JP2017533417A - 第１及び第２のエピトープの空間的近接を検出する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、対象の試料内の１つのタンパク質又はタンパク質複合体（１）の第１のタンパク質及び第２のタンパク質（１０、２０）の第１のエピトープ及び第２のエピトープ（１１、２１）の空間的近接を検出する方法に関する。当該方法は、第１のオリゴヌクレオチド（３１）を結合させた第１の結合メンバー（３０）を、第１のエピトープ（１１）に結合させるステップと、第２のオリゴヌクレオチド（４１）を結合させた第２の結合メンバー（４０）を、第２のエピトープ（２１）に結合させるステップと、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の作用が、第１のオリゴヌクレオチド（３１）及び第２のオリゴヌクレオチド（４１）に関連したドナーフルオロフォア（３２）とアクセプターフルオロフォア（４２）との間に存在しているかどうかを決定するステップであり、ＦＲＥＴの作用の存在が、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチド（３１、４１）の空間的近接を示し、従って、第１のエピトープ及び第２のエピトープ（１１、２１）の空間的近接を示す、ステップとを含む。

Description

本発明は、対象の試料内の１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質の第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を検出する方法に関する。本発明は、さらに、治療の適合性を評価するために、及び／又は、対象の疾患の結果の予後のために、及び／又は、治療に向かう疾患を患う対象の治療抵抗性の予測及び／又は検出のために、疾患を患う対象を層別化する方法に関する。さらに、本発明は、新規のキット及びその対応する使用に関する。

近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）は、２つのタンパク質の同じ場所の配置を報告する能力を持つ方法である（非特許文献１を参照）。この方法は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドでそれぞれ標識された２つの抗体を使用する。オリゴヌクレオチドはどちらも、抗体がそのエピトープに結合した後で試料に添加される２つの二次的ＤＮＡオリゴヌクレオチドから閉環を形成する必要がある。環が形成されると、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が、何百もの輪状鋳型のコピーを作製するために使用される。最後に、フルオロフォアで標識された相補プローブがＲＣＡ産物に対してアニールされ、２つのタンパク質が同じ場所に配置される箇所にて明るいスポットをもたらす。

標準的なＰＬＡプロトコルは（標識された一次抗体を用いたとしても）、完了するのに約６．５時間かかる。ＲＣＡが発生する最も長いステップは、約１時間４０分かかり、さらに、酵素を要求する。この反応にかかる長い時間に加えて、酵素の使用は、ほとんどの場合敏感な酵素の安定した貯蔵が一般的には課題であるため、アッセイ全体を装置内に統合するのを難しくする。従って、酵素の使用を要求しない、又は、少なくとも、配列増幅等の複雑な酵素反応を要求しない、患者の組織及び／又は細胞（細胞凝集体）及び／又は体液上でのｉｎ ｓｉｔｕでの染色によって２つのタンパク質の空間的近接又は同じ場所の配置を決定するための技術を有することが望ましい。

特許文献１は、コアプタマー（ｃｏ−ａｐｔａｍｅｒ）構築物の組を使用したあらゆるポリペプチド又は巨大分子複合体の同定及び定量化においても有用な組成物及び方法を開示している。巨大分子構築物のポリペプチドの独特なエピトープに結合するアプタマー構築物が構築される。それらのアプタマー構築物は、エピトープ結合部位、コアプタマー結合部位及び検出可能な標識を含有している。同族ポリペプチド、分析物−ポリペプチド複合体又は他の巨大分子複合体の存在下で、コアプタマーは互いに結合して、検出可能な信号を生成する。コアプタマー構築物は、二価のアプタマー構築物を生成するためにリンカーによって連結されてもよい。

特許文献２は、試料内の分析物を検出するための近接−プローブベースの検出アッセイ、特に、分析物結合ドメイン及び核酸ドメインをそれぞれ含み且つ分析物に直接又は間接的に同時に結合することができる少なくとも第１及び第２の近接プローブの少なくとも１つの組の使用を含む方法に関し、該近接プローブのうち少なくとも１つの核酸ドメインは、少なくとも１つの連結可能な遊離端又は上記試料内の別の核酸分子に対する相補性の領域を生成するために、核酸ドメインの切断によってアンフォールドにすることができるヘアピン構造を含み、プローブが、上記のヘアピン構造をアンフォールドにする上記の分析物に結合する場合には、上記の少なくとも第１及び第２の近接プローブの核酸ドメインが直接又は間接的に相互作用するのを可能にする。

特許文献３は、単細胞内の複数のタンパク質の活性化状態の決定のためのアプローチを提供している。このアプローチは、活性化状態、発現マーカー及び他の基準に基づく複雑な細胞集団における不均一性の迅速な検出、及び、細胞集団内で活性化において関連した変化を示す細胞サブセットの同定を可能にする。さらに、このアプローチは、細胞の活性又は特性の相関関係を可能にする。加えて、細胞活性化の修飾物質の使用が、経路及び細胞集団の特徴づけを可能にする。このアプローチを使用して分析することができるいくつかの例証となる疾患は、ＡＭＬ、ＭＤＳ及びＭＰＮを含む。

ＷＯ２００５／０５９５０９ Ａ３ ＷＯ２０１２／１５２９４２ Ａ１ ＷＯ２０１０／００６２９１ Ａ１

Ｗｅｉｂｒｅｃｈｔ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，"Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ：Ａ ｒｅｃｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｔｏｏｌｂｏｘ"，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．３，２０１０，ｐａｇｅｓ ４０１ ｔｏ ４０９ Ｋｏｏｐｍａｎｓ Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，"Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｉｒ ＦＲＥＴ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ"Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３９，２０１１，ｐａｇｅｓ ２９１ ｔｏ ３０３ Ｄｅｍｃｈｅｎｋｏ Ａ．Ｐ．，"Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ"，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．２，２０１３，２８ ｐａｇｅｓ Ｏｚａｋｉ Ｈ．ａｎｄ ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ Ｌ．Ｗ．，"Ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ"，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１９，１９９２，ｐａｇｅｓ ５２０５ ｔｏ ５２１４ Ｍａｎｎｉｎｇ Ｇ．Ｓ．，"Ｔｈｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＤＮＡ ｉｓ ｒｅａｃｈｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｉｔｓ ｎｕｌｌ ｉｓｏｍｅｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ｆｏｒｃｅ"，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．９１，Ｎｏ．１０，２００６，ｐａｇｅｓ ３６０７ ｔｏ ３６１６

対象の試料内の１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質の第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を検出する方法を提供することが本発明の目的であり、当該方法は、上述のＰＬＡの問題を解決するか又は少なくとも減らす。

本発明は、対象の試料内の１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質の第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を検出する方法を提供し、当該方法は：
− 第１のオリゴヌクレオチドを結合させた第１の結合メンバーを、第１のエピトープに結合させるステップと、
− 第２のオリゴヌクレオチドを結合させた第２の結合メンバーを、第２のエピトープに結合させるステップと、
− 蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の作用が、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドに関連したドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間に存在しているかどうかを決定するステップであり、ＦＲＥＴの作用の存在が、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの空間的近接を示し、従って、第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を示す、ステップと、
を含み、
第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、
第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの早発性のハイブリダイゼーションを防ぐために、第１のオリゴヌクレオチドには、最初に、第１の分離シールド要素が提供され、且つ／又は、第２のオリゴヌクレオチドには、最初に、第２の分離シールド要素が提供される。

第１のオリゴヌクレオチドを付着させた第１の結合メンバーは第１のエピトープに結合させられ、さらに、第２のオリゴヌクレオチドを付着させた第２の結合メンバーは第２のエピトープに結合させられるため、その存在が第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの空間的近接を示すＦＲＥＴの作用がドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間に存在しているかどうかを決定することによって、１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質の第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を、対象の試料において検出することができる。標準的なＰＬＡプロトコルと比較して、本発明の実施形態は、より短い時間で完了され得る。さらに、本発明の実施形態は、酵素の使用を要求しない、又は、少なくとも、配列増幅等の複雑な酵素反応を要求しない。

