TW202242140A

TW202242140A - 引子修飾組、試劑盒、用於對恆溫環型核酸擴增的擴增產物進行轉錄的方法以及用於對目標核酸進行檢測的方法

Info

Publication number: TW202242140A
Application number: TW111101112A
Authority: TW
Inventors: 李政旭; 朴素雁; 金珍蒂; 吳宰勳
Original assignee: 南韓商Ｌｇ化學股份有限公司; 浦項工科大學校產學協力團
Priority date: 2021-01-11
Filing date: 2022-01-11
Publication date: 2022-11-01
Also published as: KR20220101575A

Abstract

本發明是有關於一種修飾引子、引子修飾組、試劑盒、用於對恆溫環型核酸擴增的擴增產物進行轉錄的方法以及用於對目標核酸進行檢測的方法，所述修飾引子中啟動子已被插入至用於轉錄恆溫環型核酸擴增產物的恆溫環型核酸擴增引子中。根據本發明，藉由將恆溫環型核酸擴增反應的擴增產物轉錄成核糖核酸分子，可應用恆溫環型核酸擴增擴增技術的檢測系統的範圍可擴展至核糖核酸分子。

Description

用於轉錄恆溫環型核酸擴增產物之引子修飾結構以及其應用

[相關申請案的交叉參考]

本申請案主張基於2021年1月11日提出申請的韓國專利申請案第10-2021-0003090號的優先權權益，所述韓國專利申請案的全部內容併入本案供參考。 [技術領域]

本發明是有關於一種引子修飾結構以及其應用，所述引子修飾結構中啟動子已被插入至用於轉錄恆溫環型核酸擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）產物的LAMP引子中。

需求實時逆轉錄聚合酶連鎖反應（Real-time reverse transcription polymerase chain reaction，rRT-PCR）是最廣泛使用的核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）病毒檢測的實驗室方法，歸因於其在靈敏度及選擇性的卓越性。然而，rRT-PCR需要昂貴的專用設備及診斷專家來執行診斷反應，因此它不適合用作即時（point-of-care，POC）診斷。血清學測試是此種現場診斷的最合適的解決方案。然而，由於體內抗體的濃度低，很難檢測到RNA病毒感染初始階段中的抗體。由其他病毒感染引起的抗體的交叉反應是降低血清學測試特異性的一個因素。

為了克服限制，已經提出結合恆溫核酸擴增的現場檢測方法。其中一項技術是一種便攜式及對RNA病毒進行比色檢測的基於紙張的核酸診斷方法。序列特異性檢測機制依賴於支點開關（toehold switch），所述支點開關為一種合成的核糖開關（riboswitch）。在支點開關中，報道蛋白的轉譯起始位點被隱藏在莖與環結構（stem and loop structure）中。莖與環結構僅在反觸發（transtrigger）序列存在時才展開，所述反觸發序列是支點開關的互補序列。根據目標核酸序列來對支點及觸發對的序列進行設計使得能夠藉由對報道蛋白表達進行監測的簡單方式來檢測目標序列的存在。

為了提高檢測系統的靈敏度，基於核酸序列的擴增方法（例如恆溫擴增方法）已經與支點反應相結合。恆溫環型核酸擴增（LAMP）方法是恆溫擴增技術之一。它自目標基因選擇六個區，且使用至少四個引子藉由股替代反應對RNA或脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因進行擴增。此方法是一種具有快速擴增時間及高靈敏度的擴增技術，且最近已用於許多診斷研究。然而，由於LAMP擴增產物僅以DNA的形式獲得，因而此擴增方法具有限制性：僅可用於基於DNA的檢測系統（例如CRISPR 12a等）。

（專利文獻1）韓國未審查公開第10-2020-0003591號

（非專利文獻1）帕迪（Pardee，K.）等人，基於紙張的合成基因網路（Paper-based synthetic gene networks）。細胞2014，159，940至954。

（非專利文獻2）帕迪（Pardee，K.）等人，使用可程式化生物分子成分快速、低成本檢測寨卡病毒（Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components）。細胞2016，165，1255至1266。

[ 技術問題 ]

本發明人進行研究並致力於將恆溫環型核酸擴增（LAMP）方法可使用的檢測系統擴展至RNA分子。因此，本發明人藉由使用用於LAMP的修飾引子將啟動子序列添加至LAMP擴增產物，所述修飾引子中啟動子序列被插入至LAMP方法中使用的引子中。本發明人證實具有此種啟動子序列的LAMP擴增產物藉由轉錄成功地產生了RNA分子，因此完成本發明。

因此，本發明的一態樣提供一種用於恆溫環型核酸擴增（LAMP）的引子修飾組（modified primer set），所述引子修飾組使得LAMP擴增產物能夠轉錄。

本發明的另一態樣提供一種用於轉錄LAMP擴增產物的試劑盒。

本發明的又一態樣提供一種用於對LAMP擴增產物進行轉錄的方法。

本發明的再一態樣提供一種用於對目標核酸序列進行檢測的試劑盒。

本發明的其他一態樣提供一種用於對目標核酸序列進行檢測的方法。 [ 技術解決方案 ]

根據本發明的態樣，提供一種用於恆溫環型核酸擴增（LAMP）的引子修飾組，用於LAMP的所述引子修飾組包括：（a）正向外引子（F3），（b）正向內引子（FIP），（c）反向外引子（B3），以及（d）反向內引子（BIP），其中所述正向內引子（FIP）或者所述反向內引子（BIP）包含啟動子序列。

