JP2003047478A - 結核菌のｐａｂ遺伝子の検出法 - Google Patents
結核菌のｐａｂ遺伝子の検出法Info
- Publication number
- JP2003047478A JP2003047478A JP2001240874A JP2001240874A JP2003047478A JP 2003047478 A JP2003047478 A JP 2003047478A JP 2001240874 A JP2001240874 A JP 2001240874A JP 2001240874 A JP2001240874 A JP 2001240874A JP 2003047478 A JP2003047478 A JP 2003047478A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- sequence
- primer
- dna
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】結核菌のｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡを特異
的に増幅したり、検出及び同定を高感度で行なうために
有効なオリゴヌクレオチドの組み合わせを提供する。 【解決手段】ＲＮＡ増幅工程を利用した検出法におい
て、第一のプライマーとして少なくとも連続した１０塩
基以上からなるオリゴヌクレオチド、第二のプライマー
として少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴ
ヌクレオチドを用いること及びインビトロ２本鎖ＤＮＡ
転写工程を用いてＲＮＡ増幅を行なうことを特徴とする
検出法。
的に増幅したり、検出及び同定を高感度で行なうために
有効なオリゴヌクレオチドの組み合わせを提供する。 【解決手段】ＲＮＡ増幅工程を利用した検出法におい
て、第一のプライマーとして少なくとも連続した１０塩
基以上からなるオリゴヌクレオチド、第二のプライマー
として少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴ
ヌクレオチドを用いること及びインビトロ２本鎖ＤＮＡ
転写工程を用いてＲＮＡ増幅を行なうことを特徴とする
検出法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査における
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）の検出法に関するものである。
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）の検出法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】結核は近年著しく減少してきたにもかか
わらず、最近になって高齢者の罹患率が上がり、結核感
染を経験していない若年層で、一旦感染すると集団感染
を引き起こすなど深刻な問題となっている。これまでの
結核菌の検査法としては、塗抹検査や培養検査が基本で
あった。しかし、結核菌の発育は遅く結果を得るのに４
週間以上を必要としている。
わらず、最近になって高齢者の罹患率が上がり、結核感
染を経験していない若年層で、一旦感染すると集団感染
を引き起こすなど深刻な問題となっている。これまでの
結核菌の検査法としては、塗抹検査や培養検査が基本で
あった。しかし、結核菌の発育は遅く結果を得るのに４
週間以上を必要としている。
【０００３】近年、結核菌群を検出する遺伝子検出用キ
ットが販売されている。ＤＮＡ増幅を行うものとして
は、ＰＣＲ法で１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするゲノムＤ
ＮＡを増幅し、特異ＤＮＡプローブをハイブリダイズし
て検出するものや、結核菌の抗原タンパク質であるｐｒ
ｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｂ（以下ｐａｂとする）
をコードするｐａｂ遺伝子（配列は既知、Ｉｎｆ．ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎ．５７，２４８１−２４８８，１９８９
年）をｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
（ＬＣＲ法）で増幅し、ＥＩＡによって検出するものな
どが知られている（米国特許第５６３１１３０号）。こ
れらの検出法は自動化あるいは半自動化されているが、
検査所要時間が４〜６時間程度と急を要する治療用とし
ては不十分である。さらに、ＤＮＡ増幅法では生菌、死
菌の区別がつかず、抗生物質などの治療効果を観察する
には不適切である。ＲＮＡの特定配列の増幅法として
は、逆転写―ポリメラーゼチェーンリアクション（ＲＴ
−ＰＣＲ）法が知られている。この方法は、逆転写工程
で標的ＲＮＡのｃＤＮＡを合成し、引き続いてｃＤＮＡ
の特定配列の両末端部に相補的および相同な一組のプラ
イマー（アンチセンスプライマーは逆転写工程と共用で
よい）と熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ存在下で、熱変性、
プライマー・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰
り返し行なうことによって特定ＤＮＡ配列を増幅する方
法である。しかし、ＲＴ−ＰＣＲ法は、２段階の操作
（逆転写工程およびＰＣＲ工程）、および、急激な昇温
・降温を繰り返す操作が必要であり、そのことが自動化
への障害として挙げられる。
ットが販売されている。ＤＮＡ増幅を行うものとして
は、ＰＣＲ法で１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするゲノムＤ
ＮＡを増幅し、特異ＤＮＡプローブをハイブリダイズし
て検出するものや、結核菌の抗原タンパク質であるｐｒ
ｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｂ（以下ｐａｂとする）
をコードするｐａｂ遺伝子（配列は既知、Ｉｎｆ．ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎ．５７，２４８１−２４８８，１９８９
年）をｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
（ＬＣＲ法）で増幅し、ＥＩＡによって検出するものな
どが知られている（米国特許第５６３１１３０号）。こ
れらの検出法は自動化あるいは半自動化されているが、
検査所要時間が４〜６時間程度と急を要する治療用とし
ては不十分である。さらに、ＤＮＡ増幅法では生菌、死
菌の区別がつかず、抗生物質などの治療効果を観察する
には不適切である。ＲＮＡの特定配列の増幅法として
は、逆転写―ポリメラーゼチェーンリアクション（ＲＴ
−ＰＣＲ）法が知られている。この方法は、逆転写工程
で標的ＲＮＡのｃＤＮＡを合成し、引き続いてｃＤＮＡ
の特定配列の両末端部に相補的および相同な一組のプラ
イマー（アンチセンスプライマーは逆転写工程と共用で
よい）と熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ存在下で、熱変性、
プライマー・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰
り返し行なうことによって特定ＤＮＡ配列を増幅する方
法である。しかし、ＲＴ−ＰＣＲ法は、２段階の操作
（逆転写工程およびＰＣＲ工程）、および、急激な昇温
・降温を繰り返す操作が必要であり、そのことが自動化
への障害として挙げられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、現在利
用されている検査法は実際の医療現場で必要とされる迅
速な検出や治療効果確認のための用途に必ずしも答える
ものではなく、生菌のみを検出すると共に、さらなる高
感度、迅速な検出法の出現が望まれている。また、検査
をより簡便にするためには、自動化された検査装置の開
発が要求されている。
用されている検査法は実際の医療現場で必要とされる迅
速な検出や治療効果確認のための用途に必ずしも答える
ものではなく、生菌のみを検出すると共に、さらなる高
感度、迅速な検出法の出現が望まれている。また、検査
をより簡便にするためには、自動化された検査装置の開
発が要求されている。
【０００５】高感度な検出法としては標的核酸を増幅す
る方法の利用が可能である。特定ＲＮＡ配列の増幅法と
しては、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的
作用によって特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や
３ＳＲ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを
鋳型とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写
酵素、およびリボヌクレアーゼＨにより、プロモーター
配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、当該２本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、標的ＲＮＡの特
