DE69733629T2 - Verfahren zum nachweis solider krebszellen und histologischer heterotypien und verfahren zur prüfung von gewebe für die knochenmarktransplantation und die transplantation von peripheren blutstammzellen - Google Patents

Verfahren zum nachweis solider krebszellen und histologischer heterotypien und verfahren zur prüfung von gewebe für die knochenmarktransplantation und die transplantation von peripheren blutstammzellen Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen von Zellen solider Tumore und Gewebeatypie und ein Verfahren zum Testen von Geweben zur Verwendung in der Knochenmarktransplantation oder der Transplantation peripherer Blutstammzellen. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Technik, die nicht nur zur Diagnose und zum Nachweis solider Tumore und zum Nachweis von einer Atypie, wie beispielsweise eines myelodisplastischen Syndroms und ähnlicher nützlich ist, sondern auch zur Untersuchung der Sicherheit von Zellen zur Verwendung bei einer allogenen Knochenmarktransplantation oder einer autologen hämatopoetischen Stammzelltransplantation bei Patienten mit Leukämie oder einem soliden Tumor anwendbar ist, insbesondere bei der Untersuchung des Risikos eines Wiederauftretens nach der Transplantation.
  • Stand der Technik
  • Das WT1-Gen wurde vom menschlichen Chromosom 11p13 als eines der Gene isoliert, das auf der Grundlage einer Analyse des WAGR-Syndroms, das Komplikationen, wie den Wilms-Tumor, Aniridie, urogenitale Anomalien, geistige Retardierung etc. einschließt, etiologisch mit dem Wilms-Tumor in Zusammenhang gebracht. Es ist bekannt, dass seine Expression im wesentlichen auf die fötale Niere, Milz, Hoden und Eierstöcke beschränkt ist [Molecular Medicine, Band 32, Nr. 5, Seite 502 (1995)].
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben zuvor berichtet, dass das Niveau der WT1-Genexpression bei einer akuten Leukämie hoch ist, dass dieses Expressionsniveau umgekehrt mit der Prognose korreliert, und dass die sogenannte MRD (minimale restliche Erkrankung) bei einer akuten Leukämie durch die Bestimmung dieses Expressionsniveaus nachgewiesen werden kann [Blood, Band 84, Nr. 9, Seite 3071 (1994)].
  • Das Expressionsniveau des WT1-Gens kann durch die gut bekannte umgekehrt transkribierte Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR; Kawasaki, E. S. et al., Amplification of RNA, in PCR Protocol, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, 21–27 (1991)) bestimmt werden, und diese Bestimmung hat sich hinsichtlich Leukämie als klinisch signifikant herausgestellt.
  • Andererseits ist ein solider Tumor ein neoplastischer Zustand, bei dem Tumorzellen in einer soliden Masse wachsen, und ziemlich verschieden von einer Leukämie, bei der Tumorzellen getrennt wachsen, infiltrieren und metastasieren.
  • Bis jetzt ist viel an soliden Tumoren geforscht worden, aber es wurde bis jetzt noch von keinem klinischen Marker, der diesem WT1-Gen bei Leukämie entspricht, berichtet.
  • Daneben ist myelodysplastisches Syndrom (MDS) eine erworbene hämatopoetische Störung, die eine Prä-Leukämie und eine refraktäre Abnahme der Zahlen peripherer Blutzellen bedeutet. Dessen endgültige Diagnose hängt von dem Nachweis einer morphologischen Abnormalität von Blutzellen ab, und hier wurde eine Typisierung der Erkrankung bis jetzt gemäß der FAB (French-American-British Group)-Klassifizierung durchgeführt.
  • Es ist bekannt, dass das oben erwähnte MDS bei einer hohen Anzahl in eine akute Leukämie voranschreitet, und dass die Inzidenz der leukämischen Transformierung in der Hochrisikogruppe nicht weniger als 40 % und in der Niedrigrisikogruppe sogar 10 bis 15 % hoch sein soll.
  • Im Hinblick auf die Prognose und prognostische Faktoren für MDS ist die oben erwähnte FAB-Klassifizierung wohlbekannt und die Risiken für eine akute Leukämie sind nach Behauptungen hohe Blasten-Verhältnisse des Knochenmarks und des peripheren Bluts, Ansammlungen von Blasten in einem Knochenmarkbiopsat und komplizierte Chromosomenaberrationen [Naika Gaku (Internal Medicine), Seite 1711, 25. Sept. 1995, Asakura Shoten].
  • Als Erkrankungen, die auf ähnliche Weise eine leukämische Transformierung durchlaufen können, sind neben anderen Myelofibrose, Polyzythämie vera, aplastische Anämie, primäre Thrombozytose und paroxysmale nocturnale Hämoglobinurie bekannt, aber es ist noch keine etablierte Technik zum Nachweis von MDS und anderer Erkrankungen, die in Leukämie voranschreiten, verfügbar gewesen, d.h. eine Atypie mit morphologischen Eigenschaften, die von denen des normalen Gewebes oder Zellen verschieden ist.
  • Daneben wurde bei Patienten mit Leukämie eine therapeutische Form mit einigem Erfolg angewandt, welche die Durchführung einer allogenen Knochenmarktransplantation (alloBMT), d.h. einer Transfusion hämatopoetischer Stammzellen zur Vermeidung irreversibler hämatopoetischer Störungen umfasst, und daneben die Durchführung einer Anti-Krebs-Medikamententherapie, eine Bestrahlungstherapie und/oder ähnliche zur Ausrottung von leukämischen Zellen in Zusammenarbeit mit den Immunreaktionen des Patienten und um dadurch eine vollständige Heilung zu erreichen. Noch rezenter ist eine periphere Blutstammzellen-Transplantation (PBSCT) oder eine autologe BSCT (ABSCT) anstelle einer autologen Knochenmarktransplantation (ABMT), welche eine Art dieser Knochenmarktransplantation ist, von Klinikern mit zunehmender Leichtigkeit angewandt worden, da sie zahlreiche Vorteile hat.
  • In einer solchen Transplantation von Knochenmark oder peripheren Blutstammzellen werden die Myelozyten oder peripheren Blutstammzellen eines Donors mit einem im wesentlichen oder vollständig kompatiblen HLA-Antigen in den Patienten transplantiert. Die hämatopoetischen Stammzellen in dem Transplantat beginnen dann die normale Hämatopoese, mit der Hilfe der interstitiellen Zellen und der hämatopoetischen Faktoren im Knochenmark, was dadurch zu einer Erholung der Hämatopoese führt. Während eine solche Transplantation von Knochenmark oder peripherer Blutstammzellen mit einem hinreichenden Erfolg gekrönt wird, schließt die Praxis das schwere Problem des Wiederauftretens nach der Transplantation zusätzlich zur geringen Anzahl an Donoren und der mit einer Transplantation verbundenen Komplikationen ein.
