KR100262838B1

KR100262838B1 - 고형암세포및조직이형성의검출방법,및골수이식및말초혈간세포이식용조직의검사방법

Info

Publication number: KR100262838B1
Application number: KR1019970709409A
Authority: KR
Inventors: 하루오 스기야마; 가즈시 이노우에
Original assignee: 기시모토 다다미쓰; 하루오 스기야마
Priority date: 1996-04-16
Filing date: 1997-04-15
Publication date: 2003-03-15
Also published as: DE69733629T2; ATE298887T1; ES2242221T3; KR19990022939A; TW562928B; US6225051B1; DE69733629D1; EP0846949A4; EP0846949B1; CA2224970A1; WO1997039354A1; CA2224970C; JP3122771B2; EP0846949A1

Abstract

본 발명은 피검조직에 있어서의 WT1 유전자의 발현레벨을 측정하므로써 고형암세포를 검출하는 고형암 세포의 검출방법, 피검조직에 있어서의 WT1 유전자의 발현레벨을 측정하여 상기 조직의 이형성을 검출하는 이형성 검출방법 및 이식용 조직에 있어서의 CD34^-세포분획중의 WT1 유전자 발현레벨을 측정하여 이 조직내의 백혈병세포 및 고형암세포를 검출하는 골수이식 및 말초 혈간세포 이식용 조직의 검사방법을 제공한다.

Description

고형암세포 및 조직 이형성의 검출방법, 및 골수이식 및 말초 혈간세포 이식용 조직의 검사방법{METHOD OF DETECTING SOLID CANCER CELLS AND HISTOLOGICAL HETEROTYPIA AND METHOD OF EXAMINING TISSUE FOR BONE MARROW TRANSPLANTATION AND PERIPHERAL BLOOD STEM CELL TRANSPLANTATION}

WT1 유전자는 윌름(Wilms)종양, 무홍채, 비뇨생식기이상, 정신발달지연 등을 포함하는 WAGR 증후군의 분석으로부터, 윌름종양의 원인유전자의 하나로서, 인간 염색체 11p13으로부터 단리된 유전자이고, 그 발현은 태아기의 신장, 비장, 정소, 난소등에 국한된다고 알려져 있다[Molecular Medicine, Vo1. 32, No. 5, p.502(l995)등].

본 발명자들은 상기 WT1 유전자의 발현레벨이 급성 백혈병에서 높고, 그 발현레벨이 예후와 반비례하는 점 및 이 발현레벨을 측정하므로써 급성 백혈병의 MRD(미소잔존 백혈병세포)를 검출할 수 있다는 점을 이미 보고했다[Blood, Vol. 84, No. 9, p3071(l994)]. 이 발현레벨의 측정은 잘 알려져 있는 RT-PCR(Reverse Transcribed-Polymerase Chain Reaction, Kawasaki, E. S., et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27(1991))에 따라 행해졌으며, 이 WT1 유전자의 발현레벨의 측정은 상기 백혈병에 관해서 임상적으로 중요한 의의를 지니고 있었다.

한편, 고형암이라는 것은 종양세포가 괴상의 충실성 세포로 증식하는 것을 말하며, 이것은 각각의 종양세포가 유리되어 증식, 침윤, 전이하는 백혈병과는 명확히 구별된다.

종래부터, 이러한 고형암에 관해서도 다양한 연구가 진행되고 있지만, 상기 백혈병에 있어서의 WT1 유전자에 상당하는 임상적 지표는 아직 보고되어 있지 않다.

또 한편, 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndrome: MDS)은 전백혈병적 성격과 치료불응성의 말초혈구감소를 나타내는 후천적 조혈장해이고, 그 확정진단은 혈구형태의 이상에 따르고 있고, 병형확정에는 FAB 기준(French-American-British Group 분류)이 사용되고 있다.

상기 MDS는 고비율로 급성 백혈병화한다고 알려져 있으며, 위험성이 높은 군에서 40% 이상, 위험성이 낮은 군에서도 l0 내지 15%가 급성 백혈병화한다고 여겨지고 있다.

상기 MDS의 예후와 예후인자로서는, 상기 FAB 분류가 알려져 있고, 급성 백혈병화의 위험은 골수나 말초혈의 높은 아구(芽球)비율, 골수생검에서의 아구의 집괴, 복잡한 염색체이상이 있는 경우등으로 되어 있다[내과학, p. 1711, l995년 9월 25일, (주) 아사쿠라서점 발행, 참조].

마찬가지로 백혈병화된다고 여겨지는 질환으로서는, 골수섬유증, 진성다혈증, 재생불량성 빈혈, 원발성 혈소판증다증, 발작성 야간혈색소요증등이 알려져 있지만, 상기 MDS를 비롯한 각종 백혈병화되는 질환, 즉, 정상조직 내지 세포와는 다른 형태학적 특징을 갖는 이형성의 검출기술은 아직 확립되어 있지 않다.

그런데, 백혈병환자등의 치료에 있어서는 환자의 면역반응과 함께 동종골수이식(allogeneic bone marrow transplantation: alloBMT), 즉, 조혈 간세포의 수주에 의해서 비가역적 조혈장해를 회피하는 동시에 항암제, 방사선투여등을 행하여 백혈병세포를 근절시켜서 완전치유시키는 치료법이, 양호한 성적을 거두고 있다. 또한 최근, 상기 골수이식의 하나인 자가골수이식(autologous bone marrow transplantation: ABMT)을 대신하여 자가 말초 혈간세포 이식(peripheral blood stem cel1 transplantation: PBSCT 또는 autologous blood stem cell transplantation: ABSCT)이 보다 뛰어난 점이 많기 때문에 급속하게 발전되고 있다.

이들 골수 내지 말초 혈간세포 이식에 의하면, HLA 항원이 실질적으로 또는 완전히 일치하는 공여자에서 채취된 골수세포 내지 말초 혈간세포가 환자에게 수주되고, 그 속에 포함되는 조혈 간세포가 골수에서 간질세포·조혈인자의 힘을 빌려 정상조혈을 개시하여 조혈회복이 이루어진다. 이러한 골수 내지 말초 혈간세포이식은 백혈병에 대하여 우수한 성적을 나타내기는 하지만, 또한, 공여자를 찾기 어려운 점이나 이식관련 합병증의 발생 문제 외에도, 이식후의 재발이라는 매우 중대한 문제가 따른다.