第１のオリゴヌクレオチドは第２のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的であるため、空間的近接において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドはハイブリダイズすることになり、それによって、より高い確信をもってＦＲＥＴの作用がドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間で発生するのを可能にするため等、ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアを互いから適した距離に導くことができる。相補的なセグメントの長さは、好ましくは、１０ヌクレオチドを超えるべきである。さらに、多数の相補的なセグメントがオリゴヌクレオチド内に存在することができ、その間には、非相補的なセグメントが存在する。後者は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドに対して異なる長さを有してもよい。

第１及び第２のオリゴヌクレオチドの早発性のハイブリダイゼーションを防ぐために、第１のオリゴヌクレオチドには、最初に、第１の分離シールド要素が提供され、且つ／又は、第２のオリゴヌクレオチドには、最初に、第２の分離シールド要素が提供されるため、第１及び第２の結合メンバーが第１及び第２のエピトープに結合する前に第１及び第２のオリゴヌクレオチドがすでにハイブリダイズするのを防ぐことが可能である。それとともに、例えば、結合前に第１及び第２のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、ＦＲＥＴの作用がドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間で発生するのを可能にし、従って、第１及び第２の結合メンバーのうちの１つが単一のタンパク質のそれぞれ（又は、もう一方のエピトープを示さないタンパク質）のエピトープに結合する場合に引き起こされ得る検出エラーを、減らすか又は回避することができる。さらに、１つ又は複数のシールド要素は分離シールド要素であり、すなわち、それぞれのオリゴヌクレオチドに提供される前に、１つ又は複数のシールド要素は、それぞれのオリゴヌクレオチドから分離した分子の形であり、好ましくは、それぞれのオリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的であり且つそれにハイブリダイズする分子から選択されるため、遮蔽機能性、並びに、以下においてさらに説明されるその遮蔽を取り除く機能性に、高い信頼性を提供することができる。

ドイツ人科学者Ｔｈｅｏｄｏｒ Ｆｏｒｓｔｅｒからフェルスター共鳴エネルギー転移とも呼ばれる蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、２つのフルオロフォア、すなわち、光励起の後で光を再度放つことができる蛍光化学化合物間でのエネルギー転移を描写する機構である。最初に電子励起状態であるドナーフルオロフォアが、無放射の双極子双極子カップリングを介してアクセプターフルオロフォアへとエネルギーを転移させ得る。このエネルギー転移の効率は、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの距離の六乗（ｓｉｘｔｈ ｐｏｗｅｒ）に反比例しており、ＦＲＥＴを短い距離に対して極度に敏感にしている。Ｃｙ３及びＣｙ５のスペクトルを概略的且つ例証的に示している図１において例示されているように、ＦＲＥＴの作用を可能にするために、ドナーフルオロフォアの発光スペクトルの一部は、アクセプターフルオロフォアの励起スペクトルと重複していなければならない。図からわかるように、Ｃｙ３の励起スペクトル（左側の実線の曲線Ｅｘ）は、５４８ｎｍの波長にて最大励起を有しており、さらに、その発光スペクトル（左側の点線の曲線Ｅｍ）は、より高い波長にシフトされ、５６２ｎｍの波長にて最大発光を有している。対照的に、Ｃｙ５の励起スペクトル（右側の実線の曲線Ｅｘ）は、６４６ｎｍの波長にて最大励起を有しており、さらに、その発光スペクトル（右側の点線の曲線Ｅｍ）は、より高い波長にシフトされ、６６４ｎｍの波長にて最大発光を有している。Ｃｙ３の発光スペクトル及びＣｙ５の励起スペクトルの下の影のついた領域は、ＦＲＥＴの作用を可能にするために要求される重複の領域を示している。

ＦＲＥＴは、例えばヌクレオソームの揺らぎを探索するため等、２つの実体間の空間的近接を調査するために、（遺伝的コード化蛍光タンパク質を使用する場合がある）分子生物学において使用されている（非特許文献２を参照）。実際、ＦＲＥＴは、１から１０ｎｍのスケールで（生物学的）相互作用を研究するための好ましい方法である。人気のＦＲＥＴドナー−アクセプターフルオロフォアの対は：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３−Ｃｙ５、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）−Ｃｙ３、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）−黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びＥＧＦＰ−ＹＦＰを含む。

ＦＲＥＴの作用の存在は、空間分解の様式で蛍光発光をスペクトルで分析することによって決定することができる。ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアの色素は、ＦＲＥＴの作用の非存在下でアクセプターフルオロフォアを励起することなくドナーフルオロフォアを励起することができるように選ばれる。ドナーフルオロフォアを励起し且つアクセプターフルオロフォアの蛍光発光を測定することによって、アクセプターフルオロフォアの発光チャネルにおける検出可能な信号は、ＦＲＥＴの作用の存在を示す。ＦＲＥＴの効率は、分子距離に対応するとして既知であり、以下の式：

で表わされ、ここで、ＥはＦＲＥＴの効率を示し、ｒは分子距離を示し、さらに、Ｒ_０はフェルスター半径、すなわち、ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアのスペクトルの重複次第であるパラメータを示し、典型的には、ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアの発光強度間の比として決定される。すなわち、分子が近いほど、ドナーフルオロフォアからのより少ない発光及びアクセプターフルオロフォアからのより多い発光が観察される。

組織上でのタンパク質相互作用の検出又は細胞診のため、蛍光画像を、ドナーフルオロフォアの励起（吸収）バンドにおける励起、及び、アクセプターフルオロフォアの発光バンドにおける検出を用いて取得することができる。ＦＲＥＴの効率のチェックのため、これを、アクセプターフルオロフォアの励起（吸収）バンドにおける励起を用いて取得された画像と比較することができる。

対象の試料は、抽出された試料、すなわち、対象から抽出された試料であってもよい。「対象」という用語は、本明細書において使用される場合、あらゆる生物を意味する。一部の実施形態において、対象は植物である。一部の実施形態において、対象は動物であり、好ましくは哺乳動物である。特定の実施形態において、「対象」という用語はヒトを意味し、好ましくは患者を意味する。

試料の例として、対象の組織、細胞、血液及び／又は体液が挙げられるが、それらに限定されない。

一実施形態において、第１及び第２のエピトープは２つであるが、同じエピトープである。別の実施形態において、第１及び第２のエピトープは互いに異なる。

第１及び第２の結合メンバーは、第１及び第２の抗体、好ましくは、第１及び第２のモノクローナル抗体であり得る。或いは、しかし、例えばラクダ科動物抗体、アプタマー又はオリゴペプチド等の第１及び第２の抗体断片でもあり得る。より一般的には、第１及び第２の結合メンバーは、それぞれ第１及び第２のエピトープに結合することができ、さらに、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが結合することができるあらゆる種類の要素又は構造体であり得る。一実施形態において、第１及び第２の結合メンバーは同じである。別の実施形態において、第１及び第２の結合メンバーは互いに異なる。

第１及び第２のオリゴヌクレオチドの適した長さは、２０から１０００塩基対であり、好ましくは、３０から６００塩基対である。

一実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは同じである。別の実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは互いに異なる。

第１及び第２の結合メンバーの結合は２つのステップで定められているけれども、これは、これら２つのステップを異なる順で、又は、好ましくは実質的に同時に行うことはできないということを意味しているわけではないということに留意されたい。

ＦＲＥＴの作用がドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアの間で存在しているかどうかを決定する前に、ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアは、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドに結合させられる。

