JP2009508493A - すい臓がんを診断するための方法 - Google Patents

すい臓がんを診断するための方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、すい臓がんを診断する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、原発不明転移の原発巣を同定する方法を提供する。その方法は、転移性細胞を含むサンプルを入手し；少なくとも２つの異なるがんに関連するバイオマーカーを評価し；バイオマーカーから得られたデータを組み合わせ、あるアルゴリズムにして（そのアルゴリズムは、基準に対してバイオマーカーを標準化し；各々のバイオマーカーの感受性と特異性を最適化させるカットオフを課し、それらのがんに係る罹患率を加重し、原発巣組織を選択する）；そのアルゴリズムによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、そのがんが特定のがん集団に由来しないことを決定し；そして、任意に、１個以上の更なる、異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、更なるバイオマーカーに対してステップを反復する；ことによる。
【選択図】図１

Description

開示の内容
〔発明の分野〕
本発明は、すい臓がんを診断する方法を提供する。
〔発明の背景〕
すい臓がんは致死の病気であり、米国では年間２７，０００人を超える死亡率である。Lillemoe他（２０００年）参照。その病気であると診断された人々の約８５％が、転移、すなわち、すい臓を越えたその病気の広がりを有し、そして、外科的切除で治癒することがほとんど不可能である。増殖がより早く見られる場合には、はるかによく治癒する望みがあるので、切除されるかもしれない。腫瘍のうち２０％のみが切除可能であり、認められた化学療法の延命効果はかなり低く、そして、治癒の確率は通常２５％かそれ以下である。Kroep他（１９９９年）；Wiesenauer他（２００３年）；Ros他（２００１年）；Ryu他（２００２年）；および、Ito他（２００１年）参照。より早期の診断が、より早期の治療の成功のためには必要である。
超音波検査法(ultrasonography)（ＵＳ）、超音波内視鏡検査法(endoscopic ultrasonography)（ＥＵＳ）、二相スパイラルコンピュータ断層撮影法(dualphase spiral computer tomography)（ＣＴ）、磁気共鳴映像法(magnetic resonance imaging)（ＭＲＴ）、内視鏡的逆行性胆管すい臓造影法(endoscopic retrograde cholangiopancreatography)（ＥＲＣＰ）、および、経皮的微小針吸引法、もしくは、内視鏡超音波誘導微小針吸引法(transcutaneous or EUS-guided fine-needle aspiration)（ＦＮＡ）のような診断的造影方法の進展にもかかわらず、すい臓がんを良性すい臓疾患、特に慢性すい炎、と区別することは難しい。それは、放射線学的特徴、および、造影上の特徴が類似しており、そして、すい臓がんには特異的な臨床症状がないためである。
すい臓がんの初期診断に有用な道具を開発することを目的として、十分な努力がなされてきた。それにもかかわらず、確定診断は、初期治療が効果的でありうる時点を過ぎて病気が進行した後に必然的に行われる試験的手術に、しばしば依存している。米国特許出願公開第２００６００２９９８７号参照。
すい臓外分泌腺腫瘍は、すい管細胞、すい腺房細胞、および、間質細胞から生じるかもしれない。８０％のすい臓がんはすい管上皮組織に由来する。これらの腫瘍の６０％はすい頭部に位置し、１０％はすい尾部に、そして、３０％はすい体部に位置するか、もしくは、びまん性である。Warshau他（１９９２年）参照。組織学的には、これらの腫瘍は分化している（differentiated）、中程度に分化している、および、分化が乏しい、というように等級分けされる。いくつかの腫瘍は、腺扁平上皮腫瘍、粘液性がん、未分化がん、もしくは、骨芽細胞様巨細胞を伴う未分化がんとして分類される。Gibson他（１９７８年）。
すい臓がんに関連したさまざまな遺伝子発現プロファイル、および、遺伝マーカーが提示されてきた。米国特許出願公開第２００５０００９０６７号、同第２００４０２１９５７２号、および、同第２００３０２１２２６４号参照。
〔図面の簡潔な説明〕
図１は、組織パネルにおける２個の遺伝子の発現強度を示しているマイクロアレイデータの図である。（Ａ）前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、（Ｂ）凝固第５因子（Ｆ５）である。棒グラフは、Ｙ軸に強度、Ｘ軸に組織を表している。Panc Caはすい臓がん；Panc Nは正常なすい臓である。
図２は、Agilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。ＲＮＡを、３時間（Ａ）、もしくは、１６時間（Ｂ）のタンパク質分解酵素Ｋの消化により、ＦＦＰＥ組織から単離した。サンプルＣ２２（赤色）は１年前のブロックであり、サンプルＣ２３（青色）は５年前のブロックである。大きさを示すラダー(size ladder)を緑色で示す。
図３は、異なる３つのｑＲＴＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。それらのｑＲＴＰＣＲ法とは、ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写におけるランダムヘキサマープライミング(random hexamer priming)（ＲＨ２段階）；ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写における遺伝子特異的（リバースプライマー）プライミング（ＧＳＰ２段階）；または、１段階反応の遺伝子特異的プライミングとｑＲＴＰＣＲ（ＧＳＰ１段階）；である。１１個のサンプル由来のＲＮＡを３つの方法に分割し、３個の遺伝子［βアクチン（Ａ）；ＨＵＭＳＰＢ（Ｂ）；および、ＴＴＦ（Ｃ）］に対するＲＮＡ量を測定した。各方法で得られたＣｔ値の中央値を実線で示す。
