CN113966398A

CN113966398A - 包含靶结合结构域的核酶

Info

Publication number: CN113966398A
Application number: CN202080043461.0A
Authority: CN
Inventors: 侯诗盈; 高崇慧; 林妤庭
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2022-01-21
Also published as: WO2020209803A1; EP3953472A1; SG11202111264TA; EP3953472A4; US20220228145A1

Abstract

本申请公开了一种包含靶结合结构域的核酶，所述靶结合结构域用于结合靶RNA分子。所述核酶进一步包含一个或多个催化结构域和侧翼为两个核酶切割位点的一个或多个可释放RNA区段，其中通过靶RNA分子的催化结构域的激活导致在核酶切割位点的切割，这导致可释放RNA区段从核酶中释放。本申请进一步公开了所述核酶用于检测靶RNA分子的存在或扩增靶RNA分子的用途。

Description

包含靶结合结构域的核酶

相关申请的交叉引用

本申请要求保护2019年4月12日提交的新加坡临时申请号10201903323U的优先权的权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中以用于所有目的。

发明领域

本发明涉及生物化学领域，具体而言涉及分子生物学领域。具体而言，本发明涉及经工程改造以包含一个或多个靶结合结构域的核酶。

发明背景

尽管常认为RNA仅作为遗传而得的遗传密码(DNA)及其功能输出(蛋白质)之间的中间信使，但目前非常清楚的是，细胞和个体中的编码和非编码RNA二者的水平和概况，在其信使功能之外还展示大量信息。尽管医生传统上依赖病史、症状、活组织检查及其他操作来形成诊断，但随着先进测序和个性化用药的出现，检测和测定各种类型的RNA分子目前对于指导临床决策而言日渐重要。

特别关注的一类RNA分子为微小RNA(miRNA)。miRNA为结合并下调靶mRNA的内源短链非编码RNA，其在许多人类疾病中为失调的。miRNA表达特征(signature)与患者诊断、疾病分期、预后和应答相关。重要的是，发现miRNA在血液中循环，这允许以最小程度的侵入式操作来对其检测。与疾病和治疗应答的miRNA特征有关的数据持续增加，以及至今已有超过100项临床试验并入miRNA作为生物标志物。尽管有用于测定miRNA的临床方法(大部分基于RT-qPCR)，但由于生物样品(例如血清)中的miRNA的浓度常常极低，所以在检测之前，样品常常首先需要RNA纯化和浓缩。这些操作需要经由DNA中间体的反转录。因此，无需使用蛋白酶或利用DNA中间体便可在生物样品中直接扩增靶miRNA或放大其信号的工具和方法，可提升我们进行廉价且有效的RNA检测的能力。

检测RNA分子的能力亦对诊断病毒感染极其重要。存在至少47个RNA病毒家族。数个RNA病毒家族导致具有重大疾病负荷的疾病：严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)(其导致COVID-19)、埃博拉、SARS、西尼罗热、丙型肝炎、流行性感冒和麻疹，而其他RNA病毒家族与导致严重作物减产的植物病毒相关，例如马铃薯Y病毒(PVY)。在病毒性疾病爆发期间，用于诊断的灵敏、方便、可靠且迅速的方法对于快速遏制而言为至关重要的。目前用于诊断RNA病毒感染的常规方法主要基于PCR(尤其是用于新型病毒；虽然可开发血清学检验，但通常并非广泛使用的)，且需要首先将样品中的RNA分离并反转录成cDNA，然后用特异性引物扩增，之后使用荧光染料用RT-qPCR检测扩增产物。这需要昂贵的试剂、专业的设备和先进的技能组合来进行分析。因为样品必须送至专业实验室，所以这减慢了爆发期间的诊断。如DETECTR(Chen等，CRISPR-Cas12a靶结合释放无差别单链DNA酶活性(CRISPR-Cas12a target-binding unleashes indiscriminate single-stranded DNaseactivity).Science 2018)和SHERLOCK(Gootenberg,J.S.等，使用Cas13、Cas12a和Csm6的多重便携式核酸检测平台(Multiplexed and portable nucleic acid detectionplatform with Cas13,Cas12a,and Csm6).Science 360，439-444，doi:10.1126/science.aaq0179(2018))等基于CRISPR的技术显示床旁(point-of care,POC)检测的前景，但需要使用昂贵的等温扩增酶和CRISPR试剂的扩增。在开发用于病毒RNA的低成本诊断的过程中的主要障碍为缺少无需酶和通过DNA中间体便可直接扩增和检测RNA的方法。

总之，需要提供用于扩增和检测靶RNA分子或其信号的简单且有效的工具，这将使用于不同诊断应用的RNA标志物和病毒RNA的快速有效检测成为可能。

发明概述

在一方面，本公开内容涉及一种核酶，其包含：a)一个或多个催化结构域，所述催化结构域能够在活性状态和无活性状态之间转换；b)一个或多个可释放RNA区段，其中所述可释放RNA区段各自侧翼为两个核酶切割位点，其中每个切割位点被活性状态的一个或多个催化结构域的至少一个切割；c)一个或多个靶结合结构域，所述一个或多个靶结合结构域的每个用于结合靶RNA分子；其中所述一个或多个催化结构域的每个与所述一个或多个靶结合结构域之一连接，其中当与催化结构域连接的靶结合结构域未结合靶RNA分子时，所述催化结构域呈无活性状态，而其中当与催化结构域连接的靶结合结构域结合了靶RNA分子时，所述催化结构域呈活性状态；以及其中当位于可释放RNA区段侧翼的两个切割位点均被所述一个或多个催化结构域切割时，所述一个或多个可释放RNA区段从所述核酶中释放。

在另一方面，本公开内容涉及检测样品中靶RNA分子的存在的方法，其中所述方法包括：a)将样品与本公开内容的核酶一起在温度T1孵育，这允许靶RNA分子的与包含在所述核酶中的一个或多个靶结合结构域结合；b)将样品在温度T2孵育，这允许靶RNA分子和可释放RNA区段从所述核酶中释放；c)检测可释放RNA区段从所述核酶中的释放。

在又另一方面，亦提供了扩增靶RNA分子的方法，其中所述方法包括：a)将靶RNA分子与本公开内容的核酶一起在温度T1孵育，这允许所述靶RNA分子与包含在所述核酶中的一个或多个靶结合结构域结合，以及其中可释放RNA区段包含与所述靶RNA分子一致的序列；b)将结合靶RNA分子的核酶在温度T2孵育，这允许所述靶RNA分子和RNA区段从所述核酶中释放。在另一个实施例中，将步骤a)至b)重复一次或多次，其中从步骤b)释放的靶RNA分子和可释放RNA区段用于结合所述核酶的另一个拷贝。

在又另一方面，提供了在受试者中诊断疾病的方法，所述方法包括：a)获得来自受试者的样品；b)将所述样品与本公开内容的核酶一起在温度T1孵育，这允许疾病相关的靶RNA分子与包含在所述核酶中的一个或多个靶结合结构域结合；c)将所述样品在温度T2孵育，这允许所述靶RNA分子和可释放RNA区段从所述核酶中释放；d)检测来自所述核酶的可释放RNA区段的水平。

在又另一方面，提供了编码本公开内容的核酶的多核苷酸。在其中核酶由多于一条RNA链组成的一些实施例中，所述RNA链可由一个多核苷酸一起编码或者由数个多核苷酸独立编码。

在另一方面，进一步提供了包括本公开内容的核酶的试剂盒。

附图简述

当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详述将更好地理解本发明，其中：

图1(A-I).本公开内容的核酶形成的示例性且非限制性的结构。基序的标记与发明详述中结构I-V的标记一致。(A-C)由一条RNA链形成并具有一个靶结合结构域的核酶的实例。图A的核酶特征在于在可释放RNA区段(基序[E])的任一侧形成两个4路连接头，具有基于所述4路连接头结构之一的螺旋中的一个的延伸的催化结构域(基序[C]和[c])、任选的抑制结构域(基序[B]和[b])和靶结合结构域(基序[A]和[a])。除了由基序[D]和基序[e]之间的区域形成的4路连接头替换成3路连接头(图B)或2路连接头(图C)之外，图B和C的核酶采用与图A类似的结构。(D-I)由两条RNA链形成并具有两个靶结合结构域的核酶的实例。图D的核酶特征在于在可释放RNA区段的任一侧形成两个4路连接头，每一侧包含催化结构域、任选的抑制结构域以及靶结合结构域。除了4路连接头替换成3路连接头和2路连接头之外，图E和F的核酶采用与图D类似的结构。图D-F中的每个核酶可被认为是串联核酶，由两个“单核酶”反向连接(因此为“反向连接的串联核酶”)，所述两个“单核酶”展示近似“镜像”方向。而图G-I的核酶亦可被认为是由两个“单核酶”连接的串联核酶，所述两个“单核酶”采用相同的方向(因此命名为“重复串联核酶”)。图G的核酶特征在于在可释放RNA区段的任一侧形成两个4路连接头。除了4路连接头之一替换成3路连接头(图H)或2路连接头(图I)之外，H和I的核酶采用与图G的核酶类似的结构。箭头指示核酶上的切割位点。

图2.所述核酶作为RNA传感器和放大器的工作原理。连接(催化结构域的)基序[c]与(靶结合结构域的)基序[a]的可变基序[b]，将其设计成与催化结构域的基序[C]具有互补性。上图：不存在靶RNA分子时，[b]和[C]之间的结合充当“toehold”以将自切割降至最低，防止切割位点[D]的切割和可释放RNA区段的释放。下图：随着靶RNA分子与靶结合结构域结合，催化结构域被激活，这导致在切割位点切割并得到可释放RNA区段(该产物的序列可以是不同的，在一些实施例中其表现为与核酶松散互补(loose complementarity)，由此偏向切割而不是再连接)。最终切割产物包括侧翼为来自切割位点的2-4个核苷酸的可释放RNA区段。箭头指示切割位点。

图3.所述核酶作为RNA传感器和放大器的工作原理，如使用具有标记核苷酸的具体实施例所阐述的。在该实施例中，RNA切割产物和靶RNA分子二者的释放均可在解链温度得到促进，这可基于互补区的长度和程度来确定。释放的靶RNA分子可在新一轮循环中与未切割的核酶(过量存在)再次结合。因为核酶为过量的，所以给定拷贝数的靶RNA分子可激活核酶的自切割，导致释放多个切割产物，从而放大靶RNA信号。

图4.示例性核酶(以微小RNA dme-ban-5p作为其靶RNA分子)的自切割通过切下增加水平的可释放RNA片段(在该实施例中为ban-3pR RNA)来直接放大RNA信号。增加循环数(从3至5至10个循环)或增加靶RNA水平(从0(仅水)至20nM至50nM)导致切割产物的量增加，从而扩增靶RNA。在各反应中提供200nM的核酶。

图5.进一步增加循环数(从10至20至30个循环)或增加循环时间的长度(从15min至30min)导致通过示例性核酶(以微小RNA dme-ban-5p作为其靶RNA分子)产生的切割产物的量更大倍增，并进一步扩增靶RNA。在各反应中提供200nM的核酶和50nM的靶RNA分子，即核酶:靶标之比为4:1。

图6.所述核酶可扩增人微小RNA，在本文中使用以hsa-let-7f作为其靶RNA分子的示例性核酶来证实。所述核酶能够将所述靶RNA分子扩增约200倍，这通过基于S2上样对照将所有切割产物标准化并减去对照(水)中的背景切割来计算。对于各反应，加入200nM的核酶以及50nM、10nM或0.1nM的靶miRNA。

图7.以人微小RNA hsa-let-7f作为其靶标的核酶对其靶标为特异的，并能够从复杂的RNA混合物中检测并扩增其靶标。尽管加入hsa-let-7f与无靶标(水对照)相比更强地激活所述核酶，但加入50nM不同的miRNA序列(hsa-miR-122-5p)不会使切割活性增加至超过背景切割，表明所述核酶未被激活。当加入等浓度的hsa-let-7f-5p和hsa-miR-122-5p时(各50nM)，所述核酶保持其对hsa-let-7f-5p的特异性切割。当向反应中加入10倍、100倍或1000倍的来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的总RNA时，所述核酶仍能够检测并扩增hsa-let-7f-5p。在各反应中提供200nM的核酶。

图8.所述核酶可检测并扩增长为40nt、60nt和80nt的靶RNA分子，所述靶RNA分子含有来自冠状病毒SARS-CoV-2的基因组的基因(Orf1ab和E基因)的RNA序列片段。在各反应中提供200nM的核酶和50nM的靶RNA。参见方法获取其他详情。

图9.来自所述核酶的切割产物可激活Pandan荧光传感器。在该实施例中，切割产物为dme-ban-3p，以及核酶的靶RNA分子为dme-ban-5p。与即便存在靶标也不能切割的催化突变体相比，所述切割产物可激活针对dme-ban-3p的Pandan荧光传感器。荧光试验以三个重复进行。

图10(A、B).单催化结构域构型能够切割两个切割位点以导致RNA产物的释放。(A)用于检测和扩增微小RNA dme-ban-5p的“单催化结构域”设计，以切割并释放ban3p-反向RNA。显示了两种“单催化结构域”构型(i和ii)。(B)设计1和2均在与靶RNA分子一起孵育之后有效释放切割产物。

图11.对于靶向dme-ban-5p(靶RNA分子)的核酶，在切割反应中测试了范围为50℃-90℃的解链温度。在各切割反应中提供200nM的核酶和50nM的靶RNA分子。在37℃进行核酶切割。

图12.示例性核酶的构建。将用于构建一个具体核酶的序列和引物映射到核酶结构上，显示设计和构建方法。

发明详述

本发明提供对RNA的传感和放大有用的核酶。

在第一方面，本发明涉及一种核酶，其包含：a)一个或多个催化结构域，所述催化结构域能够在活性状态和无活性状态之间转换；b)一个或多个可释放RNA区段，其中所述可释放RNA区段各自侧翼为两个核酶切割位点，其中每个切割位点被活性状态的一个或多个催化结构域的至少一个切割；c)一个或多个靶结合结构域，该一个或多个靶结合结构域的每个用于结合靶RNA分子；其中所述一个或多个催化结构域的每个与所述一个或多个靶结合结构域之一连接，其中当与催化结构域连接的靶结合结构域未结合靶RNA分子时，所述催化结构域为无活性状态的，而其中当与催化结构域连接的靶结合结构域结合了靶RNA分子时，所述催化结构域呈活性状态；以及其中当位于可释放RNA区段侧翼的两个切割位点均被所述一个或多个催化结构域切割时，所述一个或多个可释放RNA区段从所述核酶中释放。

如在本文中使用的术语“核酶”，是指能够催化特定生化反应的RNA分子。这类反应的常见实例包括RNA和DNA的切割或连接以及肽键形成。如在本文中使用的术语“核酶”，包括天然核酶和人工核酶二者。人工核酶包括合成的核酶以及从天然核酶修饰或工程改造的核酶。术语“核酶”亦包括来源于天然或人工核酶的核酶融合物或核酶复合体。

如在本文中使用的术语“催化结构域”，是指在核酶内的结构域，其负责催化如上所提及的生化反应。在一个实施例中，在能够切割RNA的核酶中，催化结构域为负责催化在核酶切割位点切割RNA骨架的结构域。术语“核酶切割位点”是指被核酶催化结构域识别并切割的序列。除非另有规定，否则如在本文中使用的术语“切割位点”是指核酶切割位点。当催化结构域能够催化生化反应时，其呈“活性状态”；反之，当催化结构域不能够催化生化反应时，其呈“无活性状态”。在另一个实施例中，当催化结构域能够切割核酶切割位点时，其呈“活性状态”；反之，当催化结构域不能够切割核酶切割位点时，其呈“无活性状态”。

术语“靶结合结构域”是指能够结合靶RNA分子的结构域。在一个实施例中，靶RNA分子和靶结合结构域之间的结合通过二者之间的互补序列的退火结合来进行。因此，有可能设计或修饰一个或多个靶结合结构域的序列，以使其可与具有特定序列的不同靶RNA分子结合。