  • Um das oben erwähnte Wiederauftreten und die anderen Probleme zu überwinden, ist es äußerst wichtig, sicherzustellen, dass das Gewebe oder die Zellen, die transplantiert werden sollen, selbst frei von Tumorzellen, beispielsweise leukämischer Zellen sind, d.h., dass die Sicherheit des Knochenmarks oder der peripheren Blutstammzellen des Donors vorliegt, aber es gab bis jetzt noch keine etablierte Technik zum Testen, ob leukämische Zellen in die Myelozyten oder peripheren Blutstammzellen eingeschlossen sind.
  • Es ist deswegen ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Technik bereitzustellen, Tumorzellen zu quantifizieren, was von Wert für die Diagnose solider Tumore ist, und genauer gesagt einen quantitativen Test unter Verwendung eines klinischen Markers, der mit soliden Tumoren korreliert.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, eine Technik zum Nachweisen einer Atypie bereitzustellen, indem ein neuer Marker verwendet wird, wodurch das Risiko einer akuten leukämischen Transformierung, z.B. mit größerer Genauigkeit, und insbesondere unter Beachtung des Verlaufs und der Prognose von MDS im Besonderen, vorhergesagt werden kann.
  • Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine neue Technik bereitzustellen, die den Nachweis leukämischer Zellen im Gewebe zur Verwendung in dieser Transplantation von Knochenmark oder der Transplantation peripherer Blutstammzellen erlaubt.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Als Ergebnis ihrer intensiven Untersuchungen, die sich auf die oben erwähnten Ziele richteten, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal entdeckt, dass das WT1-Gen, welches ein gut bekannter klinischer Marker der Leukämie ist, ein signifikant hohes Expressionsniveau in soliden Tumoren aufweist, die mit einer Leukämie nicht zusammenhängen. Demgemäß haben sie herausgefunden, dass dieses Gen wirksam zum Nachweis solider Tumorzellen verwendet werden kann.
  • Die Erfinder haben weiter herausgefunden, dass das Niveau der WT1-Genexpression ebenfalls beim MDS und anderen Varianten hoch ist, die klar von einer Leukämie unterschieden werden können, und dass das Expressionsniveau des WT1-Gens in einer solchen Variante ein Indikator einer akuten leukämischen Transformation sein kann.
  • Des weiteren haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass obwohl das Expressionsniveau des WT1-Gens in der Fraktion der CD34+-Zellen eines Transplantationsmaterials nicht ein Indikator einer Verunreinigung mit leukämischen Zellen sein kann, das Niveau der WT1-Genexpression in der CD34-negativen Zellfraktion ein guter Marker der Verunreinigung mit leukämischen Zellen und soliden Tumorzellen sein kann, und dass die Bestimmung dieses Niveaus den Nachweis leukämischer Zellen und Zellen fester solider Tumore ermöglicht. Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage der obengenannten Befunde entwickelt worden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen bereit, das das Bestimmen des Expressionsniveaus des WT1-Gens in einem Gewebe, das getestet werden soll, umfasst, um dadurch solide Tumorzellen nachzuweisen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis einer Atypie eines Gewebes, das untersucht werden soll bereit, welches die Bestimmung des Expressionsniveaus des WT1-Gens in diesem Gewebe umfasst.
  • Insbesondere wird dieses Nachweisverfahren für eine Atypie bevorzugt angewandt, wenn das zu untersuchende Gewebe eines ist, das ein myelodysplastisches Syndrom aufweist (Prä-Leukämie) oder wenn die Bestimmung des Expressionsniveaus des WT1-Gens an seinem Transkript gemacht wird.
  • Der Begriff "Atypie" bedeutet, so wie er hier verwendet wird, eine morphologische Variation des normalen Gewebes oder der Zellen, und dessen Grad ist im allgemeinen parallel zur Bösartigkeit eines Tumors [Saishin Igaku Dai-Jiten (Contemporary and Comprehensive Medical Encyclopedia), 15. Juni 1987, Ishiyaku Shuppan].
  • Das Nachweisverfahren für eine Atypie gemäß der vorliegenden Erfindung wird im wesentlichen durch die Verwendung des Niveaus der WT1-Genexpression als Test für eine Atypie vorhergesagt, das bedeutet die Verwendung dieses Expressionsniveaus als Indikator einer akuten leukämischen Transformation bei MDS und anderer Erkrankungen, die oben erwähnt wurden. Das Verfahren hat daher eine große klinische Bedeutung zur Untersuchung der Prognose oder des Verlaufs von solchen Erkrankungen, einschließlich MDS.
  • Das Verfahren zum Nachweis von einer Atypie gemäß der vorliegenden Erfindung hat folgende zusätzliche klinische Bedeutung. Das heißt, wenn beispielsweise ein Patient mit MDS als ein Beispiel genommen wird, und wenn der WT1-Wert, der durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen wurde, graduell von einem niedrigen Niveau ansteigt, kann davon ausgegangen werden, dass der Patient ein hohes Risiko für eine akute Leukämie aufweist, wodurch eine frühe Transplantation allogenen Knochenmarks oder eine Transplantation allogener peripherer Blutstammzellen indiziert ist.
  • Des weiteren kann das Verfahren zum Nachweis einer Atypie gemäß der vorliegenden Erfindung zur Diagnose, ob atypische Zellen im Blut gesunder Menschen entstanden sind, oder bei Opfern von Strahlenunfällen (das Personal, das in einem Atomkraftwerk angestellt ist, Arbeiter, die mit Strahlung umgehen, Patienten bei einer Bestrahlungstherapie etc.), Personen, die eine Anti-Krebs-Therapie bei Brustkrebs erhalten haben und Patienten, die Leukämiesymptome aufweisen, die durch Infektionen induziert werden, verwendet werden.
  • Zusätzlich bietet die Erfindung ein Testverfahren bei Gewebe zur Verwendung als Transplantationsmaterial bei einer Knochenmarktransplantation oder einer Transplantation peripherer Blutstammzellen, welches die Bestimmung des WT1-Expressionsniveaus in der CD34-negativen Zellfraktion eines Transplantationsmaterials zur Transplantation umfasst, um dadurch die leukämischen Zellen und die soliden Tumorzellen in diesem Material nachzuweisen.
  • Die Abkürzungen, die für Aminosäuren, Peptide, Nukleotide oder Basensequenzen sowie Nukleinsäuren in dieser Beschreibung verwendet werden, stimmen mit denen überein, die von IUPAC-IUB oder der "Guideline for the Drafting of Specifications Including Base Sequences or Amino Acid Sequences" (herausgegeben vom japanischen Patentamt) und solchen, die routinemäßig im Fachgebiet verwendet werden, überein.
  • Das WT1-Gen, das in der Technik der vorliegenden Erfindung bestimmt wird, ist als solches bekannt und seine Basensequenz wird in der Literatur gezeigt [z.B. Cell, 60, 509 (1990); Nature, 343, 774 (1990)].
  • Was in der Technik der vorliegenden Erfindung zählt, ist das Bestimmen des Expressionsniveaus dieses WT1-Gens in einem Testgewebe oder einer CD34-negativen Zellfraktion davon, und dies ist die herausragendste Eigenschaft, die von den zahlreichen hier offenbarten Methoden geteilt wird.
