TW562928B - Method for detecting solid cancer cells and mutation in tissues and method for examining bone marrow tissues and peripheral vascular stem cells for transplantation - Google Patents

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562928 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7 _五、發明説明（1 ) 技術領域 本發明係有關於固態癌细胞與組織異常性之檢測方法 Μ及用於骨髓移植與周圍血幹细胞移植用組織的檢查方法 。更詳言之係有關於一有用於各種固態癌之診斷乃至於檢 測或骨髓發育異常症候群等異常性之檢測，又有用於白血 病與固態癌患者之同種骨髓移植或自身造血幹細胞移植時 等之移植细胞的安全性，特別是移植後再發之危險性的檢 查、把握的新方法。 習知技術 WT1遺傳基因係由合併維正姆氏（Wilms)瘤、無虹彩、 泌尿生殖器異常、精神發育延遲等之WAGR症候群的分析， 乃維耳姆氏瘤之原因遺傳基因之一，從人類染色體11p13 所分離出的遺傳基因，其發現已知被局限於胎兒期之腎臟 、脾臟、睪九、卵巢等[分子醫學，Vol.32, Νο·5, P.502 (1995)等]。 本發明者等者先提出：上述WT1遺傳基因之表現水平 在急性白血病很高、其表現水平與預後成負相關，Μ及藉 由測定此表現水平可檢測急性白血病之MRD(微少殘存白血 病細胞）的報告[Blood, Vol.84, Νο·9, p 3071 (1994)]。 此表現水平之測定以熟知之RT-PCR (反轉錄聚合酶鏈反應 (Reverse Transcribed-Polymerase Chain Reaction)， Kawasaki, E.S.,et al·, RNA 之放大（Amplification of RNA) 〇PCR試驗程序（In PCR Protocol)，方法及應用指南 (A Guide to methods and applications) ， Academic (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 4 562928 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 A7 _B7 ___五、發明説明（2 ) Press, Inc·,聖地牙哥，21-27(1991))為之，該WT1 遺傳 基因之表現水平的測定在有關於上述白血病之臨床上具有 重要的意義。 另一方面，固態癌係指瘤细胞為塊狀、充實性地增殖 者而言，此與各個瘤細胞為游離而增殖、浸潤、轉移之白 血病可明確地加Μ區別。 向來*關於此固態癌雖也進行著種種研究，但至今尚 未有如對應於上述白血病中WT1遺傳基因的臨床指標的報 告。 又一方面，骨髓發育異常症候群（myelodys plastic syndrome: MSD)係顯示前白血病性性質與與治癒不良性之 周圍血球減少的後天性造血障礙，其確定診斷係根據血球 形態之異常，病型確定採用FAB標準（法美英群分類）◦ 該MDS已知有高比率急性白血病化，高危險群在40%M 上，低危險群也有10〜15%急性白血病化。 該MDS之預後與預後因子者，由前述FAB分類可知，急 性白血病化之危險性為骨髓或周圍血之芽球比率、在骨髓 生檢時有芽球集塊、複雜之染色體異常情形等[內科學、 P/1711、1995年9月25日（株）朝倉書店發行、參照]。 同樣地會白血病化之疾患者雖知有骨髓纖維症、真性 紅血球過多症、再生不良性貧血、原發性血小板增多症、 發作性夜間血色素尿症等，但Μ上述MDS為始之各種白血 病化疾患，即，具有與正常組織乃至於细胞相異之形態學 上特徵的異常性的檢測技術尚未確立。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562928 A7 B7 五、發明説明（3 ) 另外，適於白血病患者等之治療為同種骨髓移植（allogeneic bone marrow transplantation:allo BMT) ， 即 ，藉由M造血幹细胞之輸注而迴避不可逆之造血障礙之同 時，進行抗癌劑、放射線投予等與患者之免疫反應兩者而 根絕白血病细胞使之完全治癒的治療法一直得到良好成積 。又，近年，自體周圍血幹细胞移植（Peripheral blood stem cel 1 transplantation•PBSCTsSautologous blood stem cell transplantation : ABSCT )取代了為上述骨 髓移植之一的自體骨髓移植（autologous bone marrow transplantation:ABMT)，因為具有更多優點而急速地發 展。 Μ此等之骨髓乃至於周圍血幹細胞移植，將從HLA抗 原實質上或完全一致之供給者所採取的骨髓细胞乃至於周 圍血幹細胞輸注於患者，其中所含造血幹细胞在骨髓借間 質细胞。造血因子之力開始正常造血，恢復造血。此骨髓 乃至於周圍血幹細胞移殖雖對於白血病顯示出優良之成績 ，但尚有供給者難尋或移殖相關併發症之發病問題，併有 所謂移植後再發之非常重大的問題。 