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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen von
Zellen solider Tumore und Gewebeatypie und ein Verfahren zum Testen
von Geweben zur Verwendung in der Knochenmarktransplantation oder
der Transplantation peripherer Blutstammzellen. Genauer gesagt betrifft
die vorliegende Erfindung eine neue Technik, die nicht nur zur Diagnose
und zum Nachweis solider Tumore und zum Nachweis von einer Atypie,
wie beispielsweise eines myelodisplastischen Syndroms und ähnlicher
nützlich
ist, sondern auch zur Untersuchung der Sicherheit von Zellen zur
Verwendung bei einer allogenen Knochenmarktransplantation oder einer
autologen hämatopoetischen
Stammzelltransplantation bei Patienten mit Leukämie oder einem soliden Tumor
anwendbar ist, insbesondere bei der Untersuchung des Risikos eines
Wiederauftretens nach der Transplantation.
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Stand der
Technik
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Das
WT1-Gen wurde vom menschlichen Chromosom 11p13 als eines der Gene
isoliert, das auf der Grundlage einer Analyse des WAGR-Syndroms,
das Komplikationen, wie den Wilms-Tumor, Aniridie, urogenitale Anomalien,
geistige Retardierung etc. einschließt, etiologisch mit dem Wilms-Tumor
in Zusammenhang gebracht. Es ist bekannt, dass seine Expression
im wesentlichen auf die fötale
Niere, Milz, Hoden und Eierstöcke
beschränkt
ist [Molecular Medicine, Band 32, Nr. 5, Seite 502 (1995)].
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben zuvor berichtet, dass
das Niveau der WT1-Genexpression bei einer akuten Leukämie hoch
ist, dass dieses Expressionsniveau umgekehrt mit der Prognose korreliert,
und dass die sogenannte MRD (minimale restliche Erkrankung) bei
einer akuten Leukämie
durch die Bestimmung dieses Expressionsniveaus nachgewiesen werden
kann [Blood, Band 84, Nr. 9, Seite 3071 (1994)].
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Das
Expressionsniveau des WT1-Gens kann durch die gut bekannte umgekehrt
transkribierte Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR; Kawasaki, E. S.
et al., Amplification of RNA, in PCR Protocol, A Guide to Methods
and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, 21–27 (1991))
bestimmt werden, und diese Bestimmung hat sich hinsichtlich Leukämie als
klinisch signifikant herausgestellt.
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Andererseits
ist ein solider Tumor ein neoplastischer Zustand, bei dem Tumorzellen
in einer soliden Masse wachsen, und ziemlich verschieden von einer
Leukämie,
bei der Tumorzellen getrennt wachsen, infiltrieren und metastasieren.
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Bis
jetzt ist viel an soliden Tumoren geforscht worden, aber es wurde
bis jetzt noch von keinem klinischen Marker, der diesem WT1-Gen
bei Leukämie
entspricht, berichtet.
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Daneben
ist myelodysplastisches Syndrom (MDS) eine erworbene hämatopoetische
Störung,
die eine Prä-Leukämie und
eine refraktäre
Abnahme der Zahlen peripherer Blutzellen bedeutet. Dessen endgültige Diagnose
hängt von
dem Nachweis einer morphologischen Abnormalität von Blutzellen ab, und hier
wurde eine Typisierung der Erkrankung bis jetzt gemäß der FAB
(French-American-British Group)-Klassifizierung durchgeführt.
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Es
ist bekannt, dass das oben erwähnte
MDS bei einer hohen Anzahl in eine akute Leukämie voranschreitet, und dass
die Inzidenz der leukämischen
Transformierung in der Hochrisikogruppe nicht weniger als 40 % und
in der Niedrigrisikogruppe sogar 10 bis 15 % hoch sein soll.
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Im
Hinblick auf die Prognose und prognostische Faktoren für MDS ist
die oben erwähnte
FAB-Klassifizierung wohlbekannt und die Risiken für eine akute
Leukämie
sind nach Behauptungen hohe Blasten-Verhältnisse des Knochenmarks und
des peripheren Bluts, Ansammlungen von Blasten in einem Knochenmarkbiopsat
und komplizierte Chromosomenaberrationen [Naika Gaku (Internal Medicine),
Seite 1711, 25. Sept. 1995, Asakura Shoten].
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Als
Erkrankungen, die auf ähnliche
Weise eine leukämische
Transformierung durchlaufen können, sind
neben anderen Myelofibrose, Polyzythämie vera, aplastische Anämie, primäre Thrombozytose
und paroxysmale nocturnale Hämoglobinurie
bekannt, aber es ist noch keine etablierte Technik zum Nachweis
von MDS und anderer Erkrankungen, die in Leukämie voranschreiten, verfügbar gewesen,
d.h. eine Atypie mit morphologischen Eigenschaften, die von denen
des normalen Gewebes oder Zellen verschieden ist.
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Daneben
wurde bei Patienten mit Leukämie
eine therapeutische Form mit einigem Erfolg angewandt, welche die
Durchführung
einer allogenen Knochenmarktransplantation (alloBMT), d.h. einer
Transfusion hämatopoetischer
Stammzellen zur Vermeidung irreversibler hämatopoetischer Störungen umfasst,
und daneben die Durchführung
einer Anti-Krebs-Medikamententherapie, eine Bestrahlungstherapie
und/oder ähnliche zur
Ausrottung von leukämischen
Zellen in Zusammenarbeit mit den Immunreaktionen des Patienten und
um dadurch eine vollständige
Heilung zu erreichen. Noch rezenter ist eine periphere Blutstammzellen-Transplantation (PBSCT)
oder eine autologe BSCT (ABSCT) anstelle einer autologen Knochenmarktransplantation (ABMT),
welche eine Art dieser Knochenmarktransplantation ist, von Klinikern
mit zunehmender Leichtigkeit angewandt worden, da sie zahlreiche
Vorteile hat.
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In
einer solchen Transplantation von Knochenmark oder peripheren Blutstammzellen
werden die Myelozyten oder peripheren Blutstammzellen eines Donors
mit einem im wesentlichen oder vollständig kompatiblen HLA-Antigen
in den Patienten transplantiert. Die hämatopoetischen Stammzellen
in dem Transplantat beginnen dann die normale Hämatopoese, mit der Hilfe der
interstitiellen Zellen und der hämatopoetischen Faktoren
im Knochenmark, was dadurch zu einer Erholung der Hämatopoese
führt.
Während
eine solche Transplantation von Knochenmark oder peripherer Blutstammzellen
mit einem hinreichenden Erfolg gekrönt wird, schließt die Praxis
das schwere Problem des Wiederauftretens nach der Transplantation
zusätzlich
zur geringen Anzahl an Donoren und der mit einer Transplantation
verbundenen Komplikationen ein.
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Um
das oben erwähnte
Wiederauftreten und die anderen Probleme zu überwinden, ist es äußerst wichtig,
sicherzustellen, dass das Gewebe oder die Zellen, die transplantiert
werden sollen, selbst frei von Tumorzellen, beispielsweise leukämischer
Zellen sind, d.h., dass die Sicherheit des Knochenmarks oder der
peripheren Blutstammzellen des Donors vorliegt, aber es gab bis
jetzt noch keine etablierte Technik zum Testen, ob leukämische Zellen
in die Myelozyten oder peripheren Blutstammzellen eingeschlossen
sind.
