DE69915932T2 - Verfahren zur Bestimmung von Ziel-Nukleinsäuren - Google Patents

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    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer einzelsträngigen RNA, die eine spezifische Nukleinsäuresequenz enthält, in einer Probe, das den Nachweis und die Quantifizierung viraler RNA und bakterieller mRNA ermöglicht und in der Diagnose infektiöser Erkrankungen und der Abschätzung der Wirksamkeit therapeutischer Mittel für infektiöse Erkrankungen wirksam ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen DNA und RNA, die eine spezifische Nukleinsäuresequenz enthalten, was zur Klonierung nützlicher Gene und zur Erforschung unbekannter Gene verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Reagenziensatz zur Verwendung in diesen Verfahren.
  • Bestimmungen biogener Verbindungen erfordern hohe Spezifität und Sensitivität. Sequenz-spezifische Hybridisierbarkeit einer Nukleinsäure mit einer komplementären Nukleinsäure (einer Nukleinsäuresonde) wird in Bestimmungen einer spezifischen Nukleinsäure eingesetzt. Messbare Signale, die der Menge des Hybridisierungsprodukts entsprechen, sind unabdingbar für die Quantifizierung einer Ziel-Nukleinsäure. In der klinischen Diagnose sind hoch sensitive Signale erforderlich, da die Proben üblicherweise sehr geringe Mengen der Ziel-Nukleinsäuren enthalten.
  • Zur Quantifizierung einer Ziel-Nukleinsäure in einer Probe wurde ein Sandwich-Bestimmung genanntes Verfahren angewendet, das die Festphasen-Hybridisierung der Ziel-Nukleinsäure mit einer markierten Nukleinsäuresonde, die messbare Signale auf Membranen, Kügelchen (beads) oder Gelen abgibt, beinhaltet. In praxi werden zwei für verschiedene Sequenzen innerhalb der Ziel-Nukleinsäure spezifische Nukleinsäuresonden verwendet: eine erste, mit einem Farbstoff mit einer sichtbaren Farbe, einer fluoreszierenden Verbindung oder einem Enzym, das die Entstehung eines solchen Farbstoffs oder einer fluoreszierenden Verbindung katalysiert, markierte Nukleinsäuresonde, und eine zweite, an einer Festphase immobilisierte Sonde. Diese Sonden werden zu einer Probe zugegeben und hybridisieren mit der spezifischen Nukleinsäure in der Probe, wobei sie einen Komplex an der festen Phase bilden. Die Reaktionsmischung wird dann in den Überstand und die Festphase getrennt, um die nicht hybridisierte erste Sonde zu entfernen (B/F-Trennung). Die spezifische Nukleinsäure in der Probe kann durch die Messung der Markierung auf der Festphase bestimmt werden. Ist die Markierung ein Enzym, das die Entstehung eines Farbstoffs mit einer sichtbaren Farbe oder einer fluoreszierenden Verbindung katalysiert, wird eine Vorstufe des Farbstoffs oder der fluoreszierenden Verbindung als Enzymsubstrat zu der Probenlösung nach der B/F-Trennung zugegeben, und die entstehende Farbe oder fluoreszierende Verbindung wird gemessen.
  • Da klinische Proben die Ziel-Nukleinsäure (virale Nukleinsäure) üblicherweise in sehr geringen Mengen enthalten, wurde speziell in der Diagnose von Virusinfektionen versucht, durch eine Sandwich-Bestimmung mit einer chemiluminiszenten Verbindung als Enzymsubstrat oder einer vorangehenden Präamplifizierung der Ziel-Nukleinsäure in den Proben durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Signalintensität und -sensitivität für eine sensitive und reproduzierbare Bestimmung zu erhöhen.
  • Ein anderes, auf der PCR beruhendes, für die Bestimmung einer Ziel-Nukleinsäure bekanntes Verfahren ist die kompetitive PCR. Bei diesem Verfahren wird die PCR in Gegenwart einer bestimmten Konzentration einer Nukleinsäure durchgeführt, die eine zu der der Ziel-Nukleinsäure (ein Kompetitor) in der Probe ähnliche Basensequenz hat, und die Konzentration der Ziel-Nukleinsäure wird durch den Amplifizierungsgrad der Ziel-Nukleinsäure abgeschätzt. In praxi wird mit einer Probe eine PCR in Gegenwart verschiedener Konzentrationen einer Nukleinsäure durchgeführt, die eine zu einem Primer komplementäre, terminale Sequenz besitzt und die gleichzeitig von dem Amplifikationsprodukt der Ziel-Nukleinsäure durch Trennverfahren, wie etwa Elektrophorese, unterscheidbar ist (zum Beispiel durch die Länge).
  • Der homogene, trägerfreie Ansatz für eine auf PCR beruhende Quantifizierung einer Ziel-Nukleinsäure wurde ebenfalls vorgeschlagen. Zum Beispiel veröffentlichten die genannten Erfinder ein Bestimmungsverfahren, in dem die Anfangsmenge der Ziel-Nukleinsäure durch die Messung der Fluoreszenz der Reaktionslösung nach jedem PCR-Zyklus während der PCR in Gegenwart einer fluoreszierenden, interkalierenden Verbindung bestimmt wird (JP-A-5-237000; Igaku-no-Ayumi 173 (12) (1995), 959–963; Analytical Biochemistry 229 (1995), 207–213). Da die PCR-Amplifikationsprodukte doppelsträngige DNA sind, wird in diesem Bestimmungsverfahren eine fluoreszierende, interkalierende Verbindung, die ihre Fluoreszenzcharakteristik durch die Einlagerung in eine doppelsträngige Nukleinsäure, zum Beispiel durch Erhöhung der Fluoreszenzintensität, verändert, vor der PCR-Amplifizierung zu den Probenlösungen zugegeben, und die Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung wird beobachtet, um die Anfangsmenge der Ziel-Nukleinsäure aus dem Muster der Fluoreszenzverstärkung zu bestimmen. Weiterhin ermöglicht es dieses Verfahren, die Amplifikation der Ziel-Nukleinsäure durch fluorimetrische Messung der Reaktionslösung in einem geschlossenen Reagiergefäß zu verfolgen und kann daher das Problem falsch positiver Ergebnisse umgehen, die auf eine Verschleppung der Amplifikationsprodukte zurückzuführen sind, da eine Probennahme der Reaktionslösung aus dem Reagiergefäß unnötig ist.
  • Gegenwärtig liegt die Nachweis- oder Quantifizierungsgrenze der Sandwich-Bestimmung für eine Ziel-Nukleinsäure bestenfalls bei etwa 105 Kopien, selbst wenn die erste, mit mehreren Enzymmolekülen markierte Sonde verwendet wird, um eine große Menge einer luminiszierenden Verbindung in einem für eine relativ hohe Sensitivität bekannten enzymatischen Chemiluminiszenzsystem zu erzeugen, weil die nicht spezifisch an der Festphase adsorbierte erste Sonde ein beträchtliches Hintergrundsignal (Hintergrund) abgibt und daher Fehler in der Messung der Festphasen-Hybridisierung auf der Oberfläche erzeugt.
  • Zur Vermeidung nicht spezifischer Adsorption der ersten Sonde an einem festen Träger wurden die hydrophile Oberflächenbehandlung des Trägers, die Absättigung adsorptiver Stellen auf der Trägeroberfläche mit Protein, durch Waschen des festen Trägers nach der B/F-Trennung und die Verwendung einer Reinigungslösung mit hohem Detergenzgehalt, die ein oberflächenaktives Mittel enthält, erprobt.
  • Die chemische hydrophile Oberflächenbehandlung ist jedoch auf einige Arten von Trägern, in Abhängigkeit vom Material des Trägers, nicht anwendbar und kann technisch schwierig sein. Auch die Beschichtung der Trägeroberfläche mit Protein zur Absättigung der Adsorptionsstellen auf dem Träger kann zu einer anderen Art nicht spezifischer Adsorption führen, die auf eine Wechselwirkung zwischen der Proteinbeschichtung und dem Nukleinsäuresegment oder der Markierung der ersten Sonde zurückzuführen ist. Waschschritte nach der B/F-Trennung können aufgrund operativer Beschränkungen nicht unbegrenzt ausgedehnt werden, und das der Reinigungslösung zugesetzte oberflächenaktive Mittel kann die Zersetzung des auf dem Träger gebildeten Hybrids auslösen.
  • In einer kompetitiven PCR-Bestimmung ist es erforderlich, die PCR zur Analyse einer Probe mit Probenlösungen durchzuführen, die einen Kompetitor in verschiedenen Konzentrationen enthalten, die im Bereich der vorhergesagten Konzentration der Ziel-Nukleinsäure liegen. Daneben ist die Trennung von Probenlösungen, die aus den Reagiergefässen entnommen werden, nach der PCR, zum Beispiel durch Elektrophorese, erforderlich. Daher ist die Bestimmung durch kompetitive PCR schwierig zu automatisieren und ungeeignet für die klinische Diagnostik, die eine schnelle Handhabung einer großen Anzahl von Proben erfordert. Weiterhin muß aufgrund der erforderlichen Entnahme von Probenlösungen aus den Reagiergefässen das Problem Falsch-Positiver gelöst werden, das auf Verschleppung von Amplifikationsprodukten bei der praktischen Anwendung der PCR-Bestimmung zurückzuführen ist.
  • Auf PCR beruhende Bestimmungen in Gegenwart eines fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoffs haben das Problem, daß sich der interkalierende Farbstoff in andere doppelsträngige DNA einlagert, wenn die Probe eine große Menge einer anderen doppelsträngigen DNA, wie etwa genomische DNA, zusätzlich zu der spezifischen Nukleinsäure enthält, und so einen beträchtlichen Hintergrund erzeugt, da sie auf der Fähigkeit eines fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoffs beruhen, sich in eine doppelsträngige Nukleinsäure einzulagern. Weiterhin können in auf PCR beruhenden Bestimmungen, die ein Paar zu der spezifischen Nukleinsäuresequenz komplementäre Oligo-DNAs als Primer für die Kettenverlängerung verwenden, die Primer in Abhängigkeit von ihren Basensequenzen miteinander hybridisieren und sich durch gegenseitige Verwendung als Matrizen verlängern, um Primer-Dimere zu erzeugen. Da die Einlagerung eines fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoffs in eine doppelsträngige Nukleinsäure nicht spezifisch ist, erzeugt die Entstehung eines solchen Primer-Dimers das Problem eines hohen Hintergrunds.
  • Die Nachfrage nach Automatisierung in der klinischen Diagnostik wird sich wahrscheinlich weiter erhöhen, um schnelle und reproduzierbare Analysen einer großen Anzahl von Proben zu verwirklichen. Die PCR beinhaltet das wiederholte schnelle Erhitzen und Kühlen der Reaktionslösungen und erfordert eine exakte Temperaturkontrolle während der Erhitzung und Abkühlung, da die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit dieser Abläufe die Ergebnisse der PCR beeinflussen kann. Es ist jedoch nicht einfach, ein voll automatisiertes Gerät mit genügend hohem Inkubations-Vermögen bereitzustellen, um diese Erfordernisse und eine ausreichend hohe Durchsatzkapazität zu erfüllen.
  • Weiterhin geht im Fall von RNA als der viralen Nukleinsäure in den meisten Viren der PCR die Synthese von cDNA durch eine Reverse Transkriptase voraus, die RNA als Matrize benutzt, und daher sind im Wesentlichen zwei Schritte erforderlich.
  • Für die Amplifizierung eines Ziel-Nukleotids bei konstanter Temperatur ist das so genannte NASBA-Verfahren bekannt. Das NASBA-Verfahren ist scheinbar leicht zu automatisieren, da Erhitzen oder Kühlen unnötig sind, erfordert aber eine Sandwich-Bestimmung oder elektrophoretische Trennung der amplifizierten RNA und kann daher die auf diese Abläufe zurückzuführenden Probleme nicht lösen.
  • WO 91/04340 beschreibt ein isothermes Verfahren zur Nukleinsäureamplifizierung, in dem die Ziel-DNA am 3'-Ende geschnitten wird, um eine spezifische Sequenz zu erhalten, an die ein Promotorprimer hybridisieren kann. Eine doppelsträngige DNA, die einen funktionellen Promotor enthält, wird durch die Aktivität einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase erzeugt. Transkripte werden von dem erhaltenen doppelsträngigen DNA-Molekül durch die Aktivität einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase unter Verwendung des Promotors erzeugt. Ein an das 3'-Ende der RNA bindendes Oligonukleotid dient als Primer für die reverse Transkription, die einen DNA/RNA-Heteroduplex liefert, an dem die RNA abgebaut wird. Der Promotorprimer kann dann an das entstandene DNA-Molekül binden.
  • Wenn RNA amplifiziert werden soll, bindet zuerst ein Primer an das RNA-Molekül und wird dann durch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase verlängert. Der RNA-Strang wird abgebaut, gefolgt von der Synthese des zweiten Strangs, wodurch ein doppelsträngiges DNA-Molekül erhalten wird, das einen funktionellen Promotor beinhaltet, der zur Erzeugung von RNA dienen kann.