於是，為克服上述再發等之問題，首先移植組纖細胞 自身中要不含白血病細胞等癌細胞，即供給者之骨髓或周 圍血幹細胞要安全成為其最基本之要件，但是此骨髓乃至 於周圍血幹细胞中是否存在白血病细胞之檢查技術尚未確 立0 所Μ，本發明的目的之一在於提供一於固態癌診斷等 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規洛（210Χ 297公慶） — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562928 A7 B7 五、發明説明（4 ) 有效之固態癌細胞的測定技術，特別是利用相關於固態癌 之臨床指標的上述測定技術。 本發明之其他目的在於：提供一特別是考慮MDS之經 過、予後等，利用了可更確實地把握急性白血病化風險等 之新指標的異常性檢測技術。 本發明之另一目的在於提供一新技術，可檢測前述骨 髓移植乃至於周圍血幹细胞移植所用組織中的白血病细胞 〇 發明之揭示 本發明者們由上述目的銳意研究的结果，始發現為白 血病臨床指標而公告之WT1遺傳基因即使在與該白血病無 關連之固態癌中也有有意義的高表琨水平，得到一其利用 在固態癌細胞之檢測是有效的見識。 又本發明者們也發現即使在與白血病能明確區別之MDS 其他異常性中WT1遺傳基因之表現水平亦高，且此異常性 中之WT1遺傳基因表現水平能成為急性白血病化的指標。 再者本發明者們亦發現移植用組織中之CD34+细胞分 化之WT1遺傳基因表現水平雖不能成為白血病细胞混入之 指標，但CD34-細胞分化之WT1遺傳基因表現水平成為白血 病細胞以及固態癌细胞混入之指標，藉由此之測定使白血 病细胞以及固態癌细胞之檢測成為可能。本發明乃根據此 一新見識而所完成者。 本發明乃提供一癌细胞之撿測方法，其特徵在於：藉 由側定被檢組織中WT1遺傳基因之表現水平而檢測固態癌 本&張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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AT 562928 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 _B7__五、發明説明（5 ) 細胞。 又，本發明在提供一異常性之檢測方法，其特徵在於 :測定被檢組織中WT1遺傳基因之表現水平而檢測該組織 之異常性。 特別地，此異常性之撿測方法以被檢組織為骨髓異常 性症候群之被檢組織以及WT1遺傳基因之表現水平測定Μ 其轉錄物測定而為者為宜。 又另外，所諝異常性（atypia)乃指與正常組織、細胞 形態學上相異而言，其程度一般與瘤之惡性度平行[最新 醫學大辭典，1987年6月15日醫齒藥出版（株）發行]。 本發明之異常性檢測方法將WT1遺傳基因之表現水平 作為異常性判斷之指標，即，必須將上述表現水平當作以 MDS為始之前述各種疾患中急性白血病化的指標，根據此 ，在MDS為始之各種疾患的予後、經過判斷等之臨床上極 有意義。 又，本發明之異常性檢測方法有如下之臨床上意義。 即，例如於MDS患者，依本發明方法所測定之WT1值隨著由 低值昇高時，可說是該患者之急性白血病化的危險性高， 所Μ可判斷應迅速地施行同種骨髓移植或同種周圍血幹細 胞移植術等。 又，本發明之異常性檢測方法於健康人、被暴露者 (核力發電所從業者、放射線從業者、接受放射線治療之 人等）、因固態乳癌接受抗癌劑療法之人、由感染等引起 顯示類白血病反應之患者等亦可利用於血液中異常细胞出 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（21〇χ 297公t ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562928 A7 B7 五、發明説明（6 ) 現與否的診斷。 再者，本發明為提供一骨髓移植Μ及周圍血幹细胞移 植用組織之檢查方法，其特徵在於：測定移植用組織中之 CD34·细胞分化中WT1遺傳基因表現水平而檢測該組織中之 白血病細胞Μ及固態癌细胞。 Κ下，本說明書中Κ胺基酸、胜肽、鹼基序列、核酸 等略記表示乃依IUPAC、ICB規定、「製作含有鹼基序列或 胺基酸序列之說明書等的指導」（特許廳編）Μ及該領域中 慣用記號所為。 於本發明方法所測定之WT1遺傳基因自體為公知，例 如文獻[Cell,砬，509(1990) ;Natute, 241, 774(1990)] 中顯示著該鹼基序列。 在本發明方法，測定被檢組織中或〇034_细胞分化中 之上述WT1遺傳基因的表現水平很重要，此為本發明方法 之共通的最大特徵。 然而，一般遺傳基因之表琨水平的測定技術乃例如上 述本發明者們之文獻中也記載般為人所知，本發明中測定 上述特定遺傳基因之表現水平的方法、手法等亦無任何限 定，可採用Μ該文獻所示RT-PCR為首之任何公知的各種方 法0 遣傳基因表現水平之測定可藉由更具體地例如檢測被 檢組織中WT1遺傳基因之轉錄物的方法、撿測同轉譯物的 方法等而進行。前者之方法為藉由撿測為WT1遺傳基因轉 錄物之mRNA而測定同遣傳基因之表現水平者，例如，藉由 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562928 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（7 ) 以前述RT-PCR或北方轉印分析[Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]、在位RT-PCR [核酸研 究，Zi，3159-3166 (1993)]或在位雜交之细胞表現水平 其等之測定、NASBA 法[Nucleic acid sequence-based amplification, nature, 350, 91-92 (1991) ] M及其他各 種方法可良好地實施。 