定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、当該ＲＮＡが引き続
きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とな
る連鎖反応を行なうものである。このようにＮＡＳＢＡ
法や３ＳＲ法は一定温度での核酸増幅が可能であり、自
動化へ適している方法だと考えられる。しかし、これら
の増幅法は比較的低温（例えば４１℃）で反応を行なう
ために、標的ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマー
の結合を阻害し、反応効率を低下させる可能性が考えら
れる。したがって、増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性
を行なうことで、標的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プラ
イマーの結合効率を向上させるための操作が必要であっ
た。また更には、低温でＲＮＡの検出を行なう場合に
も、前記のような分子構造を形成したＲＮＡに対して結
合し得るオリゴヌクレオチドが必要であった。
る方法の利用が可能である。特定ＲＮＡ配列の増幅法と
しては、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的
作用によって特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や
３ＳＲ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを
鋳型とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写
酵素、およびリボヌクレアーゼＨにより、プロモーター
配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、当該２本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、標的ＲＮＡの特
定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、当該ＲＮＡが引き続
きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とな
る連鎖反応を行なうものである。このようにＮＡＳＢＡ
法や３ＳＲ法は一定温度での核酸増幅が可能であり、自
動化へ適している方法だと考えられる。しかし、これら
の増幅法は比較的低温（例えば４１℃）で反応を行なう
ために、標的ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマー
の結合を阻害し、反応効率を低下させる可能性が考えら
れる。したがって、増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性
を行なうことで、標的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プラ
イマーの結合効率を向上させるための操作が必要であっ
た。また更には、低温でＲＮＡの検出を行なう場合に
も、前記のような分子構造を形成したＲＮＡに対して結
合し得るオリゴヌクレオチドが必要であった。
【０００６】そこで本願発明は結核菌の抗原タンパク質
ｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡを比較的低温（例えば４
１℃）で特異的に増幅したり、これらの検出および同定
を高感度で行なうために有用なオリゴヌクレオチドの好
適な組み合わせの提供を目的とするものである。
ｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡを比較的低温（例えば４
１℃）で特異的に増幅したり、これらの検出および同定
を高感度で行なうために有用なオリゴヌクレオチドの好
適な組み合わせの提供を目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、結核菌のｐａｂ遺伝
子に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配
列に相同的な配列を有する第一のプライマーおよび該特
定配列に相補的な配列を有する第二のプライマー（ここ
では第一または第二のプライマーのいずれか一方のプラ
イマーは、５’側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を有する）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー
ゼによりｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ
２本鎖を形成し、リボヌクレアーゼＨによってＲＮＡ−
ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成
し、該１本鎖のＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡ
ポリメラーゼにより、前記特定配列または前記特定配列
に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモータ
ー配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖
ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を
生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるよ
うなＲＮＡ増幅行程において、第一のプライマーとして
列番号７から１２に示したいずれかの配列中の少なくと
も連続した１０塩基以上からなる第一のプライマーと、
配列番号１３から２０に示したいずれかの配列中の少な
くとも連続した１０塩基以上からなる、増幅される結核
菌ｐａｂ遺伝子のＲＮＡ配列の一部と相補的な配列を有
する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライ
マーのいずれか一方は、その５’側にＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列を含む）を用いることを特徴とす
る。
になされた本願請求項１の発明は、結核菌のｐａｂ遺伝
子に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配
列に相同的な配列を有する第一のプライマーおよび該特
定配列に相補的な配列を有する第二のプライマー（ここ
では第一または第二のプライマーのいずれか一方のプラ
イマーは、５’側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を有する）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー
ゼによりｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡ
２本鎖を形成し、リボヌクレアーゼＨによってＲＮＡ−
ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成
し、該１本鎖のＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡ
ポリメラーゼにより、前記特定配列または前記特定配列
に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモータ
ー配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖
ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を
生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるよ
うなＲＮＡ増幅行程において、第一のプライマーとして
列番号７から１２に示したいずれかの配列中の少なくと
も連続した１０塩基以上からなる第一のプライマーと、
配列番号１３から２０に示したいずれかの配列中の少な
くとも連続した１０塩基以上からなる、増幅される結核
菌ｐａｂ遺伝子のＲＮＡ配列の一部と相補的な配列を有
する第二のプライマー（ここで第一または第二のプライ
マーのいずれか一方は、その５’側にＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列を含む）を用いることを特徴とす
る。
【０００８】本願請求項２の発明は、前記請求項１の発
明に係わり、前記ＲＮＡ増幅行程において、増幅により
生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、か
つ、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴ
ヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化
を測定することからなる（ただし該標識されたオリゴヌ