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Es
ist deswegen ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Technik bereitzustellen,
Tumorzellen zu quantifizieren, was von Wert für die Diagnose solider Tumore
ist, und genauer gesagt einen quantitativen Test unter Verwendung
eines klinischen Markers, der mit soliden Tumoren korreliert.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, eine Technik
zum Nachweisen einer Atypie bereitzustellen, indem ein neuer Marker
verwendet wird, wodurch das Risiko einer akuten leukämischen
Transformierung, z.B. mit größerer Genauigkeit,
und insbesondere unter Beachtung des Verlaufs und der Prognose von
MDS im Besonderen, vorhergesagt werden kann.
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Es
ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine neue
Technik bereitzustellen, die den Nachweis leukämischer Zellen im Gewebe zur
Verwendung in dieser Transplantation von Knochenmark oder der Transplantation
peripherer Blutstammzellen erlaubt.
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Offenbarung der Erfindung
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Als
Ergebnis ihrer intensiven Untersuchungen, die sich auf die oben
erwähnten
Ziele richteten, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung zum
ersten Mal entdeckt, dass das WT1-Gen, welches ein gut bekannter klinischer
Marker der Leukämie
ist, ein signifikant hohes Expressionsniveau in soliden Tumoren
aufweist, die mit einer Leukämie
nicht zusammenhängen.
Demgemäß haben
sie herausgefunden, dass dieses Gen wirksam zum Nachweis solider
Tumorzellen verwendet werden kann.
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Die
Erfinder haben weiter herausgefunden, dass das Niveau der WT1-Genexpression
ebenfalls beim MDS und anderen Varianten hoch ist, die klar von
einer Leukämie
unterschieden werden können,
und dass das Expressionsniveau des WT1-Gens in einer solchen Variante
ein Indikator einer akuten leukämischen Transformation
sein kann.
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Des
weiteren haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden,
dass obwohl das Expressionsniveau des WT1-Gens in der Fraktion der CD34+-Zellen eines Transplantationsmaterials
nicht ein Indikator einer Verunreinigung mit leukämischen
Zellen sein kann, das Niveau der WT1-Genexpression in der CD34-negativen
Zellfraktion ein guter Marker der Verunreinigung mit leukämischen
Zellen und soliden Tumorzellen sein kann, und dass die Bestimmung
dieses Niveaus den Nachweis leukämischer
Zellen und Zellen fester solider Tumore ermöglicht. Die vorliegende Erfindung
ist auf der Grundlage der obengenannten Befunde entwickelt worden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen
bereit, das das Bestimmen des Expressionsniveaus des WT1-Gens in
einem Gewebe, das getestet werden soll, umfasst, um dadurch solide
Tumorzellen nachzuweisen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis einer
Atypie eines Gewebes, das untersucht werden soll bereit, welches
die Bestimmung des Expressionsniveaus des WT1-Gens in diesem Gewebe
umfasst.
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Insbesondere
wird dieses Nachweisverfahren für
eine Atypie bevorzugt angewandt, wenn das zu untersuchende Gewebe
eines ist, das ein myelodysplastisches Syndrom aufweist (Prä-Leukämie) oder
wenn die Bestimmung des Expressionsniveaus des WT1-Gens an seinem
Transkript gemacht wird.
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Der
Begriff "Atypie" bedeutet, so wie
er hier verwendet wird, eine morphologische Variation des normalen
Gewebes oder der Zellen, und dessen Grad ist im allgemeinen parallel
zur Bösartigkeit
eines Tumors [Saishin Igaku Dai-Jiten (Contemporary and Comprehensive
Medical Encyclopedia), 15. Juni 1987, Ishiyaku Shuppan].
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Das
Nachweisverfahren für
eine Atypie gemäß der vorliegenden
Erfindung wird im wesentlichen durch die Verwendung des Niveaus
der WT1-Genexpression als Test für
eine Atypie vorhergesagt, das bedeutet die Verwendung dieses Expressionsniveaus
als Indikator einer akuten leukämischen
Transformation bei MDS und anderer Erkrankungen, die oben erwähnt wurden.
Das Verfahren hat daher eine große klinische Bedeutung zur
Untersuchung der Prognose oder des Verlaufs von solchen Erkrankungen,
einschließlich
MDS.
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Das
Verfahren zum Nachweis von einer Atypie gemäß der vorliegenden Erfindung
hat folgende zusätzliche
klinische Bedeutung. Das heißt,
wenn beispielsweise ein Patient mit MDS als ein Beispiel genommen wird,
und wenn der WT1-Wert, der durch das erfindungsgemäße Verfahren
nachgewiesen wurde, graduell von einem niedrigen Niveau ansteigt,
kann davon ausgegangen werden, dass der Patient ein hohes Risiko
für eine akute
Leukämie
aufweist, wodurch eine frühe
Transplantation allogenen Knochenmarks oder eine Transplantation
allogener peripherer Blutstammzellen indiziert ist.
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Des
weiteren kann das Verfahren zum Nachweis einer Atypie gemäß der vorliegenden
Erfindung zur Diagnose, ob atypische Zellen im Blut gesunder Menschen
entstanden sind, oder bei Opfern von Strahlenunfällen (das Personal, das in
einem Atomkraftwerk angestellt ist, Arbeiter, die mit Strahlung
umgehen, Patienten bei einer Bestrahlungstherapie etc.), Personen,
die eine Anti-Krebs-Therapie bei Brustkrebs erhalten haben und Patienten,
die Leukämiesymptome
aufweisen, die durch Infektionen induziert werden, verwendet werden.
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Zusätzlich bietet
die Erfindung ein Testverfahren bei Gewebe zur Verwendung als Transplantationsmaterial
bei einer Knochenmarktransplantation oder einer Transplantation
peripherer Blutstammzellen, welches die Bestimmung des WT1-Expressionsniveaus
in der CD34-negativen Zellfraktion eines Transplantationsmaterials
zur Transplantation umfasst, um dadurch die leukämischen Zellen und die soliden
Tumorzellen in diesem Material nachzuweisen.
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Die
Abkürzungen,
die für
Aminosäuren,
Peptide, Nukleotide oder Basensequenzen sowie Nukleinsäuren in
dieser Beschreibung verwendet werden, stimmen mit denen überein,
die von IUPAC-IUB oder der "Guideline
for the Drafting of Specifications Including Base Sequences or Amino
Acid Sequences" (herausgegeben vom
japanischen Patentamt) und solchen, die routinemäßig im Fachgebiet verwendet
werden, überein.
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Das
WT1-Gen, das in der Technik der vorliegenden Erfindung bestimmt
wird, ist als solches bekannt und seine Basensequenz wird in der
Literatur gezeigt [z.B. Cell, 60, 509 (1990); Nature, 343, 774 (1990)].