  • Jedoch ist die Technik zum Bestimmen des Expressionsniveaus von Genen im allgemeinen bekannt, wie beispielsweise aus der oben zitierten Literatur ersichtlich wird, und es gibt keine Beschränkung der Verfahren oder Protokolle, die zur Bestimmung des Expressionsniveaus des spezifischen Gens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Das heißt, dass nicht nur das RT-PCR-Verfahren, das in der obengenannten Literatur beschrieben ist, sondern auch andere bekannte Techniken oder Protokolle erfolgreich angewandt werden können.
  • Das Expressionsniveau des WT1-Gens kann spezifisch beispielsweise durch eine Technik zum Nachweisen eines Transkripts des WT1-Gens in einem Testgewebe bestimmt werden oder mit der Technik zum Nachweisen eines Translationsproduktes daraus. Gemäß der vorherigen Technik wird die mRNA als Transkript des WT1-Gens nachgewiesen, um das Expressionsniveau desselben Gens zu bestimmen, und dieser Nachweis kann erfolgreich durch diese RT-PCR, eine Northern-Blot-Analyse [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)], eine in situ RT-PCR [Nucleic Acids Res., 21, 3159–3166 (1993)] und eine in situ Hybridisierung durchgeführt werden, die Bestimmungen auf zellulärem Niveau sind, das NASBA-Verfahren [Nukleinsäuresequenz basierte Amplifizierung, Nature, 350, 91–92 (1991)] und andere Verfahren.
  • Gemäß der letztgenannten Technik wird das WT1-Protein, welches Translationsprodukt des WT1-Gens ist nachgewiesen, um das Expressionsniveau dieses Gens zu bestimmen, und diese Methodik kann beispielsweise in einem immunologischen Testverfahren unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen das WT1-Protein umgesetzt werden. Der spezifische Antikörper gegen das WT1-Protein kann hergestellt werden, indem notwendigerweise das WT1-Protein als Immunogen auf Routineweise verwendet wird [Leukemia, 9, 1060 (1995)].
  • Es gibt keine besondere Beschränkung der Testprobe, die verwendet werden kann, solange sie ein Transkript oder ein Translationsprodukt des WT1-Gens enthält. Zur Bestimmung des Transkripts können zahlreiche Gewebebestandteile, einschließlich der Zellen des Gewebes, die aus peripherem Blut stammen, aus Lymphknoten, aus Knochenmarkflüssigkeit, aus Pleuralflüssigkeit, Aszites, cerebrospinaler Flüssigkeit, chirurgischen Waschungen, isolierten Geweben, Haar und anderen Geweben verwendet werden. Zur Bestimmung des Translationsproduktes können nicht nur die oben erwähnten Gewebsbestandteile, sondern auch zahlreiche Körperflüssigkeiten, aus denen sie stammen, verwendet werden.
  • Die Ergebnisse der Bestimmung des Transkripts oder Translationsproduktes des WT1-Gens in solchen Proben werden mit den Niveaus der WT1-Genexpression in den entsprechenden Testgeweben korreliert, wodurch eine notwendige Bestimmung des Expressionsniveaus des WT1-Gens ermöglicht wird.
  • Sobald das Niveau der WT1-Genexpression höher ist als in normalen Zellen oder gesunden Menschen, können die Zellen, das Gewebe oder das fragliche Individuum als solide Tumorzellen oder ein Gewebe oder ein Individuum, das diese enthält, angesehen werden, oder als atypisch oder solche, die eine Atypie aufweisen, betrachtet werden. Auf diese Weise werden solide Tumorzellen und eine Atypie gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen. Deswegen ist die erfindungsgemäße Technik nicht nur von großem Wert bei der klinischen Untersuchung und Diagnose solider Tumoren, sondern, durch die Ermöglichung einer positiven Überwachung der leukämischen Transformation bei Patienten, beweist sie einen hohen Wert bei der klinischen Untersuchung und Diagnose von Atypien.
  • Eine Ausführungsform der Technik zum Nachweisen solider Tumorzellen und einer Atypie gemäß der Erfindung durch die Bestimmung eines Transkripts des WT1-Gens wird nun im Detail beschrieben.
  • Wie bereits unter Bezugnahme auf den Stand der Technik erwähnt wurde, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung über den Nachweis leukämischer Zellen durch Bestimmung des Niveaus der WT1-Genexpression berichtet [Blood, Band 84, Nr. 9, Seite 3071 (1994)]. Die dort zur Bestimmung des Niveaus der WT1-Genexpression mittels RT-PCR und Northern-Blot-Analyse beschriebenen Verfahren können jeweils beide mit Erfolg zum Nachweis gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die detaillierten Protokolle werden in der obengenannten Literatur beschrieben und werden hiermit durch Bezugnahme in diese Beschreibung eingeschlossen.
  • Jetzt kann die RNA der Probe extrahiert werden, gereinigt werden und auf konventionelle Weise hergestellt werden. Wenn der Nachweis eines Transkripts des WT1-Gens, das in dieser RNA enthalten ist, mittels Northern-Blot durchgeführt wird, gibt es keine Beschränkung hinsichtlich der Nachweissonde, die verwendet werden kann, solange sie das WT1-Gen oder ein Fragment davon enthält, und eine ausreichende Spezifität besitzt, um einen Nachweis unter Nachweisbedingungen zu erlauben, die in einem Hybridisierungsverfahren mit einer Test-RNA-Probe verwendet werden. Das heißt, dass die Sonde das WT1-Gen, Fragmente, die durch die Spaltung mit Restriktionsenzymen sowie Oligonukleotide, die chemisch synthetisiert wurden, gemäß der Basensequenz des WT1-Gens einschließen.
  • Wenn eine RT-PCR verwendet wird, sind die Primer, die verwendet werden, in dem amplifizierten Bereich oder der Basenlänge nicht kritisch, als alles notwendige darin liegt, dass sie in der Lage sind, das WT1-Gen selbst zu amplifizieren. Sie werden bevorzugt so entworfen, dass die gesamte Zink-Finger-Domäne des WT1-Gens enthalten ist, und im allgemeinen kann der Primer eine Teilsequenz von ungefähr 15 bis 30 Nukleotiden umfassen. Ein solches Primer-Set kann routinemäßig hergestellt werden, und ein bevorzugtes Beispiel wird in dem nachfolgenden Beispiel dargestellt.
  • Die zahlreichen Verfahren, die in der Nachweistechnik der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wie beispielsweise die chemische Synthese eines Teilgens, die enzymatischen Behandlungen zur Spaltung, Deletion, Addition oder Ligation davon und die Isolierung, Reinigung, Replizierung und Auswahl davon können alle auf konventionelle Weise durchgeführt werden [z.B. Bunshi Idengaku Jikken Ho (Experimental Protocols in Molecular Genetics), Kyoritsu Shuppan, 1983; PCR Technology, Takara Shuzo, 1990].