図４は、解析の最適化の図である。（Ａ）および（Ｂ）はAgilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。ＲＮＡを、３時間（Ａ）、もしくは、１６時間（Ｂ）のタンパク質分解酵素Ｋの消化により、ＦＦＰＥ組織から単離した。サンプルＣ２２（赤色）は１年前のブロックであり、サンプルＣ２３（青色）は５年前のブロックである。大きさを示すラダーを緑色で示す。（Ｃ）および（Ｄ）は異なる３つのｑＲＴＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。それらのｑＲＴＰＣＲ法とは、ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写におけるランダムヘキサマープライミング（ＲＨ２段階）；ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写における遺伝子特異的（リバースプライマー）プライミング（ＧＳＰ２段階）；または、１段階反応の遺伝子特異的プライミングとｑＲＴＰＣＲ（ＧＳＰ１段階）；である。１１個のサンプル由来のＲＮＡを３つの方法に分割し、２個の遺伝子［βアクチン（Ｃ）；ＨＵＭＳＰＢ（Ｄ）］に対するＲＮＡ量を測定した。各方法で得られたＣｔ値の中央値を実線で示す。
図５は、２３９個のサンプルに係る１０個のマーカーパネルの相対的な発現量を示すヒートマップである。赤色がより高い発現を表す。
〔詳細な説明〕
バイオマーカーとは、示されたマーカー遺伝子の発現量のあらゆるしるし（indicia）である。このしるしは、直接的もしくは間接的でありうるし、そして、生理学上のパラメータを考慮すれば、かつ、体内における対照、正常組織もしくは他のがんと比較して、遺伝子の過剰発現もしくは発現不足を評価することができる。バイオマーカーは、それに限定はされないが、核酸（過剰発現／発現不足および直接的／間接的の両方）を含む。核酸をバイオマーカーとして用いることには、本技術分野において既知のあらゆる方法を含むことができる。その方法とは、それらに限定はされないが、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ヘテロ接合性消失(loss of heterozygosity)（ＬＯＨ）、一塩基多型(single nucleotide polymorphisms)［ＳＮＰｓ、Brookes（１９９９年）参照］、マイクロサテライトＤＮＡ、ＤＮＡ低メチル化、もしくは、ＤＮＡ高メチル化(hypo- or hyper-methylation)を評価することを含む。タンパク質をバイオマーカーとして用いることには、本技術分野において既知のあらゆる方法を含むことができる。その方法とは、それらに限定はされないが、量、活性、修飾［例えば、グリコシル化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化(ADP-ribosylation)、ユビキチン化(ubiquitination)等］、免疫組織化学的手法（ＩＨＣ）を評価することを含む。他のバイオマーカーには、造影マーカー、細胞計数マーカー、および、アポトーシスマーカーを含む。
本明細書において提供する、示された遺伝子は、特定の腫瘍もしくは組織の種類と関連している遺伝子である。１個のマーカー遺伝子は多くの種類のがんと関連しうるが、もしその遺伝子の発現が、本明細書に記載された特定の原発巣特異的なアルゴリズムを用いて同定される１つの腫瘍もしくは組織の種類と十分に関連するならば、その遺伝子を、原発不明がん（ＣＵＰ）の原発巣組織を決定するために、特許請求の範囲に記載された発明において用いることが可能である。本技術分野では、１個以上のがんと関連する数多くの遺伝子が知られている。本発明は、好ましいマーカー遺伝子、および、さらに好ましいマーカー遺伝子の組み合わせを提供する。このことは本明細書中に詳細に記載されている。
「原発巣組織(tissue of origin)」において言及される「原発巣(origin)」とは、特定の医学的状況に応じて、組織の種類（肺、結腸等）、もしくは、組織型［腺がん(adenocarcinoma)、扁平上皮がん(squamous cell carcinoma)、等］のいずれかを意味し、このことは当業者に理解されるであろう。
マーカー遺伝子は、配列を含む場合に、配列番号(SEQ ID NO)によって示されたその配列に対応する。遺伝子部分もしくは遺伝子断片(gene segment or fragment)は、その遺伝子の配列であることを識別するのに十分な、参照された配列もしくはその相補配列の一部分を含む場合に、このような遺伝子の配列に対応する。遺伝子発現産物は、そのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは、ｃＤＮＡがこのような配列を有する組成物（例えば、プローブ）とハイブリダイズする(hybridizes)場合に、または、ペプチドもしくはタンパク質の場合には、このようなｍＲＮＡによってコードされている場合に、このような配列に対応する。遺伝子発現産物の部分、もしくは、その断片は、その遺伝子もしくは遺伝子発現産物の配列であることを識別するのに十分な、参照された遺伝子発現産物もしくはその補完物の一部分を含む場合に、このような遺伝子もしくは遺伝子発現産物の配列に対応する。
本明細書で説明された、もしくは、特許請求の範囲に記載された、発明に係る方法、組成物、物品、および、キットは、１個以上のマーカー遺伝子を含む。「マーカー」もしくは「マーカー遺伝子」は、本明細書全体を通じて、過剰発現もしくは発現不足が腫瘍もしくは組織の種類と関連している遺伝子に対応する遺伝子、および、遺伝子発現産物について言及するために用いられる。好ましいマーカー遺伝子は、表１および表１５に、より詳細に説明されている。
Figure 2009508493
Figure 2009508493
本発明はすい臓がんを診断する方法を提供する。本発明はしたがって、切除を回避するのに潜在的に十分なほど早期に、すい臓がんを同定することによって治療方針を決定する方法を提供し、ゆえに化学療法を可能にする。
本発明はさらに、配列番号３９〜４１および４３〜４５から選ばれる、少なくとも１個の単離された配列を含む組成物を提供する。本発明はさらに、本明細書において提供された方法にしたがって解析を実施するためのキットであって、バイオマーカー検出試薬(Biomarker detection reagents)をさらに含む、キットを提供する。