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Was
in der Technik der vorliegenden Erfindung zählt, ist das Bestimmen des
Expressionsniveaus dieses WT1-Gens in einem Testgewebe oder einer
CD34-negativen Zellfraktion davon, und dies ist die herausragendste
Eigenschaft, die von den zahlreichen hier offenbarten Methoden geteilt
wird.
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Jedoch
ist die Technik zum Bestimmen des Expressionsniveaus von Genen im
allgemeinen bekannt, wie beispielsweise aus der oben zitierten Literatur
ersichtlich wird, und es gibt keine Beschränkung der Verfahren oder Protokolle,
die zur Bestimmung des Expressionsniveaus des spezifischen Gens
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können.
Das heißt,
dass nicht nur das RT-PCR-Verfahren, das in der obengenannten Literatur
beschrieben ist, sondern auch andere bekannte Techniken oder Protokolle
erfolgreich angewandt werden können.
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Das
Expressionsniveau des WT1-Gens kann spezifisch beispielsweise durch
eine Technik zum Nachweisen eines Transkripts des WT1-Gens in einem
Testgewebe bestimmt werden oder mit der Technik zum Nachweisen eines
Translationsproduktes daraus. Gemäß der vorherigen Technik wird
die mRNA als Transkript des WT1-Gens nachgewiesen, um das Expressionsniveau
desselben Gens zu bestimmen, und dieser Nachweis kann erfolgreich
durch diese RT-PCR, eine Northern-Blot-Analyse [Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor Laboratory (1989)], eine in situ RT-PCR [Nucleic Acids
Res., 21, 3159–3166
(1993)] und eine in situ Hybridisierung durchgeführt werden, die Bestimmungen
auf zellulärem
Niveau sind, das NASBA-Verfahren [Nukleinsäuresequenz basierte Amplifizierung,
Nature, 350, 91–92
(1991)] und andere Verfahren.
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Gemäß der letztgenannten
Technik wird das WT1-Protein, welches Translationsprodukt des WT1-Gens
ist nachgewiesen, um das Expressionsniveau dieses Gens zu bestimmen,
und diese Methodik kann beispielsweise in einem immunologischen
Testverfahren unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen
das WT1-Protein umgesetzt werden. Der spezifische Antikörper gegen
das WT1-Protein kann hergestellt werden, indem notwendigerweise
das WT1-Protein als Immunogen auf Routineweise verwendet wird [Leukemia,
9, 1060 (1995)].
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Es
gibt keine besondere Beschränkung
der Testprobe, die verwendet werden kann, solange sie ein Transkript
oder ein Translationsprodukt des WT1-Gens enthält. Zur Bestimmung des Transkripts
können
zahlreiche Gewebebestandteile, einschließlich der Zellen des Gewebes,
die aus peripherem Blut stammen, aus Lymphknoten, aus Knochenmarkflüssigkeit,
aus Pleuralflüssigkeit,
Aszites, cerebrospinaler Flüssigkeit,
chirurgischen Waschungen, isolierten Geweben, Haar und anderen Geweben
verwendet werden. Zur Bestimmung des Translationsproduktes können nicht
nur die oben erwähnten
Gewebsbestandteile, sondern auch zahlreiche Körperflüssigkeiten, aus denen sie stammen,
verwendet werden.
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Die
Ergebnisse der Bestimmung des Transkripts oder Translationsproduktes
des WT1-Gens in solchen Proben werden mit den Niveaus der WT1-Genexpression
in den entsprechenden Testgeweben korreliert, wodurch eine notwendige
Bestimmung des Expressionsniveaus des WT1-Gens ermöglicht wird.
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Sobald
das Niveau der WT1-Genexpression höher ist als in normalen Zellen
oder gesunden Menschen, können
die Zellen, das Gewebe oder das fragliche Individuum als solide
Tumorzellen oder ein Gewebe oder ein Individuum, das diese enthält, angesehen
werden, oder als atypisch oder solche, die eine Atypie aufweisen,
betrachtet werden. Auf diese Weise werden solide Tumorzellen und
eine Atypie gemäß der vorliegenden
Erfindung nachgewiesen. Deswegen ist die erfindungsgemäße Technik
nicht nur von großem
Wert bei der klinischen Untersuchung und Diagnose solider Tumoren,
sondern, durch die Ermöglichung
einer positiven Überwachung
der leukämischen
Transformation bei Patienten, beweist sie einen hohen Wert bei der
klinischen Untersuchung und Diagnose von Atypien.
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Eine
Ausführungsform
der Technik zum Nachweisen solider Tumorzellen und einer Atypie
gemäß der Erfindung
durch die Bestimmung eines Transkripts des WT1-Gens wird nun im
Detail beschrieben.
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Wie
bereits unter Bezugnahme auf den Stand der Technik erwähnt wurde,
haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung über den Nachweis leukämischer
Zellen durch Bestimmung des Niveaus der WT1-Genexpression berichtet
[Blood, Band 84, Nr. 9, Seite 3071 (1994)]. Die dort zur Bestimmung
des Niveaus der WT1-Genexpression mittels RT-PCR und Northern-Blot-Analyse beschriebenen
Verfahren können
jeweils beide mit Erfolg zum Nachweis gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. Die detaillierten Protokolle werden in der obengenannten
Literatur beschrieben und werden hiermit durch Bezugnahme in diese
Beschreibung eingeschlossen.
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Jetzt
kann die RNA der Probe extrahiert werden, gereinigt werden und auf
konventionelle Weise hergestellt werden. Wenn der Nachweis eines
Transkripts des WT1-Gens, das in dieser RNA enthalten ist, mittels Northern-Blot
durchgeführt
wird, gibt es keine Beschränkung
hinsichtlich der Nachweissonde, die verwendet werden kann, solange
sie das WT1-Gen oder ein Fragment davon enthält, und eine ausreichende Spezifität besitzt,
um einen Nachweis unter Nachweisbedingungen zu erlauben, die in
einem Hybridisierungsverfahren mit einer Test-RNA-Probe verwendet
werden. Das heißt,
dass die Sonde das WT1-Gen, Fragmente, die durch die Spaltung mit
Restriktionsenzymen sowie Oligonukleotide, die chemisch synthetisiert
wurden, gemäß der Basensequenz
des WT1-Gens einschließen.
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Wenn
eine RT-PCR verwendet wird, sind die Primer, die verwendet werden,
in dem amplifizierten Bereich oder der Basenlänge nicht kritisch, als alles
notwendige darin liegt, dass sie in der Lage sind, das WT1-Gen selbst
zu amplifizieren. Sie werden bevorzugt so entworfen, dass die gesamte
Zink-Finger-Domäne des
WT1-Gens enthalten ist, und im allgemeinen kann der Primer eine
Teilsequenz von ungefähr
15 bis 30 Nukleotiden umfassen. Ein solches Primer-Set kann routinemäßig hergestellt
werden, und ein bevorzugtes Beispiel wird in dem nachfolgenden Beispiel
dargestellt.