  • Darstellend für die oben erwähnte Isolierung und Reinigung kann diese mittels Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt werden, und die Basensequenzierung kann beispielsweise durch das Dideoxyverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463–5467 (1977)], das Maxam-Gilbert-Verfahren [Method in Enzymology, 65, 499–560 (1980)] oder ähnliche gemacht werden. Das Letztgenannte kann leicht unter Verwendung eines kommerziellen Sequenzier-Kits durchgeführt werden. Eine PCR kann ebenfalls unter Routinebedingungen durchgeführt werden [z.B. Science, 230, 1350–1354 (1985)]. Diese grundlegenden Protokolle werden in zahlreichen Berichten, auf die sich diese Beschreibung bezieht, ebenfalls verwendet und zusammen mit dem nachfolgenden Beispiel können sie als Referenzen zurate gezogen werden.
  • Beim Durchführen der Nachweistechnik der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft, einen Soliden-Tumor- und einen Atypie-Detektionskit zu verwenden, welcher geeignete Reagenzien zum Bestimmen des Expressionsniveaus des WT1-Gens als aktive Inhaltsstoffe enthält.
  • Der Nachweis-Kit sollte spezifische Reagenzien enthalten, die auf das spezifische Verfahren zum Bestimmen des Expressionsniveaus des WT1-Gens als wesentliche Bestandteile zugeschnitten sind. Solche spezifischen Reagenzien werden entsprechend ausgewählt und gemäß des verwendeten besonderen Nachweisprotokolls etabliert, und sie werden als Reagenzien definiert, die für die Mittel für einen spezifischen Nachweis des Ziels gemäß der Erfindung notwendig sind, unter anderem beispielsweise einen anti-WT1-Protein-Antikörper, eine Nachweissonde für das WT1-Gentranskript und/oder das entsprechende Primer-Set. Des weiteren können für die PCR ebenfalls Reagenzien in dem Kit eingeschlossen sein, wie auch beispielsweise Reagenzien für die Hybridisierung, obwohl diese nicht als wesentliche Bestandteile solch eines Nachweis-Kits angesehen werden. Die vorliegende Erfindung stellt deswegen einen Kit zum Nachweis von soliden Tumorzellen und Atypie sowie einen Kit zur Krebsdiagnose bereit.
  • Das Verfahren zum Testen von Geweben für eine Transplantation von Knochenmark oder eine Transplantation peripherer Blutstammzellen wird nun im Detail beschrieben. Dieses Testverfahren umfasst die Bestimmung des Niveaus der WT1-Expression in einer CD34-Zellfraktion, die durch die Eliminierung der CD34+-Zellen aus dem Transplantatmaterial erhältlich wird.
  • Die Bestimmung des Expressionsniveaus des WT1-Gens kann durchgeführt werden, indem eine Vielzahl an Techniken verwendet wird, wie gerade die zuvor beschriebene Methode zum Nachweisen solider Tumorzellen und Atypien.
  • Die für diesen Test zu verwendende Probe ist die CD34-Zellfraktion, die durch die Eliminierung der CD34+-Zellen aus jedem Gewebe zur Verwendung als Transplantatmaterial mit Hilfe einer gut bekannten geeigneten Technik erhältlich ist. Als Beispiele können Fraktionen peripherer Blutstammzellen, Knochenmarkflüssigkeit etc. erwähnt werden. Eine solche CD34-negative Zellfraktion kann durch ein Routineverfahren isoliert werden, typischerweise durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer CD34-Säule oder einer Substanz mit einer Affinität für CD34-Zellen, wie beispielsweise FACS oder einem magnetischen Zell-Separationsapparat. Die Säule, die typischerweise für dieses Verfahren verwendet werden kann, schließt unter anderem Ceparate (hergestellt von Cell-Pro), Isolex 300 und 50 (Baxter) und MaCS (Amzene) ein.
  • Das Auftrennungsverfahren unter Verwendung eines magnetischen Zell-Separationsapparats wird nun im Detail beschrieben. Zuerst wird das mobilisierte periphere Blut, das durch die Eliminierung von Plättchen, beispielsweise durch Zentrifugieren oder ähnlichen erhältlich ist, oder die Knochenmarkflüssigkeit, die nach Eliminierung mononukleärer Zellen mit Hilfe eines Ficoll-Packs oder ähnlicher und eine anschließende Zentrifugation erhältlich ist, mit dem Anti-CD34-monoklonalen Antikörper für die Sensibilisierung reagieren gelassen, und dann mit Dynabeads reagieren gelassen, an die ein Sekundär-Antikörper konjugiert worden ist, um eine Rosettenbildung auszulösen. Diese Rosette (positive Zelle-Antikörper-Dynabead-Komplex) wird magnetisch von den nicht-rosettenbildenden Zellen (negativen Zellen) getrennt. Aus der so erhaltenen Rosette können positive Zellen mittels einer enzymatischen Behandlung mit Chymopapain geerntet werden.
  • Es ist gefunden worden, dass diese Methode der Bestimmung des Niveaus der WT1-Genexpression in der obengenannten Probe, d.h. ein Transkript oder ein Translationsprodukt des WT1-Gens, einen Wert bereitstellt, der mit der erhältlichen Anzahl leukämischer Zellen oder solider Tumorzellen gut korreliert, und dass im Falle, dass dieser gemessene Wert nicht über 10–4 liegt, die Probe als im wesentlichen keine leukämische oder solide Tumorzellen enthaltend eingestuft werden kann. Deswegen können erfindungsgemäß das Vorhandensein leukämischer Zellen und solider Tumorzellen in ein Transplantatmaterial zur Transplantation getestet werden, und daher kann die Sicherheit des Transplantatmaterials gesichert werden.
  • In dem oben erwähnten Test für Transplantatmaterialien gemäß der Erfindung können Reagenzien, die ähnlich solchen sind, die bereits für den Nachweis-Diagnose-Kit für solide Tumorzellen und Atypien erwähnt wurden, verwendet werden und die vorliegende Erfindung stellt weiter einen derartigen Test-Kit für Transplantatmaterial bereit.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine diagrammartige Darstellung der Daten, die durch Bestimmung des Niveaus der WT1-Genexpression in zahlreichen Tumorzellen gemäß Beispiel 1 gewonnen wurden.
  • 2 ist eine diagrammartige Darstellung von Plots, die durch die Bestimmung des Niveaus der WT1-Genexpression bei zahlreichen Patienten gemäß Beispiel 2 erhalten wurden.
  • 3 ist eine diagrammartige Darstellung der Daten, die durch Bestimmung des Niveaus der WT1-Genexpression in zahlreichen CD34-negativen Zellfraktionen gemäß Beispiel 3 erzeugt wurden.
  • Beste Art der Durchführung der Erfindung
  • Die folgenden Beispiele sind für die vorliegende Erfindung weiter detailliert darstellend.
  • Beispiel 1
  • Nachweis solider Tumorzellen
  • Als solide Tumorzellen wurden die folgenden Zellinien, die aus verschiedenen Geweben stammen, verwendet. Die JCRB-Nummer jeder Zellinie ist jene, die von der Japanese Cancer Research Bank (JCRB) zugeordnet wurde.
