難しい
ことでよく知られている。その結果、この種の不
応性（refractory）の微生物内のRNAやDNAを
便宜的かつ効率的に得ることはより困難であり、
これが遺伝プローブの方法による同定を不可能に
している原因である。 ヒトに疫病をおこす全ての感染症疾患の中で、
おそらく結核は最高の罹患率及び死亡率の原因と
なつていると考えられる。西欧諸国の結核発症率
は著しく低下したが、今日においても、結核は依
然として世界中で最も流行している感染症の１つ
である。世界の人口の半数以上が結核菌に感染し
ていると現在推定されている。（Youmans，G.
P.，Tuberculosis，W.B.Saunders Company
（1979））結核治療活動の年間総費用は米国単独で
１年間に約６億ドルにのぼると推定される。（会
議報告“Future Research in Tuberculosis：
Prospects and Priorities for Elimination”９
（1985年６月５〜７日）American Review of
Respiratory Diseaseの別冊として提出（以下
“Pittsfield Report”）） 1985年６月５〜７日に、the Center for Disea
se Control（CDC）、the National Institutes of
Health（NIH）、the American Thoracic
Society（ATS）及びPettsfield Antituberculosis
Association（PATA）の後援による会議での目
的は結核罹患率低下をうながし、究極的には米国
及び世界から結核を消失させるために、研究領域
の優先順位を決定することであつた。この中で本
症患の管理（治療）及び衰退に重要であると認め
られた障害は一般に行われている長たらしい診断
方法である。 世界の人口の約50％が結核菌に感染しており、
世界保健機構（WHO）は現在、１年以内に新た
に４〜500万の結核感染者が出ると推定している。
おそらく１年後にはさらに４〜500万の非感染者
が結核に罹患するであろう。この800〜1000万の
新たな患者に加えて、おそらく１年当り３〜400
万人の結核による死亡者が出ると考えられる
（「Pittsfield Report」の14ページ）。 結核の診断及び同定方法は結核治療技術の状態
を反映する。「Pittsfield Report」の17ページに
は、「結核とは今世紀の初め近代的に考えられた、
19世紀の方法を用いて依然として戦つているが、
この方法は21世紀の初めが近付くにつれもはや時
代遅れとなりつつある。」と記載されている。 感染者はRobert Kochにより開発された方法
と基本的に同じツベルクリンテストに対する反応
により診断される。 この方法は依然としてかなり粗製の抗原を皮膚
に注入し、腕の腫脹を測定し、結核感染か、他の
マイコバクテリア感染あるいは非特異的反応かを
診断しようとするものである。 症例の多くは結核菌の分離により詳しく診断さ
れる。多くの改善が成されたが、細菌学における
方法はPasteur，Ehrlich及びKochらにより開発
されたものと基本的に同じ方法が用いられてい
る。結核菌は染色され、鏡検され、培養される。
この培養には依然、数週から数カ月を要し、さら
に他のマイコバクテリアと結核菌を鑑別するため
に生化学及びその他の試験が必要である。 検出すべき細菌、この場合はMycobacterium
tuberculosisの核酸配列に相補的な核酸配列を提
供するという遺伝プローブ技術の進歩に伴い、
「Pttsfield Report」の著者はその76ページで、
マイコバクテリア属の微生物内の核酸とそれに相
補的な核酸とがハイブリダイゼーシヨンするため
にはこの微生物内核酸の遊離方法を発見すること
の重要性を以下の様に指摘した。 「マイコバクテリア検出のためのDNAプロー
ブの臨床上での使用に於ける重要な点は試料操作
である。この試験に於いて基本的に要求されるこ
とは試料の核酸がプローブとハイブリツドするた
めに利用されるようにならなければならないこと
である。このハイブリダイゼーシヨン技術は唾
液、糞尿、血清、組織ホモジネート、脊髄液及び
尿に適用できる。 さらに、臨床的方法論に関して、本報告書は続
けて以下のように明言している。 「DNAプローブを用いてマイコバクテリアを
検出する際の大きな困難はハイブリダイゼーシヨ
ンのために核酸を遊離させるためのマイコバクテ
リア細胞の破砕である。このために記述された方
法はなく、これを成し遂げるための技術開発が重
要である。」（下線は追加） 臨床的実験室に適した有効で安全、かつ簡単な
細胞破砕法の必要性は明らかである。細胞分画法
及び破砕技術の一般的概説として、Schnaitman，
C.A.，「Cell Fractionation」Manual of
Methods for General Bacteriology、Ch.5，52
〜61（Gerhardt，Ｐ他編集、1981年），Coakley
W.T.他、「Disruption of Microorganisms」
Adv.Microbial.Physiol.16：279〜341（1977）及
びHughes，D.E.他「The Disintegration of
Microorganisms，」Methods in Microbiology、
5B，ch.1，２−54（Norris，J.R.及びRibbons，
D.W.編集、1971）がある。 マイコバクテリアのような不応性細菌から
RNA又はDNAを抽出するこれまでの方法は、細
胞を苛酷な物理的粉砕や振盪により細胞成分を遊
離させるものである（H.Venner，Acta Biol.
Med.Ger.11：806（1963）；Ｍ Tsukamura他、
Am.Rev.Respirat.Diseases，81：403（1963）；
Moore他、米国特許第4295613号、名称「細胞破
砕装置」1981年10月20日発行、参照）。これらの
方法には無視できない欠点がある。まず第１に、
粉砕粒子の物理的関与による摩擦で過度の発熱が
生じ、これがDNA及びRNA等の遺伝的細胞内成
分に対し有害に作用し、その後の診断方法で使用
出来なくなるようにする。 さらに、これまでに細胞成分の抽出のためにこ
のような苛酷な条件を必要とする多くの生物は非
常に病原性が強い。開放系において大量の病原菌
の粉砕に伴う衛生上の危険は明らかである。 これらの問題を認識することにより、不応性細
胞を破砕するための別の方法を試みる研究者たち
が現われてきた。（例えば、L.G.Wayne及びG.A.
Diaz，J.Bacteriol.93：1374（1967）；L.G.Wayne
及びW.M.Gross，“Isolation of Deoxyribo
nucleid Acid From Mycobacteria”J.
Bacteriol.、95：1481（1968）、この中ではグリセ
ロールを十分含有した培地中十分な好気的条件下
で増長させたMycobacterium tuberculosis，M.
Kansasii，M. avium，M. gastri，M.
flavescens，M. smegmatis，M. phlei及び族
の暗発色性マイコバクテリアの培養物を酸素制限
下に急激に暴露した後自己溶解させる、参照）。
この方法は時間及び費用がかかり、微生物を増殖
させる段階等の多くの手順を必要とする。 おそらくこれまでの方法の中で最も有効なマイ
コバクテリア細胞破砕法は圧力室
（pressurecell）を用いた方法である。この方法
はマイコバクテリア微生物溶液を非常に高い圧力
下で非常に小さな直径の小孔に通過させる。この
小孔を細胞溶液が通過する過程で機械的な力によ
りマイコバクテリアは破砕し、細胞内成分が溶液
中に遊離される。この方法を用いた細胞破裂率の
範囲は90から100％である。しかしながら、この
ようなシステムは巨大で高価であり、過剰な発熱
を防止し、溶解した細胞成分への障害を防止する
ために冷却システムを必要とする。大量の試料を
必要とし、その装置は清潔で操作中の汚染がない
ことが必要である。結局、感染菌を扱う場合、巨
大な封鎖系が必要である。 また、マイコバクテリア属微生物を含む溶液に
非常に強力な超音波衝撃を作用させ細胞を破壊す
ることもできる。細胞を破砕するために、強力な
超音波探査器（sonifierやsonicatorとして知られ
る）のような超音波装置を用いた研究者もいた
（Seiter，J.A.及びJay，J.M.，Application of
Ployacrylamide Gel Electrophoresis to the
Characterization and Identification of BArth
robacter Species，”Int.J.Syst.acteriol.，30：
460−465（April.1980）参照。しかし、ある種の
アルトロバクター属の蛋白の特性を明らかにし、
さらにその同定から成るこの研究は大量の細胞懸
濁液を破砕するためにビーズとW350型ソニケー
ター（Heat Systems−Ultrasonics，Inc.）を用
いた。Seiterらはこの懸濁液の微片物質を除去す
るために遠心分離し、上澄を採取し、次にポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけ、蛋白特性を示
した。この型の強力な探査装置ではかなりの量の
熱が発生し、温度上昇を抑制するために、冷却外
被又は氷浴を必要とするが、この温度上昇によ
り、もはやプローブ法での検出が不可能なほど細
胞内のDNA又はRNAが破壊されることが多い。
この事実は多数の参考文献により示されている。
例えば、Salter、D.N.及びSmith，R.H.，
“Protein Utilization in the Young Steer：