그리고, 상기 재발등의 문제를 극복하기 위해서는 우선 이식조직세포자체에 백혈병세포등의 암세포가 포함되지 않을 것, 즉, 공여자의 골수나 말초 혈간세포가 안전할 것이 그 가장 기본적인 요건이 되지만, 현재, 이러한 골수 내지 말초 혈간세포중에 백혈병세포가 존재하는지 아닌지를 검사하는 기술은 확립되어 있지 않다.

발명의 요약

따라서, 본 발명의 한 목적은, 고형암의 진단등에 유효한 고형암세포의 측정기술, 특히 고형암에 상관된 임상적 지표를 이용한 상기 측정기술을 제공하는데에 있다.

본 발명의 다른 목적은, 특히 MDS의 경과, 예후등을 고려하여, 보다 적확하게 급성 백혈병화의 위험등을 파악할 수 있는 새로운 지표를 이용한 이형성의 검출기술을 제공하는데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 골수이식 내지 말초 혈간세포이식에 이용되는 조직중의 백혈병세포를 검출가능하게 하는 신규한 기술을 제공하는데에 있다.

본 발명은 고형암세포 및 조직 이형성의 검출방법과 골수이식 및 말초 혈간세포 이식용 조직의 검사방법에 관한 것이고, 보다 상세하게는 각종 고형암의 진단 내지 검출이나 골수 이형성 증후군등의 이형성의 검출에 유용하며, 또한 백혈병 및 고형암 환자의 동종 골수이식이나 자가조혈 간세포 이식 등에 있어서의 이식세포의 안전성, 특히 이식후의 재발 위험성의 검사 및 파악에도 유용한 신규한 방법에 관한 것이다.

도 1은 실시예 1에 따라서 각종 암세포의 WT1 유전자 발현레벨을 구한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 실시예 2에 따라서 각종 환자의 WT1 유전자 발현레벨을 측정하고 플로트한 그래프이다.

도 3은 실시예 3에 따라서 각종 CD34^-세포분획의 WT1 유전자 발현레벨을 구한 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명자들은 상기 목적에 의해 예의 연구한 결과, 백혈병의 임상적 지표로서 공지된 WT1 유전자가, 상기 백혈병과는 관련없는 고형암에 있어서도, 상당히 높은 발현레벨을 갖는 것을 처음으로 발견하고, 이를 이용하면 고형암 세포의 검출에 유효하다는 것을 알았다.

또한, 본 발명자들은 백혈병과는 명확히 구별되는 MDS 이외의 이형성에 있어서도 WT1 유전자의 발현레벨이 높고, 더우기 상기 이형성에 있어서의 WT1 유전자발현레벨이 급성백혈병화의 지표가 될 수 있다는 것을 발견했다.

게다가, 본 발명자들은 이식용 조직중의 CD34⁺세포분획에 있어서의 WT1 유전자 발현레벨은 백혈병세포 혼입의 지표로는 될 수 없지만, CD34^-세포분획의 WTl 유전자 발현레벨이 백혈병세포 및 고형암 세포 혼입의 지표가 될 수 있고, 이 레벨의 측정에 의해 백혈병세포 및 고형암 세포의 검출이 가능해진다는 것을 발견했다. 본 발명은 이러한 신규한 사실을 근거로하여 완성된 것이다.

본 발명에 따르면, 피검조직에 있어서의 WTl 유전자의 발현레벨을 측정하므로써 고형암 세포를 검출하는 것을 특징으로 하는 암세포의 검출방법이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 피검조직에 있어서의 WT1 유전자의 발현레벨을 측정하여 이 조직의 이형성을 검출하는 것을 특징으로 하는 이형성의 검출방법이 제공된다.

특히, 이 이형성의 검출방법은, 피검조직이 골수이형성 증후군의 피검조직이고, WT1 유전자의 발현레벨의 측정이 그 전사물의 측정에 의해 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 여기에서, 이형성(atypia)이란 정상적인 조직 및 세포와 형태학적으로 다른 것을 말하며, 그의 정도는 일반적으로 종양의 악성도에 상응한다[최신의학대사전, 1987년 6월 15일 의치약출판(주)발행].

본 발명에 관련된 이형성의 검출방법은, WT1 유전자의 발현레벨을 이형성판단의 지표로 하는 것, 즉, 상기 발현레벨을 MDS를 비롯한 상기 각종 질환에 있어서의 급성 백혈병화의 지표로 하는 것을 필수로 하며, 이에 의해 MDS를 비롯한 각종 질환의 예후, 경과판단등에 있어서 임상적으로 매우 의의가 있다.

본 발명에 따른 이형성의 검출방법은, 또한 다음과 같은 임상적 의의가 있다. 즉, 예를 들면, MDS 환자에 있어서 본 발명의 방법에 따라 측정되는 WT1값이 낮은 값에서 점차로 상승하는 경우, 이 환자는 급성 백혈병화의 위험성이 높다고 할 수 있고, 따라서 조속히 동종골수이식이나 동종 말초 혈간세포 이식술 등을 실시해야 함을 알 수 있다.

또한, 본 발명에 관련된 이형성의 검출방법은, 건강인, 피폭자(원자력발전소 종사자, 방사선 종사자, 방사선 치료를 받은 사람 등), 고형유방암 때문에 항암제 요법을 받은 사람, 감염등에 의해 일어나는 유백혈병 반응을 보이는 환자 등에 있어서 혈액중에 이형세포가 출현하고 있지 않은지의 진단에도 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 이식용조직에 있어서의 CD34^-세포분획중의 WT1 유전자 발현레벨을 측정하여 이 조직중의 백혈병 세포 및 고형암 세포를 검출하는 것을 특징으로 하는 골수이식 및 말초 혈간세포 이식용 조직의 검사방법이 제공된다.

이하, 본 명세서에 있어서의 아미노산, 펩티드, 염기서열, 핵산등의 약호에 의한 표시는 IUPAC, IUB의 규정,「염기서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 명세서등의 작성을 위한 가이드라인」(특허청편) 및 해당 분야에서의 관용기호에 따르는 것으로 한다.

