CN105969892B - Csrp2在作为评估成人b-all患者预后风险标记物中的应用 - Google Patents

Csrp2在作为评估成人b-all患者预后风险标记物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CSRP2在作为评估成人B‑ALL患者预后风险标记物中的应用。本发明所提供的应用具体为用于检测编码CSRP2蛋白的mRNA的检测物在制备用于B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险评估的产品或评估B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险中的应用。本发明实验结果证明，CSRP2低表达可能是成人B‑ALL患者OS、EFS和RFS的独立危险因素，可能在B‑ALL的分层诊断和预后评估中发挥重要作用。

Description

CSRP2在作为评估成人B-ALL患者预后风险标记物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及CSRP2在作为评估成人B-ALL患者预后风险标记物中的应用。
背景技术
B系急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是成人最常见的ALL类型，危险分层和治疗方式的进步显著改善了患者的预后，但成人B-ALL复发率高，总体预后仍较差，长期生存仅为30％-40％。目前的危险度分层根据年龄，初诊白细胞计数，染色体核型，中枢神经系统受累以及对初始治疗的反应等将患者分为标危和高危[Burke PW,Douer D.Acute lymphoblastic leukemia in adolescents and young adults.ActaHaematol.2014；132:264–73.]。但值得注意的是，标危患者中仍有部分患者复发，提示目前的危险度分层仍有待精准化，因此新的预后相关分子标记物的发现和验证对于更精确的危险度分层十分必要，且可能提供治疗靶点。
半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2(cysteine and glycine rich protein 2,CSRP2)是CSRP2基因家族成员之一，参与调节生长发育和细胞分化，可能在肿瘤发生中有一定作用。已有报道CSRP2在乳腺癌中上调，促进乳腺癌侵袭和转移[Hoffmann C,Mao X,DieterleM,Moreau F,Al Absi A,Steinmetz A,Oudin A,Berchem G,Janji B,Thomas C.CRP2,anew invadopodia actin bundling factor critically promotes breast cancer cellinvasion and metastasis.Oncotarget.2016Mar 22；7(12):13688-705.]。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种CSRP2mRNA的新用途。
本发明所提供的新用途具体为用于检测编码CSRP2蛋白的mRNA的检测物在如下(A)或(B)中的应用：
(A)制备用于B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险评估的产品；
(B)评估B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险。
本发明还提供了一种用于评估B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险的产品，含有用于检测编码CSRP2蛋白的mRNA的检测物。
根据需要，所述产品还可包含数据处理装置1；所述数据处理装置1内设模块1；所述模块1具有如下(a1)和(a2)所示的功能：(a1)以由若干名未采取任何治疗措施的B系急性淋巴细胞白血病患者组成的待测群体的离体骨髓为标本，测定每份标本中所述mRNA的表达量，然后按照所述mRNA的表达量由低到高的顺序将所述待测群体进行排列并四等分，将表达量最低的1/4所述待测群体作为CSRP2低表达组，将其余3/4所述待测群体作为CSRP2高表达组；(a2)按照如下标准确定来自于所述待测群体的待测者的预后风险：来自于所述CSRP2低表达组中的待测者的预后风险高于或候选高于来自于所述CSRP2高表达组中的待测者。
在本发明中，所述检测物可为任何能够实现对所述mRNA进行定量检测的试剂和/或仪器。具体可选自如下中任一种：用于检测所述mRNA的特异性扩增引物和/或探针。对所述mRNA进行定量检测包括但不限于：设计CSRP2的PCR引物使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测CSRP2的mRNA。
在本发明中，所述检测物具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对，和/或由序列表中序列3所示的单链探针；所述单链探针的5’端标记有荧光报告基团(如FAM)，3’端标记有荧光猝灭基团(如BHQ)。
根据需要，所述产品中还可含有用于检测IKZF1基因是否缺失的物质。
其中，这里的IKZF1基因缺失具体有如下几种情况：IKZF1基因的编码蛋白缺失第4-7个外显子、缺失第4-8个外显子、缺失第2-7个外显子和缺失第2-8个外显子。所述的IKZF1基因缺失可为如上情况中的任一种。