Digestion and Nitrogen Retention of 15N−
Labelled Rumen Bacterial Protein”，British
Journal of Nutrition，51：531−539（1984）、こ
ぶ胃の細菌の懸濁液を超音波ジスインテグレイダ
ー（Soniprobe：Dawe Instruments Ltd.，
London）を用いてガラスビーズを加えた該懸濁
液の氷冷却部分の超音波処理により破砕した。こ
の処理では温度が25〜30℃に徐々に上昇し、全細
菌の約95％が破砕された。しかしこの方法では破
砕前と最終的に破砕した細菌片の最後の透析後の
分析によつてRNA及びDNAが完全に破壊されて
いることが判明した。 この種の探査型超音波処理器の出力は80〜
100Wと測定された。（Closs、O.、他“The
Antigens of Mycobacterium bovis、Strain
BCG，Studied by Crossed
Immunoelectrophoresis：Ａ Reference
System”，Scand.J，Immunol.12：249〜263
（1980）。この研究ではMycobacterium bovis菌
液を氷水中のロゼツト冷却室中でＢ−12型の
Branson sonifier（Branson Sonic Power CO.，
Danbury，Conn.）を用いて測定時の出力80〜
100wで超音波処理し、Mycobacterium bovisの
抗原成分を明らかにした。さらに、Alliger，H.、
米国特許第3558066号、名称「グラム陽性細菌か
ら得られる抗原の超音波処理による抽出、1971年
１月26日発行、を参照すべし。対照的に、本発明
による方法で用いられる超音波浴は低出力で作動
し、使いやすく、経済的で小さく機能的である。
この装置では超音波処理する溶液に障害を与える
ほど該溶液の温度を上昇させないので、冷却外被
あるいは氷浴を必要としない。さらに、本法では
感染物質も安全な方法で取り扱うことができる。
この超音波浴は生物学的に安全なキヤビネツト内
に入れることができ噴霧状の危険物質の発生を確
実に防ぐために試験管を密閉することもできる。
また、多くの試料を同時に処理することができ
る。 結局、既存の方法である、細胞の圧力室及び強
力な超音波探査器は時間がかかりすぎ、非経済的
で、安全かつ有効なやり方で使用することは困難
である。 故に、細胞成分を遊離させるための簡単で経済
的な細胞粉砕法を提供することが本発明の第一の
目的である。さらに、細胞内の核酸を大きく損傷
することなく微生物からRNA及びDNAを遊離さ
せる方法を提供することが本発明の次の目的であ
る。未精製の生物学的、環境的、食物又は臨床的
試料中に含有される微生物からRNA及びDNAを
遊離させる方法を提供することも本発明の目的で
ある。開放又は閉鎖容器内の試料から、微生物を
容易に検出、同定又は定量するために、該微生物
を含有すると思われる未精製生物学的又は臨床試
料、即ち、唾液、糞便、血清、組織、血液、尿、
脊髄液、滑液や他の体液等の試料からRNA及び
DNAをその試料中へ遊離させるための迅速、効
率的かつ経済的な方法の提供が本発明の次の目的
である。さらに、不応性微生物から、細胞物質を
遊離させる方法を提供することが本発明の目的で
ある。加えて、上記した遊離RNA又はDNAを利
用して、前記未精製試料中に存在する微生物の検
出方法を提供することも本発明の目的である。 一般的に述べれば、溶液中の細胞又は微生物
を、例えばガラス、プラスチツク、砂又はケイ酸
塩、ラテツクス、水晶、金属、金属酸化物等の
種々の組成の小型ビーズと共に容器内で、超音波
浴（例えば宝石の洗浄や実験装置として使用され
る型）内で超音波処理すると、RNA及びDNAを
含む細胞成分を数分のうちに該溶液中に遊離する
という驚異的な発見により上述の目的は成し遂げ
られる。この結果から、前記核酸は核酸ハイブリ
ダイゼーシヨン法により容易に検出でき、他の種
類の超音波装置により時々生じる該核酸の損傷も
ないことが示された。通常不応性のマイコバクテ
リアを含む検討したすべての微生物で容易に細胞
破砕が生じた。容器内の溶液中に遊離された
RNA及びDNAは例えば、遺伝プローブ中に存在
する相補的核酸配列とハイブリダイゼーシヨンが
可能である。この方法は抗体反応のための蛋白及
び細胞成分の遊離にも使用される。細胞及びビー
ズを含有した溶液を入れた容器には、例えばプラ
スチツク製試験管又は適当に密閉し得る他の適当
な容器が使用できる。あるいはまた、超音波エネ
ルギーは例えば変換器を通して細胞及びビーズの
溶液や、懸濁液に直接伝達できるので、細胞及び
ビーズを保持する別の容器を必要としない。本発
明の方法による超音波処理で細胞が破砕した後、
遊離したRNA又はDNAと遺伝プローブとを適切
な条件下で反応させるために、緩衝液、洗剤、遺
伝プローブ、抗体、酵素、キレート化剤、塩、有
機化合物等、様々な物質を添加することができ
る。従つて、本発明の１具体例は、未精製の臨床
的又は生物学的試料中の細胞を該試料中で溶解又
は破砕することにより、検出すべき微生物の
RNA又はDNAの核酸配列と相補的な核酸配列を
持つ遺伝プローブとハイブリダイゼーシヨンさせ
るために遺伝物質を溶液中に容易に遊離させる一
過程を開示している。特定な操作で必要とする最
適条件を得るために当業者であれば溶液中に添加
するその他の物質を変化させることができる。 広い見地から、本発明の方法は、小型ビーズと
共に容器内に入れた細胞溶液を例えば超音波浴内
で超音波処理すると、細胞は破砕し、細胞成分を
必要ならば閉鎖できる容器内の溶液に遊離すると
いう驚異的発見に基づいている。本発明の方法に
より容易に遊離される細胞成分にはデオキシリボ
核酸（DNA）及びリボ核酸（RNA）がある。 ある種の細胞は破砕が非常に困難であつた。そ
の一種であるMycobacterium tuberculosisは複
合脂質から成る密度の高い細胞壁を持つ桿状形細
菌（桿菌）である。これらの細胞は破砕しにくい
ことで有名である。その結果、これらの細胞を破
砕するために苛酷な条件が提案され用いられ、そ
の有害作用のため、核酸が損傷し、以降の実験や
処理に使用不可能となる場合もあつた。しかし、
このような種類の細胞を溶解するための便宜的
で、安全、効率的及び経済的な方法は引き続き至
急に必要とされていた。 マイコバクテリア属の細胞中に含有する核酸を
ハイブリダイゼーシヨンに用いるために該細胞を
破砕することが非常に困難なのでマイコバクテリ
ア属の検出用のDNAやRNAプローブの臨床上の
使用が妨げられている。この基本的要求、すなわ
ち、効率的、安全、かつ経済的な細胞内RNA及
びDNAの溶液への遊離がなければ、ハイブリダ
イゼーシヨンは不可能で、マイコバクテリア属の
ような不応性細胞の診断手段としての遺伝プロー
ブの価値は明らかに減少する。本出願人の発明以
前にはこれらの細胞のRNA及び／又はDNAをハ
イブリダイゼーシヨン不可能とすることなく適切
に破砕する簡単な方法は示されていなかつた。 本発明の方法を実施するために、様々な市販の
超音波浴を用いることができる。例えばConnec
ticut SheltonのBranson Cleaning Equipment
Companyはタンク容積10オンスから８ガロンの
12個のモデルをBransonic という名称で販売し
ている。California AnaheimのMettler
Electronics も又タンク容積2.1クオートから18
ガロンの数種のモデルを販売している。これらの
超音波浴はペン、宝石、機械類、エンジン部品、
ノズル、実験器具、スイツチ、鍵、自動車部品、
ガラス、セラミツク、金属、硬質プラスチツク等
の洗浄に用いられる。これらの超音波浴は入力し
た電気的エネルギーを高周波数の超音波エネルギ
ーに変換するために、例えばジルコニウムチタン
酸鉛又はチタン酸バリウム等の圧電気変換器や磁
気拘束変換器を利用している。この機械的エネル
ギーすなわち振動は洗浄タンク中を占める液体中
につながりそれを通して伝達される。Bransonic
超音波洗浄器は周波数約55KHzで作動し、一方
Mettler 装置の公称周波数は22〜67KHzの範囲
である。超音波という用語は人の聴取域、即ち約
20KHzよりすぐ上の周波数を意味する。また一
方、超音波エネルギーは例えば変換器を通して細
胞溶液又は懸濁液及びビーズに直接伝達されるの
で、細胞及びビーズを入れるための容器を必要と
しない。精製済み又は未精製の細胞あるいは微生
物の溶液や懸濁液は超音波エネルギーを伝達する
ことができるステンレス鋼のような物質から成る
容器又は筒（well）あるいは一連の容器又は筒の
中に入れることができる。その筒は入力エネルギ
ーを超音波エネルギーに変換できる適切な変換器
又は他の装置に接続しているかあるいは近接して
いる。細胞及びビーズを直接試料容器として機能
する１つの筒や一連の筒に入れるか又は細胞及び
ビーズを容器内に入れ筒内にある液体中に容器を
沈めることもできる。その筒は液体漏れや噴霧形
成を防ぐために適切なふたで閉鎖することができ
る。上述の例は単なる具体例であり、本発明上の
特質や不可欠な性質を持つ他の特定な形態でも具
体化できることを理解しなければならない。 超音波による細胞破砕方法は十分説明されてい
るわけではないが、液体中を伝播する超音波は圧
縮及び圧力最小部分の交互から成り立つているも
のと仮定されている。波の振幅が十分大きい場合
は、キヤビテーシヨンという現象が生じる。キヤ
ビテーシヨンは微細小泡を発生させ、破壊する。
これらの小泡又は空洞が共振大まで成長すると、
１圧縮サイクルで直ちにかつ激しく崩壊し、おそ
らく20000気圧もの大きな局所的圧力変化が生じ
る。高出力密度装置の場合、数ミクロンの距離で
感じられるこの機械的衝撃は細胞破砕作用を示
す。（Alliger、H.Ultrasonic Disruption.