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Die
zahlreichen Verfahren, die in der Nachweistechnik der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
wie beispielsweise die chemische Synthese eines Teilgens, die enzymatischen
Behandlungen zur Spaltung, Deletion, Addition oder Ligation davon
und die Isolierung, Reinigung, Replizierung und Auswahl davon können alle
auf konventionelle Weise durchgeführt werden [z.B. Bunshi Idengaku
Jikken Ho (Experimental Protocols in Molecular Genetics), Kyoritsu
Shuppan, 1983; PCR Technology, Takara Shuzo, 1990].
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Darstellend
für die
oben erwähnte
Isolierung und Reinigung kann diese mittels Agarose-Gelelektrophorese
durchgeführt
werden, und die Basensequenzierung kann beispielsweise durch das
Dideoxyverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463–5467 (1977)],
das Maxam-Gilbert-Verfahren [Method in Enzymology, 65, 499–560 (1980)]
oder ähnliche
gemacht werden. Das Letztgenannte kann leicht unter Verwendung eines kommerziellen
Sequenzier-Kits durchgeführt
werden. Eine PCR kann ebenfalls unter Routinebedingungen durchgeführt werden
[z.B. Science, 230, 1350–1354
(1985)]. Diese grundlegenden Protokolle werden in zahlreichen Berichten,
auf die sich diese Beschreibung bezieht, ebenfalls verwendet und
zusammen mit dem nachfolgenden Beispiel können sie als Referenzen zurate
gezogen werden.
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Beim
Durchführen
der Nachweistechnik der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft,
einen Soliden-Tumor- und einen Atypie-Detektionskit zu verwenden,
welcher geeignete Reagenzien zum Bestimmen des Expressionsniveaus
des WT1-Gens als aktive Inhaltsstoffe enthält.
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Der
Nachweis-Kit sollte spezifische Reagenzien enthalten, die auf das
spezifische Verfahren zum Bestimmen des Expressionsniveaus des WT1-Gens
als wesentliche Bestandteile zugeschnitten sind. Solche spezifischen
Reagenzien werden entsprechend ausgewählt und gemäß des verwendeten besonderen
Nachweisprotokolls etabliert, und sie werden als Reagenzien definiert,
die für
die Mittel für
einen spezifischen Nachweis des Ziels gemäß der Erfindung notwendig sind,
unter anderem beispielsweise einen anti-WT1-Protein-Antikörper, eine
Nachweissonde für
das WT1-Gentranskript und/oder das entsprechende Primer-Set. Des weiteren
können
für die
PCR ebenfalls Reagenzien in dem Kit eingeschlossen sein, wie auch
beispielsweise Reagenzien für
die Hybridisierung, obwohl diese nicht als wesentliche Bestandteile
solch eines Nachweis-Kits angesehen werden. Die vorliegende Erfindung
stellt deswegen einen Kit zum Nachweis von soliden Tumorzellen und
Atypie sowie einen Kit zur Krebsdiagnose bereit.
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Das
Verfahren zum Testen von Geweben für eine Transplantation von
Knochenmark oder eine Transplantation peripherer Blutstammzellen
wird nun im Detail beschrieben. Dieses Testverfahren umfasst die
Bestimmung des Niveaus der WT1-Expression
in einer CD34–-Zellfraktion,
die durch die Eliminierung der CD34+-Zellen
aus dem Transplantatmaterial erhältlich
wird.
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Die
Bestimmung des Expressionsniveaus des WT1-Gens kann durchgeführt werden,
indem eine Vielzahl an Techniken verwendet wird, wie gerade die
zuvor beschriebene Methode zum Nachweisen solider Tumorzellen und
Atypien.
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Die
für diesen
Test zu verwendende Probe ist die CD34–-Zellfraktion, die
durch die Eliminierung der CD34+-Zellen
aus jedem Gewebe zur Verwendung als Transplantatmaterial mit Hilfe
einer gut bekannten geeigneten Technik erhältlich ist. Als Beispiele können Fraktionen
peripherer Blutstammzellen, Knochenmarkflüssigkeit etc. erwähnt werden.
Eine solche CD34-negative
Zellfraktion kann durch ein Routineverfahren isoliert werden, typischerweise
durch Säulenchromatographie
unter Verwendung einer CD34-Säule
oder einer Substanz mit einer Affinität für CD34-Zellen, wie beispielsweise
FACS oder einem magnetischen Zell-Separationsapparat. Die Säule, die
typischerweise für
dieses Verfahren verwendet werden kann, schließt unter anderem Ceparate (hergestellt
von Cell-Pro), Isolex 300 und 50 (Baxter) und MaCS (Amzene) ein.
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Das
Auftrennungsverfahren unter Verwendung eines magnetischen Zell-Separationsapparats
wird nun im Detail beschrieben. Zuerst wird das mobilisierte periphere
Blut, das durch die Eliminierung von Plättchen, beispielsweise durch
Zentrifugieren oder ähnlichen
erhältlich
ist, oder die Knochenmarkflüssigkeit,
die nach Eliminierung mononukleärer
Zellen mit Hilfe eines Ficoll-Packs oder ähnlicher und eine anschließende Zentrifugation
erhältlich
ist, mit dem Anti-CD34-monoklonalen
Antikörper
für die
Sensibilisierung reagieren gelassen, und dann mit Dynabeads reagieren
gelassen, an die ein Sekundär-Antikörper konjugiert
worden ist, um eine Rosettenbildung auszulösen. Diese Rosette (positive
Zelle-Antikörper-Dynabead-Komplex)
wird magnetisch von den nicht-rosettenbildenden Zellen (negativen
Zellen) getrennt. Aus der so erhaltenen Rosette können positive Zellen
mittels einer enzymatischen Behandlung mit Chymopapain geerntet
werden.
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Es
ist gefunden worden, dass diese Methode der Bestimmung des Niveaus
der WT1-Genexpression in der obengenannten Probe, d.h. ein Transkript
oder ein Translationsprodukt des WT1-Gens, einen Wert bereitstellt, der mit
der erhältlichen
Anzahl leukämischer
Zellen oder solider Tumorzellen gut korreliert, und dass im Falle,
dass dieser gemessene Wert nicht über 10–4 liegt,
die Probe als im wesentlichen keine leukämische oder solide Tumorzellen
enthaltend eingestuft werden kann. Deswegen können erfindungsgemäß das Vorhandensein
leukämischer
Zellen und solider Tumorzellen in ein Transplantatmaterial zur Transplantation
getestet werden, und daher kann die Sicherheit des Transplantatmaterials
gesichert werden.
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In
dem oben erwähnten
Test für
Transplantatmaterialien gemäß der Erfindung
können
Reagenzien, die ähnlich
solchen sind, die bereits für
den Nachweis-Diagnose-Kit für
solide Tumorzellen und Atypien erwähnt wurden, verwendet werden
und die vorliegende Erfindung stellt weiter einen derartigen Test-Kit
für Transplantatmaterial
bereit.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine diagrammartige Darstellung der Daten, die durch Bestimmung
des Niveaus der WT1-Genexpression in zahlreichen Tumorzellen gemäß Beispiel
1 gewonnen wurden.
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2 ist
eine diagrammartige Darstellung von Plots, die durch die Bestimmung
des Niveaus der WT1-Genexpression
bei zahlreichen Patienten gemäß Beispiel
2 erhalten wurden.