在本发明中，所述用于检测IKZF1基因是否缺失的物质具体为实施例1表1中所示的“IKZF1Δ4-7,Δ4-8,Δ2-7和Δ2-8缺失引物和TaqMan探针”。
进一步，所述IKZF1基因的GenBank登录号为NC_000007.14的第50303453-50405101位。
相应的，所述产品还可包含数据处理装置2；所述数据处理装置2内设模块2；所述模块2具有如下(b1)和(b2)所示的功能：(b1)以由若干名未采取任何治疗措施的B系急性淋巴细胞白血病患者组成的待测群体的离体骨髓为标本，测定每份标本中所述IKZF1基因是否缺失，然后将所述待测群体分为IKZF1基因正常组和IKZF1基因缺失组；之后按照前文所述(a1)再将所述待测群体分为CSRP2低表达组和CSRP2高表达组；(b2)按照如下标准确定来自于所述待测群体的待测者的预后风险：在所述IKZF1基因正常组中，来自于所述CSRP2低表达组中的待测者的预后风险高于或候选高于来自于所述CSRP2高表达组中的待测者；在所述IKZF1基因缺失组中，来自于所述CSRP2低表达组中的待测者的预后风险不高于或候选不高于来自于所述CSRP2高表达组中的待测者。
所述“用于检测编码CSRP2蛋白的mRNA的检测物”以及所述数据处理装置1在制备用于B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险评估的产品或评估B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险中的应用也属于本发明的保护范围。
所述“用于检测编码CSRP2蛋白的mRNA的检测物”、所述“用于检测IKZF1基因是否缺失的物质”以及所述数据处理装置2在制备用于B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险评估的产品或评估B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险中的应用也属于本发明的保护范围。
在本发明中，所述预后风险为经过实施例1中相应治疗后的预后风险。所述预后风险的高低具体可体现为如下指标中的全部或部分：总生存率(OS)，无复发生存率(RFS)和无事件生存率(EFS)。
若所述总生存率(OS)越低，和/或所述无复发生存率(RFS)越低，和/或所述无事件生存率(EFS)越低，则所述预后风险越高；若所述总生存率(OS)越高，和/或所述无复发生存率(RFS)越高，和/或所述无事件生存率(EFS)越高，则所述预后风险越低。
所述产品中还可包含记载有如下内容中的全部或部分的可读性载体：(1)采集待测者与健康对照者的骨髓标本，并测定其中所述mRNA的表达量，若所述待测者的骨髓标本中所述mRNA的表达量显著高于健康对照者的骨髓标本中所述mRNA的表达量，则所述待测者为或候选为B系急性淋巴细胞白血病患者；反之，则所述待测者不为或候选不为B系急性淋巴细胞白血病患者。(2)所述CSRP2低表达组的pre-B-ALL比例显著高于所述CSRP2高表达组。(3)所述CSRP2低表达组的IKZF1缺失阳性率显著低于所述CSRP2高表达组。(4)MLL重排仅出现在所述CSRP2高表达组，而在所述CSRP2低表达组中未出现。(5)单因素分析，所述CSRP2低表达组的所述总生存率(OS)显著低于所述CSRP2高表达组，但是所述CSRP2低表达组的所述无复发生存率(RFS)和无事件生存率(EFS)均与所述CSRP2高表达组无显著差异。(6)纳入CSRP2表达水平、年龄(≥vs.<35岁)(按照年龄对患者进行分组，分为大于等于35岁或小于35岁)、性别、白细胞计数(≥vs.<30×109/L)(按照初诊时白细胞计数对患者进行分组，分为大于等于30×109/L或小于30×109/L)、BCR-ABL1、MLL重排、IKZF1缺失和治疗方式(是否移植)预后相关因素，多因素分析显示所述CSRP2低表达组的所述总生存率(OS)、所述无复发生存率(RFS)和无事件生存率(EFS)均显著高于所述CSRP2高表达组。(7)纳入CSRP2表达水平、MLL重排、BCR-ABL1及治疗方式共4项因素，在所述IKZF1基因正常组中，所述CSRP2低表达组的所述总生存率(OS)、所述无复发生存率(RFS)和无事件生存率(EFS)均显著高于所述CSRP2高表达组。
在本发明中，所述B系急性淋巴细胞白血病患者为14岁以上的B系急性淋巴细胞白血病患者。
在本发明中，所述CSRP2蛋白为序列表中序列4所示蛋白质。编码所述CSRP2蛋白的mRNA的序列为序列表中序列5。
本研究首次研究CSRP2基因对成人B-ALL预后的影响，并发现CSRP2低表达是成人B-ALL患者OS、EFS和RFS的独立危险因素，且其对预后的影响在IKZF1阴性的患者中更为显著。本发明可能在B-ALL的分层诊断和预后评估中发挥重要作用。
附图说明
图1为CSRP2低表达组及CSRP2高表达组预计3年OS、EFS和RFS的比较分析，以及多因素分析CSRP2低表达对OS、EFS和RFS的影响。其中，A-C分别为CSRP2低表达组及CSRP2高表达组预计3年OS、EFS和RFS的比较分析；D-F分别为多因素分析CSRP2低表达对OS、EFS和RFS的影响。
图2为IKZF1正常组中CSRP2低表达组和CSRP2高表达组预计3年OS、EFS和RFS的比较分析，以及IKZF1缺失组中CSRP2低表达组和CSRP2高表达组预计3年OS、EFS和RFS的比较分析。其中，A-C分别为IKZF1正常组中CSRP2低表达组和CSRP2高表达组预计3年OS、EFS和RFS的比较分析；D-F分别为IKZF1缺失组中CSRP2低表达组和CSRP2高表达组预计3年OS、EFS和RFS的比较分析。