  • Ishiguro et al. (Anal. Biochem. 229 (1995), 207–213) veröffentlichen eine quantitative Bestimmung für Hepatitis C Virus-RNA durch PCR in Gegenwart eines fluoreszierenden Interkalators.
  • Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und genauen Verfahrens zur Bestimmung einer einzelsträngigen RNA, die eine spezifische Nukleinsäuresequenz enthält, in einer Probe bei nahezu konstanter Temperatur ohne wiederholtes schnelles Aufheizen und Abkühlen der Reaktionslösung in einer PCR oder der Verwendung eines Trägers bei der Messung der amplifizierten RNA, wobei alle Verfahrensschritte bevorzugt in einem geschlossenen Reagiergefäß durchgeführt werden.
  • Die genannten Erfinder entwickelten eine Nukleinsäuresonde, die komplementär zu einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in der Ziel-Nukleinsäure und mit einem fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoff markiert ist, um bei Bindung an die Ziel-Nukleinsäure ein messbares Fluoreszenzsignal abzugeben (JP-A-7-185599/EP-A-714986/Nucleic Acid Research 24 (24) (1996), 4992–4997). Die Nukleinsäuresonde erzeugt durch die Hybridisierung mit der Ziel-Nukleinsäure ein messbares Fluoreszenzsignal und ermöglicht daher den Nachweis der Hybridisierung und die Quantifizierung des Hybridisierungsprodukts ohne Abtrennung der nicht hybidisierten Sonde. Weiterhin haben die genannten Erfinder die Synthese einer RNA mit der spezifischen Nukleinsäuresequenz unter Verwendung einer Nukleinsäure-Polymerase und Nukleinsäureprimern in Gegenwart der Nukleinsäuresonde bei konstanter Temperatur entwickelt, insbesondere die Amplifizierung und die Bestimmung der Ziel-RNA bei konstanter Temperatur ohne Verwendung eines Trägers, bevorzugt in einem geschlossenen System, und haben die vorliegende Erfindung ausgeführt.
  • Gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Anmeldung stellt die vorliegende Erfindung ein einfaches und genaues Verfahren zur Bestimmung einer einzelsträngigen RNA, die eine spezifische Nukleinsäuresequenz enthält, in einer Probe bei nahezu konstanter Temperatur bereit, unter Verwendung mindestens der folgenden Reagenzien (A) bis (I), das einen Schritt der Zugabe der Reagenzien (A) bis (I) nacheinander (in beliebiger Reihenfolge), in Kombination von mindestens zweien oder alle gleichzeitig und
    einen Schritt der Messung eines Fluoreszenzsignals in Gegenwart des Reagenz (I) mindestens einmal nach Zugabe mindestens der Reagenzien (A) bis (H) enthält;
    • (A) eine erste einzelsträngige Oligonukleinsäure, die komplementär ist zu einer Sequenz neben dem 5'-Ende der spezifischen Nukleinsäure in der einzelsträngigen RNA,
    • (B) eine zweite einzelsträngige Oligo-DNA, die komplementär ist zu einer Sequenz am 3'-Ende innerhalb der spezifischen Nukleinsäuresequenz,
    • (C) eine RNA-abhängige DNA-Polymerase,
    • (D) Desoxyribonukleosidtriphosphate,
    • (E) eine dritte einzelsträngige Oligo-DNA, die (1) eine Promotorsequenz für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, (2) eine Verstärker (Enhancer)-Sequenz für den Promotor und (3) eine Sequenz vom 5'-Ende innerhalb der spezifischen Nukleinsäuresequenz, in dieser Reihenfolge vom 5'-Ende, hat,
    • (F) eine DNA-abhängige DNA-Polymerase,
    • (G) eine DNA-abhängige RNA-Polymerase,
    • (H) Ribonukleosidtriphosphate, und
    • (I) eine vierte einzelsträngige, zu der spezifischen Nukleinsäuresequenz komplementäre Oligo-DNA, die so markiert ist, daß sie ein messbares Fluoreszenzsignal bei Hybridisierung mit einer die spezifische Nukleinsäuresequenz enthaltenden Nukleinsäure abgibt.
  • Gemäß den Ansprüchen 19 bis 23 in der vorliegenden Anmeldung stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Reagenz oder einen Reagenziensatz zur Durchführung des oben genannten Verfahrens bereit, und besonders gemäß Anspruch 19 stellt die vorliegende Erfindung einen Reagenziensatz zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 bereit, der mindestens beinhaltet
    ein erstes Reagenz, das die erste einzelsträngige Oligonukleinsäure enthält,
    ein zweites Reagenz, das Tris-Acetat, Magnesiumacetat, Kaliumacetat, Sorbit und Dimethylsulfoxid enthält,
    ein drittes Reagenz, das Dithiothreit, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate, Rinderserumalbumin, die zweite einzelsträngige Oligo-DNA und die dritte einzelsträngige Oligo-DNA enthält,
    ein viertes Reagenz, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und einen RNase-Inhibitor enthält und
    ein fünftes Reagenz, das die vierte einzelsträngige Oligo-DNA enthält.
  • Besonders gemäß Anspruch 20 stellt die vorliegende Erfindung einen Reagenziensatz zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 bereit, der mindestens beinhaltet
    ein erstes Reagenz, das die erste einzelsträngige Oligonukleinsäure enthält,
    ein zweites Reagenz, das Tris-Acetat, Magnesiumacetat, Kaliumacetat, Sorbit und Dimethylsulfoxid enthält,
    ein drittes Reagenz, das Dithiothreit, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate, Rinderserumalbumin, die zweite einzelsträngige Oligo-DNA, die dritte einzelsträngige Oligo-DNA und die vierte einzelsträngige Oligo-DNA enthält, und
    ein viertes Reagenz, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und einen RNase-Inhibitor enthält.
  • Gemäß Anspruch 21 stellt die vorliegende Erfindung weiterhin einen Reagenziensatz zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 bereit, der mindestens beinhaltet
    ein erstes Reagenz, das die erste einzelsträngige Oligonukleinsäure enthält,
    ein zweites Reagenz, das Tris-Acetat, Magnesiumacetat, Kaliumacetat, Sorbit und Dimethylsulfoxid enthält,
    ein drittes Reagenz, das Dithiothreit, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate, Rinderserumalbumin, die zweite einzelsträngige Oligo-DNA und die dritte einzelsträngige Oligo-DNA enthält,
    ein viertes Reagenz, das die vierte einzelsträngige Oligo-DNA, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und einen RNase-Inhibitor enthält.
  • Besonders gemäß Anspruch 22 stellt die vorliegende Erfindung ein Reagenz zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 bereit, das mindestens die erste einzelsträngige Oligonukleinsäure, die zweite einzelsträngige Oligo-DNA, die dritte einzelsträngige Oligo-DNA, die vierte einzelsträngige Oligo-DNA, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate, Tris-Acetat, Magnesiumacetat, Kaliumacetat, Sorbit, Dimethylsulfoxid, Dithiothreit, Rinderserumalbumin und einen RNase-Inhibitor beinhaltet, und zwar ein durch Mischen aller Komponenten erhaltenes Einzelreagenz.
  • 1 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines 2%-igen Agarosegels des Produkts der PCR mit der zweiten und dritten einzelsträngigen Oligo-DNA in Beispiel 1. Spuren 2 bis 4: bekannte Konzentrationen der Standard-DNA, Spuren 5 bis 7: 0.2 bis 5 μl des PCR-Produkts.
  • 2 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines 2%-igen Agarosegels nach den Reaktionen bei verschiedenen Magnesiumacetat-Konzentrationen in Beispiel 2. Der Pfeil zeigt das spezifische Produkt an (etwa 300 bp). Die Magnesiumacetat-Konzentrationen sind als Endkonzentrationen angegeben.
  • 3 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines 2%-igen Agarosegels nach den Reaktionen bei verschiedenen Kaliumacetat-Konzentrationen in Beispiel 3. Der Pfeil zeigt das spezifische Produkt an (etwa 300 bp). Die Kaliumacetat-Konzentrationen sind als Endkonzentrationen angegeben.
  • 4 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines 2%-igen Agarosegels nach den Reaktionen bei verschiedenen Sorbit-Konzentrationen in Beispiel 4. Der Pfeil zeigt das spezifische Produkt an (etwa 300 bp).
  • 5 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines 2%-igen Agarosegels nach den Reaktionen in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der Standard-DNA in Beispiel 5. Der Pfeil zeigt das spezifische Produkt an (etwa 300 bp).
  • 6 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines 12% Harnstoff enthaltenden Polyacrylamidgels nach der Reaktion der 133mer RNA, die zu einer benachbarten Sequenz am 5'-Ende der spezifischen Nukleinsäuresequenz innerhalb der 133mer RNA komplementäre erste einzelsträngige Oligo-DNA und verschiedene RNase H-Konzentrationen in Beispiel 6. Die Pfeile zeigen das 133mer und das 72mer an.
  • 7 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines 2%-igen Agarosegels nach den Reaktionen in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der Standard-RNA in Beispiel 7. Der Pfeil zeigt das spezifische Produkt an (etwa 300 bp).
  • 8 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines 2%-igen Agarosegels der Reaktionsprodukte mit verschiedenen Konzentrationen der Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) nach RNase A- oder DNase I-Behandlung in Beispiel B. Das DNA-Produkt und das RNA-Produkt sind angezeigt.
  • 9 zeigt die Ergebnisse der densitometrischen Quantifizierung der Produkte mit der Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) bei verschiedenen Reaktionszeiten nach RNase A- oder DNase I-Behandlung, gefolgt von einer Elektrophorese eines 2%-igen Agarosegels in Beispiel 9.
  • 10 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines 2%-igen Agarosegels der Produkte mit der Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) bei verschiedenen Reaktionszeiten in Beispiel 10.
  • 11 zeigt die Ergebnisse einer Fluoreszenzmessung nach Zugabe der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA zu den in 10 gezeigten, in Beispiel 10 erhaltenen Produkten.
  • 12 zeigt die Ergebnisse der Fluoreszenzmessung nach verschiedenen Reaktionszeiten mit der Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) in Gegenwart der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA in Beispiel 11.
  • 13 zeigt die Ergebnisse der Fluoreszenzmessung nach verschiedenen Reaktionszeiten mit der Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) in Gegenwart der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA mit einem modifizierten 3'-Ende (mit ddTTP am 3'-Ende) in Beispiel 11.
  • 14 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines 2%-igen Agarosegels nach verschiedenen Reaktionszeiten mit der Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) in Gegenwart der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA mit einem modifizierten 3'-Ende (mit ddTTP am 3'-Ende) in Beispiel 12.
  • 15 zeigt die Ergebnisse der densitometrischen quantitativen Analyse des in 14 gezeigten Elektrophoretogramms in Beispiel 12.
  • 16 zeigt die Ergebnisse der Fluoreszenzmessung nach verschiedenen Reaktionszeiten mit der Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) in Gegenwart der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA mit einem modifizierten 3'-Ende (mit ddTTP am 3'-Ende) in Beispiel 13.
  • 17 zeigt die Ergebnisse der Fluoreszenzmessung nach verschiedenen Reaktionszeiten mit der Standard-RNA (104, 105 und 106 Kopien/5 μl) in Gegenwart der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA mit einem modifizierten 3'-Ende (mit ddTTP am 3'-Ende) in Beispiel 14.
  • 18 zeigt den Verlauf der Fluoreszenzverstärkung bei einer Reaktionszeit von 3 Stunden in Abhängigkeit der Anfangskonzentration der Standard-RNA, auf Basis der in 17 gezeigten, in Beispiel 14 erhaltenen Amplifikationsprofile.
  • 19 zeigt die Struktur der in den Beispielen verwendeten vierten einzelsträngigen Oligo-DNA, YO-271. Die DNA-Einheit auf der linken und der fluoreszierende, interkalierende Farbstoff, Oxazolgelb, auf der rechten Seite sind durch den in dieser Figur gezeigten Linker verbunden, so daß sich der fluoreszierende Farbstoff in einen Doppelstrang bei der Bildung des Doppelstrangs durch die DNA-Einheit einlagern kann.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun genau beschrieben.
  • Gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer einzelsträngigen RNA, die eine spezifische Nukleinsäuresequenz enthält, in einer Probe (eine Ziel-RNA) bereit. Hierbei bedeutet Bestimmung sowohl qualitative Bestimmung der RNA in einer Probe als auch quantitative Bestimmung der RNA in einer Probe.
  • Die spezifische Nukleinsäuresequenz bedeutet eine Basensequenz innerhalb der einzelsträngigen RNA, die am 5'-Ende mit der Sequenz (3) in der weiter unten genannten einzelsträngigen Oligo-DNA beginnt und am 3'-Ende mit einer zu der weiter unten genannten zweiten einzelsträngigen Oligo-DNA komplementären Sequenz endet. Die spezifische Nukleinsäuresequenz kann willkürlich definiert sein, muß aber eine Sequenz enthalten, die spezifisch genug ist, um die Ziel-RNA von anderen Nukleinsäuren zu unterscheiden. Besonders wenn eine durch ihre 5'- und 3'-Enden ausreichend von anderen Nukleinsäuren als der Ziel-Nukleinsäure unterscheidbare Sequenz als die spezifische Nukleinsäuresequenz ausgewählt wird, verbessert sich die Spezifität der Synthese einer einzelsträngigen RNA, die die spezifische Nukleinsäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt.