又，後者之方法係藉由檢測為WT1遺傳基因轉譯物之 WT1蛋白質而測定同遺傳基因之表現水平者，例如，可採 用對應WT1蛋白質之專一性抗體Μ免疫學之測定法等而進 行。在此，WT1蛋白質之專一性抗體可依需要根據常法將 WT1蛋白質作為免疫抗原而製造[白血病，沒，1060(1995)] 〇 可用於上述之檢體（樣本），只要是含有為測定對象之 WT1遺傳基因轉錄物乃至於轉譯物者即可並無特別限定， 合於轉錄物測定為例如含有來自周圍血、淋巴節、骨髓液 、胸腔液、腹腔液、髓液、手術時之洗淨液等之組織细胞 以及摘出組織或毛髮等組纖细胞等各種組織成分，加上合 於轉譯物測定之與與上述同樣的組織成分，可各個例示例 如來自其等之各種體液等。 此等檢體中WT1遺傳基因之轉錄物乃至於轉譯物的測 定结果對應於被檢組織中WT1遺傳基因之表現水平，可測 定隱微而所欲知之WT1遺傳基因表現水平。 將該WT1遺傳基因之表現水平與正常细胞或健康者比 較，比值高時，該細胞、組織乃至於被檢者可判定為固態 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

.—Γ. 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規洛（210 < 297公釐） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 562928 A7 _B7_ 五、發明説明（8 ) 癌细胞乃至於含有此者，或為異常性乃至於含有此者，依 本發明可檢測固態癌细胞Μ及異常性。所以，本發明方法 於固態癌之臨床檢査Μ及診斷極為有用，又可確實地把握 被驗者之白血病化，在異常性之臨床檢查Κ及診斷上極為 有用。 Μ下，MWT1遺傳基因之轉錄物測定更詳细地說明本 發明之固態癌细胞Μ及異常性之檢測方法的樣態。 如前述習知技術所記載地，本發明者等已經報告了藉 由測定WT1遺傳基因之表現水平而作白血病细胞之撿測。 [血液，Vol.84, Νο·9, ρ3071 (1994)]。在此所採用之Μ RT - PCR或北方轉印分析的WT1遺傳基因發現的測定技術， 任一者皆能適合地採用於本發明檢測。其詳细如上述文獻 所示般，將此引用為本發明書的揭示。 在此，被檢體之RNA可依常法萃取、精製。對於該RNA 所含之WT1遺傳基因轉錄物之檢測採用北方轉印部分析時 ，所用之檢測用探針宜為WT1遺傳基因或含有其一部分者 ，於與被檢RNA試料之雜交中採用檢測條件下，只限於能 賦與可檢測程度之專一性者，無任何限定。 此探針之例可舉出：tfTl遺傳基因、加上其限制酶切 斷斷片等、依tfTl遺傳基因之鹼基序列而化學合成之寡核 苷酸等。 又，採用RT-PCR時，所用之引子宜為可僅將WT1遺傳 基因專一地放大者，其放大範圍或鹼基長等並無限制。該 引子宜設定為含有WT1遺傳基因之全鋅手指區域者，此可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局貝工消費合作衽印製 562928 A7 B7__ 五、發明説明（9 ) 為具有通常15〜30核苷酸左右的部分序列者。此引子可依 常法適當設定，且適當之具體一例盡如後述之實施例所示 〇 又，於本發明之檢測法所能採用之各種操作，例如Μ 一部分遺傳基因之化學合成、同切斷、切除、附加乃至於 結合為目的之酵素處理、同分離、精製、複製、選擇等的 任何一種皆可依常法為之[例如參照「分子遺傳學實驗法 」，共立出版（株）1983年發行；「PCR技術學」，寶酒造 (株）1990年發行等]。 例如，上述分離、精製操作可依瓊脂糖凝膠電泳法等 ，所得之鹼基之序列決定可依例如雙去氧法[Proc. Natl. Acad. Sci·, U.S.A, Zi, 5463-5467(1977)]或麥森吉伯 法（Maxam and Gi lbert method)[酵素學之方法，迅，499 -560(1980)]等，又藉由使用市售之序列套組等亦可輕易 地進行。PCR之條件等亦可再依常法[例如參照：種學， * 2M, 1350-1354(1985)]。此等各種之基本操作於例如本 說明書引用之各種文獻中亦被採用著，可與後述之實施例 共同地參照。 又，於本發明檢測方法之實施之際，宜利用含有適當 試藥等作有效成份之固態癌细胞Μ及異常性的撿測劑以作 為測定有關本發明之WT1遺傳基因表現水平的手段。 該檢測劑中含有適於測定WT1遺傳基因表現水平之方 法的專一性試藥為必須成分。此專一性試藥雖可依採用之 檢測方法而適當設定，但例如前述WT1蛋白質抗體、WT1遣 國國家標準（ CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562928 A7 _ B7__ 五、發明説明（10 ) 傳基因轉錄物檢測用探針Μ及/或同檢測用引子組等賦有 一特徵：為檢測有關本發明測定對象之手段的必要試藥。 又，實施PCR之試藥等雖不能為此檢測劑之必須成分，但 此等亦再與例如雜交之試藥類等同樣地’也可含於上述檢 測劑中。所Μ，本發明亦為提供可利用於固態癌細胞Μ及 異常性之檢測的檢測劑乃至於癌診斷的藥劑者。 其次，詳述有關於本發明之骨髓移植Μ及周圍血幹细 胞移植用組織的檢査方法，該撿査方法乃對除了移植用組 織中CD34+细胞以外之CD细胞分化，藉由測定其WT1遺傳基 因之表現水平而實施。 