根據本發明的另一態樣，提供一種用於轉錄恆溫環型核酸擴增（LAMP）的擴增產物的試劑盒，所述試劑盒包括：用於LAMP的引子修飾組以及RNA聚合酶。

根據本發明的又一態樣，提供一種用於對恆溫環型核酸擴增（LAMP）的擴增產物進行轉錄的方法，所述方法包括以下步驟：（a）在目標核酸序列中選擇以下六個區的序列：F3、F2、F1、B1c、B2c及B3c；（b）製備包含正向外引子（F3）、正向內引子（FIP）、反向外引子（B3）及反向內引子（BIP）的引子組，其中所述正向內引子（FIP）或者所述反向內引子（BIP）包含啟動子序列，且使用所述引子組對所述目標核酸序列執行恆溫環型核酸擴增（LAMP）；以及（c）使恆溫環型核酸擴增（LAMP）的所述擴增產物與RNA聚合酶接觸。

根據本發明的又一態樣，提供一種用於對目標核酸序列進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包括：（a）用於LAMP的引子修飾組；（b）RNA聚合酶；以及（c）RNA分子檢測系統。

根據本發明的又一態樣，提供一種用於對目標核酸進行檢測的方法，所述方法包括以下步驟：（a）在目標核酸序列中選擇以下六個區的序列：F3、F2、F1、B1c、B2c及B3c；（b）製備包括正向外引子（F3）、正向內引子（FIP）、反向外引子（B3）及反向內引子（BIP）的引子組，其中所述正向內引子（FIP）或者所述反向內引子（BIP）包含啟動子序列，且使用所述引子組對推測包含所述目標核酸序列的樣品執行恆溫環型核酸擴增（LAMP）；（c）使恆溫環型核酸擴增（LAMP）的所述擴增產物與RNA聚合酶接觸，以產生RNA分子的轉錄物；以及（d）使所得的RNA分子的所述轉錄物與RNA檢測系統接觸。

[術語]

術語「擴增」是指增加核酸分子（例如基因或基因片段）的拷貝數。擴增的產物可被稱為擴增產物。體外擴增的實例包括聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction，PCR），其中一對寡核苷酸引子與樣品（例如生物樣品）在允許引子與樣品中的核酸分子雜交的條件下接觸。另外，體外擴增技術的其他實例包括實時PCR、定量實時PCR、逆轉錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）、定量RT-PCR（quantitative RT-PCR，qRT-PCR）、恆溫環型核酸擴增（LAMP）；逆轉錄LAMP（reverse-transcription LAMP，RT-LAMP）；股替代擴增（strand displacement amplification，SDA）（美國專利第5,744,311號）等。

術語「恆溫環型核酸擴增（LAMP）」指代一種對核酸進行擴增的方法。此方法是使用具有股替代活性的DNA聚合酶的單步驟擴增方法（納富（Notomi）等人，核酸研究（Nucl. Acids. Res.）28:E63，2000；長峰（Nagamine）等人，分子與細胞探針（Mol. Cell. Probes）16:223至229，2002；毛利（Mori）等人，生物化學與生物物理方法雜誌（J. Biochem. Biophys. Methods）59:145至157，2004）。一般而言，在LAMP方法中，使用特異於目標核酸序列內的六個區的四或更多個引子。引子為正向外引子（F3）、反向外引子（B3）、正向內引子（FIP）及反向內引子（BIP）。另外，為了提高擴增效率，可額外包括正向環型引子（Loop F，LF）及反向環型引子（Loop B，LB）。藉由LAMP反應生成具有莖與環結構、帶有目標核酸序列的反向重複的DNA。為了藉由LAMP反應對RNA序列進行擴增，可添加逆轉錄酶（reverse transcriptase，RT）。此種改良被稱為RT-LAMP。與PCR不同，LAMP及RT-LAMP可在恆定溫度下執行，且不需要熱循環儀。

術語「引子」是指短核酸分子，一般而言是長度為10個核苷酸或更多個核苷酸（例如，長度為10至100、10至95、10至90、10至85、10至80、10至75、10至70、10至65、10至60、15至60、15至50、15至45、15至40、20至40、20至50、25至50、25至60或30至60個核苷酸）的DNA寡核苷酸。引子可藉由核酸雜交與互補的目標核酸（DNA或RNA）股退火，且藉由DNA聚合酶沿著目標核酸股擴展。一對引子或一組引子（例如2、3、4、5、6或更多個引子）可用於藉由PCR、LAMP、RT-LAMP或其他已知的核酸擴增方法對目標核酸進行擴增。

術語「啟動子」是指DNA上被啟動單股RNA轉錄的酶（例如，RNA聚合酶）識別並結合的序列，且所述酶與DNA結合以啟動DNA下游的轉錄。在真核生物中，啟動子包含：包含轉錄開始位點及最近的上游的核心啟動子；包含距離轉錄開始位點約250個鹼基對（base pair，bp）的近端序列及主要調控元件的近端啟動子；以及特異性轉錄因子結合至的遠端啟動子。在原核生物（例如細菌）中，啟動子可在-10位處包含一致序列TATAAT，且在-35位處包含一致序列TTGACA，但不限於此。

術語「互補序列」是指核酸中單股核酸的鹼基能夠彼此形成匹配的鹼基對以穩定地形成雙股結構的核苷酸序列。舉例而言，與鹼基序列5'-C-A-T-G-3'互補的序列可為3'-G-T-A-C-5'序列。在本發明中，互補序列包括100%匹配的鹼基序列。另外，當鹼基序列部分匹配（例如99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%或75%匹配）時，但是若可穩定地形成雙股結構，則本發明中的互補序列亦包括此種序列。

術語「退火」是指具有互補鹼基序列的單股DNA分子或RNA分子藉由鹼基對之間的氫鍵形成穩定的雙股多核苷酸分子。

術語「接觸」是指將以固體或液體形式的二或更多種成分置於直接物理關聯狀態（physical association state）。舉例而言，此種接觸可在體外發生在一或多個引子與包含核酸的生物樣品之間。