クレオチドは、前記第一および第二のプライマーとは異
なる配列である）。本願請求項３の発明は、前記請求項
２の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ
転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように
設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光
特性が変化するものであることを特徴とする。そして本
願請求項４の発明は、前記請求項３の発明に係わり、前
記オリゴヌクレオチドが、配列番号２１から２３に示し
たいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上
からなる、またはその相補配列であることを特徴とす
る。以下、本発明を詳細に説明する。
明に係わり、前記ＲＮＡ増幅行程において、増幅により
生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、か
つ、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴ
ヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化
を測定することからなる（ただし該標識されたオリゴヌ
クレオチドは、前記第一および第二のプライマーとは異
なる配列である）。本願請求項３の発明は、前記請求項
２の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ
転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように
設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光
特性が変化するものであることを特徴とする。そして本
願請求項４の発明は、前記請求項３の発明に係わり、前
記オリゴヌクレオチドが、配列番号２１から２３に示し
たいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上
からなる、またはその相補配列であることを特徴とす
る。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】本発明は、試料中の結核菌ｐａｂ遺伝子に
由来するＲＮＡを増幅するための核酸増幅行程や、核酸
増幅行程によって生成したＲＮＡ転写産物の検出法を提
供する。本発明の増幅行程は、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ
法、３ＳＲ法を含むが、中でも逆転写酵素およびＲＮＡ
ポリメラーゼの協奏的作用によって（逆転写酵素および
ＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で
反応させ）結核菌ｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡ配列を
増幅するＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅
法が好ましい。
由来するＲＮＡを増幅するための核酸増幅行程や、核酸
増幅行程によって生成したＲＮＡ転写産物の検出法を提
供する。本発明の増幅行程は、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ
法、３ＳＲ法を含むが、中でも逆転写酵素およびＲＮＡ
ポリメラーゼの協奏的作用によって（逆転写酵素および
ＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で
反応させ）結核菌ｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡ配列を
増幅するＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅
法が好ましい。
【００１０】例えばＮＡＳＢＡ法は、試料中に存在する
結核菌ｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型
として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮ
Ａを合成し、リボヌクレアーゼＨによってＲＮＡ−ＤＮ
Ａ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該
１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラ
ーゼにより、前記特定配列または前記特定配列に相補的
な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を
有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡが
ＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、
該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮ
Ａ増幅行程であるが、本発明は結核菌ｐａｂ遺伝子に由
来するＲＮＡに相同的な配列を有する配列番号７から１
２に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなる第一のプライマーと、配列番号１３か
ら２０に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した
１０塩基以上からなる、増幅される結核菌ｐａｂ遺伝子
に由来するＲＮＡ配列の一部と相補的な配列を有する第
二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーの
いずれか一方は、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列を含む）を用いることを特徴とす
る。
結核菌ｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型
として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮ
Ａを合成し、リボヌクレアーゼＨによってＲＮＡ−ＤＮ
Ａ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該
１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラ
ーゼにより、前記特定配列または前記特定配列に相補的
な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を
有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡが
ＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、
該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮ
Ａ増幅行程であるが、本発明は結核菌ｐａｂ遺伝子に由
来するＲＮＡに相同的な配列を有する配列番号７から１
２に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなる第一のプライマーと、配列番号１３か
ら２０に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した
１０塩基以上からなる、増幅される結核菌ｐａｂ遺伝子
に由来するＲＮＡ配列の一部と相補的な配列を有する第
二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーの
いずれか一方は、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列を含む）を用いることを特徴とす
る。
【００１１】なお、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ
は特に限定しないが、これらの活性のすべてを有してい
るＡＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメラ
ーゼについても特に限定するものではないが、Ｔ７ファ
ージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメ
ラーゼが好ましい。
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ
は特に限定しないが、これらの活性のすべてを有してい
るＡＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメラ
ーゼについても特に限定するものではないが、Ｔ７ファ
ージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメ
ラーゼが好ましい。
【００１２】上記増幅行程では、結核菌ｐａｂ遺伝子に
由来するＲＮＡ配列の中で特定配列とする領域の５’末
領域と重複（１〜１０塩基）して隣接する領域に対し相
補的なオリゴヌクレオチドを添加し、前記結核菌ｐａｂ