一部の実施形態において、フルオロフォアは、オリゴヌクレオチドに付着させることができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアで前標識することができ、すなわち、オリゴヌクレオチドは、結合メンバーの結合の前に、好ましくは、オリゴヌクレオチドを結合させた結合メンバーが対象の試料に添加される前にすでにフルオロフォアで標識される。

一実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドはドナーフルオロフォアで前標識され、且つ／又は、第２のオリゴヌクレオチドはアクセプターフルオロフォアで前標識される。加えて又は或いは、当該方法は、第１の結合メンバーの結合の後で、ドナーフルオロフォアを第１のオリゴヌクレオチドに付着させるステップ、及び／又は、第２の結合メンバーの結合の後で、アクセプターフルオロフォアを第２のオリゴヌクレオチドに付着させるステップをさらに含む。

第１のオリゴヌクレオチドはドナーフルオロフォアで前標識されるため、及び／又は、第２のオリゴヌクレオチドはアクセプターフルオロフォアで前標識されるため、及び／又は、当該方法は、第１の結合メンバーの結合の後で、ドナーフルオロフォアを第１のオリゴヌクレオチドに付着させるステップ、及び／又は、第２の結合メンバーの結合の後で、アクセプターフルオロフォアを第２のオリゴヌクレオチドに付着させるステップをさらに含むため、ＦＲＥＴの作用がドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間で発生するのを可能にするため等、ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアを互いから適した距離に導くことができる。

第１及び第２の結合メンバーの結合の後での第１及び第２のオリゴヌクレオチドに対するドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアの付着は２つのステップで先に定められているけれども、これは、これら２つのステップを異なる順で、又は、好ましくは実質的に同時に行うことはできないということを意味しているわけではないということに留意されたい。

これは、第１及び第２の結合メンバーが第１及び第２のエピトープに結合する前に第１及び第２のオリゴヌクレオチドがすでにハイブリダイズするのを防ぐことを可能にする。それとともに、例えば、結合前に第１及び第２のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、ＦＲＥＴの作用がドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間で発生するのを可能にし、従って、第１及び第２の結合メンバーのうちの１つが単一のタンパク質のそれぞれ（又は、もう一方のエピトープを示さないタンパク質）のエピトープに結合する場合に引き起こされ得る検出エラーを、減らすか又は回避することができる。

当該方法は：
− 第１の結合メンバーの結合の後で、第１の分離シールド要素を第１のオリゴヌクレオチドから取り除くステップ、及び／又は、
− 第２の結合メンバーの結合の後で、第２の分離シールド要素を第２のオリゴヌクレオチドから取り除くステップ、
をさらに含むということが好ましい。

第１及び第２の結合メンバーの結合の後で、第１及び／又は第２の分離シールド要素を第１及び第２のオリゴヌクレオチドから取り除くことは２つのステップで先に定められているけれども、これは、これら２つのステップを異なる順で、又は、好ましくは実質的に同時に行うことはできないということを意味しているわけではないということに留意されたい。特に、第１及び／又は第２の分離シールド要素は、第１の結合メンバーも第２の結合メンバーも、そのそれぞれのエピトープに結合した後でのみ取り除かれるということが好ましい。

第１の分離シールド要素は、好ましくは、第１のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり且つそこにハイブリダイズされる第１のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を含み、且つ／又は、第２の分離シールド要素は、好ましくは、第２のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり且つそこにハイブリダイズされる第２のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を含む。

第１のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖及び／又は第２のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖の取り除きは、第１のオリゴヌクレオチドと第１のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖とのハイブリダイゼーション、及び／又は、第２のオリゴヌクレオチドと第２のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションを融解することを含むということが好ましい。

例えば、一例において、所望のハイブリダイゼーションの融解を達成するために、試料の温度が適切に上げられる。別の例において、融解を行うために、試料の溶媒が変えられる。融解の後で、非標識の第１及び第２のＤＮＡ鎖は、好ましくは、適したさらなる洗浄ステップにおいて洗い流され、実質的に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドを付着させた特異的に結合した第１及び第２の結合メンバーのみを試料内に残す。

好ましい異形において、第１のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖は第１のＲＮＡ鎖であり、且つ／又は、第２のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖は第２のＲＮＡ鎖であり、第１のＲＮＡ鎖及び／又は第２のＲＮＡ鎖の取り除きは酵素の使用を含む。

酵素は、例えば、ＲＮＡを消化するリボヌクレアーゼＨであり得る。この異形は、プロセス全体が等温になるという利点を有するが；一方、酵素の使用を要求する。

別の実施形態において、当該方法は、好ましくは：
− 第１の結合メンバーの結合の後で、ドナーフルオロフォアで前標識された第３のオリゴヌクレオチドを提供するステップであり、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、さらに、第１のオリゴヌクレオチドにドナーフルオロフォアを付着させるステップは、第３のオリゴヌクレオチドを第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを含む、ステップ、及び／又は、
−第２の結合メンバーの結合の後で、アクセプターフルオロフォアで前標識された第４のオリゴヌクレオチドを提供するステップであり、第４のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、さらに、第２のオリゴヌクレオチドにアクセプターフルオロフォアを付着させるステップは、第４のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを含む、ステップ、
を含む。

ここで、所望の空間的近接を達成するために、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは部分的に相補的であるということが好ましい。従って、第３及び第４のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの対応する相補的なセグメントの間の第１及び第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。

第１及び第２の結合メンバーの結合の後でドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアで前標識された第３及び第４のオリゴヌクレオチドを提供することは２つのステップで先に定められているけれども、これは、これら２つのステップを異なる順で、又は、好ましくは実質的に同時に行うことはできないということを意味しているわけではないということに留意されたい。

この実施形態の利点は、ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアで前標識されたオリゴヌクレオチドを検出要素の残りから分離することができ、より簡単なテスト及び（例えば、妨害するフルオロフォア又は高自己蛍光試料を用いた多重化の場合の）フルオロフォアのスイッチングを可能にし得るということである。さらに、特に第二のイムノアッセイが使用され且つテストが例えばマウス及びラットの抗体ドメインに対して設計される場合に標準化された検出テストの生成を可能にし得る。

さらなる実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドはドナーフルオロフォアで前標識され、又は、第２のオリゴヌクレオチドはアクセプターフルオロフォアで前標識され、当該方法は：
− 第１の結合メンバー及び第２の結合メンバーの結合の後で、第１及び第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖の間に介入するアクセプターフルオロフォア又はドナーフルオロフォアを添加するステップ、
を含む。

ここで、第１及び第２の結合メンバーの結合の後でのみ添加されるドナーフルオロフォア、アクセプターフルオロフォアのそれぞれは、例えば、ＤＡＰＩ（４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）又はオキサゾールイエローのテトラカチオンホモダイマーであるＹＯＹＯ等の挿入色素に基づく。挿入色素は、二本鎖ＤＮＡの間に実際に介入された場合にのみ蛍光を発するため、ＦＲＥＴの作用は所望の位置でのみ引き起こされるということが有利に保証され得る。

本発明は、対象の試料内の１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質の第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を検出する方法も提供し、当該方法は：
− 第１のオリゴヌクレオチドを結合させた第１の結合メンバーを、第１のエピトープに結合させるステップと、
− 第２のオリゴヌクレオチドを結合させた第２の結合メンバーを、第２のエピトープに結合させるステップと、
− 蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の作用が、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドに関連したドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間に存在しているかどうかを決定するステップであり、ＦＲＥＴの作用の存在が、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの空間的近接を示し、従って、第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を示す、ステップと、
を含み、
当該方法は：
− 第１の結合メンバー及び第２の結合メンバーの結合の後で、ＰＩ電子が分子に沿って非局在化されたポリマーを提供するステップを含み、ポリマーは、第１のオリゴヌクレオチドにも第２のオリゴヌクレオチドにも結合する、及び、ドナーフルオロフォアからアクセプターフルオロフォアまでエネルギーを転移させることができるか、又は、ドナーフルオロフォア及び／若しくはアクセプターフルオロフォアに対する受容体及び／若しくは供与体として作用することができる（非特許文献３を参照）。