如在本文中使用的术语“互补的”，描述了两个核苷酸或两个多核苷酸之间的关系。当提及RNA互补性时，核苷酸A与核苷酸U互补，反之亦然，以及核苷酸C与核苷酸G互补，反之亦然。互补的核苷酸包括进行沃森和克里克碱基配对的核苷酸以及以备选模式进行碱基配对的核苷酸。应理解的是，除非有明确规定(例如赋予百分数或术语“完全地”或“部分地”)，否则当用于涉及多核苷酸(长度大于2个核苷酸)时，术语“互补的”包括不同程度的互补性。如在本文中使用的术语“互补性”，是指一条RNA链或区段与另一条RNA链或区段互补的程度和模式。当对两个多核苷酸(或其区段)之间的“互补性”或“互补程度”赋予百分数时，所述百分数是指一个多核苷酸(或其区段)中与另一个多核苷酸(或其区段)互补的核苷酸的百分数。因此，提及两条多核苷酸链为“互补的”，应理解为涵盖完全互补和部分互补二者。

如在本文中使用的术语“靶RNA分子”，是指待探知并通过靶结合结构域结合的感兴趣的RNA分子。靶RNA分子的实例包括但不限于病毒RNA、微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、小RNA(sRNA)、信使RNA(mRNA)、非编码RNA(ncRNA)、短链非编码RNA、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运-信使RNA(tmRNA)、成簇的规律间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA)、反义RNA、mRNA前体和miRNA前体。

术语“连接的”是指两个结构域之间的关系，以及可指物理连接、功能连接或二者。在本发明的一个实施例中，如果催化结构域的活性/无活性状态由靶结合结构域的状态(具体而言，靶结合结构域是否与其相应的靶RNA分子结合)来决定，则所述催化结构域与所述靶结合结构域连接。

术语“在……的侧翼”是指一个多核苷酸序列邻接另一个序列或者在相对于所述序列的上游多核苷酸序列和/或下游多核苷酸序列(即5’和/或3’)之间。例如，““侧翼为”两个切割位点的可释放RNA区段”，表示一个切割位点位于所述可释放RNA区段的5’和另一个切割位点位于所述可释放RNA区段的3’；然而，在其中间可存在间隔序列。

由于切割位点包含在核酶本身上，所以认为本公开内容的核酶为自切割核酶，以及认为所述“可释放RNA区段”为自切割活性的切割产物。由于可释放RNA区段从核酶中的释放是所述核酶与其一个或多个靶RNA分子结合的结果，所以所述核酶可用于检测靶RNA分子的存在。由于靶RNA分子可从所述核酶释放以激活更多核酶并触发更多“可释放RNA区段”的释放，所以所述靶RNA分子的存在可通过以较高拷贝释放的“可释放RNA区段”来放大。所述“可释放RNA区段”为可变的并且可设计成包含特定序列。在一些实施例中，如果“可释放RNA区段”包含与靶RNA分子相同的序列，则使用本公开内容的核酶扩增所述靶RNA分子(或其序列)。

在一个实施例中，第一方面的核酶包含一个催化结构域和一个靶结合结构域，其中所述核酶包含具有以下结构的RNA链：

其中[A]至[a]为5’至3’方向性的或3’至5’方向性的，且其中：基序[A]和[a]构成用于结合靶RNA分子的靶结合结构域，基序[C]和[c]构成催化结构域，基序[D]包含能够被催化结构域切割的第一切割位点，基序[D’]包含能够被催化结构域切割的第二切割位点，基序[E]包含可释放RNA区段，基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列，其中每个连接基序的水平线代表任选的接头区；且其中当靶结合结构域与靶RNA分子结合时，催化结构域呈活性状态。

在上文提及的实施例中，靶RNA分子与靶结合结构域的结合激活催化结构域，这导致两个切割位点的切割和可释放RNA区段的随后释放。

就本说明书前文中提供的“互补的”的定义而言，本领域技术人员会理解的是，如在本文和本说明书中使用的表达“任选互补的”不仅包括完全互补性(100％互补)和部分互补(0％至100％之间的互补性)，亦包括非互补性(0％互补性)。换言之，对于上文提及的实施例的核酶，在基序[D’]和[c]之间具有与基序[E]至少部分互补的区域为任选的特征。

如在本文中使用的术语“方向性”是指单链RNA分子的末端至末端化学方向。在单链RNA中，命名核苷酸糖环中的碳原子的化学惯例意味着将会有一个5’端，其含有与核糖环的5’碳连接的磷酸基团，和一个3’端，其通常为未修饰的核糖-OH取代基。一个说明性实例为，如果链S1的[A]至[A’]为5’至3’方向，则链S2的[a]至[a’]将是3’至5’方向。

如在本文中使用的术语“基序”，是指具有特定结构或涉及特定功能的RNA链上的区域。如在本文中使用的术语“结构域”，是指具有特定结构的核酶的区域，所述特定结构涉及特定的功能。如在本文中所使用的，当提及由多于一条RNA链或由多于一条RNA链的基序形成的结构时，使用术语“结构域”。一个说明性实例为，靶结合结构域包括基序[A]和[a]二者，仅当两个基序均与RNA分子结合时才认为所述靶结合结构域与所述靶RNA分子“结合”。

在一个实施例中，如在本文中公开的核酶进一步包含一个或多个抑制结构域；其中所述一个或多个催化结构域的每个与所述一个或多个抑制结构域之一功能连接，其中催化结构域因来自抑制结构域的抑制而呈无活性状态，所述抑制结构域与所述一个或多个靶结合结构域之一连接；其中当一个或多个靶结合结构域之一与靶RNA分子结合时，与所述靶结合结构域连接的抑制结构域停止抑制与所述抑制结构域连接的催化结构域，这导致所述催化结构域转换成活性状态。在该实施例中，靶结合结构域和催化结构域之间的连接通过抑制结构域来实现，所述抑制结构域与所述靶结合结构域和所述催化结构域二者连接。

在一个实施例中，所述核酶包含一个催化结构域、一个抑制结构域和一个靶结合结构域，其中所述核酶包含具有以下结构的RNA链：

其中[A]至[a]为5’至3’方向性的或3’至5’方向性的，且其中：基序[A]和[a]构成用于结合靶RNA分子的靶结合结构域，基序[B]和[b]构成抑制结构域，基序[C]和[c]构成第一催化结构域，基序[D]包含能够被催化结构域切割的第一切割位点，基序[D’]包含能够被催化结构域切割的第二切割位点，基序[E]包含可释放RNA区段，基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列，每个连接基序的水平线代表任选的接头区；且其中所述抑制结构域特征在于以下i)或ii)：

i)当靶结合结构域未结合靶RNA分子时，基序[b]与[C]退火结合，而当靶结合结构域结合靶RNA分子时，基序[b]与[B]退火结合，

ii)当第一靶结合结构域未结合靶RNA分子时，基序[B]与基序[c]退火结合，而当靶结合结构域结合靶RNA分子时，基序[B]与[b]退火结合，其中当基序[b]与基序[B]退火结合时，催化结构域呈活性状态。

如在本领域中通常已知的，通常在核酶内形成二级结构。在本公开内容的实施例中，一个或多个二级结构由任何的基序或任选的接头区独立形成，或者由基序、接头区或其组合共同形成。在一个实施例中，任选的接头区独立或共同形成一个或多个二级结构。

如在本文中使用的术语“二级结构”，是指由一个或多个多核苷酸中的核苷酸之间的相互作用形成的结构。二级结构的实例包括但不限于单核苷酸膨出(bulge)、三核苷酸膨出、茎、茎环、t-RNA型结构、三叶草、四环、假结、对称内环、不对称内环、三茎连接头(3路连接头)、四茎连接头(4路连接头)、两茎连接头(2路连接头)或者同轴堆积或其组合。二级结构的具体实例包括茎、茎环、t-RNA型结构、三叶草、四环、假结或其组合。如在本文中使用的术语“茎环”，亦称为“发夹环”，是指这样的二级核酸结构，当相同链的两个区域在以相反的方向读取时在核苷酸序列上通常为互补的时，所述二级核酸结构形成碱基对以形成末端为不配对环的双螺旋。

图1阐述了由本公开内容的核酶形成的一些示例性且非限制性的结构。具体而言，图1A-C提供由一条RNA链形成并具有一个靶结合结构域的核酶的实例。基序的标记与上文提供的通用结构一致。在图1A中，所述核酶特征在于在可释放RNA区段(基序[E])的任一侧形成两个4路连接头，具有基于所述4路连接头结构之一的螺旋中的一个的延伸的催化结构域(基序[C]和[c])、任选的抑制结构域(基序[B]和[b])和靶结合结构域(基序[A]和[a])。除了将由基序[D]和基序[e]之间的区域形成的4路连接头替换成3路连接头(图1B)或2路连接头(图1C)之外，图1B和1C的核酶采用与图1A类似的结构。如果没有具体说明，则每个4路连接头亦可以是3路或2路连接头，反之亦然。

在其中核酶包含一个靶结合结构域的实施例中，所述靶结合结构域由基序[A]和[a]组成，基序[A]与靶RNA分子的一个区域结合，以及基序[a]与靶RNA分子的第二区域结合；其中当[A]和[a]均与靶RNA分子结合时，所述靶结合结构域与所述靶RNA分子结合。因此在另一个实施例中，基序[A]与靶RNA分子的一个区域互补，且基序[a]与靶RNA分子的第二区域互补。在另一个实施例中，基序[A]与靶RNA分子的一个区域完全互补，且基序[a]与靶RNA分子的第二区域完全互补。在一个实施例中，所述第一和第二区域在靶RNA分子上彼此邻接。

在一些实施例中，所述核酶包含两个催化结构域。在一些实施例中，所述核酶包含两个抑制结构域。在一些实施例中，所述核酶包含两个靶结合结构域。在一个具体的实施例中，所述核酶包含两个催化结构域，所述两个催化结构域的每个被两个抑制结构域之一抑制，其中所述抑制结构域的每个与两个靶结合结构域之一进一步连接。

如在本领域中通常已知的，核酶可包含一条或多条RNA链。在一个具体的实施例中，所述核酶包含第一RNA链和第二RNA链。当核酶由两条RNA链组成时，所述两条RNA链具有充分互补性以致彼此结合。通常，所述两条RNA链并非跨越其全长完全互补。每条RNA链可独立形成二级结构，如本领域一般已知的。在一个实施例中，所述核酶包含以下结构：

其中：S1为第一RNA链和S2为第二RNA链，其中[A]至[A’]和[a]至[a’]代表相反的方向性；以及基序[A]和[a]构成用于结合第一靶RNA分子的第一靶结合结构域，基序[C]和[c]构成第一催化结构域，基序[D]包含能够被第一催化结构域切割的第一切割位点，基序[A’]和[a’]构成用于结合第二靶RNA分子的第二靶结合结构域，基序[C’]和[c’]构成第二催化结构域，基序[D’]包含能够被第二催化结构域切割的第二切割位点，基序[E]包含可释放RNA区段，基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列，每个连接基序的水平线代表任选的接头区；以及其中当第一靶结合结构域与第一靶RNA分子结合时，第一催化结构域呈活性状态；和其中当第二靶结合结构域与第二靶RNA分子结合时，第二催化结构域呈活性状态。

在另一个实施例中，所述核酶包含以下结构：

其中：S1为第一RNA链和S2为第二RNA链，其中[A]至[A’]和[a]至[a’]代表相反的方向性；其中基序[A]和[a]构成用于结合第一靶RNA分子的第一靶结合结构域，基序[B]和[b]构成第一抑制结构域，基序[C]和[c]构成第一催化结构域，基序[D]包含能够被第一催化结构域切割的第一切割位点，基序[A’]和[a’]构成用于结合第二靶RNA分子的第二靶结合结构域；基序[C’]和[c’]构成第二催化结构域，基序[D’]包含能够被第二催化结构域切割的第二切割位点，基序[E]包含可释放RNA区段，基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列，每个连接基序的水平线代表任选的接头区；其中所述第一抑制结构域特征在于以下i)或ii)：

i)当第一靶结合结构域未结合第一靶RNA分子时，基序[b]与[C]退火结合，而当第一靶结合结构域结合第一靶RNA分子时，基序[b]与[B]退火结合，

ii)当第一靶结合结构域未结合第一靶RNA分子时，基序[B]与基序[c]退火结合，而当第一靶结合结构域结合第一靶RNA分子时，基序[B]与[b]退火结合，

其中当基序[b]与基序[B]退火结合时，第一催化结构域呈活性状态。

在另一个实施例中，所述第一抑制结构域进一步特征在于以下i)或ii)：i)基序[b]与基序[C]至少50％互补，且与基序[B]至少20％互补，和ii)基序[B]与基序[c]至少50％互补，且与基序[b]至少20％互补。

在另一个实施例中，所述第一抑制结构域进一步特征在于以下i)或ii)：

i)基序[b]与基序[C]至少60％、至少70％、至少80％或至少90％互补，且与基序[B]至少20％互补，或者

ii)基序[B]与基序[c]至少60％、至少70％、至少80％或至少90％互补，且与基序[b]至少20％互补。

在另一个实施例中，所述核酶包含以下结构：

其中：

S1为第一RNA链和S2为第二RNA链，其中[A]至[A’]和[a]至[a’]代表相反的方向性；其中基序[A]和[a]构成用于结合第一靶RNA分子的第一靶结合结构域，基序[B]和[b]构成第一抑制结构域，基序[C]和[c]构成第一催化结构域，基序[D]包含能够被第一催化结构域切割的第一切割位点，基序[A’]和[a’]构成用于结合第二靶RNA分子的第二靶结合结构域；基序[B’]和[b’]构成第二抑制结构域，基序[C’]和[c’]构成第二催化结构域，基序[D’]包含能够被第二催化结构域切割的第二切割位点，基序[E]包含可释放RNA区段，基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列，每个连接基序的水平线代表任选的接头区；其中所述第一抑制结构域特征在于以下i)或ii)：

其中所述第二抑制结构域特征在于以下i)或ii)：

i)当第二靶结合结构域未结合第一靶RNA分子时，基序[b’]与基序[C’]退火结合，而当第二靶结合结构域结合第二靶RNA分子时，基序[b’]与[B’]退火结合，

ii)当第二靶结合结构域未结合第二靶RNA分子时，基序[B’]与基序[c’]退火结合，而当第二靶结合结构域结合第二靶RNA分子时，基序[B’]与[b’]退火结合，

其中当基序[b]与基序[B]退火结合时，第一催化结构域呈活性状态，以及当基序[b’]与基序[B’]退火结合时，第二催化结构域呈活性状态。

如在本说明书前文中所提及的，一个或多个二级结构可由任何的基序或任选的接头区独立形成，或者由基序、接头区或其组合共同形成。在一个实施例中，所述任选的接头区独立或共同形成一个或多个二级结构。在其中核酶包含两个靶结合结构域和两个催化结构域的核酶的一些实施例中，所述核酶包含以下结构之一：

其中接头区R1和R2独立或共同形成一个或多个二级结构，且接头区R1’和R2’独立或共同形成一个或多个二级结构。

在一些实施例中，接头区R1、R2、R1’和R2’的每个具有独立选自以下的长度：介于3-1000个核苷酸、3-500个核苷酸、3-300个核苷酸、3-200个核苷酸、3-100个核苷酸、3-80个核苷酸、3-70个核苷酸、3-60个核苷酸、3-50个核苷酸、3-40个核苷酸、3-30个核苷酸的长度。在一些具体的实施例中，接头区R1和R1’的长度为40-100个核苷酸的长度、50-80个核苷酸的长度、50-70个核苷酸的长度或者60-70个核苷酸的长度。在一些具体的实施例中，接头区R2和R2’的长度为10-60个核苷酸的长度、20-40个核苷酸的长度或者25-35个核苷酸的长度。

由接头区R1、R2、R1’和R2’的任一个或任意组合独立或共同形成的一个或多个二级结构，为独立选择的且可以是相同的或不同的。在一个具体的实施例中，接头区R1和R2形成2路、3路或4路连接头。在一个具体的实施例中，接头区R1’和R2’形成2路、3路或4路连接头。由R1和R2形成的二级结构相对于由R1’和R2’形成的二级结构为独立选择的。举例说明，R1和R2可形成4路连接头，同时R1’和R2’形成3路连接头。在一个实施例中，R1和R2形成4路连接头，以及R1’和R2’亦形成4路连接头。

