JP2004194583A - リボゾームｒｎａを標的とした抗酸菌の検出法 - Google Patents
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Abstract
【課題】特定の抗酸菌群を検出する高感度な遺伝子検査法を提供すること、および、そのような高感度な遺伝子検査法を実施するのに好適なオリゴヌクレオチドを提供すること。
【解決手段】特定の抗酸菌群のｒＲＮＡに特異的な領域の塩基配列と相同的あるいは相補的な配列を有するプライマーを用いることにより、特定の抗酸菌群のｒＲＮＡのみを特異的に増幅させて検出する方法と、結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合するオリゴヌクレオチド、特定の非結核性抗酸菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合するオリゴヌクレオチドとによって、前記課題を解決する。
【選択図】 図３
【解決手段】特定の抗酸菌群のｒＲＮＡに特異的な領域の塩基配列と相同的あるいは相補的な配列を有するプライマーを用いることにより、特定の抗酸菌群のｒＲＮＡのみを特異的に増幅させて検出する方法と、結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合するオリゴヌクレオチド、特定の非結核性抗酸菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合するオリゴヌクレオチドとによって、前記課題を解決する。
【選択図】 図３
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の抗酸菌由来リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の検出法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ｒＲＮＡは、リボゾーム粒子を構成するＲＮＡで、細菌および高等生物に共通に存在する。細菌は３種類のｒＲＮＡ（２３Ｓ ｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ、５Ｓ ｒＲＮＡ）をもつが、このうち特に１６Ｓ ｒＲＮＡは細菌の分類の標的となっており、多数の菌でその配列が決定され、データベース化されている。これらの配列のデータを基礎として、１６Ｓ ｒＲＮＡを標的とした検査キットが多数開発されている。
【０００３】
例えば、結核菌群、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍあるいはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅのような特定の抗酸菌群を検出することを目的とした遺伝子検査においては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子あるいは１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の中で、標的とする抗酸菌群に特異的な、すなわち他の抗酸菌群とは異なる部分をＤＮＡプローブとして用いる方法が報告され（例えば特許文献１、特許文献２参照）、検査キットが市販されている。なおこれらのキットでは、遺伝子増幅に利用するプライマーは、抗酸菌群に共通な部分に結合する。
【０００４】
【特許文献１】特許３１１６３５３号公報
【特許文献２】特許２６７５７２３号公報
【発明が解決しようとする課題】
結核菌群、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉのような特定の抗酸菌群を検出することを目的とした遺伝子検査では、分離培養法より通常感度が低いことが知られており、さらなる高感度化が望まれている。しかし、１６Ｓ ｒＲＮＡ上で特定の抗酸菌群に特異的な領域は限られており、プローブ配列の選択には制限がかかるため、高感度化は達成されていない。
【０００５】
そこで、本発明は、特定の抗酸菌群を検出する高感度な遺伝子検査法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、１６Ｓ ｒＲＮＡを標的とした検出法を構築するにあたり、鋭意研究をかさね、はじめに抗酸菌群に共通な領域に結合するプライマーを使用した場合、標的以外の抗酸菌群をも増幅するため、競争的な増幅反応により感度が低下することを明らかにした。さらに、本発明者らは抗酸菌群に特異的に結合するプライマーを用いることにより標的となる抗酸菌群のみを増幅させ、抗酸菌群に共通な領域に結合するプローブでも特異的に検出可能であることを示した。
【０００７】
本願請求項１の発明は、特定の抗酸菌群を検出する方法として、特定の抗酸菌群のｒＲＮＡに特異的な領域の塩基配列と相同的あるいは相補的な配列を有するプライマーを用いることにより、特定の抗酸菌群のｒＲＮＡのみを特異的に増幅させて検出する方法である。
【０００８】
本願請求項２の発明は、結核菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１と２に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
本願請求項３の発明は、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号３と４に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチドである。
【００１０】
本願請求項４の発明は、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号５と６に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチドである。
【００１１】
本願請求項５の発明は、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号７と８に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチドである。
【００１２】
本願請求項６の発明は、試料中に存在する特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程を利用した検出法において、増幅される特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、増幅される特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方は、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有するプライマーである）を用いることを特徴とする特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅工程である。
【００１３】
本願請求項７の発明は、請求項６の発明に係わり、特定の抗酸菌群が結核菌で、第一のプライマーが配列番号１に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号２に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程である。
【００１４】
本願請求項８の発明は、請求項６の発明に係わり、特定の抗酸菌群がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍで、第一のプライマーが配列番号３に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号４に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程である。
【００１５】
本願請求項９の発明は、請求項６の発明に係わり、特定の抗酸菌群がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅで、第一のプライマーが配列番号５に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号６に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程である。
【００１６】
本願請求項１０の発明は、請求項６の発明に係わり、特定の抗酸菌群がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉで、第一のプライマーが配列番号７に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号８に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程である。
【００１７】
本願請求項１１の発明は、請求項６から１０の発明に係わり、増幅により生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、かつインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することからなる増幅工程（ただし該標識されたオリゴヌクレオチドは、前記第一および第二のプライマーとは異なる配列である）である。
【００１８】
本願請求項１２の発明は、請求項１１の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものであることを特徴とする検出方法である。そして、本願請求項１３の発明は、前記請求項１２の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号９に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる、またはその相補配列であることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明は５Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡのいずれに対しても適応されるが、塩基配列が報告されている抗酸菌種が最も多いという点で、１６Ｓ ｒＲＮＡを用いるのが好ましい。
【００２０】
１６Ｓ ｒＲＮＡで特定の抗酸菌群に特異的な領域は、塩基配列を遺伝子データバンク等から入手し、これを詳細に検討することによっても決定できるが、本願発明者らの知見によれば、好ましくは結核菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号 Ｚ８３８６２）のうち、塩基番号７０から２００で示される領域、さらにより好ましくは配列番号１、３、５、７に相当する塩基番号７０から９２で示される領域、および２、４、６、８に相当する塩基番号１８３から２００で示される領域である（ここで塩基番号は、Ｚ８３８６２の配列中、結核菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡの開始位置を１としている）。
【００２１】
本発明の増幅行程は、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法（例えば特開２０００−１４４００号公報参照）を含むが、中でも逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用によって（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させ）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法等の一定温度核酸増幅法が好ましい。ここで温度については特に制限はないが３５から５０℃が好ましい。
【００２２】