エネルギー転移は第３の要素、すなわちポリマーによって達成されるため、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも部分的に相補的である必要はない。これは、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが実質的に全く相補的でない場合に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの遮蔽を提供する必要はなく、この場合、遮蔽を取り除くステップも回避することができるため、より簡単なプロセスを結果として生じることができるという利点を有する。

タンパク質複合体の第１及び第２のタンパク質の第１及び第２のエピトープの空間的近接を検出するために、第１及び第２の結合メンバーは、第１及び第２のエピトープがタンパク質複合体の第１及び第２のタンパク質上で不明瞭にされないように選択されるということが好ましい。

ＦＲＥＴの作用が存在しているかどうかを決定するステップは：
− 試料の少なくとも１つの蛍光画像を取得すること、及び、
− ＦＲＥＴの作用を検出し且つ局在化させるために、少なくとも１つの蛍光画像の空間分解分析を行うこと、
を含むということが好ましい。

本発明は、シグナル経路に向けられた治療の適合性を評価するために、及び／又は、対象の疾患の結果の予後のために、及び／又は、治療に向かう疾患を患う対象の治療抵抗性の予測及び／又は検出のために、疾患を患う対象を層別化する方法も提供し、当該方法は：
− 対象の試料において、少なくとも１つの転写因子が存在しているかどうかを検出するための上記の方法を適用することによって、前記シグナル経路の活性化状態を決定するステップ、
を含む。

本発明の方法は、短時間で完了することができる。さらに、当該方法は、酵素の使用を要求しない、又は、少なくとも、配列増幅等の複雑な酵素反応を要求しない。

一部の実施形態において、疾患は癌であり得る。

本発明は、さらに、本発明によって定められる方法を行うためのキットを提供し、当該キットは、以下の構成要素、すなわち：
− 第１のエピトープに対して作られた、第１のオリゴヌクレオチドを結合させた第１の結合メンバー、
− 第２のエピトープに対して作られた、第２のオリゴヌクレオチドを結合させた第２の結合メンバー、及び
− ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォア、
を含み、
第１のエピトープ及び第２のエピトープは、１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質のエピトープであり、
第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、
第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの早発性のハイブリダイゼーションを防ぐために、第１のオリゴヌクレオチドには第１の分離シールド要素が提供され、且つ／又は、第２のオリゴヌクレオチドには第２の分離シールド要素が提供される。

本発明は、さらに、本発明によって定められる方法を行うためのキットを提供し、当該キットは、以下の構成要素、すなわち：
− 第１のエピトープに対して作られた、第１のオリゴヌクレオチドを結合させた第１の結合メンバー、
− 第２のエピトープに対して作られた、第２のオリゴヌクレオチドを結合させた第２の結合メンバー、
− ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォア、及び、
− ＰＩ電子が分子に沿って非局在化されたポリマーであり、第１のオリゴヌクレオチドにも第２のオリゴヌクレオチドにも結合する、及び、ドナーフルオロフォアからアクセプターフルオロフォアまでエネルギーを転移させることができるか、又は、ドナーフルオロフォア及び／若しくはアクセプターフルオロフォアに対する受容体及び／若しくは供与体として作用することができる、ポリマー、
を含み、
第１のエピトープ及び第２のエピトープは、１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質のエピトープである。

本発明のキットは、酵素の使用を要求しない、又は、少なくとも、配列増幅等の複雑な酵素反応に対する試薬を要求しない。

一実施形態において、ドナーフルオロフォア及び／又はアクセプターフルオロフォアは、第１のオリゴヌクレオチド及び／又は第２のオリゴヌクレオチドに関連づけられる及び／又は付着させられる。

本発明は、さらに、対応する本発明の方法における本発明のキットのそれぞれの使用を提供する。

上記の方法に対するキットの使用は、本発明が短時間で完了することを可能にする。さらに、キットの使用は、酵素の使用を要求しない、又は、少なくとも、配列増幅等の複雑な酵素反応を要求しない。

本発明の方法及びキットは、第１の結合メンバー及び第２の結合メンバー両方が、対象の試料内の１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１及び第２のタンパク質の第１及び第２のエピトープにそれぞれ結合していない場合のドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間の望まれていないＦＲＥＴの作用の発生から生じる検出エラーを減らす又は回避することができるという共通の利点を有する。

本発明の好ましい実施形態は、従属請求項又は上記の実施形態の、それぞれの独立請求項とのあらゆる組み合わせでもあり得るということが理解されることになる。

本発明の上記及び他の態様が、以下に記載の実施形態から明らかになり、さらに、以下に記載の実施形態を参考にして説明される。

Ｃｙ３及びＣｙ５の励起スペクトル及び発光スペクトルを示した図である。 本発明による第１の実施形態を示した図（ａ）乃至（ｅ）である。 図２（ａ）乃至（ｅ）において示された第１の実施形態の異形を例示した図である。 本発明の方法の第２の実施形態を例示した図である。 本発明の方法の第３の実施形態を例示した図である。 本発明の方法の第４の実施形態を例示した図である。

図において、類似の要素は、類似の参照番号を用いて指摘される。さらに、類似の要素が同じ図又は近い図において発生する場合、単一の実体のみが参照番号を用いて指摘されてもよい。

図２（ａ）乃至（ｅ）は、患者の組織及び／又は細胞及び／又は体液の試料内のタンパク質複合体１の第１及び第２のタンパク質１０、２０の第１及び第２のエピトープ１１、２１の空間的近接を検出する方法の第１の実施形態を示している。図からわかるように、第１の結合メンバー３０、ここでは第１の抗体は、第１のオリゴヌクレオチド３１を結合させており、さらに、第２の結合メンバー４０、ここでは第２の抗体は、第２のオリゴヌクレオチド４１を結合させている。

図２（ｂ）において示されているように、第１のオリゴヌクレオチド３１を結合させた第１の抗体３０は、第１のエピトープ１１に結合しており、さらに、第２のオリゴヌクレオチド４１を結合させた第２の抗体４０は、第２のエピトープ２１に結合している。特に、図２（ａ）において示されているように、第１のオリゴヌクレオチド３１を結合させた第１の抗体３０及び第２のオリゴヌクレオチド４１を結合させた第２の抗体４０は、タンパク質複合体１、この例においては、第１及び第２のタンパク質１０、２０から成るタンパク質ダイマーを含む試料に添加される。加えて、試料は、ここで示されているように、第１及び第２のタンパク質を別々に含んでもよい。次に、特定のインキュベーション時間の後で、第１及び第２の抗体３０、４０は、特異的に結合しており、すなわち、第１及び第２のエピトープ１１、２１に結合しているか、又は、場合によっては、非特異的に結合し、すなわち、第１及び第２のエピトープ１１、２１以外の位置だが、おそらく第１及び第２のエピトープ１１、２１に類似の位置に結合している（例示されたタンパク質間の空間において結合した図２（ｂ）における抗体を参照）。次に、図２（ｃ）において示されているように、適した洗浄ステップが使用されて、あり得る非特異的に結合した第１及び第２の抗体を取り除き、実質的に特異的に結合した第１及び第２の抗体のみを試料内に残している。

この実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド３１はドナーフルオロフォア３２で前標識され、さらに、第２のオリゴヌクレオチド４１はアクセプターフルオロフォア４２で前標識される。ドナー−アクセプターフルオロフォアの対に対する適した選択肢は、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３−Ｃｙ５、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）−Ｃｙ３、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）−黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びＥＧＦＰ−ＹＦＰであり得る。