術語「生物樣品」是自受試者（例如人類或非人類動物）獲得的樣品，且可包括例如流體、細胞及/或組織樣品。在一實施例中，生物樣品可為流體樣品，且可為血漿、尿液、血液、血清、糞便、唾液、腦脊液或支氣管肺泡灌洗液。

用於恆溫環型核酸擴增（LAMP）的引子修飾組

本發明的用於恆溫環型核酸擴增（LAMP）的引子修飾組包括（a）正向外引子（F3）、（b）正向內引子（FIP）、（c）反向外引子（B3）以及（d）反向內引子（BIP），且正向內引子（FIP）或反向內引子（BIP）包含啟動子序列。

在對本發明進行闡述時提到的四個引子、即正向外引子（F3）、正向內引子（FIP）、反向外引子（B3）及反向內引子（BIP）用於本發明所屬領域中熟習此項技術者眾所周知的恆溫環型核酸擴增（LAMP）方法（納富等人，核酸研究28:E63，2000；長峰等人，分子與細胞探針16:223至229，2002；毛利等人，生物化學與生物物理方法雜誌59:145至157，2004）。

本發明引子的結構及在恆溫環型核酸擴增（LAMP）過程中的功能將參照圖1更詳細地進行闡述。

本發明的所述四個引子被設計成具有與目標核酸上的六個區（F3區、F2區、F1區、B1c區、B2c區及B3c區）的序列對應的序列。

所述六個區可以[5'末端-F3區-F2區-F1區-目標區-B1c區-B2c區-B3c區-3'末端]的順序位於單股目標核酸上。

更具體而言，本發明的用於LAMP的引子修飾組用於對目標核酸序列進行擴增，所述目標核酸序列包含[5'末端-F3區-F2區-F1區-目標區-B1c區-B2c區-B3c區-3'末端]的順序的區。

在本發明中，目標核酸可為DNA分子或RNA分子。

如本文中所用，術語F1、F1c、F2、F2c、F3、F3c、B1、B1c、B2、B2c、B3及B3c用於指代或對目標核酸上的特定區、該些特定區的序列、引子本身或該些引子的序列進行闡述。術語中的小寫字母「c」旨在表示互補序列。

舉例而言，當術語「F3」指代目標核酸上的特定區時，可被闡述為「F3區」；當指代引子時，可被闡述為「F3」、「F3引子」或「引子F3」；當指代F3區的序列時，亦可被闡述為「F3序列」。

正向外引子（F3）包含能夠與F3c區的序列退火的序列，所述F3c區的序列具有與F3區的序列互補的序列。

反向外引子（B3）包含能夠與B3c區的序列退火的序列。

正向內引子（FIP）包含：F1c序列，能夠在5'末端至3'末端方向上與F1區的序列退火；以及F2序列，能夠與F2c區的序列退火。

反向內引子（BIF）包含：B1c序列，能夠在5'末端至3'末端方向上與B1區的序列退火；以及B2序列，能夠與B2c區的序列退火。

正向內引子（FIP）或反向內引子（BIP）包含啟動子序列。

啟動子序列可為能夠進行轉錄的任何啟動子序列、例如tac啟動子、lac啟動子、lacUV5啟動子、lpp啟動子、pLλ啟動子、pRλ啟動子、rac5啟動子、amp啟動子、recA啟動子、SP6啟動子、trp啟動子、T3啟動子及T7啟動子序列而不進行限制，但本發明不限於此。

在一實施例中，正向內引子（FIP）可包含F1c序列及F2序列，且啟動子序列可包含在F1c序列與F2序列之間。換言之，包含在正向內引子（FIP）中的啟動子序列可位於FIP引子中的F1c序列與F2序列之間。

在另一實施例中，正向內引子（FIP）可包含[5'末端-F1c序列-啟動子序列-F2序列-3'末端]順序的序列。

在另一實施例中，F1c序列、啟動子序列及F2序列可直接連接，但是亦可在不影響LAMP擴增及擴增產物的轉錄的範圍內在序列之間插入間隔序列。

在一實施例中，反向內引子（BIP）可包含B1c序列及B2序列，且啟動子序列可包含在B1c序列與B2序列之間。換言之，包含在反向內引子（BIP）中的啟動子序列可位於BIP引子中的B1c序列與B2序列之間。

在另一實施例中，反向內引子（BIP）可包含[5'末端-B1c序列-啟動子序列-B2序列-3'末端]順序的序列。

在另一實施例中，B1c序列、啟動子序列及B2序列可直接連接，但是亦可在不影響LAMP擴增及擴增產物的轉錄的範圍內在序列之間插入間隔序列。

在另一實施例中，包含在正向內引子（FIP）或反向內引子（BIP）中的啟動子序列可為啟動子序列的原始序列的序列、即有義股（sense strand），或者為與原始序列互補的序列的序列、即反義股（antisense strand）。

在另一實施例中，包含在正向內引子或反向內引子中的啟動子序列可為啟動子序列的原始序列的序列、即有義股。

在另一實施例中，包含在正向內引子或反向內引子中的啟動子序列可為與原始啟動子序列互補的序列的序列、即反義股。

本發明所屬領域中熟習此項技術者可適當地確定啟動子序列的類型及方向，以使考慮到目標核酸序列周圍的序列或啟動子序列插入至的序列周圍的序列可根據啟動子序列適當地發生轉錄。