上記増幅行程では、特定の抗酸菌群１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の中で特定配列とする領域の５’末端領域と重複（１から１０塩基）して隣接する領域に対し相補的なオリゴヌクレオチドを添加し、前記１６Ｓ ｒＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素による）して核酸増幅初期の鋳型とすることにより、特定配列が５’末端に位置していない１６Ｓ ｒＲＮＡをも増幅することができる。この切断のためには、たとえば、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを使用することができる。なお、前記切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反応をおさえるために３’末端水酸基が化学的に修飾（たとえばアミノ化）されたものであることが望ましい。
【００２３】
以上の核酸増幅方法で得られた増幅産物は既知の核酸検出方法で検出することができるが、好適な態様では前記核酸増幅をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することが望ましい。該オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたもので、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成するとインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としないことを特徴とする（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７参照）。
【００２４】
該オリゴヌクレオチドが結合する配列は、特定の抗酸菌群に特異的な配列、および抗酸菌群で共通の配列のいずれであってもよく、特に限定はないが、配列番号９に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基からなる配列、あるいはその相補配列であることが望ましい。また、該オリゴヌクレオチドをプライマーとした伸長反応を抑えるために該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基は化学的に修飾（たとえばグリコール酸付加）することが望ましい。
【００２５】
これにより、特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡ中の特定配列と同じ配列からなるＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段階で増幅し、検出することが可能となり、自動化への適用も容易となる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本願発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例 １
図１に示す組み合わせ（ａ）および（ｂ）が、結核菌に特異的であるか確認した。
（１）以下に示す各菌種のコロニーをグアジニンイソチアネートが入った注射用蒸留水に懸濁させ、ガラスビーズ（１５０から２１２μｍ、シグマ製）存在下で５分間攪拌させた。次に、本菌体液をＥｘｔｒａｇｅｎ（東ソー製）により核酸抽出し、これを抗酸菌の核酸抽出物とした。
【００２７】
評価実検体一覧
Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ ９２７）
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＡＴＣＣ １２４７８）
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＡＴＣＣ １３９５０）
Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ（ＡＴＣＣ １４４７０）
Ｍ．ｇａｓｔｒｉ（ＡＴＣＣ １５７５４）
Ｍ．ｔｅｒｒａｅ（ＡＴＣＣ １５７５５）
Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ（ＡＴＣＣ １９２５０）
Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ（ＡＴＣＣ １９４２２）
Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ １９５３０）
Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ（ＡＴＣＣ １９９８１）
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ（ＡＴＣＣ ２５４２０）
Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ（ＡＴＣＣ ３５７９９）
Ｍ．ａｖｉｕｍ（臨床分離株）
結核菌（臨床分離株）
（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、商品名、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記核酸抽出物５μＬを添加した。なお、第１・第２・第３オリゴヌクレオチドおよびインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドの組み合わせが表１に示す組み合わせになるよう溶液を調製した。
【００２８】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド
１．０μＭの第２オリゴヌクレオチド
１．０μＭの第３オリゴヌクレオチド
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００２９】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μＬにおける濃度）
２．０％ ソルビトール
３．６μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ（株）製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
（５）各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を表２に示した。また、電気泳動結果の写真（白黒反転）を図２に示した。立ち上がり時間での判定の結果、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドで識別する組み合わせ（ａ）では、結核菌群の抗酸菌（結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を、本願発明のオリゴヌクレオチドを使用した組み合わせ（ｂ）では結核菌群の抗酸菌（結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）およびＭ．ｍａｒｉｎｕｍを特異的に検出していることが示された。
（６）反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するためアガロースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。電気泳動後の染色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（タカラバイオ（株）製）により行なった。電気泳動の結果、組み合わせ（ａ）の時は全ての核酸抽出物について特異的な増幅産物が見られた。一方、組み合わせ（ｂ）の時は結核菌群の抗酸菌（結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）は明瞭な増幅バンドが見られ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍにはわずかな増幅バンドがみられた。
【００３０】
【表１】
表１は実施例１および２で用いた第１・第２・第３オリゴヌクレオチドおよびインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドの組み合わせ、およびその組み合わせを用いて増幅される特定バンドの鎖長を示す。各オリゴヌクレオチドの組み合わせでの、結核菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡにおけるオリゴヌクレオチドの位置および増幅領域は図１に示している。第１オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、３’末端の水酸基はアミノ化されている。第２オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、５’末端側第１番目の「Ａ」から第２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモーター領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から第２８番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。インターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドのうち、ＹＯ−ＭＴ １６Ｓ−Ｓ−Ｇ（配列番号１５）は５’末端から１６番目の「Ｃ」と１７番目の「Ｃ」との間のリンに、ＹＯ−ＭＹＲ−Ｓ−Ｇ（配列番号９）は５’末端から７塩基目の「Ａ」と８塩基目の「Ｇ」との間のリンにそれぞれインターカレーター性色素が標識されており、また３’末端側の水酸基はグリコール基で修飾されている。
【００３１】
第１オリゴヌクレオチド
ＭＴＲ−１Ｓ（配列番号１１、塩基番号１３５から１５８）
ＭＹＲ−１Ｓ−１０（配列番号１０、塩基番号５２から７５）
第２オリゴヌクレオチド
ＭＴＲ−１Ｆ（配列番号１２、塩基番号１５３から１７５）
ＭＹＲ−１Ｆ−１０（配列番号１３、塩基番号７０から９２）
第３オリゴヌクレオチド
ＭＴＲ−７Ｒ（配列番号１４、塩基番号４４４から４６３）
ＭＹＲ−３ＲＴ１８（配列番号２、塩基番号１８３から２００）
インターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチド
ＹＯ−ＭＴ １６Ｓ―Ｓ−Ｇ（配列番号１５、塩基番号１８３から２０２）
ＹＯ−ＭＹＲ−Ｓ−Ｇ（配列番号９、塩基番号１４７から１６６）
【００３２】
【表２】
表２は各オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて抗酸菌の核酸抽出物を測定した結果である。なお、結果は立ち上がり時間にて表記している。表中のＮ．Ｄ．は組み合わせ（ａ）では６０分以内、組み合わせ（ｂ）では２０分以内に立ち上がりの見られなかった（検出されなかった）試料を示す。組み合わせ（ａ）では結核菌群の抗酸菌（結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を、組み合わせ（ｂ）では結核菌群の抗酸菌（結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）およびＭ．ｍａｒｉｎｕｍを検出していた。
【００３３】
実施例 ２
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドで特異性を識別する組み合わせ（ａ）と本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせ（ｂ）を用いて、喀痰中にある結核菌の検出を様々な菌数濃度で行なった。
（１）喀痰中にある結核菌の検出感度測定用検体として結核菌４から４×１０6菌を１ｍＬの陰性喀痰に懸濁させた試料を用いた。また検体中の核酸抽出法としては、本検体をＮＡＬＣ処理後、グアジニンイソチアネートとガラスビーズ（１５０から２１２μｍ、シグマ製）を用いて処理した溶液をＥｘｔｒａｇｅｎ（東ソー（株）製）を用いて抽出した。
（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。なお、第１・第２・第３オリゴヌクレオチドおよびインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドの組み合わせが表１に示す組み合わせになるよう溶液を調製した。