遺伝子に由来するＲＮＡを特定配列の５’末領域で切断
（リボヌクレアーゼＨによる）して核酸増幅初期の鋳型
とすることにより、特定配列が５’末端に位置していな
い結核菌ｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡをも増幅するこ
とができる。この切断のためには、たとえば、配列番号
１から６のオリゴヌクレオチド（ただし、前記増幅行程
において第二のプライマーとして使用したもの以外のオ
リゴヌクレオチド）を使用することができる。なお、前
記切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反
応をおさえるために３’末水酸基が化学的に修飾（たと
えばアミノ化）されたものであることが望ましい。
由来するＲＮＡ配列の中で特定配列とする領域の５’末
領域と重複（１〜１０塩基）して隣接する領域に対し相
補的なオリゴヌクレオチドを添加し、前記結核菌ｐａｂ
遺伝子に由来するＲＮＡを特定配列の５’末領域で切断
（リボヌクレアーゼＨによる）して核酸増幅初期の鋳型
とすることにより、特定配列が５’末端に位置していな
い結核菌ｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡをも増幅するこ
とができる。この切断のためには、たとえば、配列番号
１から６のオリゴヌクレオチド（ただし、前記増幅行程
において第二のプライマーとして使用したもの以外のオ
リゴヌクレオチド）を使用することができる。なお、前
記切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反
応をおさえるために３’末水酸基が化学的に修飾（たと
えばアミノ化）されたものであることが望ましい。
【００１３】以上の核酸増幅方法で得られた増幅産物は
既知の核酸検出方法で検出することができるが、好適な
態様では前記核酸増幅をインターカレーター性蛍光色素
で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応
液の蛍光特性の変化を測定することが望ましい。該オリ
ゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のリンにリン
カーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させ
たもので、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成する
とインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレ
ートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要とし
ないことを特徴とする（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１
９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４（２
４）４９９２−４９９７）。
既知の核酸検出方法で検出することができるが、好適な
態様では前記核酸増幅をインターカレーター性蛍光色素
で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応
液の蛍光特性の変化を測定することが望ましい。該オリ
ゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のリンにリン
カーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させ
たもので、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成する
とインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレ
ートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要とし
ないことを特徴とする（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１
９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４（２
４）４９９２−４９９７）。
【００１４】該オリゴヌクレオチドの配列は、増幅産物
の少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に
限定しないが、配列番号２１から２３に示した配列中の
少なくとも連続した１０塩基からなる配列、あるいはそ
の相補配列であることが好ましい。また、該オリゴヌク
レオチドをプライマーとした伸長反応を抑えるために該
オリゴヌクレオチドの３’末の水酸基は化学的に修飾
（たとえばグリコール酸付加）することが望ましい。
の少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に
限定しないが、配列番号２１から２３に示した配列中の
少なくとも連続した１０塩基からなる配列、あるいはそ
の相補配列であることが好ましい。また、該オリゴヌク
レオチドをプライマーとした伸長反応を抑えるために該
オリゴヌクレオチドの３’末の水酸基は化学的に修飾
（たとえばグリコール酸付加）することが望ましい。
【００１５】これにより、結核菌ｐａｂ遺伝子に由来す
るＲＮＡの中の特定配列と同じ配列からなるＲＮＡを、
一チューブ内、一定温度、一段階で増幅し、検出するこ
とが可能となり、自動化への適用も容易となる。
るＲＮＡの中の特定配列と同じ配列からなるＲＮＡを、
一チューブ内、一定温度、一段階で増幅し、検出するこ
とが可能となり、自動化への適用も容易となる。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例により更に
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定さ
れるものではない。
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定さ
れるものではない。
【００１７】実施例１
結核菌ｐａｂ遺伝子由来のＲＮＡに特異的に結合するオ
リゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応を行なった。
なお、ｐａｂ−ＲＮＡとは、ｐａｂの塩基配列を含む二
本鎖ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精
製されたものである。 （１）結核菌ｐａｂ遺伝子に由来するｐａｂ−ＲＮＡの
塩基番号１１１〜１４３６（ＲＮＡの塩基番号はｉｎ
ｆ．ａｎｄ ｉｍｍｕｎ．５７，２４８１−２４８８，
１９８９年に従った）を含む標準ＲＮＡ（１３２６ｍｅ
ｒ）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ ＲＮ
ａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造製）、５ｍＭ Ｄ
ＴＴ）を用い、１０3コピー／５μＬとなるよう希釈し
た。コントロール試験区（陰性）には希釈液のみを用い
た。 （２）以下の組成の反応液２０ μＬを０．５ ｍＬ容
ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌ
ｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエル
マー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加
した。
リゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応を行なった。
なお、ｐａｂ−ＲＮＡとは、ｐａｂの塩基配列を含む二
本鎖ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精
製されたものである。 （１）結核菌ｐａｂ遺伝子に由来するｐａｂ−ＲＮＡの
塩基番号１１１〜１４３６（ＲＮＡの塩基番号はｉｎ
ｆ．ａｎｄ ｉｍｍｕｎ．５７，２４８１−２４８８，
１９８９年に従った）を含む標準ＲＮＡ（１３２６ｍｅ
ｒ）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ ＲＮ
ａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造製）、５ｍＭ Ｄ
ＴＴ）を用い、１０3コピー／５μＬとなるよう希釈し
た。コントロール試験区（陰性）には希釈液のみを用い
た。 （２）以下の組成の反応液２０ μＬを０．５ ｍＬ容
ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌ
ｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエル
マー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加
した。
【００１８】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
１の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表１に示す組み合わせにな