ここで、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１は、互いに対して空間的近接にある場合にハイブリダイズすることができるように、少なくとも部分的に相補的である。第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１の早発性のハイブリダイゼーションを防ぐために、すなわち、第１及び第２の抗体３０、４０が第１及び第２のエピトープ１１、２１に結合する前に第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１がすでにハイブリダイズするのを防ぐために、第１のオリゴヌクレオチド３１には、最初に、第１の分離シールド要素３３が提供され、さらに、第２のオリゴヌクレオチド４１には、最初に、第２の分離シールド要素４３が提供される。第１及び／又は第２の分離シールド要素３３、４３は、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１よりもはるかに短くてもよく、又は、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１のハイブリダイゼーションを失敗させるのを可能にする限り、多数の短い要素から成ってもよい。この実施形態において、第１の分離シールド要素３３は、第１のオリゴヌクレオチド３１に対して少なくとも部分的に相補的であり且つそこにハイブリダイズする第１のＤＮＡ鎖を含み、さらに、第２の分離シールド要素４３は、第２のオリゴヌクレオチド４１に対して少なくとも部分的に相補的であり且つそこにハイブリダイズする第２のＤＮＡ鎖を含む。第１及び第２のＤＮＡ鎖は、ここで、非標識のＤＮＡ鎖であり、すなわち、ドナーフルオロフォア３２又はアクセプターフルオロフォア４２で前標識されていない。

図２（ｄ）において示されているように、第１の抗体３０を結合させた後で、第１の分離シールド要素３３、ここでは第１のＤＮＡ鎖は、第１のオリゴヌクレオチド３１から取り除かれ、さらに、第２の抗体４０を結合させた後で、第２の分離シールド要素４３、ここでは第２のＤＮＡ鎖は、第２のオリゴヌクレオチド４１から取り除かれる。この実施形態において、第１及び第２のＤＮＡ鎖の取り除きは、第１のオリゴヌクレオチド３１と第１のＤＮＡ鎖３３とのハイブリダイゼーション、及び、第２のオリゴヌクレオチド４１と第２のＤＮＡ鎖４３とのハイブリダイゼーションを融解することを含む。例えば、一例において、所望のハイブリダイゼーションの融解を達成するために、試料の温度が適切に上げられる。別の例において、融解を行うために、試料の溶媒が変えられる。融解の後で、非標識の第１及び第２のＤＮＡ鎖３３、４３は、図２（ｄ）においても示されているように、適したさらなる洗浄ステップにおいて洗い流され、実質的に、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１を付着させた特異的に結合した第１及び第２の抗体３０、４０のみを試料内に残す。

第１及び第２の分離シールド要素３３、４３、ここでは第１及び第２のＤＮＡ鎖が、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１から取り除かれると、少なくとも部分的に相補的である２つのオリゴヌクレオチドは、図２（ｅ）の中心において示されているように、ハイブリダイズすることができ、ドナーフルオロフォア３２及びアクセプターフルオロフォア４２を、ＦＲＥＴの作用がその間に発生するのを可能にする空間的近接に導く（このステップは、好ましくは、先行する融解ステップの後で再び試料の温度を下げることを含む）。従って、ドナーフルオロフォア３２とアクセプターフルオロフォア４２との間の、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１の空間的近接を示すＦＲＥＴの作用の存在を決定することによって、患者の組織及び／又は細胞及び／又は体液の試料内のタンパク質複合体１の第１及び第２のタンパク質１０、２０の第１及び第２のエピトープ１１、２１の空間的近接を検出することが可能になる。対照的に、図２（ｅ）の左側及び右側に示されているように、それぞれの単一のタンパク質のエピトープに特異的に結合した抗体は、そこに結合したアクセプター／ドナーフルオロフォアにより前標識されたオリゴヌクレオチドは、それぞれのドナー／アクセプターフルオロフォアで前標識されたオリゴヌクレオチドと空間的近接にはないため、ＦＲＥＴの作用をもたらさない。

第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１は、好ましくは、主鎖上で前標識され、通常そうであるように単に３´又は５´末端では前標識されない。さらに、標識は、非特許文献４において記載されているラベリングを使用して特定の部位に適用されてもよい。抗体に対する部位特異的結合のために使用することができる分子を含有する塩基を配列に添加することも好ましく、これの上には、好ましくは、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１がハイブリダイズするのに十分な立体的自由を有し得るように、少なくとも１０から２０ｎｍの（長い持続長のため、リンカーが二本鎖ＤＮＡである場合にはより長い）リンカーがあるべきである。

効率的なエネルギー転移を達成する種々の方法が、文献において記載されてきている（非特許文献３を参照）。従って、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１上でのドナーフルオロフォア３２及びアクセプターフルオロフォア４２の対称的分布を有することは必要ではない。

蛍光スキャナー又は顕微鏡の検出下限（ＬＯＤ）は、非常に、オプティクス及びカメラの質、並びに、組込み時間及び励起強度等、測定の条件次第である。概算は、従来の蛍光顕微鏡光学構成に対しては、約０．２５μｍ^２の光学分割において１つの標的を有すると仮定して、１つの標的あたり約１００の色素分子を使用する必要があるということである。その結果、個々のオリゴヌクレオチドを検出するために、約１００の色素分子に対応する発光強度が目標とされる。

別の設計態様は、同じ種類の色素間の同種のＦＲＥＴ相互作用を回避することである。何が可能であるかという推定は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のウェブサイトにおいて与えられている。これによると、２０の塩基対あたり約１の色素分子にて、Ａｌｅｘａファミリーの色素が、従来のシアニン色素より優れている。しかし、この１：２０の比重は、ニックトランスレーションによる無作為の標識によって得られ、これは、２０塩基対未満のフルオロフォアをばらばらに含むということを意味するということに留意しなくてはならない。特定の標識によって、それぞれのオリゴヌクレオチドにおける２０の塩基対あたり少なくとも１つのＦＲＥＴの対というより高い比重を達成することができる。

有利に、標識によって完全に飽和したオリゴヌクレオチドは、同種のＦＲＥＴを示すことになるが、全てのドナーフルオロフォアの標識が、依然としてそのエネルギーをそのアクセプターフルオロフォアの標識まで転移させることができ、より低い標識の要求をもたらす。

さらに、ＦＲＥＴしているオリゴヌクレオチドの活性化の後で得られた画像から、前に得られた画像を差し引くことによって画像を生成するために、クエンチングも使用することができる。

アクセプターフルオロフォア及びドナーフルオロフォアの設計及びタイプに応じて、例えば、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１の分子、量子ドット、ナノ粒子又はポリマー、サイズを選ぶことができる。

有機蛍光色素を用いる古典的な設計の場合、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１は、好ましくは、（例えば２０×１００＝２０００塩基、又は、５×１００＝５００塩基等）約１００の色素分子に対して十分な位置を提供するためにかなり長くするべきである。

しかし、個々のタンパク質複合体を検出することができないほどの少ない色素の数だが、正しくは、検出器の光学分割内の発光の総量が検出限界を超えるように複合体の特定の濃度を選ぶことも実現可能である。

図２（ａ）乃至（ｅ）において示された第１の実施形態の異形が、図３において例示されている。この異形は、実質的に、第１の実施形態に類似している。しかし、この異形において、第１の分離シールド要素３３は、第１のオリゴヌクレオチド３１に対して少なくとも部分的に相補的であり且つそこにハイブリダイズする第１のＲＮＡ鎖を含み、さらに、第２の分離シールド要素４３は、第２のオリゴヌクレオチド４１に対して少なくとも部分的に相補的であり且つそこにハイブリダイズする第２のＲＮＡ鎖を含むという相違点が実際には存在する。第１及び第２のＲＮＡ鎖の取り除きは、従って、例えばＲＮＡを消化するリボヌクレアーゼＨ等の酵素５０の使用を含む。この異形は、プロセス全体が等温になるという利点を有するが；一方、酵素５０の使用を要求する。