图3为针对44例IKZF1正常组患者，建立cox回归模型，纳入CSRP2表达水平、MLL重排、BCR-ABL1及治疗方式共4项因素，多因素分析IKZF1正常组中CSRP2低表达对OS、EFS和RFS的影响。其中，A-C分别表示OS、EFS和RFS。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、CSRP2低表达—成人B系急性淋巴细胞白血病潜在的独立危险因素
一、研究对象与方法
(一)研究对象
1、入组标准
收集2008年12月至2015年9月北京大学人民医院初诊为B-ALL的83例患者作为研究组。入选标准：①年龄≥14岁；②符合B-ALL标准诊断(参照WHO关于前体B和T细胞肿瘤分类标准)；③均为初诊，未进行任何相关治疗。另选择43例造血干细胞移植健康供者作为对照组，入选标准：①年龄≥14岁；②经检查排除血液系统疾病。本研究经我院伦理委员会批准。患者或患者监护人(若患者年龄<18岁)均签署知情同意书。
2、诊断、危险度分层和治疗反应
骨髓穿刺和活检的细胞形态学分析根据WHO分类标准，同时结合细胞化学方法，采用流式细胞术常规检测免疫表型，应用实时荧光定量PCR方法检测ALL相关融合基因。Pro-B-ALL定义为CD10-，CD19+，cCD79a+，cCD22+以及TdT+；Pre-B-ALL定义为胞浆μ+，slg-，CD10+/-；Com-B-ALL定义为CD10，CD19，CD22和CD79a表达以及表面Ig-[Bassan R,Gatta G,Tondini C,Willemze R.Adult acute lymphoblastic leukaemia.Crit Rev OncolHematol.2004；50:223–61.和J.Jaso,D.A.Thomas,K.Cunningham,J.L.Jorgensen,H.M.Kantarjian,L.J.Medeiros,et al.,Prognostic significance ofimmunophenotypic and karyotypicfeatures of Philadelphia positive B-lymphoblastic leukemia in the era oftyrosine kinase inhibitors,Cancer 117(2011)4009–4017.]。有任何以下任何一种异常定义为高危：1、低倍体；2、t(v；11q23)或MLL重排；3、t(9；11)或BCR-ABL基因突变；4、复杂核型。无以上异常则定义为标危[J.C.Alvarnas,P.A.Brown,P.Aoun,K.K.Ballen,N.Bellam,W.Blum,et al.,Acutelymphoblastic leukemia,J.Natl.Compr.Canc.Netw.JNCCN 10(2012)858–914.]。完全缓解(CR)定义为骨髓原始淋巴细胞<5％，中性粒细胞>1.0×109/L，血细胞>100×109/L，无髓外复发，持续4周以上；复发定义为完全缓解的患者出现骨髓原始细胞>5％或髓外白血病[J.C.Alvarnas,P.A.Brown,P.Aoun,K.K.Ballen,N.Bellam,W.Blum,et al.,Acutelymphoblastic leukemia,J.Natl.Compr.Canc.Netw.JNCCN 10(2012)858–914.]。
3、治疗方案
所有患者接受诱导化疗，若患者达完全缓解，给予巩固治疗2疗程；2疗程巩固化疗后，部分患者再进行0-2疗程巩固化疗后行造血干细胞移植；未移植的患者继续接受巩固治疗1到1.5年，后继续进行维持化疗至少1年。诱导化疗方案包括VDCLP(长春新碱1.5mg/m2/d,d1,8,15,22，即在治疗第1,8,15,22天给予4次；柔红霉素45mg/m2/d,d1-3和d15-17；环磷酰胺800mg/m2/d,d1和d15；泼尼松60mg/m2/d,d1-19；左旋门冬酰胺酶10,000U/m2/d,d19-28)。巩固治疗方案包括hyper-CVAD(B)(甲氨蝶呤1g/m2/d,d1；和阿糖胞苷6g/m2/d,d2-7)；hyper-CVAD(A)(环磷酰胺600mg/m2/d,d1-3；柔红霉素50mg/m2/d,d4-5；长春新碱2mg/m2/d,d4；地塞米松40mg/d,d1-4和d11-14)；甲氨蝶呤和左旋门冬酰胺酶(甲氨蝶呤1g/m2/d,d1；左旋门冬酰胺酶10,000U/m2/d,d2-8)或CAM(环磷酰胺800mg/m2/d,d1；阿糖胞苷100/m2/d,d1-7；6-巯基嘌呤75mg/m2/d口服,d1-7)交替应用。维持治疗包括6-巯基嘌呤50mg/m2/d口服，每天1次和甲氨蝶呤MTX 20mg/m2/d口服，每周1次。中枢神经系统白血病预防：患者在诱导和巩固化疗期间接受8～10次三联药物(甲氨蝶呤、阿糖胞苷和地塞米松)鞘内注射[YanCH,Jiang Q,Wang J,Xu LP,Liu DH,Jiang H,Chen H,Zhang XH,Liu KY,HuangXJ.Superior survival of unmanipulated haploidentical hematopoietic stem celltransplantation compared with chemotherapy alone used as post-remissiontherapy in adults with standard-risk acute lymphoblastic leukemia in firstcomplete remission.Biol Blood Marrow Transplant.2014Sep；20(9):1314-21.]