  • Weiterhin verbessert sich die Spezifität der Bestimmung gemäß der vorliegenden Erfindung weiter, wenn die spezifische Nukleinsäuresequenz darüberhinaus eine interne Sequenz enthält, die die Ziel-Nukleinsäure ausreichend von anderen Nukleinsäuren unterscheidet.
  • In der vorliegenden Erfindung wird schließlich eine große Menge einer RNA mit der spezifischen Nukleinsäuresequenz synthetisiert, wenn die Ziel-RNA in der Probe vorhanden ist.
  • Das Reagenz (A) ist eine erste Oligonukleinsäure, die komplementär zu einer Sequenz neben dem 5'-Ende der spezifischen Nukleinsäuresequenz innerhalb der Ziel-RNA ist. Das Reagenz ermöglicht es, die Ziel-RNA am 5'-Ende der spezifischen Nukleinsäuresequenz zu schneiden, so daß bei Bindung einer zweiten einzelsträngigen Oligo-DNA an die Ziel-RNA eine RNA-abhängige DNA-Polymerase cDNA an dem entstandenen RNA-Fragment mit der spezifischen Nukleinsäuresequenz am 5'-Ende als Matrize in Gegenwart der weiter unten genannten Reagenzien (B) bis (D) synthetisiert, um eine cDNA mit einer zu der spezifischen Nukleinsäuresequenz komplementären Sequenz am 3'-Ende zu liefern. Wenn, zum Beispiel, eine DNA als die erste Oligonukleinsäure zusammen mit RNase H zugegeben wird, wird die Ziel-RNA dort geschnitten, wo die erste Oligonukleinsäure an die Ziel-RNA bindet, um so die erste Base der spezifischen Oligonukleinsäure am 5'-Ende zu erhalten. Alternativ kann ein DNAzym oder Ribozym, das eine einzelsträngige Nukleinsäure an einer spezifischen Stelle katalytisch spaltet (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 4262–4266), als erste Oligonukleinsäure verwendet werden.
  • RNase H spaltet eine RNA in einem RNA-DNA-Heteroduplex unspezifisch. Daher wird, wenn RNase H verwendet wird, die RNase H im Wesentlichen, zum Beispiel durch Erhitzen oder durch Zugabe eines bekannten RNase H-Inhibitors vor der Zugabe von Reagenz (B) deaktiviert. Im Fall der Erhitzung ist es ausreichend, die Temperatur auf 60–70°C zu erhöhen und diese Temperatur für eine ziemlich kurze Zeit zu halten. Wenn RNase H verwendet wird, geht dementsprechend, nachdem das Reagenz (A) und RNase H nacheinander oder gleichzeitig zugegeben werden, der Zugabe der Reagenzien (B) bis (I) eine entsprechende Inkubationszeit voraus. Ein DNAzym oder ein Ribozym als Reagenz (A) kann hingegen alleine oder zur selben Zeit wie andere Reagenzien ohne die Notwendigkeit einer Erhitzung oder der Zugabe eines Inhibitors zugegeben werden.
  • Das Reagenz (B) ist eine zweite einzelsträngige Oligo-DNA, die komplementär zu einer Sequenz am 3'-Ende innerhalb der spezifischen Nukleinsäuresequenz ist. Das Reagenz (B) hybridisiert mit der Ziel-RNA, so daß eine RNA-abhängige DNA-Polymerase cDNA an der RNA als Matrize in Gegenwart der weiter unten genannten Reagenzien (C) bis (D) synthetisiert, um eine cDNA mit einer Sequenz am 5'-Ende zu liefern, die komplementär zu einer Sequenz am 3'-Ende innerhalb der spezifischen Nukleinsäuresequenz ist. Die zweite Oligonukleinsäure wird in einer Menge von 0.02 bis 1 μM in der Gegenwart der Ziel-Nukleinsäure zugegeben.
  • Das Reagenz (C) ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, und das Reagenz (D) ist das Substrat von Reagenz (C), Desoxyribonukleosidtriphosphate. In der Gegenwart der Reagenzien (B) bis (D) wird eine cDNA mit einer zum 3'-Ende der spezifischen Nukleinsäuresequenz innerhalb der Ziel-RNA komplementären Sequenz am 5'-Ende synthetisiert.
  • Der cDNA in Form eines DNA-RNA-Doppelstrangs mit der Matrizen-RNA wird Gelegenheit gegeben, mit einer dritten einzelsträngigen Oligo-DNA als dem weiter unten genannten Reagenz (E) zu hybridisieren. Hierzu wird zum Beispiel 5 bis 20% Dimethylsulfoxid (hier im Folgenden DMSO genannt) zugegeben, um die komplementäre Bindung zwischen der DNA und RNA weniger stabil zu machen. DMSO beeinträchtigt die Wirkung der anderen Reagenzien nicht und wirkt nur ausreichend, wenn es so zugegeben wird, daß es gemeinsam mit dem DNA-RNA-Doppelstrang mindestens vor der DNA-Synthese durch die Reagenzien (D) bis (F) vorliegt. Da einige RNA-abhängige DNA-Polymerasen, repräsentiert durch die aviäre Myoblastomvirus-Polymerase (hier im Folgenden AMV Reverse Transkriptase), RNA in einem DNA-RNA-Doppelstrang, wenn auch mit geringen Aktivitäten, schneiden, kann ein solches Enzym mit RNA-abbauender Aktivität in einer Alternative als das oben genannte Reagenz (C) verwendet werden. Es ist besonders bevorzugt, die Wirkung von DMSO und die Wirkung einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase, wie etwa CMV Reverse Transkriptase, zu verwenden, obwohl es ausreichend ist, die Wirkung beider alleine zu verwenden. Durch die Wirkung von DMSO und/oder einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase wird die RNA in dem RNA-DNA-Doppelstrang abgebaut und/oder getrennt, wodurch eine einzelsträngige DNA zurückbleibt.
  • Das Reagenz (E) ist eine dritte einzelsträngige Oligo-DNA mit (1) einer Promotorsequenz für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, (2) einer Enhancersequenz für den Promotor und (3) einer Sequenz am 5'-Ende innerhalb der spezifischen Nukleinsäuresequenz, in dieser Reihenfolge vom 5'-Ende. Die dritte Oligo-DNA wird in einer Menge von 0.02 bis 1 μM in Gegenwart der Ziel-Nukleinsäure zugegeben. Die Region (3) in der dritten Oligo-DNA bindet an das 3'-Ende der in Gegenwart der Reagenzien (B) bis (D) synthetisierten DNA. In Gegenwart der Reagenzien (D) und (F) verlängert daher eine DNA-abhängige DNA-Polymerase komplementär das 3'-Ende der dritten DNA unter Verwendung der DNA als Matrize und das 3'-Ende der DNA unter Verwendung der dritten Oligo-DNA als Matrize, um eine vollständig doppelsträngige DNA zu liefern.
  • Das Reagenz (F) ist eine DNA-abhängige DNA-Polymerase. In der vorliegenden Erfindung wird es besonders bevorzugt, eine geringere Zahl von Reagenzien durch Verwendung eines einzelnen Enzyms einzusetzen, das sowohl als RNA-abhängige DNA-Polymerase als Reagenz (C) wie auch als DNA-abhängige DNA-Polymerase wirkt. Zum Beispiel ist AMV Reverse Transkriptase, die die Aktivität der beiden Polymerasen besitzt, besonders für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung vorzuziehen, da sie auch, wie oben beschrieben, die RNA-Kette in einem DNA-RNA-Doppelstrang abbaut und auch im Handel erhältlich ist.
  • Das Reagenz (G) ist eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, und das Reagenz (H) ist das Substrat von Reagenz (G), Ribonukleosidtriphosphate. Die in Gegenwart der Reagenzien (D) bis (F) synthetisierte doppelsträngige DNA hat eine Promotorregion für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase an einem Ende. In Gegenwart der Reagenzien (G) und (H) folgt daher auf die Synthese der DNA unmittelbar die Synthese einer einzelsträngigen RNA mit der spezifischen Nukleinsäuresequenz. Spezifische Beispiele der DNA-abhängigen RNA-Polymerase als Reagenz (G) schließen T7 RNA-Polymerase, T3 RNA-Polymerase und SP6 RNA-Polymerase ein.
  • Die in Gegenwart der Reagenzien (G) bis (H) synthetisierte einzelsträngige RNA besitzt die spezifische Nukleinsäuresequenz. Daher veranlaßt das gleichzeitige Vorliegen der synthetisierten einzelsträngigen RNA mit den Reagenzien (B) bis (F) den erneuten Beginn der oben genannten Reaktionsfolge. Es ist daher in der vorliegenden Erfindung möglich, die oben genannte doppelsträngige DNA mit einer Promotorregion an einem Ende aus einer sehr geringen Menge der Ziel-RNA in der Probe nur durch Zugabe der entsprechenden Reagenzien zu der Probe zu synthetisieren, und zwar ohne kaum automatisierbare Abläufe, wie etwa Erhitzung, und die doppelsträngige DNA bewirkt die Synthese einer einzelsträngigen RNA mit der spezifischen Nukleinsäuresequenz. Die synthetisierte einzelsträngige RNA nimmt an der nächsten Runde der Synthese der doppelsträngigen DNA teil. Demgemäß vermehrt sich die einzelsträngige RNA mit der spezifischen Nukleinsäuresequenz im Lauf der Zeit drastisch.
  • Die Syntheserate der einzelsträngigen RNA mit der spezifischen Nukleinsäuresequenz und die Endmenge der synthetisierten einzelsträngigen RNA hängen von der Menge der Ziel-RNA in der Probe ab. Dementsprechend ermöglicht die Verwendung des Reagenz (I) in der vorliegenden Erfindung die Bestimmung der Ziel-RNA in der Probe.
  • Das Reagenz (I) ist eine vierte einzelsträngige, markierte, die zu der spezifischen Nukleinsäuresequenz komplementäre Sequenz enthaltende Oligo-DNA, die ein meßbares Fluoreszenzsignal bei Hybridisierung mit einer die spezifische Nukleinsäuresequenz enthaltenden Nukleinsäure liefert. Die vierte Oligo-DNA kann, zum Beispiel, eine mit einem fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoff verbundene DNA sein. Die DNA-Einheit ist 6 bis 100 Nukleotide lang, vorzugsweise 10 bis 30 Nucleotide lang, um die Spezifität für die spezifische Nukleinsäuresequenz in der Bestimmung zu gewährleisten. Natürlich muß die DNA-Einheit zu einer Sequenz innerhalb der spezifischen Nukleinsäuresequenz komplementär sein, die die Ziel-Nukleinsäure ausreichend von anderen Nukleinsäuren unterscheidet.
  • Die DNA-Einheit hat bevorzugt eine Sequenz am 3'-Ende, die nicht komplementär zu der spezifischen Nukleinsäuresequenz ist oder ein chemisch modifiziertes 3'-Ende hat, so daß das 3'-Ende nicht durch die Aktivität der bereits vorhandenen RNA-abhängigen DNA-Polymerase bei Hybridisierung mit der synthetisierten einzelsträngigen RNA mit der spezifischen Nukleinsäuresequenz verlängert wird.
  • Wenn die DNA-Einheit mit einer anderen Nukleinsäure hybridisiert wird, lagert sich der fluoreszierende, interkalierende Farbstoff in den entstandenen Doppelstrang ein und ändert seine Fluoreszenzcharakteristik. Hierzu kann der fluoreszierende, interkalierende Farbstoff mit der DNA-Einheit durch einen Linker entsprechender Länge verbunden sein. Jeder Linker, der den fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoff nicht an der Einlagerung in den Doppelstrang hindert, kann ohne Beschränkung verwendet werden. Ein bifiunktioneller Kohlenwasserstoff-Linker mit funktionellen Gruppen an beiden Enden ist wegen seiner unkomplizierten Verwendung in der Modifikation von Oligonukleotiden besonders bevorzugt. In einer Alternative kann ein im Handel erhältlicher Kit (C6-Thiolmodifier, Handelsname, Clontech) verwendet werden.
  • Der fluoreszierende, interkalierende Farbstoff ist nicht im Besonderen eingeschränkt, solange er bei Einlagerung in einen Doppelstrang seine Fluoreszenzcharakteristik ändert, zum Beispiel Fluoreszenz mit einem Maximum anderer Wellenlänge abgibt. Es sind jedoch solche mit Hinblick auf die Erleichterung der Fluoreszenzmessung besonders bevorzugt, die die Fluoreszenz durch die Einlagerung verstärken. Genauer sind, zum Beispiel, Thiazol-Orange, Oxazol-Gelb und deren Derivate besonders bevorzugte fluoreszierende, interkalierende Farbstoffe, da sie eine deutliche Änderung in der Fluoreszenz zeigen.