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3 ist
eine diagrammartige Darstellung der Daten, die durch Bestimmung
des Niveaus der WT1-Genexpression in zahlreichen CD34-negativen
Zellfraktionen gemäß Beispiel
3 erzeugt wurden.
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Beste Art
der Durchführung
der Erfindung
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Die
folgenden Beispiele sind für
die vorliegende Erfindung weiter detailliert darstellend.
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Beispiel 1
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Nachweis solider
Tumorzellen
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Als
solide Tumorzellen wurden die folgenden Zellinien, die aus verschiedenen
Geweben stammen, verwendet. Die JCRB-Nummer jeder Zellinie ist jene,
die von der Japanese Cancer Research Bank (JCRB) zugeordnet wurde.
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Magenkrebs
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- (1) AZ-521 ... Magenkrebs (JCRB0061)
- (2) MKN1 ... Magenkrebs, adenosquamöses Karzinom (JCRB0252)
- (3) MKN28 ... Magenkrebs (JCRB0253)
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Kolonkrebs
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- (4) LOVO ... Kolon-Adenokarzinom (Cancer Res.,
36, 467–475
(1976))
- (5) SW480 ... Kolon-Adenokarzinom (Cancer Res., 38, 3186–3190 (1978))
- (6) SW620 ... Kolon-Adenokarzinom (Laboratory Investigation,
44, 309–323
(1981))
- (7) COLO320DM ... Kolon-Adenokarzinom (Anticancer Res., 13,
2011–2019
(1993))
- (8) HT29 ... Kolon-Adenokarzinom (Clinical Molecular Pathology,
48, M326-M332 (1995)).
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Lungenkrebs
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- (9) OS1 ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom
(Japanese J. Cancer Res., 81, 289–297 (1990))
- (11) OS2R ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom (Cancer Res.,
56, 354–358
(1996))
- (12) OS3 ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom (Japanese J.
Cancer Res., 81, 289–297
(1990))
- (14) LU65A ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom (JCRB0054)
- (15) LU65B ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom (JCRB0055)
- (16) LU99B ... Lungenkrebs, Riesenzell-Karzinom (JCRB0057)
- (17) LU99C ... Lungenkrebs, Riesenzell-Karzinom (JCRB0058)
- (18) VMRC-LCP ... Lungenkrebs, squamöses Zellkarzinom (JCRB0103)
- (19) LC6 ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom
- (20) RERF-LC-MS ... Lungenkrebs, Adenokarzinom (JCRB0081)
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Brustkrebs
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- (21) MDA MB231 ... Brustkrebs (Endocrinology,
129, 323–329
(1991))
- (22) ZR75 ... Brustkrebs (Mol. Cell Endocr., 41, 197–204 (1985))
- (23) YMB1 ... Brustkrebs (JCRB0823)
- (24) T47D ... Brustkrebs (Endocrinology, 129, 323–329 (1991))
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Keimzelltumor
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- (25) NEC8 ... Keimzelltumor (Hoden) (JCRB0250)
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Eierstockkrebs
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- (26) TYK NU ... Eierstockkrebs, nicht differenziert
(JCRB0234.0)
- (27) TYK-nu. cp-r ... Eierstockkrebs, nicht differenziert (JCBR0234.
1)
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Schilddrüsenkrebs
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- (28) Tumorzellen von Patienten mit Krebs der
Schilddrüse
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Das
Expressionsniveau des WT1-Gens in diesen Zellinien wurde in Übereinstimmung
mit dem Protokoll, das in der Literatur [Blood, 84(9), 3071 (1994)]
beschrieben wurde, wie folgt bestimmt.
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Das
heißt,
dass Gesamt-RNA aus jeder Zellinie durch ein Routineverfahren [z.B.
Säure-Guanidin-Phenol-Chloroform-Verfahren; Anal.
Biochem., 162, 156 (1987)] extrahiert wurde, in Diethylpyrocarbonat-behandeltem
Wasser gelöst
wurde und optisch bei 260 nm quantifiziert wurde.
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Auf
diese Weise wurden 15,5 μl
Diethylpyrocarbonat-behandeltes
Wasser, enthaltend 1 μg
Gesamt-RNA bei 65°C
für 5 Minuten
erwärmt
und mit 14,5 μl
RT-Puffer gemischt (50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3), 70 mmol/l KCl,
3 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l Dithiothreitol),
der 600 U Reverse Transkriptase (Moloney Maus-Leukämie-Virus-Reverse
Transkriptase, GIBCO-BRL), 500 mmol/l jedes Deoxynukleotidtriphosphats
(dNTP, Pharmacia), 750 ng Oligo-dT-Primerset und 40 U RNase-Inhibitor (Boehringer
Mannheim) enthielt.
-
Dieses
Gemisch wurde für
90 Minuten bei 37°C
inkubiert, für
20 Minuten auf 70°C
erwärmt
und bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
-
Die
PCR wurde auf einem DNA-Thermocycler (Perkin Elmer-Cetus) in einer
Runde von Zyklen aus Denaturierung bei 94°C × 1 min, Primer-Anlagerung
bei 64°C × 1 min
(β-Actin:
60°C × 1 min)
und Kettenverlängerung
bei 72°C × 2 min
durchgeführt,
um ein PCR-Produkt bereitzustellen (PCR der ersten Runde).
-
Sofern
die Densitometereinheit (unten beschrieben) dieses PCR-Produkts
weniger als 500 betrug, wurde eine zweite PCR-Runde mit einem "nested" inneren Primersatz durchgeführt, in
dem ein 2,5 μl
Aliquot des Produkts der PCR der ersten Runde verwendet wurde.
-
Das
so erhaltene PCR-Produkt wurde in Übereinstimmung mit dem Protokoll,
das in der Literatur angegeben ist, wie folgt untersucht [J. Immunol.,
147, 4307 (1991)].
-
Das
heißt,
dass das PCR-Produkt von 20 ng Gesamt-RNA auf ein 1,3 % Agarose-Gel,
das 0,05 μg/ml Ethidiumbromid
enthält,
aufgetragen wurde und unter Verwendung eines Polaroidfilms (Polaroid
665 Film, Polaroid Corp.) fotografiert wurde.
-
Das
Filmnegativ wurde bei 25°C
für 5 Minuten
entwickelt und mit einem Densitometer gescannt (CS-9000, Shimadzu),
um die "Densitometereinheit" herauszufinden.
-
Das
Ergebnis für
das erhaltene PCR-Produkt in Abwesenheit von RNA unter ansonsten
gleichen Bedingungen wurde als negative Kontrolle verwendet.
-
Die
in den obengenannten Verfahren verwendeten Primer werden in Tabelle
1 gezeigt.
-
-
Als
Primer für β-Actin, die
als interne Kontrolle verwendet wurden, wurden solche verwendet,
die in der Literatur beschrieben sind [Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
82, 6133, (1985)]. Die entsprechenden Primer wurden allesamt mit
einem konventionellen chemischen Verfahren synthetisiert.
-
Um
die Menge an RNA für
die RT-PCR zu standardisieren und den Unterschied der RNA-Zersetzung der
Proben zu standardisieren, wurde das Ergebnis (die Densitometereinheit)
mit dem WT1-Gen durch das Ergebnis mit β-Actin geteilt, und der Wert
wurde als Niveau der WT1-Expression verwendet.