American Laboratory、1975年10月よりの再出
版） しかしながら、本発明の方法に於いては、細胞
がキヤビテーシヨンにより破壊されるとは考えら
れない。なぜならば実際に、細胞は小型ビーズが
なくては破壊されないからである。むしろ、超音
波が細菌溶接又は懸濁液中のビーズを振動させ、
その結果、剪断力により細胞が破砕されると考え
られる。微小ビーズと超音波との間の正確な相互
作用は明らかでなく、出願人もある理論に拘束又
は制限されることを好まないが、超音波がビーズ
に振動性運動を伝えると考えられている。そし
て、細胞はビーズの前記運動による強い剪断作用
を受け、その結果細胞壁が破裂し、細胞成分が遊
離する。しかしながら、一度溶液中に遊離された
細胞成分の損傷を防ぐことが大切である。本発明
の低出力密度超音波浴は細胞を十分破壊するが、
一度遊離されたRNA又はDNAを破壊する程強力
ではない。その上、本発明の方法は室温（18℃）
及びそれ以上で有効に細胞を破砕する。しかしこ
のパラメーターは本発明の有効な温度範囲を制限
しているとは考えられない。 本発明による超音波法ではマイコバクテリア属
のような不応性微生物も、迅速、安全、効率的及
び経済的な方法で有効に破砕し、容易にRNA及
びDNA等の細胞成分を遊離させることが認めら
れている。 出願人は本発明方法を細胞加圧を用いた細胞破
砕法と比較した。細胞加圧法はこの方法を用いて
ほぼ全ての細菌が破砕されるため、比較のための
参考方法として選択した。マイコバクテリア属の
菌液を用いた。上記比較のための一般的プロトロ
ールを以下に示した。 Ａ マイコバクテリア属を含む溶液を４つの試料
に分けた。 (1) 第１試料は細胞を18000psiで２回加圧し
た。 (2) 第２試料には閉鎖容器内でガラスビーズを
添加し、超音波浴内に入れ、本発明方法に従
い超音波処理を行つた。 (3) 第３試料は閉鎖容器内でガラスビーズを添
加せず、(2)の通りに超音波処理を行つた。 (4) 第４試料は処理をせずに対照として用い
た。 Ｂ Ａの各試料の破砕された細胞分画を測定し
た。 特定の処理をした各試料中に遊離されたRNA
量は核酸ハイブリダイゼーシヨン動力学法により
測定した。各試料の一部を0.48Mリン酸緩衝液
（PB）、0.2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で
調整した。Mycobacterium tuberculosis RNA
に相補的な放射性標識DNAを各試料に加え、72
℃でインキユベートした。特定の時間後に各試料
の一部を採取し、0.14M PB、0.02％SDSで希釈
した。この希釈試料は72℃、0.14M PB、0.02％
SDSで平衡状態としたハイドロキシアパタイト
（HA）カラム上で分析した。基本的なHA分画法
はKohne及びBritten，Procedures in Nucleic
Acid Research（1971），Cantoni及びDavies編、
Harper＆Row.2巻500ページ（1971）中に記載さ
れている。各試料中の遊離RNA濃度を測定する
ために試料の動力学プロフイルを比較した。 Ｃ 結果を表に示した。 表 細胞処理法 破壊された細胞分画 １ 細胞加圧法 100％ 18000psiの圧力を ２回細胞に加圧 ２ ガラスビーズを添加し、 100％ 10分間超音波処理 ３ ガラスビーズを添加せ 15％ ずに10分間超音波処理 ４ 対 照 12％ 種々の異なる細菌を用いて、超音波洗浄浴中で
の破砕とFrench pressure cellを用いた破砕とを
比較した。試料を２つに分けた。その一方の
100μ（mg）を同容量のガラスビーズを添加し
た試験管に加え、脱気した水（脱気法は超音波浴
を沸騰水で満たし、温度が90℃に低下した時に15
分超音波処理して行なつた）を用いた超音波浴中
で75℃で10分間超音波処理を行つた。この試料を
10倍希釈し、H6000Aローターを用いてSorvall
RC−3Bで3400rpm30分間遠心分離し、粒子物質
を沈渣とした。各試料のもう一方をFrench
pressure cellを通した後水で10倍希釈し、同様
に遠心分離した。細胞物質の遊離を255nmの紫外
線吸収で調べた。255nmの吸収は細胞破砕の指数
となる。核酸及び蛋白はこの波長で吸収を示す主
な物質である。この結果は、同様な懸濁液から上
澄に遊離されたA255の単位で以下の表に示し
た。
願された米国特許出願456729号、名称「非ウイル
ス性微生物の検出、同定及び定量法」、Kohne，
D.E.により1984年９月４日出願された米国特許出
願6553655号、名称「微生物及びウイルスの検出、
同定及び定量法」、Kohne，D.E.により1984年７
月５日出願された米国特許出願627795号、名称
「核酸再結合促進法」及びKohne、D.E.らにより
1986年１月７日出願された米国特許出願、名称
「核酸再結合促進法」に関係するものである。こ
れらの全ての開示は本明細書の記載内容中で参照
される。 本発明の技術分野 本発明は細胞破砕（disrupting）とそれにより
細胞成分を溶液中へ遊離させる（release）方法
に関するものである。特に、本発明は様々な組成
の小ビーズを含む容器内に入れた微生物溶液中で
微生物からRNA及びDNAを遊離させるための方
法に関するものである。この容器を次いで、細胞
が破砕し細胞成分が遊離されるまで超音波浴中に
設置する。前記溶液中には、緩衝液、洗剤、遺伝
プローブ、抗体、酵素、キレート化剤、塩、有機
化合物等の様々な添加物を入れることができる。
本発明方法の結果、開放又は閉鎖容器中の臨床的
又は生物学的試料中に存在するMycobacterium
tuberculosisのような他の方法では不応性の完全
な微生物も破砕することができ、RNA及びDNA
を含む細胞成分を遊離させ、試料中で検出、同
定、定量又は遺伝プローブや抗体検出法を用いた
その他の診断法を行なうことができる。 先行技術の説明 バイオテクノロジー革命によつて細胞の遺伝的
成分に大きな関心が生じた。その結果、微生物内
からのRNA及びDNA遊離を促進させる方法を決
定するための大規模な努力が過去25年間に費やさ
れてきた。例えば、微生物内に含まれるRNAお
よびDNAは、その微生物の臨床的又は生物学的
試料中の存在の有無を同定するために有用な価値
ある情報を与えることができる。遺伝プローブを
含むハイブリダイゼーシヨン反応は遺伝プローブ
上の相補的な核酸配列とのハイブリダイゼーシヨ
ンを促進させるため細胞内からの遺伝情報の遊離
に依存している。このようなハイブリダイゼーシ
ヨン反応は生物学的試料中に存在する微生物の分
離、検出、同定及び／又は定量に用いることがで
きる。 ある種の細胞は容易に破砕され、細胞成分を遊
離するが、他の種類で細胞を破砕しにくいものも
ある。その細胞の１例であるMycobacterium
tuberculosisは結核の原因となり、破砕が難しい
ことでよく知られている。その結果、この種の不
応性（refractory）の微生物内のRNAやDNAを
便宜的かつ効率的に得ることはより困難であり、
これが遺伝プローブの方法による同定を不可能に
している原因である。 ヒトに疫病をおこす全ての感染症疾患の中で、
おそらく結核は最高の罹患率及び死亡率の原因と
なつていると考えられる。西欧諸国の結核発症率
は著しく低下したが、今日においても、結核は依
然として世界中で最も流行している感染症の１つ
である。世界の人口の半数以上が結核菌に感染し
ていると現在推定されている。（Youmans，G.
P.，Tuberculosis，W.B.Saunders Company
（1979））結核治療活動の年間総費用は米国単独で
１年間に約６億ドルにのぼると推定される。（会
議報告“Future Research in Tuberculosis：
Prospects and Priorities for Elimination”９
（1985年６月５〜７日）American Review of
Respiratory Diseaseの別冊として提出（以下
“Pittsfield Report”）） 1985年６月５〜７日に、the Center for Disea
se Control（CDC）、the National Institutes of
Health（NIH）、the American Thoracic
Society（ATS）及びPettsfield Antituberculosis
Association（PATA）の後援による会議での目
的は結核罹患率低下をうながし、究極的には米国
及び世界から結核を消失させるために、研究領域
の優先順位を決定することであつた。この中で本
症患の管理（治療）及び衰退に重要であると認め
られた障害は一般に行われている長たらしい診断
方法である。 世界の人口の約50％が結核菌に感染しており、
世界保健機構（WHO）は現在、１年以内に新た
に４〜500万の結核感染者が出ると推定している。
おそらく１年後にはさらに４〜500万の非感染者
が結核に罹患するであろう。この800〜1000万の
新たな患者に加えて、おそらく１年当り３〜400
万人の結核による死亡者が出ると考えられる
（「Pittsfield Report」の14ページ）。 結核の診断及び同定方法は結核治療技術の状態
を反映する。「Pittsfield Report」の17ページに
は、「結核とは今世紀の初め近代的に考えられた、
19世紀の方法を用いて依然として戦つているが、
この方法は21世紀の初めが近付くにつれもはや時
代遅れとなりつつある。」と記載されている。 感染者はRobert Kochにより開発された方法
と基本的に同じツベルクリンテストに対する反応
により診断される。 この方法は依然としてかなり粗製の抗原を皮膚
に注入し、腕の腫脹を測定し、結核感染か、他の
マイコバクテリア感染あるいは非特異的反応かを
診断しようとするものである。 症例の多くは結核菌の分離により詳しく診断さ
れる。多くの改善が成されたが、細菌学における
方法はPasteur，Ehrlich及びKochらにより開発
されたものと基本的に同じ方法が用いられてい
る。結核菌は染色され、鏡検され、培養される。
この培養には依然、数週から数カ月を要し、さら
に他のマイコバクテリアと結核菌を鑑別するため
に生化学及びその他の試験が必要である。 検出すべき細菌、この場合はMycobacterium
tuberculosisの核酸配列に相補的な核酸配列を提
供するという遺伝プローブ技術の進歩に伴い、
「Pttsfield Report」の著者はその76ページで、
マイコバクテリア属の微生物内の核酸とそれに相
補的な核酸とがハイブリダイゼーシヨンするため
にはこの微生物内核酸の遊離方法を発見すること
の重要性を以下の様に指摘した。 「マイコバクテリア検出のためのDNAプロー
ブの臨床上での使用に於ける重要な点は試料操作
である。この試験に於いて基本的に要求されるこ
とは試料の核酸がプローブとハイブリツドするた
めに利用されるようにならなければならないこと
である。このハイブリダイゼーシヨン技術は唾
液、糞尿、血清、組織ホモジネート、脊髄液及び
尿に適用できる。 さらに、臨床的方法論に関して、本報告書は続
けて以下のように明言している。 「DNAプローブを用いてマイコバクテリアを
検出する際の大きな困難はハイブリダイゼーシヨ
ンのために核酸を遊離させるためのマイコバクテ
リア細胞の破砕である。このために記述された方
法はなく、これを成し遂げるための技術開発が重
要である。」（下線は追加） 臨床的実験室に適した有効で安全、かつ簡単な
細胞破砕法の必要性は明らかである。細胞分画法
及び破砕技術の一般的概説として、Schnaitman，
C.A.，「Cell Fractionation」Manual of
Methods for General Bacteriology、Ch.5，52
〜61（Gerhardt，Ｐ他編集、1981年），Coakley
W.T.他、「Disruption of Microorganisms」
Adv.Microbial.Physiol.16：279〜341（1977）及
びHughes，D.E.他「The Disintegration of
Microorganisms，」Methods in Microbiology、
5B，ch.1，２−54（Norris，J.R.及びRibbons，
D.W.編集、1971）がある。 マイコバクテリアのような不応性細菌から
RNA又はDNAを抽出するこれまでの方法は、細
胞を苛酷な物理的粉砕や振盪により細胞成分を遊
離させるものである（H.Venner，Acta Biol.