るよう溶液を調製した。 （４）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成の酵素液５μＬを添加した。
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
１の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表１に示す組み合わせにな
るよう溶液を調製した。 （４）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成の酵素液５μＬを添加した。
【００１９】酵素液の組成（各数値は最終反応液量３０
μＬにおける値） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。 （６）反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するため、アガロ
ースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。
電気泳動後の染色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒
造製）により行なった。標的ＲＮＡの特定部位にオリゴ
ヌクレオチドプローブが結合すると第２オリゴヌクレオ
チドと第３オリゴヌクレオチドに挟まれた部分のＲＮＡ
が増幅され、特定バンドが観察される。
μＬにおける値） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。 （６）反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するため、アガロ
ースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。
電気泳動後の染色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒
造製）により行なった。標的ＲＮＡの特定部位にオリゴ
ヌクレオチドプローブが結合すると第２オリゴヌクレオ
チドと第３オリゴヌクレオチドに挟まれた部分のＲＮＡ
が増幅され、特定バンドが観察される。
【００２０】電気泳動結果の写真を図１に示した。この
反応で増幅される特定バンドの鎖長は表１に示した通り
である。これより表１に示したオリゴヌクレオチドの組
み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応において、組み合わせ
（ｃ）、（ｈ）、（ｍ）にて特定バンドが確認できたた
め、これらの組み合わせで使用したオリゴヌクレオチド
は結核菌の検出に有効であることが示された。
反応で増幅される特定バンドの鎖長は表１に示した通り
である。これより表１に示したオリゴヌクレオチドの組
み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応において、組み合わせ
（ｃ）、（ｈ）、（ｍ）にて特定バンドが確認できたた
め、これらの組み合わせで使用したオリゴヌクレオチド
は結核菌の検出に有効であることが示された。
【００２１】
【表１】
表１は本実験系で用いた第１、第２、第３オリゴヌクレ
オチドの組み合わせ、およびその組み合わせを用いてＲ
ＮＡ増幅反応させたときに増幅される特定バンドの鎖長
を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、
３’末端の水酸基はアミノ化されている。第２オリゴヌ
クレオチドの塩基配列のうち、５’末端第１番目の
「Ａ」から２８番目の「Ａ」までの領域はＴ７ポリメレ
ースのプロモーター配列を付加した。また塩基番号は結
核菌ｐａｂ遺伝子の塩基配列の番号である。
オチドの組み合わせ、およびその組み合わせを用いてＲ
ＮＡ増幅反応させたときに増幅される特定バンドの鎖長
を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、
３’末端の水酸基はアミノ化されている。第２オリゴヌ
クレオチドの塩基配列のうち、５’末端第１番目の
「Ａ」から２８番目の「Ａ」までの領域はＴ７ポリメレ
ースのプロモーター配列を付加した。また塩基番号は結
核菌ｐａｂ遺伝子の塩基配列の番号である。
【００２２】第１オリゴヌクレオチド
ＭＰ−１Ｓ（配列番号１、塩基番号２１３から２３６）
ＭＰ−４Ｓ（配列番号２、塩基番号４５３から４７６）
ＭＰ−６Ｓ（配列番号３、塩基番号４９４から５１７）
ＭＰ−９Ｓ（配列番号４、塩基番号７０８から７３１）
ＭＰ−１２Ｓ（配列番号５、塩基番号７８６から８０
９） ＭＰ−１３Ｓ（配列番号６、塩基番号９３３から９５
６） 第２オリゴヌクレオチド ＭＰ−１Ｆ（配列番号７、塩基番号２２８から２５０） ＭＰ−４Ｆ（配列番号８、塩基番号４６８から４９０） ＭＰ−６Ｆ（配列番号９、塩基番号５０９から５３１） ＭＰ−９Ｆ（配列番号１０、塩基番号７２３から７４
５） ＭＰ−１２Ｆ（配列番号１１、塩基番号８００から８２
３） ＭＰ−１３Ｆ（配列番号１２、塩基番号９４８から９７
０） 第３オリゴヌクレオチド ＭＰ−３Ｒ（配列番号１３、塩基番号３１９から３３
９） ＭＰ−９Ｒ（配列番号１４、塩基番号７１２から７３
１） ＭＰ−１０Ｒ（配列番号１５、塩基番号７２４から７４
３） ＭＰ−１１Ｒ（配列番号１６、塩基番号７５７から７７
８） ＭＰ−１２Ｒ（配列番号１７、塩基番号７９０から８０
９） ＭＰ−１６Ｒ（配列番号１８、塩基番号１０７１から１
０９３） ＭＰ−１７Ｒ（配列番号１９、塩基番号１１０３から１
１２３） ＭＰ−２０Ｒ（配列番号２０、塩基番号１２７０から１
２９０） 実施例２ 本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い
て、結核菌ｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡの様々な初期
コピー数における検出を行なった。
９） ＭＰ−１３Ｓ（配列番号６、塩基番号９３３から９５
６） 第２オリゴヌクレオチド ＭＰ−１Ｆ（配列番号７、塩基番号２２８から２５０） ＭＰ−４Ｆ（配列番号８、塩基番号４６８から４９０） ＭＰ−６Ｆ（配列番号９、塩基番号５０９から５３１） ＭＰ−９Ｆ（配列番号１０、塩基番号７２３から７４
５） ＭＰ−１２Ｆ（配列番号１１、塩基番号８００から８２
３） ＭＰ−１３Ｆ（配列番号１２、塩基番号９４８から９７
０） 第３オリゴヌクレオチド ＭＰ−３Ｒ（配列番号１３、塩基番号３１９から３３
９） ＭＰ−９Ｒ（配列番号１４、塩基番号７１２から７３
１） ＭＰ−１０Ｒ（配列番号１５、塩基番号７２４から７４
３） ＭＰ−１１Ｒ（配列番号１６、塩基番号７５７から７７
８） ＭＰ−１２Ｒ（配列番号１７、塩基番号７９０から８０
９） ＭＰ−１６Ｒ（配列番号１８、塩基番号１０７１から１
０９３） ＭＰ−１７Ｒ（配列番号１９、塩基番号１１０３から１
１２３） ＭＰ−２０Ｒ（配列番号２０、塩基番号１２７０から１
２９０） 実施例２ 本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い
て、結核菌ｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡの様々な初期
コピー数における検出を行なった。
【００２３】実施例１と同様の結核菌のｐａｂ遺伝子に
由来するｐａｂ−ＲＮＡの標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒ（宝酒造製）、５ｍＭＤＴＴ）を用い、１０1
コピー／５μＬから１０5コピー／５μＬまでとなるよ
う希釈した。コントロール試験区（陰性）には希釈液の
みを用いた。
由来するｐａｂ−ＲＮＡの標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒ（宝酒造製）、５ｍＭＤＴＴ）を用い、１０1
コピー／５μＬから１０5コピー／５μＬまでとなるよ
う希釈した。コントロール試験区（陰性）には希釈液の
みを用いた。
【００２４】以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チ
ューブ（容量０．５ｍＬ；ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−
Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキ
ンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬ
を添加した。
ューブ（容量０．５ｍＬ；ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−
Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキ
ンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬ
を添加した。
【００２５】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム １５０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（ＭＰ−１３
Ｓ、配列番号６、３’末端の水酸基はアミノ化されてい