本発明はさらに、遺伝子発現を決定するために配列番号４２および４６の単位複製配列を生成すること、および、すい臓がんを診断するために、これらの単位複製配列のうち少なくとも１個を正常組織の遺伝子発現量と比較することによって、遺伝子発現を評価する方法を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記載された方法を実行するためのマイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ(gene chips)を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記載されたような遺伝子の組み合わせに係る、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、それらの一部を含む、診断上の／予後上のポートフォリオ(portfolios)を提供する。この組み合わせは、異なるがん由来の細胞、もしくは、正常組織由来の細胞と比較して、転移性細胞を有する生物サンプルにおける、遺伝子発現を評価するために、または、その遺伝子発現を特徴付けるのに十分なものである。
本発明において説明されたあらゆる方法は、サンプルにおいて構成的に発現する、少なくとも１個の遺伝子の発現を評価することをさらに含むことができる。
好ましくは、すい臓がんのためのマーカーは、凝固第５因子(coagulation factor V)（Ｆ５）、前立腺幹細胞抗原(prostate stem cell antigen)（ＰＳＣＡ）、インテグリン(integrin)β６（ＩＴＧＢ６）、カリクレイン(kallikrein)１０（ＫＬＫ１０）、クラウジン(claudin)１８（ＣＬＤＮ１８）、トリオアイソフォーム(trio isoform)（ＴＲ１０）、および、ＦＫ５０６結合タンパク質と類似した仮想タンパク質ＦＬＪ２２０４１（ＦＫＢＰ１０）である。好ましくは、Ｆ５、および、ＰＳＣＡのバイオマーカーは、同時に評価する。ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および、ＦＫＢＰ１０のバイオマーカーは、Ｆ５、および／もしくは、ＰＳＣＡに加えて、または、Ｆ５、および／もしくは、ＰＳＣＡの代わりに、評価することができる。Ｆ５は、例えば、米国特許出願公開第２００４００７６９５５号；同第２００４０００５５６３号；および、国際公開番号ＷＯ２００４０３１４１２号に記載されている。ＰＳＣＡは、例えば、国際公開番号ＷＯ１９９８０４０４０３号；米国特許出願公開第２００３０２３２３５０号；および、国際公開番号ＷＯ２００４０６３３５５号に記載されている。ＩＴＧＢ６は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０１８９９９号；および、米国特許第６３３９１４８号に記載されている。ＫＬＫ１０は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０７７０６０号；および、米国特許出願公開第２００３０２３５８２０号に記載されている。ＣＬＤＮ１８は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０６３３５５号；および、同ＷＯ２００５００５６０１号に記載されている。ＴＲ１０は、例えば、米国特許出願公開第２００２００５５６２７号に記載されている。ＦＫＢＰ１０は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００００５５３２０号に記載されている。
本発明はさらに、本明細書に記載された方法にしたがって、すい臓がんの存在を決定すること、および、そのすい臓がんに対応する予後を特定することによって、予後診断を提示するための方法を提供する。
本発明はさらに、特定の転移におけるマーカー遺伝子の発現量を決定すること；そのマーカー遺伝子の発現を決定するためのマーカー遺伝子に対するバイオマーカーを評価すること；本明細書に記載された方法にしたがって、マーカー遺伝子の発現を分析すること；および、マーカー遺伝子がすい臓がんに対して効果的に特異的であるかどうかを決定すること；を含む、バイオマーカーを発見する方法を提供する。
本発明はさらに、配列番号３９〜４６から選ばれる、少なくとも１個の単離された配列を含む組成物を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記載された解析を実施するためのキット、物品、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ、診療上の／予後上のポートフォリオ、および、本方法によって得られた結果を報告するための患者報告を提供する。
特定の核酸配列が、組織サンプルに単に存在するかしないかということだけでは、診断上の、もしくは、予後上の価値を持つことはめったにわからなかった。一方、さまざまなタンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡの発現についての情報は、ますます重要なものとみなされている。ゲノムの中に、タンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡを発現する可能性を有する核酸配列（このような配列を「遺伝子」というが）が単に存在するということは、それだけでは、タンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡが所与の細胞において発現するかどうか、決定的なものではない。タンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡを発現することができる所与の遺伝子が発現するかどうかということ、および、たとえそうであっても、どの程度このような発現が起こるかということは、さまざまな複合的要因によって決定される。これらの要因を理解すること、および、判定することの難しさに関わりなく、遺伝子発現を解析することは、重要な事象（例えば、腫瘍形成、転移、アポトーシス、および、臨床上関連のあるその他の現象）の発生についての有用な情報を提供することができる。遺伝子が活性であるか、もしくは、不活性であるかの程度に係る相対的な指標は、遺伝子発現プロファイルに見出すことができる。本発明の遺伝子発現プロファイルは、ＣＵＰの患者に対して診断を提供するために、および、ＣＵＰの患者を治療するために用いられる。
上記の方法において、サンプルを、本技術分野において既知のあらゆる方法によって準備することが可能である。その方法とは、それらに限定されないが、大量組織標本(bulk tissue preparation)、および、レイザーキャプチャーマイクロダイセクション(laser capture microdissection)を含む。大量組織標本は、例えば、生検もしくは外科的な標本から入手することができる。
上記の方法において、遺伝子発現を評価することはまた、サンプルにおいて構成的に発現する、少なくとも１個の遺伝子の発現量を評価することを含むこともできる。