Med.Ger.11：806（1963）；Ｍ Tsukamura他、
Am.Rev.Respirat.Diseases，81：403（1963）；
Moore他、米国特許第4295613号、名称「細胞破
砕装置」1981年10月20日発行、参照）。これらの
方法には無視できない欠点がある。まず第１に、
粉砕粒子の物理的関与による摩擦で過度の発熱が
生じ、これがDNA及びRNA等の遺伝的細胞内成
分に対し有害に作用し、その後の診断方法で使用
出来なくなるようにする。 さらに、これまでに細胞成分の抽出のためにこ
のような苛酷な条件を必要とする多くの生物は非
常に病原性が強い。開放系において大量の病原菌
の粉砕に伴う衛生上の危険は明らかである。 これらの問題を認識することにより、不応性細
胞を破砕するための別の方法を試みる研究者たち
が現われてきた。（例えば、L.G.Wayne及びG.A.
Diaz，J.Bacteriol.93：1374（1967）；L.G.Wayne
及びW.M.Gross，“Isolation of Deoxyribo
nucleid Acid From Mycobacteria”J.
Bacteriol.、95：1481（1968）、この中ではグリセ
ロールを十分含有した培地中十分な好気的条件下
で増長させたMycobacterium tuberculosis，M.
Kansasii，M. avium，M. gastri，M.
flavescens，M. smegmatis，M. phlei及び族
の暗発色性マイコバクテリアの培養物を酸素制限
下に急激に暴露した後自己溶解させる、参照）。
この方法は時間及び費用がかかり、微生物を増殖
させる段階等の多くの手順を必要とする。 おそらくこれまでの方法の中で最も有効なマイ
コバクテリア細胞破砕法は圧力室
（pressurecell）を用いた方法である。この方法
はマイコバクテリア微生物溶液を非常に高い圧力
下で非常に小さな直径の小孔に通過させる。この
小孔を細胞溶液が通過する過程で機械的な力によ
りマイコバクテリアは破砕し、細胞内成分が溶液
中に遊離される。この方法を用いた細胞破裂率の
範囲は90から100％である。しかしながら、この
ようなシステムは巨大で高価であり、過剰な発熱
を防止し、溶解した細胞成分への障害を防止する
ために冷却システムを必要とする。大量の試料を
必要とし、その装置は清潔で操作中の汚染がない
ことが必要である。結局、感染菌を扱う場合、巨
大な封鎖系が必要である。 また、マイコバクテリア属微生物を含む溶液に
非常に強力な超音波衝撃を作用させ細胞を破壊す
ることもできる。細胞を破砕するために、強力な
超音波探査器（sonifierやsonicatorとして知られ
る）のような超音波装置を用いた研究者もいた
（Seiter，J.A.及びJay，J.M.，Application of
Ployacrylamide Gel Electrophoresis to the
Characterization and Identification of BArth
robacter Species，”Int.J.Syst.acteriol.，30：
460−465（April.1980）参照。しかし、ある種の
アルトロバクター属の蛋白の特性を明らかにし、
さらにその同定から成るこの研究は大量の細胞懸
濁液を破砕するためにビーズとW350型ソニケー
ター（Heat Systems−Ultrasonics，Inc.）を用
いた。Seiterらはこの懸濁液の微片物質を除去す
るために遠心分離し、上澄を採取し、次にポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけ、蛋白特性を示
した。この型の強力な探査装置ではかなりの量の
熱が発生し、温度上昇を抑制するために、冷却外
被又は氷浴を必要とするが、この温度上昇によ
り、もはやプローブ法での検出が不可能なほど細
胞内のDNA又はRNAが破壊されることが多い。
この事実は多数の参考文献により示されている。
例えば、Salter、D.N.及びSmith，R.H.，
“Protein Utilization in the Young Steer：
Digestion and Nitrogen Retention of 15N−
Labelled Rumen Bacterial Protein”，British
Journal of Nutrition，51：531−539（1984）、こ
ぶ胃の細菌の懸濁液を超音波ジスインテグレイダ
ー（Soniprobe：Dawe Instruments Ltd.，
London）を用いてガラスビーズを加えた該懸濁
液の氷冷却部分の超音波処理により破砕した。こ
の処理では温度が25〜30℃に徐々に上昇し、全細
菌の約95％が破砕された。しかしこの方法では破
砕前と最終的に破砕した細菌片の最後の透析後の
分析によつてRNA及びDNAが完全に破壊されて
いることが判明した。 この種の探査型超音波処理器の出力は80〜
100Wと測定された。（Closs、O.、他“The
Antigens of Mycobacterium bovis、Strain
BCG，Studied by Crossed
Immunoelectrophoresis：Ａ Reference
System”，Scand.J，Immunol.12：249〜263
（1980）。この研究ではMycobacterium bovis菌
液を氷水中のロゼツト冷却室中でＢ−12型の
Branson sonifier（Branson Sonic Power CO.，
Danbury，Conn.）を用いて測定時の出力80〜
100wで超音波処理し、Mycobacterium bovisの
抗原成分を明らかにした。さらに、Alliger，H.、
米国特許第3558066号、名称「グラム陽性細菌か
ら得られる抗原の超音波処理による抽出、1971年
１月26日発行、を参照すべし。対照的に、本発明
による方法で用いられる超音波浴は低出力で作動
し、使いやすく、経済的で小さく機能的である。
この装置では超音波処理する溶液に障害を与える
ほど該溶液の温度を上昇させないので、冷却外被
あるいは氷浴を必要としない。さらに、本法では
感染物質も安全な方法で取り扱うことができる。
この超音波浴は生物学的に安全なキヤビネツト内
に入れることができ噴霧状の危険物質の発生を確
実に防ぐために試験管を密閉することもできる。
また、多くの試料を同時に処理することができ
る。 結局、既存の方法である、細胞の圧力室及び強
力な超音波探査器は時間がかかりすぎ、非経済的
で、安全かつ有効なやり方で使用することは困難
である。 故に、細胞成分を遊離させるための簡単で経済
的な細胞粉砕法を提供することが本発明の第一の
目的である。さらに、細胞内の核酸を大きく損傷
することなく微生物からRNA及びDNAを遊離さ
せる方法を提供することが本発明の次の目的であ
る。未精製の生物学的、環境的、食物又は臨床的
試料中に含有される微生物からRNA及びDNAを
遊離させる方法を提供することも本発明の目的で
ある。開放又は閉鎖容器内の試料から、微生物を
容易に検出、同定又は定量するために、該微生物
を含有すると思われる未精製生物学的又は臨床試
料、即ち、唾液、糞便、血清、組織、血液、尿、
脊髄液、滑液や他の体液等の試料からRNA及び
DNAをその試料中へ遊離させるための迅速、効
率的かつ経済的な方法の提供が本発明の次の目的
である。さらに、不応性微生物から、細胞物質を
遊離させる方法を提供することが本発明の目的で
ある。加えて、上記した遊離RNA又はDNAを利
用して、前記未精製試料中に存在する微生物の検
出方法を提供することも本発明の目的である。 一般的に述べれば、溶液中の細胞又は微生物
を、例えばガラス、プラスチツク、砂又はケイ酸
塩、ラテツクス、水晶、金属、金属酸化物等の
種々の組成の小型ビーズと共に容器内で、超音波
浴（例えば宝石の洗浄や実験装置として使用され
る型）内で超音波処理すると、RNA及びDNAを
含む細胞成分を数分のうちに該溶液中に遊離する
という驚異的な発見により上述の目的は成し遂げ
られる。この結果から、前記核酸は核酸ハイブリ
ダイゼーシヨン法により容易に検出でき、他の種
類の超音波装置により時々生じる該核酸の損傷も
ないことが示された。通常不応性のマイコバクテ
リアを含む検討したすべての微生物で容易に細胞
破砕が生じた。容器内の溶液中に遊離された
RNA及びDNAは例えば、遺伝プローブ中に存在
する相補的核酸配列とハイブリダイゼーシヨンが
可能である。この方法は抗体反応のための蛋白及
び細胞成分の遊離にも使用される。細胞及びビー
ズを含有した溶液を入れた容器には、例えばプラ
スチツク製試験管又は適当に密閉し得る他の適当
な容器が使用できる。あるいはまた、超音波エネ
ルギーは例えば変換器を通して細胞及びビーズの
溶液や、懸濁液に直接伝達できるので、細胞及び
ビーズを保持する別の容器を必要としない。本発
明の方法による超音波処理で細胞が破砕した後、
遊離したRNA又はDNAと遺伝プローブとを適切
な条件下で反応させるために、緩衝液、洗剤、遺
伝プローブ、抗体、酵素、キレート化剤、塩、有
機化合物等、様々な物質を添加することができ
る。従つて、本発明の１具体例は、未精製の臨床
的又は生物学的試料中の細胞を該試料中で溶解又
は破砕することにより、検出すべき微生物の
RNA又はDNAの核酸配列と相補的な核酸配列を
持つ遺伝プローブとハイブリダイゼーシヨンさせ
るために遺伝物質を溶液中に容易に遊離させる一
過程を開示している。特定な操作で必要とする最
適条件を得るために当業者であれば溶液中に添加
するその他の物質を変化させることができる。 広い見地から、本発明の方法は、小型ビーズと
共に容器内に入れた細胞溶液を例えば超音波浴内
で超音波処理すると、細胞は破砕し、細胞成分を
必要ならば閉鎖できる容器内の溶液に遊離すると