在另一實施例中，當正向內引子（FIP）包含啟動子序列時，反向內引子（BIP）可不包含轉錄終止子序列。

在另一實施例中，用於恆溫環型核酸擴增（LAMP）的引子修飾組可額外地包含正向環型引子（LF）及/或反向環型引子（LB）以增加擴增效率。

恆溫環型核酸擴增（LAMP）的擴增產物的轉錄

根據本發明的另一態樣，提供一種用於轉錄恆溫環型核酸擴增（LAMP）的擴增產物的試劑盒，所述試劑盒包含上述用於LAMP的引子修飾組及RNA聚合酶。

在本發明中，當模板核酸為RNA分子時，LAMP擴增反應可為RT-LAMP反應。

本發明的LAMP反應或RT-LAMP反應中使用的DNA聚合酶可為任何能夠在LAMP反應中使用的DNA聚合酶而不進行限制，所述DNA聚合酶可由熟習此項技術者自已知技術或文獻容易地選擇。具體而言，可在本發明的LAMP或RT-LAMP反應中使用的DNA聚合酶可為具有高的股替代活性的DNA聚合酶，例如嗜熱細菌（例如嗜熱脂肪芽孢桿菌（ Bacillus stearothermophilus，Bst）、史密斯芽孢桿菌（ Bacillus Smithii，Bsm）、土芽孢桿菌（ Geobacillussp. M，GspM）或熱脫硫桿菌屬（ Thermodesulfatator indicus，Tin））的DNA聚合酶長片段（long fragment，LF）、其修飾變體或者Taq DNA聚合酶變體。

RT-LAMP反應中使用的逆轉錄酶可為任何適用於RT-LAMP反應的酶而不進行限制，且熟習此項技術者可容易地選擇合適的逆轉錄酶。舉例而言，可使用來源於禽成髓細胞增多症病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）的逆轉錄酶或莫洛尼鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）的逆轉錄酶，但本發明不限於此。

上述試劑盒在LAMP反應的情況下可更包含DNA聚合酶，或者在RT-LAMP反應的情況下可更包含逆轉錄酶及DNA聚合酶。

本發明的LAMP反應或RT-LAMP反應可藉由在包含DNA聚合酶及逆轉錄酶的合適的反應緩衝液中、在60℃至68℃的溫度下，使目標核酸模板與上述引子組反應達15分鐘至60分鐘來實行。

使用本發明的用於LAMP的上述引子修飾組執行LAMP反應，並使所得的LAMP擴增產物與RNA聚合酶接觸以進行反應，使得轉錄能夠進行並提供作為轉錄物的RNA分子。

在一實施例中，轉錄RNA分子包含位於目標核酸上的目標區的核苷酸序列。

考慮到轉錄效率，可選擇適合包含在正向內引子（FIP）或者反向內引子（BIP）中的啟動子序列的類型的RNA聚合酶。舉例而言，當將T7啟動子序列插入至正向內引子或者反向內引子中時，可選擇並使用T7 RNA聚合酶。

上述試劑盒可更包括額外的試劑，例如包含三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、胞苷三磷酸（cytidine triphosphate，CTP）、三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）及三磷酸尿苷（Uridine Triphosphate，UTP）的溶液、含有脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）的溶液、及/或用於轉錄反應的反應緩衝液。

上述額外的試劑可與引子組一起包含在同一容器中，或者可包含在與引子組分開的容器中。

根據本發明的又一態樣，提供一種用於對恆溫環型核酸擴增（LAMP）的擴增產物進行轉錄的方法，所述方法包括以下步驟：（a）在目標核酸序列中選擇以下六個區的序列：F3、F2、F1、B1c、B2c及B3c；（b）製備包含正向外引子（F3）、正向內引子（FIP）、反向外引子（B3）及反向內引子（BIP）的引子組，其中正向內引子（FIP）或反向內引子（BIP）包含啟動子序列，並使用所述引子組對目標核酸序列執行恆溫環型核酸擴增（LAMP）；以及（c）使恆溫環型核酸擴增的擴增產物與RNA聚合酶接觸。

如圖1中所示，所述六個區可以[5'末端-F3區-F2區-F1區-目標區-B1c區-B2c區-B3c區-3'末端]的順序位於單股目標核酸上。

在一實施例中，正向內引子（FIP）可包含F1c序列及F2序列，且啟動子序列可包含在F1c序列與F2序列之間。

在一實施例中，反向內引子（BIP）可包含B1c序列及B2序列，且啟動子序列可包含在B1c序列與B2序列之間。

在作為上述本發明的態樣的「用於恆溫環型核酸擴增（LAMP）的引子修飾組」中闡述的內容中，為避免說明書的複雜性，與「用於對恆溫環型核酸擴增（LAMP）的擴增產物進行轉錄的方法」及「用於轉錄的試劑盒」中的內容重疊的內容，例如關於目標核酸的序列及區、用於LAMP的引子、啟動子、LAMP擴增反應等的內容將不再贅述，且引用上述內容。

在一實施例中，恆溫環型核酸擴增（LAMP）產物的轉錄可為體外轉錄。

體外轉錄可藉由以下方式來實行：將RNA聚合酶、DNA模板、ATP、CTP、GTP及UTP（其等為用於轉錄反應所必需的成分）在包含反應緩衝液的試管或微管中在室溫（例如20℃至40℃）下反應2小時至4小時。

由於體外轉錄是熟習此項技術者熟知的，熟習此項技術者可容易地選擇適當的反應條件。

用於對目標核酸序列進行檢測的試劑盒及檢測方法

根據本發明的又一態樣，提供一種用於對目標核酸序列進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包括：用於LAMP的上述引子修飾組；（b）RNA聚合酶；以及（c）RNA分子檢測系統。

在實施例中，RNA分子檢測系統可為核糖開關（riboswitch）。

在另一實施例中，核糖開關可為支點開關。

支點開關包括目標核酸序列、報道蛋白編碼核苷酸序列、報道蛋白編碼核苷酸序列的轉譯起始位點以及核糖體結合位點（ribosome binding site，RBS）序列，且轉譯起始位點隱藏在支點開關中形成的莖與環二級結構中（細胞，2014年11月6日；159（4）：925至939）。

當具有與支點開關的目標核酸序列互補的序列的RNA分子存在時，具有所述互補序列的RNA分子與支點系統的目標核酸序列結合形成雙股結構。藉此，莖與環結構展開，且報道蛋白的轉譯啟動。