【００３４】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１２０ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製）
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド
１．０μＭの第２オリゴヌクレオチド
１．０μＭの第３オリゴヌクレオチド
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００３５】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μＬにおける濃度）
２．０％ ソルビトール
３．６μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
（５）酵素添加時の時刻を０分として、各検体の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化を図３に示し、各検体の検出結果を表３に示した。これらの結果、本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせ［組み合わせ（ｂ）］での検出感度は４菌／１ｍＬ（喀痰）であり、インターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドで特異性を識別する組み合わせ（ａ）［４×１０3菌／ ｍＬ（喀痰）］よりも高感度であった。また本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせ［組み合わせ（ｂ）］を用いた結果と、市販のキット（アンプリコアマイコバクテリウムツベルクローシス、商品名、ロシュダイアグノスティックス社製）との感度比較を表３に示す。本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた測定試薬の感度は市販キットと比較して高感度であることを確認した。
【００３６】
【表３】
表３は表１に示した各オリゴヌクレオチドの組み合わせ［組み合わせ（ａ）、（ｂ）］および市販キット（アンプリコアマイコバクテリウムツベルクローシス、商品名）を用いて喀痰中の結核菌を測定した結果である。なお、組み合わせ（ａ）と（ｂ）を用いて実験した際の検出の有無は３０分以内に立ち上がりがみられるかで判定した。検出感度は組み合わせ（ａ）で４×１０3菌／１ｍＬ（喀痰）、組み合わせ（ｂ）で４菌／１ｍＬ（喀痰）、市販キットで４×１０2菌／１ｍＬ（喀痰）であった。
【００３７】
実施例 ３
本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせが、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍに特異的であるか確認した。
（１）以下に示す各菌種のコロニーをグアジニンイソチアネートが入った注射用蒸留水に懸濁させ、ガラスビーズ（１５０から２１２μｍ、シグマ製）存在下で５分間攪拌させた。次に、本菌体液をＥｘｔｒａｇｅｎ（東ソー（株）製）により核酸抽出し、これを抗酸菌の核酸抽出物とした。
【００３８】
評価実検体一覧
Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ ９２７）
Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ（ＡＴＣＣ ６８４１）
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＡＴＣＣ １２４７８）
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＡＴＣＣ １３９５０）
Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ １４４６７）
Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ（ＡＴＣＣ １４４７０）
Ｍ．ｇａｓｔｒｉ（ＡＴＣＣ １５７５４）
Ｍ．ｔｅｒｒａｅ（ＡＴＣＣ １５７５５）
Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ（ＡＴＣＣ １９２５０）
Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ（ＡＴＣＣ １９４２２）
Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ １９５３０）
Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ（ＡＴＣＣ １９９７７）
Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ（ＡＴＣＣ １９９８１）
Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ（ＡＴＣＣ ２３２９２）
Ｍ．ｓｉｍｉａｅ（ＡＴＣＣ ２５２７５）
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ（ＡＴＣＣ ２５４２０）
Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ（ＡＴＣＣ ３５７５２）
Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ（ＡＴＣＣ ３５７９９）
Ｍ．ａｖｉｕｍ（臨床分離株）
結核菌（臨床分離株）
（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、商品名、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００３９】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−１０、配列番号１０，３’末端側の水酸基はアミノ化されている。）
１．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１ＦＡ−１０、配列番号１６、５’末端側第１番目の「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモーターの領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。）
１．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＡ１８、配列番号４）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｓ−Ｇ、配列番号９、５’末端から７番目の「Ａ」と８番目の「Ｇ」との間のリンにインターカレーター性色素が標識されている。また、３’末端側の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４０】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
２．０％ ソルビトール
３．６μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ（株）製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
（５）各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を表４に示した。これらの結果、本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせがＭ．ａｖｉｕｍを特異的に検出していることが示された。
【００４１】
【表４】
表４は本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、抗酸菌の核酸抽出物を測定した結果である。なお、結果は立ち上がり時間で表記している。表中のＮ．Ｄ．は２０分以内に立ち上がりの見られなかった（検出されなかった）試料を示す。本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせはＭ．ａｖｉｕｍを特異的に検出していた。
【００４２】
実施例 ４
本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせが、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅに特異的であるか確認した。
（１）以下に示す各菌種のコロニーをグアジニンイソチアネートが入った注射用蒸留水に懸濁させ、ガラスビーズ（１５０から２１２μｍ、シグマ製）存在下で５分間攪拌させた。次に、本菌体液をＥｘｔｒａｇｅｎ（東ソー（株）製）により核酸抽出し、これを抗酸菌の核酸抽出物とした。
【００４３】
評価実検体一覧
Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ ９２７）
Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ（ＡＴＣＣ ６８４１）
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＡＴＣＣ １２４７８）
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＡＴＣＣ １３９５０）
Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ １４４６７）
Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ（ＡＴＣＣ １４４７０）
Ｍ．ｇａｓｔｒｉ（ＡＴＣＣ １５７５４）
Ｍ．ｔｅｒｒａｅ（ＡＴＣＣ １５７５５）
Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ（ＡＴＣＣ １９２５０）
Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ（ＡＴＣＣ １９４２２）
Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ １９５３０）
Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ（ＡＴＣＣ １９９７７）
Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ（ＡＴＣＣ １９９８１）
Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ（ＡＴＣＣ ２３２９２）
Ｍ．ｓｉｍｉａｅ（ＡＴＣＣ ２５２７５）
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ（ＡＴＣＣ ２５４２０）
Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ（ＡＴＣＣ ３５７５２）
Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ（ＡＴＣＣ ３５７９９）
Ｍ．ａｖｉｕｍ（臨床分離株）
結核菌（臨床分離株）
（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４４】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−１０、配列番号１０，３’末端側の水酸基はアミノ化されている。）
１．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１ＦＩ−１０、配列番号１７、５’末端側第１番目の「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモーターの領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。）