いう驚異的発見に基づいている。本発明の方法に
より容易に遊離される細胞成分にはデオキシリボ
核酸（DNA）及びリボ核酸（RNA）がある。 ある種の細胞は破砕が非常に困難であつた。そ
の一種であるMycobacterium tuberculosisは複
合脂質から成る密度の高い細胞壁を持つ桿状形細
菌（桿菌）である。これらの細胞は破砕しにくい
ことで有名である。その結果、これらの細胞を破
砕するために苛酷な条件が提案され用いられ、そ
の有害作用のため、核酸が損傷し、以降の実験や
処理に使用不可能となる場合もあつた。しかし、
このような種類の細胞を溶解するための便宜的
で、安全、効率的及び経済的な方法は引き続き至
急に必要とされていた。 マイコバクテリア属の細胞中に含有する核酸を
ハイブリダイゼーシヨンに用いるために該細胞を
破砕することが非常に困難なのでマイコバクテリ
ア属の検出用のDNAやRNAプローブの臨床上の
使用が妨げられている。この基本的要求、すなわ
ち、効率的、安全、かつ経済的な細胞内RNA及
びDNAの溶液への遊離がなければ、ハイブリダ
イゼーシヨンは不可能で、マイコバクテリア属の
ような不応性細胞の診断手段としての遺伝プロー
ブの価値は明らかに減少する。本出願人の発明以
前にはこれらの細胞のRNA及び／又はDNAをハ
イブリダイゼーシヨン不可能とすることなく適切
に破砕する簡単な方法は示されていなかつた。 本発明の方法を実施するために、様々な市販の
超音波浴を用いることができる。例えばConnec
ticut SheltonのBranson Cleaning Equipment
Companyはタンク容積10オンスから８ガロンの
12個のモデルをBransonic という名称で販売し
ている。California AnaheimのMettler
Electronics も又タンク容積2.1クオートから18
ガロンの数種のモデルを販売している。これらの
超音波浴はペン、宝石、機械類、エンジン部品、
ノズル、実験器具、スイツチ、鍵、自動車部品、
ガラス、セラミツク、金属、硬質プラスチツク等
の洗浄に用いられる。これらの超音波浴は入力し
た電気的エネルギーを高周波数の超音波エネルギ
ーに変換するために、例えばジルコニウムチタン
酸鉛又はチタン酸バリウム等の圧電気変換器や磁
気拘束変換器を利用している。この機械的エネル
ギーすなわち振動は洗浄タンク中を占める液体中
につながりそれを通して伝達される。Bransonic
超音波洗浄器は周波数約55KHzで作動し、一方
Mettler 装置の公称周波数は22〜67KHzの範囲
である。超音波という用語は人の聴取域、即ち約
20KHzよりすぐ上の周波数を意味する。また一
方、超音波エネルギーは例えば変換器を通して細
胞溶液又は懸濁液及びビーズに直接伝達されるの
で、細胞及びビーズを入れるための容器を必要と
しない。精製済み又は未精製の細胞あるいは微生
物の溶液や懸濁液は超音波エネルギーを伝達する
ことができるステンレス鋼のような物質から成る
容器又は筒（well）あるいは一連の容器又は筒の
中に入れることができる。その筒は入力エネルギ
ーを超音波エネルギーに変換できる適切な変換器
又は他の装置に接続しているかあるいは近接して
いる。細胞及びビーズを直接試料容器として機能
する１つの筒や一連の筒に入れるか又は細胞及び
ビーズを容器内に入れ筒内にある液体中に容器を
沈めることもできる。その筒は液体漏れや噴霧形
成を防ぐために適切なふたで閉鎖することができ
る。上述の例は単なる具体例であり、本発明上の
特質や不可欠な性質を持つ他の特定な形態でも具
体化できることを理解しなければならない。 超音波による細胞破砕方法は十分説明されてい
るわけではないが、液体中を伝播する超音波は圧
縮及び圧力最小部分の交互から成り立つているも
のと仮定されている。波の振幅が十分大きい場合
は、キヤビテーシヨンという現象が生じる。キヤ
ビテーシヨンは微細小泡を発生させ、破壊する。
これらの小泡又は空洞が共振大まで成長すると、
１圧縮サイクルで直ちにかつ激しく崩壊し、おそ
らく20000気圧もの大きな局所的圧力変化が生じ
る。高出力密度装置の場合、数ミクロンの距離で
感じられるこの機械的衝撃は細胞破砕作用を示
す。（Alliger、H.Ultrasonic Disruption.
American Laboratory、1975年10月よりの再出
版） しかしながら、本発明の方法に於いては、細胞
がキヤビテーシヨンにより破壊されるとは考えら
れない。なぜならば実際に、細胞は小型ビーズが
なくては破壊されないからである。むしろ、超音
波が細菌溶接又は懸濁液中のビーズを振動させ、
その結果、剪断力により細胞が破砕されると考え
られる。微小ビーズと超音波との間の正確な相互
作用は明らかでなく、出願人もある理論に拘束又
は制限されることを好まないが、超音波がビーズ
に振動性運動を伝えると考えられている。そし
て、細胞はビーズの前記運動による強い剪断作用
を受け、その結果細胞壁が破裂し、細胞成分が遊
離する。しかしながら、一度溶液中に遊離された
細胞成分の損傷を防ぐことが大切である。本発明
の低出力密度超音波浴は細胞を十分破壊するが、
一度遊離されたRNA又はDNAを破壊する程強力
ではない。その上、本発明の方法は室温（18℃）
及びそれ以上で有効に細胞を破砕する。しかしこ
のパラメーターは本発明の有効な温度範囲を制限
しているとは考えられない。 本発明による超音波法ではマイコバクテリア属
のような不応性微生物も、迅速、安全、効率的及
び経済的な方法で有効に破砕し、容易にRNA及
びDNA等の細胞成分を遊離させることが認めら
れている。 出願人は本発明方法を細胞加圧を用いた細胞破
砕法と比較した。細胞加圧法はこの方法を用いて
ほぼ全ての細菌が破砕されるため、比較のための
参考方法として選択した。マイコバクテリア属の
菌液を用いた。上記比較のための一般的プロトロ
ールを以下に示した。 Ａ マイコバクテリア属を含む溶液を４つの試料
に分けた。 (1) 第１試料は細胞を18000psiで２回加圧し
た。 (2) 第２試料には閉鎖容器内でガラスビーズを
添加し、超音波浴内に入れ、本発明方法に従
い超音波処理を行つた。 (3) 第３試料は閉鎖容器内でガラスビーズを添
加せず、(2)の通りに超音波処理を行つた。 (4) 第４試料は処理をせずに対照として用い
た。 Ｂ Ａの各試料の破砕された細胞分画を測定し
た。 特定の処理をした各試料中に遊離されたRNA
量は核酸ハイブリダイゼーシヨン動力学法により
測定した。各試料の一部を0.48Mリン酸緩衝液
（PB）、0.2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で
調整した。Mycobacterium tuberculosis RNA
に相補的な放射性標識DNAを各試料に加え、72
℃でインキユベートした。特定の時間後に各試料
の一部を採取し、0.14M PB、0.02％SDSで希釈
した。この希釈試料は72℃、0.14M PB、0.02％
SDSで平衡状態としたハイドロキシアパタイト
（HA）カラム上で分析した。基本的なHA分画法
はKohne及びBritten，Procedures in Nucleic
Acid Research（1971），Cantoni及びDavies編、
Harper＆Row.2巻500ページ（1971）中に記載さ
れている。各試料中の遊離RNA濃度を測定する
ために試料の動力学プロフイルを比較した。 Ｃ 結果を表に示した。 表 細胞処理法 破壊された細胞分画 １ 細胞加圧法 100％ 18000psiの圧力を ２回細胞に加圧 ２ ガラスビーズを添加し、 100％ 10分間超音波処理 ３ ガラスビーズを添加せ 15％ ずに10分間超音波処理 ４ 対 照 12％ 種々の異なる細菌を用いて、超音波洗浄浴中で
の破砕とFrench pressure cellを用いた破砕とを
比較した。試料を２つに分けた。その一方の
100μ（mg）を同容量のガラスビーズを添加し
た試験管に加え、脱気した水（脱気法は超音波浴
を沸騰水で満たし、温度が90℃に低下した時に15
分超音波処理して行なつた）を用いた超音波浴中
で75℃で10分間超音波処理を行つた。この試料を
10倍希釈し、H6000Aローターを用いてSorvall
RC−3Bで3400rpm30分間遠心分離し、粒子物質
を沈渣とした。各試料のもう一方をFrench
pressure cellを通した後水で10倍希釈し、同様
に遠心分離した。細胞物質の遊離を255nmの紫外
線吸収で調べた。255nmの吸収は細胞破砕の指数
となる。核酸及び蛋白はこの波長で吸収を示す主
な物質である。この結果は、同様な懸濁液から上
澄に遊離されたA255の単位で以下の表に示し
た。
【表】
Legionella pneumophila及びEscherichia
Coliはグラム陰性桿菌の例である。Bacillus
subtilisはグラム陽性桿菌である。
Staphylococcus aureusはグラム陽性球菌、一方
Mycobacterium nonchromogeniumは抗酸菌で
ある。最後に、パン酵母は細菌以外の生物を代表
している。異なる種類の細胞壁を持つこれらの生
物は全て本発明を用いて容易に破壊される。 本発明方法によれば、不応性細胞であつても、
ビーズが溶液中に存在する限りは低出力密度でも
細胞破砕が生じることが判明している。超音波探
査器を細胞懸濁液の容器内に直接設置し、0.2〜
0.3W／mlの超音波出力密度にした場合、表層へ
の作用及び衝撃波が主に細胞崩壊の原因となると
考えられる（Coakley他、上記文献303ページ参
照）。しかし、出願人は本発明の相対的出力密度
を典型的な高出力密度プローブ超音波発信器と比
較し、本発明の方法においては溶液中にビーズが
存在する限り0.2W／mlより顕著に低密度でも細
胞を破砕できることを発見した。高出力密度プロ
