CN108034695B - 一种高效获得t-dna插入侧翼序列的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Transfer DNA(T‑DNA)插入真核生物基因组后，其相关插入位点侧翼序列信息获得的方法及其应用，属于生物技术研究领域。本发明在双元质粒T‑DNA区域的左边界(Left Border)或者右边界(Right Border)附近设计一条生物素标记的特异引物；利用该引物可以同时结合靶标序列片段以及链霉亲和素的特性，将含有T‑DNA插入的边界核酸序列分离并纯化；接着将一个已知序列的接头连接到纯化片段的5’端，并进行PCR扩增；最后将PCR序列克隆至载体测序，获得插入序列信息。和传统的iPCR和TAIL‑PCR相比，该方法可以显著提高鉴定T‑DNA插入位点的效率和准确率。

Description

一种高效获得T-DNA插入侧翼序列的方法及其应用

技术领域

本发明涉及Transfer DNA(T-DNA)插入真核生物基因组后，其相关插入位点侧翼序列信息获得的方法及其应用，属于生物技术研究领域。

背景技术

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)能将其细胞内携带的Ti质粒(Tumorinducing plasmid)上的一段特殊序列，即转移DNA(transfer DNA，简称T-DNA)，随机整合至受体植物或真菌的基因组中，最终诱发受体细胞产生基因突变或者产生转基因细胞系。目前，对于一部分植物和真菌，利用T-DNA基因组随机插入法鉴定基因的生物学功能已经比较成熟。科研人员利用常见的iPCR法(inverse Polymerase Chain Reaction)以及TAILPCR法(Thermal asymmetric interlaced PCR)获取T-DNA插入位点的侧翼序列(即T-DNA插入基因组的位置)，然后结合已知的相关物种的基因组信息，便可以获得对应的转基因品系或菌株中哪些功能基因被突变。但是，上述iPCR法和TAIL-PCR法也存在局限性，它们由于过分依赖PCR，导致假阳性率较高，或者完全无法扩增到预期条带。

iPCR法首先通过内切酶彻底切割基因组DNA，接着利用连接酶，促使被切割的片段DNA发生自环化，最后利用形成的环状DNA上的已知序列及其特异引物，扩增已知序列边界的未知基因组序列，最后将PCR产物进行测序。该方法受到多种因素的干扰，比如说酶切和自环化的效率、PCR引物的非特异性结合等等，这些因素导致该方法的效率和准确性不高。TAIL-PCR则是利用3条结合到已知边界序列的特异引物，以及一条较短的简并引物分别进行槽式PCR的扩增，最后通过测序PCR产物获得未知序列的信息。该方法由于过分依赖于PCR，因此，如果引物设计或者PCR程序的条件不够理想，很可能完全扩增不到预期的条带。

生物素(biotin)广泛分布于动、植物组织中，其分子量为244.31 Da。生物素分子有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环。链霉亲和素(streptavidin)是由链霉菌Streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素，因此一个链霉亲和素分子能结合4个生物素分子，二者亲和常数(Kd)为10^-15M^-1。生物素-链霉亲和素(biotin-streptavidin)系统由于其高度的亲和性和特异性，一直被运用于免疫标记和示踪分析领域。最近，生物素-链霉亲和素系统也开始应用于核酸分离和纯化领域，而本发明正是基于这一基础。

发明内容

本发明根据所使用的Ti质粒序列信息，在其T-DNA区域的左边界(Left Border)或者右边界(Right Border)附近设计一条生物素标记的特异引物；利用该引物可以同时结合靶标序列片段以及链霉亲和素的特性，将含有T-DNA插入的边界核酸序列纯化并富集；接着将一个已知序列的接头连接到纯化片段的5’端，并进行PCR扩增；最后将PCR序列克隆至载体测序，获得插入序列信息。

相关技术路线如下：

1.根据所使用的Ti质粒序列信息，在其T-DNA区域的左边界(Left Border)或者右边界(Right Border)附近设计一条特异引物，引物的序列长度在25-30个碱基，退火温度在68～72度之间，并且在该引物5’端增加生物素基团的修饰。

2.合成一条引物，其序列和上述生物素标记的引物序列必须反向互补。

3.合成一条双链DNA接头，该接头的5’端为平末端，3’端为一个T碱基突出的粘性末端。

4.合成一对PCR引物，上游引物序列为部分接头序列，下游引物序列为T-DNA的靠近Left Border或者Right Border的序列，且必须在生物素标记引物位点和Left Border(或者Right Border)序列之间。