본 발명의 방법에서 측정되는 WT1 유전자 자체는 공지된 것이며, 예를 들면, 문헌[Cel1,60, 509(l990); Nature,343, 774(1990)]에 그 염기서열이 나타나 있다.

본 발명의 방법에서는 피검조직중 또는 CD34^-세포분획중의 상기 WT1 유전자의 발현레벨을 측정하는 것이 중요하며, 이것이 본 발명에 따른 방법의 공통된 최대의 특징이다.

그리고, 일반적으로 유전자의 발현레벨의 측정기술은, 예를 들면, 상술한 본 발명자들의 문헌에도 기재되어 있는 바와 같이 잘 알려져 있고, 본 발명에 있어서의 상기 특정 유전자의 발현레벨의 측정을 위한 방법 및 수단 등도 아무런 한정이 없고, 해당문헌에 표시되는 RT-PCR을 비롯하여 공지의 각종 방법을 모두 사용할 수 있다.

WTl 유전자의 발현레벨의 측정은, 보다 구체적으로는 예를 들면, 피검조직에 있어서의 WT1 유전자의 전사물을 검출하는 방법, 동번역물을 검출하는 방법등에 의해 실행할 수 있다. 전자 방법은, WT1 유전자의 전사물인 mRNA를 검출하므로써 동유전자의 발현레벨을 측정하는 것이며, 예를 들면, 상기 RT-PCR이나 노던 블로트 해석[Molecular C1oning, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)], 동일 반응계내에서의 RT-PCR[Nucleic Acids Res.,21, 3159-3166(1993)]과 동일 반응계내에서의 하이브리다이제이션(hybridization)과 같은 세포레벨에서의 그들의 측정, NASBA법[Nucleic acid sequence-based amplification, nature,350, 91-92(1991)] 및 그 밖의 각종방법에 의해 양호하게 실시할 수 있다.

또한, 후자방법은 WT1 유전자의 번역물인 WT1 단백질을 검출하므로써 동유전자의 발현레벨을 측정하는 것이며, 예를 들면, WTl 단백질에 대한 특이항체를 사용하는 면역학적 측정법등에 의해 실행할 수 있다. 여기에서, WTl 단백질에 대한 특이항체는, 필요에 의해 통상적인 방법에 따라서, WT1 단백질을 면역항원으로 하여 제조할 수 있다[Leukemia,9, l060(1995)].

상기에서 이용할 수 있는 검체(샘플)로서는, 측정대상인 WT1 유전자의 전사물 내지 번역물을 포함하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 전사물의 측정에 있어서는, 예를 들면, 말초혈, 임파절, 골수액, 흉강액, 복강액, 수액, 수술시의 세정액 등에서 유래되는 조직세포 및 적출조직이나 모발등의 조직세포등을 포함하는 각종 조직성분을, 또한 번역물의 측정에 있어서는, 상기와 같은 조직성분 외에, 예를 들면 그들에서 유래되는 각종의 체액등을 각각 예시할 수 있다.

이들 검체에 있어서의 WT1 유전자의 전사물 내지 번역물의 측정결과는 피검조직에 있어서의 WT1 유전자의 발현레벨에 대응하며, 이렇게 해서 원하는 WT1 유전자의 발현레벨을 측정할 수 있다.

상기 WT1 유전자의 발현레벨을 정상세포 또는 건강인에 있어서의 발현레벨과 비교하여 이것이 높은 경우에는 해당 세포, 조직 내지 피검자가 고형암 세포 내지 이것을 포함하는 것 혹은 이형성 내지 이것을 포함한다고 판정할 수 있고, 이렇게 해서 본 발명에 따라 고형암 세포 및 이형성을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 고형암의 임상검사 및 진단에 매우 유용하고, 또한 피검자의 백혈병화를 적확하게 파악할 수 있어서, 이형성의 임상검사 및 진단상 매우 유용하다.

이하, WTl 유전자의 전사물의 측정에 의한 본 발명의 고형암 세포 및 이형성의 검출방법의 형태를 보다 상세히 설명한다.

상기 종래기술에서 기재한 바와 같이, 이미 본 발명자들은 WT1 유전자의 발현레벨 측정에 의한 백혈병세포의 검출을 보고하고 있다[Blood, Vol. 84, No. 9, p3071(l994)]. 여기서 사용된, RT-PCR 또는 노던 블로트해석에 의한 WT1 유전자의 발현의 측정기술은 모두 본 발명에서의 검출에 적합하게 사용할 수 있다. 그 에 대한 세부사항은 상기 문헌에 표시된 바와 같고, 이것을 본 명세서의 개시로서 인용한다.

여기에서, 피검체의 RNA는 통상적인 방법에 따라서 추출, 정제, 조제할 수 있다. 상기 RNA에 포함되는 WTl 유전자 전사물의 검출에 있어서, 노던 블로트 분석을 사용할 경우에 이용되는 검출용 프로브는 WT1 유전자 또는 그 일부를 포함하는 것이면 좋고, 피검 RNA 시료와의 하이브리다이제이션에서 사용하는 검출조건하에 검출가능한 정도의 특이성을 부여하는 것인 한 아무런 한정은 없다. 이러한 프로브의 예로서는, WT1 유전자, 그의 제한효소 절단단편등과 더불어, WTl 유전자의 염기서열에 따라 화학합성한 올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다.

또한, RT-PCR을 사용하는 경우에 이용되는 프라이머는 WT1 유전자만을 특이적으로 증폭할 수 있는 것이면 좋고, 그 증폭하는 영역이나 염기길이등에는 제한은 없다. 상기 프라이머는 바람직하게는, WT1 유전자의 징크 핑거 영역(zinc finger domain) 전체를 포함하도록 설정하는 것이 좋고, 이것은 통상 15 내지 30 뉴클레오티드정도의 부분서열을 갖는 것일 수 있다. 이러한 프라이머는 통상적인 방법에 따라 적절히 설정할 수 있고, 그 바람직한 구체적 일례로서는 후술의 실시예에 나타난 바와 같다.