-
Des
Weiteren, indem das Niveau der WT1-Genexpression in der Zellinie
K562, von der bekannt ist, dass sie das WT1-Gen exprimiert [Lozzio,
C. B. und Lozzio, B. B., Human chronic myelogenous leukemia cell line
with positive Philadelphia chromosome, Blood, 45, 321–334 (1995)],
welches durch das oben erwähnte Verfahren
bestimmt wurde, und als Referenz genommen wurde (1,00), wurden die
Niveaus der WT1-Genexpression
in zahlreichen Testzellen als relative Verhältnisse ausgerechnet.
-
Die
Ergebnisse werden in 1 gezeigt.
-
In
der 1 stellt die Ordinate die relativen Verhältnisse
der WT1-Genexpression in verschiedenen Zellinien dar, wobei das
WT1-Genexpressions-Niveau in der Zellinie K562 (K562 in der Tabelle)
als 1,00 genommen wird, während
die Abszisse die Testzellen darstellt (Magenkrebs-, Kolonkrebs-,
Lungenkrebs-, Brustkrebs-, Keimzelltumor-, Eierstockkrebs- und Schilddrüsenkrebszellen,
die durch die zuvor angegebenen Nummern zugeordnet werden).
-
Aus 1 wird
ersichtlich, dass WT1 in allen Magenkrebs-, Kolonkrebs-, Lungenkrebs-,
Brustkrebs-, Keimzelltumoren-, Eierstockkrebs- und Schilddrüsenkrebszellen
stark exprimiert wird, was darauf hindeutet, dass WT1 als Tumormarker
für solche
soliden Tumorzellen verwendet werden kann. Es ist daher klar, dass eine
klinisch wertvolle, neue Detektion und Testtechnik für solide
Tumore etabliert worden ist.
-
Beispiel 2
-
Nachweis von MDS
-
(1) Bestimmung des Niveaus
der WT1-Genexpression
-
Das
Niveau der WT1-Genexpression wurde in Übereinstimmung mit dem Protokoll
bestimmt, das in der Literatur beschrieben wurde [Blood, 84(9):
3071, 1994].
-
Das
heißt,
dass das gesamte RNA aus jeder Probe mit einem Routineverfahren
extrahiert wurde [Säure-Guanidin-Phenol-Chloroform-Verfahren,
Anal. Biochem., 162, 156 (1987)], in Diethylpyrocarbonat-behandeltem
Wasser gelöst
wurde und optisch bei 260 nm quantifiziert wurde.
-
Dann
wurden 15,5 μl
Diethylpyrocarbonat-behandelten Wassers, enthaltend 1 μg Gesamt-RNA,
bei 65°C
für 5 Minuten
erwärmt
und mit 14,5 μl
RT-Puffer gemischt (50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3), 70 mmol/l KCl,
3 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l Dithiothreitol),
welcher 600 U Reverse Transkriptase enthält (Moloney-Maus-Leukämie-Virus-Reverse
Transkriptase, GIBCO-BRL),
500 mmol/l jedes Deoxynukleotidtriphosphats (dNTP, Pharmacia), 750
ng Oligo-dT-Primerset und 40 U RNase-Inhibitor (Boehringer Mannheim). Dieses
Gemisch wurde bei 37°C
für 90
Minuten inkubiert, für
20 Minuten auf 70°C
erwärmt
und bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
-
Die
PCR wurde auf einem DNA-Thermocycler (Perkin Elmer-Cetus) in einer
Abfolge von Zyklen aus Denaturierung bei 94°C × 1 min, Primeranlagerung bei
64°C × 1 min β-Actin: 60°C × 1 min)
und Kettenverlängerung
bei 72°C × 2 min
durchgeführt,
um ein PCR-Produkt bereitzustellen (PCR der ersten Runde).
-
Wenn
eine Densitometereinheit (unten beschrieben) dieses PCR-Produkts weniger
als 500 betrug, wurde eine PCR der zweiten Runde mit einem inneren "nested" Primerset unter
Verwendung eines 2,5 μl
Aliquots des PCR-Produkts der ersten Runde durchgeführt.
-
Das
PCR-Produkt, das auf diese Weise erhalten wurde, wurde in Übereinstimmung
mit dem Protokoll untersucht, das in der Literatur wie folgt angegeben
ist [J. Immunol., 147, 4307 (1991)].
-
Das
heißt,
dass das PCR-Produkt aus 20 ng Gesamt-RNA auf einem 1,3%igen Agarosegel,
enthaltend 0,05 μg/ml
Ethidiumbromid aufgetragen wurde und unter Verwendung eines Polaroidfilms
(Polaroid 665-Film, Polaroid Corp.) fotografiert wurde. Das Filmnegativ
wurde bei 25°C
für 5 Minuten
entwickelt und mit einem Densitometer (CS-9000, Shimadzu) gescannt,
um eine "Densitometereinheit" zu finden. Das Ergebnis für das erhaltene
PCR-Produkt in Abwesenheit von RNA unter ansonsten gleichen Bedingungen
wurde als negative Kontrolle verwendet.
-
Die
in den obigen Verfahren verwendeten Primer werden in Tabelle 2 gezeigt.
-
-
Wie
bei den Primern für β-Actin, die
als interne Kontrolle verwendet wurden, wurden diejenigen, die in der
Literatur beschrieben sind [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 6133,
(1985)], verwendet. Die entsprechenden Primer wurden jeweils durch
ein konventionelles chemisches Verfahren synthetisiert.
-
Um
die Menge der RNA für
die RT-PCR und den Unterschied der RNA-Zersetzung der Proben zu
standardisieren, wurde das Ergebnis (Densitometereinheit) mit dem
WT1-Gen durch das Ergebnis mit β-Actin
geteilt, und der Wert wurde als Niveau der WT1-Genexpression verwendet.
Des weiteren wurde mit dem Niveau der WT1-Genexpression in der Zellinie
K562, von der bekannt ist, dass die das WT1-Gen exprimiert [Lozzio, C.
B. und Lozzio, B. B., Human chronic myelogenous leukemia cell line
with positive Philadelphia Chromosom, Blood, 45, 321–334 (1995)],
welche gemäß dem obigen
Verfahren bestimmt wurde, als Referenz von 1,00 genommen, die Niveaus
der WT1-Genexpression
in den verschiedenen Proben als relative Verhältnisse berechnet.
-
Von
18 MDS-Patienten (TA, UE, FU, TK, TN, CH, NA, MI, SH, AO, NO, SZ,
HA, SO, UR, MK, UK und TS), 2 Myelofibrose-Patienten (MY und MA),
einem Leukozytose-Patienten (NB), einem Patienten mit aplastischer
Anämie
(YA), einem Patienten mit Polycythemie vera (ALS), einem Eosinophilie-Patienten
(MS) und 2 Patienten mit primärer
Thrombozytose (GO und FS) oder einer Gesamtzahl von 26 Patienten
wurden Knochenmark und peripheres Blut gewonnen, und das Niveau
der WT1-Genexpression
in jeder Probe wurde mit dem oben beschriebenen Verfahren bestimmt.
Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt.
-
Aufgetragen
(auf die Abszisse) in der 2 sind die
relativen Werte des Niveaus der WT1-Genexpression in jeder Probe,
wobei das Niveau der WT1-Genexpression in der K562-Linie als 1,00 genommen
wurde.
-
Das
relative Niveau der WT1-Genexpression in dem normalen Knochenmark
(8,0 × 10–4)
wird als Referenzlinie auf der Abszisse aufgetragen. Die eingekreisten
Patienten in dem Diagramm starben anschließend.
-
Hinsichtlich
der 5 MDS-Patienten (CH, NO, SZ, SO und MK) sind die Niveaus der
WT1-Genexpression, die durch die Wiederbestimmung, die 3 Monate
(CH), 1 Jahr (NO), 6 Monate (SZ), 3 Monate (SO) und 2 Monate (MK)
jeweils nach der anfänglichen
Bestimmung durchgeführt
worden sind in dem Pfeil gezeigt.
-
Folgendes
kann aus 2 gesehen werden.
-
Nämlich, dass
die MDS-Patienten NO (nach 1 Jahr), SZ (nach 6 Monaten) und SO (nach
3 Monaten), die gleichermaßen
hoch gemessene Werte in der Anfangsbestimmung gezeigt hatten, progressiv
in einer kurzen Zeit atypisch wurden und schließlich an einer leukämischen
Transformation verstarben.
-
Andererseits
zeigten die MDS-Patienten TA, AO und TS niedrige Niveaus der WT1-Genexpression und
blieben klinisch stabil, d.h., dass sie Fälle mit einem niedrigen Risiko
einer leukämischen
Transformation waren.
-
Das
bedeutet, dass in Übereinstimmung
mit der erfindungsgemäßen Technik
nicht nur der Nachweis einer Atypie möglich gemacht wird, sondern
auch das Risiko einer leukämischen
Transformation bei MDS-Patienten vorhergesagt werden kann, indem
ein serieller Nachweis des Niveaus der WT1-Genexpression durchgeführt wird.
-
Beispiel 3
-
Test von Transplantatmaterialien
-
Als
Transplantatmaterialien für
eine Transplantation peripherer Blutstammzellen wurden periphere Blutstammzellen
aus verschiedenen Patienten isoliert, denen Granulozyten- Kolonien-stimulierender
Faktor (G-CSF; "Gran", Produkt von Kirin-Sankyo,
oder "Neutrogin", Produkt von Chugai)
zuvor verabreicht worden ist (autologe periphere Blutstammzellen-Transplantation:
2 μg/kg
Körpergewicht × 3 bis
7 Tage; allogene periphere Blutstammzell-Transplantation: 10 μg/kg Körpergewicht × 7 Tage).
Von den isolierten peripheren Blutstammzellen wurden die CD34–-Zellen
abgetrennt und unter Verwendung eines Zell-Trennungssystems gewonnen
(Isolex 50, Produkt von Baxter) [z.B. J. Hematotherapy, 4, 531–438 (1995)].
-
Dieses
Verfahren wurde in Übereinstimmung
mit dem Handbuch des Herstellers durchgeführt. Die Zellen wurden zuerst
mit einem Anti-CD34-monoklonalen Antikörper umgesetzt und dann mit
Dynabeads reagieren gelassen, die mit einem Sekundärantikörper zur
Rosettenbildung konjugiert waren. Diese Rosette (positive Zellen-Antikörper-Dynabeads-Komplex)
wird von den nicht-rosettenbildenden Zellen (negative Zellen) abgetrennt.
Von dieser Rosette können
die positiven Zellen durch eine enzymatische Behandlung mit Chymopapain gewonnen
werden.
-
Das
Expressionsniveau des WT1-Gens in der CD34–-Fraktionen
dieser Patienten wurde in Übereinstimmung
mit dem in der Literatur beschriebenen Protokoll [Blood, 84(9),
3071 (1994)] wie folgt bestimmt.
-
Das
heißt,
dass das gesamte RNA aus jeder Fraktion mit einem Routineverfahren
extrahiert wurde [z.B. Säure-Guanidin-Phenol-Chloroform-Verfahren;
Anal. Biochem., 162, 156 (1987)], in Diethylpyrocarbonat-behandeltem
Wasser gelöst
wurde und optisch bei 260 nm quantifiziert wurde.
-
Auf
diese Weise wurden 15,5 μl
Diethylpyrocarbonat-behandelten
Wassers, enthaltend 1 μg
Gesamt-RNA bei 65°C
für 5 Minuten
erwärmt
und mit 14,5 μl
RT-Puffer gemischt (50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3), 70 mmol/l KCl,
3 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l Dithiothreitol),
enthaltend 600 U Reverse Transkriptase (Moloney-Maus-Leukämievirus
Reverse Transkriptase, GIBCO-BRL), 500 mmol/l jedes Deoxynukleotidtriphosphats (dNTP,
Pharmacia), 750 ng Oligo-dT-Primerset
und 40 U RNase-Inhibitor (Boehringer Mannheim). Dieses Gemisch wurde
bei 37°C
für 90
Minuten inkubiert, bei 70°C
für 20
Minuten erwärmt
und bei –20°C bis zur
Verwendung aufbewahrt.
-
Eine
PCR wurde mit Hilfe eines DNA-Thermocyclers (Perkin Elmer-Cetus)
in einer Runde von Zyklen aus Denaturierung bei 94°C × 1 min,
Primeranlagerung bei 64°C × 1 min
(β-Actin:
60°C × 1 min)
und Kettenverlängerung
bei 72°C × 1 min
durchgeführt,
um ein PCR-Produkt hervorzubringen (PCR der ersten Runde).
-
Wenn
die Densitometereinheit (unten beschrieben) dieses PCR-Produkts weniger
als 500 betrug, wurde eine PCR der zweiten Runde mit einem inneren "nested" Primer-Set durchgeführt, indem
ein 2,5 μl
Aliquot des PCR-Produktes der ersten Runde verwendet wurde.
-
Das
PCR-Produkt, das auf diese Weise erhalten wurde, wurde in Übereinstimmung
mit dem Protokoll, das in der Literatur angegeben ist [J. Immunol.,
147, 4307 (1991)] wie folgt bestimmt.
-
Das
bedeutet, dass das PCR-Produkt aus 20 ng Gesamt-RNA auf einem 1,3%igen
Agarosegel, enthaltend 0,05 μg/ml
Ethidiumbromid, aufgetragen wurde und unter Verwendung eines Polaroid-Films
(Polaroid 665-Film, Polaroid Corp.) fotografiert wurde. Das Filmnegativ
wurde bei 25°C
für 5 Minuten
entwickelt und mit Hilfe eines Densitometer gescannt (CS-9000, Shimadzu),
um eine "Densitometereinheit" zu finden. Das Ergebnis
des PCR-Produkts, das in Abwesenheit von RNA unter ansonsten gleichen
Bedingungen erhalten wurde, wurde als negative Kontrolle verwendet.