上記の方法において、その特異性は好ましくは少なくとも約４０％であり、その感受性は少なくとも約８０％である。
上記の方法において、事前決定されたカットオフ水準(pre-determined cut-off levels)は、良性細胞もしくは正常組織と比較して、サンプルにおいて少なくとも約１．５倍の過剰発現、もしくは、約１．５倍の発現不足（about 1.5-fold over- or under- expression）である。
上記の方法において、事前決定されたカットオフ水準は、転移性細胞を有するサンプルにおいて、良性細胞もしくは正常組織と比較して、少なくとも統計的に有意なｐ値の過剰発現（statistically significant p-value over-expression）を有し、好ましくはそのｐ値は０．０５未満である。
上記の方法において、遺伝子発現は、本技術分野において既知のあらゆる方法であって、その方法は、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ上で行われるものに限定されず、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(reverse transcription polymerase chain reaction)（ＲＴ−ＰＣＲ）のような、ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction)（ＰＣＲ）によって行われる核酸増幅を含み、タンパク質特異的抗体といった、遺伝子によりコードされたタンパク質を測定または検出する、既知のあらゆる方法によってか、または、ＤＮＡ増幅、メチレーション、突然変異、および、対立遺伝子変異のような遺伝子の特徴を評価することによって、評価することができる。マイクロアレイは、例えば、ｃＤＮＡアレイ、もしくは、オリゴヌクレオチドアレイであることが可能である。これらの方法はすべて、さらに１種以上の内部対照試薬(internal control reagents)を含むことができる。
本発明は、本明細書に記載された方法のうちのいずれかに係る結果を決定すること、ならびに、それらの結果、および、それらによって作られた患者報告を表示する報告を準備することによって、すい臓がんの予後の患者報告を作り出す方法を提供する。その報告はさらに、患者の結果（patient outcome）の判定、および／もしくは、患者集団と比較した危険性の確率を含むことができる。
サンプルの準備には、患者サンプルの収集が必要である。本発明の方法で用いられた患者サンプルは、組織の細針吸引(fine needle aspirate)（ＦＮＡ）により小節から採取された細胞のような、異常細胞を含む疑いがあるサンプルである。生検、もしくは、外科的な標本、および、レイザーキャプチャーマイクロダイセクション(laser capture microdissection)により得られた大量組織標本(bulk tissue preparation)も使用に適している。レイザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）技術は、研究用の細胞を選ぶ１つの方法であり、細胞の種類の不均一性によって生ずるばらつきを最小限にする。その結果、マーカー遺伝子発現における、正常もしくは良性細胞と悪性腫瘍細胞との間の、中程度の、もしくは、小さな変化が容易に検出できる。サンプルはまた、末梢血から抽出された循環系上皮細胞(circulating epithelial cells)も含みうる。これらは多くの方法にしたがって手に入れることができるが、最も好ましい方法は、米国特許第６１３６１８２号に記載された磁気分離法(magnetic separation technique)である。ひとたび目的の細胞を含むサンプルが得られれば、適切なポートフォリオにおける遺伝子のためのバイオマーカーを用いて、遺伝子発現プロファイルが手に入る。
遺伝子発現プロファイルを確立するための好ましい方法は、タンパク質、もしくは、ペプチドをコードしうる遺伝子によって生成されるＲＮＡ量を決定することを含む。このことは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(reverse transcriptase PCR)（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合ＲＴ−ＰＣＲ(competitive RT-PCR)、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ(differential display RT-PCR)、ノザンブロット分析(Northern Blot analysis)、および、その他の関係した検査法によって達成される。個々のＰＣＲ反応を用いてこれらの技術を実施することが可能であるが、ｍＲＮＡから生成される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、もしくは、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を増幅すること、および、マイクロアレイによって分析することが最善である。多くの異なるアレイ配置(array configuration)、および、それらを作製する方法が当業者に知られており、例えば、米国特許第５４４５９３４号；同第５５３２１２８号；同第５５５６７５２号；同第５２４２９７４号；同第５３８４２６１号；同第５４０５７８３号；同第５４１２０８７号；同第５４２４１８６号；同第５４２９８０７号；同第５４３６３２７号；同第５４７２６７２号；同第５５２７６８１号；同第５５２９７５６号；同第５５４５５３１号；同第５５５４５０１号；同第５５６１０７１号；同第５５７１６３９号；同第５５９３８３９号；同第５５９９６９５号；同第５６２４７１１号；同第５６５８７３４号；および、同第５７００６３７号に記載されている。
マイクロアレイ技術は、何千個もの遺伝子の定常状態ｍＲＮＡ量を同時に評価することができ、それによって、制御されていない細胞増殖の開始、停止、あるいは、調節といった効果を特定するための強力な手法を提示することができる。２つのマイクロアレイ技術が現在広く使われている。第１のものはｃＤＮＡアレイであり、そして、第２のものはオリゴヌクレオチドアレイである。これらのチップの構造にはちがいがあるけれども、本質的には、すべての下流データの分析、および、それらの出力は同一のものである。これらの分析の成果は、通常、標識プローブから受信されるシグナル強度の測定値である。標識プローブは、マイクロアレイ上の既知の位置にある核酸配列にハイブリダイズするサンプル由来のｃＤＮＡ配列を検出するために用いられる。通常、シグナル強度は、サンプル細胞において発現されたｃＤＮＡ量、および、ひいてはｍＲＮＡ量に比例する。大変多くのこのような技術が利用可能であり、有用である。遺伝子発現を決定するための好ましい方法は、米国特許第６２７１００２号；同第６２１８１２２号；同第６２１８１１４号；および、同第６００４７５５号に見出すことができる。