。46例(53％)患者接受异基因造血干细胞移植，17例(37％)HLA全相合，29例(63％)HLA半相合(1个HLA抗原不合1例，2个HLA抗原不合7例，3个HLA抗原不合21例)。HLA全合移植患者，预处理方案包括：阿糖胞苷(Ara-C)，环磷酰胺(CTX)，白舒菲(BU)以及甲环己亚硝脲(MeCCNU)。对HLA不合/单倍体移植患者，预处理方案加用抗人胸腺球蛋白(ATG)。所有供者均接受rhG-CSF 5μg/(kg·d)，连续皮下注射5～6天。第4天采集骨髓，有核细胞要求达3～4×108/kg；第5～6天应用COBE血细胞分离机采集外周血干细胞，循环总量约10L，总单个核细胞达3～4×108/kg；所有采集物根据供受者ABO血型相合程度进行必要的去红和/或去浆处理后立即回输给患者。移植物抗宿主病预防采用环孢素，骁悉和短程环磷酰胺联合方案[Huang XJ,Liu DH,Liu KY,Xu LP,Chen H,Han W,Chen YH,Zhang XH,Lu DP.Treatment of acuteleukemia with unmanipulated HLA-mismatched/haploidentical blood and bonemarrow transplantation.Biol Blood Marrow Transplant.2009Feb；15(2):257-65.]。
4、评价终点
总生存(OS)定义为从CR1开始至死亡的时间。无事件生存(EFS)定义为从CR1开始至第1次复发或死亡的时间。无复发生存(RFS)定义为从CR1开始至第1次复发的时间。观察截止时间为2016年6月1日。
(二)研究方法
1、标本采集
B-ALL患者治疗前，对照组供者动员前，采集骨髓4ml，加入EDTA抗凝，应用密度梯度离心法提取单个核细胞。
2、CSRP2表达量测定
CSRP2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。所述编码CSRP2蛋白的mRNA的序列为序列表中序列5。
将骨髓标本加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液，梯度离心，分离出单个核细胞。采用美国Invitrogen公司TRIzol提取单个核细胞总RNA，Nanodrop1000检测总RNA的浓度和纯度，已制备的总RNA置于-80℃保存备用。使用Applied Biosystems公司的cDNA逆转录试剂盒进行逆转录。应用Primer Express 2.0软件设计CSRP2引物和探针如下：
CSRP2-FP：5’-GTGATGGCAGGAGCTTCCA-3’(序列1)；
CSRP2-RP：5’-GCCACTGTTGTGCTATCTAAATTTTT-3’(序列2)；
CSRP2-Probe：5’-FAM-CGCTGCTGCTTTCTCTGCATGGTTT-BHQ-3’(序列3)。
ABL1(GenBank：NM_005157)作为内参对照，扩增内参ABL1的引物和探针序列如下：
ABL1-FP：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’；
ABL1-RP：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’；
ABL1-Probe：5’-FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-BHQ-3’。
使用PCR Master Mix试剂盒配置10μl PCR反应体系如下：5μlUniversal PCR Master Mix；400nM引物；250nM荧光探针；150-500ng cDNA。使用ABI7500 FAST RT-PCR仪进行PCR分析，循环体系为：50℃2min，95℃10min，然后95℃15s，50℃1min进行50个循环。应用标准曲线计算CSRP2和ABL的表达量。系列稀释表达ABL的质粒(参见“Gabert J,Beillard E,van der Velden VH,Bi W,Grimwade D,PallisgaardN,et al.Standardization and quality control studies of “real-time”quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion genetranscripts for residual disease detection in leukemia—a Europe AgainstCancer program.Leukemia.2003；17:2318–2357”一文中的“ABL plasmid”)(106、105、104、103、102、101和100拷贝/μl)，建立标准曲线。Ct值和质粒拷贝数的对数间呈线性相关，相关系数>0.99。标准曲线显示ABL和CSRP2扩增效率相似，斜率分别为-3.50和-3.49。扩增曲线阈值设置为0.082。CSRP2在阳性骨髓标本的检测敏感性为10-5。