１．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＩ１８、配列番号６）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｓ−Ｇ、配列番号９、５’末端から７番目の「Ａ」と８番目の「Ｇ」との間のリンにインターカレーター性色素が標識されている。また、３’末端側の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４５】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
２．０％ ソルビトール
３．６μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
（５）各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を表５に示した。これらの結果、本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせがＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを特異的に検出していることが示された。
【００４６】
【表５】
表５は本願発明の示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、抗酸菌の核酸抽出物を測定した結果である。なお、結果は立ち上がり時間で表記している。表中のＮ．Ｄ．は２０分以内に立ち上がりの見られなかった（検出されなかった）試料を示す。本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせはＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを特異的に検出していた。
【００４７】
実施例 ５
本願発明の示すオリゴヌクレオチドの組み合わせが、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉに特異的であるか確認した。
（１）以下に示す各菌種のコロニーをグアジニンイソチアネートが入った注射用蒸留水に懸濁させ、ガラスビーズ（１５０から２１２μｍ、シグマ製）存在下で５分間攪拌させた。次に、本菌体液をＥｘｔｒａｇｅｎ（東ソー製）により核酸抽出し、これを抗酸菌の核酸抽出物とした。
【００４８】
評価実検体一覧
Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ ９２７）
Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ（ＡＴＣＣ ６８４１）
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＡＴＣＣ １２４７８）
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＡＴＣＣ １３９５０）
Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ １４４６７）
Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ（ＡＴＣＣ １４４７０）
Ｍ．ｇａｓｔｒｉ（ＡＴＣＣ １５７５４）
Ｍ．ｔｅｒｒａｅ（ＡＴＣＣ １５７５５）
Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ（ＡＴＣＣ １９２５０）
Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ（ＡＴＣＣ １９４２２）
Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ １９５３０）
Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ（ＡＴＣＣ １９９７７）
Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ（ＡＴＣＣ １９９８１）
Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ（ＡＴＣＣ ２３２９２）
Ｍ．ｓｉｍｉａｅ（ＡＴＣＣ ２５２７５）
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ（ＡＴＣＣ ２５４２０）
Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ（ＡＴＣＣ ３５７５２）
Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ（ＡＴＣＣ ３５７９９）
Ｍ．ａｖｉｕｍ（臨床分離株）
結核菌（臨床分離株）
（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、商品名、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４９】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−１０、配列番号１０，３’末端側の水酸基はアミノ化されている。）
１．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１ＦＫ−１０、配列番号１８、５’末端側第１番目の「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモーターの領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。）
１．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＫ１８、配列番号８）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｓ−Ｇ、配列番号９、５’末端から７番目の「Ａ」と８番目の「Ｇ」との間のリンにインターカレーター性色素が標識されている。また、３’末端側の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００５０】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
２．０％ ソルビトール
３．６μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ（株）製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
（５）各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を表６に示した。これらの結果、本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせがＭ．ｋａｎｓａｓｉｉとＭ．ｇａｓｔｒｉ（本抗酸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのそれと同一である）を特異的に検出していることが示された。
【００５１】
【表６】
表６は本願発明の示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、抗酸菌の核酸抽出物を測定した結果である。なお、結果は立ち上がり時間で表記している。表中のＮ．Ｄ．は２０分以内に立ち上がりの見られなかった（検出されなかった）試料を示す。本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉとＭ．ｇａｓｔｒｉを特異的に検出していた。
【００５２】
【発明の効果】
以上の説明のように、本願発明の検出法は、特定の抗酸菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡを特異的にかつ高感度に検出するのに有用である。
【００５３】
本願発明のオリゴヌクレオチドは、配列表に記載した塩基配列（１８塩基から２３塩基）の物に限られず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであれば良いのであるが、これらは、標的核酸に対して極めて高い特異性を有している。またこれらオリゴヌクレオチドまたはその少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドは、比較的低温（好ましくは４４℃）条件下でもプライマーまたはプローブとして十分な標的核酸への特異性を確保しており、本願発明のオリゴヌクレオチドを用いることで一定温度（比較的低温）でｒＲＮＡの特異的な増幅、検出を実現できることが明らかである。
【００５４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例１および２で使用した各オリゴヌクレオチドの位置および増幅領域を示している［（Ａ）：組み合わせ（ａ）、（Ｂ）：組み合わせ（ｂ）］。図中の塩基番号は結核菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号 Ｚ８３８６２）のうち１６Ｓ ｒＲＮＡの開始位置を１としている。また両矢印は抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡにおいて結核菌に特異的な領域であることを示す。
【図２】図２は実施例１で行なった各オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、抗酸菌の核酸抽出物実検体試料をＲＮＡ増幅反応させた時の電気泳動写真（白黒反転）である。レーン１が結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ陽性標準（１０４コピー）、レーン２がＭ．ｍａｒｉｎｕｍ、レーン３がＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ、レーン４がＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、レーン５がＭ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、レーン６がＭ．ｇａｓｔｒｉ、レーン７がＭ．ｔｅｒｒａｅ、レーン８がＭ．ｘｅｎｏｐｉ、レーン９がＭ．ｍｉｃｒｏｔｉ、レーン１０がＭ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ、レーン１１がＭ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、レーン１２がＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、レーン１３がＭ．ｓｚｕｌｇａｉ、レーン１４がＭ．ａｖｉｕｍ、レーン１５が結核菌で、レーンＮが陰性コントロール（核酸抽出物の代わりに希釈液のみを用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ ４、ニッポンジーン（株）製）を使用した（レーンＭ）。なお、図中の矢印は各オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたときの特異的増幅バンドを示している。図２（Ａ）［組み合わせ（ａ）］では全ての抗酸菌の核酸抽出物について特定バンドが見られたのに対し、図２（Ｂ）［組み合わせ（ｂ）］では結核菌群の抗酸菌（結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）およびＭ．ｍａｒｉｎｕｍに特定バンドが見られた。
【図３】図３は実施例２で行なった結核菌４から４×１０６菌を１ｍＬの陰性喀痰に分散させた検体について、反応時間と検体中のＲＮＡの生成とともに増大する蛍光強度比のグラフである［（Ａ）：組み合わせ（ａ）、（Ｂ）：組み合わせ（ｂ）］。組み合わせ（ａ）では４×１０３菌／１ｍＬ（喀痰）、組み合わせ（ｂ）では４菌／１ｍＬ（喀痰）までの検体が検出された。