또한, 본 발명의 검출법에서 사용될 수 있는 각종의 조작, 예를 들면, 일부유전자의 화학합성, 절단, 삭제, 부가 내지 결합을 목적으로 하는 효소처리, 단리, 정제, 복제, 선택등은 모두 통상적인 방법에 따를 수 있다[예를 들면,「분자유전학실험법」, 교리츠 출판(주) 1983년 발행; 「PCR 테크놀로지」, 다까라주조(주) 1990년 발행등 참조].

예를 들면, 상기 단리, 정제조작은 아가로스겔 전기영동법등에 따를 수 있고, 얻어지는 염기의 서열결정은, 예를 들면, 디데옥시법[Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A,74, 5463-5467(l977)]과 맥심-길버트법[Method in Enzymology,65, 499-560(1980)]등에 따를 수 있고, 또한, 시판되는 시퀀스 키트 등을 이용하므로써도 용이하게 실행할 수 있다. PCR의 조건등도 또한 통상적인 방법[예를 들면, Science,230, 1350-1354(1985)등 참조]에 따를 수 있다. 이들 각종의 기본적 조작은 예를 들면, 본 명세서에 인용된 각종 문헌에서도 사용되어 있고, 후술의 실시예와 함께 참조될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 검출방법의 실시에 있어서는, 본 발명에 이러한 WT1 유전자의 발현레벨을 측정하기 위한 수단으로서의 적당한 시약등을 유효성분으로서 함유하는 고형암 세포 및 이형성의 검출제를 이용하는 것이 바람직하다.

상기 검출제에는 WT1 유전자의 발현을 측정하기 위한 방법에 따른 특이적인 시약이 필수성분으로서 함유된다. 이러한 특이적 시약은 사용하는 검출방법에 따라서 적절히 설정되는데, 예를 들면, 상기한 WT1 단백질 항체, WT1 유전자 전사물 검출용 프로브 및/또는 동검출용 프라이머 셋트등의, 본 발명에 따른 측정대상을 특이적으로 검출하기 위한 수단에 필요한 시약으로서 특징지워진다. 또한, PCR의 실시를 위한 시약등은 이러한 검출제의 필수성분이라고는 생각할 수 없지만, 이들도 또한 예를 들면, 하이브리다이제이션을 위한 시약류등과 마찬가지로, 상기 검출제에 포함시킬 수도 있다. 따라서, 본 발명은 고형암 세포 및 이형성의 검출에 이용되는 이러한 검출제 내지 암진단을 위한 약제를 제공하는 것이다.

이어서, 본 발명에 관련된 골수이식 및 말초 혈간세포 이식용 조직의 검사방법에 대해 상술하면, 상기 검사방법은 이식용 조직중의 CD34⁺세포를 제외한 CD34^-세포분획에 대해서 그 WT1 유전자의 발현레벨을 측정하므로써 실시된다.

이 WT1 유전자의 발현레벨의 측정은 상술한 본 발명의 고형암 세포 및 이형성의 검출방법과 같은 각종 방법에 따라 실행할 수 있다.

여기에서 이용하는 검체(샘플)는 이식에 이용되는 조직으로서, 그 속에 존재하는 CD34⁺세포를 미리 주지의 적당한 수단에 의해 제외한 CD34^-세포분획이면 특별이 한정되지 않는다. 그 예로서는, 예를 들면, 말초 혈간세포, 골수액등의 조직성분을 예시할 수 있다. 이러한 CD34^-세포분획은 통상적인 방법에 따라, 예를 들면, 대표적으로는 CD34 컬럼이나, FACS등의 CD34 세포에 친화성을 갖는 물질을 이용한 컬럼 크로마토그래피나, 자기세포분리기를 이용하여 분획할 수 있다. 여기에서 이용되는 컬럼으로서는, 대표적으로는 세파레이트(Ceparate, 셀프로사제), 아이소렉스 300(Isolex 300), 아이소렉스 50(Isolex 50, 모두 백스터사제), MaCS(암젠사제)등을 사용할 수 있다.

보다 자세하게는, 예를 들면, 상기 자기세포분리기를 이용하는 분리조작은 우선 미리 원심분리등에 의해 혈소판등을 제거한 동화(Mobilized) 말초혈이나, 피콜팩 등을 사용하여 단핵세포를 제거하고, 원심분리된 골수액에 항CD34 모노클로날 항체를 반응시켜서 감작시킨 후, 제2항체를 결합시킨 다이나비드(Dynabead)를 반응시켜서 로젯트(rosette)를 형성시키며, 상기 로젯트(양성세포-항체-다이나비드 복합체)와 비로젯트세포(음성세포)를 자기(磁氣)분리하므로써 실시할 수 있다. 또한, 얻어지는 로젯트로 부터는 이것을 키모파파인을 이용하여 효소처리를 하므로써 양성세포를 모을 수 있다.

상기 검체에 있어서의 WT1 유전자 발현레벨의 측정, 즉 WTl 유전자의 전사물 내지 번역물의 측정에 의하면, 존재하는 백혈병세포 및 고형암 세포수에 매우 관련있는 측정치를 얻을 수 있고, 이 측정치가 10^-4레벨 이하인 경우에는 실질적으로 백혈병세포도 고형암 세포도 존재하지 않는다고 판정할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따르면, 이식용 조직의 백혈병세포 및 고형암 세포를 검출할 수 있으며, 이렇게 해서 이식용조직의 안전성을 인식할 수 있는 것이다.

본 발명에 관련된 상기 이식용조직의 검사에 있어서는, 전술한 고형암 세포 및 이형성의 검출제 내지 진단제와 같은 약제를 이용할 수 있고, 본 발명은 이러한 이식용 조직의 검사제도 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해 실시예를 든다.

실시예 l

고형암 세포의 검출

고형암 세포로서 각종 조직에서 유래하는 하기 세포주를 사용하였다. 또한, 각 세포주에 있어서의 JCRB 번호는 세포뱅크 JCRB(Japanese Cancer Research Bank)의 것이다.