  • Magenkrebs
    • (1) AZ-521 ... Magenkrebs (JCRB0061)
    • (2) MKN1 ... Magenkrebs, adenosquamöses Karzinom (JCRB0252)
    • (3) MKN28 ... Magenkrebs (JCRB0253)
  • Kolonkrebs
    • (4) LOVO ... Kolon-Adenokarzinom (Cancer Res., 36, 467–475 (1976))
    • (5) SW480 ... Kolon-Adenokarzinom (Cancer Res., 38, 3186–3190 (1978))
    • (6) SW620 ... Kolon-Adenokarzinom (Laboratory Investigation, 44, 309–323 (1981))
    • (7) COLO320DM ... Kolon-Adenokarzinom (Anticancer Res., 13, 2011–2019 (1993))
    • (8) HT29 ... Kolon-Adenokarzinom (Clinical Molecular Pathology, 48, M326-M332 (1995)).
  • Lungenkrebs
    • (9) OS1 ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom (Japanese J. Cancer Res., 81, 289–297 (1990))
    • (11) OS2R ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom (Cancer Res., 56, 354–358 (1996))
    • (12) OS3 ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom (Japanese J. Cancer Res., 81, 289–297 (1990))
    • (14) LU65A ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom (JCRB0054)
    • (15) LU65B ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom (JCRB0055)
    • (16) LU99B ... Lungenkrebs, Riesenzell-Karzinom (JCRB0057)
    • (17) LU99C ... Lungenkrebs, Riesenzell-Karzinom (JCRB0058)
    • (18) VMRC-LCP ... Lungenkrebs, squamöses Zellkarzinom (JCRB0103)
    • (19) LC6 ... Lungenkrebs, kleinzelliges Karzinom
    • (20) RERF-LC-MS ... Lungenkrebs, Adenokarzinom (JCRB0081)
  • Brustkrebs
    • (21) MDA MB231 ... Brustkrebs (Endocrinology, 129, 323–329 (1991))
    • (22) ZR75 ... Brustkrebs (Mol. Cell Endocr., 41, 197–204 (1985))
    • (23) YMB1 ... Brustkrebs (JCRB0823)
    • (24) T47D ... Brustkrebs (Endocrinology, 129, 323–329 (1991))
  • Keimzelltumor
    • (25) NEC8 ... Keimzelltumor (Hoden) (JCRB0250)
  • Eierstockkrebs
    • (26) TYK NU ... Eierstockkrebs, nicht differenziert (JCRB0234.0)
    • (27) TYK-nu. cp-r ... Eierstockkrebs, nicht differenziert (JCBR0234. 1)
  • Schilddrüsenkrebs
    • (28) Tumorzellen von Patienten mit Krebs der Schilddrüse
  • Das Expressionsniveau des WT1-Gens in diesen Zellinien wurde in Übereinstimmung mit dem Protokoll, das in der Literatur [Blood, 84(9), 3071 (1994)] beschrieben wurde, wie folgt bestimmt.
  • Das heißt, dass Gesamt-RNA aus jeder Zellinie durch ein Routineverfahren [z.B. Säure-Guanidin-Phenol-Chloroform-Verfahren; Anal. Biochem., 162, 156 (1987)] extrahiert wurde, in Diethylpyrocarbonat-behandeltem Wasser gelöst wurde und optisch bei 260 nm quantifiziert wurde.
  • Auf diese Weise wurden 15,5 μl Diethylpyrocarbonat-behandeltes Wasser, enthaltend 1 μg Gesamt-RNA bei 65°C für 5 Minuten erwärmt und mit 14,5 μl RT-Puffer gemischt (50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3), 70 mmol/l KCl, 3 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l Dithiothreitol), der 600 U Reverse Transkriptase (Moloney Maus-Leukämie-Virus-Reverse Transkriptase, GIBCO-BRL), 500 mmol/l jedes Deoxynukleotidtriphosphats (dNTP, Pharmacia), 750 ng Oligo-dT-Primerset und 40 U RNase-Inhibitor (Boehringer Mannheim) enthielt.
  • Dieses Gemisch wurde für 90 Minuten bei 37°C inkubiert, für 20 Minuten auf 70°C erwärmt und bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
  • Die PCR wurde auf einem DNA-Thermocycler (Perkin Elmer-Cetus) in einer Runde von Zyklen aus Denaturierung bei 94°C × 1 min, Primer-Anlagerung bei 64°C × 1 min (β-Actin: 60°C × 1 min) und Kettenverlängerung bei 72°C × 2 min durchgeführt, um ein PCR-Produkt bereitzustellen (PCR der ersten Runde).
  • Sofern die Densitometereinheit (unten beschrieben) dieses PCR-Produkts weniger als 500 betrug, wurde eine zweite PCR-Runde mit einem "nested" inneren Primersatz durchgeführt, in dem ein 2,5 μl Aliquot des Produkts der PCR der ersten Runde verwendet wurde.
  • Das so erhaltene PCR-Produkt wurde in Übereinstimmung mit dem Protokoll, das in der Literatur angegeben ist, wie folgt untersucht [J. Immunol., 147, 4307 (1991)].
  • Das heißt, dass das PCR-Produkt von 20 ng Gesamt-RNA auf ein 1,3 % Agarose-Gel, das 0,05 μg/ml Ethidiumbromid enthält, aufgetragen wurde und unter Verwendung eines Polaroidfilms (Polaroid 665 Film, Polaroid Corp.) fotografiert wurde.
  • Das Filmnegativ wurde bei 25°C für 5 Minuten entwickelt und mit einem Densitometer gescannt (CS-9000, Shimadzu), um die "Densitometereinheit" herauszufinden.
  • Das Ergebnis für das erhaltene PCR-Produkt in Abwesenheit von RNA unter ansonsten gleichen Bedingungen wurde als negative Kontrolle verwendet.
  • Die in den obengenannten Verfahren verwendeten Primer werden in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00180001
  • Als Primer für β-Actin, die als interne Kontrolle verwendet wurden, wurden solche verwendet, die in der Literatur beschrieben sind [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 6133, (1985)]. Die entsprechenden Primer wurden allesamt mit einem konventionellen chemischen Verfahren synthetisiert.
  • Um die Menge an RNA für die RT-PCR zu standardisieren und den Unterschied der RNA-Zersetzung der Proben zu standardisieren, wurde das Ergebnis (die Densitometereinheit) mit dem WT1-Gen durch das Ergebnis mit β-Actin geteilt, und der Wert wurde als Niveau der WT1-Expression verwendet.
  • Des Weiteren, indem das Niveau der WT1-Genexpression in der Zellinie K562, von der bekannt ist, dass sie das WT1-Gen exprimiert [Lozzio, C. B. und Lozzio, B. B., Human chronic myelogenous leukemia cell line with positive Philadelphia chromosome, Blood, 45, 321–334 (1995)], welches durch das oben erwähnte Verfahren bestimmt wurde, und als Referenz genommen wurde (1,00), wurden die Niveaus der WT1-Genexpression in zahlreichen Testzellen als relative Verhältnisse ausgerechnet.
  • Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt.