ーブ超音波発信器は200mlの水中で５分間作動さ
せた。8.95℃の温度変化があつた。この変化を
8.95×200又は1790cal／５分の出力又は25Wの出
力に換算した。典型的な実験で、この出力の大部
分が３ml以内のプローブ先端に集中し、その結果
出力密度は約8.3w／mlとなる。これと比べて、
250mlの水を入れた典型的な超音波浴を10分間作
動させた結果温度は10.4℃上昇する。この上昇は
18w／浴の出力に換算される。本発明によれば、
典型的細胞破砕実験では浴に750mlの水を入れる。
この出力密度は0.024w／mlである。この比較に
よれば、このプローブ超音波発信器の出力密度は
洗浄浴の300倍以上になる。しかし、出願者は、
上述したように、細胞溶液に粒子状ビーズを加え
た場合、このように低出力密度でも細胞破砕が生
じることを発見した。 他の実験において、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）中でmycobacteria懸濁液を調製し、
Petroff−Hausser計数チヤンバを用いて細胞数
を数えた。１％SDSで希釈して７×108個／mlに
調製し、1000psiの圧力のFrench pressure cell
を用いて破砕した。同様の懸濁液の試料１mlを
0.1mlのガラスビーズ（0.1〜0.3mm）を入れたフタ
付きEppendorf管中に加え、洗浄浴（Mettler
Electronics Cavitator ME4.6）を用い室温で10
分間、超音波処理を行つた。プローブ測定法によ
り遊離されたRNA量を測定することにより破砕
の程度を測定した。 試 薬： 試薬１：0.96Mリン酸ナトリウム緩衝液、PH6.8 2.0％SDS 1mM EDTA 1mM EGTA プローブ溶液：3.5ml試薬１ 0.14Mリン酸緩衝液及び0.02％
SDS中の125I標識TBプローブ30μ
でその活性は8000cpm／μ 試薬２：0.14Mリン酸ナトリウム緩衝液、PH6.8 0.02％SDS １ｇハイドロキシアパタイト
（HA）／50ml 試薬３：0.14Mリン酸ナトリウム緩衝液PH6.8 0.02％SDS 方法：試料は100μの破砕された細胞懸濁液及
び100μのプローブ溶液から成る。正の対照
は100μのプローブ溶液及び10μのTB
RNA（0.5μｇ／10μ）及び90μの水から成
る。負の対照は100μのプローブ溶液と100μ
の水から成る。100μのプローブを用いて
総カウント数を測定した。 各時間ごとに個々の試料を調製した。破砕され
た各生物試料は各々15，30及び120分にて測定し
た。試料及び対照は72℃でインキユベートした。
インキユベーシヨン後、総カウント及びHA対照
を除く対照及び試料全てに５mlの試薬２を添加し
試料を撹拌した。 72℃で５分間インキユベーシヨンした後、試験
管を攪拌し、IEC36筒型遠心器を用い1500rpmで
遠心分離した。上澄を静かに除去し、総カウント
試料以外の対照及び試料全てに５mlの試薬３を添
加した。この試料を攪拌し、前述のように遠心分
離した。上澄を静かに除去し、5.5mlのcytoscint
を添加し、攪拌し、シンチレーシヨンカウンター
でこの試験管をカウントした。HA試料のカウン
トはバツクグラウンドと考えられるので各試料及
び総カウントから減じる。試料当りのこの結果の
カウントを総カウント数で割り、100倍して％ハ
イブリダイゼーシヨン（％hyb）を得た。 １組の中で％hybの値が最も高いものを％max
とした。１本鎖の％（％SS）は100（％max−％
hyb）％maxとした。時間ごとのlog（％SS）をプ
ロツトし、％SS＝0.5の時点からt1/2を測定した。
RNA濃度は次式で示される： ［RNA］＝２（0.0023）／0.011／t1/2 式中の0.0023はTBプローブのCotの半分に相当
する。0.011の値はマイクロモルへの光学密度の
変換係数で、係数２は濃度を最初の破砕した溶液
の濃度にするために必要である。 細胞等価物のRNA数は5.5×10-9μｇ／細胞と
測定された。 結果：それぞれガラスビーズと超音波洗浄浴
（Son.）及びFrench Pressure Cell（F.P.）を用い
て与えられた細胞懸濁液から遊離されたRNAの
割合を以下の表で示した。
Coliはグラム陰性桿菌の例である。Bacillus
subtilisはグラム陽性桿菌である。
Staphylococcus aureusはグラム陽性球菌、一方
Mycobacterium nonchromogeniumは抗酸菌で
ある。最後に、パン酵母は細菌以外の生物を代表
している。異なる種類の細胞壁を持つこれらの生
物は全て本発明を用いて容易に破壊される。 本発明方法によれば、不応性細胞であつても、
ビーズが溶液中に存在する限りは低出力密度でも
細胞破砕が生じることが判明している。超音波探
査器を細胞懸濁液の容器内に直接設置し、0.2〜
0.3W／mlの超音波出力密度にした場合、表層へ
の作用及び衝撃波が主に細胞崩壊の原因となると
考えられる（Coakley他、上記文献303ページ参
照）。しかし、出願人は本発明の相対的出力密度
を典型的な高出力密度プローブ超音波発信器と比
較し、本発明の方法においては溶液中にビーズが
存在する限り0.2W／mlより顕著に低密度でも細
胞を破砕できることを発見した。高出力密度プロ
ーブ超音波発信器は200mlの水中で５分間作動さ
せた。8.95℃の温度変化があつた。この変化を
8.95×200又は1790cal／５分の出力又は25Wの出
力に換算した。典型的な実験で、この出力の大部
分が３ml以内のプローブ先端に集中し、その結果
出力密度は約8.3w／mlとなる。これと比べて、
250mlの水を入れた典型的な超音波浴を10分間作
動させた結果温度は10.4℃上昇する。この上昇は
18w／浴の出力に換算される。本発明によれば、
典型的細胞破砕実験では浴に750mlの水を入れる。
この出力密度は0.024w／mlである。この比較に
よれば、このプローブ超音波発信器の出力密度は
洗浄浴の300倍以上になる。しかし、出願者は、
上述したように、細胞溶液に粒子状ビーズを加え
た場合、このように低出力密度でも細胞破砕が生
じることを発見した。 他の実験において、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）中でmycobacteria懸濁液を調製し、
Petroff−Hausser計数チヤンバを用いて細胞数
を数えた。１％SDSで希釈して７×108個／mlに
調製し、1000psiの圧力のFrench pressure cell
を用いて破砕した。同様の懸濁液の試料１mlを
0.1mlのガラスビーズ（0.1〜0.3mm）を入れたフタ
付きEppendorf管中に加え、洗浄浴（Mettler
Electronics Cavitator ME4.6）を用い室温で10
分間、超音波処理を行つた。プローブ測定法によ
り遊離されたRNA量を測定することにより破砕
の程度を測定した。 試 薬： 試薬１：0.96Mリン酸ナトリウム緩衝液、PH6.8 2.0％SDS 1mM EDTA 1mM EGTA プローブ溶液：3.5ml試薬１ 0.14Mリン酸緩衝液及び0.02％
SDS中の125I標識TBプローブ30μ
でその活性は8000cpm／μ 試薬２：0.14Mリン酸ナトリウム緩衝液、PH6.8 0.02％SDS １ｇハイドロキシアパタイト
（HA）／50ml 試薬３：0.14Mリン酸ナトリウム緩衝液PH6.8 0.02％SDS 方法：試料は100μの破砕された細胞懸濁液及
び100μのプローブ溶液から成る。正の対照
は100μのプローブ溶液及び10μのTB
RNA（0.5μｇ／10μ）及び90μの水から成
る。負の対照は100μのプローブ溶液と100μ
の水から成る。100μのプローブを用いて
総カウント数を測定した。 各時間ごとに個々の試料を調製した。破砕され
た各生物試料は各々15，30及び120分にて測定し
た。試料及び対照は72℃でインキユベートした。
インキユベーシヨン後、総カウント及びHA対照
を除く対照及び試料全てに５mlの試薬２を添加し
試料を撹拌した。 72℃で５分間インキユベーシヨンした後、試験
管を攪拌し、IEC36筒型遠心器を用い1500rpmで
遠心分離した。上澄を静かに除去し、総カウント
試料以外の対照及び試料全てに５mlの試薬３を添
加した。この試料を攪拌し、前述のように遠心分
離した。上澄を静かに除去し、5.5mlのcytoscint
を添加し、攪拌し、シンチレーシヨンカウンター
でこの試験管をカウントした。HA試料のカウン
トはバツクグラウンドと考えられるので各試料及
び総カウントから減じる。試料当りのこの結果の
カウントを総カウント数で割り、100倍して％ハ
イブリダイゼーシヨン（％hyb）を得た。 １組の中で％hybの値が最も高いものを％max
とした。１本鎖の％（％SS）は100（％max−％
hyb）％maxとした。時間ごとのlog（％SS）をプ
ロツトし、％SS＝0.5の時点からt1/2を測定した。
RNA濃度は次式で示される： ［RNA］＝２（0.0023）／0.011／t1/2 式中の0.0023はTBプローブのCotの半分に相当
する。0.011の値はマイクロモルへの光学密度の
変換係数で、係数２は濃度を最初の破砕した溶液
の濃度にするために必要である。 細胞等価物のRNA数は5.5×10-9μｇ／細胞と
測定された。 結果：それぞれガラスビーズと超音波洗浄浴
（Son.）及びFrench Pressure Cell（F.P.）を用い
て与えられた細胞懸濁液から遊離されたRNAの
割合を以下の表で示した。
【表】
【表】
この例では、これら26株のマイコバクテリアは
全て上述した超音波破砕法を用いて破砕されるこ
とが示されている。 本発明の方法はM. tuberculosisより不応性で