此WT1遺傳基因表現水平之測定可依與上述本發明之 固態癌細胞K異常性檢測方法同樣的各種方法進行。 在此使用之檢體（樣本）為移植所利用之組織，只要是 將其內存在之CD34+细胞預先Μ習知之適當方式除去後的 CD341田胞部分即可，並無特別限定。其例可例示如周圍 血幹细胞、骨髓液等之組織成分。此CD34·细胞部分乃依 常法，例如代表性地利用使用了CD34管柱或FACS等對CD34 細胞具有親和性物質的管柱層析法或磁性细胞分離器而分 離。在此所使用之管柱者，代表上可使用细巴雷（Cepar^te ，细魯普羅社製）、艾索雷斯300 (Isolex300)、同50 (Isolex50，皆由貝克斯達社製）、MaCS (阿姆然社製）等。 更詳言之，例如採用上述磁性细胞分離器之分離操作 可藉由··首先於預先以離心分離等除去了血小板等之動化 (Mobilized)周圍血或採用Ficoll paque等除去單核细胞 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562928 A7 • B7 五、發明説明（11 ) 、離心分離之骨髓液中，使抗CD34單株抗體反應而相互作 用後，使結合第二抗體之戴那磁珠（Dynal beads)反應而 形成羅塞特將該羅塞特（陽性细胞與抗體一戴那磁珠（Dynal beads)複合體）與非羅塞特細胞（陰性细胞）K磁性分離而 實施。又，藉由使用木瓜凝乳蛋白酶將此作酵素處理，可 由所得之羅塞特收集陽性细胞。 Μ上述檢體中WT1遺傳基因表現水平之測定，gPWTl遺 傳基因之轉錄物乃至於轉譯物的測定，可得到與存在之白 血病细胞K及固態癌細胞數極相關的測定值，該側定值在 10_4水平Μ下時，明確地可判定實質上白血病细胞也不存 在，固態癌细胞也不存在。所以，Μ本發明可檢測移植用 之白血病细胞Μ及固態癌細胞，可認織如此移植用組織的 安全性。 於本發明之上述移植用組織的檢查中，可利用與前述 固態癌細胞Μ及異常性之檢測劑乃至於診斷劑同樣之藥劑 ，本發明亦為提供此移植用組織之檢查劑者。 圖示之簡單說明 第1圖為表示依實施例1求出各種癌细胞之WT1遺傳 基因表現水平之结果的圖； 第2圖為依實施例2側定各種患者之WT1遺傳基因表 現水平，描點之圖； 第3圖為表示依實施例3求出各種CD34-细胞部分之 WT1遺傳基因表現水平之結果的圖。 實施發明之最佳樣態 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格I 210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562928 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ♦ _B7__ 五、發明説明（12 ) 以下，擧出實施例以更詳细說明本發明。 實施例1 固態癌細胞之檢測 使用來自各種組纖之Μ下细胞株為固態癌细胞。又， 各細胞株之號碼為细胞銀行JCRB (日本癌症研究銀行）者。 •胃癌(胃） (1) 4乙-521...胃癌（几!^0061) (2) ΜΚΝ1···胃癌、腺膦狀癌（JCRB0252: (3) ΜΚΝ28·· ♦胃癌（JCRB0253) •大腸癌（大腸） (4) L0V0· · ·大腸腺癌（Cancer Res.,监，467-475 (1976)) (5) SW480· · ·大腸腺癌（Cancer Res·,從，3186-3190 (1978)) (6) SW620· ··大腸腺癌（Laboratory Investigative, Μ, 309-323 (1981)) (7) C0L0320DM· ··大腸腺癌（Anticancer Res· ,13_, 2011-2019(1993)) (8) HT29···大腸腺癌（Clinical Molecular Pathology， M326-M332 (1995)) •肺癌（lung) (9) 0S1···肺癌，小细胞癌（Japanese J· Cancer Res·， SI, 289-297(1990)) (11)052匕..肺癌，小细胞癌（〇311〇61"1^5.,5^,354- C讀先閱讀背面之注意事項存填寫本fo

尺度適用中國國家標準（CN\S ) A4規格（210 X 297公慶） 經濟部中央榡準局員工消費合作杜印製 562928 A7 _B7_______ 五、發明説明（13 ) 358(1996)) (12)0S3·· ♦肺癌，小细胞癌（Japanese J. Cancer Res·,ai, 289-297(1990)) (14) 1^165々...肺癌，小细胞癌（儿1^0054) (15) LU65B···肺癌，小细胞癌（JCRB0055) (16) LU99B·· J市癌，巨细胞癌（JCRB0057) (17) LU99C···肺癌，巨细胞癌（JCRB0058) (18) VMRC-LCP· · ·肺癌，鱗狀细胞癌（JCRB0103) (19) LC6...肺癌，小細胞癌 (20) RERF-LC-MS···肺癌，腺癌（JCRB0081) •乳癌（乳房） (21) MDA MB231···?ί癌（Endocrinology, 129· 323- 329(1991)) (22) ZR75····乳癌（Mol, Cell Endocr.,il, 197-204 (1985)) (23) YMB1. (24) T47D····乳癌（内分泌學，m, 323-329(1991)) •胚细胞癌（胚细胞瘤） (25) NEC8· · ·胚细胞瘤（睪丸）（JCRB0250) •卵巢癌（卵巢） (26) TYK NU···卵巢癌，未分化（JCRB0234.0) (27) TYK-nu. cp-r. ♦.卵巢癌，未分化（JCRB0234.1) •甲狀腺癌 (28) 甲狀腺癌患者之癌细胞 本錄尺度適用十國國家標準（CNS ) A4規格（210 X： 297公羞） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tr

