JP5165890B2 - WT1遺伝子の発現を抑制するsiRNAおよびその利用 - Google Patents
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Description
Call KM, et al : Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms' tumor locus. Cell 60 : 509, 1990 Gessler M, et al : Homozygous deletion in Wilms tumours of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping. Nature 343 '. 774, 1990 Inoue K, et al : WTl as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood 84 : 3071, 1994 Inoue K, et al : Aberrant overexpression of the Wilms tumor gene (WT1) in human leukemia. Blood 89 : 1405, 1997 Yamagami T, Sugiyama H, Inoue K, Ogawa H, Tatekawa T, Hirata M, Kudoh T, Akiyama T, Murakami A, Maekawa T. Growth inhibition of human leukemic cells by WT1 (Wilms tumor gene) antisense oligodeoxynucleotides: implications for the involvement of WT1 in leukemogenesis. Blood. 1996 Apr 1;87(7):2878-84. Inoue K,et al:Wilms’tumor gene(WTl)competes with differentiation−inducing signal in hematopoietic progenitor cells.Blood 91:2969,1998 Oji, Y., Ogawa, H., Tamaki, H., Oka, Y., Tsuboi, A., Kim, E.H., Soma, T., Tatekawa, T., Kawakami, M., Asada, M., Kishimoto, T., and Sugiyama, H. Expression of the Wilms' tumor gene WT1 in solid tumors and its involvement in tumor cell growth. Japanese Journal of Cancer Research, 90: 194-204, 1999. Oji, Y., Miyoshi, S., Maeda, H., Hayashi, S., Tamaki, H., Nakatsuka, S., Yao, M., Takahashi, E., Nakano, Y., Hirabayashi, H., Shintani, Y., Oka, Y., Tsuboi, A., Hosen, N., Asada, M., Fujioka, T., Murakami, M., Kanato, K., Motomura, M., Kim, E.H., Kawakami, M., Ikegame, K., Ogawa, H., Aozasa, K., Kawase, I., and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms’ tumor gene WT1 in de novo lung cancers. International Journal of Cancer, 100: 304-308, 2002. Ueda, T., Oji, Y., Naka, N., Nakano, Y., Takahashi, E., Koga, S., Asada, M., Ikeba, A., Nakatsuka, S., Abeno, S., Hosen, N., Tomita, Y., Aozasa, K., Tamai, N., Myoui, A., Yoshikawa, H., and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms’ tumor gene WT1 in human bone and soft-tissue sarcomas. Cancer Science, 94: 271-276, 2003. Oji, Y., Inohara, H., Nakazawa, M., Nakano, Y., Akahani, S., Nakatusuka, S., Koga, S., Abeno, S., Honjo, Y., Yamamoto, Y., Iwai, S., Yoshida, K., Oka, Y., Ogawa, H., Yoshida, J., Aozasa, K., Kubo, T., and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms’ tumor gene WT1 in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Science, 94: 523-529, 2003. Oji, Y., Miyoshi, Y., Koga, S., Nakano, Y., Ando, A., Nakatuska, S., Ikeba, A., Takahashi, E., Sakaguchi, N., Yokota, A., Hosen, N., Ikegame, K., Kawakami, M., Tsuboi, A., Oka, Y., Ogawa, H., Aozasa, K., Noguchi, S., and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms’ tumor gene WT1 in primary thyroid cancer. Cancer Science, 94: 606-611, 2003. Oji, Y., Yamamoto, H., Nomura, M., Nakano, Y., Ikeba, A., Nakatsuka, S., Abeno, S., Kiyotoh, E., Jomgeow, T., Sekimoto, M., Nezu, R., Yoshikawa, Y., Inoue, Y., Hosen, N., Kawakami, M., Tsuboi, A., Oka, Y., Ogawa, H., Souda, S., Aozasa, K., Monden, M., and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms’ tumor gene WT1 in colorectal adenocarcinoma. Cancer Science, 94: 712-717, 2003. Oji, Y., Miyoshi, S., Takahashi, E., Koga, S., Nakano, Y., Shintani, Y., Hirabayashi, H., Matsumura, A., Iuchi, K., Ito, K., Kishimoto, Y., Tsuboi, A., Ikegame, K., Hosen, N., Oka, Y., Ogawa, H., Maeda, H., Hayashi, S., Kawase, I., and Sugiyama, H. Absence of mutations in the Wilms' tumor gene WT1 in de novo non-small cell lung cancers. Neoplasma, 51:17-20, 2004. Oji, Y., Miyoshi, Y., Kiyotoh, E., Koga, S., Nakano, Y., Ando, A., Hosen, N., Tsuboi, A., Kawakami, M., Ikegame, K., Oka, Y., Ogawa, H., Noguchi, S., and Sugiyama, H. Absence of mutations in the Wilms' tumor gene WT1 in primary breast cancer. Jpn J Clin Oncol, 34:74-7, 2004. Oji Y, Suzuki T, Nakano Y, Maruno M, Nakatsuka S, Jomgeow T, Abeno S, Tatsumi N, Yokota A, Aoyagi S, Nakazawa T, Ito K, Kanato K, Shirakata T, Nishida S, Hosen N, Kawakami M, Tsuboi A, Oka Y, Aozasa K, Yoshimine T, Sugiyama H Overexpression of the Wilms' tumor gene WT1 in primary astrocytic tumors. Cancer Sci. 95:822-7,2004. Oji Y, Yano M, Nakano Y, Abeno S, Nakatsuka S, Ikeba A, Yasuda T, Fujiwara Y, Takiguchi S, Yamamoto H, Fujita S, Kanato K, Ito K, Jomgeow T, Kawakami M, Tsuboi A, Shirakata T, Nishida S, Hosen N, Oka Y, Aozasa K, Monden M, Sugiyama H. Overexpression of the Wilms' tumor gene WT1 in esophageal cancer. Anticancer Res. 24:3103-8, 2004. Oji Y, Nakamori S, Fujikawa M, Nakatsuka S, Yokota A, Tatsumi N, Abeno S, Ikeba A, Takashima S, Tsujie M, Yamamoto H, Sakon M, Nezu R, Kawano K, Nishida S, Ikegame K, Kawakami M, Tsuboi A, Oka Y, Yoshikawa K, Aozasa K, Monden M, Sugiyama H. Overexpression of the Wilms' tumor gene WT1 in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Sci. 95:583-7,2004.
[1] 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する細胞増殖抑制剤
(a)WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター
[2] 二重鎖RNAが、WT1遺伝子の転写産物の17AA部位に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む、[1]に記載の細胞増殖抑制剤
[3] 二重鎖RNAが、WT1遺伝子の転写産物の17AA部位に存在する配列番号:1に記載の塩基配列に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む、[1]に記載の細胞増殖抑制剤
[4] 二重鎖RNAが配列番号:1に記載の塩基配列と配列番号:2に記載の塩基配列との対合を含む、[1]に記載の細胞増殖抑制剤
[5] 二重鎖RNAが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[1]に記載の細胞増殖抑制剤
(a)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(c)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
[6] 標的細胞が癌細胞である、[1]〜[5]のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
[7] 標的細胞が線維肉腫細胞、大腸癌細胞、白血病細胞、または胃癌細胞のいずれかである、[1]〜[5]のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
[8] 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する細胞死誘導剤。
(a)WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター
[9] 二重鎖RNAが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[8]に記載の細胞死誘導剤。
(a)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(c)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
[10] 細胞死がミトコンドリアを介して誘導されることを特徴とする、[8]または[9]に記載の細胞死誘導剤。
[11] 標的細胞が癌細胞である、[8]〜[10]のいずれかに記載の細胞死誘導剤。
[12] 標的細胞が線維肉腫細胞、大腸癌細胞、白血病細胞、または胃癌細胞のいずれかである、[8]〜[10]のいずれかに記載の細胞死誘導剤。