  • Der fluoreszierende, interkalierende Farbstoff kann mit beliebigen Stellen der DNA-Einheit verbunden sein, einschließlich dem 5'-Ende, dem 3'-Ende und der Mitte, so lange die Verbindung weder die Einlagerung des fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoffs in einen Doppelstrang behindert, noch die DNA-Einheit an der Hybridisierung mit RNA hindert.
  • Das Reagenz (I) gibt ein meßbares Fluoreszenzsignal in Gegenwart der in Gegenwart der doppelsträngigen DNA, der Reagenzien (G) und (H) synthetisierten, einzelsträngigen RNA mit der spezifischen Nukleinsäuresequenz ab. Überraschenderweise wurde gefunden, daß die synthetisierte einzelsträngige RNA als Matrize für DNA-Synthese in Gegenwart der Reagenzien (B) bis (D) dient, sogar wenn das Hybrid aus der RNA und der vierten Oligo-DNA ein Fluoreszenzsignal abgibt. Mit anderen Worten finden in der vorliegenden Erfindung eine Reihe von Abläufen, Synthese von DNA an RNA, Synthese doppelsträngiger DNA und Synthese von RNA an doppelsträngiger DNA in Gegenwart der entsprechenden Reagenzien, in Gegenwart der vierten Oligo-DNA statt.
  • Daher kann die Ziel-Nukleinsäure in einer Probe durch Messung des Fluoreszenzsignals von Reagenz (I) bestimmt werden, das nach Zugabe der Reagenzien (A) bis (H) mindestens einmal zugegeben wird. Das Reagenz (I) kann gleichzeitig mit den anderen Reagenzien zugegeben werden, da die Anwesenheit der vierten Oligonukleinsäure keinerlei Hindernis für die Synthese einer einzelsträngigen RNA mir der spezifischen Nukleinsäuresequenz darstellt.
  • Wenn das Fluoreszenzsignal nur einmal gemessen wird, folgt auf die Zugabe der Reagenzien (A) bis (H) eine ausreichende Inkubationszeit zur Synthese der einzelsträngigen RNA mir der spezifischen Nukleinsäuresequenz. Das Reagenz (I) muß vor der Messung zugegeben werden, zum Beispiel gleichzeitig mit den anderen Reagenzien. Diese Art der Messung wird als Endpunktbestimmung bezeichnet, und die Ziel-Nukleinsäure in einer Probe kann, zum Beispiel, durch Vergleich mit Ergebnissen bestimmt werden, die durch Anwendung des Verfahrens mit Lösungen erhalten wurden, die bekannte Mengen der Ziel-Nukleinsäure enthalten. In der vorliegenden Erfindung folgt bevorzugt der Zugabe der Reagenzien (A) bis (H) eine zeitliche Messung der Fluoreszenzsignale unmittelbar oder nach einer bestimmten Zeitspanne. Obwohl die vierte DNA während der Synthese der einzelsträngigen RNA wiederholt an die synthetisierte RNA bindet und sich von ihr löst, ist es möglich, die Vermehrung der einzelsträngigen RNA zu verfolgen, da die gemessenen Fluoreszenzsignale von der gebundenen vierten DNA mit den RNA-Mengen zum Zeitpunkt der Messungen korrelieren. Die Messung kann kontinuierlich oder diskontinuierlich in konstanten Intervallen erfolgen. Der zeitliche Verlauf des Fluoreszenzsignals kann daher durch dauernde Messung verfolgt werden, und die Menge (Ausgangsmenge) der Ziel-RNA in einer Probe kann, zum Beispiel, durch die Zeit bestimmt werden, die erforderlich ist, um ein stabiles Fluoreszenzsignal nach Zugabe der Reagenzien (A) bis (H) zu erhalten, oder durch die Zeitspanne zwischen der Zugabe der Reagenzien (A) bis (H) und einem deutlichen Anstieg des Fluoreszenzsignals.
  • Wie später in den Beispielen gezeigt werden wird, sind in der vorliegenden Erfindung alle der oben genannten Reagenzien (A) bis (I) bevorzugt frei von Chloriden. Weiterhin wird bevorzugt ein Acetat, wie etwa Magnesiumacetat oder Kaliumacetat, zusätzlich zu den Reagenzien (A) bis (H) verwendet. Ein Acetat wird spätestens zum Zeitpunkt der Synthese der einzelsträngigen DNA in Gegenwart der Reagenzien (B) bis (D), bevorzugt in einer Konzentration von 5 bis 20 mM für Magnesiumacetat, von 50 bis 200 mM für Kaliumacetat, zugegeben. In der vorliegenden Erfindung wird weiterhin die Verwendung von Sorbit bevorzugt. Sorbit wird spätestens zum Zeitpunkt der Synthese der einzelsträngigen DNA in Gegenwart der Reagenzien (B) bis (D) zugegeben. Weiterhin wird auch die Verwendung eines Proteins, wie etwa Rinderserumalbumin, und eines Reduktionsmittels, wie etwa Dithiothreit, die Verwendung eines RNase-Inhibitors mit Hinblick auf die Hemmung des Abbaus der synthetisierten einzelsträngigen RNA durch RNase bevorzugt. Darüberhinaus wird auch eine Puffersubstanz bevorzugt verwendet, um die Reaktionslösung innerhalb eines für die entsprechend verwendeten Enzyme aktiven pH-Bereichs zu halten. Als Puffersubstanz wird Tris-Acetat besonders bevorzugt. Diese Reagenzien werden spätestens zum Zeitpunkt der Synthese der einzelsträngigen DNA in Gegenwart der Reagenzien (B) bis (D) zugegeben. Die Verwendung dieser optionalen Reagenzien führt zu einer Erhöhung der Menge der als Produkt synthetisierten einzelsträngigen RNA.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Bestimmung einer Ziel-RNA in einer Probe bei konstanter Temperatur ohne Erhitzung. Die konstante Temperatur kann, ohne jede Beschränkung, jede Temperatur sein, bei der die als Reagenzien (A), (B), (E) und (I) in der vorliegenden Erfindung verwendeten entsprechenden Oligonukleinsäuren hybridisieren können, und die Enzyme als Reagenzien (C), (F) und (G) aktiv sind. Genauer gefaßt, wird die Temperatur aus einem Bereich von 35 bis 60°C gewählt. Die Temperatur muß nicht genau konstant sein, und es ist ausreichend, die Temperatur nahezu konstant zu halten.
  • Wie aus der obigen Erklärung ersichtlich, können die Reagenzien im Bestimmungsverfahren gemäß Anspruch 1 nacheinander, in Kombination von mindestens zweien oder alle gleichzeitig zugegeben werden. Wenn alle Reagenzien gleichzeitig zu der Probe zugegeben werden, kann insbesondere die Bestimmung der Ziel-RNA in einem geschlossenen Gefäß realisiert werden, um das Problem der Verschleppung der synthetisierten einzelsträngigen RNA zu lösen, die erfolgen kann, wenn das Gefäß geöffnet oder geschlossen wird.
  • Die vorliegende Erfindung gemäß oben beschriebenem Anspruch 1 kann, zum Beispiel, mit einem Reagenziensatz, der mindestens ein erstes Reagenz beinhaltet, das eine erste einzelsträngige Oligonukleinsäure enthält, ein zweites Reagenz, das Tris-Acetat, Magnesiumacetat, Kaliumacetat, Sorbit und Dimethylsulfoxid enthält, ein drittes Reagenz, das Dithiothreit, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate, Rinderserumalbumin, eine zweite einzelsträngige Oligo-DNA und eine dritte einzelsträngige Oligo-DNA enthält, ein viertes Reagenz, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige RNA-Polymere und einen RNase-Inhibitor enthält und ein fünftes Reagenz, das eine vierte einzelsträngige Oligo-DNA enthält, und durch Zugabe dieser Reagenzien in numerischer Reihenfolge zu einer Probe durchgeführt werden. Wenn die vorliegende Erfindung gemäß Anspruch 21 die erste einzelsträngige Oligonukleinsäure nicht erfordert, kann das erste Reagenz weggelassen werden.
  • Die vorliegende Erfindung gemäß oben beschriebenem Anspruch 1 kann, zum Beispiel, auch mit einem Reagenziensatz, der mindestens ein erstes Reagenz beinhaltet, das eine erste einzelsträngige Oligonukleinsäure enthält, ein zweites Reagenz, das Tris-Acetat, Magnesiumacetat, Kaliumacetat, Sorbit und Dimethylsulfoxid enthält, ein drittes Reagenz, das Dithiothreit, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate, Rinderserumalbumin, eine zweite einzelsträngige Oligo-DNA, eine dritte einzelsträngige Oligo-DNA und eine vierte einzelsträngige Oligo-DNA enthält, und ein viertes Reagenz, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymere, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und einen RNase-Inhibitor enthält, und durch Zugabe dieser Reagenzien in numerischer Reihenfolge zu einer Probe durchgeführt werden. Wenn die vorliegende Erfindung gemäß Anspruch 21 die erste einzelsträngige Oligonukleinsäure nicht erfordert, kann das erste Reagenz weggelassen werden.
  • Die vorliegende Erfindung gemäß oben beschriebenem Anspruch 1 kann, zum Beispiel, auch mit einem Reagenziensatz, der mindestens ein erstes Reagenz beinhaltet, das eine erste einzelsträngige Oligonukleinsäure enthält, ein zweites Reagenz, das Tris-Acetat, Magnesiumacetat, Kaliumacetat, Sorbit und Dimethylsulfoxid enthält, ein drittes Reagenz, das Dithiothreit, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate, Rinderserumalbumin, eine zweite einzelsträngige Oligo-DNA und eine dritte einzelsträngige Oligo-DNA enthält, ein viertes Reagenz, das eine vierte einzelsträngige Oligo-DNA, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige RNA-Polymere und einen RNase-Inhibitor enthält, und durch Zugabe dieser Reagenzien in numerischer Reihenfolge zu einer Probe durchgeführt werden. Wenn die vorliegende Erfindung gemäß Anspruch 21 die erste einzelsträngige Oligonukleinsäure nicht erfordert, kann das erste Reagenz weggelassen werden.
  • Die vorliegende Erfindung gemäß oben beschriebenem Anspruch 1 kann, zum Beispiel, auch mit einem Reagenz, das mindestens eine erste einzelsträngige Oligonukleinsäure, eine zweite einzelsträngige Oligo-DNA, eine dritte einzelsträngige Oligo-DNA, eine vierte einzelsträngige Oligo-DNA, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate, Tris-Acetat, Magnesiumacetat, Kaliumacetat, Sorbit, Dimethyl sulfoxid, Dithiothreit, Rinderserumalbumin und einen RNase-Inhibitor beinhaltet, und durch Zugabe des Reagenz zu einer Probe durchgeführt werden.
  • Die Konzentration jeder Komponente der oben genannten Reagenziensätze oder des Reagenz sollte so eingestellt werden, daß jede Komponente in einer erforderlichen Menge in einer Probe vorhanden ist, wenn sie zu der Probe zugegeben wird. Wie zuvor beschrieben, kann ein einzelnes Enzym, daß die Aktivität sowohl einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase als auch einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase besitzt als RNA-abhängige DNA-Polymerase und DNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun im Folgenden durch Bezugnahme auf Beispiele genauer beschrieben.
  • BEISPIEL 1 Herstellung doppelsträngiger DNA
  • Eine doppelsträngige, aus einem DNA-Einzelstrang mit der SP6-Promotorsequenz am 5'-Ende und einem komplementären DNA-Einzelstrang bestehende DNA wurde hergestellt.
    70 μl einer Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung wurde in ein PCR-Gefäß pipettiert.
    10.7 mM Tris-HCl Puffer (pH 8.3)
    53.6 mM Kaliumchlorid
    2.36 mM Magnesiumchlorid
    0.268 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    0.257 μM dritte einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
    0.257 μM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
    0.032 U/μl im Handel erhältlicher DNA-abhängiger DNA-Polymerase (AmpliTaq, Handelsname, Perkin Elmer)
  • Dann wurde 5 μl einer 1865 bp doppelsträngigen DNA (10–6 Kopien), die die Basen 1 bis 1863 in humaner Hepatitis C-Virus (HCV) cDNA enthält, als Standard-DNA zugegeben. Für die Basen-Nummerierung sollte die Literatur (Kato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 9524 – 9528) verglichen werden.
  • Dann wurde die Reaktionslösung erhitzt und für 9 Minuten bei 95°C inkubiert, und ein Inkubationszyklus mit den folgenden Schritten (1) bis (3) wurde 40 mal wiederholt.
    • (1) Inkubation bei 95°C für 30 Sekunden,
    • (2) Inkubation bei 65°C für 30 Sekunden und
    • (3) Inkubation bei 72°C für 1 Minute.
  • Nach 40 Inkubationszyklen wurde die Reaktionslösung entnommen und einer Elektrophorese mit einem 2%-igen Agarosegel mit anschließender Ethidiumbromid-Färbung unterzogen.