5.将目的基因组DNA用超声波破碎仪随机打断，片段大小在400-1000bp之间。

6.上述破碎后的基因组DNA为模板，依次加入生物素标记的引物，PCR反应所必须的组分，以及可以在PCR产物3’端形成A尾的扩增效率较强的Taq酶，设定PCR参数后，进行一轮的PCR扩增，扩增期间，加入反向互补引物，以降低生物素标记引物的非特异性扩增。

7.利用链霉亲和素(streptavidin)磁珠纯化PCR产物，取部分纯化后的产物进行接头的连接。

8.用磁珠法纯化并回收大小在300-1000bp之间的片段，并将纯化后的片段作为模板，用第4步中合成的引物再次进行PCR扩增，扩增的PCR酶为可以产生A尾的Taq酶。

9.扩增后的产物进行电泳，并回收大小在600-1000bp之间的片段。

10.将回收的片段克隆至T质粒上，然后送生物技术公司测序。

有益效果：和传统的iPCR和TAIL-PCR相比，该方法可以显著提高鉴定T-DNA插入位点的效率和准确率。其关键改进措施就是通过生物素标记引物和链霉亲和素磁珠的结合作用，很大程度上降低了非特异性PCR扩增发生的可能性，从而达到提高正确率的目的。

附图说明

图1.生物素标记引物设计位点示意图

图2.生物素标记引物、靶标序列、磁珠三者结合示意图

图3.双链DNA接头序列

图4.实例中胶回收核酸片段大小分布图

图5.实例中通过上述方法获得的插入位点序列

具体实施方式

1.生物素标记的特异引物的设计

特异引物的序列是根据所使用的T-DNA载体而设计的，设计的位点如附图的图1所示，理论上应该尽量靠近T-DNA区域的边界，但考虑到T-DNA边界在整合进基因组的过程中不稳定，可能会导致丢失一部分序列，所以设计引物的位置最好距离边界序列大约100-150bp。如本实例中，所使用的载体是1300-bisGFP-hyg(具体序列信息请参阅本实验室之前申请的专利201310162982X)，因此我们设计的特异引物的序列为ACCACCCCGGTGAACAGCTCCTC(5’-3’)，并且该引物的5’端有生物素基团的修饰。同时，合成一条与该生物素标记特异引物反向互补的引物，在下面的双链DNA合成环节使用，用来结合多余的生物素标记的DNA。

2.基因组样品的预处理以及生物素标记引物与对应模板DNA的结合

本专利中使用的是两个含有T-DNA插入的大丽轮枝菌菌株(Verticilliumdahliae)，5B3和54D11。基因组DNA需要进行超声破碎，产生400-1000bp大小不等的核酸片段。不同超声破碎仪根据具体产品和型号确定，本实例使用Bioruptor Pico超声波破碎仪，设定参数为：50μl体积(DNA浓度为50-20ng/μl)，15s开/30s关，6个循环。

以上述片段化的基因组DNA为模板，加入生物素标记的引物，PCR反应所必须的组分，以及可以在PCR产物3’端形成A尾的扩增效率较强的Taq酶，设定PCR参数后，进行一轮的PCR扩增。PCR反应的总体积为50μl，PCR酶是One taq(NEB公司M0481S)，所需的试剂包括：体系包括：buffer 10μl，dNTP 1μl(dNTP母液为10mM)，生物素标记引物1μl(10μM)，聚合酶0.25μl，片段化的DNA模板20μl，最后用灭菌超纯水将总体积调整至50μl。PCR仪设定的反应步骤为：95℃变性DNA片段2分钟，然后在68℃条件下，反应并且延伸序列3min，然后暂停pcr，保持温度，同时保持PCR管依然放在PCR加热槽上，小心加入2ul(10uM)的互补引物，在PCR仪上小心吸打混匀。然后，继续PCR，68度5分钟；最后4度恒温。结束后，将样品取出，至于冰上备用。自此，完成生物素标记引物与对应模板DNA的结合。

3.被生物素引物结合的DNA片段的纯化。

尽快在上述PCR产物中加入0.5μl的0.5M EDTA，加入50μl 1M的NaCl，最后加入0.4M的Tris-HCl(pH 7.5)5μl混匀后，冰上备用。

Streptavidin磁珠的准备：本实例选用的是购置于NEB公司的streptavidin磁珠(S1420S)，使用前需要将磁珠测底混匀。取125μl磁珠，加入100μl的Washing/BindingBuffer[0.5M NaCl，20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA]涡旋震荡混匀。将磁珠放在磁铁架上(Thermo Fisher MR02)，去除上清液。然后加入100μl Washing/Binding Buffer，重悬磁珠后，将上一步骤准备好的冰上放置的PCR 105μl样品与磁珠混匀。在室温保持10分钟，每2-3分钟轻弹混匀一次；10分钟后，放到磁铁架上。小心用移液器移去上清。