图1D-I提供了由两条RNA链形成并具有两个靶结合结构域的核酶的一些实例。基序的标记与上文提供的通用结构一致。图1D的核酶特征在于在可释放RNA区段的任一侧形成两个4路连接头，各侧包含一个催化结构域、一个任选的抑制结构域和一个靶结合结构域。除了4路连接头替换成3路连接头和2路连接头之外，图1E和1F采用与图1D类似的结构。图1D-F中各图的核酶可被认为是由两个“单核酶”反向连接的串联核酶(因此为“反向连接的串联核酶”)，所述两个“单核酶”展示“镜像”方向。而图1G-I的核酶亦可被认为是由两个“单核酶”连接的串联核酶，所述两个“单核酶”采用相同的方向(因此命名为“重复串联核酶”)。图1G的核酶特征在于在可释放RNA区段的任一侧形成两个4路连接头。除了4路连接头替换成3路连接头(图1H)或2路连接头(图1I)之外，图1H和图1I的核酶采用与图1G类似的结构。

对于如何将不同的基序和结构域包含在一个示例性核酶上并共同起作用的一个说明性实施例，请参考图2。图2阐述了一种具体构型，其中所述核酶具有反向连接的串联核酶结构。连接(催化结构域的)基序[c]与(靶结合结构域的)基序[a]的可变基序[b]，被设计成与催化结构域的基序[C]互补。连接(催化结构域的)基序[c]与(靶结合结构域的)基序[a]的可变基序[b]，将其设计成与催化结构域的基序[C]互补。不存在靶RNA分子时，[b]和[C]之间的结合充当“toehold”以使自切割降至最低，防止切割位点[D]的切割和可释放RNA区段的释放。靶RNA结合激活切割，释放可释放RNA区段(该产物的序列可以是不同的，其在一些实施例中与核酶松散互补，由此偏向切割而不是再连接)。释放的靶RNA分子可在新一轮循环中与未切割的核酶(过量存在)再次结合。因为核酶为过量的，所以给定拷贝数的靶RNA分子可激活核酶的自切割，导致多个切割产物的释放，从而放大靶RNA信号。本领域技术人员会立即理解的是，本文所阐述的工作原理加以必要修改之后适用于其他结构的核酶，例如在图1A-I中所阐述的核酶。

在另一个实施例中，所述第一和第二靶RNA分子为相同的。在另一个实施例中，所述第一和第二靶RNA分子为不同的。表达“第一和第二靶RNA分子为相同的”，是指其中通过一个特定的靶RNA分子(所述靶RNA分子的一个拷贝结合两个靶结合结构域之一)激活核酶(导致可释放RNA区段的释放)的情况。表达“第一和第二靶RNA分子为不同的”，是指其中通过两个不同的靶RNA分子(每个靶结合结构域用于结合两个靶RNA分子之一)激活核酶的情况。

为进行说明且不受理论束缚，所述第一催化结构域的活性状态需要基序[C]和[c]中的特定核苷酸以经由催化结构域形成的二级结构与切割位点形成特异性相互作用。当基序[C]或[c]与基序[b]或[B]退火结合时，不能形成支持与切割位点的这些分子间相互作用所需的特定二级结构。

i)基序[b]与基序[C]至少50％互补，且与基序[B]至少20％互补，和

ii)基序[B]与基序[c]至少50％互补，且与基序[b]至少20％互补；

以及所述第二抑制结构域进一步特征在于以下i)或ii)：

i)基序[b’]与基序[C’]至少50％互补，且与基序[B’]至少20％互补，和

ii)基序[B’]与基序[c’]至少50％互补，且与基序[b’]至少20％互补。

i)基序[b]与基序[C]至少80％、90％、95％或100％互补，且与基序[B]至少30％互补，

ii)基序[B]与基序[c]至少80％、90％、95％或100％互补，且与基序[b]至少30％互补；

以及所述第二抑制结构域进一步特征在于以下i)或ii)：

i)基序[b’]与基序[C’]至少80％、90％、95％或100％互补，且与基序[B’]至少30％互补，

ii)基序[B’]与基序[c’]至少80％、90％、95％或100％互补，且与基序[b’]至少30％互补。

在一些实施例中，基序[b]与基序[C]完全互补，或者基序[B]与基序[c]完全互补。在一些实施例中，基序[b’]与基序[C’]完全互补，或者基序[B’]与基序[c’]完全互补。

在一些实施例中，基序[b]和基序[B]之间的互补性为100％。在其他实施例中，基序[b]和基序[B]之间的互补性为30％-70％。在一个具体的实施例中，基序[b]和基序[B]之间的互补性约为50％。

在其中基序[B’]和[b]包含在所述核酶上的一些实施例中，基序[b’]和基序[B’]之间的互补性为100％。在其他的具体实施例中，基序[b’]和基序[B’]之间的互补性为30％-70％。在一个具体的实施例中，基序[b’]和基序[B’]之间的互补性约为50％。

在一个实施例中，当基序[b]与基序[B]退火结合时，或者当基序[b’]与基序[B’]退火结合时，所述退火结合是基于互补和非互补的交替区段，其中每个区段长为一个核苷酸。

在一些实施例中，其中核酶包含结构IV或VII的结构，以及其中[A]至[A’]为5’至3’方向，基序[B]与基序[b]部分互补。在一些实施例中，所述核酶包含V或VIII的结构，基序[B]与基序[b]部分互补，且基序[B’]与基序[b’]完全互补。在另一些实施例中，其中所述核酶包含V或VIII的结构，以及其中[A]至[A’]为5’至3’方向，基序[B]与基序[b]完全互补，且基序[B’]与基序[b’]完全互补。

在一些实施例中，基序[B]、[b]、[C]、[c]、[B’]、[b’]、[C’]、[c’]和[D]的每个的长度独立地为1-100个核苷酸。在一些具体的实施例中，基序[B]、[b]、[C]、[c]、[B’]、[b’]、[C’]、[c’]和[D]的每个的长度为1-5、或5-10、或10-15、或15-20、或20-30、或30-40、或40-50、50-60、60-70、70-80或者3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸。在一些具体的实施例中，基序[B]具有与基序[b]相同的长度。在一些具体的实施例中，基序[C]具有与基序[c]相同的长度。在一些具体的实施例中，基序[B’]具有与基序[b’]相同的长度。在一些具体的实施例中，基序[C’]具有与基序[c]相同的长度。在一个实施例中，基序[B]、[b]、[B’]、[b’]的每个的长度为1-20个核苷酸。在另一个实施例中，基序[C]、[c]、[C’]和[c’]的每个的长度为5-12个核苷酸。在一个实施例中，基序[B]、[b]、[B’]、[b’]的每个的长度为8个核苷酸。在另一个实施例中，基序[C]、[c]、[C’]和[c’]各自长为8个核苷酸。

在另一个实施例中，基序[A]和[A’]分别与第一和第二靶RNA分子的第一区结合，以及基序[a]和[a’]分别与第一和第二靶RNA分子的第二区结合；其中当[A]和[a]均与第一靶RNA分子结合时，所述第一靶结合结构域与所述第一靶RNA分子结合，以及当[A’]和[a’]均与第二靶RNA分子结合时，所述第二靶结合结构域与所述第二靶RNA分子结合。在一个具体的实施例中，所述第一或第二靶RNA分子上的第一区和第二区彼此邻接。在另一个实施例中，所述第一区和第二区长度相等。因此在另一个实施例中，基序[A]与第一靶RNA分子的第一区互补，基序[a]与第一靶RNA分子的第二区互补，基序[A’]与第二靶RNA分子的第一区互补，基序[a’]与第二靶RNA分子的第二区互补。在另一个实施例中，基序[A]与第一靶RNA分子的第一区完全互补，基序[a]与第一靶RNA分子的第二区完全互补，基序[A’]与第二靶RNA分子的第一区完全互补，基序[a’]与第二靶RNA分子的第二区完全互补。在一个实施例中，第一靶RNA分子上的第一区和第二区彼此邻接。在一个实施例中，第二靶RNA分子的第一区和第二区彼此邻接。

在一些实施例中，基序[A]和[a]的核苷酸分别与靶RNA分子的相反端互补结合。例如，基序[A]可与靶RNA分子的5’端互补结合，而基序[a]可与靶RNA分子的3’端互补结合，反之亦然。在另一些实施例中，基序[A]或[a]各自长为1-5、或5-10、或10-15、或15-20、或20-30、或30-40、或40-50、或50-60、或60-70、或70-80个核苷酸。在一些实施例中，基序[a]为11个核苷酸长。在一些实施例中，对基序[A]和[a]的上述描述亦适用于基序[A’]和[a’]。

所述互补结合为部分互补的或完全互补的。例如，基序[A]与靶RNA分子的5’端约70-约80％、或者约80％-约90％、或者约90％-约100％、或者约75％-约85％、或者约85％-约95％、或者约95％-约100％、或者约88％-约98％、或者约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％互补；且基序[a]与相同靶RNA分子的3’端约70-约80％、或者约80％-约90％、或者约90％-约100％、或者约75％-约85％、或者约85％-约95％、或者约95％-约100％、或者约88％-约98％、或者约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％互补，反之亦然。基序[A]和[a]的长度彼此独立，且可以是相同的或不同的。例如，基序[A]和[a]的每个的长度可为3-5、或5-10、或10-15、或15-20、或20-30、或30-40、或40-50、或者3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个核苷酸。在一些具体的实施例中，基序[A]和[a]的每个的长度为11个核苷酸长。

在一些实施例中，基序[E]和[e]彼此为小于70％、小于60％、小于50％、小于40％或小于30％互补的。在一个具体的实施例中，基序[E]和[e]之间的互补性特征在于交替的互补区和非互补区。在一个特别具体的实施例中，每个互补区长度不超过3个连续的核苷酸，且每个非互补区长度为至少3个连续的核苷酸。在一些实施例中，基序[E]和[e]的每个的长度为3-50个核苷酸。在一些具体的实施例中，基序[E]和[e]的每个的长度为3-5、或5-10、或10-15、或15-20、或20-30、或30-40、或40-50、50-60、60-70、70-80或者21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸。在一些具体的实施例中，基序[E]和[e]的每个的长度为23个核苷酸。

如在本文中使用的“互补区”，是指核酶中第一和第二RNA链彼此完全互补的区域；而“非互补区”是指核酶中第一和第二RNA链彼此不互补的区域。

在一些实施例中，所述核酶从天然存在的核酶修饰得到。在一些实施例中，所述核酶从人工核酶、融合核酶、其片段和衍生物修饰得到。在一个具体的实施例中，所述核酶以发夹状核酶或锤头状核酶或其片段和融合物为特征。在一个具体的实施例中，所述核酶为双核酶(twin ribozyme)或双重核酶(duplex ribozyme)。在一个具体的实施例中，所述核酶包含双发夹状核酶结构，如在图1中所述。

在一个实施例中，其中所述核酶包含结构V或VIII的结构，第一RNA链(S1)上的基序[A]和基序[E]之间的区域(在[A]至[E]方向)包含SEQ ID NO.:27的序列)。

SEQ ID NO.:27是指序列：5’-GUAUAUUAGUAUAUUACCUGGUUUUCGAUCGAAAGAUCGACGAGGUGAAAACCUCGUGACAGUCC-3’。

在一个实施例中，其中所述核酶包含结构III或VI的结构，第一RNA链(S1)上的基序[A]和基序[E]之间的区域(在[A]至[E]方向)包含SEQ ID NO.:81的序列。

SEQ ID NO.:81是指序列：

5’-GGGAAGUGGUAUAUUACCUGGUUUUCGAUCGAAAGAUCGACGAGGUGAAAACCUCGUGACAGUCC-3’。

在一个实施例中，其中所述核酶包含结构V或VIII的结构，第一RNA链(S1)上的基序[E]和基序[A’]之间的区域(在[E]至[A’]方向)包含SEQ ID NO.:28的序列。

SEQ ID NO.:28是指序列：5’-CAGUCCUGAUUGUGCUCGAAAGAGCACAGACCUGAAAAGGUCUUUCGUGGUAUAUUACUCUCUGAA-3’。

在一个实施例中，其中所述核酶包含结构III或VI的结构，第一RNA链(S1)上的基序[E]和基序[A’]之间的区域(在[E]至[A’]方向)包含SEQ ID NO.:82的序列。

SEQ ID NO.:82是指序列：

5’-CAGUCCUGAUUGUGCUCGAAAGAGCACAGACCUGAAAAGGUCUUUCGUGGUAUAUUACCUGGUCCC-3’。

在一个实施例中，其中所述核酶包含结构V或VIII的结构，第二RNA链(S2)上的基序[a’]和基序[e]之间的区域(在[a’]至[e]的方向)包含SEQ ID NO.:30的序列。

SEQ ID NO.:30是指序列：5’-GUAAUAUAAGAAACACACGAAUCAGAGAAG-3’。

在一个实施例中，其中所述核酶包含结构III或VI的结构，第二RNA链(S2)上的基序[a’]和基序[e]之间的区域(在[a’]至[e]的方向)包含SEQ ID NO.:84的序列。

SEQ ID NO.:84是指序列：

5’-GGGACCAGAGAAACACACGAAUCAGAGAAG-3’。

在一个实施例中，其中所述核酶包含结构V或VIII的结构，第一RNA链(S1)上的基序[e]和基序[a]之间的区域(在[e]至[a]的方向)包含SEQ ID NO.:31的序列。

SEQ ID NO.:31是指序列：5’-GAGAAGUCAACCAGAGAAACAUAAUAUAC-3’。

在一个实施例中，其中所述核酶包含结构III或VI的结构，第一RNA链(S1)上的基序[e]和基序[a]之间的区域(在[e]至[a]的方向)包含SEQ ID NO.:85的序列。

SEQ ID NO.:85是指序列：

5’-GAGAAGUCAACCAGAGAAACACACUUCCC-3’。

在一个实施例中，其中所述核酶包含结构III或VI的结构，第一RNA链(S1)和第二RNA链(S2)分别包含SEQ ID NO.:80和SEQ ID NO.:83的序列。

SEQ ID NO.:80是指序列：

5’-(n)_aGGGAAGUGGUAUAUUACCUGGUUUUCGAUCGAAAGAUCGACGAGGUGAAAACCUCGUGACAGUCC(n)_xCAGUCCUGAUUGUGCUCGAAAGAGCACAGACCUGAAAAGGUCUUUCGUGGUAUAUUACCUGGUCCC(n)_b-3’，其中(n)_x代表与S1上的可释放RNA区段部分互补的区域，以及(n)_a和(n)_b代表与第二和第一靶RNA分子互补的序列。

SEQ ID NO.:83是指序列：

5’-(n)_aGGGACCAGAGAAACACACGAAUCAGAGAAG(n)_xGAGAAGUCAACCAGAGAAACACACUUCCC(n)_b-3’，其中(n)_x代表与S1上的可释放RNA区段部分互补的区域，以及(n)_a和(n)_b代表与第二和第一靶RNA分子互补的序列。

在另一个实施例中，其中所述核酶包含结构V或VIII的结构，第一RNA链(S1)和第二RNA链(S2)分别包含SEQ ID NO.:26和SEQ ID NO.:29的序列。

SEQ ID NO.:26是指序列：5’-(n)_aGUAUAUUAGUAUAUUACCUGGUUUUCGAUCGAAAGAUCGACGAGGUGAAAACCUCGUGACAGUCC(n)_xCAGUCCUGAUUGUGCUCGAAAGAGCACAGACCUGAAAAGGUCUUUCGUGGUAUAUUACUCUCUGAA(n)_b-3’，其中(n)_a对应于与第一靶结合结构域的基序[A]相对应的可变序列，(n)_x对应于与基序[E]相对应的可变序列，以及(n)_b对应于与第二靶结合结构域的基序[A’]相对应的可变序列。

SEQ ID NO.:29是指序列：5’-(n)_aGUAAUAUAAGAAACACACGAAUCAGAGAAG(n)_xGAGAAGUCAACCAGAGAAACAUAAUAUAC(n)_b-3’，其中(n)_a对应于与第二靶结合结构域的基序[a’]相对应的可变序列，(n)_x对应于与基序[e]相对应的可变序列，以及(n)_b对应于与第二靶结合结构域的基序[a]相对应的可变序列。