BCR-ABL1，MLL-AF4的检测方式如前所述[Gabert J,Beillard E,van der VeldenVH,Bi W,Grimwade D,Pallisgaard N,Barbany G,Cazzaniga G,Cayuela JM,CavéH,PaneF,Aerts JL,De Micheli D,Thirion X,Pradel V,González M,Viehmann S,Malec M,Saglio G,van Dongen JJ.Standardization and quality control studies of 'real-time'quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusiongene transcripts for residual disease detection in leukemia-a Europe AgainstCancer program.Leukemia.2003Dec；17(12):2318-57.]。
WT1的检测方式如前所述[Qin YZ,Wang Y,Zhu HH,Gale RP,Zhang MJ,Jiang Q,Jiang H,Xu LP,Chen H,Zhang XH,Liu YR,Lai YY,Jiang B,Liu KY,Huang XJ.LowWT1transcript levels at diagnosis predicted poor outcomes of acute myeloidleukemia patients with t(8；21)who received chemotherapy or allogeneichematopoietic stem cell transplantation.Chin J Cancer.2016May 19；35(1):46.]。
IKZF1缺失的检测方式参照如前所述[Yao QM,Liu KY,Gale RP,Jiang B,Liu YR,Jiang Q,Jiang H,Zhang XH,Zhang MJ,Chen SS,Huang X-J,Xu LP*and Ruan GR*.Prognostic impact of IKZF1 deletion in adults with common B-cell acutelymphoblastic leukemia.BMC Cancer.2016；16(269):DOI 10.1186/s12885-016-2300-7及Caye A,Beldjord K,Mass-Malo K,Drunat S,Soulier J,Gandemer V,etal.Breakpoint-specific multiplex PCR allows the detection of IKZF1 intragenicdeletions and minimal residual disease monitoring in B-cell precursor acutelymphoblastic leukemia.Haematologica.2013；98:597–601]。具体而言，本发明检测IKZF1缺失与否的方法如下：
(1)样本来源
骨髓DNA样本选自在北京大学人民医院就诊的初治成人普通B-ALL患者。诊断参照2008年世界卫生组织(WHO)造血与淋巴组织分类标准。本研究获得北京大学人民医院医学伦理会批准，遵循赫尔辛基宣言。
(2)试剂和材料
DNAzol试剂盒：美国Invitrogen公司。2×Universal PCR Mastermix：北京天根生物技术有限公司。荧光分子量标准(Gene ScanTMSize Standard v2.0)：美国ABI公司。高纯度甲酰胺(Hi-DiTM Formamide)：美国ABI公司。Fast Reaction Tubes：美国ABI公司。NH4Cl、NH4HCO3粉末：美国sigma公司。
(3)主要仪器
超低温冰箱：日本Sanyo公司。超净工作台：北京半导体设备厂。低温高速离心机：GS-15R型，美国Beckman公司。低速离心机：BFX5-320型，白洋离心机厂。移液器：德国Eppendorf公司。ND-1000分光光度计：美国NanoDrop公司。分析天平：上海天平仪器厂。ABI3500基因分析仪：美国ABI公司。PCR扩增仪：GeneAmp PCR System 9700型，美国ABI公司。定量PCR仪：ABL7500FAST，美国Perkin Elmer Cetus公司。
(4)基因组DNA提取
参照DNAzol试剂盒(Invitrogen公司)说明书在无菌条件下提取基因组DNA，方法为：抽取2-3ml骨髓液，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中抗凝，骨髓标本应用红细胞裂解液分离单个核细胞。
用生理盐水洗涤分离出的单个核细胞2次。加入600μl DNAzol试剂，震荡15秒后室温放置5分钟。加入600μl无水乙醇，充分混匀，12000rpm 4℃离心15分钟后，去上清。加入600μl 80％的冷乙醇洗涤一次，室温干燥。加适量的水溶解所提取DNA。经ND-1000分光光度计(NanoDrop科技有限责任公司)检测浓度后(A260:A280比值均>1.8)。置于-80℃保存。
(5)扩增IKZF1基因突变的引物及探针
IKZF1基因缺失具体有如下几种情况：IKZF1基因的编码蛋白缺失第4-7个外显子，或缺失第4-8个外显子，或缺失第2-7个外显子，或缺失第2-8个外显子。其中，所述IKZF1基因的GenBank登录号为NC_000007.14的50303453-50405101位。扩增IKZF1基因突变的引物和探针及扩增内参的引物和探针序列具体如表1所示。