Die in den obengenannten Verfahren verwendeten Primer werden in
Tabelle 3 gezeigt.
-
-
Als
Primer für β-Actin, die
als interne Kontrolle verwendet wurde, wurden solche, die in der
Literatur beschrieben sind [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 6133,
(1985)], verwendet. Die entsprechenden Primer wurden jeweils durch
ein konventionelles chemisches Verfahren synthetisiert.
-
Um
die Menge an RNA für
die RT-PCR und den Unterschied der RNA-Zersetzung der Proben zu
standardisieren, wurde das Ergebnis (Densitometereinheit) mit dem
WT1-Gen durch das Ergebnis mit β-Actin
geteilt, und das Produkt wurde als Niveau der WT1-Genexpression
verwendet.
-
Außerdem wurde
durch das Niveau der WT1-Genexpression in der Zellinie K562, von
der bekannt ist, dass sie das WT1-Gen exprimiert [Lozzio, C. B.
und Lozzio, B. B., Human chronic myelogenous leukemia cell line
with positive Philadelphia chromosome, Blood 45, 321–334 (1995)],
welche durch das obige Verfahren bestimmt wurde als Referenz (1.00)
genommen, die die Niveaus der WT1-Genexpression in den zahlreichen Testfraktionen
wurden als relative Verhältnisse
berechnet.
-
Die
Ergebnisse werden in 3 dargestellt.
-
Auf
die Ordinate aufgetragen, sind die relativen Niveaus der WT1-Genexpression
in den zahlreichen Testzellen (CD34–-Zellfraktionen),
wobei das Niveau der WT1-Genexpression
in der K562-Zellinie (K562 in der Tabelle) als 100 genommen wird.
-
Die
getesteten Zellen waren wie folgt.
(1)–(4) ... Die CD34–-Zellfraktion
peripherer hämatopoetischer
Blut-Stammzellen von Patienten
(5)–(9) ... Die CD34–-Zellfraktion
leukämischer
Zellen
(10) ... Die CD34–-Zellfraktion von Magenkrebs-Zellen
(11),
(12) ... Die CD34–-Zellfraktion von Kolonkrebs-Zellen
(13),
(14) ... Die CD34–-Zellfraktion von Lungenkrebs-Zellen
(15)
... Die CD34–-Zellfraktion
von Brustkrebs-Zellen
(16), (17) ... Die CD34–-Zellfraktion
von Eierstockkrebs-Zellen
-
Folgendes
kann aus dem Diagramm ersehen werden. Frische leukämische Zellen
umfassen nämlich CD34+- und CD34–-Zellen,
von denen beide das WT1-Gen in hohen Niveaus exprimieren [10–1-
bis 100-Niveau: siehe (5)–(9)]. Andererseits
exprimieren die CD34–-Zellfraktionen normaler
hämatopoetischer
Stammzellen das WT1-Gen auf niedrigen Niveaus, ≤ 10–4 [(1)–(4); jedoch
ist das Niveau der WT1-Expression
in diesen Zellen hoch].
-
Wenn
die CD34–-Zellfraktion
einer isolierten Probe hämatopoetischer
Stammzellen leukämische
Zellen enthält
(welche CD34– sind),
sollte das WT1-Niveau in diesen Zellen erhöht sein. Deswegen können durch die
Bestimmung des WT1-Werts
dieser CD34–-Zellfraktion
leukämische
Zellen nachgewiesen werden, vorausgesetzt, dass eine leukämische Zelle
unter 103 bis 104 normalen Zellen vorhanden ist. Wenn das Vorhandensein
leukämischer
Zellen in der CD34–-Zellfraktion der hämatopoetischen Zellprobe dadurch
durch das obige Nachweisverfahren bestätigt wird, ist es sicher, dass
die CD34+-Zellfraktion der hämatopoetischen
Stammzellen in dem Transplantatmaterial auch leukämische Zellen
enthält,
was darauf hindeutet, dass die Verwendung solcher Zellen für die Transplantation
aus Sicherheitsgründen
vermieden werden sollte.
-
Bezugnehmend
auf solide Tumorzellen, die intrinsisch CD34-negativ sind, ist es klar, dass wenn
eine Probe hämatopoetischer
Stammzellen mit Tumorzellen kontaminiert worden ist, die meisten
in der CD34–-Zellfraktion
vorhanden sein sollten. Deswegen kann durch die Bestimmung des WT1-Wertes dieser Fraktion
das Auftreten von Tumorzellen auf gleiche Weise nachgewiesen werden.
-
Das
heißt,
dass in Übereinstimmung
mit der Technik der vorliegenden Erfindung das Vorhandensein oder
die Abwesenheit leukämischer
Zellen oder Tumorzellen in einem Transplantat-Gewebematerial mit Sicherheit bestätigt werden
kann.
-
Industrielle
Anwendbarkeit
-
In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung wird eine Technik zum Nachweisen
solider Tumorzellen und Atypien bereitgestellt und eine Technik
zum Testen von Transplantatmaterial. Diese Technologien sind von
großem
klinischem Nutzen, da sie den Nachweis und die Diagnose solider
Tumore erlauben und eine Vorhersage des Risikos einer leukämischen
Transformation oder die Prognose zahlreicher Erkrankungen, von denen
bekannt ist, dass sie in eine Leukämie voranschreiten, wie beispielsweise
MDS oder eine Bestätigung der
Sicherheit der Transplantatmaterialien.
-
Besonders
ist die Technologie zum Nachweisen solider Tumorzellen gemäß der Erfindung
für die
Aufklärung
des etiologischen Mechanismus und der Pathologie verschiedener solider
Tumore und der Diagnose solcher Erkrankungen von Nutzen. Genauer
gesagt ermöglicht
die vorliegende Erfindung
- 1. die Diagnose der
Bösartigkeit
einer Läsion,
- 2. die Diagnose einer Tumorzell-Invasion in das Gewebe einschließlich einer
primären
Läsion
und einer Tumor-Metastasierung
in entfernte Organe, einschließlich
des Knochenmarks oder der Lymphknoten,
- 3. die Diagnose von Tumorzellen in verschiedenen Körperflüssigkeiten,
Pleuralflüssigkeit
und Aszites,
- 4. den Nachweis von Tumorzellen im peripheren Blut, und
- 5. den Nachweis von Tumorzellen in isoliertem Knochenmark oder
peripherer Blutstammzellfraktionen für die Transplantation von Knochenmark
oder die Transplantation von peripheren Blutstammzellen.
-
Des
weiteren haben die vorstelligen Erfinder bis jetzt Beweise für das Vorhandensein
eines WT1-Gens vom hohen Expressionstyp und niedrigen Expressionstyp
in zahlreichen Keimzelltumoren gewonnen und deswegen ermöglicht das
WT1-Gen eine neue Klassifizierung der Bösartigkeit von Keimzelltumoren
und anderer solider Tumore. Der Nachweis einer solchen Differenz
der Eigenschaft solider Tumore sollte einen klinisch nützlichen
Marker der Bösartigkeit
oder ähnlicher,
insbesondere bei Keimzelltumoren bereitstellen, die nicht pathologisch
differenziert werden können.