  • In der 1 stellt die Ordinate die relativen Verhältnisse der WT1-Genexpression in verschiedenen Zellinien dar, wobei das WT1-Genexpressions-Niveau in der Zellinie K562 (K562 in der Tabelle) als 1,00 genommen wird, während die Abszisse die Testzellen darstellt (Magenkrebs-, Kolonkrebs-, Lungenkrebs-, Brustkrebs-, Keimzelltumor-, Eierstockkrebs- und Schilddrüsenkrebszellen, die durch die zuvor angegebenen Nummern zugeordnet werden).
  • Aus 1 wird ersichtlich, dass WT1 in allen Magenkrebs-, Kolonkrebs-, Lungenkrebs-, Brustkrebs-, Keimzelltumoren-, Eierstockkrebs- und Schilddrüsenkrebszellen stark exprimiert wird, was darauf hindeutet, dass WT1 als Tumormarker für solche soliden Tumorzellen verwendet werden kann. Es ist daher klar, dass eine klinisch wertvolle, neue Detektion und Testtechnik für solide Tumore etabliert worden ist.
  • Beispiel 2
  • Nachweis von MDS
  • (1) Bestimmung des Niveaus der WT1-Genexpression
  • Das Niveau der WT1-Genexpression wurde in Übereinstimmung mit dem Protokoll bestimmt, das in der Literatur beschrieben wurde [Blood, 84(9): 3071, 1994].
  • Das heißt, dass das gesamte RNA aus jeder Probe mit einem Routineverfahren extrahiert wurde [Säure-Guanidin-Phenol-Chloroform-Verfahren, Anal. Biochem., 162, 156 (1987)], in Diethylpyrocarbonat-behandeltem Wasser gelöst wurde und optisch bei 260 nm quantifiziert wurde.
  • Dann wurden 15,5 μl Diethylpyrocarbonat-behandelten Wassers, enthaltend 1 μg Gesamt-RNA, bei 65°C für 5 Minuten erwärmt und mit 14,5 μl RT-Puffer gemischt (50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3), 70 mmol/l KCl, 3 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l Dithiothreitol), welcher 600 U Reverse Transkriptase enthält (Moloney-Maus-Leukämie-Virus-Reverse Transkriptase, GIBCO-BRL), 500 mmol/l jedes Deoxynukleotidtriphosphats (dNTP, Pharmacia), 750 ng Oligo-dT-Primerset und 40 U RNase-Inhibitor (Boehringer Mannheim). Dieses Gemisch wurde bei 37°C für 90 Minuten inkubiert, für 20 Minuten auf 70°C erwärmt und bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
  • Die PCR wurde auf einem DNA-Thermocycler (Perkin Elmer-Cetus) in einer Abfolge von Zyklen aus Denaturierung bei 94°C × 1 min, Primeranlagerung bei 64°C × 1 min β-Actin: 60°C × 1 min) und Kettenverlängerung bei 72°C × 2 min durchgeführt, um ein PCR-Produkt bereitzustellen (PCR der ersten Runde).
  • Wenn eine Densitometereinheit (unten beschrieben) dieses PCR-Produkts weniger als 500 betrug, wurde eine PCR der zweiten Runde mit einem inneren "nested" Primerset unter Verwendung eines 2,5 μl Aliquots des PCR-Produkts der ersten Runde durchgeführt.
  • Das PCR-Produkt, das auf diese Weise erhalten wurde, wurde in Übereinstimmung mit dem Protokoll untersucht, das in der Literatur wie folgt angegeben ist [J. Immunol., 147, 4307 (1991)].
  • Das heißt, dass das PCR-Produkt aus 20 ng Gesamt-RNA auf einem 1,3%igen Agarosegel, enthaltend 0,05 μg/ml Ethidiumbromid aufgetragen wurde und unter Verwendung eines Polaroidfilms (Polaroid 665-Film, Polaroid Corp.) fotografiert wurde. Das Filmnegativ wurde bei 25°C für 5 Minuten entwickelt und mit einem Densitometer (CS-9000, Shimadzu) gescannt, um eine "Densitometereinheit" zu finden. Das Ergebnis für das erhaltene PCR-Produkt in Abwesenheit von RNA unter ansonsten gleichen Bedingungen wurde als negative Kontrolle verwendet.
  • Die in den obigen Verfahren verwendeten Primer werden in Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2
    Figure 00210001
  • Wie bei den Primern für β-Actin, die als interne Kontrolle verwendet wurden, wurden diejenigen, die in der Literatur beschrieben sind [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 6133, (1985)], verwendet. Die entsprechenden Primer wurden jeweils durch ein konventionelles chemisches Verfahren synthetisiert.
  • Um die Menge der RNA für die RT-PCR und den Unterschied der RNA-Zersetzung der Proben zu standardisieren, wurde das Ergebnis (Densitometereinheit) mit dem WT1-Gen durch das Ergebnis mit β-Actin geteilt, und der Wert wurde als Niveau der WT1-Genexpression verwendet. Des weiteren wurde mit dem Niveau der WT1-Genexpression in der Zellinie K562, von der bekannt ist, dass die das WT1-Gen exprimiert [Lozzio, C. B. und Lozzio, B. B., Human chronic myelogenous leukemia cell line with positive Philadelphia Chromosom, Blood, 45, 321–334 (1995)], welche gemäß dem obigen Verfahren bestimmt wurde, als Referenz von 1,00 genommen, die Niveaus der WT1-Genexpression in den verschiedenen Proben als relative Verhältnisse berechnet.
  • Von 18 MDS-Patienten (TA, UE, FU, TK, TN, CH, NA, MI, SH, AO, NO, SZ, HA, SO, UR, MK, UK und TS), 2 Myelofibrose-Patienten (MY und MA), einem Leukozytose-Patienten (NB), einem Patienten mit aplastischer Anämie (YA), einem Patienten mit Polycythemie vera (ALS), einem Eosinophilie-Patienten (MS) und 2 Patienten mit primärer Thrombozytose (GO und FS) oder einer Gesamtzahl von 26 Patienten wurden Knochenmark und peripheres Blut gewonnen, und das Niveau der WT1-Genexpression in jeder Probe wurde mit dem oben beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt.
  • Aufgetragen (auf die Abszisse) in der 2 sind die relativen Werte des Niveaus der WT1-Genexpression in jeder Probe, wobei das Niveau der WT1-Genexpression in der K562-Linie als 1,00 genommen wurde.
  • Das relative Niveau der WT1-Genexpression in dem normalen Knochenmark (8,0 × 10–4) wird als Referenzlinie auf der Abszisse aufgetragen. Die eingekreisten Patienten in dem Diagramm starben anschließend.
  • Hinsichtlich der 5 MDS-Patienten (CH, NO, SZ, SO und MK) sind die Niveaus der WT1-Genexpression, die durch die Wiederbestimmung, die 3 Monate (CH), 1 Jahr (NO), 6 Monate (SZ), 3 Monate (SO) und 2 Monate (MK) jeweils nach der anfänglichen Bestimmung durchgeführt worden sind in dem Pfeil gezeigt.
  • Folgendes kann aus 2 gesehen werden.