表1 扩增IKZF1基因突变的引物及探针
实时定量PCR利用ABI7500FAST PCR扩增仪完成。PCR反应体系为10μl包括1×TaqMan Universal PCR Master mix 5μl，900nM引物，250nM探针，1μl DNA。PCR步骤：50℃2分钟；95℃10分钟；45个循环(95℃15秒钟；60℃1分钟)。
(6)IKZF1Δ4-7突变标准质粒的构建
IKZF1扩增体系(50μl)：25μl 2×Universal PCR Master mix(天根生物技术有限公司，北京)，400nM引物(C813-FP：5’-CCACAGGGCAAGTCATCCACATTTTG-3’；C814-RP：5’-CAGACCATAGAGTCCCTCCTAGGGGAAAAA-3’；测序引物：C815:5’-TTCTTAGAAGTCTGGAGTCTGTGAAGGTCA-3’)和300ng模板DNA。
PCR反应条件为：95℃5min→(95℃40sec→58℃40sec→72℃60sec)36个循环→72℃10min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。切下目的条带，胶回收，纯化。与pMD18-T质粒载体连接。连接后的重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态。筛选阳性克隆提取质粒并纯化。测序验证片段序列的准确性，得到含目的基因的质粒标准品。
(7)标准曲线的制备
在紫色分光光度计上测定含有目的基因DNA的重组质粒的浓度，根据分子量计算其拷贝数，用灭菌双蒸注射用水1:10稀释梯度，制备成6个系列稀释的定量标准品：106,105，104，103，102，101(拷贝/μl)。按上述实时定量PCR方法进行扩增，得到定量评估目的拷贝数的标准曲线。
(8)定量PCR检测IZKF1突变灵敏度测定
将8例IKZF1突变的ALL患者DNA标本，用灭菌注射用水1:10稀释梯度，制备成6个系列的稀释样品：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6稀释样本。按上述实时定量PCR方法进行扩增，得到检测ALL患者骨髓样本中IKZF1基因的灵敏度检测结果。
3、流式细胞术和染色体核型分析
免疫分型检测如前报道[Liu YR,Yu H,Chang Y,Chen SS.[The application of4-color fluorescence labeling antibodies and its significance inimmunophenotyping for leukemia by flow cytometer].Zhongguo Shi Yan Xue Ye XueZa Zhi.2002Oct；10(5):423-7.]。细胞遗传学分析应用标准G显带方法[12.Zhang Y,He Q,Huang XJ,Jiang H,Yang SM,Lu J,Qing YZ,Shi Y,Dang H,Qiu JY,Lu DP.[Cytogeneticstudy on eosinophilia].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi.2007Jun；15(3):454-7.]。
(三)统计学分析
采用SPSS18.0和Graphad Prism 5.0统计软件进行数据分析。计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。计量资料以中位数(范围)表示，非正态分布资料比较应用Mann-Whitney非参数检验。运用Kaplan-Meier法计算生存率，Log-rank检验进行生存分析，建立Cox比例风险回归模型对CSRP2基因表达水平及其他可能影响预后的因素进行多因素分析，研究CSRP2表达水平对总生存率(OS)，无复发生存率(RFS)和无事件生存率(EFS)等预后指标的影响。P>0.1变量从模型中去除，以P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
CSRP2在83例初诊B-ALL中的表达量显著高于健康供者组[(中位值63.8％；范围0-1368.1％)：(0.4％；0-1.8％)；P<0.001](通过样本内参基因ABL1及目的基因CSRP2的扩增曲线及设定的阈值(0.082)得到其ABL1及CSRP2的Ct值，再根据ABL1标准曲线(由于CSRP2与ABL1扩增效率相近，为减少实验误差，均参照ABL1标准曲线计算)，得到样本ABL1及CSRP2的拷贝数，以CSRP2的拷贝数除以ABL1的拷贝数为样本CSRP2表达量，为了与临床常规所发报告的形式一致，结果再乘以百分之百，最终以CSRP2的拷贝数/ABL的拷贝数×百分数＝样本CSRP2表达量的形式呈现)。按照CSRP2表达水平由低到高的顺序将83例初诊B-ALL患者进行排列并四等分，将表达量最低的1/4患者作为CSRP2低表达组，将其余3/4患者作为CSRP2高表达组，即CSRP2低表达组(21例)及CSRP2高表达组(62例)。相比于CSRP2高表达组，CSRP2低表达组血小板低[46.5(8-152)：52.5(5-338)；P＝0.027]，pre-B-ALL比例高[23.8％(5/21)：4.8％(3/62)；P＝0.022]。而CSRP2高表达组IKZF1缺失阳性率高(54.8％：19.0％，P＝0.004)，MLL重排(n＝9)仅出现在CSRP2高表达组。两组间年龄、性别、白细胞计数和骨髓原始细胞数、BCR-ABL1，WT1过表达或危险度分层无明显差异(表2)