·위암(stomach)

(1) AZ-521···위암(JCRB0061)

(2) MKNl···위암, adenosquamous carcinoma(JCRB0252)

(3) MKN28···위암(JCRB0253)

·대장암(colon)

(4) LOVO···Colon adenocarcinoma(Cancer Res.,36, 467-475(l976))

(5) SW480···Colon adenocarcinoma(Cancer Res.,38, 3186-3190(1978))

(6) SW620···Co1on adenocarcinoma(Laboratory Investigation,44,309-323 (1981))

(7) COLO320DM···Colon adenocarcinoma(Anticancer Res.,13, 20l1-2019(l993))

(8) HT29···Colon adenocarcinoma(Clinica1 Molecular Pathology,48, M326-M332(1995))

·폐암(1ung)

(9) OS1···폐암, Smal1 cell carcinoma(Japanese J. Cancer Res.,81, 289-297(1990))

(11) OS2R···폐암, Small cell carcinoma(Cancer Res.,56, 354-358 (1996))

(l2) OS3···폐암, Small cell carcinoma(Japanese J. Cancer Res.,81, 289-297(l990))

(14) LU65A···폐암, small cell carcinoma(JCRB0054)

(15) LU65B ···폐암, small cell carcinoma(JCRB0055)

(16) LU99B···폐암, giant cell carcinmna(JCRB0057)

(17) LU99C···폐암, giant cell carcinoma(JCRB0058)

(18) VMRC-LCP···폐암, squamous cell carcinoma (JCRB0103)

(19) LC6···폐암, Smal1 cell carcinoma

(20) RERF-LC-MS···폐암, adenocarcinoma(JCRB008l)

·유방암(breast)

(21) MDA MB231···유방암(Endocrinology,129,323-329(l991))

(22) ZR75···유방암(Mol. Cell Endocr.,41, 197-204(l985))

(23) YMBl···유방암(JCRB0823)

(24) T47D···유방암(Endocrinology,129, 323-329(l991))

·배세포암(germ cell tumor)

(25) NEC8···배세포암(testis)(JCRB0250)

·난소암(ovary)

(26) TYK NU···난소암, 미분화(JCRB0234. 0)

(27) TYK-nu. cp-r···난소암, 미분화(JCBR0234.l)

·갑상선암

(28) 갑상선암 환자의 암세포

이들 세포주에 있어서의 WT1 유전자의 발현레벨을, 문헌[Blood,84(9), 3071 (1994)]에 기재된 방법에 준하여 하기와 같이 행했다.

즉, 통상의 방법[예를 들면, acid-guanidine-phenol-chloroform method : Anal. Biochem.,162, 156(1987)]에 따라 각 세포주로부터 총RNA를 추출하고, 디에틸피로카보네이트 처리수에 용해시켜 흡광도 260nm에서 광학적으로 정량화시켰다.

1μg의 총RNA를 포함하는 디에틸피로카보네이트 처리수 15. 5μl를 65℃에서 5분간 가열하고, 600U의 역전사효소(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase: GIBCO-BRL), 500 mmol/1의 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP: Pharmacia), 750ng의 올리고 dT 프라이머 및 40U의 RNase 저해제(Boehringer Mannheim)를 포함하는 RT완충액(50mmo1/l 트리스 HCl(pH 8.3); 70mmol/l KCl; 3mmol/1 MgCl₂; 10mmol/1 디티오트레이톨) 14.5μl와 혼합하였다.

혼합물을 37℃에서 90분간 항온처리하고, 70℃에서 20분간 가열한 후, 사용할 때까지 -20℃에서 보존하였다.

PCR은 DNA 써말 사이클러(thermal cycler)(Perkin Elmer-Cetus)에서 94℃, 1분의 변성; 64℃, 1분(β액틴: 60℃, 1분)의 프라이머 어닐링(annealing); 및 72℃, 2분의 쇄연장(Chain elongation)의 조건으로 반복 사이클을 행하고, PCR 산물(제 1 라운드 PCR)을 얻었다.

상기 PCR 산물의 덴시토미터 단위(하기)가 500 미만인 경우에는, 제 1 라운드PCR 산물 2.5μl를 포함하는 반응액에서 네스티드(nested) 내측 프라이머에 의한 제 2 라운드 PCR을 실행하였다.

얻어진 PCR 산물을 문헌[J. Immuno1.,147, 4307, (1991)]에 기재된 방법에 준하여 이하와 같이 정량했다.

즉, 20ng의 총 RNA 로부터의 PCR 산물을 0.05μg/ml의 에티디움 브로마이드를 포함하는 1.3% 아가로즈겔에 분리하고, 폴라로이드 필름(Polaroid 665 film, Polaroid Corp.)으로 촬영하였다.

네가필름을 25℃에서 5분간 현상하고, 덴시토미터(CS-9000: 시마즈)로 검정하여 「덴시토미터 단위」로서 얻었다.

또한, 상기에 있어서 RNA를 포함하지 않은 경우의 PCR 산물을 이용한 결과를 음성 대조용으로 했다.

또한, 상기에서 사용한 프라이머는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

제 1 라운드 PCR 프라이머	염 기 서 열
외측 센스 프라이머	5＇-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3＇
외측 안티센스 프라이머	5＇-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3＇
제 2 라운드 PCR 프라이머	염 기 서 열
내측 센스 프라이머	5＇-GCTGTCCCACTTACAGATGCA-3＇
내측 안티센스 프라이머	5＇-TCAAAGCGCCAGCTGGAGTTT-3＇

또한, 내부 대조용으로 한 β액틴의 프라이머로서는 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,82, 6133, (l985)]에 기재된 것을 사용하였다. 이들 각 프라이머는모두 통상적인 방법에 따라 화학합성하였다.

RT-PCR로의 RNA 사용량과 각 샘플에 있어서의 RNA 분해의 차이를 표준화하기 위해서, WT1 유전자의 결과(덴시토미터 단위)를 β액틴의 결과로 나누고, 이것을 WT1 유전자 발현레벨로 하였다.

또한, WT1 유전자를 발현하고 있다고 알려져 있는 세포주 K562[Lozzio, C. B. 및 Lozzio, B. B., Human chronic myelogenous leukemia cell line with positive Philadelphia chromosome, Blood,45, 321-334(1995)]에 대해서 상기에 따라 측정된 WT1 유전자 발현레벨을 기준(1. 00)으로 하여, 각 피검세포에 대한 WT1 유전자 발현레벨을 그 상대비로써 산출했다.