図４は、患者の組織及び／又は細胞及び／又は体液の試料内のタンパク質複合体１の第１及び第２のタンパク質１０、２０の第１及び第２のエピトープ１１、２１の空間的近接を検出する方法の第２の実施形態を示している。

この実施形態は、実質的に、図２（ａ）乃至（ｅ）において示されている第１の実施形態と類似している。しかし、この実施形態において、ドナーフルオロフォア３２は、第１の結合メンバー３０、ここでは第１の抗体の結合の後でのみ第１のオリゴヌクレオチド３１に付着させられ、さらに、アクセプターフルオロフォア４２は、第２の結合メンバー４０、ここでは第２の抗体の結合の後でのみ第２のオリゴヌクレオチド４１に付着させられるという相違点が実際には存在している。特に、図４において示されているように、第１の抗体３０の結合の後で、ドナーフルオロフォア３２で標識された第３のオリゴヌクレオチド３４が提供され、第３のオリゴヌクレオチド３４は、第１のオリゴヌクレオチド３１に対して少なくとも部分的に相補的であり、さらに、第１のオリゴヌクレオチド３１へのドナーフルオロフォア３２の付着は、そこに第３のオリゴヌクレオチド３４をハイブリダイズさせることを含む。同様に、第２の抗体４０の結合の後で、アクセプターフルオロフォア４２で標識された第４のオリゴヌクレオチド４４が提供され、第４のオリゴヌクレオチド４４は、第２のオリゴヌクレオチド４１に対して少なくとも部分的に相補的であり、さらに、第２のオリゴヌクレオチド４１へのアクセプターフルオロフォア４２の付着は、そこに第４のオリゴヌクレオチド４４をハイブリダイズさせることを含む。

ここで、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１は、所望の空間的近接を達成するために部分的に相補的であるということが好ましい。従って、図４において示されているように、第３及び第４のオリゴヌクレオチド３４、４４は、好ましくは、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１の対応する相補的なセグメントの間の第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１にハイブリダイズする。

この実施形態の利点は、ドナーフルオロフォア３２及びアクセプターフルオロフォア４２で標識されたオリゴヌクレオチドを検出要素の残りから分離することができ、より簡単なテスト及び（例えば、妨害するフルオロフォア又は高自己蛍光試料を用いた多重化の場合の）フルオロフォアのスイッチングを可能にし得るということである。さらに、特に第二のイムノアッセイが使用され且つテストが例えばマウス及びラットの抗体ドメインに対して設計される場合に標準化された検出テストの生成を可能にし得る。

図５は、患者の組織及び／又は細胞及び／又は体液の試料内のタンパク質複合体１の第１及び第２のタンパク質１０、２０の第１及び第２のエピトープ１１、２１の空間的近接を検出する方法の第３の実施形態を例示している。

この実施形態は、実質的に、図２（ａ）乃至（ｅ）において示されている第１の実施形態と類似している。特に、この実施形態においても、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１は、互いに空間的近接にある場合にハイブリダイズすることができるように、少なくとも部分的に相補的である。しかし、この実施形態において、第２のオリゴヌクレオチド４１のみがアクセプターフルオロフォア４２で標識され、さらに、図５において示されているように、第１及び第２の結合メンバー３０、４０、ここでは第１及び第２の抗体の結合の後で、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１のハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖の間に介入するドナーフルオロフォア３２が添加されるという相違点が実際には存在している。

ここで、第１及び第２の抗体３０、４０の結合の後でのみ添加されるドナーフルオロフォア３２は、例えばＤＡＰＩ（４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）又はオキサゾールイエローのテトラカチオンホモダイマーであるＹＯＹＯ等の挿入色素に基づいている。挿入色素は、二本鎖ＤＮＡの間に実際に介入された場合にのみ蛍光を発するため、ＦＲＥＴの作用は所望の位置でのみ引き起こされるということが有利に保証され得る。

図６は、患者の組織及び／又は細胞及び／又は体液の試料内のタンパク質複合体１の第１及び第２のタンパク質１０、２０の第１及び第２のエピトープ１１、２１の空間的近接を検出する方法の第４の実施形態を例示している。

この実施形態は、実質的に、図２（ａ）乃至（ｅ）において示されている第１の実施形態と類似している。しかし、この実施形態において、第１及び第２の結合メンバー３０、４０、ここでは第１及び第２の抗体の結合の後で、ＰＩ電子が分子に沿って非局在化されたポリマー６０が提供され、ポリマー６０は、第１のオリゴヌクレオチド３１にも第２のオリゴヌクレオチド４１にも結合する、及び、ドナーフルオロフォア３２からアクセプターフルオロフォア４２までエネルギーを転移させることができるか、又は、ドナーフルオロフォア３２及び／若しくはアクセプターフルオロフォア４２に対する受容体及び／若しくは供与体として作用することができるという相違点が実際には存在している。

この実施形態において、エネルギー転移は第３の要素、すなわちポリマー６０によって達成されるため、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１は、少なくとも部分的に相補的である必要はない。これは、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１が実質的に全く相補的でない場合に、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１の遮蔽を提供する必要はなく、この場合、遮蔽を取り除くステップも回避することができるため、より簡単なプロセスを結果として生じることができるという利点を有する。

好ましくは、１つ又は複数のポリマーが、１つのオリゴヌクレオチドに連結され、さらに、１つ又は複数の量子ドットが、相補的なオリゴヌクレオチドに連結され、試料内に容易に拡散することができる非常にコンパクトな検出要素をもたらし得る。

上記の図２乃至６を参考にして記載された第１乃至第４の実施形態において、第１及び第２の結合メンバー３０、４０は第１及び第２の抗体、好ましくは第１及び第２のモノクローナル抗体であるけれども、他の実施形態においては、例えば、ラクダ科動物抗体、アプタマー又はオリゴペプチド等の第１及び第２の抗体断片でもあり得る。より一般的には、第１及び第２の結合メンバー３０、４０は、それぞれ第１及び第２のエピトープ１１、２１に結合することができ、さらに、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１が結合することができるあらゆる種類の要素又は構造体であり得る。

上記の図２乃至６を参考にして記載された第１乃至第４の実施形態において、第１及び第２の抗体３０、４０の結合は２つのステップにおいて定められているけれども、これは、これら２つのステップを異なる順で、又は、好ましくは実質的に同時に行うことはできないということを意味しない。第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１から第１及び第２の分離シールド要素３３、４３を取り除くステップ、及び、第１及び第２の抗体３０、４０の結合の後で、ドナーフルオロフォア３２及びアクセプターフルオロフォア４２を第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１に付着させるステップについても同じことが言える。

上記の図５を参考にして記載された第３の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチド４１のみがアクセプターフルオロフォア４２で標識され、さらに、第１及び第２の抗体３０、４０の結合の後で、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１のハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖の間に介入するドナーフルオロフォア３２が添加されているけれども、逆もあり得る。言い換えると：別の実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド３１のみをドナーフルオロフォア３２で標識することができ、さらに、第１及び第２の抗体３０、４０の結合の後で、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１のハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖の間に介入するアクセプターフルオロフォア４２を添加することができる。

上記の図２乃至６を参考にして記載された第１乃至第４の実施形態において、第１及び第２の抗体３０、４０は、好ましくは、第１及び第２のエピトープ１１、２１がタンパク質複合体１の第１及び第２のタンパク質１０、２０上で不明瞭にされないように選択される。