ない多数の他の生物において細胞を破砕するため
にも利用される。遺伝プローブによる標準的ハイ
ブリダイゼーシヨン法により細胞の破砕が証明さ
れた。高いハイブリダイゼーシヨン値の結果を得
たことは完全な細胞破砕及び完全なRNAの利用
の可能性を示している。 細胞破砕のための至適条件を決定するために実
験を行つた。細胞破砕の程度を規定する比較的重
要な３つの変数を決定するために８組の実験を行
つた。これらの３つの変数は： (1) 浴内の水に存在する気体の量； (2) 浴内の水の温度；及び (3) 試験管中に加えるビーズの量 である。 以下のコーテイングを用いて２段階階乗子計画
（two−level factorial design）を行つた
（Dupont−“Strategy of Experimentation”，
Rev.Ed.p.20ff，Wilmington，Delaware、1975
年10月）。脱 気 温 度 ビーズ量 ＋＝脱気 ＋＝70℃ ＋＝0.5ml −＝非脱気 −＝30℃ −＝0.1ml 以下のどの実験のコーテイングも第１に脱気条
件、第２に浴内温度及び第３にビーズ量という一
連の３つの記号により計画されている。 測定のプロトコールは以下の通りである。 ７×108細胞／mlのMycobacterium
nonchromog enicumの細胞懸濁液１mlを測定し
た量のガラスビーズを含むEppendorf管に加え
る。本発明の方法に従い、この管を浴内で10分間
超音波処理を行う。対照を調製し、超音波処理を
せずに同様な方法で処理した。試料及び対照を遠
心分離し、破砕されていない細胞を沈渣で除去
し、細胞物質の遊離を上述した255nmの紫外線吸
収法（A255ハイブリダイゼーシヨン）により測定
した。 脱気方法は超音波浴に沸騰した湯を満たし温度
が90℃に低下した時点で15分間超音波処理して行
なう。実験の結果を表に示した。
全て上述した超音波破砕法を用いて破砕されるこ
とが示されている。 本発明の方法はM. tuberculosisより不応性で
ない多数の他の生物において細胞を破砕するため
にも利用される。遺伝プローブによる標準的ハイ
ブリダイゼーシヨン法により細胞の破砕が証明さ
れた。高いハイブリダイゼーシヨン値の結果を得
たことは完全な細胞破砕及び完全なRNAの利用
の可能性を示している。 細胞破砕のための至適条件を決定するために実
験を行つた。細胞破砕の程度を規定する比較的重
要な３つの変数を決定するために８組の実験を行
つた。これらの３つの変数は： (1) 浴内の水に存在する気体の量； (2) 浴内の水の温度；及び (3) 試験管中に加えるビーズの量 である。 以下のコーテイングを用いて２段階階乗子計画
（two−level factorial design）を行つた
（Dupont−“Strategy of Experimentation”，
Rev.Ed.p.20ff，Wilmington，Delaware、1975
年10月）。脱 気 温 度 ビーズ量 ＋＝脱気 ＋＝70℃ ＋＝0.5ml −＝非脱気 −＝30℃ −＝0.1ml 以下のどの実験のコーテイングも第１に脱気条
件、第２に浴内温度及び第３にビーズ量という一
連の３つの記号により計画されている。 測定のプロトコールは以下の通りである。 ７×108細胞／mlのMycobacterium
nonchromog enicumの細胞懸濁液１mlを測定し
た量のガラスビーズを含むEppendorf管に加え
る。本発明の方法に従い、この管を浴内で10分間
超音波処理を行う。対照を調製し、超音波処理を
せずに同様な方法で処理した。試料及び対照を遠
心分離し、破砕されていない細胞を沈渣で除去
し、細胞物質の遊離を上述した255nmの紫外線吸
収法（A255ハイブリダイゼーシヨン）により測定
した。 脱気方法は超音波浴に沸騰した湯を満たし温度
が90℃に低下した時点で15分間超音波処理して行
なう。実験の結果を表に示した。
【表】
算出された因子効果は：
(1) 脱 気 0.065
(2) 温 度 0.082
(3) ビーズ量 0.049
最小有効因子（minimum significant factor）
は最小限0.024と算出された。このように扱つた
全ての因子は細胞破砕に重要である。浴の水温の
高温での維持、脱気水浴の使用及び管の中のビー
ズ量の増加により好適な細胞破砕条件が得られ
る。 本発明に使用されるビーズは異なつた形や大き
さの様々な物質から成り、市販のビーズの多くは
一般に球状又は球形であるが、多くのビーズは不
規則な形であり、それでも有効である。市販のビ
ーズには例えばAmberlite，Dowex，
Impandex，Potters等がある。しかし、本発明で
は他の種類のガラスビーズ、プラスチツク、水
晶、金属、金属酸化物、ラテツクス及び砂やケイ
酸塩のような顆粒又は粒状物質も使用できる。故
に、本発明の方法の概念及び重要な特性に相反す
ることがなければビーズ、又はそれと等価の顆粒
又は粒状物質を用いることができる。 Mycobacterium nonchromogenicumを異なる
種類の物質から成るビーズを用いた前述の方法に
より超音波で処理した。超音波処理後、異なる種
類のビーズによる破砕率を測定するために上述し
たA255測定のプロトコールを用いた。その結果を
以下の表に示した。 表 ビーズの種類 A255アツセイ ガラス 0.423 Amberlite 0.101 Dowex50 0.287 砂 0.180 さらに、破砕率に及ぼすビーズの大きさの及び
組成の影響を決定するために、前述の条件下で大
きさや種類が異なるガラスビーズを
Mycobacterium nonchromogenicumと共に超音
波処理を行つた。結果は標準としてImpandexビ
ーズを用いた破砕分画により標準化した。前述し
たA255測定法を用いた。その結果を以下の表で
示した。
は最小限0.024と算出された。このように扱つた
全ての因子は細胞破砕に重要である。浴の水温の
高温での維持、脱気水浴の使用及び管の中のビー
ズ量の増加により好適な細胞破砕条件が得られ
る。 本発明に使用されるビーズは異なつた形や大き
さの様々な物質から成り、市販のビーズの多くは
一般に球状又は球形であるが、多くのビーズは不
規則な形であり、それでも有効である。市販のビ
ーズには例えばAmberlite，Dowex，
Impandex，Potters等がある。しかし、本発明で
は他の種類のガラスビーズ、プラスチツク、水
晶、金属、金属酸化物、ラテツクス及び砂やケイ
酸塩のような顆粒又は粒状物質も使用できる。故
に、本発明の方法の概念及び重要な特性に相反す
ることがなければビーズ、又はそれと等価の顆粒
又は粒状物質を用いることができる。 Mycobacterium nonchromogenicumを異なる
種類の物質から成るビーズを用いた前述の方法に
より超音波で処理した。超音波処理後、異なる種
類のビーズによる破砕率を測定するために上述し
たA255測定のプロトコールを用いた。その結果を
以下の表に示した。 表 ビーズの種類 A255アツセイ ガラス 0.423 Amberlite 0.101 Dowex50 0.287 砂 0.180 さらに、破砕率に及ぼすビーズの大きさの及び
組成の影響を決定するために、前述の条件下で大
きさや種類が異なるガラスビーズを
Mycobacterium nonchromogenicumと共に超音
波処理を行つた。結果は標準としてImpandexビ
ーズを用いた破砕分画により標準化した。前述し
たA255測定法を用いた。その結果を以下の表で
示した。
【表】
表のデータからわかるように、本発明の方法
では様々な種類のガラスビーズが有利に用いられ
る。さらに、ビーズの大きさも細胞破砕の程度に
影響を及ぼすと考えられる。実験から、直径約
0.05mmから約1.0mmのビーズが効果的に細胞破砕
を行うことが示されている。しかし、本発明の方
法は様々な種類や大きさのビーズに適用され、こ
の範囲が限度とは考えられない。その上に、接頭
辞Ｈと呼ばれている高密度チタン酸バリウムガラ
スは他のより低密度のガラスと同様には作用しな
いようである。 一度細胞が破砕され、その内容物が溶液中に流
出すると、その遺伝物質は遺伝プローブとのハイ
ブリダイゼーシヨンが可能である。その遺伝子プ
ローブはその生物を同定、検出又は定量するため
に生物の核酸配列と相補的な核酸配列から成る。
ハイブリダイゼーシヨン反応法は特許出願中の２
つの明細書“METHOD FOR DETECTION，
IDENTIFICATION AND QUANTITATION
OF NON−VIRAL ORGANISMS”出願番号
456729，1983年１月10日出願及び“METHOD
FOR DETECTING，IDENTIFYING AND
QUANTITATING ORGANISMS AND
VIRUSES”出願番号655365、1984年９月４日出
願に記載されている。これらの開示内容は参考と
して本明細書中に編入されている。 細胞から遊離された遺伝物質とそれと相補的な
核酸配列を持つ遺伝プローブとのハイブリダイゼ
ーシヨンを促進させるために、細胞及びビーズを
入れる容器内にハイブリダイゼーシヨン促進のた
めの至適反応条件を与えるために様々な添加物も
含有させることができる。それらの添加物には、
緩衝液、キレート化剤、有機化合物及び洗剤、ジ
ヒドロキシベンゼン、ドデシル硫酸ナトリウム、
ジイソブチルスルホサクシネートナトリウム、テ
トラデシル硫酸ナトリウム、並びにSO4 -2、
PO4 -3、Cl-1及びHCOO-1のサルコシル、アルカ
リ金属及びアンモニウム塩等の核酸沈澱剤等があ
る。これらの添加物はハイブリダイゼーシヨン反
応が起るための至適条件を与えるために当業者に
よつて利用される。一本鎖核酸分子から二本鎖核
酸分子へのハイブリダイゼーシヨンを促進させる