所述核酶可以是单催化结构域构型的。这些核酶仅包含1条RNA链，如类似于结构I和II。

以下提供了单催化结构域核酶的通用序列，其中所述核酶包含结构II的结构：

5’-(n)_aGUAUAUUAGUAUAUUACCUGGUUUUCGAUCGAAAGAUCGACGAGGUGAAAACCUCGUGACAGUCC(n)_xCAGUCCUGAUUGUGAUCGAAAGAGCACAGACCUGAAAAGGUCUUUCUGGUUUCGACCAGAAUCAGAGAAG(n)_yGAGAAGUCAACCAGAGAAACAUAAUAUAC(n)_b-3’(SEQ ID.:88)，其中(n)_a和(n)_b代表与RNA的第一和第二靶区互补的序列；(n)_x代表可释放RNA片段，以及(n)_y代表与可释放RNA区段互补的序列。

在一些实施例中，上文列出的各可变序列中的核苷酸的数量，独立地为3-150、3-100、3-80、3-60、6-50、6-40、6-30、10-15或15-23的数量。

在一个具体的实施例中，所述可释放RNA区段(或者在一些实施例中为基序[E])的序列包含5’-GUCCUUAGUCGAAAGUUUUACUAGAGUCA-3’(SEQ ID NO.:25)的序列。

在一个实施例中，其中所述核酶包含结构III-VIII中任意的结构，第一RNA链(S1)和第二RNA链(S2)分别包含SEQ ID NO.:34和SEQ ID NO.:35的序列。在另一个实施例中，其中所述核酶包含结构V或VIII的结构，第一RNA链(S1)和第二RNA链(S2)分别包含SEQ IDNO.:32和SEQ ID NO.:33的序列。

在一个实施例中，所述靶RNA分子长度大于16、大于18、大于20、大于22、大于24、大于26、大于28、大于30、大于32、大于34、大于36、大于38、大于40个核苷酸、大于50个核苷酸、大于60个核苷酸、大于70个核苷酸、大于80个核苷酸、大于90个核苷酸或大于100个核苷酸。在一个具体的实施例中，所述靶RNA分子的长度为6-200、6-100、6-80、10-60、10-30、10-25或15-23个核苷酸。在又另一个具体的实施例中，所述靶RNA长约18-23个核苷酸。

在另一个实施例中，所述靶RNA分子包含与靶结合结构域互补的区域，其中所述区域长度大于16、大于18、大于20、大于22、大于24、大于26、大于28、大于30、大于32、大于34、大于36、大于38、大于40、大于50个核苷酸、大于60个核苷酸、大于70个核苷酸核苷酸。在一个更具体的实施例中，所述区域长度为6-100、6-80、6-30、10-25或15-23个核苷酸。在又另一个具体的实施例中，所述区域长约6-80个核苷酸。

在另一个实施例中，所述可释放RNA区段长度为3-200个核苷酸。在另外的实施例中，所述可释放RNA区段长度为3-150、或6-120、或6-100、或6-80、或6-60、或10-50、或20-40个核苷酸。

在一些实施例中，其中第一方面的核酶包含两条RNA链S1和S2，S1和S2分别包含SEQ ID NO.2和3的序列，或者分别包含SEQ ID NO.5和6的序列、分别包含SEQ ID NO.41和42的序列、分别包含SEQ ID NO.44和45的序列、分别包含SEQ ID NO.47和48的序列、分别包含SEQ ID NO.70和71的序列、分别包含SEQ ID NO.72和73的序列、分别包含SEQ ID NO.74和75的序列、分别包含SEQ ID NO.76和77的序列、分别包含SEQ ID NO.78和79的序列、分别包含SEQ ID NO.92和93的序列、分别包含SEQ ID NO.94和95的序列、分别包含SEQ IDNO.96和97的序列、分别包含SEQ ID NO.98和99的序列、分别包含SEQ ID NO.100和101的序列。在一些实施例中，其中第一方面的核酶包含一条RNA链，所述核酶包含SEQ ID NO.86或87的序列。

在一个实施例中，所述核酶的一个或多个靶结合结构域结合或用于结合相同的靶RNA分子。在一个具体的实施例中，所述核酶包含第一靶结合结构域和第二靶结合结构域，且所述两个靶结合结构域用于结合相同的靶RNA分子。如在本文中使用的“相同的靶RNA分子”，是指具有相同序列的靶RNA分子。

在另一个实施例中，所述可释放RNA区段包含与所述一个或多个靶RNA分子的至少一个相一致的序列。在一个具体的实施例中，所述核酶包含用于结合特定靶RNA分子的两个靶结合结构域，其中所述靶RNA分子包含与靶RNA分子一致的序列。在这个具体的实施例中，靶RNA分子的结合导致包含与靶RNA分子相同序列的RNA分子的释放。

在一些实施例中，靶RNA分子与所述核酶的一个或多个靶结合结构域的结合在温度T1发生。在一些具体的实施例中，T1为不超过50℃的温度。在其他实施例中，T1为0℃-50℃的温度、15℃-45℃的温度、25℃-45℃的温度、30℃-40℃的温度、35℃-38℃的温度、36.5℃-37.5℃的温度。在一个具体的实施例中，T1为约37℃的温度。

在另一个实施例中，与所述核酶的靶结合结构域结合的靶RNA分子在温度T2从所述靶结合结构域释放。在一些实施例中，其中位于可释放RNA区段侧翼的两个切割位点被切割，所述可释放RNA区段在优选的温度T2释放。在一些实施例中，T2为20℃-100℃的温度、25℃-80℃的温度、30℃-80℃的温度、35℃-80℃的温度、40℃-80℃的温度、45℃-80℃的温度、50℃-80℃的温度、55℃-75℃的温度、57℃-63℃的温度。在一个具体的实施例中，T2为约60℃的温度。

应理解的是，如上所述的T1和T2分别是指允许(靶向RNA分子的)结合和(靶RNA分子和可释放RNA区段的)释放的温度。不应认为T1意指在该温度靶RNA分子或可释放RNA区段不能释放的温度；以及不应认为T2意指在该温度靶RNA分子不能与靶结合结构域结合的温度。本领域一般理解的是，尽管具有不同的动力学，但互补RNA链的结合(亦称为“退火”)和释放(亦称为“解链”)可跨越大范围的温度同时发生，因此T1和T2可以是相同的或不同的。在一些实施例中，靶RNA分子可结合所述核酶的靶结合结构域，触发可释放RNA区段的切割和释放，并从核酶中释放，这均在35℃-38℃的温度进行。然而，当所述核酶用于检测和扩增靶分子时，退火(在T1)和解链(在T2)的进行(其中T2高于T1)向前推动反应并导致释放的可释放RNA产物的数量增加。

在具体的实施例中，所述靶RNA分子为获自动物、病毒、细菌、酵母或植物的RNA分子。

在一个具体的实施例中，所述靶RNA分子为RNA病毒的基因组或其片段。在另外的实施例中，所述RNA病毒为单链或双链的RNA病毒。在另外的实施方案中，所述RNA病毒为正义RNA病毒或反义RNA病毒或双义RNA病毒。在另外的实施例中，所述病毒为逆转录病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、冠状病毒科病毒、小核糖核酸病毒科病毒、杯状病毒科病毒、黄病毒科病毒、披膜病毒科病毒、博尔纳病毒科、纤丝病毒科、副粘病毒科、肺病毒亚科、弹状病毒科、沙粒病毒科、本扬病毒科、正粘病毒科或δ病毒。

在具体的实施例中，所述RNA病毒选自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、冠状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征病毒(SARS)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、甲型肝炎、诺瓦克病毒、黄热病病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、风疹病毒、罗斯河病毒、辛德比斯病毒、基孔肯雅病毒、博尔纳病病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、新城疫病毒、人呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、拉沙病毒、汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、流感和丁型肝炎病毒。在一个具体的实施例中，所述RNA病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)病毒。

在一些实施例中，所述靶RNA分子为微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、小RNA(sRNA)、信使RNA(mRNA)、非编码RNA(ncRNA)、短链非编码RNA、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运-信使RNA(tmRNA)、成簇的规律间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA)、反义RNA、mRNA前体或miRNA前体、或其片段。在一个具体的实施例中，所述靶RNA分子为微小RNA、或其前体、或其片段。

如在本文中使用的术语“微小RNA”(缩写为miRNA)，是指小型非编码RNA分子。其通常在RNA沉默和基因表达的转录后调节中起作用。尽管大部分miRNA位于细胞内，但亦在包括各种生物流体和细胞培养基等的胞外环境中发现某些miRNA，通常称为循环miRNA或胞外miRNA。miRNA的长度可以是18-25nt长。

第一方面的核酶可用于检测样品中靶RNA分子的存在。因此，在第二方面，本发明提供在检测样品中靶RNA分子的存在的方法，其中所述方法包括：a)将样品与第一方面的核酶一起在温度T1孵育，这允许靶RNA分子的结合，以与包含在所述核酶中的一个或多个靶结合结构域结合；b)将样品在温度T2孵育，这允许靶RNA分子和可释放RNA区段从所述核酶中释放；c)检测可释放RNA区段从所述核酶中的释放。在一个实施例中，步骤c)通过检测样品中可释放RNA区段的存在来进行。可使用本领域已知的任何RNA检测方法或RNA检测系统。RNA检测方法的示例性且非穷举的实例包括：反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、定量RT-PCR(RT-qPCR)、基于探针的RNA检测(例如RNA印迹、微阵列和分子信标)。RNA检测系统的示例性且非穷举的实例包括：NanoString Technologies的

miRNA表达测定法和Exiqon的Smart Flares)，RNA激活的荧光传感器，例如Pandan荧光传感器(PCT专利PCT/SG2017/050086；Aw等，Nucleic Acids Research 2016)和基于CRISPR-Cas的核酸检测系统，例如DETECTR(Chen,J.S.等，CRISPR-Cas12a target-binding unleashesindiscriminate single-stranded DNase activity.Science 360，436-439，doi:10.1126/science.aar6245(2018))和SHERLOCK(Gootenberg,J.S.等，Multiplexed andportable nucleic acid detection platform with Cas13,Cas12a,and Csm6.Science360，439-444，doi:10.1126/science.aaq0179(2018))。

在一个具体的实施例中，在进行步骤c)之前将步骤a)至b)重复一次或多次，其中从步骤b)释放的RNA分子用于结合所述核酶的另一个拷贝。在该实施例中，在第一次进行步骤a)时，可将样品与过量的核酶一起孵育，由此在第二次或后续次数进行a)时，可不向样品中补充另外的核酶。因为在步骤b)中从核酶释放的靶RNA分子可进一步结合新的核酶，释放的切割产物(“可释放RNA区段”)的拷贝数可以是样品中靶分子的拷贝数的许多倍。因此，释放的“可释放RNA区段”的存在或数量用作样品中靶RNA分子的存在或数量的放大信号。因此，当联合使用时，该方法可改进现有RNA检测技术的灵敏性。

所述可释放RNA区段可包含与靶RNA一致的序列，在所述情况下，释放的“可释放RNA区段”可如同靶RNA分子本身一样进一步结合新的核酶。通过如上重复步骤a)至b)，可实现靶RNA分子(或靶RNA分子的序列)的指数式扩增。因此，在第三方面，提供了扩增靶RNA分子的方法，其中所述方法包括：a)将靶RNA分子与第一方面的核酶一起在温度T1孵育，这允许所述靶RNA分子与包含在所述核酶中的一个或多个靶结合结构域结合，以及其中可释放RNA区段包含与所述靶RNA分子一致的序列；b)将结合靶RNA分子的核酶在温度T2孵育，这允许所述靶RNA分子和RNA区段从所述核酶中释放。在另一个实施例中，将步骤a)至b)重复一次或多次，其中从步骤b)释放的靶RNA分子和可释放RNA区段用于结合所述核酶的另一个拷贝。

许多RNA分子(例如微小RNA)充当用于疾病诊断的生物标志物。RNA病毒的基因组核酸的检测亦在诊断病毒感染和病毒导致的疾病中有用。可方便地修饰本发明的核酶以结合在疾病或病毒RNA中显示的(indicated)RNA生物标志物。这可通过使用本领域的普通技术来修饰靶结合结构域的序列以使其与所感兴趣的靶RNA分子上的特定区域互补或通过直接合成来实现。因此，在第四方面，提供了在受试者中诊断疾病的方法，所述方法包括：a)从受试者获得样品；b)使所述样品与根据第一方面的核酶一起在温度T1孵育，这允许疾病相关的靶RNA分子与包含在所述核酶中的一个或多个靶结合结构域结合；c)使所述样品在温度T2孵育，这允许所述靶RNA分子和可释放RNA区段从所述核酶中释放；d)检测来自所述核酶的可释放RNA区段的水平。

如在本文中使用的术语“受试者”，可指任何生物体。在一些实施例中，所述受试者可以是动物受试者或者更具体而言为人类受试者。在其他实施例中，所述受试者可以是植物或真菌。因此术语“疾病”包括人类疾病、动物疾病、植物疾病或真菌疾病。

如在本文中使用的术语“样品”，是指疑似含有靶RNA分子的样品。其可包括体液。本文中使用的术语“样品”是指生物样品，或者包含至少某些生物物质(例如核酸)的样品。本公开内容的生物样品可以是疑似含有靶核酸序列的任何样品，包括来自动物或人类受试者的液体样品，例如全血、血清、血浆、脑脊液、中央脊髓液、淋巴液、囊液、痰、粪便、胸腔积液、粘液、胸膜液、腹水、羊水、腹膜液、唾液、支气管灌洗液、尿和其他体液、或其提取物。本公开内容的生物样品亦可获自非动物受试者，例如植物、真菌或细菌。

在一个具体的实施例中，所述方法进一步包括将可释放RNA区段的水平与对照样品进行比较。如在本文中使用的术语“对照样品”，是指获自健康受试者的样品，根据步骤b)和c)将其与相同的核酶一起孵育。

在一些实施例中，T1为不超过50℃的温度。在其他实施例中，T1为0℃-50℃之间的温度、15℃-45℃之间的温度、25℃-45℃之间的温度、30℃-40℃之间的温度、35℃-38℃之间的温度、36.5℃-37.5℃之间的温度。在一个具体的实施例中，T1为约37℃的温度。

在一些实施例中，T2为20℃-100℃的温度、25℃-80℃的温度、30℃-80℃的温度、35℃-80℃的温度、40℃-80℃的温度、45℃-80℃的温度、50℃-80℃的温度、55℃-75℃的温度或者57℃-63℃的温度。在一个具体的实施例中，T2为约60℃的温度。

如在本说明书前文中所提及的，因为靶结合、核酶切割以及靶标和产物释放可跨越大范围的温度同时发生，所以有可能以相同或不同的T1和T2进行靶RNA分子的检测和扩增。然而，退火(在T1)和解链(在T2)循环的进行(其中T2高于T1)帮助向前推动反应并导致释放的可释放RNA产物的数目增加。因此，在一些实施例中，T2为高于T1的温度。在一些实施例中，靶分子的释放在T1和T2均发生。在一个实施例中，T1为25℃-45℃的温度，和T2为51℃-80℃的温度。

在第五方面，提供了编码本公开内容第一方面的核酶的多核苷酸。在其中核酶由多于一条RNA链组成的一些实施例中，所述RNA链可由一个多核苷酸一起编码或者由数个多核苷酸独立编码。

如在本文中使用的术语“多核苷酸”和“核酸”，在本文中可交换使用，是指任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链的DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合物、或包含嘌呤或嘧啶碱基或者其他天然核苷酸碱基、化学或生化修饰的非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。

在第六方面，进一步提供了包括本公开内容第一方面的核酶的试剂盒。

在一个具体的实施例中，所述试剂盒进一步包括RNA检测系统。在一些实施例中，所述RNA检测系统包括RNA激活的荧光传感器。在一个具体的实施例中，所述传感器为Pandan荧光传感器或检测系统(PCT专利PCT/SG2017/050086；Aw等，Nucleic AcidsResearch 2016)。在另一个实施例中，所述RNA检测系统为基于CRISPR-Cas的核酸检测系统。基于CRISPR-Cas的RNA检测方法和系统为本领域已知的，且公开于例如Chen,J.S.等，CRISPR-Cas12a target-binding unleashes indiscriminate single-stranded DNaseactivity.Science 360，436-439，doi:10.1126/science.aar6245(2018)，和Gootenberg,J.S.等，Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13,Cas12a,and Csm6.Science 360，439-444，doi:10.1126/science.aaq0179(2018)。