る。） １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（ＭＰ−１３Ｆ、
配列番号１２） １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（ＭＰ−１７Ｒ、
配列番号１９） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチド（ＹＯ−Ｐａｂ１０７６−Ｓ−Ｇ、
配列番号２１、５’末端から１０番目の「Ａ」と１１番
目の「Ｔ」との間のリンにインターカレーター性蛍光色
素が標識されている。また３’末端の水酸基はグリコー
ル基で修飾されている。） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
５μＬを添加した。
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム １５０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（ＭＰ−１３
Ｓ、配列番号６、３’末端の水酸基はアミノ化されてい
る。） １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（ＭＰ−１３Ｆ、
配列番号１２） １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（ＭＰ−１７Ｒ、
配列番号１９） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチド（ＹＯ−Ｐａｂ１０７６−Ｓ−Ｇ、
配列番号２１、５’末端から１０番目の「Ａ」と１１番
目の「Ｔ」との間のリンにインターカレーター性蛍光色
素が標識されている。また３’末端の水酸基はグリコー
ル基で修飾されている。） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
５μＬを添加した。
【００２６】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μＬにおける濃度） ７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。
μＬにおける濃度） ７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。
【００２７】酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍
光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図２（Ａ）に示した。また、
初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が
陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値：１．２にな
るまでの時間）との関係の結果を図２（Ｂ）に示した。
なお、初期ＲＮＡ量は１０1コピー／試験から１０5コピ
ー／試験である。
光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図２（Ａ）に示した。また、
初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が
陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値：１．２にな
るまでの時間）との関係の結果を図２（Ｂ）に示した。
なお、初期ＲＮＡ量は１０1コピー／試験から１０5コピ
ー／試験である。
【００２８】図２（Ａ）より、１０2コピーが約１５分
で検出された。標的ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プ
ロファイルと検量線が得られ、未知試料中に存在する結
核菌ｐａｂ遺伝子由来のＲＮＡの定量が可能であること
が示された。以上より、本法により、結核菌の迅速・高
感度な検出が可能であることが示された。
で検出された。標的ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プ
ロファイルと検量線が得られ、未知試料中に存在する結
核菌ｐａｂ遺伝子由来のＲＮＡの定量が可能であること
が示された。以上より、本法により、結核菌の迅速・高
感度な検出が可能であることが示された。
【００２９】
【発明の効果】以上の説明のように本発明によれば、試
料中のＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーやプロ
ーブの結合を阻害しかねない、比較的低温かつ一定温度
（３５℃から５０℃、好ましくは４１℃）条件下でも、
結核菌ｐａｂ遺伝子由来のＲＮＡに特異的に結合し、標
的ＲＮＡを迅速に増幅し、かつ検出等するためのオリゴ
ヌクレオチドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブ
の組み合わせとして有用である。
料中のＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーやプロ
ーブの結合を阻害しかねない、比較的低温かつ一定温度
（３５℃から５０℃、好ましくは４１℃）条件下でも、
結核菌ｐａｂ遺伝子由来のＲＮＡに特異的に結合し、標
的ＲＮＡを迅速に増幅し、かつ検出等するためのオリゴ
ヌクレオチドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブ
の組み合わせとして有用である。
【００３０】本願発明の組み合わせにおけるオリゴヌク
レオチドの塩基長は、具体的に記載した長さに限られ
ず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上か
らなるオリゴヌクレオチドを含む。これは、比較的低温
（好ましくは４１℃）条件下で、プライマーまたはプロ
ーブの標的核酸への特異性を確保するためには１０塩基
程度の塩基配列があれば十分であることから明らかであ
る。
レオチドの塩基長は、具体的に記載した長さに限られ
ず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上か
らなるオリゴヌクレオチドを含む。これは、比較的低温
（好ましくは４１℃）条件下で、プライマーまたはプロ
ーブの標的核酸への特異性を確保するためには１０塩基
程度の塩基配列があれば十分であることから明らかであ
る。
【００３１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> TOSOH Corporation
<120> 結核菌のｐａｂ遺伝子の検出法
<130> PA211-0532
<160> 23
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−１Ｓ
<400> 1
gtggtttcga gccacagccc gccg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−４Ｓ
<400> 2
gataggcgtc ggaggcccca atgt 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−６Ｓ
<400> 3
gttcatcagc cccttgtgcg cggc 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−９Ｓ
<400> 4
agaaggtgtc accggacccg tcgg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−１２Ｓ
<400> 5
ggaagtcgac ggtggtgccg aagc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−１３Ｓ
<400> 6
tattgcctag ttgggcctcg ccga 24
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−１Ｆ
<400> 7
aattctaata cgactcacta tagggagacg aaaccaccga gcggttcgcc t 51
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−４Ｆ
<400> 8
aattctaata cgactcacta tagggagaac gcctatctgt cggaaggtga t 51
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−６Ｆ
<400> 9
aattctaata cgactcacta tagggagact gatgaacatc gcgctagcca t 51
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−９Ｆ
<400> 10
aattctaata cgactcacta tagggagaac accttcttgt tcacccagta c 51
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−１２Ｆ
<400> 11