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の抗酸菌由来リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の検出法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ｒＲＮＡは、リボゾーム粒子を構成するＲＮＡで、細菌および高等生物に共通に存在する。細菌は３種類のｒＲＮＡ（２３Ｓ ｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ、５Ｓ ｒＲＮＡ）をもつが、このうち特に１６Ｓ ｒＲＮＡは細菌の分類の標的となっており、多数の菌でその配列が決定され、データベース化されている。これらの配列のデータを基礎として、１６Ｓ ｒＲＮＡを標的とした検査キットが多数開発されている。
【０００３】
例えば、結核菌群、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍあるいはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅのような特定の抗酸菌群を検出することを目的とした遺伝子検査においては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子あるいは１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の中で、標的とする抗酸菌群に特異的な、すなわち他の抗酸菌群とは異なる部分をＤＮＡプローブとして用いる方法が報告され（例えば特許文献１、特許文献２参照）、検査キットが市販されている。なおこれらのキットでは、遺伝子増幅に利用するプライマーは、抗酸菌群に共通な部分に結合する。
【０００４】
【特許文献１】特許３１１６３５３号公報
【特許文献２】特許２６７５７２３号公報
【発明が解決しようとする課題】
結核菌群、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉのような特定の抗酸菌群を検出することを目的とした遺伝子検査では、分離培養法より通常感度が低いことが知られており、さらなる高感度化が望まれている。しかし、１６Ｓ ｒＲＮＡ上で特定の抗酸菌群に特異的な領域は限られており、プローブ配列の選択には制限がかかるため、高感度化は達成されていない。
【０００５】
そこで、本発明は、特定の抗酸菌群を検出する高感度な遺伝子検査法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、１６Ｓ ｒＲＮＡを標的とした検出法を構築するにあたり、鋭意研究をかさね、はじめに抗酸菌群に共通な領域に結合するプライマーを使用した場合、標的以外の抗酸菌群をも増幅するため、競争的な増幅反応により感度が低下することを明らかにした。さらに、本発明者らは抗酸菌群に特異的に結合するプライマーを用いることにより標的となる抗酸菌群のみを増幅させ、抗酸菌群に共通な領域に結合するプローブでも特異的に検出可能であることを示した。
【０００７】
本願請求項１の発明は、特定の抗酸菌群を検出する方法として、特定の抗酸菌群のｒＲＮＡに特異的な領域の塩基配列と相同的あるいは相補的な配列を有するプライマーを用いることにより、特定の抗酸菌群のｒＲＮＡのみを特異的に増幅させて検出する方法である。
【０００８】
本願請求項２の発明は、結核菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１と２に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
本願請求項３の発明は、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号３と４に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチドである。
【００１０】
本願請求項４の発明は、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号５と６に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチドである。
【００１１】
本願請求項５の発明は、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号７と８に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチドである。
【００１２】
本願請求項６の発明は、試料中に存在する特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程を利用した検出法において、増幅される特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、増幅される特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方は、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有するプライマーである）を用いることを特徴とする特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅工程である。
【００１３】
本願請求項７の発明は、請求項６の発明に係わり、特定の抗酸菌群が結核菌で、第一のプライマーが配列番号１に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号２に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程である。
【００１４】
本願請求項８の発明は、請求項６の発明に係わり、特定の抗酸菌群がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍで、第一のプライマーが配列番号３に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号４に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程である。
【００１５】
本願請求項９の発明は、請求項６の発明に係わり、特定の抗酸菌群がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅで、第一のプライマーが配列番号５に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号６に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程である。
【００１６】
本願請求項１０の発明は、請求項６の発明に係わり、特定の抗酸菌群がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉで、第一のプライマーが配列番号７に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号８に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程である。
【００１７】
本願請求項１１の発明は、請求項６から１０の発明に係わり、増幅により生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、かつインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することからなる増幅工程（ただし該標識されたオリゴヌクレオチドは、前記第一および第二のプライマーとは異なる配列である）である。
【００１８】
本願請求項１２の発明は、請求項１１の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものであることを特徴とする検出方法である。そして、本願請求項１３の発明は、前記請求項１２の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号９に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる、またはその相補配列であることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明は５Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡのいずれに対しても適応されるが、塩基配列が報告されている抗酸菌種が最も多いという点で、１６Ｓ ｒＲＮＡを用いるのが好ましい。
【００２０】
１６Ｓ ｒＲＮＡで特定の抗酸菌群に特異的な領域は、塩基配列を遺伝子データバンク等から入手し、これを詳細に検討することによっても決定できるが、本願発明者らの知見によれば、好ましくは結核菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号 Ｚ８３８６２）のうち、塩基番号７０から２００で示される領域、さらにより好ましくは配列番号１、３、５、７に相当する塩基番号７０から９２で示される領域、および２、４、６、８に相当する塩基番号１８３から２００で示される領域である（ここで塩基番号は、Ｚ８３８６２の配列中、結核菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡの開始位置を１としている）。
【００２１】
本発明の増幅行程は、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法（例えば特開２０００−１４４００号公報参照）を含むが、中でも逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用によって（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させ）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法等の一定温度核酸増幅法が好ましい。ここで温度については特に制限はないが３５から５０℃が好ましい。
【００２２】
上記増幅行程では、特定の抗酸菌群１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の中で特定配列とする領域の５’末端領域と重複（１から１０塩基）して隣接する領域に対し相補的なオリゴヌクレオチドを添加し、前記１６Ｓ ｒＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素による）して核酸増幅初期の鋳型とすることにより、特定配列が５’末端に位置していない１６Ｓ ｒＲＮＡをも増幅することができる。この切断のためには、たとえば、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを使用することができる。なお、前記切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反応をおさえるために３’末端水酸基が化学的に修飾（たとえばアミノ化）されたものであることが望ましい。
【００２３】
以上の核酸増幅方法で得られた増幅産物は既知の核酸検出方法で検出することができるが、好適な態様では前記核酸増幅をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することが望ましい。該オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたもので、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成するとインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としないことを特徴とする（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７参照）。
【００２４】