上記の図２乃至６を参考にして記載された第１乃至第４の実施形態において、本発明は、タンパク質複合体１の第１及び第２のタンパク質１０、２０の第１及び第２のエピトープ１１、２１の空間的近接の検出に関して説明されてきた。しかし、本発明は、１つ（単一）のタンパク質の第１及び第２のエピトープの空間的近接の検出に利用することもできる。

本発明において、本明細書において記載されているように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）及びＬＮＡ（ロックド核酸）分子も含むように使用されている。

第１及び／又は第２のオリゴヌクレオチド３１、４１に対するＰＮＡ及び／又はＬＮＡの使用は、どちらも、より高い特異性でＤＮＡ（及びＲＮＡ）に結合するとして既知であるため、有利であり得る。この特性を使用して、例えば、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１の早発性のハイブリダイゼーションをさらにより防ぐことによって、第１及び第２のオリゴヌクレオチド３１、４１が少なくとも相補的である実施形態をさらにより特異的且つ頑強にすることができる。加えて、ＰＮＡ分子及び／又はＬＮＡ分子が第１及び／又は第２のオリゴヌクレオチド３１、４１に対して使用される場合、第１及び第２の分離シールド要素３３、４３を取り除くのに要求される温度の上昇はより少なくてもよい。またさらに、ＰＮＡ及びＬＮＡ等の人工核酸は、より短い持続長を有してもよい。

加えて、例えば塩濃度を上げることによって、この場合結果的に持続長は減るため、オリゴヌクレオチドの可撓性を改善することができる。非特許文献５は、塩濃度を０．１Ｍを超えて上げることによって、二本鎖ＤＮＡの持続長を、通常の５０ｎｍの代わりに３０ｎｍまで下げることが可能であるということを示している。

本発明は、疾患の診断、特に、癌の診断の分野において適用することができる。本発明によって検出することができるタンパク質ダイマー等の多量体タンパク質凝集物、及び／又は、タンパク質翻訳後修飾の例として：
− ＨＥＲ２−ＨＥＲ２ダイマー、
− ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ダイマー、
− ＨＥＲ２リン酸化、
− ＡＫＴリン酸化、
− ＥＲ−ＥＲダイマー、
− ＥＲ−ｐ３００ダイマー、
− ＡＲ−ｐ３００ダイマー、
− ＴＣＦ４−β−カテニンダイマー、
等が挙げられる。

一般に、本発明は、シグナル経路に向けられた治療の適合性を評価するために、及び／又は、対象の疾患、好ましくは癌患者の癌の結果の予後のために、及び／又は、治療に向かう疾患を患う対象、好ましくは癌患者の治療抵抗性の予測及び／又は検出のために、疾患を患う対象、好ましくは患者、より好ましくは癌患者を層別化する方法にも関する。当該方法は、対象の試料において、少なくとも１つの転写因子が存在しているかどうかを検出するための、本明細書において先に記載された本発明による方法を適用することによって、シグナル経路の活性化状態を決定するステップを含む。

そのような方法は、例えば、特定のタンパク質、好ましくは、膜受容体ＨＥＲ２等の転写因子の存在、又は、２つ以上の空間的近接のタンパク質、好ましくは、ＥＲ及びｐ３００（上記を参照）等の転写因子複合体の一部である２つ以上のタンパク質の存在を検出するために使用されてもよい。

例えば、半定量的な様式において、ＨＥＲ２の存在を示すために、免疫組織化学（ＩＨＣ）実験が、組織生検試料に対してルーチン的に行われる。この受容体の有無は、患者が標的薬物ハーセプチンに応答することになるかどうかを示すため、臨床的に関連性がある。そのような臨床的なＩＨＣテストの他の例として、ＥＲ及びＰＲ等のホルモン受容体の存在の検出が挙げられるが、例えば、増殖マーカーＫｉ６７の存在の検出も挙げられる。

ＩＨＣは証明された臨床的値を有するけれども、単なるタンパク質の存在は、細胞シグナリングにおけるその能動的役割を証明することができないという事実に関して制限される。タンパク質は能動的にシグナル伝達しているかどうか言うことができるように、そのリン酸化状態、又は、他のタンパク質との複合体を形成しているかどうかを検出する本願の方法が必要とされる。例えば、上記のＨＥＲ２タンパク質は、タンパク質ＨＥＲ３とダイマーを形成し、さらに、ハーセプチンの作用を回避することができる。関連性のある相互作用の別の例は、多数のタンパク質の凝縮物である転写因子複合体であり、その存在が遺伝子転写の活性化を示し得る。その存在は、おそらく、腫瘍により駆り立てられる経路を示し、従って、上記の腫瘍の治療に関連性がある。一例は、転写因子複合体ＴＧＦ−β／β−カテニンであり：これらのタンパク質は核において非常に空間的近接にあると示すことができる場合、Ｗｎｔ経路はオン状態である可能性が最も高く、単なるこれら２つのタンパク質のうち１つの存在のみでは、同じ意味を有さない。

上記のように、本発明は、本発明による方法を行うためのキットにも関する。行われることになる方法に応じて、そのようなキットの構成成分は、その方法に合うように選択されなければならない。例えば、ハーセプチン治療の適合性を評価する方法を行うために、そのようなキットは、第１のエピトープ１１に対して作られた、例えば第１の抗体等の、第１のオリゴヌクレオチド３１を結合させた第１の結合メンバー３０と、第２のエピトープ２１に対して作られた、例えば第２の抗体等の、第２のオリゴヌクレオチド４１を結合させた第２の結合メンバー４０と、ドナーフルオロフォア３２及びアクセプターフルオロフォア４２とを含んでもよく、第１のエピトープ１１はＨＥＲ２のものであり、さらに、第２のエピトープ２１はＨＥＲ３のものである。

開示された実施形態に対する他の異形は、請求された発明を実行する際に、図面、明細書、及び付随の特許請求の範囲の調査から当業者により理解する及びもたらすことができる。

特許請求の範囲において、「含む」という用語は、他の要素又はステップを除外せず、不定冠詞はその複数形を除外しない。

特許請求の範囲におけるいかなる参照番号も、その範囲を限定するとして解釈されるべきではない。

本発明は、対象の試料内の１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質の第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を検出する方法も提供し、当該方法は：
− 第１のオリゴヌクレオチドを結合させた第１の結合メンバーを、第１のエピトープに結合させるステップと、
− 第２のオリゴヌクレオチドを結合させた第２の結合メンバーを、第２のエピトープに結合させるステップと、
− 蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の作用が、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドに関連したドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間に存在しているかどうかを決定するステップであり、ＦＲＥＴの作用の存在が、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの空間的近接を示し、従って、第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を示す、ステップと、
を含み、
当該方法は：
− 第１の結合メンバー及び第２の結合メンバーの結合の後で、ＰＩ電子が分子に沿って非局在化されたポリマーを提供するステップを含み、ポリマーは、第１のオリゴヌクレオチドにも第２のオリゴヌクレオチドにも結合する、及び、ドナーフルオロフォアからアクセプターフルオロフォアまでエネルギーを転移させることができる（非特許文献３を参照）。

本発明は、さらに、本発明によって定められる方法を行うためのキットを提供し、当該キットは、以下の構成要素、すなわち：
− 第１のエピトープに対して作られた、第１のオリゴヌクレオチドを結合させた第１の結合メンバー、
− 第２のエピトープに対して作られた、第２のオリゴヌクレオチドを結合させた第２の結合メンバー、
− ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォア、及び、
− ＰＩ電子が分子に沿って非局在化されたポリマーであり、第１のオリゴヌクレオチドにも第２のオリゴヌクレオチドにも結合する、及び、ドナーフルオロフォアからアクセプターフルオロフォアまでエネルギーを転移させることができる、ポリマー、
を含み、
第１のエピトープ及び第２のエピトープは、１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質のエピトープである。

Claims (14)