2006年美国血液学年会(ASH)Gokbuget报告中指出pre-B-ALL中70％具有t(4；11)和高白细胞(>100×109/L)，50％以上伴髓系抗原表达(CD13/CD33)，属于高危型，本发明中CSRP2低表达组pre-B-ALL高可能是其预后较差的原因之一。CSRP2高表达组IKZF1缺失阳性率高(54.8％：19.0％，P＝0.004)，MLL重排(n＝9)仅出现在高表达组。MLL重排是B-ALL预后不良因素，IKZF1缺失被认为是成人B-ALL的预后不良因素之一，且常与BCR-ABL1同时出现[13.Beldjord K,Chevret S,Asnafi V,Huguet F,Boulland ML,Leguay T,Thomas X,Cayuela JM,Grardel N,Chalandon Y,Boissel N,Schaefer B,Delabesse E,CavéH,Chevallier P,Buzyn A,Fest T,Reman O,Vernant JP,Lhéritier V,Béné MC,Lafage M,Macintyre E,Ifrah N,Dombret H；Group for Research on Adult Acute LymphoblasticLeukemia(GRAALL).Oncogenetics and minimal residual disease are independentoutcome predictors in adult patients with acute lymphoblasticleukemia.Blood.2014 Jun 12；123(24):3739-49.]，而本发明中虽然高表达组中IKZF1缺失和MLL重排阳性率高，但其总体预后好，提示CSRP2高表达可能能抵消一些传统预后因素的不良影响。
表2 CSRP2表达与预后危险因素的关系
中位随访时间为18.4月(2.1-90.3月)。CSRP2低表达组中位OS(15.4月)较CSRP2高表达组(20.5月)短，CSRP2低表达组及CSRP2高表达组预计3年OS为27％(14-41％)：60％(54-67％)(P＝0.032)，预计3年EFS为36％(25-47％)：58％(52-65％)(P＝0.101)，预计3年RFS为43％(31-54％)：60％(53-66％)(P＝0.240)(图1中A-C)。单因素分析显示CSRP2低表达是OS的预后不良因素[HR＝2.064，95％CI(1.049–4.061)，P＝0.036]，对EFS[HR＝1.729，95％CI(0.891–3.353)，P＝0.105]或RFS[HR＝1.521，95％CI(0.751–3.081)，P＝0.244]无明显影响。
因为混杂因素较多，包括CSRP2和IKZF1的相关性，IKZF1和BCR-ABL1的相关性，以及治疗方式的不同，因此本发明的发明人建立cox多因素回归模型解决混杂的情况，纳入CSRP2表达水平、年龄(≥vs.<35岁)(按照年龄对患者进行分组，分为大于等于35岁或小于35岁)、性别、白细胞计数(≥vs.<30×109/L)(按照初诊时白细胞计数对患者进行分组，分为大于等于30×109/L或小于30×109/L)、BCR-ABL1、MLL重排、IKZF1缺失和治疗方式(是否移植)预后相关因素，多因素分析显示CSRP2低表达组是成人B-ALL的OS[HR＝2.8，95％CI(1.4-5.8)；P＝0.005]、EFS[HR＝2.8，(1.3-5.7)；p＝0.006]和RFS[HR＝2.5，95％CI(1.2-5.3)；P＝0.018]的独立危险因素(图1中D-F)。其他因素中，造血干细胞移植是OS[HR＝0.2，95％CI(0.1-0.4)；P<0.001]，EFS[HR＝0.2，95％CI(0.1-0.4)；P<0.001]和RFS的保护性因素[HR＝0.2，95％CI(0.1-0.4)；P<0.001]，MLL重排是EFS[HR＝5.4，95％CI(1.9-15.2)；P＝0.002]和RFS[HR＝3.9，95％CI(1.5-10.3)；P＝0.005]的独立危险因素(表3)。年龄、性别、白细胞计数、BCR-ABL1、IKZF1缺失等对预后无影响。
表3 83例B-ALL患者OS，EFS和RFS多因素分析
因CSRP2与IKZF1缺失存在相关性(r＝0.271，P＝0.013)，为了解决IKZF1的混杂问题，发明人根据IKZF1缺失与否进行了区组分析。1例患者无IKZF1结果，44例IKZF1正常，38例存在IKZF1缺失。IKZF1正常组中，CSRP2低表达16例，CSRP2高表达28例，CSRP2低表达组和CSRP2高表达组预计3年OS分别为18％(3.8-32％)：60％(51-70％)(P＝0.022)，3年EFS为29％(17-41％)：57％(48-67％)(P＝0.084)，3年RFS为36％(23-50％)：57％(48-67％)(P＝0.246)(图2中A-C)。IKZF1缺失组中，CSRP2低表达5例，CSRP2高表达33例，CSRP2低表达组和CSRP2高表达组预计3年OS分别为60％(38-81％)：44％(29-58％)(P＝0.979)，3年EFS为60％(38-81％)：30％(14-44％)(P＝0.882)，3年RFS为60％(38-81％)：30％(14-46％)(P＝0.956)(图2中D-F)。因BCR-ABL1基因、MLL重排及是否移植等对患者预后均有影响，因此发明人针对44例IKZF1正常组患者，建立cox回归模型，纳入CSRP2表达水平、MLL重排、BCR-ABL1及治疗方式共4项因素，进行多因素分析，结果显示，在IKZF1正常的B-ALL患者中，CSRP2低表达仍是OS[HR＝4.2，95％CI(1.7-10.4)；P＝0.002]、EFS[HR＝3.6，(1.4-9.7)；P＝0.007]和RFS[HR＝2.9，95％CI(1.1-7.9)；P＝0.033]的独立危险因素(图3中A-C；表4)。