発現量の分析は、このようなシグナル強度を比較することによって実施される。このことは、対照サンプルの発現強度に対する試験サンプルでの遺伝子の発現強度の比率行列を生成することによって、最もよく行われる。例えば、罹患組織由来の遺伝子発現強度は、同じ種類の良性組織、もしくは、正常組織から生じた発現強度と比べることができる。これらの発現強度の比率は、試験サンプルと対照サンプルとの間で、遺伝子発現において、倍の変化（fold-change）があることを示している。
選択は統計的検定に基づくことができる。この統計的検定は、腫瘍のもともとの原発巣部位に関係する因子間において、各遺伝子が差異のある発現をすることに対する有意性の証拠と関係した順位付けされた一覧を提出する。このような検定の例には、分散分析(ＡＮＯＶＡ)、および、クラスカル・ウォリス検定(Kruskal-Wallis)が含まれる。順位付けは、このような、カットオフ(cutoff)までの重みの総計を、他の分類以上に１つの分類の利益になるような証拠の優越として解釈するように設計されたモデルにおいて、重みづけ（weightings）として用いることができる。文献に記載されたような従来の証拠も、その重みづけを調整するために用いてもよい。
好ましい実施形態は、安定した対照群を同定し、この集合をすべてのサンプルにわたってゼロ分散に設定することによって、各測定を標準化することである。解析における系統誤差によって作用され、かつ、この誤差から独立して変化することが知られていない、あらゆる単一の内因性転写産物、もしくは、そのようなあらゆる内因性転写産物の集合として、この対照群は定義される。すべてのマーカーは、対照群のあらゆる記述的統計値（例えば、平均値、もしくは、中央値）に対するゼロ分散、または、直接測定に対するゼロ分散を生ずるサンプル特異的な因子によって調整される。あるいは、系統誤差にのみ関係する対照の分散の前提が真ではなく、しかし標準化が行われた場合に、生ずる分類誤差がより小さくなる場合、対照群はなお、前述のとおり用いられるであろう。非内因性のスパイクコントロール(spike control)もまた役に立ったが、好ましいものではない。
遺伝子発現プロファイルは、多くのやり方で表示することができる。最も一般的な方法は、未加工の蛍光強度もしくは比率行列を、縦に試験サンプルを、横に遺伝子を示した図形的な系統樹上に配置することである。データは、類似の発現プロファイルを有する遺伝子が互いに近位にあるように配置される。各遺伝子の発現率は、色として視覚化される。例えば、１未満の発現率［ダウンレギュレーション(down-regulation)］は、スペクトルの青色部分に現れ、１を超える発現率［アップレギュレーション(up-regulation)］は、スペクトルの赤色部分に現れる。「GeneSpring」（Silicon Genetics, Inc.）、ならびに、「Discovery」および「Infer」（Partek, Inc.）を含む、市販のコンピュータソフトウェアプログラムは、このようなデータを表示するために利用できる。
遺伝子発現を決定するためにタンパク質量を測定する場合、もしそれが結果的に適切な特異性および感受性をもたらすならば、本技術分野において知られているあらゆる方法が適当である。例えば、タンパク質量は、そのタンパク質特異的な抗体、もしくは、抗体断片へ結合することによって、および、抗体結合タンパク質の量を測定することによって、測定することができる。抗体は、検出を容易にするために、放射性試薬、蛍光性試薬、もしくは、他の検出可能な試薬で標識することができる。検出方法は、それらに限定されないが、酵素免疫測定法(enzyme-linked immunosorbent assay)（ＥＬＩＳＡ）、および、免疫ブロット(immunoblot)法を含む。
本発明に係る方法で用いられる調節された遺伝子は、実施例中で説明される。差異のある発現をする遺伝子は、特定の原発巣のがんを有する患者では、異なる原発巣由来のがんを有する者と比べて、アップレギュレートされるか、またはダウンレギュレートされる。アップレギュレーション、および、ダウンレギュレーションとは、いくつかの基準と比較して、遺伝子発現量において（その測定に用いられたシステムにおけるノイズが寄与する以上に）検出可能な差異が見られることを意味する相対的な用語である。この場合、基準はアルゴリズムに基づいて決定される。異常細胞(diseased cells)における目的遺伝子はしたがって、同一の測定方法を用いた基準レベルと比較して、アップレギュレートされるか、もしくは、ダウンレギュレートされるかのどちらかである。本明細書の内容において、異常な(diseased)とは、制御されない細胞増殖とともに起こるような、身体的機能の適切な作動を中断する（すなわち、阻害する）身体の状態変化、もしくは、その適切な作動を阻害する可能性がある身体の状態変化を言う。ある人間の遺伝子型もしくは表現型のいくつかの観点が病気の存在と一致する場合に、その人間は、その病気であると診断される。しかしながら、診断もしくは予後診断を実施するという行為には、再発の可能性、治療の種類、および、治療観察を決定するといった、病気／状態に係る課題の決定を含んでいてもよい。治療観察においては、遺伝子発現プロファイルが正常組織とより矛盾のないパターンに変化したかどうか、もしくは、変化しつつあるかどうかを決定するために、時間をかけて遺伝子発現を比較することによって、所与の一連の治療の効果について、臨床上の判断がなされる。
遺伝子は、グループ化することができる。このため、そのグループの遺伝子群について得られた情報が、診断、予後、もしくは、治療選択のような臨床上関連のある判断を行うためのしっかりした基準を提供する。これらの遺伝子群は、本発明のポートフォリオを作り上げる。大部分の診断マーカーと同様に、正しい医療上の判断を行うのに十分なほどの最も少ない数のマーカーを用いることが、しばしば望ましい。このことは、時間および資源の非生産的な使用を防止すると同時に、更なる分析の間の治療の遅延を防止する。