在本文中说明性描述的本发明，可在不存在任一个要素或任何要素、任一个限制或任何限制的情况下适当实施，所述要素、限制未在本文中具体公开。因此，例如术语“包括”、“包含”、“含有”等，应扩展且不受限制地理解。另外，本文中所用的术语和表达是用作描述而非限制的术语，以及不意图在使用所述术语和表达时排除显示和描述的特征的任何等同物或其部分，但认为在权利要求的发明范围内的各种修改为可能的。因此，应理解的是，尽管通过优选的实施方案和任选的特征具体公开了本发明，但本文所公开的其中实施的本发明的修改和变动为本领域技术人员可采用的，且认为所述修改和变动在本发明的范围之内。

本文概括且通用地描述了本发明。落入通用公开内容之内的更窄的种类和亚属分组各自亦形成本发明的部分。这包括具有从属中移除任何主题物质的限制性条款或否定限制的本发明的通用描述，而不论移除的物质是否在本文中具体描述。

其他实施方案在下文权利要求和非限制性实施例之内。

试验部分

使用Cas13、Cas12a和Csm6的检测平台(detection platform with Cas13,Cas12a,and Csm6).Science 360，439-444，doi:10.1126/science.aaq0179(2018)。

本文概括且通用性地描述了本发明。落入通用公开内容之内的更窄的种类和亚属分组各自亦形成本发明的一部分。这包括具有从属中移除任何主题名称的限制性条件或否定限制的本发明的通用描述，而不论移除的材料是否在本文中具体描述。

1.用于核酶产生和切割试验的方法

模板的PCR扩增

根据制造商说明书，使用含HF缓冲液的Phusion高保真PCR Master Mix(目录号F531L；Thermo Fisher Scientific，美国)进行用于RNA链体外转录的模板的PCR扩增，所述RNA链用于切割反应。使用的引物和模板如上所示设计以及在随附序列表中。根据制造商方案，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(目录号28106；Qiagen，美国)纯化所得的PCR产物。

RNA的体外转录

将纯化的PCR产物用作模板，用于根据制造商方案使用Epicentre AmpliScribe^TMT7-Flash^TM转录试剂盒(目录号ASF3507 Lucigen，美国)的体外转录。反应之后，向20μL的体外转录反应中加入280μL无RNA酶水(目录号SH30538.02；Hyclone，美国)。通过加入300μLpH 4.5的酸-酚:氯仿(含IAA，125:24:1)(目录号AM9722 Invitrogen，美国)、混合并在14,000rpm于室温离心3min来纯化RNA。将水相转移至新离心管，并加入300μL氯仿。将混合物再次在14,000rpm于室温离心3min。将水相转移至新离心管并使用1/10体积(25μL)pH 5.2的3M乙酸钠和2.5x体积(625μL)100％乙醇来沉淀RNA。于-20℃沉淀过夜之后，将样品在13,000rpm于4℃离心20min。弃去上清液，用冷的75％乙醇洗涤RNA沉淀，并再次在13,000rpm于4℃离心20min。离心之后，完全去除上清液并使沉淀进行空气干燥约30秒。用50μL无RNA酶水重悬沉淀，并使用NanoDrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国)测定其浓度。

切割反应

将退火和切割反应设定为S1和S2各200nM，加入水(对照)或50nM(除非另有规定)的各靶RNA。以600μL的总体积在反应缓冲液(50mM Tris、12mM氯化镁和5mM四盐酸精胺，pH7.4)中进行反应。将600μL反应体积分成各100μL的6个等份，并移取到PCR联排管中。使用以下程序在热循环仪中孵育样品：

1. 60℃，1min

2. 56.5℃，1min

3. 53℃，1min

4. 49.5℃，1min

5. 46℃，1min

6. 42.5℃，1min

7. 39℃，1min

8. 37℃，15min

9.将步骤1-8循环9次

RNA沉淀以用于显影

在切割反应结束时，将各样品转移至15mL离心管，并加入900μL终止缓冲液(7M尿素和50nM EDTA)来终止。通过加入1.8mL pH 4.5的酸-酚:氯仿(含IAA，125:24:1)(目录号AM9722 Invitrogen，美国)来纯化RNA。将各样品混合并在13,000rpm于4℃离心15min。将水相转移至新离心管，并加入1.8mL氯仿(目录号07278-00Kanto Chemical，日本)。将各样品再次混合并在13,000rpm于4℃离心15min。将水相转移至新离心管，并用1/10体积(120μL)pH 5.2的3M乙酸钠、2.5x体积(3.3mL)100％乙醇、2μL RNA级糖原(目录号R0551；ThermoFisher Scientific，美国)和1/100体积(43μL)1M氯化镁来沉淀。于-20℃沉淀过夜之后，将样品在13,000rpm于4℃离心1小时。弃去上清液，用冷的75％乙醇洗涤RNA沉淀，将其转移至1.5mL微量离心管，并再次在13,000rpm于4℃离心30min。离心之后，完全去除上清液并使沉淀进行空气干燥约10秒。用10μL无RNA酶水重悬RNA沉淀，并使用NanoDrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测定其浓度。

将300μg的RNA于70℃热变性10min，用RNA上样染料(目录号B0363S NEB，美国)上样并在10x TBE(Tris/硼酸/EDTA)缓冲液(目录号1610770Bio-Rad，美国)中用10％变性聚丙烯酰胺凝胶(目录号EC-833 National Diagnostics，美国)于200V分离1小时，或直至染料前沿迁移至凝胶的底部。将低范围ssRNA分子量标准(ladder)(目录号N0364S NEB，美国)上样作为大小标准，并向分子量标准中掺入25ng的29nt寡核苷酸(5’-GUCCUUAGUCGAAAGUUUUACUAGAGUCA-3’)(IDT)(SEQ ID NO.25)作为另外的大小标志物，其对应于预期切割产物的大小。适当时，亦向分子量标准中掺入25ng靶序列作为大小标志物。使用1:10,000SYBR^TM Gold核酸凝胶染料(目录号S11494 Invitrogen，美国)将凝胶染色，并使用Gel Doc XR+凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)显影。使用Image Lab软件(Bio-Rad，美国)分析影像。

灵敏性测定

使用Tlet7f_Cban3pR核酶来测定核酶检测的灵敏性，所述核酶检测hsa-let-7f-5p。进行靶miRNA的连续稀释。然后以50nM、10nM和0.1nM的最终工作浓度将这些连续稀释物加到切割反应中。各切割反应含200nM针对hsa-let-7f-5p的核酶。

特异性测定

通过以下来测定Tlet7f_Cban3pR核酶的序列特异性：1)加入具有不同序列(hsa-miR-122-5p：5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’)(SEQ ID NO.24)的miRNA；2)加入等浓度的两种miRNA(hsa-let-7f-5p和hsa-miR-122-5p)，或3)以一系列浓度(与靶miRNA量的相比10倍、100倍或1000倍总RNA)向RNA混合物中掺入从成年黑腹果蝇提取的总RNA。各切割反应含200nM针对hsa-let-7f-5p的核酶。

2.用于核酶设计(具有两个靶结合结构域构型)的序列

具有两个靶结合结构域的核酶(例如类似于发明详述中的结构III-V的核酶)由两条RNA链组成：链S1(含有RNA切割产物)和链S2(该链将不被切割)。为了生成S1和S2 RNA，我们使用通过PCR生成的DNA模板进行体外RNA转录。DNA模板和引物从Integrated DNAtechnologies(IDT)订购。将用以扩增S1和S2链的正向引物设计成包含用于T7 RNA聚合酶的5’启动子序列(5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGA-3’)(SEQ ID NO.:7)；3’末端GGGA将包含在最终转录的RNA中并包含在其5’端。然而，所述GGGA并非S1或S2的功能部分。将用于扩增S1和S2的正向和反向引物分别设计成编码与靶RNA分子的3’区和5’区互补的序列。首先显示靶向微小RNA的核酶的实施例，接着为靶向病毒RNA序列的核酶的实施例。

A.靶向微小RNAdme-ban-5p(Tban5p_Cban3pR)和hsa-let-7f(Tlet7f-Cban3pR)的核酶的实施例，二者切下dme-ban3p反向序列)。

表1.靶向微小RNA dme-ban-5p(Tban5p_Cban3pR)和hsa-let-7f(Tlet7f- Cban3pR)的核酶的实施例，二者切下dme-ban3p反向序列)。加下划线(______)的序列代表包含在靶结合结构域上的序列。加波浪下划线

的序列代表包含在可释放RNA区段上的序列，或者包含在与可释放RNA区段相反且至少部分互补的区域上的序列。

i)包含两个催化结构域和两个抑制结构域(“toehold”)的核酶的通用图示 (general schematic)(例如类似于发明详述中的结构V的核酶)

S1的序列含有切割产物。在该实施例中，所述切割产物具有序列{GUCCUUAGUCGAAAGUUUUACUAGAGUCA}(SEQ ID NO 25，其中加下划线的核苷酸对应于dme-ban3p(如在发明详述中所定义的可变的“可释放RNA区段”)的反向序列。注意5’端的GUCC和3’端的CA对于在切割位点的切割而言为必需的，并因此不是“可释放RNA区段”的一部分，而是切割产物的一部分。如下为S1和S2的图示形式，此处(n)_a和(n)_b代表与靶miRNA互补的序列，并通过{}界定(demarcated)切割产物：

S1序列：

5’-(n)_aGUAUAUUAGUAUAUUACCUGGUUUUCGAUCGAAAGAUCGACGAGGUGAAAACCUCGUGACA{GUCCUUAGUCGAAAGUUUUACUAGAGUCA}GUCCUGAUUGUGCUCGAAAGAGCACAGACCUGAAAAGGUCUUUCGUGGUAUAUUACUCUCUGAA(n)_b-3’(SEQ ID NO.:8)。

S2序列：

5’-(n)_aGUAAUAUAAGAAACACACGAAUCAGAGAAGACGAGCGUCCCACGGGCGCAGAAGAGAAGUCAACCAGAGAAACAUAAUAUAC(n)_b-3’(SEQ ID NO.:9)。

ii)示例性核酶序列：

核心S1模板(可用作所有核酶的S1的PCR模板)(SEQ ID NO.:10)：

5’-CTGGTTTTCGATCGAAAGATCGACGAGGTGAAAACCTCGTGACAGTCCTTAGTCGAAAGTTTTACTAGAGTCAGTCCTGATTGTGCTCGAAAGAGCAC-3’

核心S2模板(可用作所有核酶的S1的PCR模板)(SEQ ID NO.:11)：

5’-AGAAACACACGAATCAGAGAAGACGAGCGTCCCACGGGCGCAGAAGAGAAGTCA-3’

实施例1：果蝇(Drosophila)bantam-5p核酶

dme-ban-5p的序列：5’-CCGGUUUUCGAUUUGGUUUGACU-3’(SEQ ID NO.:2)

5’配对序列的反向互补序列：AUCGAAAACCGG(SEQ ID NO.:12)。

3’配对序列的反向互补序列：AGUCAAACCAA(SEQ ID NO.:13)。

S1正向引物(用于dme-ban-5p)：(T7启动子序列加下划线)(SEQ ID NO.:14)：

5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGAAGTCAAACCAAGTATATTAGTATATTACCTGGTTTTCGATCGAAAGATC-3’

S1反向引物(用于dme-ban-5p)(SEQ ID NO.:15)：

5’-CCGGTTTTCGATTTCAGAGAGTAATATACCACGAAAGACCTTTTCAGGTCTGTGCTCTTTCGAGCACAATC-3’

S2正向引物(用于dme-ban-5p)：(T7启动子序列加下划线)(SEQ ID NO.:16)：

5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGAAGTCAAACCAAGTAATATAAGAAACACACGAATCAGAGAA-3’

S2反向引物(用于dme-ban-5p)(SEQ ID NO.:17)：

5’-CCGGTTTTCGATGTATATTATGTTTCTCTGGTTGACTTCTCTTCTGCG-3’

得到的dme-ban-5p核酶的S1链(SEQ ID NO.:2)：

5’-GGGAAGUCAAACCAAGUAUAUUAGUAUAUUACCUGGUUUUCGAUCGAAAGAUCGACGAGGUGAAAACCUCGUGACAGUCCUUAGUCGAAAGUUUUACUAGAGUCAGUCCUGAUUGUGCUCGAAAGAGCACAGACCUGAAAAGGUCUUUCGUGGUAUAUUACUCUCUGAAAUCGAAAACCGG-3’

得到的dme-ban-5p核酶的S2链(SEQ ID NO.:3)：

5’-GGGAAGUCAAACCAAGUAAUAUAAGAAACACACGAAUCAGAGAAGACGAGCGUCCCACGGGCGCAGAAGAGAAGUCAACCAGAGAAACAUAAUAUACAUCGAAAACCGG-3’

实施例2：人let-7f-5p核酶

hsa-let-7f-5p的序列：5’-UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU-3’(SEQ ID NO.:4)

5’配对序列的反向互补序列：CUACUACCUCA(SEQ ID NO.:18)。

3’配对序列的反向互补序列：AACUAUACAAU(SEQ ID NO.:19)。

S1正向引物(用于hsa-let-7f-5p)：(T7启动子序列加下划线)(SEQ ID NO.:20)：

5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGAAACTATACAATGTATATTAGTATATTACCTGGTTTTCGATCGAAAGATC-3’

S1反向引物(用于hsa-let-7f-5p)(SEQ ID NO.:21)：

5’-TGAGGTAGTAGTTCAGAGAGTAATATACCACGAAAGACCTTTTCAGGTCTGTGCTCTTTCGAGCACAATC-3’

S2正向引物(用于hsa-let-7f-5p)：(T7启动子序列加下划线)(SEQ ID NO.:22)：

5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGAAACTATACAATGTAATATAAGAAACACACGAATCAGAGAA-3’

S2反向引物(用于hsa-let-7f-5p)(SEQ ID NO.:23)：

5’-TGAGGTAGTAGGTATATTATGTTTCTCTGGTTGACTTCTCTTCTGCG-3’

得到的hsa-let-7f-5p核酶的S1链(SEQ ID NO.:5)：

5’-GGGAAACUAUACAAUGUAUAUUAGUAUAUUACCUGGUUUUCGAUCGAAAGAUCGACGAGGUGAAAACCUCGUGACAGUCCUUAGUCGAAAGUUUUACUAGAGUCAGUCCUGAUUGUGCUCGAAAGAGCACAGACCUGAAAAGGUCUUUCGUGGUAUAUUACUCUCUGAACUACUACCUCA-3’

得到的hsa-let-7f-5p核酶的S2链(SEQ ID NO.:6)：

5’-GGGAAACUAUACAAUGUAAUAUAAGAAACACACGAAUCAGAGAAGACGAGCGUCCCACGGGCGCAGAAGAGAAGUCAACCAGAGAAACAUAAUAUACCUACUACCUCA-3’

B.靶向来自SARS-CoV-2病毒基因组的不同大小的病毒RNA序列(Orf1ab和E基因) 的核酶的实施例，其切下dme-ban3p反向序列)

基于在用于SARS-CoV-2检测的其他方案中的使用，选择了两个基因用于检测：Orf1ab基因和E基因。注意本文所用的序列与上文提及的用于其他方法的确切序列略有不同。由于靶序列很长，所以经由体外转录制备靶RNA，且所得RNA包含5’T7启动子序列(5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGA-3’)(SEQ ID NO.:7)。核酶的序列和靶序列在下表中概述(T7启动子序列加下划线)。

表2.靶向来自SARS-CoV-2病毒基因组的不同大小的病毒RNA序列(Orf1ab和E基因)的核酶的实施例，其切下dme-ban3p反向序列)

用于扩增各核酶的S1和S2链的引物：

S1_Orf1ab_基因_20_F(SEQ ID NO.52)：

5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGAGCAGCCATTAGTATATTAGTATATTACCTGGTTTTCGATCGAAAGATC-3’

S1_Orf1ab_基因_20_R(SEQ ID NO.53)：

5’-GGGACAGATCTTCAGAGAGTAATATACCACGAAAGACCTTTTCAGGTCTGTGCTCTTTCGAGCACAATC-3’

S2_Orf1ab_基因_20_F(SEQ ID NO.54)：

5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGAGCAGCCATTAGTAATATAAGAAACACACGAATCAGAGAA-3’

S2_Orf1ab_基因_20_R(SEQ ID NO.55)：

5’-GGGACAGATCGTATATTATGTTTCTCTGGTTGACTTCTCTTCTGCG-3’