[13] 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞の抗癌剤に対する感受性を増強させる薬剤。
(a)WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター
[14] 二重鎖RNAが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[13]に記載の薬剤。
(a)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(c)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
[15] 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞の細胞死誘導剤に対する感受性を増強させる薬剤。
(a)WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター
[16] 二重鎖RNAが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[15]に記載の薬剤。
(a)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(c)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
[17] 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞においてミトコンドリア膜電位を消失させる薬剤。
(a)WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター
[18] 二重鎖RNAが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[17]に記載の薬剤。
(a)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(c)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
[19] 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する、細胞質へのチトクロムCの放出を増強する薬剤。
(a)WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター
[20] 二重鎖RNAが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[19]に記載の薬剤。
(a)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(c)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
<実施例に用いた細胞>
WT1遺伝子mRNA 17AA部位を標的とするsiRNA発現ベクター作製のため、挿入するDNAを作製した。該標的部位の具体的位置は、配列番号6に示したWT1遺伝子配列の第150位から第179位である。作製した配列を下記に示す(配列番号:3)。
5'- C CCT TCT GTC CAT TTC ACT GAG CTG GAG CT
(標的RNAのアンチセンス鎖-30mer-をコードするDNA)-
-AAAACTCGAGAAAA (ループシークエンスXhoIサイトを含む)-
-AG CTC CAG CTC AGT GAA ATG GAC AGA AGG G
(標的RNAのセンス鎖-30mer-をコードするDNA)-
-GGTACCCCGGATATCTTTTTTT-3'
aag gtg gct cct aag ttc atc tga ttc cag(アンチセンスRNA鎖をコードするDNA、配列番号4)
ctg gaa tca gat gaa ctt agg agc cac ctt(センスRNA鎖をコードするDNA、配列番号5)
を含む。WRI3による標的部位は、配列番号6に示したWT1遺伝子配列の第1101位から1130位である。
WT1遺伝子を高発現するFibrosarcoma cell line HT-1080細胞を10%含Dulbecco’s Modified Medium(DMEM) 中で培養した。トリプシナイズしたHT-1080細胞2x104 cells/2mlを6 well plateにまき、24時間後にFugene 6 (ROCHE)を用いてWRI4ベクターあるいは空ベクター2μgをHT-1080細胞へ導入した。
WRI4ベクターによる細胞増殖抑制効果を検討した。ベクターを導入したHT-1080細胞を、24h、48h、または72h培養し、細胞数を算定した。細胞数の算定は、トリプシナイズした後算定板を用いて算定した。
WRI4ベクターによるWT117AA mRNAの発現抑制効果をRT-PCR法により検討した。
loop1配列(40nt、配列番号:18)を含むWT1mRNAに特異的な配列 ( センス鎖(30nt) ‐ loop1(40nt、配列番号:18) - アンチセンス鎖(30nt) )のオリゴヌクレオチドを1種類、およびloop2配列(10nt : human pre-miR-23のloop配列、配列番号:19)を含むWT1mRNAに特異的な配列( センス鎖(30nt) - loop2(10nt、配列番号:19) - アンチセンス鎖(30nt) )のオリゴヌクレオチドを5種類合成した(Japan Bio Service)。これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングした後piGENEtRNA Pur Vector (Clonetech)のtRNAValpromoterの下流に挿入し、loop1(40nt、配列番号:18)を含むdsRNAを転写するloop1-WRI-4、および、loop2(10nt)を含むdsRNAを転写するWRI-4、WRI-4m、WRI-16m、WRI-17m、およびWRI-18mの計6種類のsiRNA vectorを作製した。これらのうちmと表示されているものはベクター型WT-siRNAの効果を高めるためにセンス鎖に変異を挿入した配列をもつベクターである。それぞれのsiRNA vectorの標的部位および配列を図3、図4および表1に示す。
b:loop1の配列はAAAACTCGAGAAAAAAGGGAGCACAACCATCTGCATTTGAGAGG(配列番号:18)、loop2の配列はCTTCCTGTCA(配列番号:19)である。
WT1mRNAの様々な部位を標的とする6種類のベクター型WT1-siRNA :loop1-WRI4, WRI-4, WRI-4m, WRI-16m,WRI17m, WRI-18mまたはWRI-4m, WRI-16m,WRI17m, WRI-18mの混合物 (図3、図4および表1 )の線維肉腫細胞HT-1080におけるWT1遺伝子発現抑制効率について検討した。