  • 1 zeigt die Ergebnisse auf dem Ethidiumbromid-gefärbten Gel. 1 zeigt deutlich einzelne DNA-Banden von etwa 320 bp, was die Herstellung einer DNA mit der folgenden Basensequenz, die die SP6-Promotorsequenz (unterstrichen) am 5'-Ende enthält, und eines komplementären Strangs durch das oben genannte Verfahren anzeigt.
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA A- (Basen 11 bis 300 in der HCV-cDNA) 3'
  • BEISPIEL 2 Einfluß der Magnesiumacetat-Konzentration
  • Die für die vorliegende Erfindung optimale Magnesiumacetat-Konzentration wurde untersucht. Reaktionslösungen der folgenden Zusammensetzungen wurden hergestellt, und 14 μl der Reaktionslösungen wurde in PCR-Gefäße pipettiert.
    85.7 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    16.1, 32.1 oder 48.2 mM Magnesiumacetat
    214.3 mM Kaliumacetat
    21.4% DMSO
    32.1% Sorbit
    2.1 mM jeweils ATP, GTP, CTP und UTP
    2.1 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    214 μg/ml BSA
    0.12 mM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
  • Dann wurden 10 μl einer Standard-DNA (104 Kopien, 105 Kopien, 106 Kopien und 107 Kopien/10 μl) oder 10 μl DNA-freier TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (ph 8.0) mit 0.1 mM EDTA) als Negativkontrolle zugegeben. Die Standard-DNA war eine doppelsträngige DNA mit einem DNA-Strang folgender Sequenz und einem komplementären DNA-Strang.
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA A- (Basen 11 bis 300 in der HCV-cDNA) 3'
  • Die Reaktionslösungen wurden mit 100 μl Mineralöl überschichtet und bei 45°C für 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurde 5 μl einer mit den folgenden Enzymen zusammengestellten Lösung zugegeben, und die Reaktion wurde bei 45°C für 1 Stunde durchgeführt.
    30 U/μl im Handel erhältliche SP6 RNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    12 U/μl im Handel erhältlicher RNase-Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
  • Dann wurde 0.6 μl einer dritten einzelsträngigen Oligo-DNA (2.75 μM) zugegeben.
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
  • Anschließend wurde 0.4 μl AMV Reverse Transkriptase (37 U/μl, Takara Shuzo Co., Ltd.) als RNA-abhängige DNA-Polymerase und als DNA-abhängige DNA-Polymerase zugegeben. Nach 2 Stunden Inkubation bei 45°C wurde 5 μl der Reaktionslösungen einer Elektrophorese mit einem 2%-igen Agarosegel unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 10000-fach verdünntem SYBR Green II® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt.
  • 2 zeigt das Muster auf dem angefärbten Gel. Eine maximale Produktmenge wurde in Gegenwart von Magnesiumacetat in einer Endkonzentration von 15 mM erhalten.
  • BEISPIEL 3 Einfluß von Kaliumacetat
  • Die für die vorliegende Erfindung optimale Kaliumacetat-Konzentration wurde untersucht. Reaktionslösungen der folgenden Zusammensetzungen wurden hergestellt, und 14 μl der Reaktionslösungen wurde in PCR-Gefäße pipettiert.
    85.7 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    28.9 mM Magnesiumacetat
    214.3, 235.7, 257.1 oder 278.6 mM Kaliumacetat
    21.4% DMSO
    32.1% Sorbit
    2.1 mM jeweils ATP, GTP, CTP und UTP
    2.1 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    214 μg/ml BSA
    0.12 μM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
  • Dann wurden 10 μl einer Standard-DNA (103 Kopien, 104 Kopien, 105 Kopien und 106 Kopien/10 μl) oder 10 μl DNA-freier TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (ph 8.0) mit 0.1 mM EDTA) als Negativkontrolle zugegeben. Die Standard-DNA war eine doppelsträngige DNA mit einem DNA-Strang folgender Sequenz und einem komplementären DNA-Strang.
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA A- (Basen 11 bis 300 in der HCV-cDNA) 3'
  • Die Reaktionslösungen wurden mit 100 μl Mineralöl überschichtet und bei 45°C für 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurde 5 μl einer mit den folgenden Enzymen zusammengestellten Lösung zugegeben, und die Reaktion wurde bei 45°C für 1 Stunde durchgeführt.
    30 U/μl im Handel erhältliche SP6 RNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    12 U/μl im Handel erhältlicher RNase-Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
  • Dann wurde 0.6 μl einer dritten einzelsträngigen Oligo-DNA (2.75 μM) zugegeben.
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
  • Anschließend wurde 0.4 μl AMV Reverse Transkriptase (37 U/μl, Takara Shuzo Co., Ltd.) als RNA-abhängige DNA-Polymerase und als DNA-abhängige DNA-Polymerase zuge geben. Nach 2 Stunden Inkubation bei 45°C wurde 5 μl der Reaktionslösungen einer Elektrophorese mit einem 2%-igen Agarosegel unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 10000-fach verdünntem SYBR Green II® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt.
  • 3 zeigt das Muster auf dem angefärbten Gel. Sogar wenn die anfängliche Kopienzahl der Ziel-Nukleinsäure 103 betrug, wurde das Produkt in Gegenwart von Kaliumacetat in einer Endkonzentration von 120 mM erhalten. Eine maximale Reaktionseffizienz wurde somit in Gegenwart einer von Kaliumacetat in einer Endkonzentration von 110 bis 130 mM erhalten.
  • BEISPIEL 4 Einfluß von Sorbit
  • Die für die vorliegende Erfindung optimale Sorbit-Konzentration wurde untersucht. 20 μl von den Reaktionslösungen der folgenden Zusammensetzungen wurden in PCR-Gefäße pipettiert.
    60 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    20.3 mM Magnesiumacetat
    187.5 mM Kaliumacetat
    15% DMSO
    22.5, 16.8, 13.5 oder 11.3% Sorbit
    (Endkonzentration: 15, 11.3, 9 oder 7.5%)
    1.5 mM jeweils ATP, GTP, CTP und UTP
    1.5 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    150 μg/ml BSA
    0.3 μM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
    0.3 μM dritte einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
  • Dann wurden 5 μl einer Standard-RNA (103 Kopien, 104 Kopien, 105 Kopien und 106 Kopien/5 μl) oder 5 μl RNA-freier TE-Puffer als Negativkontrolle zugegeben. Die Standard-RNA hatte die folgende Sequenz.
    (Sequenz) 5' GAA UAC AA- (Basen 11 bis 300 in der HCV-RNA) 3'
  • Die Reaktionslösungen wurden mit 100 μl Mineralöl überschichtet und bei 65°C für 10 Minuten inkubiert, und dann konnten die Gefäße für 5 Minuten in eiskaltem Wasser ruhen.
  • Dann wurde 5 μl einer mit den folgenden Enzymen zusammengestellten Lösung zugegeben, und die Reaktion wurde bei 45°C für 4 Stunden durchgeführt.
    36 U/μl im Handel erhältliche SP6 RNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    12 U/μl im Handel erhältlicher RNase-Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    9 U/μl AMV Reverse Transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.) als RNA-abhängige DNA-Polymerase und als DNA-abhängige DNA-Polymere.
  • 5 μl der Reaktionslösungen wurden einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 10000-fach verdünntem SYBR Green II® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt.
  • 4 zeigt das Muster auf dem angefärbten Gel. Die deutlichen 300 bp-Banden wurden in Gegenwart von Sorbit in einer Endkonzentration von 7.5 bis 11.3% erhalten, sogar wenn die Ausgangsmenge der Ziel-Nukleinsäure 103 Kopien betrug. Die maximale Reaktionseffizienz wurde somit erhalten, wenn die Sorbit-Endkonzentration 7.5 bis 11.3% betrug.
  • BEISPIEL 5 Amplifizierung doppelsträngiger DNA als Ziel-Nukleinsäure
  • Die Menge des Amplifikationsprodukts aus verschiedenen Konzentrationen einer doppelsträngigen DNA als Ziel-Nukleinsäure wurde untersucht. Eine Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt, und 19 μl der Reaktionslösung wurde in PCR-Gefäße pipettiert.
    63.2 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    21.3 mM Magnesiumacetat
    197.4 mM Kaliumacetat
    22.5% DMSO
    22.5% Sorbit
    1.6 mM jeweils ATP, GTP, CTP und UTP
    1.6 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    157.9 μg/ml BSA
    0.055 μM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
  • Dann wurden 5 μl einer Standard-DNA (103 Kopien, 104 Kopien, 105 Kopien oder 106 Kopien/5 μl) oder 5 μl RNA-freier TE-Puffer als Negativkontrolle zugegeben. Die Standard-DNA war eine doppelsträngige DNA mit einem DNA-Strang folgender Sequenz und einem komplementären DNA-Strang.
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA A- (Basen 11 bis 300 in der HCV-cDNA) 3'
  • Die Reaktionslösungen wurden mit 100 μl Mineralöl überschichtet und bei 45°C für 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurde 5 μl einer mit den folgenden Enzymen zusammengestellten Lösung zugegeben, und die Reaktion wurde bei 45°C für 1 Stunde durchgeführt.
    30 U/μl im Handel erhältliche SP6 RNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    12 U/μl im Handel erhältlicher RNase-Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
  • Dann wurde 2.75 μl einer dritten einzelsträngigen Oligo-DNA (2.75 μM) zugegeben.
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
  • Anschließend wurde 0.4 μl AMV Reverse Transkriptase (37 U/μl, Takara Shuzo Co., Ltd.) als RNA-abhängige DNA-Polymerase und als DNA-abhängige DNA-Polymerase zugegeben. Nach 2 Stunden Inkubation bei 45°C wurde 5 μl der Reaktionslösungen einer Elektrophorese mit einem 2%-igen Agarosegel unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 10000-fach verdünntem SYBR Green II® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt.
  • 5 zeigt das Muster auf dem angefärbten Gel. Immer wenn die Ausgangsmenge der Ziel-Nukleinsäure 103 Kopien/5 μl oder mehr betrug, wurden Banden von etwa 300 bp nachgewiesen, und die Bandenintensität war von der Ausgangsmenge der Nukleinsäure abhängig, was auf die Möglichkeit einer Bestimmung einer doppelsträngigen DNA als Ziel-Nukleinsäure mit hoher Sensitivität hindeutet.
  • BEISPIEL 6 Spezifische Spaltung von RNA mit der ersten einzelsträngigen Oligonukleinsäure und RNase H
  • RNA wurde am 5'-Ende einer spezifischen Nukleinsäuresequenz mit einer ersten einzelsträngigen Oligonukleinsäure und RNase H gespalten.
  • Eine Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt, und 7.2 μl der Reaktionslösung wurde in PCR-Gefäße pipettiert.
    40 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8.0)
    4 mM Magnesiumchlorid
    1 mM Dithiothreit
    1 μM erste einzelsträngige Oligo-DNA (11mer)
    (Sequenz) 5' GTC GCC CCC AA 3'
  • Dann wurde 1.8 μl RNA (133mer, 5.7 μM) zugegeben, auf eine 10-minütige Erhitzung auf 65°C folgte schnelles Abkühlen in eiskaltem Wasser. Die 133mer RNA hatte die folgende Sequenz.
    (Sequenz) 5' (Vektorsequenz) GGG AAA GCU UGC AUG CCU GCA GGU CGA CUC UAG AGG AUC CCC GGG UAC CGA GCU CGA AUU CC (Sequenz von HCV) U UGG GGG CGA CAC UCC ACC AUA GAU CAC UCC CCU GUG AGG AAC UAC UGU CUU CAC GCA GAA AGC GUC UAG C 3'
    (Die der 11mer DNA komplementäre Sequenz ist unterstrichen.)
  • Nach 5-minütiger Inkubation bei 37°C wurde 1 μl RNase H (0.01, 0.001, 0.0001 oder 0.00001 U/μl, Takara Shuzo Co., Ltd.) zugegeben, und die Reaktion wurde bei 37°C für 1 Stunde durchgeführt. Zu den Reaktionslösungen wurden 2 μl Gelauftragspuffer (0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) mit 60 mM EDTA, 0.25% Bromphenolblau und 40% Sucrose) und dann 12 μl Formamid zugegeben. Nach 5-minütiger Inkubation bei 65°C wurde 12 μl der Reaktionslösungen einer Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel mit 12% Harnstoff unterzogen.
  • Das Acrylamidgel wurde dreimal für je 5 Minuten mit Wasser gewaschen und mit 10000-fach verdünntem SYBR Green II® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt.
  • Getrennt davon wurde eine Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung hergestellt, und 10.8 μl der Reaktionslösung wurde in PCR-Gefäße pipettiert.
    40 mM Tris-Acetat-Puffer (pH 8.1)
    37 mM Magnesiumacetat
    347 mM Kaliumacetat
    22% Sorbit
    1 mM Dithiothreit
    0.9 μM erste einzelsträngige Oligo-DNA (11mer)
    (Sequenz) 5' GTC GCC CCC AA 3'
  • Dann wurde 1.8 μl RNA (133mer, 5.7 μM) zugegeben, auf eine 10-minütige Erhitzung auf 65°C folgte schnelles Abkühlen in eiskaltem Wasser.