遺伝子発現ポートフォリオを確立する１つの方法は、株式ポートフォリオを確立するのに広く用いられている、平均分散アルゴリズムのような最適化アルゴリズムを使用することである。この方法は、米国特許出願公開第２００３０１９４７３４号に詳細に記載されている。本質的には、その方法は、収益の変動を最小化すると同時にその収益を使用するために、受け取る収益（例えば、生成されたシグナル）を最適化するであろう入力群（金融応用における株式、本明細書においては、強度によって評価されるような発現）の確立を要求する。多くの市販のソフトウェアプログラムが、このような作業を実行するために利用可能である。本明細書全体を通じて「Wagner Software」と言われる「Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application」は、好ましいものである。このソフトウェアは、有効フロンティアを決定するために、「Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library」からの関数を用い、マーコウィッツの意味（Markowitz sense）における最適ポートフォリオが好ましい。Markowitz（１９５２年）参照。この種のソフトウェアを用いるには、そのソフトウェアを意図された金融分析の目的で用いる場合に株式収益および危険率評価が用いられるように、マイクロアレイデータを入力として扱うことを可能にするために、そのマイクロアレイデータを変換することが必要である。
ポートフォリオを選択する過程はまた、ヒューリスティクスな(heuristic)ルールの適用を含むことができる。好ましくは、このようなルールは、生物学、および、臨床上の結果を生むために用いられた技術への理解に基づいて公式化される。より好ましくは、それらは最適化法からの出力に適用される。例えば、ポートフォリオ選択における平均分散法は、がん患者において差異のある発現をする多くの遺伝子に対するマイクロアレイデータに適用することができる。この方法からの出力は、罹患組織におけるのと同様に、末梢血においても発現された、いくつかの遺伝子を含みうる最適化された遺伝子群であるであろう。もし試験方法において用いられたサンプルが末梢血から得られ、がんの例において差異がある発現をする特定の遺伝子がまた、末梢血においても差異がある発現をすることがあるならば、ヒューリスティクスなルールを適用することができる。そのヒューリスティクスなルールにおいて、ポートフォリオは、末梢血において差異がある発現をするものを除いた有効フロンティアから選択される。もちろん、そのルールは、例えば、データの事前選択の間にそのルールを適用することによって、有効フロンティア形成に先立って適用することができる。
必ずしも問題の生物学と関連がある必要がない他のヒューリスティクスなルールが適用されうる。例えば、所定の割合のポートフォリオのみが、特定の遺伝子もしくは遺伝子群によって示されうる、というルールを適用することができる。Wagner Softwareのような市販のソフトウェアは、容易にこれらのタイプのヒューリスティクスと適合する。このことは、例えば、確度および精度以外の要因（例えば、期待されたライセンス料）が１個以上の遺伝子を含むことの望ましさに対して影響力がある場合、有用でありうる。
本発明の遺伝子発現プロファイルはまた、がんの診断、予後、もしくは、治療観察において有用な、他の非遺伝子的診断法とともに用いられることが可能である。例えば、いくつかの状況下では、前記の遺伝子発現に基づいた方法の診断力を、血清タンパク質マーカー［例えば、がん抗原２７．２９(Cancer Antigen 27.29)（「ＣＡ２７．２９」）］のようなよく用いられるマーカーからのデータと組み合わせることが有用である。このようなマーカーの範囲は、ＣＡ２７．２９のような分析物を含んで存在する。１つのこのような方法において、血液は治療される患者から定期的に採取され、それから前記の血清マーカーのうちの１つに対する酵素免疫測定を受ける。マーカーの濃度が、腫瘍の再発もしくは治療の失敗を示唆する場合、遺伝発現分析を受けることが可能なサンプル源を採取する。疑わしい腫瘤（suspicious mass）が存在する場合、細針吸引法（ＦＮＡ）を採り、それから腫瘤から採取した細胞の遺伝子発現プロファイルを前記のように分析する。あるいは、組織サンプルは、以前に腫瘍を除去した組織に近い領域から採取されてもよい。このアプローチは、他の試験があいまいな結果を示すときに特に有用である。
本発明にしたがって作られたキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するためにフォーマット化された解析を含む。これらは、バイオマーカーを解析する試薬および指示書、ならびに、媒体のような、解析を実施するのに必要な材料のうちすべて、もしくは、一部を含むことができる。
本発明に係る物品は、病気を治療し、診断し、予示し、判定するために有用な遺伝子発現プロファイルの説明（representations）を含む。これらのプロファイルの説明は、コンピュータが読み込み可能な媒体（磁気的、光学的、および、同様の媒体）のような、自動的に機械によって読み込み可能な媒体へ変換される。この物品はまた、このような媒体における遺伝子発現プロファイルを判定するための命令を含むことができる。例えば、この物品は、前記遺伝子に係るポートフォリオの遺伝子発現プロファイルを比較するためのコンピュータ命令を有するＣＤ−ＲＯＭを含んでもよい。物品はまた、患者サンプル由来の遺伝子発現データと比較することができるように、電子的に記録された遺伝子発現プロファイルを有してもよい。あるいは、プロファイルを、別の表現フォーマットで記録することができる。図示された記録はそのようなフォーマットの１つである。前述のPartek, Inc.の「DISCOVERY」および「INFER」ソフトウェアに組み込まれたアルゴリズムのようなクラスタリングアルゴリズム(clustering algorithms)は、このようなデータを視覚化することにおいて、最もよい支援になりうる。
本発明にしたがった別の種類の製品は、遺伝子発現プロファイルを明らかにするために用いられる媒体、もしくは、フォーマット化された解析である。これらは、例えば、相補配列もしくはプローブが、目的遺伝子を示す配列が結合したマトリックスに対して貼り付けられたマイクロアレイを含むことができ、それらの存在の読み取り可能な決定要因を生み出す。あるいは、本発明に係る物品は、がんを検出するための目的遺伝子の発現量を示すハイブリダイゼーション、増幅、および、シグナル生成を実施するための試薬キットへと作られることができる。
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された発明について説明するために提供されたものであるが、その発明を限定するものではない。本明細書に引用されたあらゆる参照文献は、参照により本明細書中に組み入れる。