報道蛋白可為任何具有藉由顯色、變色或螢光等檢測允許容易地確認目標核酸序列存在的性質的蛋白質而不進行限制，舉例而言，β-半乳糖苷酶（beta-galactosidase，LacZ）、氯黴素乙醯轉移酶（chloramphenicol acetyltransferase，Cat）、綠色螢光蛋白（green fluorescent protein，Gfp）、紅色螢光蛋白（red fluorescent protein，Rfp）或螢光素酶（luciferase enzyme，Luc），但本發明不限於此。

轉譯起始位點是指核苷酸序列上核糖體結合且第一個轉運RNA（transfer RNA，tRNA）起始轉譯的位置，且通常可包括「AUG」序列。

核糖體結合位點（RBS）是存在於信使RNA（messenger RNA，mRNA）轉錄物的開始密碼子上游的核苷酸序列，且指代能夠在蛋白質轉譯起始期間獲取核糖體的序列。

在一實施例中，用於對目標核酸序列進行檢測的試劑盒可更包含DNA聚合酶、或者逆轉錄酶及DNA聚合酶。

在另一實施例中，用於對目標核酸序列進行檢測的試劑盒可更包括額外的試劑，例如包含ATP、CTP、GTP及UTP的溶液、包含dNTP的溶液、及/或用於轉錄反應的反應緩衝液。

用於對目標核酸序列進行檢測的試劑盒可更包括一或多種試劑（例如，能夠對報道蛋白的存在進行檢測的比色試劑）。

根據本發明的又一態樣，提供一種對目標核酸序列進行檢測的方法，所述方法包括以下步驟：（a）在目標核酸序列中選擇以下六個區的序列：F3、F2、F1、B1c、B2c及B3c；（b）製備包含正向外引子（F3）、正向內引子（FIP）、反向外引子（B3）及反向內引子（BIP）的引子組，其中正向內引子（FIP）或反向內引子（BIP）包含啟動子序列，且使用所述引子組對推測包含目標核酸序列的樣品執行恆溫環型核酸擴增（LAMP）；（c）使恆溫環型核酸擴增的擴增產物與RNA聚合酶接觸，以產生RNA分子的轉錄物；以及（d）使所得的RNA分子的轉錄物與RNA檢測系統接觸。

目標核酸可自待檢測受試者的生物樣品分離或純化，且可為DNA分子或RNA分子。

在另一實施例中，F1c序列、啟動子序列及F2序列可直接連接，但亦可在不影響LAMP擴增及擴增產物的轉錄的範圍內在序列之間插入間隔序列。

在作為上述本發明的態樣的「用於恆溫環型核酸擴增（LAMP）的引子修飾組」中闡述的內容中，為避免說明書的複雜性，與「用於對目標核酸序列進行檢測的試劑盒及檢測方法」中的內容重疊的內容，例如關於目標核酸的序列及區、用於LAMP的引子、啟動子、LAMP擴增反應等的內容將不再贅述，且引用上述內容。

在另一實施例中，RNA檢測系統可為支點開關。

在另一實施例中，步驟（c）中使LAMP擴增產物與RNA聚合酶接觸的步驟可在體外轉錄系統中實行。

在另一實施例中，使作為所得轉錄物的RNA分子與RNA檢測系統接觸的步驟可在體外轉譯系統中實行。

由於體外轉錄及體外轉譯系統是熟習此項技術者已知的，因此熟習此項技術者可容易地選擇適當的系統。

用於對目標核酸序列進行檢測的方法可在步驟（d）之後更包括在RNA檢測系統中檢測訊號的步驟。

所述訊號可為由表達的報道蛋白引起的顯色、變色或螢光的訊號。 [有利效果]

根據本發明，藉由將LAMP反應的擴增產物轉錄成RNA分子，可將可應用LAMP擴增技術的檢測系統的範圍擴展至RNA分子。

在下文中，將藉由實施例詳細地闡述本發明。然而，對於熟習此項技術者而言顯而易見的是：以下實例僅對本發明進行具體例示；且本發明的範圍不應被解釋為受以下實例的限制。

實例1：使用已插入至啟動子中的引子的RT-LAMP反應

本發明人對LAMP方法中所使用的引子進行修飾，以使LAMP擴增產物可轉錄成RNA。

LAMP反應基本上需要如下四種類型的引子：正向內引子（FIP）、反向內引子（BIP）、正向外引子（F3）及反向外引子（B3）。

藉由參照圖1對藉由LAMP方法進行目標核酸的擴增過程進行闡述。反向內引子（BIP）與目標核酸模板結合，且發生逆轉錄。然後，反向外引子（B3）亦與目標核酸模板結合並對鏈進行替代，並將由反向內引子（BIP）形成的核酸股分離。此成為正向內引子（FIP）再次與之結合的在一側呈環形狀的單核酸股。正向外引子（F3）進一步與之結合，並將由正向內引子（FIP）產生的核酸股分離。它具有在兩側具有環型結構的啞鈴狀結構，此為進行擴增的關鍵結構且隨後用於對擴增進行循環的步驟中。內引子與啞鈴狀結構結合，且目標核酸分子發生延伸及擴增。

為了將LAMP擴增產物轉錄成RNA分子，本發明人在所述四個引子中在正向內引子（FIP）內的F1c序列與F2序列之間插入T7啟動子序列，並確認是否執行轉錄。另外，將T7終止子插入至反向內引子（BIP）中，並確認是否執行擴增。另外，關於插入的T7啟動子序列的方向，分為其中將T7啟動子的原始（直接）序列插入至FIP引子中的情況及其中將T7啟動子的互補序列插入至FIP引子中的情況，且確認效果。LAMP擴增後，藉由擴增產物的電泳確認在凝膠上是否執行LAMP擴增。當執行擴增時，出現寬的拖帶。