該オリゴヌクレオチドが結合する配列は、特定の抗酸菌群に特異的な配列、および抗酸菌群で共通の配列のいずれであってもよく、特に限定はないが、配列番号９に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基からなる配列、あるいはその相補配列であることが望ましい。また、該オリゴヌクレオチドをプライマーとした伸長反応を抑えるために該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基は化学的に修飾（たとえばグリコール酸付加）することが望ましい。
【００２５】
これにより、特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡ中の特定配列と同じ配列からなるＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段階で増幅し、検出することが可能となり、自動化への適用も容易となる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本願発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例 １
図１に示す組み合わせ（ａ）および（ｂ）が、結核菌に特異的であるか確認した。
（１）以下に示す各菌種のコロニーをグアジニンイソチアネートが入った注射用蒸留水に懸濁させ、ガラスビーズ（１５０から２１２μｍ、シグマ製）存在下で５分間攪拌させた。次に、本菌体液をＥｘｔｒａｇｅｎ（東ソー製）により核酸抽出し、これを抗酸菌の核酸抽出物とした。
【００２７】
評価実検体一覧
Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ ９２７）
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＡＴＣＣ １２４７８）
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＡＴＣＣ １３９５０）
Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ（ＡＴＣＣ １４４７０）
Ｍ．ｇａｓｔｒｉ（ＡＴＣＣ １５７５４）
Ｍ．ｔｅｒｒａｅ（ＡＴＣＣ １５７５５）
Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ（ＡＴＣＣ １９２５０）
Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ（ＡＴＣＣ １９４２２）
Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ １９５３０）
Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ（ＡＴＣＣ １９９８１）
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ（ＡＴＣＣ ２５４２０）
Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ（ＡＴＣＣ ３５７９９）
Ｍ．ａｖｉｕｍ（臨床分離株）
結核菌（臨床分離株）
（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、商品名、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記核酸抽出物５μＬを添加した。なお、第１・第２・第３オリゴヌクレオチドおよびインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドの組み合わせが表１に示す組み合わせになるよう溶液を調製した。
【００２８】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド
１．０μＭの第２オリゴヌクレオチド
１．０μＭの第３オリゴヌクレオチド
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００２９】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μＬにおける濃度）
２．０％ ソルビトール
３．６μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ（株）製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
（５）各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を表２に示した。また、電気泳動結果の写真（白黒反転）を図２に示した。立ち上がり時間での判定の結果、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドで識別する組み合わせ（ａ）では、結核菌群の抗酸菌（結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を、本願発明のオリゴヌクレオチドを使用した組み合わせ（ｂ）では結核菌群の抗酸菌（結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）およびＭ．ｍａｒｉｎｕｍを特異的に検出していることが示された。
（６）反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するためアガロースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。電気泳動後の染色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（タカラバイオ（株）製）により行なった。電気泳動の結果、組み合わせ（ａ）の時は全ての核酸抽出物について特異的な増幅産物が見られた。一方、組み合わせ（ｂ）の時は結核菌群の抗酸菌（結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）は明瞭な増幅バンドが見られ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍにはわずかな増幅バンドがみられた。
【００３０】
【表１】
【００３１】
第１オリゴヌクレオチド
ＭＴＲ−１Ｓ（配列番号１１、塩基番号１３５から１５８）
ＭＹＲ−１Ｓ−１０（配列番号１０、塩基番号５２から７５）
第２オリゴヌクレオチド
ＭＴＲ−１Ｆ（配列番号１２、塩基番号１５３から１７５）
ＭＹＲ−１Ｆ−１０（配列番号１３、塩基番号７０から９２）
第３オリゴヌクレオチド
ＭＴＲ−７Ｒ（配列番号１４、塩基番号４４４から４６３）
ＭＹＲ−３ＲＴ１８（配列番号２、塩基番号１８３から２００）
インターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチド
ＹＯ−ＭＴ １６Ｓ―Ｓ−Ｇ（配列番号１５、塩基番号１８３から２０２）
ＹＯ−ＭＹＲ−Ｓ−Ｇ（配列番号９、塩基番号１４７から１６６）
【００３２】
【表２】
【００３３】
実施例 ２
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドで特異性を識別する組み合わせ（ａ）と本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせ（ｂ）を用いて、喀痰中にある結核菌の検出を様々な菌数濃度で行なった。
（１）喀痰中にある結核菌の検出感度測定用検体として結核菌４から４×１０6菌を１ｍＬの陰性喀痰に懸濁させた試料を用いた。また検体中の核酸抽出法としては、本検体をＮＡＬＣ処理後、グアジニンイソチアネートとガラスビーズ（１５０から２１２μｍ、シグマ製）を用いて処理した溶液をＥｘｔｒａｇｅｎ（東ソー（株）製）を用いて抽出した。
（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。なお、第１・第２・第３オリゴヌクレオチドおよびインターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドの組み合わせが表１に示す組み合わせになるよう溶液を調製した。
【００３４】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１２０ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ製）
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド
１．０μＭの第２オリゴヌクレオチド
１．０μＭの第３オリゴヌクレオチド
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００３５】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μＬにおける濃度）
２．０％ ソルビトール
３．６μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
（５）酵素添加時の時刻を０分として、各検体の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化を図３に示し、各検体の検出結果を表３に示した。これらの結果、本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせ［組み合わせ（ｂ）］での検出感度は４菌／１ｍＬ（喀痰）であり、インターカレーター性色素で標識されたオリゴヌクレオチドで特異性を識別する組み合わせ（ａ）［４×１０3菌／ ｍＬ（喀痰）］よりも高感度であった。また本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせ［組み合わせ（ｂ）］を用いた結果と、市販のキット（アンプリコアマイコバクテリウムツベルクローシス、商品名、ロシュダイアグノスティックス社製）との感度比較を表３に示す。本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた測定試薬の感度は市販キットと比較して高感度であることを確認した。
【００３６】
【表３】
【００３７】
実施例 ３
本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせが、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍに特異的であるか確認した。
（１）以下に示す各菌種のコロニーをグアジニンイソチアネートが入った注射用蒸留水に懸濁させ、ガラスビーズ（１５０から２１２μｍ、シグマ製）存在下で５分間攪拌させた。次に、本菌体液をＥｘｔｒａｇｅｎ（東ソー（株）製）により核酸抽出し、これを抗酸菌の核酸抽出物とした。
【００３８】
評価実検体一覧
Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ ９２７）
Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ（ＡＴＣＣ ６８４１）
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＡＴＣＣ １２４７８）
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＡＴＣＣ １３９５０）
Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ １４４６７）
Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ（ＡＴＣＣ １４４７０）
Ｍ．ｇａｓｔｒｉ（ＡＴＣＣ １５７５４）
Ｍ．ｔｅｒｒａｅ（ＡＴＣＣ １５７５５）
Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ（ＡＴＣＣ １９２５０）
Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ（ＡＴＣＣ １９４２２）
Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ １９５３０）
Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ（ＡＴＣＣ １９９７７）
Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ（ＡＴＣＣ １９９８１）
Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ（ＡＴＣＣ ２３２９２）
Ｍ．ｓｉｍｉａｅ（ＡＴＣＣ ２５２７５）
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ（ＡＴＣＣ ２５４２０）
Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ（ＡＴＣＣ ３５７５２）
Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ（ＡＴＣＣ ３５７９９）
Ｍ．ａｖｉｕｍ（臨床分離株）
結核菌（臨床分離株）
（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、商品名、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００３９】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−１０、配列番号１０，３’末端側の水酸基はアミノ化されている。）
１．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１ＦＡ−１０、配列番号１６、５’末端側第１番目の「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモーターの領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。）
１．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＡ１８、配列番号４）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｓ−Ｇ、配列番号９、５’末端から７番目の「Ａ」と８番目の「Ｇ」との間のリンにインターカレーター性色素が標識されている。また、３’末端側の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４０】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
２．０％ ソルビトール
３．６μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ（株）製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
（５）各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を表４に示した。これらの結果、本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせがＭ．ａｖｉｕｍを特異的に検出していることが示された。
【００４１】
【表４】
【００４２】
実施例 ４
本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせが、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅに特異的であるか確認した。
（１）以下に示す各菌種のコロニーをグアジニンイソチアネートが入った注射用蒸留水に懸濁させ、ガラスビーズ（１５０から２１２μｍ、シグマ製）存在下で５分間攪拌させた。次に、本菌体液をＥｘｔｒａｇｅｎ（東ソー（株）製）により核酸抽出し、これを抗酸菌の核酸抽出物とした。
【００４３】
評価実検体一覧
Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ ９２７）
Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ（ＡＴＣＣ ６８４１）
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＡＴＣＣ １２４７８）
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＡＴＣＣ １３９５０）
Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ １４４６７）
Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ（ＡＴＣＣ １４４７０）
Ｍ．ｇａｓｔｒｉ（ＡＴＣＣ １５７５４）
Ｍ．ｔｅｒｒａｅ（ＡＴＣＣ １５７５５）
Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ（ＡＴＣＣ １９２５０）
Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ（ＡＴＣＣ １９４２２）
Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ １９５３０）
Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ（ＡＴＣＣ １９９７７）
Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ（ＡＴＣＣ １９９８１）
Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ（ＡＴＣＣ ２３２９２）
Ｍ．ｓｉｍｉａｅ（ＡＴＣＣ ２５２７５）
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ（ＡＴＣＣ ２５４２０）
Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ（ＡＴＣＣ ３５７５２）
Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ（ＡＴＣＣ ３５７９９）
Ｍ．ａｖｉｕｍ（臨床分離株）
結核菌（臨床分離株）
（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４４】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−１０、配列番号１０，３’末端側の水酸基はアミノ化されている。）
１．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１ＦＩ−１０、配列番号１７、５’末端側第１番目の「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモーターの領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。）
１．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＩ１８、配列番号６）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｓ−Ｇ、配列番号９、５’末端から７番目の「Ａ」と８番目の「Ｇ」との間のリンにインターカレーター性色素が標識されている。また、３’末端側の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４５】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
２．０％ ソルビトール
３．６μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
（５）各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を表５に示した。これらの結果、本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせがＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを特異的に検出していることが示された。
【００４６】
【表５】
【００４７】
実施例 ５
本願発明の示すオリゴヌクレオチドの組み合わせが、非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉに特異的であるか確認した。
（１）以下に示す各菌種のコロニーをグアジニンイソチアネートが入った注射用蒸留水に懸濁させ、ガラスビーズ（１５０から２１２μｍ、シグマ製）存在下で５分間攪拌させた。次に、本菌体液をＥｘｔｒａｇｅｎ（東ソー製）により核酸抽出し、これを抗酸菌の核酸抽出物とした。
【００４８】
評価実検体一覧
Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ ９２７）
Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ（ＡＴＣＣ ６８４１）
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＡＴＣＣ １２４７８）
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＡＴＣＣ １３９５０）
Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ １４４６７）
Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ（ＡＴＣＣ １４４７０）
Ｍ．ｇａｓｔｒｉ（ＡＴＣＣ １５７５４）
Ｍ．ｔｅｒｒａｅ（ＡＴＣＣ １５７５５）
Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ（ＡＴＣＣ １９２５０）
Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ（ＡＴＣＣ １９４２２）
Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ １９５３０）
Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ（ＡＴＣＣ １９９７７）
Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ（ＡＴＣＣ １９９８１）
Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ（ＡＴＣＣ ２３２９２）
Ｍ．ｓｉｍｉａｅ（ＡＴＣＣ ２５２７５）
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ（ＡＴＣＣ ２５４２０）
Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ（ＡＴＣＣ ３５７５２）
Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ（ＡＴＣＣ ３５７９９）
Ｍ．ａｖｉｕｍ（臨床分離株）
結核菌（臨床分離株）
（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、商品名、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４９】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−１０、配列番号１０，３’末端側の水酸基はアミノ化されている。）
１．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１ＦＫ−１０、配列番号１８、５’末端側第１番目の「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモーターの領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。）