562928 A7 B7 五、發明説明（14 ) 根據文獻[blood, M(9), 3071 (1994)]記載之方法’ 將此等细胞株中WT1遺傳基因之表現水平如Μ下進行。 即，依通常之方法[例如酸一亞氨基甲二胺一酚-氯 仿法：分析生化學，m, 156(1987)]由各细胞株萃取總 RNA，溶解於二乙基焦碳酸酐處理水中，Μ吸光度260nm光 學上定量化。 將含有1 ug總RNA之二乙基焦碳酸酐處理水15.5 id在 65°C加熱5分鐘，與含有600U反轉錄酶（莫洛尼（Moloney) 鼠白血病毒反轉錄酶：GIBC0-BRL)、500mmol/l之各去氧 核苷酸三磷酸dHTP :法瑪西亞）、750ng之寡dT引子Μ及40 U之RNase抑制劑（百靈佳曼漢）的RT媛衝液（50mmol/l tris (PH83) ; 70mmol/l KCl ; 3mmol/l MgCl2 ; 10fflmol/l二硫 蘇糖醇）14.5 ill混合。 將混合物任37°C培養90分鐘，在70°C加熱20分鐘後， 使用時前保存於一20°C。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) PCR係MDNA熱循環器（Perkin Elmer-Cetus)於94°C變 性1分鐘、於64°C作1分鐘（卢肌動蛋白：60°C、1分鐘）之 引子回溫（armealing)M及於72°C 2分鐘之鏈延長（chain elongation)的條件下反覆循環，而得到PCR產物（第1回合 PCR)。 該PCR產物之细菌生長密度計單位（後述）未滿500時， 將含有第1回合PCR產觀2.5U之反應液以涅斯泰德（承又亍 V F)內方引子進行第2回合PCR。 將所得之PCR產物Μ文獻[免疫學（J. Immun〇l.) ,141, 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210人297公釐） 562928 A7 B7 五、發明説明（15 ) 4037, (1991)]記載之方法為準如Μ下進行定量。 即，將來自20ng總RNA之PCR產物，分離於含有0.05Wg /ml溴化錠（ethidiumbromide)的1.3¾壤脂糖凝膠，以拍立 得（Polaroid 665 film，Polaroid Corp·)攝影0 將負片M 25°C 5分鐘顯像，M细菌生長密度計（CS-9000 :島津）檢定而得到「細菌生長密度計單位」。 又，於上述中將利用不含RNA時之PCR產物的結果作為 陰性對照組。 又，於上述中使用之引子係如下述第1表所示。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 第1表 第1回合PCR引子 鹼基序列 外方引子 5f-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3 ? 外方反意引子 5 ’ -GAGAGTCAGACTTGAMGCAGT-3 ’ 第2回合PCR引子 鹼基序列 內方引子 5 ’-GCTGTCCCACTTACAGATGCA-3 ’ 內方反意引子 5 ’ -TCMAGCGCCAGCTGGAGTTT-3 ’ 訂

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 562928 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（16 ) 又，作為内部控制組之/3肌動蛋白引子者係使用文獻 [Proc· Natl· Acad· Sci· USA·,S2, 6133, (1985)]中記 載者。此等之各個引子皆依常法化學合成。 為了將RT-PCR之RNA使用量與各樣本中RNA分解之相異 標準化，將WT1遺傳基因之结果（细菌生長密度計單位）除 M/S肌動蛋白之结果，Μ此作為WT1遺傳基因表現水平。 又，關於巴知發現了WT1遺傳基因之细胞株Κ 562 [Lozzio, C.B.和Lozzio, Β.Β.,具有陽性費城染色體人類 慢性骨髓性白血病细胞糸，血液，处，321-334(1995)]， 乃將依上述所測定之WT1遺傳基因表現水平作為基準（1.00) ，算出各被檢细胞之WT1遺傳基因表現水平為其相對比。 將结果示於第1圖。 圖中，縱軸係表示將K562株（表中示為[K562])中WT1 遺傳基因表現水平作為1.00時，各细胞中WT1遺傳基因表 現水平之相對比，橫軸係表示被檢细胞（胃癌、大腸癌、 肺癌、乳癌、胚细胞癌、卵巢癌以及甲狀腺癌之各细胞）。 由該圖明白於所試驗之胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、 胚细胞癌、卵巢癌Μ及甲狀腺癌各細胞任何一者中WT1皆 高，由此可判明tfTl可利用作為此等固態癌细胞之腫瘤標 記，藉此可確立一臨床上有價值之固態癌的新檢測、測定 技術。 實施例2 MDS之撿測