〔実施例１〕
材料と方法
＜すい臓がんマーカー遺伝子の発見＞
ＲＮＡを、すい臓腫瘍、正常すい臓組織、肺組織、結腸組織、乳房組織、および卵巣組織から、トリゾールを用いて単離した。そのＲＮＡは、増幅され、標識されたＲＮＡを生成するために用いられ［Lipshutz他（１９９９年）参照］、それから、その標識ＲＮＡをAffymetrix U133A array上にハイブリダイズさせた。それから、そのデータは２つの方法で分析された。
１番目の方法では、このデータ群は、データ群全体にわたり、少なくとも２つの存在コール(present calls)を有する遺伝子のみを保有するように、ふるいにかけられた。このようなふるいにかけた結果、１４，５４７個の遺伝子が残った。２，７３６個の遺伝子は、すい臓がんにおいて正常すい臓に対して０．０５未満のｐ値で過剰発現していることがわかった。その２，７３６個の遺伝子のうち４５個の遺伝子はまた、肺および結腸組織で見られた最大強度と比して、少なくとも２倍過剰発現されていた。最終的に、６個のプローブ群が見出され、そのプローブ群は、肺組織、結腸組織、乳房組織、および、卵巣組織で観察された最大強度と比べて、少なくとも２倍過剰発現されていた。
２番目の方法では、このデータ群は、乳房組織、結腸組織、肺組織、および、卵巣組織において、わずか２つの存在コールしか有さない遺伝子のみを保有するように、ふるいにかけられた。このようなふるいにかけた結果、４，６５４個の遺伝子が残った。この４，６５４個の遺伝子のうち１６０個の遺伝子が、すい臓の（正常な、および、がん）組織において、少なくとも２つの存在コールを有することがわかった。最終的に、８個のプローブ群が選択され、そのプローブ群は、すい臓がん組織とすい臓正常組織との間で、最も差異のある発現を示した。
＜組織サンプル＞
全体で２６０個のＦＦＰＥ転移性組織および原発組織が、さまざまな業者から入手された。試験されたサンプルには、３０個の乳がん転移、３０個の結腸直腸がん転移、５６個の肺がん転移、４９個の卵巣がん転移、４３個のすい臓がん転移、１８個の前立腺原発腫瘍、および、２個の前立腺がん転移、ならびに、３２個のその他の原発巣（６個の胃がん、６個の腎臓がん、３個の喉頭がん、２個の肝臓がん、１個の食道がん、１個の咽頭がん、１個の胆管がん、１個の胸膜がん、３個の膀胱がん、５個のメラノーマ、３個のリンパ腫）を含んだ。
＜ＲＮＡ抽出＞
パラフィン組織切片からのＲＮＡ単離は、以下の修正を伴うHigh Pure RNA Paraffin Kit manual（Roche）に記載された方法、および、試薬に基づいた。パラフィン包埋組織サンプルは、包埋された転移の大きさにしたがって切断され（大きさが２〜５ｍｍであれば９×１０μｍ、６〜８ｍｍであれば６×１０μｍ、８〜１０ｍｍ以上であれば３×１０μｍ）、１．５ｍＬエッペンドルフチューブ(Eppendorf tubes)中のＲＮＡ分解酵素／ＤＮＡ分解酵素の中に静置した。切片は、１０〜２０秒撹拌した後、室温で２〜５分間、１ｍＬのキシレン中でインキュベーション(incubation)することで、脱パラフィン化した。その後、チューブを遠心分離し、上澄みを除去し、そして、脱パラフィン化のステップをくり返した。上澄みを除去した後、１ｍＬのエタノールを加え、サンプルを１分間撹拌し遠心分離し、上澄みを除去した。この過程をもう一度くり返した。残存しているエタノールを除去し、ペレット(pellet)を５５℃のオーブンで５〜１０分間乾燥させ、１００μＬの組織溶解バッファー(tissue lysis buffer)、１６μＬの１０％ＳＤＳ、および、８０μＬのタンパク質分解酵素Ｋに再懸濁させた。サンプルを、４００回転／分に設定したサーモミキサー(thermomixer)内で、５５℃で２時間にわたり撹拌およびインキュベートした。３２５μＬの結合バッファー(binding buffer)、および、３２５μＬのエタノールを各々のサンプルに加え、そのサンプルをかき混ぜ、遠心分離し、そして、上澄みをフィルターカラムに加えた。フィルターカラムを収集チューブとともに、８０００回転／分で１分間遠心分離し、流出物（flow through）を廃棄した。一連の洗浄を行った［５００μＬの洗浄バッファー(wash buffer)Ｉ→５００μＬの洗浄バッファーＩＩ→３００μＬの洗浄バッファーＩＩ］。その洗浄では、各々の溶液をカラムに加え、遠心分離し、そして、流出物を廃棄した。カラムをその後、最大速度で２分間遠心分離し、新しい１．５ｍＬチューブ中に入れ、そして、９０μＬの溶出バッファー(elution buffer)を加えた。ＲＮＡは、室温で１分間のインキュベーション、および、その後の８０００回転／分で１分間の遠心分離を行った後に得られた。サンプルは、１０μＬのＤＮＡ分解酵素インキュベーションバッファー(DNase incubation buffer)、２μＬのＤＮＡ分解酵素Ｉを加えることによって、ＤＮＡ分解酵素処理され、そして３７℃で３０分間インキュベートされた。ＤＮＡ分解酵素は、２０μＬの組織溶解バッファー、１８μＬの１０％ＳＤＳおよび４０μＬのタンパク質分解酵素Ｋを加えた後に、不活化された。再び、３２５μＬの結合バッファー、および、３２５μＬのエタノールを各々のサンプルに加え、そのサンプルをかき混ぜ、遠心分離し、そして、上澄みをフィルターカラムに加えた。一連の洗浄、および、ＲＮＡの溶出は、ＲＮＡを溶出するために５０μＬの溶出バッファーが用いられたことを除いては、前述のとおり行われた。カラムから持ち越されるガラス繊維による汚染を排除するために、ＲＮＡを最大速度で２分間遠心分離し、上澄みを新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中に移した。サンプルを、分光光度計によって得られたＯＤ ２６０／２８０の示度により定量し、５０ｎｇ／μＬに希釈した。単離されたＲＮＡを、使用するまでＲＮＡ分解酵素の含まれない水中に−８０℃で保管した。
＜TaqManプライマーおよびプローブ設計＞