作為用於LAMP擴增的核酸模板，使用中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）序列的一部分。MERS-CoV基因組的核苷酸序列自基因庫（GenBank）（登錄號：JX869059）獲得。將T7啟動子序列插入MERS-CoV序列的一部分的上游，且使用T7 RNA聚合酶（紐英倫生物技術（New England Biolabs），美國，伊普斯維奇）實行轉錄反應。使用脫氧核糖核酸酶I（DNase I）（寶生物有限公司（Takara Bio Inc .），日本，野路東）對自轉錄獲得的RNA分子進行處理，並使用日博克萊爾（Riboclear）（全基因生物科技有限公司（GeneAll Biotechnology Co .，LTD.），南韓，首爾）進行純化。將如此轉錄的RNA分子用作模板，且使用添加啟動子及終止子的修飾LAMP引子執行RT-LAMP反應。對於RT-LAMP反應，將在最佳化的緩衝液中包含股替代DNA聚合酶及逆轉錄酶的沃斯塔特（WarmStart）LAMP試劑盒2X主混合物（Master Mix）（紐英倫，E1700；50%）、10X引子混合物[16微莫耳/升的FIP或插入T7啟動子的FIP、16微莫耳/升的BIP或插入T7終止子的BIP、2微莫耳/升的F3引子、以及2微莫耳/升的B3引子]、以及目標RNA模板（40%）在室溫下混合。在使混合物能夠反應後，將反應混合物在加熱塊中於65℃下溫育60分鐘，然後藉由在80℃下溫育5分鐘進行熱滅活。

在LAMP擴增實驗中使用的T7啟動子、T7終止子、LAMP引子及其中已插入T7啟動子或T7終止子的修飾LAMP引子中的每一序列在下表1中顯示。

[表1]

序列ID編號：	序列（5'→3'）	說明
1	TAATACGACTCACTATAGGG	T7啟動子
2	TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG	T7終止子
3	ACCATCTGAGAAATTACCAACTGAATAATACGACTCACTATAGGGGCTACTATACGAAAAATTTACCCT	修飾的正向內引子；T7啟動子（5' F1c-7啟動子-F2 3'）
4	ACCATCTGAGAAATTACCAACTGAACCCTATAGTGAGTCGTATTAGCTACTATACGAAAAATTTACCCT	修飾的正向內引子；T7啟動子互補序列（5' F1c-7啟動子-F2 3'）
5	CCGATGGATGTGGCACTTTACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCAG GACAATGATTTCCAGAG	修飾的反向內引子；T7終止子（5' B1c-T7終止子-F2 3'）
6	CCGATGGATGTGGCACTTTACCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACA GGACAATGATTTCCAGAG	修飾的反向內引子；T7終止子互補序列（5' B1c-T7終止子互補序列-B2 3'）
7	CCGATGGATGTGGCACTTTACCAGCAGGACAATGATTTCC	不具有T7終止子的修飾的反向內引子（5' B1c-B2 3'）
8	ATTAGCCCATCTACCAGC	正向外引子
9	TGGCAAAAGAAGTATAGGAATT	反向外引子

如圖2中所示，實驗結果顯示在其中插入終止子（T _T7）的模型中沒有發生擴增。同時，在其中未插入終止子（T _T7）的模型中，當T7啟動子（P _T7）序列的互補序列被插入至正向內引子（FIP）中時，發生擴增。

實例2：使用支點開關系統對LAMP擴增產物的轉錄反應進行驗證

使用作為RNA分子檢測系統的支點開關對實例1中獲得的RT-LAMP擴增產物實際上是否被轉錄進行確認（參見圖3）。

在支點開關中，不發生轉譯，但是當目標核酸序列存在時，開始密碼子序列周圍的二級結構解開，且轉譯啟動。lacZ基因被用作待轉譯的基因。轉譯的蛋白質將叫做氯酚紅-D-吡喃半乳糖苷（chlorophenol red-D-galactopyranoside，CPRG）的黃色化學物質轉化為叫做氯酚紅（chlorophenol red，CPR）的紫色化學物質。因此，可在視覺上確認目標核酸分子序列的存在或不存在。藉由量測在570奈米下的吸光度來對紫色度進行量化。該些反應是在包含對於轉錄及轉譯必需物質的條件下實行。支點開關的序列及目標核酸的序列如下表2中所示。

[表2]

序列ID編號：	序列（5'→3'）	說明
10	TAATACGACTCACTATAGGG AAAGAACTAGAGTATGATTGAAGAAGCGGCCCATTTGGACTTTAGAACAGAGGAGATAAAGATG *AAATGGGCCGCA* AACCTGGCGGCAGCGCAAAAGATGCGTAAA	MERS-CoV目標支點開關
11	AAAUGGGCCGCUUCUUCAAUCAUACUCUAGUUCUUU	MERS-CoV目標核酸序列
12	TAATACGACTCACTATAGGGTCGTCCGTATAGGAGCAGCTGCCAATTCCACTGGCACTGTTATTATTAGCCCATCTACCAGCGCTACTATACGAAAAATTTACCCTGCTTTTATGCTGGGTTCTTCAGTTGGTAATTTCTCAGATGGTAAAATGGGCCGCTTCTTCAATCATACTCTAGTTCTTTTGCCCGATGGATGTGGCACTTTACTTAGAGCTTTTTATTGTATTCTAGAGCCTCGCTCTGGAAATCATTGTCCTGCTGGCAATTCCTATACTTCTTTTGCCACTTATCACACTCCTGCAACAGATTGTTCTGATGGCAATTACAATCGTAATG	被設計成包含MERS-CoV目標核酸序列的模板序列