  • Nach 5-minütiger Inkubation bei 37°C wurde 1 μl RNase H (0.01, 0.001, 0.0001 oder 0.00001 U/μl, Takara Shuzo Co., Ltd.) zugegeben, und die Reaktion wurde bei 37°C für 1 Stunde durchgeführt. Zu den Reaktionslösungen wurden 2 μl Gelauftragspuffer und dann 10 μl Formamid zugegeben. Nach 5-minütiger Inkubation bei 65°C wurden 12 μl der Reaktionslösungen einer Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel mit 12% Harnstoff unterzogen.
  • Das Acrylamidgel wurde dreimal für je 5 Minuten mit Wasser gewaschen und mit 10000-fach verdünntem SYBR Green II® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt.
  • 6 zeigt die mit den entsprechenden Reaktionslösungen unterschiedlicher Zusammensetzung erhaltenen Ergebnisse. Wurde der Tris-HCl-Puffer in Gegenwart von RNase H in Endkonzentrationen von 0.000001 und 0.00001 U/μl verwendet, verschwand die Bande des 133mer, und Banden von 60 bis 70mer wurden nachgwiesen. Eine noch höhere Endkonzentration von RNase H führte zu weitergehendem Abbau des 133mer. Wurde hingegen der Tris-Acetat-Puffer in Gegenwart von RNase H in einer Endkonzentration von 0.0007 U/μl verwendet, verschwand die Bande des 133mer, und eine Bande eines 60 bis 70mer wurde nachgwiesen. Diese Bande stimmt in der Wanderungsgeschwindigkeit mit dem RNA-Fragment überein, das erhalten wird, wenn die 133mer RNA dort geschnitten wird, wo die erste einzelsträngige Oligonukleinsäure an das 133mer bindet.
  • Somit war es möglich, die Ziel-RNA am 5'-Ende der spezifischen Nukleinsäuresequenz mit der ersten einzelsträngigen Oligo-Nukleinsäure und RNase H zu schneiden.
  • BEISPIEL 7 Amplifizierung von RNA als Ziel-Nukleinsäure
  • Die vorliegende Erfindung wurde mit verschiedenen Konzentrationen Ziel-RNA durchgeführt, und die Amplifikationsprodukte wurden untersucht. Eine Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt, und 20 μl der Reaktionslösung wurde in PCR-Gefäße pipettiert.
    60 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    20.3 mM Magnesiumacetat
    187.5 mM Kaliumacetat
    22.5% DMSO
    22.5% Sorbit
    1.5 mM jeweils ATP, GTP, CTP und UTP
    1.5 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    150 μg/ml BSA
    0.3 μM dritte einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
    0.3 μM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
  • Dann wurden 5 μl einer Standard-RNA (102 Kopien, 103 Kopien, 104 Kopien, 105 Kopien oder 106 Kopien/5 μl) oder 5 μl RNA-freier TE-Puffer als Negativkontrolle zugegeben. Die Standard-RNA hatte die folgende Sequenz.
    (Sequenz) 5' GAA UAC AA- (Basen 11 bis 300 in der HCV-RNA) 3'
  • Die Reaktionslösungen wurden mit 100 μl Mineralöl überschichtet und bei 65°C für 10 Minuten inkubiert, und dann konnten die Gefäße für 5 Minuten in eiskaltem Wasser ruhen. Dann wurde 5 μl einer mit den folgenden Enzymen zusammengestellten Lösung zugegeben, und die Reaktion wurde bei 45°C für 4 Stunden durchgeführt.
    36 U/μl im Handel erhältliche SP6 RNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    12 U/μl im Handel erhältlicher RNase-Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    9 U/μl AMV Reverse Transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.) als RNA-abhängige DNA-Polymere und als DNA-abhängige DNA-Polymerase.
  • 5 μl der Reaktionslösungen wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 10000-fach verdünntem SYBR Green II® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt.
  • 7 zeigt das Muster auf dem angefärbten Gel. Wie in 7 gezeigt, wurden Banden von etwa 300 bp nachgewiesen, wenn die Ausgangskonzentration der Ziel-RNA 103 Kopien/5 μl oder mehr betrug, und die Bandenintensität war von der Ausgangsmenge der RNA abhängig. Somit war es möglich, die Ziel-RNA mit hoher Sensitivität durch die vorliegende Erfindung nachzuweisen. Die Menge des Amplifikationsprodukts erhöhte sich im Lauf der Zeit und war von der Ausgangsmenge der Ziel-RNA abhängig.
  • BEISPIEL 8 Identifizierung des Amplifikationsprodukts
  • Amplifikationsprodukte wurden nach der Behandlung mit DNase oder RNase identifiziert. Es wurde dem Verfahren in Beispiel 7 bis zur Anwendung der Enzyme in 5 μl TE-Puffer als Negativkontrolle und in 5 μl einer Standard-RNA (105 Kopien oder 106 Kopien/5 μl) gefolgt. Die Standard-RNA war wie folgt.
    (Sequenz) 5' GAA UAC AA- (Basen 11 bis 300 in HCV-RNA) 3'
  • Als Standard-DNA wurde eine doppelsträngige DNA mit einem DNA-Strang folgender Sequenz und einem komplementären Strang verwendet.
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA A- (Basen 11 bis 300 in HCV-cDNA) -3'
  • Nach dem Verfahren wurde jede Reaktionslösung bei 65°C für 30 Minuten inkubiert. 6 μl der drei verschiedenen Reaktionslösungen, die Standard-RNA (69 ng/μl) und die Standard-DNA (6 ng/μl) wurden in jeweils 3 Gefäße pipettiert. Zu einem davon wurde 0.6 μl RNase A (0.5 mg/ml) zugegeben, zu einem anderen wurde 0.6 μl DNase I (1 mg/ml) zugegeben, und zu dem verbleibenden wurde nichts zugegeben. Die drei Gefäße jeder Gruppe wurden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert, und 5 μl jeder Reaktionslösung wurden einer Elektrophorese mit einem 2%-igen Agarosegel unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Agarosegel mit 10000-fach verdünntem SYBR Green II® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen mit der Standard-RNA (69 ng/μl) und der Standard-DNA (6 ng/μl) waren die gleichen wie die Zusammensetzung der anderen, mit dem Verfahren in Beispiel 7 erhaltenen Reaktionslösungen, außer das die Enzyme weggelassen wurden.
  • 8 zeigt, daß das durch DNase I-Behandlung des DNA-Produkts erhaltene RNA-Produkt aus 106 Kopien der Ziel-Standard-RNA in der Bandenintensität 345 ng der Standard-RNA entspricht. Die durch DNase I-Behandlung erhaltene Bande des RNA-Produkts stimmte bezüglich der Wanderungsgeschwindigkeit mit der Bande der Standard-RNA überein.
  • Andererseits stimmte die durch Amplifizierung von 106 Kopien der Ziel-Standard-RNA, gefolgt von einer RNase A-Behandlung des RNA-Produkts erhaltene Bande bezüglich der Wanderungsgeschwindigkeit nahezu mit der Standard-DNA überein.
  • Somit wurden sowohl das RNA-Produkt als auch das DNA-Produkt gleichzeitig aus der Ziel-RNA synthetisiert.
  • BEISPIEL 9 Zeitverläufe der RNA-Produktion und DNA-Produktion
  • Die Zeitverläufe der DNA-Produktion und der RNA-Produktion wurden verfolgt. Eine Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt, und 33 μl der Reaktionslösung wurde in 10 PCR-Gefäße pipettiert.
    61 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    20.5 mM Magnesiumacetat
    189.2 mM Kaliumacetat
    21.7% DMSO
    12% Sorbit
    15 mM Dithiothreit
    1.5 mM jeweils ATP, GTP, CTP und UTP
    1.5 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    151 μg/ml BSA
    0.3 μM dritte einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
    0.3 μM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
  • Dann wurden 8.3 μl einer Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) oder TE-Puffer als Negativkontrolle in fünf Gefäße pipettiert. Die Standard-RNA hatte die folgende Sequenz.
    (Sequenz) 5' GAA UAC AA- (Basen 11 bis 300 in der HCV-RNA) 3'
  • Die Reaktionslösungen wurden mit 100 μl Mineralöl überschichtet und bei 65°C für 10 Minuten inkubiert, und dann konnten die Gefäße für 5 Minuten in eiskaltem Wasser ruhen. Nach 10-minütiger Inkubation bei 44°C wurde 8.6 μl einer mit den folgenden Enzymen zusammengestellten Lösung zugegeben. Nach 0-, 1-, 2-, 3- und 4-stündiger Reaktion bei 44°C wurde je ein Gefäß der Standard-RNA und der Negativkontrolle entnommen und auf Eis gestellt.
    32.8 U/μl im Handel erhältliche SP6 RNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    11.8 U/μl im Handel erhältlicher RNase-Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    8.2 U/μl AMV Reverse Transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.) als RNA-abhängige DNA-Polymerase und als DNA-abhängige DNA-Polymerase.
  • 5 μl der Reaktionslösungen in jedem Gefäß wurde einer Elektrophorese mit einem 2%-igen Agarosegel unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 10000-fach verdünntem SYBR Green II® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt und photographiert. Die Bandenintensitäten (OD) in der Photographie wurden dann mit einem Densitometer gemessen.
  • Der Rest jeder Reaktionslösung wurde bei 65°C für 20 Minuten erhitzt, und 10 μl jeder Reaktionslösung wurde in drei Gefäße pipettiert. Zu einem davon wurde 1 μl RNase A (0.5 mg/ml) zugegeben, zu einem anderen wurde 1 μl DNase I (1 mg/ml) zugegeben, und zum letzten wurde 1 μl TE-Puffer zugegeben. Alle drei Gefäße von jeder Gruppe wurden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert, und dann wurde 5 μl jeder Reaktionslösung einer Elektrophorese mit einem 2%-igen Agarosegel unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 10000-fach verdünntem SYBR Green I® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt und photographiert. Die Bandenintensitäten (OD) in der Photographie wurden dann mit einem Densitometer gemessen.
  • 9 zeigt den aus den Bandenintensitäten im Elektrophoretogramm bestimmten Zeitverlauf der DNA-Produktion und der RNA-Produktion. Die RNA-Produktion war etwa 40-mal größer als die DNA-Produktion. Weiterhin erhöhten sich sowohl die RNA-Produktion als auch die DNA-Produktion schlagartig 2 Stunden nach Beginn der Reaktion. Somit zeigten sowohl die RNA-Produktion als auch die DNA-Produktion durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung ähnliche Amplifikationskurven.
  • BEISPIEL 10 Bestimmung von Amplifikationsprodukt mit der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA
  • Ein RNA-Produkt in Reaktionslösungen wurde durch Messung des Fluoreszenzsignals mit einer vierten einzelsträngigen Oligo-RNA bestimmt. Zunächst wurden 20 μl einer Reaktionslösung mit der folgenden Zusammensetzung in 30 PCR-Gefäße pipettiert.
    60 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    20.3 mM Magnesiumacetat
    187.5 mM Kaliumacetat
    22.5% DMSO
    12% Sorbit
    1.5 mM jeweils ATP, GTP, CTP und UTP
    1.5 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    150 μg/ml BSA
    0.3 μM dritte einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
    0.3 μM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
  • Dann wurden 5 μl einer Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) und TE-Puffer als Negativkontrolle zu jeweils 15 Gefäßen zugegeben. Die Standard-RNA hatte die folgende Sequenz.
    (Sequenz) 5' GAA UAC AA- (Basen 11 bis 300 in der HCV-RNA) 3'
  • Die Reaktionslösungen wurden mit 100 μl Mineralöl überschichtet und bei 65°C für 10 Minuten inkubiert, und dann konnten die Gefäße für 5 Minuten in eiskaltem Wasser ruhen. Nach 10-minütiger Inkubation bei 44°C wurde 5 μl einer mit den folgenden Enzymen zusammengestellten Lösung zugegeben. Nach 0-, 1-, 2-, 3- und 4-stündiger Reaktion bei 44°C wurden je drei Gefäß der Standard-RNA und der Negativkontrolle entnommen und auf Eis gestellt.
    36 U/μl im Handel erhältliche SP6 RNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    12 U/μl im Handel erhältlicher RNase-Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    9 U/μl AMV Reverse Transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.) als RNA-abhängige DNA-Polymerase und als DNA-abhängige DNA-Polymerase.
  • 5 μl der Reaktionslösung in jedem Gefäß wurde einer Elektrophorese mit einem 2%-igen Agarosegel unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden die Reaktionslösungen in den drei zu den jeweiligen Reaktionszeiten entnommenen Gefäßen gemischt und 5 μl jedes Gemisches wurde einer Elektrophorese mit einem 2%-igen Agarosegel unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Agarosegel mit 10000-fach verdünntem SYBR Green II® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt und photographiert.