加入100μl Washing/Binding Buffer后涡旋，再次清洗磁珠，放回磁铁架上，小心用移液器去除上清。次清洗步骤重复两次。接着加入提前冰上预冷的低盐Buffer[0.15MNaCl，20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA]，悬浮磁珠进行清洗，然后放到磁铁架上，再次去掉上清。

加入25μl 70℃预热的洗脱Buffer[10mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA]，并小心用移液器吹吸重悬，然后70℃水浴5分钟。再次将离心管放回磁铁架上，待上清清澈后，小心将含有目的片段的上清转移到新的离心管中，-20℃保存备用。

4.双链DNA接头的连接

本实例采用NEB的T7DNA连接酶(M0318S)进行接头序列的连接。取12.5μl上述biotin磁珠纯化过的产物，2μl合成的双链DNA接头(如附图图3，接头浓度为10μM)，15.5μlT7DNA连接酶Bufffer和1μl的T7连接酶，混匀后，25度反应2小时(结束后，可以放到4度过夜)。

5.接头以及短片段的去除

取69μl灭菌超纯水加入上述连接产物中并混匀，混合后体积为100μl，然后采用Beckman Coulter的核酸纯化磁珠(B23317)对300-1000bp范围内的片段进行回收，步骤均按照产品说明书进行，最后用25μl TE buffer(pH＝8)洗脱磁珠。

6.PCR扩增放大产物并进行胶回收和测序

取上一步骤的磁珠纯化产物3μl作为模板，用One taq(NEB公司M0481S)体系进行扩增。总体积：50μl；Buffer：25μl；Ampl和Amp2引物：各1μl(引物母液原始浓度为10μM)；DNA模板：3μl；DDW：20μl。引物Ampl的序列为：GATCTACACTCTTTCCCTACACG；Amp2的序列为：TCCTCGCCCTTGCTCACCAT。

PCR运行程序：

94℃ 2分钟预变性；

94℃ 20秒；58℃30秒；68℃60秒；(30个循环)

68℃ 2分钟；

4℃ 恒温。

最后，将所有PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收600～1000bp范围内的片段，然后将回收产物取适量，通过pMD18-T Simple克隆试剂盒(Takara)。将连接产物转化大肠杆菌，以含有氨苄(100μg/ml)的LB平板进行筛选，37℃过夜培养后，挑取阳性克隆。每个真菌材料挑取10个克隆，摇菌提取质粒后进行测序。测序后获得的结果如图5所示。

Claims (4)

1.一种获得T-DNA插入基因组DNA位点侧翼序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A. 在双元质粒T-DNA区域的左边界或者右边界附近设计一条生物素标记的特异引物；

B. 合成一条引物，其序列和所述生物素标记的引物序列反向互补；

C. 合成一条双链DNA接头，该接头的5’端为平末端，3’端为一个T碱基突出的粘性末端；

D. 合成一对PCR引物，上游引物序列为部分接头序列，下游引物序列为T-DNA的靠近左边界或右边界的序列，且在生物素标记引物位点和左边界或右边界序列之间；

E. 将目的基因组DNA用超声波破碎仪随机打断，片段大小在400-1000bp之间；

F. 以破碎后的基因组DNA为模板，依次加入步骤A中的生物素标记的引物，PCR反应所必须的组分，进行1个循环的PCR扩增，其中在扩增期间，在PCR延伸阶段暂停，保持当前温度，加入步骤B中合成的反向互补引物并吹吸混匀；

G. 利用链霉亲和素磁珠纯化PCR产物，并用T7连接酶将纯化产物与步骤C中合成的双链DNA接头进行连接反应；

H. 用磁珠法纯化连接产物并回收大小在300-1000bp之间的片段，并将纯化后的片段作为模板，用步骤D中合成的PCR引物再次进行PCR扩增；

I. 扩增后的产物进行电泳，并回收大小在600-1000bp之间的片段；

J. 将回收的片段克隆至T载体上，然后测序；

其中，所述步骤A中设计的特异引物的位置距离左边界或右边界序列100-150bp，退火温度在68-72度之间；所述步骤F中PCR反应所必须的组分包括：buffer、dNTP、聚合酶，所述聚合酶为在PCR产物3’端形成A尾的Taq酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中生物素标记的特异引物的5’端为生物素基团，3’端为与双元质粒的T-DNA边界附近互补的序列；该引物可以同时结合T-DNA侧翼序列片段以及链霉亲和素，在链霉亲和素磁珠以及磁铁的作用下，可以将含有T-DNA插入的边界序列纯化并富集。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于获得T-DNA插入真核生物基因组侧翼序列信息；其中，所述真核生物为真菌和植物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述真核生物为大丽轮枝菌菌株。

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