在以上表2中，支點開關的序列（序列ID編號:10）具有 T7 啟動子+目標核酸序列（a+b）+保守序列+ 目標核酸序列的一部分的互補序列（ b 的互補序列） +保守序列的結構。如下製備用於無細胞反應的紙片。在121℃下將濾紙（沃特曼（Whatman），1442-042）高壓滅菌90分鐘，並在5%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）（西格瑪（Sigma），A2153）中封閉過夜。使用無核酸酶的水對封閉的紙清洗三次，並在65℃下在乾燥烘箱中乾燥。使用配備有活塞的活組織檢查打孔機（biopsy punch）（內徑2毫米，泰德派拉（Ted pella），15110-20）將紙打孔成圓盤狀，並放置在384孔板（康寧（Corning），3540）上並使用。在包括體外蛋白質合成試劑盒（紐英倫，E6800）的溶液A（40%）、溶液B（30%）、CPRG（西格瑪，59767，0.6毫克/毫升；4%）、核糖核酸酶抑制劑（紐英倫，M0314L；2%）、對支點開關進行編碼的DNA（線性DNA 90奈克/微升至100奈克/微升；8%）以及藉由LAMP或無核酸酶水擴增的觸發RNA（16%）中實行用於體外轉錄及轉譯的無細胞反應。將無細胞的反應混合物（1.8微升）裝載至製備的紙片上，並在37℃下使用讀板儀（美谷分子（Molecular Devices），光譜麥克斯（SpectraMax）ABS）量測570奈米下的吸光度。自所有樣品的吸光度減去樣品的背景吸光度，所述樣品中不存在支點開關及目標基因。藉由對具有目標基因的樣品的吸光度除以不具有目標基因的樣品的吸光度的倍數變化值進行計算來對反應進行量化。

如圖4中所確認的，實驗結果顯示，僅具有T7啟動子的互補序列而不具有終止子的模型顯示出高的倍數變化值及支點開關反應（參加圖4，b）。即，當包含T7啟動子序列的互補序列且不存在終止子序列時，可能發生擴增以產生RNA轉錄物。其原因在於在圖1的步驟7中FIP所附接至的環型區的結構存在差異。

具體而言，在步驟7中，FIP可由5'-F1c-F2-3'組成且FIP的F2結合至單股環型區的F2c區，並發生延伸。當包含T7啟動子互補序列時，在環型區內的F2c區中不形成二級結構。因此，FIP的F2區可容易地進行互補結合，且可發生延伸及擴增。同時，當包含T7啟動子序列時，可在F2c區中形成二級結構。二級結構干擾FIP的F2區與F2c區的結合，且因此，不會發生延伸，且亦可不發生擴增。二級結構可為髮夾結構（hairpin structure）。

以上圖5顯示在圖1的步驟7中藉由包含T7啟動子序列的FIP獲得的結構、以及在圖1的步驟7中藉由包含T7啟動子互補序列的FIP獲得的結構。

參照圖5，可確認當包含T7啟動子的互補序列時，步驟7中FIP應附接至的環型區（F2c）作為完整的單股環型結構產生。相反，可證實當包含T7啟動子序列時，F2c不作為完整的單股存在，而是形成部分髮夾結構。

因此，當在步驟7中插入常規T7啟動子序列時，可能不形成單股環型結構，且因此，較佳為插入T7啟動子的互補序列。

此外，參照圖4，可發現即使包括T7啟動子的互補序列，包含終止子序列的BIP引子亦不發生擴增，且只有其中不存在終止子序列的BIP引子才發生擴增。具體而言，當終止子序列存在時，由於終止子序列中不可避免地包含的髮夾結構，B2c部分可能難以形成單股環型結構，且各種結構可能由終止子序列形成。藉此，不可能形成單股、完整的環型結構，且可能不發生擴增。即，可被視為類似於如上所述其中T7啟動子序列包含在FIP中的情況的情況。終止子序列可能干擾B2c區的單股環型結構的形成。

相反，當包含T7啟動子的互補序列且不存在終止子序列時，可形成單股環型結構而不受二級結構的干擾。因此，FIP的F2與F2c發生結合，且擴增後可提高RNA轉錄效率。根據本發明，藉由以上圖4，已經證明在FIP包含T7啟動子的互補序列且BIP不具有終止子的條件下，使用用於LAMP的修飾引子使LAMP的擴增產物擴增及轉錄。

儘管上面已經闡述本申請案的代表性實施例，但是本申請的範圍不限於如上所述的具體實施例，熟習此項技術者可在本申請案的申請專利範圍中闡述的範圍內對本申請案進行變化。

無

圖1顯示本發明的恆溫環型核酸擴增（LAMP）過程。圖2是確認產生擴增產物的凝膠照片，所述擴增產物是藉由使用具有引子序列的正向內引子（FIP）與具有或不具有終止子序列的反向內引子（BIP）執行恆溫環型核酸擴增（LAMP）獲得的。圖3是顯示將本發明的改良恆溫環型核酸擴增（LAMP）方法與支點開關相結合來檢測目標RNA序列的策略的示意性例示。圖4顯示使用支點開關檢測系統確認本發明的改良恆溫環型核酸擴增（LAMP）中擴增產物轉錄的結果。圖5顯示在圖1中的步驟7中藉由包含T7啟動子序列的FIP獲得的結構、以及在圖1中的步驟7中藉由包含T7啟動子互補序列的FIP獲得的結構。