条件については出願中の２つの米国特許
“ACCELERATED NUCLEIC ACID
REASSOCIATION METHOD”出願番号
627795、1984年７月５日出願及びその一部継続出
願である“ACCELERATED NUCLEIC ACID
REASSOCIATION METHOD”1986年１月６
日出願の明細書に開示されている。 本発明の方法は精製された試料又は唾液、糞
便、組織、血液、脊髄液、滑液、血清、尿若しく
は他の体液等の未精製臨床試料又は環境、食物試
料中の細胞あるいは微生物に対して行うことがで
きる。 本発明の方法では、細胞又は微生物に超音波エ
ネルギーを作用させる前に細胞又は微生物を溶液
中に懸濁ないし載置させることができる。処理の
前に細胞をさらに遠心分離するか又はのり状にす
ることもできる。上述した未精製試料の場合、細
胞又は微生物は超音波エネルギーを作用させる前
は処理されることなく完全なままそれら自身の生
物学的環境中で存在している。これらの試料を病
原微生物を保持している疑いのある患者からち直
接採取し、直ちにビーズの入つた適当な容器に採
取する。微生物の混入があると考えられる水試料
のような環境的試料又は食物試料にも又、本発明
の適用が可能である。本発明によればその容器に
ふたをして、超音波処理を行うことができる。明
快にするために、溶液及び懸濁液という用語は使
用上、相互変換可能である。 出願人の発見の結果、小型ビーズを入れた閉鎖
又は開放容器内の未精製な生物学的あるいは臨床
的試料中に存在する細胞又は微生物を、例えば低
出力超音波浴で超音波処理し、溶解又は破砕し
て、その結果溶液中にRNA及びDNAを得ること
ができる。本発明の方法ではそのような低出力密
度であるため、RNA及びDNAは大きな損傷を受
けず相補的な遺伝プローブと結合する能力を保持
する。次に、この微生物の核酸を用いて同一の容
器中で遺伝プローブとのハイブリダイゼーシヨン
が促進される。従つて、臨床的、環境的、食物又
は生物学的試料中の細胞を破砕し、RNA及び
DNAの遊離を促進させ、溶液中で遺伝プローブ
と前述の核酸をハイブリダイゼーシヨンさせる、
閉鎖された、試料中の一段階法として迅速かつ効
率の良いシステムが開示される。この本発明方法
により、唾液、糞便、組織、血液、滑液又は脊髄
液、血清、尿等の未精製の臨床試料及び他の未精
製の生物学的試料中から、例えばmycobacteria
のような微生物を迅速に検出、同定及び定量する
ことができる。簡単、容易、便利及び迅速なこの
ようなシステムは一般に行われている複雑な多段
式診断法と比べて明らかな利点を有する。その
上、この方法は適切な抗体との反応のために細胞
から抗原を遊離させる際にも利用できる。 本文中に述べた具体例は本発明の原理を説明す
るもので、本発明の範囲内で他の変更をおこなう
ことができるものである。それ故に、この発明は
添付した特許請求の範囲のみに従つて限定される
ものである。
では様々な種類のガラスビーズが有利に用いられ
る。さらに、ビーズの大きさも細胞破砕の程度に
影響を及ぼすと考えられる。実験から、直径約
0.05mmから約1.0mmのビーズが効果的に細胞破砕
を行うことが示されている。しかし、本発明の方
法は様々な種類や大きさのビーズに適用され、こ
の範囲が限度とは考えられない。その上に、接頭
辞Ｈと呼ばれている高密度チタン酸バリウムガラ
スは他のより低密度のガラスと同様には作用しな
いようである。 一度細胞が破砕され、その内容物が溶液中に流
出すると、その遺伝物質は遺伝プローブとのハイ
ブリダイゼーシヨンが可能である。その遺伝子プ
ローブはその生物を同定、検出又は定量するため
に生物の核酸配列と相補的な核酸配列から成る。
ハイブリダイゼーシヨン反応法は特許出願中の２
つの明細書“METHOD FOR DETECTION，
IDENTIFICATION AND QUANTITATION
OF NON−VIRAL ORGANISMS”出願番号
456729，1983年１月10日出願及び“METHOD
FOR DETECTING，IDENTIFYING AND
QUANTITATING ORGANISMS AND
VIRUSES”出願番号655365、1984年９月４日出
願に記載されている。これらの開示内容は参考と
して本明細書中に編入されている。 細胞から遊離された遺伝物質とそれと相補的な
核酸配列を持つ遺伝プローブとのハイブリダイゼ
ーシヨンを促進させるために、細胞及びビーズを
入れる容器内にハイブリダイゼーシヨン促進のた
めの至適反応条件を与えるために様々な添加物も
含有させることができる。それらの添加物には、
緩衝液、キレート化剤、有機化合物及び洗剤、ジ
ヒドロキシベンゼン、ドデシル硫酸ナトリウム、
ジイソブチルスルホサクシネートナトリウム、テ
トラデシル硫酸ナトリウム、並びにSO4 -2、
PO4 -3、Cl-1及びHCOO-1のサルコシル、アルカ
リ金属及びアンモニウム塩等の核酸沈澱剤等があ
る。これらの添加物はハイブリダイゼーシヨン反
応が起るための至適条件を与えるために当業者に
よつて利用される。一本鎖核酸分子から二本鎖核
酸分子へのハイブリダイゼーシヨンを促進させる
条件については出願中の２つの米国特許
“ACCELERATED NUCLEIC ACID
REASSOCIATION METHOD”出願番号
627795、1984年７月５日出願及びその一部継続出
願である“ACCELERATED NUCLEIC ACID
REASSOCIATION METHOD”1986年１月６
日出願の明細書に開示されている。 本発明の方法は精製された試料又は唾液、糞
便、組織、血液、脊髄液、滑液、血清、尿若しく
は他の体液等の未精製臨床試料又は環境、食物試
料中の細胞あるいは微生物に対して行うことがで
きる。 本発明の方法では、細胞又は微生物に超音波エ
ネルギーを作用させる前に細胞又は微生物を溶液
中に懸濁ないし載置させることができる。処理の
前に細胞をさらに遠心分離するか又はのり状にす
ることもできる。上述した未精製試料の場合、細
胞又は微生物は超音波エネルギーを作用させる前
は処理されることなく完全なままそれら自身の生
物学的環境中で存在している。これらの試料を病
原微生物を保持している疑いのある患者からち直
接採取し、直ちにビーズの入つた適当な容器に採
取する。微生物の混入があると考えられる水試料
のような環境的試料又は食物試料にも又、本発明
の適用が可能である。本発明によればその容器に
ふたをして、超音波処理を行うことができる。明
快にするために、溶液及び懸濁液という用語は使
用上、相互変換可能である。 出願人の発見の結果、小型ビーズを入れた閉鎖
又は開放容器内の未精製な生物学的あるいは臨床
的試料中に存在する細胞又は微生物を、例えば低
出力超音波浴で超音波処理し、溶解又は破砕し
て、その結果溶液中にRNA及びDNAを得ること
ができる。本発明の方法ではそのような低出力密
度であるため、RNA及びDNAは大きな損傷を受
けず相補的な遺伝プローブと結合する能力を保持
する。次に、この微生物の核酸を用いて同一の容
器中で遺伝プローブとのハイブリダイゼーシヨン
が促進される。従つて、臨床的、環境的、食物又
は生物学的試料中の細胞を破砕し、RNA及び
DNAの遊離を促進させ、溶液中で遺伝プローブ
と前述の核酸をハイブリダイゼーシヨンさせる、
閉鎖された、試料中の一段階法として迅速かつ効
率の良いシステムが開示される。この本発明方法
により、唾液、糞便、組織、血液、滑液又は脊髄
液、血清、尿等の未精製の臨床試料及び他の未精
製の生物学的試料中から、例えばmycobacteria
のような微生物を迅速に検出、同定及び定量する
ことができる。簡単、容易、便利及び迅速なこの
ようなシステムは一般に行われている複雑な多段
式診断法と比べて明らかな利点を有する。その
上、この方法は適切な抗体との反応のために細胞
から抗原を遊離させる際にも利用できる。 本文中に述べた具体例は本発明の原理を説明す
るもので、本発明の範囲内で他の変更をおこなう
ことができるものである。それ故に、この発明は
添付した特許請求の範囲のみに従つて限定される
ものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 検出すべき微生物を含有していると思われる
試料を入手し、直径が0.05〜1.0mmの範囲にある
ビーズを含有する適当な容器内に該試料を収容
し、該微生物のRNA及びDNAを溶液中に遊離さ
せるために充分な時間、出力密度が0.2W／mlを
越えない超音波を該容器に作用させて該微生物を
破砕した後、検出すべき微生物のRNA及びDNA
の核酸配列と相補的な核酸配列を有する遺伝プロ
ーブを添加し、該遺伝プローブと該RNA及び
DNAとのハイブリダイゼーシヨンを行い、該ハ
イブリダイゼーシヨン度を測定することを特徴と
する未精製試料中に存在する該微生物の検出方
法。 ２ 前記ビーズの直径が0.1mm〜0.5mmの範囲にあ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 ３ 前記微生物が不応性であることを特徴とする
特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４ 前記微生物がMycobacterium属に属する微
生物であることを特徴とする特許請求の範囲第１
項又は第２項に記載の方法。 ５ 超音波浴を用いて前記超音波を該容器に作用
させる特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の
方法。 ６ 前記超音波浴に入れる液体をあらかじめ脱気
させた後に超音波を作用させることを特徴とする
特許請求の範囲第５項に記載の方法。
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