결과를 도 l에 나타낸다.

도면에 있어서, 세로축은 K562주(표 중「K562」로 표시)에 있어서의 WT1 유전자 발현레벨을 1.00으로 했을 때의 각 세포에 있어서의 WT1 유전자 발현레벨의 상대비를 나타내고, 가로축은 피검세포(위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 난소암 및 갑상선암의 각 세포, 상기 번호로 표시)를 나타낸다.

해당 도면에서, 시험한 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 난소암 및 갑상선암의 각 세포중 어느 것에서나 WT1이 고발현하고 있는 것이 분명하고, 이점에서 WTl이 이들 고형암세포의 종양 마커(marker)로서 이용할 수 있고, 이에 따라 임상적으로 가치있는 고형암의 새로운 검출, 측정기술이 확립되어 있음을 알 수 있다.

실시예 2

MDS의 검출

(1) WT1 유전자의 발현레벨의 측정

WT1 유전자의 발현레벨의 측정을 문헌[Blood,84(9): 3071, 1994]에 기재된 방법에 준해서 이하와 같이 실시했다.

즉, 총RNA는 피검체로부터 통상적인 방법[acid-guanidine-phenol-chloroform method: Anal. Biochem.,162, 156(1987)]에 따라 추출하고, 디에틸피로카보네이트 처리수에 용해하여 흡광도 260nm에서 광학적으로 정량화했다.

1μg의 총RNA를 포함하는 디에틸피로카보네이트 처리수 15.5μl를 65℃에서 5분간 가열하고, 600U의 역전사효소(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase: GIBCO-BRL), 500 mmol/l의 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP: Pharmacia), 750ng의 올리고 dT 프라이머 및 40U의 RNase 저해제(Boehringer Mannheim)를 포함하는 RT완충액(50mmol/l 트리스 HCl(pH 8.3); 70 mmol/1 KCl; 3mmol/l MgCl₂; 10mmo1/l 디티오트레이톨) 14. 5μl와 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 90분간 항온처리하고, 70℃에서 20분간 가열한 후, 사용할 때까지 -20℃에서 보존하였다.

PCR은 DNA 써말 사이클러(Perkin Elmer Cetus)로, 94℃, 1분의 변성; 64℃, 1분(β액틴: 60℃, 1분)의 프라이머 어닐링(annealing); 및 72℃, 2분의 쇄연장(chain elongation)의 조건으로 적절한 사이클을 반복하여 행하고, PCR산물(제 1 라운드 PCR)을 얻었다.

상기 PCR 산물의 덴시토미터 단위(하기)가 500미만인 경우에는, 제 1 라운드 PCR 산물 2. 5μl를 포함하는 반응액으로 네스티드 내측 프라이머에 의한 제 2 라운드 PCR을 행했다.

PCR 산물은 문헌[J. Immuno1.,147, 4307(1991)]에 기재된 방법에 준하여 정량하였다.

즉, 20ng의 총 RNA로부터의 PCR 산물을, 0. 05μg/m1의 에티디움 브로마이드를 포함하는 1.3% 아가로스겔로 분리하고, 폴라로이드 필름(Polaroid 665 film, Polaroid Corp.)으로 촬영하였다. 네가필름을 25℃에서 5분간 현상하고, 덴시토미터(CS-9000: 시마즈)로 검정하여 「덴시토미터 단위」로서 얻었다. 상기에서 RNA를 포함하지 않는 경우의 PCR 산물을 이용한 결과를 음성 대조용으로 했다.

사용한 프라이머는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

또한, 내부 대조용으로 한 β액틴의 프라이머로서는 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 6l33(1985)]에 기재된 것을 사용하고, 이들 프라이머는 모두가 통상적인 방법에 따라 화학합성했다.

RT-PCR로의 RNA 사용량과 각 검체에 있어서의 RNA 분해의 차이를 표준화하기 위해서, WT1 유전자의 결과(덴시토미터 단위)를 β액틴의 결과로 나누고, 이것을 WT1 유전자 발현레벨로 했다. 또한, WTl 유전자를 발현하고 있다고 알려져 있는 세포주 K562[Lozzio, C. B. 및 Lozzio, B. B., Human chronic myelogenous 1eukemia cel1 line with positive philadelphia chromosome, Blood,45, 321-334 (l975)]에서 측정한 이 WT1 유전자 발현레벨을 1.00으로 해서 상기 피검체에 있어서의 WTl 유전자 발현레벨을 그 상대비로서 산출하였다.

MDS 환자18명(TA, UE, FU, TK, TN, CH, NA, MI, SH, AO, NO, SZ, HA, SO, UR, MK, UK 및 TS), 골수섬유증환자 2명(MY 및 MA), 백혈구증다증환자 l명(NB), 재생불량성 빈혈환자 l명(YA), 진성다혈증환자 1명(AS), 호산구증다증 환자 1명(MS) 및 원발성 혈소판증다증환자 2명(GO 및 FS) 등 합계 26명에 대하여, 각각 골수와 말초혈을 채취하여 검체샘플로 하고, 이들 각 샘플에 있어서의 WT1 유전자 발현레벨을 상기에 따라 측정한 결과를 도 2에 나타낸다.

도 2는 K562주에 있어서의 WT1 유전자 발현레벨을 1.00으로 했을 때의 각 샘플에 있어서의 WT1 유전자 발현레벨의 상대치(세로축에 표시)를 플로트한 것이다.

또한, 정상골수에 있어서의 WT1 유전자 발현레벨의 상대값(8.0 × 10^-4)을 가로축 기준선으로 하여 도면에 나타내었다. 또한, 도면에서 둥근 표시를 한 환자는 그 후 사망하였다.

게다가, MDS환자 5명(CH, NO, SZ, SO 및 MK)에 대해서는, 첫회 측정하고 나서 3개월후(CH), 1년후(NO), 6개월후(SZ), 3개월후(SO) 및 2개월후(MK)에 각각 다시 측정한 상기 유전자 발현레벨을 화살표를 붙여서 나타내었다.

도 2로부터 다음을 알 수 있다.