  • Nämlich, dass die MDS-Patienten NO (nach 1 Jahr), SZ (nach 6 Monaten) und SO (nach 3 Monaten), die gleichermaßen hoch gemessene Werte in der Anfangsbestimmung gezeigt hatten, progressiv in einer kurzen Zeit atypisch wurden und schließlich an einer leukämischen Transformation verstarben.
  • Andererseits zeigten die MDS-Patienten TA, AO und TS niedrige Niveaus der WT1-Genexpression und blieben klinisch stabil, d.h., dass sie Fälle mit einem niedrigen Risiko einer leukämischen Transformation waren.
  • Das bedeutet, dass in Übereinstimmung mit der erfindungsgemäßen Technik nicht nur der Nachweis einer Atypie möglich gemacht wird, sondern auch das Risiko einer leukämischen Transformation bei MDS-Patienten vorhergesagt werden kann, indem ein serieller Nachweis des Niveaus der WT1-Genexpression durchgeführt wird.
  • Beispiel 3
  • Test von Transplantatmaterialien
  • Als Transplantatmaterialien für eine Transplantation peripherer Blutstammzellen wurden periphere Blutstammzellen aus verschiedenen Patienten isoliert, denen Granulozyten- Kolonien-stimulierender Faktor (G-CSF; "Gran", Produkt von Kirin-Sankyo, oder "Neutrogin", Produkt von Chugai) zuvor verabreicht worden ist (autologe periphere Blutstammzellen-Transplantation: 2 μg/kg Körpergewicht × 3 bis 7 Tage; allogene periphere Blutstammzell-Transplantation: 10 μg/kg Körpergewicht × 7 Tage). Von den isolierten peripheren Blutstammzellen wurden die CD34-Zellen abgetrennt und unter Verwendung eines Zell-Trennungssystems gewonnen (Isolex 50, Produkt von Baxter) [z.B. J. Hematotherapy, 4, 531–438 (1995)].
  • Dieses Verfahren wurde in Übereinstimmung mit dem Handbuch des Herstellers durchgeführt. Die Zellen wurden zuerst mit einem Anti-CD34-monoklonalen Antikörper umgesetzt und dann mit Dynabeads reagieren gelassen, die mit einem Sekundärantikörper zur Rosettenbildung konjugiert waren. Diese Rosette (positive Zellen-Antikörper-Dynabeads-Komplex) wird von den nicht-rosettenbildenden Zellen (negative Zellen) abgetrennt. Von dieser Rosette können die positiven Zellen durch eine enzymatische Behandlung mit Chymopapain gewonnen werden.
  • Das Expressionsniveau des WT1-Gens in der CD34-Fraktionen dieser Patienten wurde in Übereinstimmung mit dem in der Literatur beschriebenen Protokoll [Blood, 84(9), 3071 (1994)] wie folgt bestimmt.
  • Das heißt, dass das gesamte RNA aus jeder Fraktion mit einem Routineverfahren extrahiert wurde [z.B. Säure-Guanidin-Phenol-Chloroform-Verfahren; Anal. Biochem., 162, 156 (1987)], in Diethylpyrocarbonat-behandeltem Wasser gelöst wurde und optisch bei 260 nm quantifiziert wurde.
  • Auf diese Weise wurden 15,5 μl Diethylpyrocarbonat-behandelten Wassers, enthaltend 1 μg Gesamt-RNA bei 65°C für 5 Minuten erwärmt und mit 14,5 μl RT-Puffer gemischt (50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3), 70 mmol/l KCl, 3 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l Dithiothreitol), enthaltend 600 U Reverse Transkriptase (Moloney-Maus-Leukämievirus Reverse Transkriptase, GIBCO-BRL), 500 mmol/l jedes Deoxynukleotidtriphosphats (dNTP, Pharmacia), 750 ng Oligo-dT-Primerset und 40 U RNase-Inhibitor (Boehringer Mannheim). Dieses Gemisch wurde bei 37°C für 90 Minuten inkubiert, bei 70°C für 20 Minuten erwärmt und bei –20°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
  • Eine PCR wurde mit Hilfe eines DNA-Thermocyclers (Perkin Elmer-Cetus) in einer Runde von Zyklen aus Denaturierung bei 94°C × 1 min, Primeranlagerung bei 64°C × 1 min (β-Actin: 60°C × 1 min) und Kettenverlängerung bei 72°C × 1 min durchgeführt, um ein PCR-Produkt hervorzubringen (PCR der ersten Runde).
  • Wenn die Densitometereinheit (unten beschrieben) dieses PCR-Produkts weniger als 500 betrug, wurde eine PCR der zweiten Runde mit einem inneren "nested" Primer-Set durchgeführt, indem ein 2,5 μl Aliquot des PCR-Produktes der ersten Runde verwendet wurde.
  • Das PCR-Produkt, das auf diese Weise erhalten wurde, wurde in Übereinstimmung mit dem Protokoll, das in der Literatur angegeben ist [J. Immunol., 147, 4307 (1991)] wie folgt bestimmt.
  • Das bedeutet, dass das PCR-Produkt aus 20 ng Gesamt-RNA auf einem 1,3%igen Agarosegel, enthaltend 0,05 μg/ml Ethidiumbromid, aufgetragen wurde und unter Verwendung eines Polaroid-Films (Polaroid 665-Film, Polaroid Corp.) fotografiert wurde. Das Filmnegativ wurde bei 25°C für 5 Minuten entwickelt und mit Hilfe eines Densitometer gescannt (CS-9000, Shimadzu), um eine "Densitometereinheit" zu finden. Das Ergebnis des PCR-Produkts, das in Abwesenheit von RNA unter ansonsten gleichen Bedingungen erhalten wurde, wurde als negative Kontrolle verwendet. Die in den obengenannten Verfahren verwendeten Primer werden in Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3
    Figure 00260001
  • Als Primer für β-Actin, die als interne Kontrolle verwendet wurde, wurden solche, die in der Literatur beschrieben sind [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 6133, (1985)], verwendet. Die entsprechenden Primer wurden jeweils durch ein konventionelles chemisches Verfahren synthetisiert.
  • Um die Menge an RNA für die RT-PCR und den Unterschied der RNA-Zersetzung der Proben zu standardisieren, wurde das Ergebnis (Densitometereinheit) mit dem WT1-Gen durch das Ergebnis mit β-Actin geteilt, und das Produkt wurde als Niveau der WT1-Genexpression verwendet.
  • Außerdem wurde durch das Niveau der WT1-Genexpression in der Zellinie K562, von der bekannt ist, dass sie das WT1-Gen exprimiert [Lozzio, C. B. und Lozzio, B. B., Human chronic myelogenous leukemia cell line with positive Philadelphia chromosome, Blood 45, 321–334 (1995)], welche durch das obige Verfahren bestimmt wurde als Referenz (1.00) genommen, die die Niveaus der WT1-Genexpression in den zahlreichen Testfraktionen wurden als relative Verhältnisse berechnet.
  • Die Ergebnisse werden in 3 dargestellt.
  • Auf die Ordinate aufgetragen, sind die relativen Niveaus der WT1-Genexpression in den zahlreichen Testzellen (CD34-Zellfraktionen), wobei das Niveau der WT1-Genexpression in der K562-Zellinie (K562 in der Tabelle) als 100 genommen wird.