  • Zu 50 μl jedes Gemisches wurden 100 μl Meßpuffer mit der folgenden Zusammensetzung zugegeben.
    40 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    13 mM Magnesiumacetat
    125 mM Kaliumacetat
    10 mM Dithiothreit
    2 U/μl RNase-Inhibitor
    37.5 nM vierte einzelsträngige Oligo-DNA (hier im Folgenden YO-271 genannt)
    (Sequenz) 5' CTC GC*G GGG GCT G 3'
    (* zeigt die mit dem fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoff Oxazol-Gelb markierte Stelle an. Die Sequenz der Basen 1 bis 11 in der DNA-Einheit ist komplementär zur Sequenz der Basen 223 bis 233 in der HCV-cDNA). Der fluoreszierende Farbstoff war mit der DNA-Einheit, wie für YO-YPF-271 in Nucleic Acid Research 24 (24) (1996), 4992–4997 beschrieben, verbunden. Die Struktur von YO-271 ist wie folgt:
  • Figure 00270001
  • Die Reaktionslösungen wurden bei 65°C für 15 Minuten inkubiert und schnell in eiskaltem Wasser für 5 Minuten abgekühlt. Dann wurden die Reaktionslösungen bei 37°C für 10 Minuten inkubiert und in auf 37°C vorgeheizte fluorimetrische Küvetten gefüllt, und die Fluoreszenzintensitäten wurden bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm gemessen.
  • 10 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese, und 11 zeigt die Resultate der Messungen der Fluoreszenzsignale der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA (YO-271). Wie aus 11 ersichtlich, erhöhte sich das Fluoreszenzsignal von YO-271 schlagartig in 2 Stunden bei der Standard-RNA, wohingegen es keine Erhöhung der Fluoreszenzintensität bei der Negativkontrolle gab. Somit ermöglichte die Verwendung der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA den spezifischen Nachweis des Amplifikationsprodukts.
  • BEISPIEL 11 Modifizierung des 3'-Endes der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA
  • Während der Synthese einer einzelsträngigen RNA in Gegenwart einer vierten einzelsträngigen Oligo-DNA kann die Verlängerung der DNA am 3'-Ende durch die Aktivität einer zugleich vorliegenden RNA-abhängigen DNA-Polymerase zu einem Anstieg eines nicht spezifischen Signals führen. Daher wurde das 3'-Ende der Oligo-DNA durch Behandlung mit Terminaler Transferase (TdT) modifiziert (Anhängen von ddTTP), und deren Einfluß wurde untersucht.
  • Die TdT-Behandlung wurde in einer Reaktionslösung (Gesamtvolumen 50 μl) mit der folgenden Zusammensetzung bei 37°C für 1 Stunde durchgeführt.
    100 mM Natriumkakodyl-Puffer (pH 7.2)
    1 mM Kobaltchlorid
    0.1 mM Dithiothreit
    0.5 mM ddTTP
    0.6 U/μl TdT (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    37.3 μM vierte einzelsträngige Oligo-DNA (YO-271)
  • Das modifizierte Produkt wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von der Reinigung aus der wäßrigen Phase mit einer im Handel erhältlichen Säule (Chroma Spin-10, Handelsname, Toyobo Co., Ltd.), isoliert und durch Messung der OD260 nachgewiesen.
  • Das erhaltene TdT-behandelte YO-271 und nicht behandeltes YO-271 wurden für die Messung der Fluoreszenzsignale in der vorliegenden Erfindung verwendet.
    50 μl der Reaktionslösungen folgender Zusammensetzungen (mit nicht behandeltem YO-271 oder TdT-behandeltem YO-271) wurden in jeweils 10 Gefäße pipettiert.
    69 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    20.3 mM Magnesiumacetat
    187.5 mM Kaliumacetat
    21.5% DMSO
    12% Sorbit
    15 mM Dithiothreit
    1.5 mM jeweils ATP, GTP, CTP und UTP
    1.5 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    150 μg/ml BSA
    0.3 μM dritte einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
    0.3 μM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
    112.5 nM TdT-behandeltes YO-271 oder nicht behandeltes YO-271
  • Dann wurden 12.5 μl einer Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) oder TE-Puffer als Negativkontrolle in jeweils fünf Gefäße zugegeben. Die Standard-RNA hatte die folgende Sequenz.
    (Sequenz) 5' GAA UAC AA- (Basen 11 bis 300 in der HCV-RNA) 3'
  • Die Reaktionslösungen wurden mit 100 μl Mineralöl überschichtet und bei 65°C für 10 Minuten inkubiert, und dann konnten die Gefäße für 5 Minuten in eiskaltem Wasser ruhen. Nach 10-minütiger Inkubation bei 44°C wurde 12.5 μl einer mit den folgenden Enzymen zusammengestellten Lösung zugegeben. Nach 0-, 1-, 2-, 3- und 4-stündiger Reaktion bei 40°C wurden Gefäße der Standard-RNA und der Negativkontrolle entnommen und in eiskaltes Wasser gestellt.
    34.2 U/μl im Handel erhältliche SP6 RNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    12 U/μl im Handel erhältlicher RNase-Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    8.4 U/μl AMV Reverse Transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.) als RNA-abhängige DNA-Polymerase und als DNA-abhängige DNA-Polymerase.
  • Ein 50 μl Aliquot jeder Reaktionslösung wurde mit 100 μl Verdünnungspuffer der folgenden Zusammensetzung gemischt, bei 44°C für 5 Minuten inkubiert und in eine auf 44°C vorgeheizte fluorimetrische Küvette gefüllt, und die Fluoreszenzintensität wurde bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm gemessen.
    40 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    13 mM Magnesiumacetat
    125 mM Kaliumacetat
    10 mM Dithiothreit
    2 U/μl RNase-Inhibitor
  • 12 bzw. 13 zeigen die Ergebnisse mit dem nicht behandelten bzw. dem TdT-behandelten YO-271.
  • Im Fall des nicht behandelten YO-271 gab es einen Anstieg des Fluoreszenzsignals in Gegenwart der Negativkontrolle, und das Fluoreszenzsignal in Gegenwart der Negativkontrolle unterschied sich nicht wesentlich von dem in Gegenwart der Standard-RNA. Im Fall des ddTTP-behandelten YO-271 hingegen gab es einen deutlichen Unterschied zwischen dem Fluoreszenzsignal in Gegenwart der Negativkontrolle und in Gegenwart der Standard-RNA. Somit wird es für die RNA-Synthese in Gegenwart der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, das 3'-Ende der DNA so zu modifizieren, daß die Verlängerung der DNA am 3'-Ende durch die Aktivität der RNA-abhängigen DNA-Polymerase verhindert wird.
  • BEISPIEL 12 RNA- oder DNA-Synthese in Gegenwart der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA
  • Die Einflüsse des in Beispiel 11 hergestellten ddTTP-behandelten YO-271 auf RNA- oder DNA-Synthese in Gegenwart einer vierten einzelsträngigen Oligo-DNA wurden untersucht. 50 μl einer Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung wurde in 10 Gefäße pipettiert.
    60 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    2.3 mM Magnesiumacetat
    187.5 mM Kaliumacetat
    21.5% DMSO
    12% Sorbit
    15 mM Dithiothreit
    1.5 mM jeweils ATP, GTP, CTP und UTP
    1.5 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    150 μg/ml BSA
    0.3 μM dritte einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
    0.3 μM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
    112.5 nM TdT-behandeltes YO-271
  • Dann wurden 12.5 μl einer Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) oder TE-Puffer als Negativkontrolle in jeweils fünf Gefäße zugegeben. Die Standard-RNA hatte die folgende Sequenz.
    (Sequenz) 5' GAA UAC AA- (Basen 11 bis 300 in der HCV-RNA) 3'
  • Die Reaktionslösungen wurden mit 100 μl Mineralöl überschichtet und bei 65°C für 10 Minuten inkubiert, und dann konnten die Gefäße für 5 Minuten in eiskaltem Wasser ruhen. Nach 10-minütiger Inkubation bei 44°C wurde 12.5 μl einer mit den folgenden Enzymen zusammengestellten Lösung zugegeben. Nach 0-, 1-, 2-, 3- und 4-stündiger Reaktion bei 40°C wurden Gefäße der Standard-RNA und der Negativkontrolle entnommen und in eiskaltes Wasser gestellt.
    342 U/μl im Handel erhältliche SP6 RNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    12 U/μl im Handel erhältlicher RNase-Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    8.4 U/μl AMV Reverse Transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.) als RNA-abhängige DNA-Polymerase und als DNA-abhängige DNA-Polymerase.
  • 5 μl der Reaktionslösung in jedem Gefäß wurden einer Elektrophorese mit einem 2%-igen Agarosegel unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 10000-fach verdünntem SYBR Green II® (Takara Shuzo Co., Ltd.) für 30 Minuten angefärbt und photo graphiert. Die Bandenintensitäten (OD) in der Photographie wurden mit einem Densitometer gemessen.
  • 14 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese, und 15 zeigt die Ergebnisse der OD-Messung des Elektrophoretogramms. In Gegenwart der Standard-DNA stieg das Amplifikationsprodukt im Lauf der Zeit an, wohingegen es in Gegenwart der Negativkontrolle keinen Anstieg des Amplifikationsprodukts gab. Somit hemmte die Gegenwart der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA die RNA-Synthese in der vorliegenden Erfindung nicht.
  • BEISPIEL 13 Analyse der Zeitabhängigkeit der Menge des Amplifikationsprodukts bei Verwendung der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA
  • Die RNA-Produktion wurde mit dem in Beispiel 11 hergestellten YO-271 als der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA über einen Zeitraum verfolgt. Zunächst wurde 50 μl einer Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung in 10 Gefäße pipettiert.
    60 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    20.3 mM Magnesiumacetat
    187.5 mM Kaliumacetat
    21.5% DMSO
    12% Sorbit
    15 mM Dithiothreit
    1.5 mM jeweils ATP, GTP, CTP und UTP
    1.5 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    150 μg/ml BSA
    0.3 μM dritte einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
    0.3 μM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
    112.5 nM TdT-behandeltes YO-271
  • Dann wurden 12.5 μl einer Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) oder TE-Puffer als Negativkontrolle in jeweils fünf Gefäße zugegeben. Die Standard-RNA hatte die folgende Sequenz.
    (Sequenz) 5' GAA UAC AA- (Basen 11 bis 300 in der HCV-RNA) 3'
  • Die Reaktionslösungen wurden mit 100 μl Mineralöl überschichtet und bei 65°C für 10 Minuten inkubiert, und dann konnten die Gefäße für 5 Minuten in eiskaltem Wasser ruhen. Nach 10-minütiger Inkubation bei 44°C wurde 12.5 μl einer mit den folgenden Enzymen zusammengestellten Lösung zugegeben. Nach 0-, 1-, 2-, 3- und 4-stündiger Reaktion bei 40°C wurden Gefäße der Standard-RNA und der Negativkontrolle entnommen und in eiskaltes Wasser gestellt.
    34.2 U/μl im Handel erhältliche SP6 RNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    12 U/μl im Handel erhältlicher RNase-Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    8.4 U/μl AMV Reverse Transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.) als RNA-abhängige DNA-Polymerase und als DNA-abhängige DNA-Polymerase.
  • Ein 50 μl Aliquot jeder Reaktionslösung wurde mit 100 μl Verdünnungspuffer der folgenden Zusammensetzung gemischt, bei 44°C für 5 Minuten inkubiert und in eine auf 44°C vorgeheizte fluorimetrische Küvette gefüllt, und die Fluoreszenzintensität wurde bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm gemessen.
    40 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    13 mM Magnesiumacetat
    125 mM Kaliumacetat
    10 mM Dithiothreit
    2 U/μl RNase-Inhibitor
  • 16 zeigt die Ergebnisse der Fluoreszenzmessung. In Gegenwart der Standard-RNA stieg die Fluoreszenzintensität im Lauf der Zeit an, wohingegen die Fluoreszenzintensität in Gegenwart der Negativkontrolle nicht anstieg. Das Fluoreszenzprofil stimmte nahezu mit den Ergebnissen der elektrophoretischen Quantifizierung in Beispiel 12 überein. Somit ermöglichte es die Verwendung der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA, den Zeitverlauf der spezifischen Amplifizierung (RNA-Synthese) zu verfolgen.
  • BEISPIEL 14 Messung eines Fluoreszenzsignals bei Verwendung der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA
  • Die Fluoreszenzintensität des in Beispiel 11 hergestellten ddTTP-behandelten YO-271 wurde in Gegenwart bekannter Konzentrationen der Ziel-RNA gemessen. Zunächst wurde 50 μl einer Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung in 17 PCR-Gefäße pipettiert.