ベクター型WT1-siRNAの細胞増殖に及ぼす影響を解析するために6種類のベクター型WT1-siRNA である、loop1-WRI4, WRI-4, WRI-4m, WRI-16m,WRI17m, WRI-18mまたは、WRI-4m, WRI-16m,WRI17m, およびWRI-18mの混合物導入後72時間における細胞数をカウントした。WT1発現細胞株HT-1080線維肉腫細胞においてすべてのWT1-siRNA処理はMockベクターでの処理に比べ有意に細胞増殖を抑制した。なかでもWRI-4mは90%以上増殖を抑制した。それに対してWT1非発現細胞株PC-14肺癌細胞においては6種類のベクター型WT1-siRNAのいずれの処理によっても細胞増殖は抑制されなかった(図6)。
ベクター型WT1-siRNAによる癌細胞の増殖抑制の機序を明らかにするために、ベクター型WT1-siRNA処理後の細胞におけるアポトーシスの誘導について解析した。2種のWT1発現細胞株HT-1080、AZ-521およびWT1非発現細胞株PC-14においてWRI-4m処理後AnnexinV-FITCおよびPIで二重染色し、フローサイトメトリーにて解析した。
ベクター型WT1-siRNAによるアポトーシス誘導がミトコンドリアを介する経路によるものかどうかを明らかにするために、WT1発現細胞株HT-1080細胞、WT1非発現細胞株PC-14細胞をWRI-4mあるいはMockベクターで処理し72時間後においてミトコンドリア膜電位の状態をMitoLight染色後フローサイトメトリーにて解析した。
抗がん剤の多くはミトコンドリアを介する経路を通じて癌細胞にアポトーシスを誘導する。そこでミトコンドリアの膜電位を消失させるベクター型WT1-siRNAを化学療法剤と併用することにより、癌細胞の抗がん剤に対する感受性を増強することができるのではないかと考えた。そこでベクター型WT1-siRNA (WRI-4mあるいはWRI-16m)処理を行った細胞と行わなかった細胞に対する抗がん剤ドキソルビシンおよびエトポシドの細胞増殖抑制を解析した。
Claims (12)
- 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
(a)WT1遺伝子の転写産物の17AA部位に存在する配列番号:1に記載の塩基配列に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA、若しくは、
以下の(1)〜(2)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA;
(1)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
(2)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター - 二重鎖RNAが、配列番号:1に記載の塩基配列と配列番号:2に記載の塩基配列との対合を含む、請求項1に記載の細胞増殖抑制剤。
- 標的細胞が癌細胞である、請求項1又は2に記載の細胞増殖抑制剤。
- 標的細胞が線維肉腫細胞、大腸癌細胞、白血病細胞、または胃癌細胞のいずれかである、請求項1又は2に記載の細胞増殖抑制剤。
- 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する細胞死誘導剤。
(a)以下の(1)〜(2)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA;
(1)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
(2)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター - 細胞死がミトコンドリアを介して誘導されることを特徴とする、請求項5に記載の細胞死誘導剤。
- 標的細胞が癌細胞である、請求項5又は6に記載の細胞死誘導剤。
- 標的細胞が線維肉腫細胞、大腸癌細胞、白血病細胞、または胃癌細胞のいずれかである、請求項5又は6のいずれかに記載の細胞死誘導剤。
- 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞の抗癌剤に対する感受性を増強させる薬剤。
(a)二重鎖RNAが、以下の(1)〜(2)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA;
(1)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
(2)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター - 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞の細胞死誘導剤に対する感受性を増強させる薬剤。
(a)二重鎖RNAが、以下の(1)〜(2)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA;
(1)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
(2)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター - 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞においてミトコンドリア膜電位を消失させる薬剤。
(a)二重鎖RNAが、以下の(1)〜(2)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA;
(1)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
(2)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター - 以下の(a)から(c)のいずれかを有効成分として含有する、細胞質へのチトクロムCの放出を増強する薬剤。
(a)二重鎖RNAが、以下の(1)〜(2)のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA;
(1)配列番号:9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
(2)配列番号:11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、
(b)(a)の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
(c)(b)のDNAが挿入されたベクター
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