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562928 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（17 ) Μ文獻[血液，M(9) : 3071,1994]記載之方法為準如 下實施WT1遣傳基因表現水平之測定。 即，總RNA依常法[酸一亞氨基甲二胺一酚一氯仿法： 分析生化（Aual · Biochem., 1£2，156 (1987)]從被檢體萃 取，溶解於二乙基焦碳酸酐處理水而以吸光度260nm作光 學上之定量化。 將含有1 Wg總RNA之二乙基焦碳酸酐處理水15.5 ill在 65°C加熱5分鐘，與含有600U反轉錄酶（莫洛尼（Moloney) 鼠白血病毒反轉錄酶：GIBC0-BRL)、500mmol/l之各去氧 核苷酸三磷酸dNTP ··法瑪西亞）、750ng之寡dT引子Μ及40 U之RNase抑制劑（百靈佳曼漢）的RT媛衝液（50mmol/l tris (pH83) ; 70mmol/l KC1 ; 3mmol/l MgCl2 ; 10mmol/l二硫 蘇糖醇）14.5 /il混合。 將混合物任37°C培養90分鐘，在70°C加熱20分鐘後， 使用時前保存於一20°C。 PCR係MDNA熱循環器（Perkin Elmer-Cetus)於94°C變 性1分鐘、於64°C作1分鐘（卢肌動蛋白：60°C、1分鐘）之 引子回溫（anneal ing)Μ及於72°C 2分鐘之鏈延長（chain elongation)的條件下反覆循環，而得到PCR產物（第1回合 PCRh 該PCR產物之細菌生長密度計單位（後述）未滿500時， 將含有第1回合PCR產物2.5wl之反應液以涅斯泰德（氺又亍 V F)內方引子進行第2回合PCR。 將所得之PCR產物Μ文獻[免疫學（J. Immunol·),MI, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562928 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（18 ) 4037, (1991)]記載之方法為準如Μ下進行定量。 即，將來自20ng總RNA之PCR產物，分離於含有〇.〇5iig /ml溴化錄（ethidiumbromide)的1.3%填脂糖凝膠，以拍立 得（Polaroid 665 film, Polaroid Corp·)攝影。 將負片M 25°C 5分鐘顯像，M细菌生長密度計（CS-9000:島津）檢定而得到「細菌生長密度計單位」。 又，於上述中將利用不含RNA時之PCR產物的结果作為 陰性對照組。 使用之引子如下述第2表所示。 第2表 第1回合PCR引子 鹼基序列 外方引子 5f-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3f 外方反意引子 5T-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3? 第2回合PCR引子 鹼基序列 內方引子 5 ’ -GCTGTCCCACTTACAGATGCA-3 ’ 内方反意引子 5 ’-TCAAAGCGCCAGCTGGAGTTT-3f 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562928 A7 B7 五、發明説明（19 ) 又，作為内部控制組之/3肌動蛋白引子者係使用文獻 [Proc· Natl· Acad· Sci· USA·，δΖ, 6133, (1985)]中記 載者，此等之各個引子皆依常法化學合成。 • 為了將RT-PCR之RHA使用量與各檢體中RNA分解之相異 標準化，將WT1遺傳基因之结果（细菌生長密度計單位）除 Μ/?肌動蛋白之结果，Μ此作為WT1遺傳基因表現水平。 又，於巴知發現了WT1遺傳基因之細胞株K 562[L〇ZZio,C. B.和Lozzio, Β具有陽性費城染色體人類慢性骨髓性 白血病细胞糸，血液，组，321-334(1995)]，將所測定之 WT1遺傳基因表現水平作為基準1.00，算出上述被檢细胞 之WT1遺傳基因表現水平為其相對比。 對MDS患者 18名（ΤΑ、UE、FU、ΤΚ、ΤΝ、CH、ΝΑ、ΜΙ、 SH、AO、NO、SZ、HA、SO、UR、ΜΚ、UKM及TS)、骨髓纖 維症患者2名（MYM及MA)、白血球增多症患者1名（NB)、再 生不良性貧血患者1名（YA)、真性紅血球過多症1名（AS)、 嗜酸性球增多症患者1名（MS)M及原發性血小板增多症患 者2名（G0M及FS)合計26名，各別地採取骨髓與周圍血作 為檢體樣本，依上述測定此等各樣本之WT1遺傳基因表現 水平，將结果示於第2圖。 第2圖係將K562中WT1遺傳基因表現水平作為1.00時 把各樣本中遺傳基因表現水平之相對值（表示於縱軸）描點 而成者。 又，將正常骨髓中WT1遺傳基因表現水平之相對值 (8.0X10-4)作為橫軸基準線，示於圖中。又，圖中註上 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公趁） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562928 A7 B7____ 五、發明説明（20 ) 圓印之患者在其後死亡。 再者，MDS患者5名（CH、NO、SI、S0M及MK)於初次測 定起3個月後（CH)、1年後（N0)、6個月後（SZ)、3個月後 (S0)M及2個月後（MK)分別地再度測定同遺傳基因表現水 平，將之註Μ箭頭表示。 由第2圖可判明其次之事項。 