S1_Orf1ab_基因_40_F(SEQ ID NO.56)：

5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGAATTAGGTTTCTTAATAGTAAGTATATTAGTATATTACCTGGTTTTCGATCGAAAGATC-3’

S1_Orf1ab_基因_40_R(SEQ ID NO.57)：

5’-GGGAGTAGACAATTCTAGTCTTCAGAGAGTAATATACCACGAAAGACCTTTTCAGGTCTGTGCTCTTTCGAGCACAATC-3’

S2_Orf1ab_基因_40_F(SEQ ID NO.58)：

5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGAATTAGGTTTCTTAATAGTAAGTAATATAAGAAACACACGAATCAGAGAA-3’

S2_Orf1ab_基因_40_R(SEQ ID NO.59)：

5’-GGGAGTAGACAATTCTAGTCGTATATTATGTTTCTCTGGTTGACTTCTCTTCTGCG-3’

S1_E_基因_60_F(SEQ ID NO.60)：

5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGATTTTACAAGACTCACGTTAACAATATTGCAGTATATTAGTATATTACCTGGTTTTCGATCGAAAGATC-3’

S1_E_基因_60_R(SEQ ID NO.61)：

5’-GGGACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTTCAGAGAGTAATATACCACGAAAGACCTTTTCAGGTCTGTGCTCTTTCGAGCACAATC-3’

S2_E_基因_60_F(SEQ ID NO.62)：

5’-GTATAATACGACTCACTATAGGGATTTTACAAGACTCACGTTAACAATATTGCAGTAATATAAGAAACACACGAATCAGAGAA-3’

S2_E_基因_60_R(SEQ ID NO.63)：

5’-GGGACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCGTATATTATGTTTCTCTGGTTGACTTCTCTTCTGCG-3’。

上文提及的核酶亦可以“重复串联核酶)构型排列，如在图1G-I中所述。表3提供呈所述构型(具体而言在图1l中阐述的构型)的核酶的示例性序列，其靶向微小RNA dme-ban-5p、hsa-let-7f-5p和不同长度的病毒Orf1ab基因片段。

表3.呈所述构型(具体而言在图1F中阐述的构型)的核酶的示例性序列。加下划线(______)的序列代表包含在靶结合结构域上的序列。加波浪下划线

实施例3.上述核酶均包含抑制结构域(“toehold”)以将背景切割活性降至最低。如在发明详述中所描述的，我们亦在本文中公开了不含toehold特征的核酶(例如类似于发明详述中的结构III的核酶)。下表提供了靶向微小RNA dme-ban-5p、hsa-let-7f-5p和不同长度的病毒Orf1ab和E基因片段的核酶(不含toehold)的序列。

下表中的核酶遵循通用S1序列：

5’-(n)_aGGGAAGUGGUAUAUUACCUGGUUUUCGAUCGAAAGAUCGACGAGGUGAAAACCUCGUGACAGUCC(n)_xCAGUCCUGAUUGUGCUCGAAAGAGCACAGACCUGAAAAGGUCUUUCGUGGUAUAUUACCUGGUCCC(n)_b-3’(SEQ ID.:80)，和通用S2序列：

5’-(n)_aGGGACCAGAGAAACACACGAAUCAGAGAAG(n)_xGAGAAGUCAACCAGAGAAACACACUUCCC(n)_b-3’(SEQ ID.:83)，其中(n)_x代表可释放RNA区段，以及(n)_a和(n)_b代表与第一和第二靶RNA分子互补的序列。

表4.不含toehold(抑制结构域)的核酶的实施例。加下划线(______)的序列代表包含在靶结合结构域上的序列。加波浪下划线

实施例4.所述核酶可以是单催化结构域构型的。这些核酶仅包含1条RNA链，类似于发明详述中的结构I和II。

以下提供了单催化结构域核酶的通用序列：

5’-(n)_aGUAUAUUAGUAUAUUACCUGGUUUUCGAUCGAAAGAUCGACGAGGUGAAAACCUCGUGACAGUCC(n)_xCAGUCCUGAUUGUGAUCGAAAGAGCACAGACCUGAAAAGGUCUUUCUGGUUUCGACCAGAAUCAGAGAAG(n)_yGAGAAGUCAACCAGAGAAACAUAAUAUAC(n)_b-3’(SEQ ID.:88)，其中(n)_a和(n)_b代表与第一和第二靶RNA分子互补的序列；(n)_x代表可释放RNA区段，而(n)_y代表与可释放RNA区段互补的序列。

在表5提供了在图10中检测的2个特异性核酶的序列：

表5.包含单催化结构域的核酶的实施例。加单下划线(______)的序列代表包含在靶结合结构域上的序列。加波浪下划线

的序列代表包含在可释放RNA区段上的序列。加粗下划线

的序列代表包含在与可释放RNA区段相反且至少部分互补的区域上的序列。

3.结果

图3显示一个示例性核酶的工作原理。在该实施例中，所述核酶通过两个发夹状核酶反向连接，所述两个发夹状核酶为串联排列的，各自具有含可变茎部区域和靶miRNA的互补序列的经修饰的螺旋4。连接所述核酶与靶RNA的互补侧的可变茎部，被设计成与催化环具有部分互补性，充当“toehold”以将自切割降至最低。不存在靶RNA时，不发生切割，且不释放切割产物。退火循环期间的靶RNA结合激活切割，释放RNA产物(该产物的序列可以是不同的，且具有与核酶的松散互补性，由此偏向切割而不是再连接)；RNA切割产物和靶miRNA均在解链循环期间释放。因此释放的靶RNA分子可在下一轮退火循环中与未切割的核酶(过量存在)再次结合。因为核酶为过量的，所以单个靶miRNA可激活多个串联HpRz的自切割，导致多个切割产物的释放，从而放大靶RNA信号。

另外，切割产物序列可与靶RNA的序列相同，从而允许指数式扩增。)

图4和5显示针对miRNA dme-bantam-5p的核酶与其靶标一起检测的结果。增加miRNA水平(图4)和增加循环数(图4和5)导致产生的切割产物的水平增加3-4倍。鉴于以相对于靶标4x摩尔比提供核酶，这证实提供的核酶被完全切割。

所述核酶亦对人miRNA起作用，如通过hsa-let-7f传感器所证实(图6)。当以相对于靶miRNA 2000倍摩尔比提供let-7f传感器的量时(200nM传感器与0.1nM靶标)，靶信号放大约200倍(图6)。

所述核酶为特异性的，能够区分其靶RNA和不同的微小RNA，以及可从浓度为其靶RNA 1000倍的复杂的RNA混合物中检测其靶标(图7)。

所述核酶可检测并扩增长为40nt、60nt和80nt的靶RNA分子，所述靶RNA分子含有来自冠状病毒SARS-CoV-2基因组的基因(Orf1ab和E基因)的RNA序列片段。在各反应中提供200nM的核酶和50nM的靶RNA。

通过核酶的自切割生成的切割产物可用于激活Pandan荧光，如与不能切割的突变型核酶进行比较(图9)。

我们亦测试了具有单催化结构域构型的核酶。所述单催化结构域构型能够切割两个切割位点以导致RNA产物的释放。测试了两个“单催化结构域”构型，二者均靶向微小RNAdme-ban-5p。(B)设计1和2均在与靶RNA分子(dme-ban-5p)一起孵育后有效释放切割产物(ban3p反向RNA)。

在靶向dme-ban-5p(靶RNA分子)的核酶的切割反应中测试了范围从50℃至90℃的解链温度。范围从50℃以上至90℃的温度在促进切割产物释放上尤其有效。

4.序列表

序列表

<110> 新加坡科技研究局

<120> 包含靶结合结构域的核酶

<130> 9869SG5876

<150> SG 10201903323U

<151> 2019-04-12

<160> 102

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性靶RNA dme-bantam-5p的序列

<400> 1

ccgguuuucg auuugguuug acu 23

<210> 2

<211> 181

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 所得的dme-ban-5-核酶的S1链(S1_Tban5p_Cban3pR)

<400> 2

gggaagucaa accaaguaua uuaguauauu accugguuuu cgaucgaaag aucgacgagg 60

ugaaaaccuc gugacagucc uuagucgaaa guuuuacuag agucaguccu gauugugcuc 120

gaaagagcac agaccugaaa aggucuuucg ugguauauua cucucugaaa ucgaaaaccg 180

g 181

<210> 3

<211> 109

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 所得的dme-ban-5p-核酶的S2链(S2_Tban5p_Cban3pR)

<400> 3

gggaagucaa accaaguaau auaagaaaca cacgaaucag agaagacgag cgucccacgg 60

gcgcagaaga gaagucaacc agagaaacau aauauacauc gaaaaccgg 109

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性靶RNA hsa-let-7f-5p的序列

<400> 4

ugagguagua gauuguauag uu 22

<210> 5

<211> 180

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 所得的hsa-let-7f-5p-核酶的S1链

(S1_Tlet7f_Cban3pR)

<400> 5

gggaaacuau acaauguaua uuaguauauu accugguuuu cgaucgaaag aucgacgagg 60

ugaaaaccuc gugacagucc uuagucgaaa guuuuacuag agucaguccu gauugugcuc 120

gaaagagcac agaccugaaa aggucuuucg ugguauauua cucucugaac uacuaccuca 180

<210> 6

<211> 108

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 所得的hsa-let-7f-5p-核酶的S2链

(S2_Tlet7f_Cban3pR)

<400> 6

gggaaacuau acaauguaau auaagaaaca cacgaaucag agaagacgag cgucccacgg 60

gcgcagaaga gaagucaacc agagaaacau aauauaccua cuaccuca 108

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7启动子序列

<400> 7

gtataatacg actcactata ggga 24

<210> 8

<211> 156

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 带有示例性切割产物的S1序列，且(n)a和(n)b代表与靶RNA分子互补的序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> (n)a代表与靶RNA分子互补的第一序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (63)..(91)

<223> 示例性切割产物SEQ ID NO. 25

<220>

<221> misc_feature

<222> (156)..(156)

<223> (n)b代表与靶RNA分子互补的第二序列。

<400> 8

nguauauuag uauauuaccu gguuuucgau cgaaagaucg acgaggugaa aaccucguga 60

caguccuuag ucgaaaguuu uacuagaguc aguccugauu gugcucgaaa gagcacagac 120

cugaaaaggu cuuucguggu auauuacucu cugaan 156

<210> 9

<211> 84

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2序列。(n)a和(n)b代表与靶RNA分子互补的序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> (n)a代表与靶RNA分子互补的第一序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (84)..(84)

<223> (n)b代表与靶RNA分子互补的第二序列。

<400> 9

nguaauauaa gaaacacacg aaucagagaa gacgagcguc ccacgggcgc agaagagaag 60

ucaaccagag aaacauaaua uacn 84

<210> 10

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核心S1 DNA模板

<400> 10

ctggttttcg atcgaaagat cgacgaggtg aaaacctcgt gacagtcctt agtcgaaagt 60

tttactagag tcagtcctga ttgtgctcga aagagcac 98

<210> 11

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核心S2 DNA模板

<400> 11

agaaacacac gaatcagaga agacgagcgt cccacgggcg cagaagagaa gtca 54

<210> 12

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dme-ban-5p的5’配对序列的反向互补序列

<400> 12

aucgaaaacc gg 12

<210> 13

<211> 11

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dme-ban-5p的3’配对序列的反向互补序列

<400> 13

agucaaacca a 11

<210> 14

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于dme-ban-5p的S1正向引物

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 14

gtataatacg actcactata gggaagtcaa accaagtata ttagtatatt acctggtttt 60

cgatcgaaag atc 73

<210> 15

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于dme-ban-5p的S1反向引物

<400> 15

ccggttttcg atttcagaga gtaatatacc acgaaagacc ttttcaggtc tgtgctcttt 60

cgagcacaat c 71

<210> 16

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于dme-ban-5p的S2反向引物

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 16

gtataatacg actcactata gggaagtcaa accaagtaat ataagaaaca cacgaatcag 60

agaa 64

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于dme-ban-5p的S2反向引物

<400> 17

ccggttttcg atgtatatta tgtttctctg gttgacttct cttctgcg 48

<210> 18

<211> 11

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-let-7f-5p的5’配对序列的反向互补序列

<400> 18

cuacuaccuc a 11

<210> 19

<211> 11

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-let-7f-5p的3’配对序列的反向互补序列

<400> 19

aacuauacaa u 11

<210> 20

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于hsa-let-7f-5p的S1正向引物

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 20

gtataatacg actcactata gggaaactat acaatgtata ttagtatatt acctggtttt 60

cgatcgaaag atc 73

<210> 21

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于hsa-let-7f-5p的S1反向引物

<400> 21

tgaggtagta gttcagagag taatatacca cgaaagacct tttcaggtct gtgctctttc 60

gagcacaatc 70

<210> 22

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于hsa-let-7f-5p的S2正向引物

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 22

gtataatacg actcactata gggaaactat acaatgtaat ataagaaaca cacgaatcag 60

agaa 64

<210> 23

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于hsa-let-7f-5p的S2反向引物

<400> 23

tgaggtagta ggtatattat gtttctctgg ttgacttctc ttctgcg 47

<210> 24

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-122-5p，具有与靶RNA分子不同序列的对照RNA分子，用以测定核酶的序列特异性

<400> 24

uggaguguga caaugguguu ug 22

<210> 25

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO. 8的示例性切割产物。

<400> 25

guccuuaguc gaaaguuuua cuagaguca 29

<210> 26

<211> 134

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 含toehold的示例性S1序列。(n)x代表可释放RNA区段，以及(n)a和(n)b代表与第一和第二靶RNA分子互补的序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> (n)a代表与靶RNA分子互补的第一序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (67)..(67)

<223> (n)x代表可释放RNA区段。

<220>

<221> misc_feature

<222> (134)..(134)

<223> (n)b代表与靶RNA分子互补的第二序列。

<400> 26

nguauauuag uauauuaccu gguuuucgau cgaaagaucg acgaggugaa aaccucguga 60

caguccncag uccugauugu gcucgaaaga gcacagaccu gaaaaggucu uucgugguau 120

auuacucucu gaan 134

<210> 27

<211> 65

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.: 26的(n)a (与靶RNA分子互补的第一序列)和(n)x (可释放RNA区段)之间的部分。

<400> 27

guauauuagu auauuaccug guuuucgauc gaaagaucga cgaggugaaa accucgugac 60

agucc 65

<210> 28

<211> 66

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.: 26的(n)x (切割产物)和(n)b (与靶RNA分子互补的第二序列)之间的部分。

<400> 28

caguccugau ugugcucgaa agagcacaga ccugaaaagg ucuuucgugg uauauuacuc 60

ucugaa 66

<210> 29

<211> 62

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性S2序列(含toehold)。(n)x代表与S1上的可释放RNA区段部分互补的区域，以及(n)a和(n)b代表与第二和第一靶RNA分子互补的序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> (n)a代表与靶RNA分子互补的第一序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> (n)x代表与S1上的可释放RNA区段部分互补的区域。

<220>

<221> misc_feature

<222> (62)..(62)

<223> (n)b代表与靶RNA分子互补的第二序列。

<400> 29

nguaauauaa gaaacacacg aaucagagaa gngagaaguc aaccagagaa acauaauaua 60

cn 62

<210> 30

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.: 29的(n)a (与第二靶RNA分子互补的序列)和(n)x (与可释放RNA区段部分互补的区域)之间的部分。

<400> 30

guaauauaag aaacacacga aucagagaag 30

<210> 31

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.: 29的(n)x (与可释放RNA区段部分互补的区域)和(n)b (与第二靶RNA分子互补的序列)之间的部分。

<400> 31

gagaagucaa ccagagaaac auaauauac 29

<210> 32

<211> 154

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1的基序[A]和[A’]之间的区域的示例性序列，以[A]至[A’]的方向。

<400> 32

guauauuagu auauuaccug guuuucgauc gaaagaucga cgaggugaaa accucgugac 60

aguccuuagu cgaaaguuuu acuagaguca guccugauug ugcucgaaag agcacagacc 120

ugaaaagguc uuucguggua uauuacucuc ugaa 154

<210> 33

<211> 82

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2的基序[a’]和[a]之间的区域的示例性序列，以[a’]至[a]的方向。

<400> 33

guaauauaag aaacacacga aucagagaag acgagcgucc cacgggcgca gaagagaagu 60

caaccagaga aacauaauau ac 82

<210> 34

<211> 107

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1的基序[B]和[B’]之间的区域的示例性序列，以[B]至[B’]的方向。