１．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＫ１８、配列番号８）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｓ−Ｇ、配列番号９、５’末端から７番目の「Ａ」と８番目の「Ｇ」との間のリンにインターカレーター性色素が標識されている。また、３’末端側の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４４℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００５０】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０ μＬにおける濃度）
２．０％ ソルビトール
３．６μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ（株）製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
（５）各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を表６に示した。これらの結果、本願発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせがＭ．ｋａｎｓａｓｉｉとＭ．ｇａｓｔｒｉ（本抗酸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのそれと同一である）を特異的に検出していることが示された。
【００５１】
【表６】
【００５２】
【発明の効果】
以上の説明のように、本願発明の検出法は、特定の抗酸菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡを特異的にかつ高感度に検出するのに有用である。
【００５３】
本願発明のオリゴヌクレオチドは、配列表に記載した塩基配列（１８塩基から２３塩基）の物に限られず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであれば良いのであるが、これらは、標的核酸に対して極めて高い特異性を有している。またこれらオリゴヌクレオチドまたはその少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドは、比較的低温（好ましくは４４℃）条件下でもプライマーまたはプローブとして十分な標的核酸への特異性を確保しており、本願発明のオリゴヌクレオチドを用いることで一定温度（比較的低温）でｒＲＮＡの特異的な増幅、検出を実現できることが明らかである。
【００５４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例１および２で使用した各オリゴヌクレオチドの位置および増幅領域を示している［（Ａ）：組み合わせ（ａ）、（Ｂ）：組み合わせ（ｂ）］。図中の塩基番号は結核菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号 Ｚ８３８６２）のうち１６Ｓ ｒＲＮＡの開始位置を１としている。また両矢印は抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡにおいて結核菌に特異的な領域であることを示す。
【図２】図２は実施例１で行なった各オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、抗酸菌の核酸抽出物実検体試料をＲＮＡ増幅反応させた時の電気泳動写真（白黒反転）である。レーン１が結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ陽性標準（１０４コピー）、レーン２がＭ．ｍａｒｉｎｕｍ、レーン３がＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ、レーン４がＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、レーン５がＭ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、レーン６がＭ．ｇａｓｔｒｉ、レーン７がＭ．ｔｅｒｒａｅ、レーン８がＭ．ｘｅｎｏｐｉ、レーン９がＭ．ｍｉｃｒｏｔｉ、レーン１０がＭ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ、レーン１１がＭ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、レーン１２がＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、レーン１３がＭ．ｓｚｕｌｇａｉ、レーン１４がＭ．ａｖｉｕｍ、レーン１５が結核菌で、レーンＮが陰性コントロール（核酸抽出物の代わりに希釈液のみを用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ ４、ニッポンジーン（株）製）を使用した（レーンＭ）。なお、図中の矢印は各オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたときの特異的増幅バンドを示している。図２（Ａ）［組み合わせ（ａ）］では全ての抗酸菌の核酸抽出物について特定バンドが見られたのに対し、図２（Ｂ）［組み合わせ（ｂ）］では結核菌群の抗酸菌（結核菌、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）およびＭ．ｍａｒｉｎｕｍに特定バンドが見られた。
【図３】図３は実施例２で行なった結核菌４から４×１０６菌を１ｍＬの陰性喀痰に分散させた検体について、反応時間と検体中のＲＮＡの生成とともに増大する蛍光強度比のグラフである［（Ａ）：組み合わせ（ａ）、（Ｂ）：組み合わせ（ｂ）］。組み合わせ（ａ）では４×１０３菌／１ｍＬ（喀痰）、組み合わせ（ｂ）では４菌／１ｍＬ（喀痰）までの検体が検出された。
Claims (13)
- 特定の抗酸菌群を検出する方法として、特定の抗酸菌群のｒＲＮＡに特異的な領域の塩基配列と相同的あるいは相補的な配列を有するプライマーを用いることにより、特定の抗酸菌群のｒＲＮＡのみを特異的に増幅させて検出する方法。
- 結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１と２に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号３と４に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号５と６に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 非結核性抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の部位に結合する、ＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号７と８に示したいずれかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 試料中に存在する特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程を利用した検出法において、増幅される特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、増幅される特定の抗酸菌群由来１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方は、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有するプライマーである）を用いることを特徴とする特定の抗酸菌群由来１６ＳｒＲＮＡの増幅工程。
- 請求項６に記載の方法で、特定の抗酸菌群が結核菌で、第一のプライマーが配列番号１に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号２に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程。
- 請求項６に記載の方法で、特定の抗酸菌群がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍで、第一のプライマーが配列番号３に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号４に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程。
- 請求項６に記載の方法で、特定の抗酸菌群がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅで、第一のプライマーが配列番号５に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号６に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程。
- 請求項６に記載の方法で、特定の抗酸菌群がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉで、第一のプライマーが配列番号７に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなり、第二のプライマーが配列番号８に示した配列中のあるいはその相補鎖の少なくとも連続した１０塩基以上からなる増幅工程。
- 請求項６から１０に記載のＲＮＡ増幅工程において、増幅により生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、かつインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することからなる増幅工程（ただし該標識されたオリゴヌクレオチドは、前記第一および第二のプライマーとは異なる配列である）。
- 前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものであることを特徴とする請求項１１に記載の検出方法。
- 前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドが、配列番号９に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基からなる配列、あるいはその相補配列であることを特徴とする請求項１２に記載の検出方法。
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Cited By (2)
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| JPH07155200A (ja) * | 1993-12-10 | 1995-06-20 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の検出及び菌種同定用オリゴヌクレオチド |
| US5712095A (en) * | 1994-06-16 | 1998-01-27 | Becton Dickinson And Company | Rapid and sensitive detection of antibiotic-resistant mycobacteria using oligonucleotide probes specific for ribosomal RNA precursors |
| US5925518A (en) * | 1995-05-19 | 1999-07-20 | Akzo Nobel N.V. | Nucleic acid primers for amplification of a mycobacteria RNA template |
| JPH10323189A (ja) * | 1997-05-23 | 1998-12-08 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
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Cited By (2)
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