  • Die getesteten Zellen waren wie folgt.
    (1)–(4) ... Die CD34-Zellfraktion peripherer hämatopoetischer Blut-Stammzellen von Patienten
    (5)–(9) ... Die CD34-Zellfraktion leukämischer Zellen
    (10) ... Die CD34-Zellfraktion von Magenkrebs-Zellen
    (11), (12) ... Die CD34-Zellfraktion von Kolonkrebs-Zellen
    (13), (14) ... Die CD34-Zellfraktion von Lungenkrebs-Zellen
    (15) ... Die CD34-Zellfraktion von Brustkrebs-Zellen
    (16), (17) ... Die CD34-Zellfraktion von Eierstockkrebs-Zellen
  • Folgendes kann aus dem Diagramm ersehen werden. Frische leukämische Zellen umfassen nämlich CD34+- und CD34-Zellen, von denen beide das WT1-Gen in hohen Niveaus exprimieren [10–1- bis 100-Niveau: siehe (5)–(9)]. Andererseits exprimieren die CD34-Zellfraktionen normaler hämatopoetischer Stammzellen das WT1-Gen auf niedrigen Niveaus, ≤ 10–4 [(1)–(4); jedoch ist das Niveau der WT1-Expression in diesen Zellen hoch].
  • Wenn die CD34-Zellfraktion einer isolierten Probe hämatopoetischer Stammzellen leukämische Zellen enthält (welche CD34 sind), sollte das WT1-Niveau in diesen Zellen erhöht sein. Deswegen können durch die Bestimmung des WT1-Werts dieser CD34-Zellfraktion leukämische Zellen nachgewiesen werden, vorausgesetzt, dass eine leukämische Zelle unter 103 bis 104 normalen Zellen vorhanden ist. Wenn das Vorhandensein leukämischer Zellen in der CD34-Zellfraktion der hämatopoetischen Zellprobe dadurch durch das obige Nachweisverfahren bestätigt wird, ist es sicher, dass die CD34+-Zellfraktion der hämatopoetischen Stammzellen in dem Transplantatmaterial auch leukämische Zellen enthält, was darauf hindeutet, dass die Verwendung solcher Zellen für die Transplantation aus Sicherheitsgründen vermieden werden sollte.
  • Bezugnehmend auf solide Tumorzellen, die intrinsisch CD34-negativ sind, ist es klar, dass wenn eine Probe hämatopoetischer Stammzellen mit Tumorzellen kontaminiert worden ist, die meisten in der CD34-Zellfraktion vorhanden sein sollten. Deswegen kann durch die Bestimmung des WT1-Wertes dieser Fraktion das Auftreten von Tumorzellen auf gleiche Weise nachgewiesen werden.
  • Das heißt, dass in Übereinstimmung mit der Technik der vorliegenden Erfindung das Vorhandensein oder die Abwesenheit leukämischer Zellen oder Tumorzellen in einem Transplantat-Gewebematerial mit Sicherheit bestätigt werden kann.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird eine Technik zum Nachweisen solider Tumorzellen und Atypien bereitgestellt und eine Technik zum Testen von Transplantatmaterial. Diese Technologien sind von großem klinischem Nutzen, da sie den Nachweis und die Diagnose solider Tumore erlauben und eine Vorhersage des Risikos einer leukämischen Transformation oder die Prognose zahlreicher Erkrankungen, von denen bekannt ist, dass sie in eine Leukämie voranschreiten, wie beispielsweise MDS oder eine Bestätigung der Sicherheit der Transplantatmaterialien.
  • Besonders ist die Technologie zum Nachweisen solider Tumorzellen gemäß der Erfindung für die Aufklärung des etiologischen Mechanismus und der Pathologie verschiedener solider Tumore und der Diagnose solcher Erkrankungen von Nutzen. Genauer gesagt ermöglicht die vorliegende Erfindung
    • 1. die Diagnose der Bösartigkeit einer Läsion,
    • 2. die Diagnose einer Tumorzell-Invasion in das Gewebe einschließlich einer primären Läsion und einer Tumor-Metastasierung in entfernte Organe, einschließlich des Knochenmarks oder der Lymphknoten,
    • 3. die Diagnose von Tumorzellen in verschiedenen Körperflüssigkeiten, Pleuralflüssigkeit und Aszites,
    • 4. den Nachweis von Tumorzellen im peripheren Blut, und
    • 5. den Nachweis von Tumorzellen in isoliertem Knochenmark oder peripherer Blutstammzellfraktionen für die Transplantation von Knochenmark oder die Transplantation von peripheren Blutstammzellen.
  • Des weiteren haben die vorstelligen Erfinder bis jetzt Beweise für das Vorhandensein eines WT1-Gens vom hohen Expressionstyp und niedrigen Expressionstyp in zahlreichen Keimzelltumoren gewonnen und deswegen ermöglicht das WT1-Gen eine neue Klassifizierung der Bösartigkeit von Keimzelltumoren und anderer solider Tumore. Der Nachweis einer solchen Differenz der Eigenschaft solider Tumore sollte einen klinisch nützlichen Marker der Bösartigkeit oder ähnlicher, insbesondere bei Keimzelltumoren bereitstellen, die nicht pathologisch differenziert werden können.

Claims (6)

  1. In vitro-Verfahren zum Nachweis von Zellen solider Tumore, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Magen-, Kolon-, Lungen-, Brust-, Hodenkeimzellkrebs und Schilddrüsenkrebszellen, umfassend die Bestimmung einer Zunahme des Expressionsniveaus des WT1-Gens in einem Probengewebe, um die Zellen solider Tumore nachzuweisen.
  2. Nachweisverfahren gemäss Anspruch 1, worin das Expressionsniveau des WT1-Gens anhand eines Transkripts von besagtem Gen bestimmt wird.
  3. Verfahren zum Nachweis von Atypie, umfassend die Bestimmung des Expressionsniveaus des WT1-Gens in einem Probengewebe, um dadurch Atypie nachzuweisen.
  4. Nachweisverfahren gemäss Anspruch 3, worin das Probengewebe von einem Patienten mit myelodysplastischem Syndrom stammt.
  5. Nachweisverfahren gemäss Anspruch 3 oder 4, worin das Expressionsniveau des WT1-Gens anhand eines Transkripts von besagtem Gen bestimmt wird.
  6. Verfahren zum Testen von Transplantatgewebematerial für die Knochenmarktransplantation oder Transplantation peripherer Blutstammzellen, umfassend die Bestimmung des Expressionsniveaus des WT1-Gens in einer CD34-Zellfraktion von besagtem Transplantatgewebematerial, um leukämische Zellen und Zellen solider Tumore in dem Gewebe nachzuweisen.
DE69733629T 1996-04-16 1997-04-15 Verfahren zum nachweis solider krebszellen und histologischer heterotypien und verfahren zur prüfung von gewebe für die knochenmarktransplantation und die transplantation von peripheren blutstammzellen Expired - Lifetime DE69733629T2 (de)

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