즉, NO(1년후), SZ(6개월후) 및 SO(3개월후) 등의 MDS환자는 모두 첫회 측정치가 높은 값을 나타내고, 단기간내에 이형성이 강해져서 최종적으로 백혈병화하여 사망하였다.

또한, TA, AO 및 TS 등의 MDS환자는 WT1 유전자 발현레벨이 낮은 값이고, 임상적으로도 안정되어 있어서 백혈병화의 위험은 적다고 할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 방법에 따르면, 이형성의 검출뿐만아니라, MDS환자에 있어서의 WTl 유전자의 발현레벨을 경시적으로 측정하므로써 백혈병화의 위험을 미리 알 수 있다.

실시예 3

이식용 조직의 검사

말초 혈간세포 이식을 위한 이식용 조직으로서, 미리 G-CSF[기린·산쿄사제, 「그랜」 또는 중외사제, 「노이트로딘」] 투여(자가말초 혈간세포이식의 경우: 2μg/kg 체중× 3 내지 7일, 동종말초 혈간세포이식의 경우: l0μg/kg 체중 × 7일)된 각종 환자로부터 말초 혈간세포를 채취하고, 채취된 말초 혈간세포로부터 세포분리시스템(백스터(Baxter)사제, 「아이소렉스 50(Isolex 50) 세포분리기」사용)을이용하여 CD34^-세포를 분리 및 회수하였다[예를 들면, J. Hematotherapy,4, 531-438(1995) 참조].

그 조작은 동사의 매뉴얼에 따른 것으로, 우선 세포와 항CD34 모노클로날 항체를 반응시키고, 제 2 항체를 결합시킨 다이나비드를 반응시켜서 로제트를 형성시키고, 이 로제트(양성세포-항체-다이나비드 복합체)를 비로제트 세포(음성세포)와 분리하는 것이다. 또한, 얻어진 로제트로부터는 이를 키모파파인을 이용하여 효소처리하므로써 양성세포를 모을 수 있다.

상기 각 환자 유래의 CD34^-세포분획에 대하여, 이들의 WT1 유전자 발현레벨을 문헌[Blood,84(9), 307l(1994)]에 기재된 방법에 준하여 하기와 같이 측정하였다.

즉, 통상의 방법[예를 들면, acid-guanidine-pheno1-chloroform method: Anal. Biochem.,162, 156(1987)]에 따라 각 세포분획으로부터 총RNA를 추출하고, 디에틸피로카보네이트 처리수에 용해시켜 흡광도 260nm에서 광학적으로 정량화하였다.

1μg의 총RNA를 포함하는 디에틸피로카보네이트 처리수 l5.5μl를 65℃에서 5분간 가열하고, 600U의 역전사효소(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase: GIBCO-BRL), 500mmo1/l의 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP: Pharmacia), 750ng의 올리고 dT프라이머 및 40U의 RNase저해제(Boehringer Mannheim)를 포함하는 RT 완충액(50mmo1/l 트리스 HCl(pH 8.3); 70mmo1/l KCl; 3mmol/l MgCl₂; 10mmol/l 디티오트레이톨) 14.5μl와 혼합하였다.

PCR은 DNA 써말 사이클러(Perkin Elmer Cetus)로, 94℃, 1분의 변성; 64℃, 1분(β액틴: 60℃, 1분)의 프라이머 어닐링(annealing); 및 72℃, 1분의 쇄연장(chain elongation)의 조건으로 반복 사이클을 실행하여 PCR 산물(제 1 라운드 PCR)을 얻었다.

상기 PCR 산물의 덴시토미터 단위(하기)가 500미만인 경우에는 제 1 라운드 PCR 산물 2.5μl를 포함하는 반응액으로 네스티드 내측 프라이머에 의한 제 2 라운드 PCR을 실행하였다.

얻어진 PCR 산물을 문헌[J. Immunol.,147, 4307, (1991)]에 기재된 방법에 준해서 이하와 같이 정량했다.

즉, 20ng의 총 RNA로부터의 PCR 산물을 0.05μg/m1의 에티디움 브로마이드를 포함하는 1.3% 아가로스겔로 분리하고, 폴라로이드 필름(Polaroid 665 film, Polaroid Corp.)으로 촬영했다.

또한, 상기에 있어서 RNA를 함유하지 않은 경우의 PCR 산물을 이용한 결과를 음성 대조용으로 하였다.

또한, 상기에서 사용한 프라이머는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.

또한, 내부 대조용으로 한 β액틴의 프라이머로서는 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,82, 6133, (1985)]에 기재된 것을 사용했다. 이들 각 프라이머는 모두 통상적인 방법에 따라 화학합성하였다.

RT-PCR로의 RNA 사용량과 각 샘플에 있어서의 RNA분해의 차이를 표준화하기 위해서 WT1 유전자의 결과(덴시토미터 단위)를 β액틴의 결과로 나누고, 이것을 WT1 유전자 발현레벨로 했다.

또한, WT1 유전자를 발현하고 있다고 알려져 있는 세포주 K562[Lozzio, C. B. 및 Lozzio, B. B., Human chronic myelogenous leukemia cell line with positive Philadelphia chromosome, Blood,45, 321-334(1995)]에 대해서 상기에 따라 측정된 WT1 유전자 발현레벨을 기준(1.00)으로 하여 각 피검세포분획에 대한 WT1 유전자 발현레벨을 그 상대비로써 산출했다.

결과를 도 3에 나타낸다.

도면에 있어서, 세로축은 K562주(표 중「K562」로 표시)에 있어서의 WT1 유전자 발현레벨을 10°로 해서 각 피검세포(CD34^-세포분획)에 있어서의 WT1 유전자발현레벨의 상대값을 각각 플로트한 것이고, 시험한 세포는 각각 이하와 같다.

(1)∼(4) … 환자말초혈 조혈 간세포의 CD34^-세포분획

(5)∼(9) … 백혈병세포의 CD34^-세포분획

(10) … 위암세포의 CD34^-세포분획

(11), (12) … 대장암세포의 CD34^-세포분획

(13), (14) … 폐암세포의 CD34^-세포분획

(15) … 유방암세포의 CD34^-세포분획

(16), (17) … 난소암세포의 CD34^-세포분획

이 도면으로부터 다음을 알 수 있다. 즉, 신선한 백혈병세포는 CD34⁺세포와 CD34^-세포로 이루어지며, 어느 세포나 WTl을 고레벨로 발현하고 있다[10^-1내지 10⁰레벨: (5)∼(9)참조]. 한편, 정상적인 조혈 간세포의 CD34^-세포분획은 WT1의 발현레벨이 낮고, 10^-4이하이다[(1)∼(4)참조. 단 이들 세포의 CD34⁺세포분획의 WT1 발현레벨은 높다].