aattctaata cgactcacta tagggagatc gacttcccgg cggtgccggg t 51
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−１３Ｆ
<400> 12
aattctaata cgactcacta tagggagata ggcaatagct ctggcaattt c 51
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−３Ｒ
<400> 13
gggtagagca gcgtgctacc g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−９Ｒ
<400> 14
agaaggtgtc accggacccg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−１０Ｒ
<400> 15
actgggtgaa caagaaggtg 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−１１Ｒ
<400> 16
cttgccccag ccctcgggat ct 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−１２Ｒ
<400> 17
ggaagtcgac ggtggtgccg 20
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−１６Ｒ
<400> 18
gtagttgatg atcgggtagc cgt 23
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−１７Ｒ
<400> 19
cttttgccgg ttgttgacga t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ＭＰ−２０Ｒ
<400> 20
ggtggtcaac gaggctagct g 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>ＹＯ−Ｐａｂ １０７６−Ｓ−Ｇ
<400> 21
tcgtagttga tgatcgggta 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifiial sequence
<220>
<223>ＹＯ−Ｐａｂ ５３７−Ｓ−Ｇ
<400> 22
gttgtagttg acctgctgag 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifiial sequence
<220>
<223>ＹＯ−Ｐａｂ ９７８−Ｓ−Ｇ
<400> 23
ctgaatgctt tgcgcgtcgg 20
【００３２】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において、表１の組み合わせ（ａ）〜
（ｍ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の電気泳動写真である。図中、Ｐは初期ＲＮＡ量
１０3コピー／試験をＲＮＡ試料として用いた場合であ
り、Ｎは陰性コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈
液のみを用いたもの）である。また分子量マーカーはφ
Ｘ１７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ
４）を使用した（レーンＭ）。
（ｍ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の電気泳動写真である。図中、Ｐは初期ＲＮＡ量
１０3コピー／試験をＲＮＡ試料として用いた場合であ
り、Ｎは陰性コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈
液のみを用いたもの）である。また分子量マーカーはφ
Ｘ１７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ
４）を使用した（レーンＭ）。
【図２】図２は実施例２で行なった初期ＲＮＡ量１０1
コピー／試験から１０5コピー／試験において、反応時
間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加比のグラフ
（Ａ）および初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間と
の間で得られた検量線（Ｂ）である。初期コピー数１０
2コピー／試験のＲＮＡが反応約１５分で検出でき、初
期ＲＮＡ量と立ち上がり時間との間に相関関係のあるこ
とが示された。
コピー／試験から１０5コピー／試験において、反応時
間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加比のグラフ
（Ａ）および初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間と
の間で得られた検量線（Ｂ）である。初期コピー数１０
2コピー／試験のＲＮＡが反応約１５分で検出でき、初
期ＲＮＡ量と立ち上がり時間との間に相関関係のあるこ
とが示された。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA31 CA04 CA09 CA12
CA20 FA02 HA08 HA11 HA13
HA14 HA20
4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ43 QQ53
QR08 QR14 QR32 QR35 QR39
QR42 QR56 QR62 QS24 QS34
QX02
Claims (4)
- 【請求項１】試料中に存在する結核菌の遺伝子要素であ
るｐａｂ遺伝子に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型とし
て、該特定配列に相同的な配列を有する第一のプライマ
ーおよび該特定配列に相補的な配列を有する第二のプラ
イマー（ここで第一または第二のプライマーのいずれか
一方のプライマーは５’側にＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を付加した配列を有する）を用い、ＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成し、リ
ボヌクレアーゼＨによってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮ
Ａを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、前
記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなる
ＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖Ｄ
ＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラ
ーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産
物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによ
るｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程を利
用した検出法において、配列番号７から１２に示したい
ずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上から
なる、増幅される結核菌のｐａｂ遺伝子のＲＮＡ配列の
一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、配列
番号１３から２０に示したいずれかの配列中の少なくと
も連続した１０塩基以上からなる結核菌ｐａｂ遺伝子の
ＲＮＡの配列の一部と相補的な配列を有する第二のプラ
イマーを用いることを特徴とする結核菌のｐａｂ遺伝子
の増幅工程。 - 【請求項２】前記ＲＮＡ増幅工程において、増幅により
生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、かつ
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌク
レオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測
定することからなる請求項第１項に記載の工程（ただし
該標識されたオリゴヌクレオチドは、前記第一および第
二のプライマーとは異なる配列である）。 - 【請求項３】前記プローブが、ＲＮＡ転写産物の少なく
とも一部の配列と相補結合するように設計され、複合体
を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するも
のであることを特徴とする請求項第２項に記載の検出方
法。 - 【請求項４】前記プローブが、配列番号２１から２３に
示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基
からなる配列、あるいはその相補配列であることを特徴