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(9)

<223> 催化结构域

<400> 34

guauauuacc ugguuuucga ucgaaagauc gacgagguga aaaccucgug acaguccuua 60

gucgaaaguu uuacuagagu caguccugau ugugcucgaa agagcac 107

<210> 35

<211> 66

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2的基序[b’]和[b]之间的区域的示例性序列，以[b’]至[b]的方向。

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(66)

<223> 催化结构域

<400> 35

agaaacacac gaaucagaga agacgagcgu cccacgggcg cagaagagaa gucaaccaga 60

gaaaca 66

<210> 36

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于不含T7启动子序列的dme-ban-5p的S1正向引物

<400> 36

agtcaaacca agtatattag tatattacct ggttttcgat cgaaagatc 49

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于不含T7启动子序列的dme-ban-5p的S2正向引物

<400> 37

agtcaaacca agtaatataa gaaacacacg aatcagagaa 40

<210> 38

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于不含T7启动子序列的hsa-let-7f-5p的S1正向引物

<400> 38

aactatacaa tgtatattag tatattacct ggttttcgat cgaaagatc 49

<210> 39

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于不含T7启动子序列的hsa-let-7f-5p的S2正向引物

<400> 39

aactatacaa tgtaatataa gaaacacacg aatcagagaa 40

<210> 40

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶RNA T7_Orf1ab_ 20

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 40

guauaauacg acucacuaua gggacagauc uaauggcugc 40

<210> 41

<211> 174

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1_Orf1ab _20

<400> 41

gcagccauua guauauuagu auauuaccug guuuucgauc gaaagaucga cgaggugaaa 60

accucgugac aguccuuagu cgaaaguuuu acuagaguca guccugauug ugcucgaaag 120

agcacagacc ugaaaagguc uuucguggua uauuacucuc ugaagaucug uccc 174

<210> 42

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2_Orf1ab_20

<400> 42

gcagccauua guaauauaag aaacacacga aucagagaag acgagcgucc cacgggcgca 60

gaagagaagu caaccagaga aacauaauau acgaucuguc cc 102

<210> 43

<211> 60

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶RNA T7_Orf1ab_ 40

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 43

guauaauacg acucacuaua gggaguagac aauucuaguc uuacuauuaa gaaaccuaau 60

<210> 44

<211> 194

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1_Orf1ab _40

<400> 44

auuagguuuc uuaauaguaa guauauuagu auauuaccug guuuucgauc gaaagaucga 60

cgaggugaaa accucgugac aguccuuagu cgaaaguuuu acuagaguca guccugauug 120

ugcucgaaag agcacagacc ugaaaagguc uuucguggua uauuacucuc ugaagacuag 180

aauugucuac uccc 194

<210> 45

<211> 122

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2_Orf1ab_40

<400> 45

auuagguuuc uuaauaguaa guaauauaag aaacacacga aucagagaag acgagcgucc 60

cacgggcgca gaagagaagu caaccagaga aacauaauau acgacuagaa uugucuacuc 120

cc 122

<210> 46

<211> 80

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7_E基因_60

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 46

guauaauacg acucacuaua gggacugcgc uucgauugug ugcguacugc ugcaauauug 60

uuaacgugag ucuuguaaaa 80

<210> 47

<211> 214

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1_E_基因_60

<400> 47

uuuuacaaga cucacguuaa caauauugca guauauuagu auauuaccug guuuucgauc 60

gaaagaucga cgaggugaaa accucgugac aguccuuagu cgaaaguuuu acuagaguca 120

guccugauug ugcucgaaag agcacagacc ugaaaagguc uuucguggua uauuacucuc 180

ugaagcagua cgcacacaau cgaagcgcag uccc 214

<210> 48

<211> 142

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2_E基因_60

<400> 48

uuuuacaaga cucacguuaa caauauugca guaauauaag aaacacacga aucagagaag 60

acgagcgucc cacgggcgca gaagagaagu caaccagaga aacauaauau acgcaguacg 120

cacacaaucg aagcgcaguc cc 142

<210> 49

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含T7启动子序列的靶RNA T7_Orf1ab_20

<400> 49

cagaucuaau ggcugc 16

<210> 50

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含T7启动子序列的靶RNA T7_Orf1ab_40

<400> 50

guagacaauu cuagucuuac uauuaagaaa ccuaau 36

<210> 51

<211> 56

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含T7启动子序列的T7_E基因_60

<400> 51

cugcgcuucg auugugugcg uacugcugca auauuguuaa cgugagucuu guaaaa 56

<210> 52

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于S1_Orf1ab_基因_20_F的S1正向引物

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 52

gtataatacg actcactata gggagcagcc attagtatat tagtatatta cctggttttc 60

gatcgaaaga tc 72

<210> 53

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1反向引物 S1_Orf1ab_基因_20_R

<400> 53

gggacagatc ttcagagagt aatataccac gaaagacctt ttcaggtctg tgctctttcg 60

agcacaatc 69

<210> 54

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2正向引物 S2_Orf1ab_基因_20_F

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 54

gtataatacg actcactata gggagcagcc attagtaata taagaaacac acgaatcaga 60

gaa 63

<210> 55

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2反向引物 S2_Orf1ab_基因_20_R

<400> 55

gggacagatc gtatattatg tttctctggt tgacttctct tctgcg 46

<210> 56

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1正向引物 S1_Orf1ab_基因_40_F

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 56

gtataatacg actcactata gggaattagg tttcttaata gtaagtatat tagtatatta 60

cctggttttc gatcgaaaga tc 82

<210> 57

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1反向引物 S1_Orf1ab_基因_40_R

<400> 57

gggagtagac aattctagtc ttcagagagt aatataccac gaaagacctt ttcaggtctg 60

tgctctttcg agcacaatc 79

<210> 58

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2正向引物 S2_Orf1ab_基因_40_F

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 58

gtataatacg actcactata gggaattagg tttcttaata gtaagtaata taagaaacac 60

acgaatcaga gaa 73

<210> 59

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2反向引物 S2_Orf1ab_基因_40_R

<400> 59

gggagtagac aattctagtc gtatattatg tttctctggt tgacttctct tctgcg 56

<210> 60

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1正向引物 S1_E_基因_60_F

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 60

gtataatacg actcactata gggattttac aagactcacg ttaacaatat tgcagtatat 60

tagtatatta cctggttttc gatcgaaaga tc 92

<210> 61

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1反向引物 S1_E_基因_60_R

<400> 61

gggactgcgc ttcgattgtg tgcgtactgc ttcagagagt aatataccac gaaagacctt 60

ttcaggtctg tgctctttcg agcacaatc 89

<210> 62

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2正向引物 S2_E_基因_60_F

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(24)

<223> T7启动子序列

<400> 62

gtataatacg actcactata gggattttac aagactcacg ttaacaatat tgcagtaata 60

taagaaacac acgaatcaga gaa 83

<210> 63

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2反向引物 S2_E_基因_60_R

<400> 63

gggactgcgc ttcgattgtg tgcgtactgc gtatattatg tttctctggt tgacttctct 60

tctgcg 66

<210> 64

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于不含T7启动子序列的S1_Orf1ab_基因_20_F的S1正向引物

<400> 64

gcagccatta gtatattagt atattacctg gttttcgatc gaaagatc 48

<210> 65

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2正向引物不含T7启动子序列的S2_Orf1ab_基因_20_F

<400> 65

gcagccatta gtaatataag aaacacacga atcagagaa 39

<210> 66

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1正向引物不含T7启动子序列的S1_Orf1ab_基因_40_F

<400> 66

attaggtttc ttaatagtaa gtatattagt atattacctg gttttcgatc gaaagatc 58

<210> 67

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2正向引物不含T7启动子序列的S2_Orf1ab_基因_40_F

<400> 67

attaggtttc ttaatagtaa gtaatataag aaacacacga atcagagaa 49

<210> 68

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1正向引物不含T7启动子序列的S1_E_基因_60_F

<400> 68

ttttacaaga ctcacgttaa caatattgca gtatattagt atattacctg gttttcgatc 60

gaaagatc 68

<210> 69

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2正向引物不含T7启动子序列的S2_E_基因_60_F

<400> 69

ttttacaaga ctcacgttaa caatattgca gtaatataag aaacacacga atcagagaa 59

<210> 70

<211> 181

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含toehold的dme-ban-5p的S1链

<400> 70

gggaagucaa accaagggaa gugguauauu accugguuuu cgaucgaaag aucgacgagg 60

ugaaaaccuc gugacagucc uuagucgaaa guuuuacuag agucaguccu gauugugcuc 120

gaaagagcac agaccugaaa aggucuuucg ugguauauua ccugguccca ucgaaaaccg 180

g 181

<210> 71

<211> 109

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含toehold的dme-ban-5p的S2链

<400> 71

gggaagucaa accaagggac cagagaaaca cacgaaucag agaagacgag cgucccacgg 60

gcgcagaaga gaagucaacc agagaaacac acuucccauc gaaaaccgg 109

<210> 72

<211> 180

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含toehold的hsa-let-7f-5p的S1链

<400> 72

gggaaacuau acaaugggaa gugguauauu accugguuuu cgaucgaaag aucgacgagg 60

ugaaaaccuc gugacagucc uuagucgaaa guuuuacuag agucaguccu gauugugcuc 120

gaaagagcac agaccugaaa aggucuuucg ugguauauua ccuggucccc uacuaccuca 180

<210> 73

<211> 108

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含toehold的hsa-let-7f-5p的S2链

<400> 73

gggaaacuau acaaugggac cagagaaaca cacgaaucag agaagacgag cgucccacgg 60

gcgcagaaga gaagucaacc agagaaacac acuuccccua cuaccuca 108

<210> 74

<211> 174

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含toehold的Orf1ab_基因_20nt的S1链

<400> 74

gcagccauua gggaaguggu auauuaccug guuuucgauc gaaagaucga cgaggugaaa 60

accucgugac aguccuuagu cgaaaguuuu acuagaguca guccugauug ugcucgaaag 120

agcacagacc ugaaaagguc uuucguggua uauuaccugg ucccgaucug uccc 174

<210> 75

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含toehold的Orf1ab_基因_20nt的S2链

<400> 75

gcagccauua gggaccagag aaacacacga aucagagaag acgagcgucc cacgggcgca 60

gaagagaagu caaccagaga aacacacuuc ccgaucuguc cc 102

<210> 76

<211> 194

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含toehold的Orf1ab_基因_40nt的S1链

<400> 76

auuagguuuc uuaauaguaa gggaaguggu auauuaccug guuuucgauc gaaagaucga 60

cgaggugaaa accucgugac aguccuuagu cgaaaguuuu acuagaguca guccugauug 120

ugcucgaaag agcacagacc ugaaaagguc uuucguggua uauuaccugg ucccgacuag 180

aauugucuac uccc 194

<210> 77

<211> 122

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含toehold的Orf1ab_基因_40nt的S2链

<400> 77

auuagguuuc uuaauaguaa gggaccagag aaacacacga aucagagaag acgagcgucc 60

cacgggcgca gaagagaagu caaccagaga aacacacuuc ccgacuagaa uugucuacuc 120

cc 122

<210> 78

<211> 214

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含toehold的E_基因_60nt的S1链

<400> 78

uuuuacaaga cucacguuaa caauauugca gggaaguggu auauuaccug guuuucgauc 60

gaaagaucga cgaggugaaa accucgugac aguccuuagu cgaaaguuuu acuagaguca 120

guccugauug ugcucgaaag agcacagacc ugaaaagguc uuucguggua uauuaccugg 180

ucccgcagua cgcacacaau cgaagcgcag uccc 214

<210> 79

<211> 142

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含toehold的E_基因_60nt的S2链

<400> 79

uuuuacaaga cucacguuaa caauauugca gggaccagag aaacacacga aucagagaag 60

acgagcgucc cacgggcgca gaagagaagu caaccagaga aacacacuuc ccgcaguacg 120

cacacaaucg aagcgcaguc cc 142

<210> 80

<211> 134

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性S1序列(不含toehold)。(n)x代表与S1上的可释放RNA区段部分互补的区域，以及(n)a和(n)b代表与靶miRNA分子互补的序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> (n)a代表与靶RNA分子互补的第一序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (67)..(67)

<223> (n)x代表与S1上的可释放RNA区段部分互补的区域。

<220>

<221> misc_feature

<222> (134)..(134)

<223> (n)b代表与靶RNA分子互补的第二序列。

<400> 80

ngggaagugg uauauuaccu gguuuucgau cgaaagaucg acgaggugaa aaccucguga 60

caguccncag uccugauugu gcucgaaaga gcacagaccu gaaaaggucu uucgugguau 120

auuaccuggu cccn 134

<210> 81

<211> 65

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.: 80的(n)a (与靶RNA分子互补的第一序列)和(n)x (可释放RNA区段)之间的部分。

<400> 81

gggaaguggu auauuaccug guuuucgauc gaaagaucga cgaggugaaa accucgugac 60

agucc 65

<210> 82

<211> 66

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.: 80的(n)x (切割产物)和(n)b (与靶RNA分子互补的第二序列)之间的部分。

<400> 82

caguccugau ugugcucgaa agagcacaga ccugaaaagg ucuuucgugg uauauuaccu 60

gguccc 66

<210> 83

<211> 62

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 示例性S2序列(不含toehold)。(n)x代表与S1上的可释放RNA区段部分互补的区域，以及(n)a和(n)b代表与第二和第一靶RNA分子互补的序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> (n)a代表与靶RNA分子互补的第一序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> (n)x代表与S1上的可释放RNA区段部分互补的区域。

<220>

<221> misc_feature

<222> (62)..(62)

<223> (n)b代表与靶RNA分子互补的第二序列。

<400> 83

ngggaccaga gaaacacacg aaucagagaa gngagaaguc aaccagagaa acacacuucc 60

cn 62

<210> 84

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.: 83的(n)a (与第二靶RNA分子互补的序列)和(n)x (与可释放RNA区段部分互补的区域)之间的部分。

<400> 84

gggaccagag aaacacacga aucagagaag 30

<210> 85

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.: 83的(n)x (与可释放RNA区段部分互补的区域)和(n)b (与第二靶RNA分子互补的序列)之间的部分。

<400> 85

gagaagucaa ccagagaaac acacuuccc 29

<210> 86

<211> 237

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tban5p_Cban3pR_单侧设计1_全长

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(15)

<223> 与靶RNA互补的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (81)..(103)

<223> 可释放RNA区段

<220>

<221> misc_feature

<222> (174)..(196)

<223> 与可释放RNA区段部分互补的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (226)..(237)

<223> 与靶RNA互补的序列

<400> 86

gggaagucaa accaaguaua uuaguauauu accugguuuu cgaucgaaag aucgacgagg 60

ugaaaaccuc gugacagucc uuagucgaaa guuuuacuag agucaguccu gauugugauc 120

gaaagagcac agaccugaaa aggucuuucu gguuucgacc agaaucagag aagacgagcg 180

ucccacgggc gcagaagaga agucaaccag agaaacauaa uauacaucga aaaccgg 237

<210> 87

<211> 193

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tban5p_Cban3pR_单侧设计2_全长

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(15)

<223> 与靶RNA分子互补的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (81)..(103)

<223> 可释放RNA区段

<220>

<221> misc_feature

<222> (130)..(152)

<223> 与可释放RNA区段部分互补的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (182)..(193)

<223> 与靶RNA分子互补的序列

<400> 87

gggaagucaa accaaguaua uuaguauauu accugguuuu cgaucgaaag aucgacgagg 60

ugaaaaccuc gugacagucc uuagucgaaa guuuuacuag agucaguccu gauuuucgaa 120

ucagagaaga cgagcguccc acgggcgcag aagagaaguc aaccagagaa acauaauaua 180

caucgaaaac cgg 193

<210> 88

<211> 168

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链核酶的示例性序列。

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> (n)a代表与靶RNA分子的第一区域互补的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (67)..(67)

<223> (n)x代表可释放RNA区段

<220>

<221> misc_feature

<222> (138)..(138)

<223> (n)y代表任选与可释放RNA区段互补的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (168)..(168)