表4 44例IKZF1正常的B-ALL患者OS，EFS和RFS多因素分析
本发明的实验结果表明，CSRP2低表达是成人B-ALL患者OS、EFS和RFS的独立危险因素，且其对预后的影响在IKZF1阴性的患者中更为显著。本发明可能在B-ALL的分层诊断和预后评估中发挥重要作用。

Claims (8)

1.用于检测编码CSRP2蛋白的mRNA的检测物在制备用于B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险评估的产品中的应用；
所述检测物为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对，和由序列表中序列3所示的单链探针；所述单链探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述预后风险的高低体现为如下指标中的全部或部分：总生存率，无复发生存率和无事件生存率；
若所述总生存率越低，和/或所述无复发生存率越低，和/或所述无事件生存率越低，则所述预后风险越高；
若所述总生存率越高，和/或所述无复发生存率越高，和/或所述无事件生存率越高，则所述预后风险越低。
3.用于评估B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险的产品，含有用于检测编码CSRP2蛋白的mRNA的检测物；
所述检测物为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对，和由序列表中序列3所示的单链探针；所述单链探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光猝灭基团；
所述产品还包含数据处理装置1；所述数据处理装置1内设模块1；所述模块1具有如下(a1)和(a2)所示的功能：(a1)以由若干名未采取任何治疗措施的B系急性淋巴细胞白血病患者组成的待测群体的离体骨髓为标本，测定每份标本中所述mRNA的表达量，然后按照所述mRNA的表达量由低到高的顺序将所述待测群体进行排列并四等分，将表达量最低的1/4所述待测群体作为CSRP2低表达组，将其余3/4所述待测群体作为CSRP2高表达组；(a2)按照如下标准确定来自于所述待测群体的待测者的预后风险：来自于所述CSRP2低表达组中的待测者的预后风险高于或候选高于来自于所述CSRP2高表达组中的待测者。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述产品中还含有用于检测IKZF1基因是否缺失的物质。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述产品还包含数据处理装置2；所述数据处理装置2内设模块2；所述模块2具有如下(b1)和(b2)所示的功能：(b1)以由若干名未采取任何治疗措施的B系急性淋巴细胞白血病患者组成的待测群体的离体骨髓为标本，测定每份标本中所述IKZF1基因是否缺失，然后将所述待测群体分为IKZF1基因正常组和IKZF1基因缺失组；之后按照权利要求3中的所述(a1)再将所述待测群体分为CSRP2低表达组和CSRP2高表达组；(b2)按照如下标准确定来自于所述待测群体的待测者的预后风险：在所述IKZF1基因正常组中，来自于所述CSRP2低表达组中的待测者的预后风险高于或候选高于来自于所述CSRP2高表达组中的待测者；在所述IKZF1基因缺失组中，来自于所述CSRP2低表达组中的待测者的预后风险不高于或候选不高于来自于所述CSRP2高表达组中的待测者。
6.根据权利要求3-5中任一所述的产品，其特征在于：所述预后风险的高低体现为如下指标中的全部或部分：总生存率，无复发生存率和无事件生存率；
若所述总生存率越低，和/或所述无复发生存率越低，和/或所述无事件生存率越低，则所述预后风险越高；
若所述总生存率越高，和/或所述无复发生存率越高，和/或所述无事件生存率越高，则所述预后风险越低。
7.应用，为如下(A)或(B)：
(A)权利要求3-5任一中所述的“用于检测编码CSRP2蛋白的mRNA的检测物”以及所述的数据处理装置1在制备用于B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险评估的产品中的应用；
(B)权利要求3-5任一中所述的“用于检测编码CSRP2蛋白的mRNA的检测物”、所述的“用于检测IKZF1基因是否缺失的物质”以及所述的数据处理装置2在制备用于B系急性淋巴细胞白血病患者预后风险评估的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述预后风险的高低体现为如下指标中的全部或部分：总生存率，无复发生存率和无事件生存率；
若所述总生存率越低，和/或所述无复发生存率越低，和/或所述无事件生存率越低，则所述预后风险越高；
若所述总生存率越高，和/或所述无复发生存率越高，和/或所述无事件生存率越高，则所述预后风险越低。
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