    60 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    20.3 mM Magnesiumacetat
    187.5 mM Kaliumacetat
    21.5% DMSO
    12% Sorbit
    15 mM Dithiothreit
    1.5 mM jeweils ATP, GTP, CTP und UTP
    1.5 mM jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP
    150 μg/ml BSA
    0.3 μM dritte einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG 3'
    0.3 μM zweite einzelsträngige Oligo-DNA
    (Sequenz) 5' ACT CGC AAG CAC CCT ATC A 3'
    112.5 nM TdT-behandeltes YO-271
  • Dann wurden 12.5 μl einer Standard-RNA (104 oder 105 Kopien/5 μl) und TE-Puffer als Negativkontrolle in jeweils vier Gefäße pipettiert. Getrennt davon wurde 12.5 μl der Standard-RNA (106 Kopien/5 μl) in fünf Gefäße pipettiert.
  • Die Standard-RNA hatte die folgende Sequenz.
    (Sequenz) 5' GAA UAC AA- (Basen 11 bis 300 in der HCV-RNA) 3'
  • Die Reaktionslösungen wurden mit 100 μl Mineralöl überschichtet und bei 65°C für 10 Minuten inkubiert, und dann konnten die Gefäße für 5 Minuten in eiskaltem Wasser ruhen. Nach 10-minütiger Inkubation bei 44°C wurde 12.5 μl einer mit den folgenden Enzymen zusammengestellten Lösung zugegeben. Nach 0-, 1- (nur für 106 Kopien/5 μl der Standard-RNA), 2-, 3- und 4-stündiger Reaktion bei 44°C wurde je ein Gefäß der Standard-RNA und der Negativkontrolle entnommen und in eiskaltes Wasser gestellt.
    34.2 U/μl im Handel erhältliche SP6 RNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    12 U/μl im Handel erhältlicher RNase-Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
    8.4 U/μl AMV Reverse Transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.) als RNA-abhängige DNA-Polymerase und als DNA-abhängige DNA-Polymerase.
  • Ein 50 μl Aliquot jeder Reaktionslösung wurde mit 100 μl Verdünnungspuffer der folgenden Zusammensetzung gemischt, bei 44°C für 5 Minuten inkubiert und in eine auf 44°C vorgeheizte fluorimetrische Küvette gefüllt, und die Fluoreszenzintensität wurde bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm gemessen.
    40 mM Tris-Acetat (pH 8.1)
    13 mM Magnesiumacetat
    125 mM Kaliumacetat
    10 mM Dithiothreit
    1 U/μl RNase-Inhibitor
  • 17 zeigt die bei den jeweiligen Reaktionszeiten gemessenen Fluoreszenzintensitäten nach Abzug der Hintergrund-Fluoreszenzintensität. Die Auftragung der auf den Fluoreszenzprofilen basierenden Fluoreszenzintensitäten bei einer Reaktionszeit von 3 Stunden gegen die Ausgangskonzentrationen der Ziel-RNA (18) zeigt eine Konzentrationsabhängige Fluoreszenzverstärkung. Somit wurde eine Eichkurve auf der Basis der durch die Messung der Fluoreszenzintensität erhaltenen Amplifikationskurve erhalten, die die Korrelation zwischen der Ausgangskonzentration der Ziel-RNA und der Fluoreszenzverstärkung zeigt. Somit konnte durch Messung der Fluoreszenzintensität einer Probe, die die Ziel-RNA in einer unbekannten Konzentration enthält, die Ausgangsmenge der Ziel-RNA bestimmt werden.
  • Wie soweit beschrieben, ermöglicht die vorliegende Erfindung die Bestimmung einer einzelsträngigen RNA, die eine spezifische Nukleinsäuresequenz enthält, in einer Probe bei nahezu konstanter Temperatur ohne wiederholtes Erhitzen und Kühlen der Reaktionslösungen. Weiterhin ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine hoch sensitive, spezifische, homogene Bestimmung einer Ziel-Nukleinsäure ohne Verwendung eines Trägers.
  • In der vorliegenden Erfindung wird, ausgehend von einer sehr geringen Menge einer einzelsträngigen RNA in einer Probe, eine doppelsträngige DNA mit einer Promotorregion für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase an einem Ende synthetisiert, und durch die doppelsträngige DNA werden viele RNA-Einzelstränge erzeugt. Die synthetisierte einzelsträngige RNA ist an der nächsten Syntheserunde der doppelsträngigen DNA beteiligt. Demzufolge steigt die in der Abfolge der Reaktionen als Zwischenstufe synthetisierte einzelsträngige RNA im Lauf der Zeit drastisch an. Da die Rate der RNA-Synthese und die Endmenge der synthetisierten RNA von der Menge der Ziel-RNA in der Probe abhängen, ist jedoch die Bestimmung der Ziel-RNA durch die Messung der Menge der synthetisierten RNA möglich.
  • Die vierte einzelsträngige Oligo-DNA in der vorliegenden Erfindung verstärkt die Fluoreszenzintensität bei Hybridisierung mit der einzelsträngigen RNA in der Reaktionslösung, und ermöglicht so die Bestimmung der Ausgangsmenge der Ziel-RNA in der Probe durch die Messung der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung.
  • Somit kann das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung bei nahezu konstanter Temperatur durchgeführt werden, da die Reaktionen durch die Bindung von Primern an die als Zwischenprodukte synthetisierte einzelsträngige RNA und DNA ablaufen, und es kann leicht automatisiert werden, da es für das Priming im Gegensatz zur PCR kein wiederholtes schnelles Erhitzen und Abkühlen der Reaktionslösungen erfordert. Weiterhin ermöglicht es die Verwendung der vierten einzelsträngigen Oligo-DNA in der vorliegenden Erfindung, die RNA-Synthese durch Messung der Fluoreszenzintensität während der einzelsträngigen RNA zu verfolgen. Daher ist es möglich, ein einfaches Einschrittverfahren für die genaue, schnelle, homogene, qualitative und quantitative Bestimmung einer Ziel-RNA zur Anwendung in der klinischen Diagnostik, ohne die Notwendigkeit einer Elektrophorese oder einer Sandwich-Bestimmung des Reaktionsprodukts, bereitzustellen.
  • Auf der Basis der Vervielfachung einer spezifischen RNA-Sequenz bei konstanter Temperatur stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls ein einfaches Verfahren zur Herstellung von RNA bereit, das unter milderen Bedingungen als in der herkömmlichen chemischen Synthese und der RT-PCR durchgeführt werden kann.

Claims (21)

  1. Verfahren zum Testen einer einzelsträngigen RNA, die eine spezifische Nucleinsäuresequenz enthält, in einer Probe bei einer konstanten Temperatur, durch Zugeben zu der Probe, die die einzelsträngige RNA enthält, mindestens der folgenden Reagenzien (A) bis (I), umfassend einen Schritt der Zugabe der Reagenzien (A) bis (I) nacheinander (in beliebiger Reihenfolge), in Kombinationen von mindestens zweien oder alle gleichzeitig, und einen Schritt der Messung eines Fluoreszenzsignals in Gegenwart des Reagenzes (I) mindestens einmal nach Zugabe mindestens der Reagenzien (A) bis (H); (A) eine erste einzelsträngige Oligonucleinsäure, die komplementär ist zu einer Sequenz direkt stromaufwärts des 5'-Endes der spezifischen Nucleinsäuresequenz in der einzelsträngigen RNA, wobei die erste einzelsträngige Oligonucleinsäure es erlaubt, die einzelsträngige RNA am 5'-Ende der spezifischen Nucleinsäuresequenz zu schneiden, wobei diese erste einzelsträngige Oligonucleinsäure gemeinsam mit einem Reagenz, das die RNA am 5'-Ende der spezifischen Nucleinsäuresequenz schneidet, hinzugegeben wird, (B) eine zweite einzelsträngige Oligo-DNA, die zu der Sequenz am 3'-Ende der spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementär ist, (C) eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, (D) Desoxyribonucleosidtriphosphate, (E) eine dritte einzelsträngige Oligo-DNA, die in 5'- zu 3'-Richtung (1) eine Promotorsequenz für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, (2) eine Enhancersequenz für den Promotor und (3) eine Sequenz besitzt, die dem 5'-Ende der spezifischen Nucleinsäuresequenz entspricht, (F) eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, (G) eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, (H) Ribonucleosidtriphosphate, und (I) eine vierte einzelsträngige Oligo-DNA, die komplementär ist zu der spezifischen Nucleinsäuresequenz, die mit einem fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff markiert ist, so dass diese bei Hybridisierung mit einer Nucleinsäure, die die spezifische Nucleinsäuresequenz enthält, ein messbares Fluoreszenzsignal abgibt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Temperatur ausgewählt wird aus dem Bereich von 35 bis 60°C und eine Temperatur ist, bei der die Oligonucleinsäuren, die als Reagenzien (A), (B), (E) und (I) verwendet werden, hybridisieren können und bei der die Enzyme als Reagenzien (C), (F) und (G) aktiv sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Oligonucleinsäure als das Reagenz (A) eine DNA ist und das Verfahren weiterhin einen Schritt der Zugabe von RNase H umfasst und einen nachfolgenden Schritt der Deaktivierung der RNase H durch Erhitzen oder durch Zugabe eines Inhibitors vor der Zugabe von Reagenz (B).
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei nach der Zugabe des Reagenzes (A) die Reagenzien (B) bis (H) gleichzeitig zugegeben werden, und weiterhin das Reagenz (I) zugegeben wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei nach der Zugabe des Reagenzes (A) die Reagenzien (B) bis (I) gleichzeitig zugegeben werden.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das weiterhin Dimethylsulfoxid verwendet und/oder ein Enzym, das RNA in einem DNA-RNA-Doppelstrang abbaut.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, das Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 5–20% verwendet.
  8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Enzym, welches RNA in einem DNA-RNA-Doppelstrang abbaut, die RNA-abhängige DNA-Polymerase als das Reagenz (C) ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Enzym, das sowohl eine RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität als auch eine DNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität hat, als das Reagenz (C) und (F) verwendet wird, um die Zugabe des Reagenzes (C) oder des Reagenzes (F) auszulassen.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Enzym aviäre Myoblastomvirus-Polymerase ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die zweiten und dritten Oligo-DNAs als die Reagenzien (B) und (E) bei einer Konzentration von 0,02 bis 1 μM verwendet werden.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die DNA-abhängige RNA-Polymerase als das Reagenz (G) mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phage SP6-Polymerase, Phage T3-Polymerase und Phage T7-Polymerase ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die vierte Oligo-DNA als das Reagenz (I) eine DNA ist, die eine Sequenz am 3'-Ende hat, die zu der spezifischen Nucleinsäuresequenz nicht komplementär ist, oder ein chemisch modifiziertes 3'-Ende hat, so dass das 3'-Ende bei Hybridisierung mit der synthetisierten einzelsträngigen RNA, die die spezifische Nucleinsäuresequenz hat, durch die Aktivität von Reagenz (C) nicht verlängert wird.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, das weiterhin einen Schritt des Nachweises oder der Quantifizierung der einzelsträngigen RNA in der Probe umfasst, basierend auf dem gemessenen Fluoreszenzsignal oder dem Wechsel in dem gemessenen Fluoreszenzsignal.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei alle Reagenzien chloridfrei sind.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, das weiterhin ein Acetat verwendet, welches spätestens zum Zeitpunkt der Synthese einzelsträngiger DNA in Gegenwart der Reagenzien (B) bis (D) hinzugegeben wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Acetat Magnesiumacetat in einer Konzentration von 5 bis 20 mM ist oder Kaliumacetat in einer Konzentration von 50 bis 200 mM.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, das weiterhin Sorbit verwendet, welches spätestens zum Zeitpunkt der Synthese einzelsträngiger DNA in Gegenwart von Reagenzien (B) bis (D) hinzugegeben wird.
  19. Reagenziensatz zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18, das mindestens umfasst ein erstes Reagenz, enthaltend die erste einzelsträngige Oligonucleinsäure, ein zweites Reagenz, enthaltend Tris-Acetat, Magnesiumacetat, Kalium-acetat, Sorbit und Dimethylsulfoxid, ein drittes Reagenz, enthaltend Dithiothreit, Desoxyribonucleosid-triphosphate, Ribonucleosidtriphosphate, Rinderserumalbumin, die zweite einzelsträngige Oligo-DNA und die dritte einzelsträngige Oligo-DNA, ein viertes Reagenz, enthaltend eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase und eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und einen RNase-Inhibitor und eine vierte einzelsträngige Oligo-DNA, die entweder in dem dritten Reagenz oder in dem vierten Reagenz oder in einem fünften Reagenz enthalten ist.
  20. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18, welches mindestens die erste einzelsträngige Oligonucleinsäure, die zweite einzelsträngige Oligo-DNA, die dritte einzelsträngige Oligo-DNA, die vierte einzelsträngige Oligo-DNA, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, Desoxyribonucleosidtriphosphate, Ribonucleosidtriphosphate, Tris-Acetat, Magnesiumacetat, Kaliumacetat, Sorbit, Dimethylsulfoxid, Dithiothreit, Rinderserumalbumin und einen RNase-Inhibitor umfasst.
  21. Reagenziensatz oder Reagenz nach einem der Ansprüche 19 bis 20, wobei ein Enzym, das sowohl eine RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität als auch eine DNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität hat, mindestens als die RNA-abhängige DNA-Polymerase und als die DNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet wird.
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