即Ν0(1年後）、SZ(6個月後）Μ及S0(3個月後）之MDS患 者的其中任一皆顯示高值之初次測定值，異常性於短期間 之内變強，最後白血病化而死亡。 又，ΤΑ、Α0Μ及TS之MDS患者，其WT1遺傳基因表現水 平低值，臨床上也安定著，可說白血病化的風險小。 如此地，Μ本發明不僅可檢測異常性，藉由歷時地測 定MDS患之WT1遺傳基因表現水平亦可預知白血病化之風險 〇 實施例3 移植用組織之檢查 由預光投與G-CSF[麒麟·三共社製，「葛蘭」或中 外社製「諾Μ得各辛」](自體周圍血幹细胞移植時·· 2^/ kg體重X3〜7日，同種周圍血幹细胞移植時：l〇um/kg體 動X7日）之各種患者採取周圍血幹细胞，使用细胞分離系 統（使用百克斯特（Baxter)社製「艾索雷克斯50 (Isolex50) 細胞分離器」）由所採取之周圍血幹细胞分離CD34-細胞， 回收[參照例如血液治療期刊（J.Hematotherapy,生，531-438(1995)]。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

562928 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（21 ) 其操作乃依同社之操作手冊者，首先使细胞與抗CD34 單株抗體反應，其次使結合了第二抗體之戴那磁珠（Dynal beads)反應而使元形成羅塞特，將該羅塞特（陽性細胞與 抗體戴那磁珠（Dynal beads)複合體）與非羅塞特细胞（陰 性細胞）分離者。又，藉由使用木瓜凝乳蛋白酶將此作酵 素處理，可由所得之羅塞特收集陽性细胞。 至於來自上述各患者之CD34·細胞分化， 根據文獻[blood, M(9), 3071 (1994)]記載之方法， 將此等细胞株中WT1遺傳基因之表現水平如以下進行。 即，依通常之方法[例如酸-亞氨基甲二胺一酚-氯 仿法：分析生化學，156(1987)]由各细胞株萃取總 RNA，溶解於二乙基焦碳酸酐處理水中，以吸光度260nm光 學上定量化。 將含有1狀總RNA之二乙基焦碳酸酐處理水15.5 /11在 65°C加熱5分鐘，與含有600U反轉錄酶（莫洛尼（Moloney) 鼠白血病毒反轉錄酶：GIBC0-BRL)、500mmol/l之各去氧 核苷酸三磷酸dNTP :法瑪西亞）、750ng之寡dT引子Μ及40 U之RNase抑制劑（百靈佳曼漢）的RT媛衝液（50mmol/l tris (pH83) ; 70mmol/l KC1 ; 3mmol/l MgCl2 ; 10mmol/l二硫 蘇糖醇）14.5 jil混合。 將混合物任37°C培養90分鐘，在7〇°C加熱20分鐘後， 使用時前保存於一20°C。 PCR係MDNA熱循環器（Perkin Elmer-Cetus)於94°C變 性1分鐘、於64°C作1分鐘（/3肌動蛋白：60°C、1分鐘）之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

24 562928 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（22 ) 引子回溫（anneal ing)Μ及於72°C 2分鐘之鏈延長（chain elongation)的條件下反覆循環，而得到PCR產物（第1回合 PCIO。 該PCR產物之細菌生長密度計單位（後述）未滿500時， 將含有第1回合PCR產物2.5m1之反應液Μ涅斯泰德（承义亍 y F)内方引子進行第2回合PCR。 將所得之PCR產物Μ文獻[免疫學（J,Immim〇l.),14Z, 4037, (1991)]記載之方法為準如Μ下進行定量。 即，將來自20ng總RNA之PCR產物，分離於含有0.05此 /ml溴化錄（ethidiumbromide)的1·3%璃脂糖凝膠，以拍立 得（Polaroid 665 film, Polaroid Corp·)攝影。 將負片以25°C 5分鐘顯像，M细菌生長密度計（cs-9000 :島津）檢定而得到「細菌生長密度計單位」。 又，於上述中將利用不含RNA時之PCR產物的结果作為 陰性對照組。 又，於上述中使用之引子係如下述第3表所示。 本纸張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562928 五、發明説明（23 ) 第3表 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 第1回合PCR引子 鹼基序列 外方引子 5 ’-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3 ’ 外方反意引子 5T-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3τ 第2回合PCR引子 鹼基序列 內方引子 5，-GCTGTCCCACTTACAGATGCA-3， 内方反意引子 5f-TCAAAGCGCCAGCTGGAGTTT-3f 又，作為內部控制組之/9肌動蛋白引子者係使用文獻 [Proc· Natl· Acad· Sci· USA·,S2, 6133, (1985)]中記 載者。此等之各個引子皆依常法化學合成。 為了將RT-PCR之RNA使用量與各樣本中RNA分解之相異 標準化，將WT1遺傳基因之结果（細菌生長密度計單位）除 MyS肌動蛋白之结果，K此作為WT1遺傳基因表現水平。 又，關於巴知發現了WT1遺傳基因之细胞株K 562 [Lozzio, C.B.和Lozzio, B.B.,具有陽性費城染色體人類 慢性骨髓性白血病細胞系，血液，处，321-334(1995)]， 乃將依上述所測定之WT1遺傳基因表現水平作為基準（1.00) 本紙張尺度適用中國國家標隼（CMS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