<223> (n)b代表与靶RNA分子的第二区域互补的序列

<400> 88

nguauauuag uauauuaccu gguuuucgau cgaaagaucg acgaggugaa aaccucguga 60

caguccncag uccugauugu gaucgaaaga gcacagaccu gaaaaggucu uucugguuuc 120

gaccagaauc agagaagnga gaagucaacc agagaaacau aauauacn 168

<210> 89

<211> 65

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.: 88的(n)a和(n)x之间的部分

<400> 89

guauauuagu auauuaccug guuuucgauc gaaagaucga cgaggugaaa accucgugac 60

agucc 65

<210> 90

<211> 70

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.: 88的(n)x和(n)y之间的部分

<400> 90

caguccugau ugugaucgaa agagcacaga ccugaaaagg ucuuucuggu uucgaccaga 60

aucagagaag 70

<210> 91

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.: 88的(n)y和(n)b之间的部分

<400> 91

gagaagucaa ccagagaaac auaauauac 29

<210> 92

<211> 183

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1_Tban5p_Cban3pR_Dup

<400> 92

gggaagucaa accaaguaua uuaguauauu accugguuuu cgaucgaaag aucgacgagg 60

ugaaaaccuc gugacagucc uuagucgaaa guuuuacuag agucagucca gaaaucuccc 120

ucacuucggu gagggagauu ucugagaaga caccagagaa acauaauaua caucgaaaac 180

cgg 183

<210> 93

<211> 95

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2_Tban5p_Cban3pR_Dup

<400> 93

gggaagucaa accaaguaua uuaguauauu accugguguc ccacgggcgc agaagagaag 60

ucaaccagag aaacauaaua uacaucgaaa accgg 95

<210> 94

<211> 182

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1_Tlet7f_Cban3pR_Dup

<400> 94

gggaaacuau acaauguaua uuaguauauu accugguuuu cgaucgaaag aucgacgagg 60

ugaaaaccuc gugacagucc uuagucgaaa guuuuacuag agucagucca gaaaucuccc 120

ucacuucggu gagggagauu ucugagaaga caccagagaa acauaauaua ccuacuaccu 180

ca 182

<210> 95

<211> 94

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2_Tlet7f_Cban3pR_Dup

<400> 95

gggaaacuau acaauguaua uuaguauauu accugguguc ccacgggcgc agaagagaag 60

ucaaccagag aaacauaaua uaccuacuac cuca 94

<210> 96

<211> 180

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1_T_Orf1ab_20_Cban3pR_Dup

<400> 96

gggagcagcc auuaguauau uaguauauua ccugguuuuc gaucgaaaga ucgacgaggu 60

gaaaaccucg ugacaguccu uagucgaaag uuuuacuaga gucaguccag aaaucucccu 120

cacuucggug agggagauuu cugagaagac accagagaaa cauaauauac gaucuguccc 180

<210> 97

<211> 92

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2_T_Orf1ab_20_Cban3pR_Dup

<400> 97

gggagcagcc auuaguauau uaguauauua ccuggugucc cacgggcgca gaagagaagu 60

caaccagaga aacauaauau acgaucuguc cc 92

<210> 98

<211> 200

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1_T_Orf1ab_40_Cban3pR_Dup

<400> 98

gggaauuagg uuucuuaaua guaaguauau uaguauauua ccugguuuuc gaucgaaaga 60

ucgacgaggu gaaaaccucg ugacaguccu uagucgaaag uuuuacuaga gucaguccag 120

aaaucucccu cacuucggug agggagauuu cugagaagac accagagaaa cauaauauac 180

gacuagaauu gucuacuccc 200

<210> 99

<211> 112

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2_T_Orf1ab_40_Cban3pR_Dup

<400> 99

gggaauuagg uuucuuaaua guaaguauau uaguauauua ccuggugucc cacgggcgca 60

gaagagaagu caaccagaga aacauaauau acgacuagaa uugucuacuc cc 112

<210> 100

<211> 220

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S1_T_E基因_60_Cban3pR_Dup

<400> 100

gggauuuuac aagacucacg uuaacaauau ugcaguauau uaguauauua ccugguuuuc 60

gaucgaaaga ucgacgaggu gaaaaccucg ugacaguccu uagucgaaag uuuuacuaga 120

gucaguccag aaaucucccu cacuucggug agggagauuu cugagaagac accagagaaa 180

cauaauauac gcaguacgca cacaaucgaa gcgcaguccc 220

<210> 101

<211> 132

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S2_T_E基因_60_Cban3pR_Dup

<400> 101

gggauuuuac aagacucacg uuaacaauau ugcaguauau uaguauauua ccuggugucc 60

cacgggcgca gaagagaagu caaccagaga aacauaauau acgcaguacg cacacaaucg 120

aagcgcaguc cc 132

<210> 102

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RNA T7启动子序列

<400> 102

guauaauacg acucacuaua ggga 24

Claims

1.一种核酶，其包含：

a)一个或多个催化结构域，所述催化结构域能够在活性状态和无活性状态之间转换；

b)一个或多个可释放RNA区段，其中所述可释放RNA区段各自侧翼为两个核酶切割位点，其中每个切割位点被活性状态的一个或多个催化结构域的至少一个切割；

c)一个或多个靶结合结构域，所述一个或多个靶结合结构域的每个用于结合靶RNA分子；

其中所述一个或多个催化结构域的每个与所述一个或多个靶结合结构域之一连接；

其中当与催化结构域连接的靶结合结构域未结合靶RNA分子时，所述催化结构域为无活性状态的，而其中当与催化结构域连接的靶结合结构域结合了靶RNA分子时，所述催化结构域呈活性状态；和

其中当位于可释放RNA区段侧翼的两个切割位点均被所述一个或多个催化结构域切割时，所述一个或多个可释放RNA区段从核酶中释放。

2.根据权利要求1所述的核酶，其进一步包含一个或多个抑制结构域；

其中所述一个或多个催化结构域的至少一个与所述一个或多个抑制结构域之一连接，其中所述催化结构域因来自抑制结构域的抑制而呈无活性状态，所述抑制结构域与所述一个或多个靶结合结构域之一连接；

其中当一个或多个靶结合结构域之一与靶RNA分子结合时，与所述靶结合结构域连接的抑制结构域停止抑制与所述抑制结构域连接的所述催化结构域，这导致所述催化结构域转换成活性状态。

3.如权利要求1所述的核酶，其中所述核酶包含一个催化结构域和一个靶结合结构域，其中所述核酶包含以下结构：

其中[A]至[a]为5’至3’方向性的或3’至5’方向性的，且其中：

基序[A]和[a]构成用于结合靶RNA分子的所述靶结合结构域；

基序[C]和[c]构成所述催化结构域；

基序[D]包含能够被所述催化结构域切割的第一切割位点；

基序[D’]包含能够被所述催化结构域切割的第二切割位点；

基序[E]包含可释放RNA区段；

基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列；

每个连接基序的水平线代表任选的接头区；和

其中当所述靶结合结构域与靶RNA分子结合时，所述催化结构域呈活性状态。

4.如权利要求2所述的核酶，其中所述核酶包含一个催化结构域、一个抑制结构域和一个靶结合结构域，其中所述核酶包含具有以下结构的RNA链：

基序[A]和[a]构成用于结合靶RNA分子的所述靶结合结构域；

基序[B]和[b]构成所述抑制结构域；

基序[C]和[c]构成第一催化结构域；

基序[D]包含能够被所述催化结构域切割的第一切割位点；

基序[D’]包含能够被所述催化结构域切割的第二切割位点；

基序[E]包含可释放RNA区段；

基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列；

每个连接基序的水平线代表任选的接头区；和

其中所述抑制结构域特征在于以下i)或ii)：

i)当所述靶结合结构域未结合靶RNA分子时，基序[b]与[C]退火结合，而当靶结合结构域结合靶RNA分子时，基序[b]与[B]退火结合，

ii)当第一靶结合结构域未结合靶RNA分子时，基序[B]与基序[c]退火结合，而当靶结合结构域结合靶RNA分子时，基序[B]与[b]退火结合，其中当基序[b]与基序[B]退火结合时，所述催化结构域呈活性状态。

5.如权利要求1或2所述的核酶，其中所述核酶包含两个催化结构域。

6.如权利要求5所述的核酶，其中所述核酶包含两个靶结合结构域。

7.如权利要求5或6所述的核酶，其中所述核酶包含第一RNA链和第二RNA链。

8.如权利要求7所述的核酶，其中所述核酶包含以下结构：

S1

S2

其中：

S1为第一RNA链和S2为第二RNA链，其中[A]至[A’]和[a]至[a’]代表相反的方向性；其中

基序[A]和[a]构成用于结合第一靶RNA分子的第一靶结合结构域；

基序[C]和[c]构成第一催化结构域；

基序[D]包含能够被所述第一催化结构域切割的第一切割位点；

基序[A’]和[a’]构成用于结合第二靶RNA分子的第二靶结合结构域；

基序[C’]和[c’]构成第二催化结构域；

基序[D’]包含能够被所述第二催化结构域切割的第二切割位点；

基序[E]包含可释放RNA区段；

基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列；

每个连接基序的水平线各自代表任选的接头区；和

其中当所述第一靶结合结构域与所述第一靶RNA分子结合时，所述第一催化结构域呈活性状态；和其中当所述第二靶结合结构域与所述第二靶RNA分子结合时，所述第二催化结构域呈活性状态。

9.如权利要求2所述的核酶，其中所述核酶包含以下结构：

S1

S2

其中：

基序[B]和[b]构成抑制结构域；

基序[C]和[c]构成第一催化结构域；

基序[D]包含能够被第一催化结构域切割的第一切割位点；

基序[C’]和[c’]构成第二催化结构域；

基序[E]包含可释放RNA区段；

基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列；

每个连接基序的水平线代表任选的接头区；

其中所述抑制结构域特征在于以下i)或ii)：

i)当所述第一靶结合结构域未结合所述第一靶RNA分子时，基序[b]与[C]退火结合，而当所述第一靶结合结构域结合所述第一靶RNA分子时，基序[b]与[B]退火结合，

ii)当所述第一靶结合结构域未结合所述第一靶RNA分子时，基序[B]与基序[c]退火结合，而当所述第一靶结合结构域结合所述第一靶RNA分子时，基序[B]与[b]退火结合；

其中当基序[b]与基序[B]退火结合时，所述第一催化结构域呈活性状态。

10.如权利要求4或9所述的核酶，其中所述抑制结构域进一步特征在于以下i)或ii)：

ii)基序[B]与基序[c]至少50％互补，且与基序[b]至少20％互补。

11.如权利要求2所述的核酶，其中所述核酶包含以下结构：

S1

S2

其中：

基序[B]和[b]构成第一抑制结构域；

基序[C]和[c]构成第一催化结构域；

基序[B’]和[b’]构成第二抑制结构域；

基序[C’]和[c’]构成第二催化结构域；

基序[E]包含可释放RNA区段；

基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列；

每个连接基序的水平线代表任选的接头区；

其中所述第一抑制结构域特征在于以下i)或ii)：

ii)当所述第一靶结合结构域未结合所述第一靶RNA分子时，基序[B]与基序[c]退火结合，而当所述第一靶结合结构域结合所述第一靶RNA分子时，基序[B]与[b]退火结合，

其中所述第二抑制结构域特征在于以下i)或ii)：

i)当所述第二靶结合结构域未结合所述第一靶RNA分子时，基序[b’]与基序[C’]退火结合，而当所述第二靶结合结构域结合所述第二靶RNA分子时，基序[b’]与[B’]退火结合，

ii)当所述第二靶结合结构域未结合所述第二靶RNA分子时，基序[B’]与基序[c’]退火结合，而当所述第二靶结合结构域结合所述第二靶RNA分子时，基序[B’]与[b’]退火结合，

12.如权利要求11所述的核酶，其中所述第一抑制结构域进一步特征在于以下i)或ii)：

ii)基序[B]与基序[c]至少50％互补，且与基序[b]至少20％互补；和所述第二抑制结构域进一步特征在于以下i)或ii)：

i)基序[b’]与基序[C’]至少50％互补，且与基序[B’]至少20％互补，

13.如权利要求3-12中任一项所述的核酶，其中所述任选的接头区独立或共同形成一个或多个二级结构。

14.如权利要求13所述的核酶，其中所述一个或多个二级结构选自由以下组成的组：单核苷酸膨出、三核苷酸膨出、茎、茎环、t-RNA型结构、三叶草、四环、假结、对称内环、不对称内环、三茎连接头(3路连接头)、四茎连接头(4路连接头)、两茎连接头(2路连接头)或者同轴堆积或其组合。

15.如权利要求3-14中任一项所述的核酶复合体，其中基序[E]和[e]以小于70％的互补性彼此互补。

16.如权利要求11-15中任一项所述的核酶，其中所述第一RNA链(S1)和第二RNA链(S2)分别包含SEQ ID NO.:26和SEQ ID NO.:29的序列。

17.如权利要求1-16中任一项所述的核酶，其中所述靶RNA分子长度大于16个核苷酸。

18.如权利要求1-17中任一项所述的核酶，其中所述靶RNA分子包含与所述靶结合结构域互补的区域，其中所述区域长度大于16个核苷酸。

19.如权利要求1-18中任一项所述的核酶，其中所述可释放RNA区段长为6-150个核苷酸。

20.如权利要求1-19中任一项所述的核酶，其中所述一个或多个靶结合结构域用于结合相同的靶RNA分子。

21.如权利要求1-20中任一项所述的核酶，其中所述可释放RNA区段包含与所述一个或多个靶RNA分子的至少一个相一致的序列。

22.一种检测样品中靶RNA分子的存在的方法，其中所述方法包括：

a)将样品与根据权利要求1-21中任一项所述的核酶一起在温度T1孵育，这允许靶RNA分子与包含在所述核酶中的一个或多个靶结合结构域结合；

b)将样品在温度T2孵育，这允许靶RNA分子和RNA区段从所述核酶中释放；

c)检测可释放RNA区段从所述核酶中的释放。

23.如权利要求22所述的方法，其中在进行步骤c)之前将步骤a)至b)重复一次或多次，其中从步骤b)释放的RNA分子能够结合所述核酶的另一个拷贝。

24.一种扩增靶RNA分子的方法，其中所述方法包括：

a)将靶RNA分子与根据权利要求1-21中任一项所述的核酶一起在温度T1孵育，这允许所述靶RNA分子与包含在所述核酶中的一个或多个靶结合结构域结合，以及其中可释放RNA区段包含与所述靶RNA分子一致的序列；

b)将结合靶RNA分子的核酶在温度T2孵育，这允许所述靶RNA分子和RNA区段从所述核酶中释放。

25.如权利要求24所述的方法，其中将步骤a)至b)重复一次或多次，其中从步骤b)释放的靶RNA分子和可释放RNA区段能够结合所述核酶的另一个拷贝。

26.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其中T1为不超过50℃的温度。

27.如权利要求22-26中任一项所述的方法，其中T2为20℃-100℃的温度。

28.如权利要求1-21中任一项所述的核酶或权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子为获自动物、病毒、细菌、酵母或植物的RNA分子。

29.如权利要求1-21中任一项所述的核酶或权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子为微小RNA、或其前体、或其片段。

30.如权利要求1-21中任一项所述的核酶或权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子为RNA病毒的基因组、或其片段。

31.如权利要求30所述的核酶或方法，其中所述RNA病毒选自由以下组成的组：逆转录病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、冠状病毒科病毒、小核糖核酸病毒科病毒、杯状病毒科病毒、黄病毒科病毒、披膜病毒科病毒、博尔纳病毒科、纤丝病毒科、副粘病毒科、肺病毒亚科、弹状病毒科、沙粒病毒科、本扬病毒科、正粘病毒科和δ病毒。

32.如权利要求31所述的核酶或方法，其中所述RNA病毒选自以下组成的组：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、冠状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征病毒(SARS)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、甲型肝炎、诺瓦克病毒、黄热病病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、风疹病毒、罗斯河病毒、辛德比斯病毒、基孔肯雅病毒、博尔纳病病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、新城疫病毒、人呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、拉沙病毒、汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、流感病毒和丁型肝炎病毒。

33.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-21所述的核酶。

34.一种试剂盒，其包括如权利要求1-21所述的核酶。

35.如权利要求34所述的试剂盒，其进一步包括RNA检测系统。

36.如权利要求35所述的试剂盒，其中所述RNA检测系统包括RNA激活的荧光传感器。

37.如权利要求35所述的试剂盒，其中所述RNA检测系统为基于CRISPR-Cas的核酸检测系统。