이러한 점에서, 채취한 조혈 간세포의 CD34^-세포분획에, 백혈병세포(CD34^-이다)가 혼입되어 있으면 WT1 레벨은 상승하고, 이 CD34^-세포분획의 WT1값을 측정하므로써 10³내지 l0⁴개의 정상세포에 1개의 비율로 백혈병세포가 혼입되어 있으면 검출할 수 있다. 이 검출에 의해, 채취한 조혈 간세포의 CD34^-세포분획중에 백혈병세포가 존재한다는 것을 확인할 수 있으면, 동시에 실제로 이식에 이용되는 조혈 간세포의 CD34⁺세포분획에도 백혈병세포가 존재하는 것이 분명하고, 이러한 세포를 이식에 이용하는 것은 그 안전성면에서 회피해야 한다는 것을 알 수 있다.

또한, 고형암에 대해서는, 고형암세포는 본래 CD34^-이기 때문에, 만일 채취한 조혈간세포중에 암세포의 혼입이 있으면, 그 대부분은 CD34^-세포분획에 존재하고, 따라서 이 분획의 WTl측정에 의하면, 상기와 마찬가지로해서 암세포의 혼입을 확인할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명의 방법에 의하면, 이식용 조직중의 백혈병세포 내지 암세포의 혼입의 유무를 확실히 검정할 수 있다.

본 발명에 의하면, 고형암세포 및 이형성의 검출방법과 이식용조직의 검사방법이 제공되며, 이들에 의해, 고형암의 검출 및 진단, 또는 MDS 같이 백혈병화되는 것으로 알려져 있는 각종 질환에 있어서의 상기 백혈병화의 위험 또는 예후의 판단을 할 수 있고, 또한 이식용조직의 안전성을 확인할 수 있어 임상적으로 유용하다.

특히 본 발명에 관련된 고형암 세포의 검출방법은 각종 고형암의 발생기작이나 병태의 해명, 이들 질환의 진단등에 유용하다. 보다 자세하게는, 본 발명에 의해 다음과 같은 것들을 행할 수 있다:

1. 병소가 악성인지 아닌지의 진단,

2. 암병소와 동일조직 내에서의 암세포의 침윤의 진단과 골수를 포함하는 원격장기, 임파절로의 암전이의 유무의 진단,

3. 각종 체액, 흉수, 복수내에서의 암세포 유무의 진단,

4. 말초혈중의 암세포 검출,

5. 골수이식, 말초 혈간세포 이식시 채취 골수 및 채취 말초 혈간세포분획에 혼입되어 있는 암세포의 검출.

또한, 본 발명자의 식견에 의하면, 배세포암(germ cell tumor)에 있어서, WT1의 고발현타입과 저발현타입이 존재하는 것을 확인하고 있고, WTl은 배세포암을 비롯한 고형암에 있어서의 악성도 등의 새로운 분류도 가능하게 한다. 이와 같은 고형암의 성질의 차이를 검출하는 것은, 특히 병리학적으로 구별이 불가능하다고 여겨지는 배세포암에 있어서 악성도 등의 임상적으로 유용한 지표가 되는 것이라 생각된다.

Claims

위 조직, 대장 조직, 폐 조직, 유방 조직, 배세포 조직 및 갑상선 조직으로 구성된 군에서 선택된 피검 조직을 수득하는 단계; 및

WT1 유전자의 전사물인 mRNA를 검출하는 기술 또는 WT1 유전자의 번역 산물인 WT1 단백질을 검출하는 기술에 의해 상기 피검 조직의 세포중의 WT1 유전자의 발현레벨을 측정하는 단계를 포함하는, 피검 조직에서 위암 세포, 대장암 세포, 폐암 세포, 유방암 세포, 배세포암 세포 및 갑상선암 세포로 구성된 군에서 선택된 고형암 세포의 존재의 검출 방법.
제 1 항에 있어서,

WT1 유전자의 발현레벨을 상기 유전자의 전사물인 mRNA를 검출하는 기술에 의해 측정하는 방법.
피검 조직을 수득하는 단계; 및

WT1 유전자의 전사물인 mRNA를 검출하는 기술 또는 WT1 유전자의 번역 산물인 WT1 단백질을 검출하는 기술에 의해 상기 피검 조직의 세포중의 WT1 유전자의 발현레벨을 측정하는 단계를 포함하는, 피검 조직에서 이형성의 존재를 검출하는 방법.
제 3 항에 있어서,

피검 조직이 골수이형성증후군 환자의 조직인 방법.
제 3 항에 있어서,

WT1 유전자의 발현레벨을 상기 유전자의 전사물인 mRNA를 검출하는 기술에 의해 측정하는 방법.
말초 혈간세포 이식의 골수 이식에 유용한 이식편 조직을 수득하는 단계; 및

WT1 유전자의 전사물인 mRNA를 검출하는 기술 또는 WT1 유전자의 번역 산물인 WT1 단백질을 검출하는 기술에 의해 상기 이식편 조직의 CD34^-세포중의 WT1 유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 이식편 조직에서 백혈병 및/또는 고형암 세포의 존재여부의 검사 방법.
제 6 항에 있어서,

WT1 유전자의 발현레벨을 상기 유전자의 전사물인 mRNA를 검출하는 기술에 의해 측정하는 방법.
활성 성분으로서 WT1 유전자의 발현레벨을 측정하기위한 시약을 포함하는 제 1 항의 방법에 유용한 키트.
활성 성분으로서 WT1 유전자의 발현레벨을 측정하기위한 시약을 포함하는 제 4 항의 방법에 유용한 키트.
활성 성분으로서 WT1 유전자의 발현레벨을 측정하기위한 시약을 포함하는 제 7 항의 방법에 유용한 키트.