562928 A7 B7 五、發明説明（24 ) ，算出各被檢细胞分化之WT1遺傳基因表現水平為其相對 比。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將结果示於第3圖。 圖中，縱軸係表示將K562株（表中示為[K562])中WT1 遣傳基因表現水平作為10°時，各被檢细胞（CD34-细胞分 化）中WT1遺傳基因表現水平相對值各個地描點而成者，試 驗之细胞各個如Μ下者。 (I) 〜（4) · · ·患者周圍造血幹細胞之CD34-細胞分化 (5)〜（9)...白血病细胞之CD34-细胞分化 (10) ·. ·胃癌细胞之CD341田胞分化 (II) ，（12)···大腸癌细胞之CD34-细胞分化 (13)，（14)···肺癌细胞之CD34-細胞分化 (15) ♦ · ·乳癌細胞之CD34-細胞分化 (16) ，（17)···卵巢癌细胞之〇034_细胞分化 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由該圖可判明其次之事項。即，新鮮之白血病細胞係 由CD34+细胞與CD341田胞所成，那一邊之细胞皆發現WT1 高水平[10-1〜10。程度：參照（5)〜（9)]。另一方面，正 常造血幹細胞之CD34-細胞分化其WT1之表現水平低，為 1〇_4Μ下[參照（1)〜（4)。但此等之细胞的CD34+细胞分化 的WT1表現水平高]。 由此等事實可知，若白血病细胞（為⑶料-)混入，WT1 水平上昇，若白血病細胞以1〇3〜1〇4個正常细胞中有1個 白血病細胞的比例混入的話，藉由測定此CD341田胞分化 之WT1值可檢測出來。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 562928 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（25 ) Μ此檢測可判明：若確認白血病细胞存在於採取之造 血幹细胞CD341田胞分化中，則同時地可明白實際上移植 時所利用之同造血幹细胞的CD34+细胞分化中亦存在白血 病细胞，此细胞對於移植之利用從其安全性考量應予避免 〇 又，關於固態癌，因固態癌细胞本來為CD34-，若採 取之造血幹细胞中有癌细胞混入時，其大部分存在於CD34_ 细胞分化，所以由此分化之WT1測定，與上述同樣為之， 可確認癌細胞之混入。 如Μ上，Μ本發明方法，可確實地檢定移植用組織中 有無白血病细胞Β至於癌细胞的混入。 產業上之利用可能性 本發明提供一固態癌细胞Κ及異常性之檢測方法與移 植用組纖之檢查方法，藉由此等可判斷固態癌之檢測、診 斷或已知MDS等白血病化之各種疾患中該白血病化的風險 或預後，又，可確認移植用組織之安全性，於臨床上有用 〇 特別是本發明之固態癌细胞檢測方法於各種固態癌之 發生機轉或病態之閫明、此等疾患之診斷等有用。更詳言 之，以本發明可進行： I病巢為惡性與否之診斷。 2. 與癌病巢同一組織內之癌细胞的浸潤的診斷或對含 骨髓之遠隔臟器、淋巴節有無癌轉移的診斷。 3. 各種體液、胸水、腹水中有無癌细胞之診斷。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562928 Α7 Β7 五、發明説明（26 ) 4. 周圍血中之癌细胞之檢測。 5. 骨髓移植、周圍血幹细胞移植時，檢測在採取骨髓 Μ及採取周圍血幹细胞分化中混入之癌细胞等。又，依本 發明者之見識，確認於胚细胞瘤（germ cell tumor)中存 在WT1之高表現型與低表現型，WT1亦可作K胚细胞癌為首 之固態癌中之惡性度等的新分類。如此檢測固態癌性質之 差異，特別是於病理學上不可能區別之胚細胞癌上，成為 惡性度等在臨床上有用的指標者。 n' ϋϋ ϋϋ ϋϋ ϋϋ ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）

Claims (1)

1. 562928 4^·告公 8 8 8 8 A BCD 正充 修補 β 2 ο 月1· 六、申請專利範圍 第關4912號專财請案中請專利範圍修正本 1 ^ m ^ 修正曰期·· 92年1月2曰 種固“細胞之檢測方法，其特徵在於：藉由測定被 檢組織tWTi遺傳基因之表現位準，而檢_選自於胃 癌、大腸癌、肺癌、贸儒 Μ 礼癌胚種細胞癌及甲狀線癌中的 固怨癌細胞。 2. 如申請專利範圍第i項之檢測方法，其中咖遺傳基因之 表現位準的測定乃以該遺傳基因之轉錄物測定而為之。 3. -種異常性（atypia)之檢測方法，其特徵在於：測定被檢 ^織中WT1遺傳基因之表現位準，而檢測出該組織之異 常性，該被檢組織係源自於—疑有異常性之病患。 4. 如申凊專利$|圍第3項之檢測方法，其中被檢組織為骨體 異常性症候群之被檢組織。 5·如申凊專利範圍第3項之檢測方法，其中π”遺傳基因之 表現位準的測定，乃以其轉錄物之測定而為之。 6.種k測移植用、址織中《白血病細胞及/或固態癌細胞 之存在性的方法，其特徵在於其包含下列步驟： (a) 取付月也移植或周圍幹細胞移植用之組織，及 (b) 測疋在遠移植用組織之CD34·細胞部分中的WT1 遺傳基因表現位準， 而k測出該組織中白血病細胞及/或固態癌細胞。