<![CDATA[<110>    LG 化學股份有限公司]]>
                   浦項工科大學校產學協力團
          <![CDATA[<120>    用於轉錄恆溫環型核酸擴增產物]]>
                   之引子修飾結構以及其應用
          <![CDATA[<130>    2021-OPLC-6417/TW/EKL/HSK]]>
          <![CDATA[<150>    KR KR 10-2021-0003090]]>
          <![CDATA[<151>    2021-01-11]]>
          <![CDATA[<160>    12]]>
          <![CDATA[<170>    KoPatentIn 3.0]]>
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          taatacgact cactataggg                                                     20
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          tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttg                       47
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          accatctgag aaattaccaa ctgaataata cgactcacta taggggctac tatacgaaaa         60
          atttaccct                                                                 69
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          atttaccct                                                                 69
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          gttttttgca ggacaatgat ttccagag                                            88
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          ttatgctaca ggacaatgat ttccagag                                            88
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          ccgatggatg tggcacttta ccagcaggac aatgatttcc                               40
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          attagcccat ctaccagc                                                       18
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          tggcaaaaga agtataggaa tt                                                  22
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          taatacgact cactataggg aaagaactag agtatgattg aagaagcggc ccatttggac         60
          tttagaacag aggagataaa gatgaaatgg gccgcaaacc tggcggcagc gcaaaagatg        120
          cgtaaa                                                                   126
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          aaaugggccg cuucuucaau cauacucuag uucuuu                                   36
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          <![CDATA[<223>    包含MERS-Cov目標核酸序列的模板序列]]>
          <![CDATA[<400>    12]]>
          taatacgact cactataggg tcgtccgtat aggagcagct gccaattcca ctggcactgt         60
          tattattagc ccatctacca gcgctactat acgaaaaatt taccctgctt ttatgctggg        120
          ttcttcagtt ggtaatttct cagatggtaa aatgggccgc ttcttcaatc atactctagt        180
          tcttttgccc gatggatgtg gcactttact tagagctttt tattgtattc tagagcctcg        240
          ctctggaaat cattgtcctg ctggcaattc ctatacttct tttgccactt atcacactcc        300
          tgcaacagat tgttctgatg gcaattacaa tcgtaatg                                338

Claims

一種用於恆溫環型核酸擴增（LAMP）的引子修飾組，所述用於恆溫環型核酸擴增的引子修飾組包括：（a）正向外引子（F3），（b）正向內引子（FIP），（c）反向外引子（B3），以及（d）反向內引子（BIP），其中所述正向內引子（FIP）或者所述反向內引子（BIP）包含啟動子序列。
如請求項1所述的用於恆溫環型核酸擴增的引子修飾組，其中所述正向內引子（FIP）包含F1c序列及F2序列，且所述啟動子序列被包含在所述F1c序列與所述F2序列之間。
如請求項1所述的用於恆溫環型核酸擴增的引子修飾組，其中所述反向內引子（BIP）包含B1c序列及B2序列，且所述啟動子序列被包含在所述B1c序列與所述B2序列之間。
如請求項1所述的用於恆溫環型核酸擴增的引子修飾組，其中所述反向內引子（BIP）不包含終止子序列。
一種用於轉錄恆溫環型核酸擴增（LAMP）的擴增產物的試劑盒，所述試劑盒包括：（a）如請求項1至4中任一項所述的用於恆溫環型核酸擴增的引子修飾組；以及（b）核糖核酸聚合酶。
一種用於對恆溫環型核酸擴增（LAMP）的擴增產物進行轉錄的方法，所述方法包括以下步驟：（a）在目標核酸序列中選擇以下六個區的序列：F3、F2、F1、B1c、B2c及B3c；（b）製備包含正向外引子（F3）、正向內引子（FIP）、反向外引子（B3）及反向內引子（BIP）的引子組，其中所述正向內引子（FIP）或者所述反向內引子（BIP）包含啟動子序列，且使用所述引子組對所述目標核酸序列執行恆溫環型核酸擴增（LAMP）；以及（c）使所述恆溫環型核酸擴增（LAMP）的所述擴增產物與核糖核酸聚合酶接觸。
如請求項6所述的用於對恆溫環型核酸擴增（LAMP）的擴增產物進行轉錄的方法，其中所述正向內引子（FIP）包含F1c序列及F2序列，且所述啟動子序列被包含在所述F1c序列與所述F2序列之間。
如請求項6所述的用於對恆溫環型核酸擴增（LAMP）的擴增產物進行轉錄的方法，其中所述反向內引子（BIP）包含B1c序列及B2序列，且所述啟動子序列被包含在所述B1c序列與所述B2序列之間。
一種用於對目標核酸序列進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包括：（a）如請求項1至4中任一項所述的用於恆溫環型核酸擴增的引子修飾組；（b）核糖核酸聚合酶；以及（c）核糖核酸分子檢測系統。
如請求項9所述的用於對目標核酸序列進行檢測的試劑盒，其中所述核糖核酸檢測系統是支點開關。
一種用於對目標核酸進行檢測的方法，包括以下步驟：（a）在目標核酸序列中選擇六個區的序列：F3、F2、F1、B1c、B2c及B3c；（b）製備包括正向外引子（F3）、正向內引子（FIP）、反向外引子（B3）及反向內引子（BIP）的引子組，其中所述正向內引子（FIP）或者所述反向內引子（BIP）包含啟動子序列，且使用所述引子組對推測包含所述目標核酸序列的樣品執行恆溫環型核酸擴增（LAMP）；（c）使所述恆溫環型核酸擴增（LAMP）的擴增產物與核糖核酸聚合酶接觸，以產生核糖核酸分子的轉錄物；以及（d）使所得的核糖核酸分子的所述轉錄物與核糖核酸檢測系統接觸。
如請求項11所述的用於對目標核酸進行檢測的方法，其中所述正向內引子（FIP）包含F1c序列及F2序列，且所述啟動子序列被包含在所述F1c序列與所述F2序列之間。
如請求項11所述的用於對目標核酸進行檢測的方法，其中所述反向內引子（BIP）包含B1c序列及B2序列，且所述啟動子序列被包含在所述B1c序列與所述B2序列之間。
如請求項11所述的用於對目標核酸進行檢測的方法，其中所述核糖核酸檢測系統是支點開關。