1. 対象の試料内の１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質の第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を検出する方法であって、
   − 第１のオリゴヌクレオチドを結合させた第１の結合メンバーを、前記第１のエピトープに結合させるステップと、
   − 第２のオリゴヌクレオチドを結合させた第２の結合メンバーを、前記第２のエピトープに結合させるステップと、
   − 蛍光共鳴エネルギー転移の作用が、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドに関連したドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間に存在しているかどうかを決定するステップであり、前記蛍光共鳴エネルギー転移の作用の存在が、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドの空間的近接を示し、従って、前記第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を示す、ステップと、
   を含み、
   前記第１のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、
   前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドの早発性のハイブリダイゼーションを防ぐために、前記第１のオリゴヌクレオチドには、最初に、第１の分離シールド要素が提供され、且つ／又は、前記第２のオリゴヌクレオチドには、最初に、第２の分離シールド要素が提供される、方法。
2. 前記第１のオリゴヌクレオチドは前記ドナーフルオロフォアで前標識され、且つ／又は、前記第２のオリゴヌクレオチドは前記アクセプターフルオロフォアで前標識され、且つ／又は、当該方法は、
   − 前記第１の結合メンバーの結合の後で、前記ドナーフルオロフォアを前記第１のオリゴヌクレオチドに付着させるステップ、及び／又は、
   − 前記第２の結合メンバーの結合の後で、前記アクセプターフルオロフォアを前記第２のオリゴヌクレオチドに付着させるステップ、
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. − 前記第１の結合メンバーの結合の後で、前記第１の分離シールド要素を前記第１のオリゴヌクレオチドから取り除くステップ、及び／又は、
   − 前記第２の結合メンバーの結合の後で、前記第２の分離シールド要素を前記第２のオリゴヌクレオチドから取り除くステップ、
   を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１の分離シールド要素は、前記第１のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり且つそこにハイブリダイズする第１のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を含み、且つ／又は、前記第２の分離シールド要素は、前記第２のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり且つそこにハイブリダイズする第２のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を含む、請求項１又は３に記載の方法。
5. 前記第１のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖、及び／又は、前記第２のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を取り除くステップは、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第１のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖のハイブリダイゼーション、及び／又は、前記第２のオリゴヌクレオチド及び前記第２のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを融解させることを含む、請求項３を引用する場合の請求項４に記載の方法。
6. 前記第１のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖は第１のＲＮＡ鎖であり、且つ／又は、前記第２のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖は第２のＲＮＡ鎖であり、前記第１のＲＮＡ鎖及び／又は前記第２のＲＮＡ鎖を取り除くステップは酵素の使用を含む、請求項３を引用する場合の請求項４に記載の方法。
7. − 前記第１の結合メンバーの結合の後で、前記ドナーフルオロフォアで前標識された第３のオリゴヌクレオチドを提供するステップであり、前記第３のオリゴヌクレオチドは、前記第１のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、さらに、前記第１のオリゴヌクレオチドに前記ドナーフルオロフォアを付着させるステップは、前記第３のオリゴヌクレオチドを前記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを含む、ステップ、及び／又は、
   −前記第２の結合メンバーの結合の後で、前記アクセプターフルオロフォアで前標識された第４のオリゴヌクレオチドを提供するステップであり、前記第４のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、さらに、前記第２のオリゴヌクレオチドに前記アクセプターフルオロフォアを付着させるステップは、前記第４のオリゴヌクレオチドを前記第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを含む、ステップ、
   を含む、請求項２乃至６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１のオリゴヌクレオチドは前記ドナーフルオロフォアで前標識され、又は、前記第２のオリゴヌクレオチドは前記アクセプターフルオロフォアで前標識され、当該方法は、
   − 前記第１の結合メンバー及び前記第２の結合メンバーの結合の後で、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖の間に介入する前記アクセプターフルオロフォア又は前記ドナーフルオロフォアを添加するステップ、
   を含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
9. 対象の試料内の１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質の第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を検出する方法であって、
   − 第１のオリゴヌクレオチドを結合させた第１の結合メンバーを、前記第１のエピトープに結合させるステップと、
   − 第２のオリゴヌクレオチドを結合させた第２の結合メンバーを、前記第２のエピトープに結合させるステップと、
   − 蛍光共鳴エネルギー転移の作用が、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドに関連したドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間に存在しているかどうかを決定するステップであり、前記蛍光共鳴エネルギー転移の作用の存在が、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドの空間的近接を示し、従って、前記第１のエピトープ及び第２のエピトープの空間的近接を示す、ステップと、
   を含み、
   当該方法は、
   − 前記第１の結合メンバー及び前記第２の結合メンバーの結合の後で、ＰＩ電子が分子に沿って非局在化されたポリマーを提供するステップを含み、前記ポリマーは、前記第１のオリゴヌクレオチドにも前記第２のオリゴヌクレオチドにも結合する、及び、前記ドナーフルオロフォアから前記アクセプターフルオロフォアまでエネルギーを転移させることができるか、又は、前記ドナーフルオロフォア及び／又は前記アクセプターフルオロフォアに対する受容体及び／又は供与体として作用することができる、方法。
10. 前記蛍光共鳴エネルギー転移の作用が存在しているかどうかを決定するステップは、
    − 前記試料の少なくとも１つの蛍光画像を取得すること、及び、
    − 前記蛍光共鳴エネルギー転移の作用を検出し且つ局在化させるために、前記少なくとも１つの蛍光画像の空間分解分析を行うこと、
    を含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
11. シグナル経路に向けられた治療の適合性を評価するために、及び／又は、対象の疾患の結果の予後のために、及び／又は、治療に向かう疾患を患う対象の治療抵抗性の予測及び／又は検出のために、疾患を患う対象を層別化する方法であって、
    − 前記対象の試料において、少なくとも１つの転写因子が存在しているかどうかを検出するための請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法を適用することによって、前記シグナル経路の活性化状態を決定するステップ、
    を含む方法。
12. 請求項１乃至８、１０又は１１のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、以下の構成要素、すなわち、
    − 第１のエピトープに対して作られた、第１のオリゴヌクレオチドを結合させた第１の結合メンバー、
    − 第２のエピトープに対して作られた、第２のオリゴヌクレオチドを結合させた第２の結合メンバー、及び
    − ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォア、
    を含み、
    前記第１のエピトープ及び前記第２のエピトープは、１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質のエピトープであり、
    前記第１のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、
    前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドの早発性のハイブリダイゼーションを防ぐために、前記第１のオリゴヌクレオチドには第１の分離シールド要素が提供され、且つ／又は、前記第２のオリゴヌクレオチドには第２の分離シールド要素が提供される、キット。
13. 請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、以下の構成要素、すなわち、
    − 第１のエピトープに対して作られた、第１のオリゴヌクレオチドを結合させた第１の結合メンバー、
    − 第２のエピトープに対して作られた、第２のオリゴヌクレオチドを結合させた第２の結合メンバー、
    − ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォア、及び、
    − ＰＩ電子が分子に沿って非局在化されたポリマーであり、前記第１のオリゴヌクレオチドにも前記第２のオリゴヌクレオチドにも結合する、及び、前記ドナーフルオロフォアから前記アクセプターフルオロフォアまでエネルギーを転移させることができるか、又は、前記ドナーフルオロフォア及び／又は前記アクセプターフルオロフォアに対する受容体及び／又は供与体として作用することができる、ポリマー、
    を含み、
    前記第１のエピトープ及び前記第２のエピトープは、１つのタンパク質又はタンパク質複合体の第１のタンパク質及び第２のタンパク質のエピトープである、キット。
14. 請求項１乃至８、１０又は１１のいずれか一項に記載の方法において使用するための請求項１２に記載のキットの使用、又は、請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の方法において使用するための請求項１３に記載のキットの使用。

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