とする請求項第３項に記載の検出方法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001240874A JP2003047478A (ja) | 2001-08-08 | 2001-08-08 | 結核菌のｐａｂ遺伝子の検出法 |
| KR1020037004251A KR100984264B1 (ko) | 2001-07-25 | 2002-07-24 | 결핵균 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 및 방법 |
| PCT/JP2002/007508 WO2003010309A1 (fr) | 2001-07-25 | 2002-07-24 | Oligonucleotides utilises dans la detection du bacille de la tuberculose et procede correspondant |
| CNB028025067A CN100351374C (zh) | 2001-07-25 | 2002-07-24 | 用于检测结核分枝杆菌的寡核苷酸和方法 |
| AT02749365T ATE470710T1 (de) | 2001-07-25 | 2002-07-24 | Auf nasba basiertes detektionsverfahren zur detektion des tuberkelbazillus |
| EP02749365A EP1411117B1 (en) | 2001-07-25 | 2002-07-24 | NASBA based method for detecting mycobacterium tuberculosis |
| DE60236659T DE60236659D1 (de) | 2001-07-25 | 2002-07-24 | Auf NASBA basiertes Detektionsverfahren zur Detektion des Tuberkelbazillus |
| TW091116495A TWI243855B (en) | 2001-07-25 | 2002-07-24 | Oligonucleotides and process for detecting mycobacterium tuberculosis |
| US10/381,256 US7105319B2 (en) | 2001-07-25 | 2002-07-24 | Oligonucleotides for detecting tubercle bacillus and method therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001240874A JP2003047478A (ja) | 2001-08-08 | 2001-08-08 | 結核菌のｐａｂ遺伝子の検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003047478A true JP2003047478A (ja) | 2003-02-18 |
Family
ID=19071420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001240874A Pending JP2003047478A (ja) | 2001-07-25 | 2001-08-08 | 結核菌のｐａｂ遺伝子の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003047478A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000210090A (ja) * | 1998-11-19 | 2000-08-02 | Tosoh Corp | Ｈｃｖｒｎａに強く結合するオリゴｄｎａ及びそのようなｄｎａの簡便な製造方法 |
| WO2000075371A1 (fr) * | 1999-06-04 | 2000-12-14 | Tosoh Corporation | Procede d'amplification d'acide nucleique potentialise |
-
2001
- 2001-08-08 JP JP2001240874A patent/JP2003047478A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000210090A (ja) * | 1998-11-19 | 2000-08-02 | Tosoh Corp | Ｈｃｖｒｎａに強く結合するオリゴｄｎａ及びそのようなｄｎａの簡便な製造方法 |
| WO2000075371A1 (fr) * | 1999-06-04 | 2000-12-14 | Tosoh Corporation | Procede d'amplification d'acide nucleique potentialise |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7313537B2 (ja) | コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の検出方法 | |
| JP7313645B2 (ja) | Ｒｎａ検出方法 | |
| EP1134292B1 (en) | Oligonucleotides for detection of 'Vibrio parahaemolyticus' and detection method for 'Vibrio parahaemolyticus' using the same oligonucleotides | |
| JP4304976B2 (ja) | リボゾームｒｎａを標的とした抗酸菌の検出法 | |
| KR20100083133A (ko) | 레지오넬라속균 ｒＲＮＡ 증폭용 프라이머, 검출방법 및 검출 키트 | |
| EP1512753B1 (en) | Detection reagent for thermostable direct hemolysin-related hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus | |
| EP1411117B1 (en) | NASBA based method for detecting mycobacterium tuberculosis | |
| JP2003047478A (ja) | 結核菌のｐａｂ遺伝子の検出法 | |
| JP7191600B2 (ja) | ミュータンス菌の検出法 | |
| JP2003284565A (ja) | 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 | |
| JP2003289869A (ja) | 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 | |
| JP2002051778A (ja) | 小型球形ウイルス（ｓｒｓｖ）ｒｎａ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 | |
| JP7472476B2 (ja) | プライマー及び百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法 | |
| JP2002218999A (ja) | ジェノグループｉｉ型小型球形ウイルスｒｎａの検出法 | |
| EP1512754A1 (en) | Detection reagent for thermostable direct hemolysin gene of vibrio parahaemolyticus | |
| JP6967214B2 (ja) | 新規核酸合成法 | |
| JP2002281972A (ja) | サルモネラ検出のためのオリゴヌクレオチド及び検出法 | |
| JP2001258569A (ja) | 腸炎ビブリオ菌検出のためのオリゴヌクレオチド | |
| TW202242140A (zh) | 引子修飾組、試劑盒、用於對恆溫環型核酸擴增的擴增產物進行轉錄的方法以及用於對目標核酸進行檢測的方法 | |
| JP2001340087A (ja) | 腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝子の検出法 | |
| JP2003033182A (ja) | 結核菌検出のためのオリゴヌクレオチド | |
| JP2006158220A (ja) | マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）検出のためのオリゴヌクレオチドプライマー | |
| JP2001340086A (ja) | 腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒遺伝子の検出法 | |
| JP2001340088A (ja) | 腸炎ビブリオ菌の毒素遺伝子の検出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080709 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111018 |