適当なｍＲＮＡ参照配列アクセッション番号(mRNA reference sequence accession numbers)が、Oligo 6.0とともに、TaqMan（登録商標）ＣＵＰ解析［肺がんマーカー：ヒト肺サーファクタント関連タンパク質B(human surfactant, pulmonary-associated protein B)（ＨＵＭＰＳＰＢＡ）、甲状腺転写因子１（ＴＴＦ１）、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）、結腸直腸がんマーカー：カドヘリン１７（ＣＨＤ１７）、乳がんマーカー：マンマグロビン（ＭＧ）、前立腺由来ets転写因子（ＰＤＥＦ）、卵巣がんマーカー：ウィルムス腫１（ＷＴ１）、すい臓がんマーカー：前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、凝固第５因子（Ｆ５）、前立腺マーカー：カリクレイン３（ＫＬＫ３）］、および、ハウスキーピング解析（housekeeping assays）［βアクチン、ハイドロキシメチルビラン合成酵素(hydroxymethylbilane synthase)（ＰＢＧＤ）］を開発するために用いられた。各解析のためのプライマー、および、加水分解プローブは、表２に列記されている。エキソン−イントロンスプライシング部位周辺に解析を設計することで、ゲノムＤＮＡ増幅を除去した。加水分解プローブは、５’末端のヌクレオチドにおいてＦＡＭ（レポーター染料）で、３’末端のヌクレオチドにおいてＢＨＱ１−ＴＴ［インターナルクエンチング染料(internal quenching dye)］で標識された。
＜定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応＞
遺伝子特異的ＲＮＡの定量は、ABI Prism 7900HT配列検知システム（Applied Biosystems）の３８４ウェルプレート(well plate)において、実行された。各サーモサイクラー(thermo-cycler)の実行のために、キャリブレーターおよび標準曲線を増幅した。各マーカーためのキャリブレーターは、生体外転写産物中の標的遺伝子からなり、それらはラットの腎臓由来のキャリアＲＮＡ(carrier RNA)中で１×１０５コピーで希釈したものであった。ハウスキーピングマーカーための標準曲線は、生体外転写産物中の標的遺伝子からなり、それらはラットの腎臓由来のキャリアＲＮＡ中で１×１０７、１×１０５、１×１０３コピーで連続希釈したものであった。標的遺伝子がない対照（No target controls）も、周囲の汚染（environmental contamination）がないことを確かめるために、各解析の実行に含まれた。すべてのサンプルおよび対照は繰り返して実行された。ｑＲＴＰＣＲは、１０μＬの反応物（10μl reaction）中で一般的な研究室で用いられる試薬で実行された。その１０μＬの反応物には、ＲＴ−ＰＣＲバッファー［５０ｎＭビシン／水酸化カリウムｐＨ８．２、１１５ｎＭ酢酸カリウム、８％グリセロール、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、３．５ｍＭ硫酸マンガン、各０．５ｍＭのデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）］、添加物［２ｍＭトリス塩酸バッファー(Tris-Cl)ｐＨ８、０．２ｍＭウシアルブミン、１５０ｍＭトレハロース、０．００２％ Tween20］、酵素混合液［２Ｕ Ｔｔｈ（Roche）、０．４ｍｇ／μＬ Ａｂ ＴＰ６−２５］、プライマーおよびプローブ混合液（０．２μＭプローブ、０．５μＭプライマー）を含んだ。その後のサイクリングパラメータ(cycling parameter)は、９５℃、１分間を１サイクル；５５℃、２分間を１サイクル；温度上昇（Ramp）５％；７０℃、２分間を１サイクル；９５℃、１５秒間、５８℃、３０秒間を４０サイクル；であった。ＰＣＲ反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したＣｔ値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
＜１段階反応対２段階反応＞
第一鎖合成は、１反応あたり、１００ｎｇのランダムヘキサマー、もしくは、遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いて実行した。第１段階目では、１１．５μＬの混合液１（プライマー、および、１μｇの全ＲＮＡ）を６５℃まで５分間加熱し、その後、氷上で冷却した。８．５μＬの混合液２［１×バッファー、０．０１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、各０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを混合したもの）、０．２５Ｕ／μＬ RNasin（登録商標）、１０Ｕ／μＬ Superscript III］を混合液１に添加し、５０℃、６０分間インキュベートした後、９５℃で、５分間インキュベートした。ｃＤＮＡを、使える状態になるまで、−２０℃で保管した。２段階反応の第２段階目のｑＲＴＰＣＲは、以下のサイクリングパラメータ、すなわち９５℃、１分間を１サイクル；９５℃、１５秒間、５８℃、３０秒間を４０サイクル；を伴って、前述のとおり実行した。１段階反応のためのｑＲＴＰＣＲは、前の段落に記載のとおり正確に実行された。１段階および２段階反応はともに、１００ｎｇの鋳型（ＲＮＡ／ｃＤＮＡ）に対して実行された。ＰＣＲ反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したＣｔ値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
＜ヒートマップ(heatmap)の生成＞
各サンプルのΔＣｔは、各々のＣＵＰマーカーのＣｔ値の平均値をとり、平均のハウスキーピングマーカーのＣｔ値の平均値を引くことにより計算された［ΔＣｔ＝Ｃｔ（ＣＵＰマーカー）−Ｃｔ（平均のハウスキーピングマーカー）］。各々の原発巣組織（肺、乳、前立腺、結腸、卵巣、すい臓）マーカー群の最小のΔＣｔを、サンプルごとに決定した。全体の最小ΔＣｔを有する原発巣組織には得点１を与え、他のすべての原発巣組織には得点０を与える。データを病理学上の診断にしたがって分類した。Partek Proには修正された実現可能性データを投入し、強度プロット(intensity plot)を生成した。
結果
＜新規のすい臓原発巣腫瘍およびがん状況マーカーの発見＞
まず、５つのすい臓マーカー候補が解析された。それらのマーカー候補は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、セリンプロテイナーゼ阻害剤(serine proteinase inhibitor)、クレードＡメンバー１(clade A member 1)（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、サイトケラチン(cytokeratin)７（ＫＲＴ７）、マトリックスメタロプロテアーゼ(matrix meralloprotease)１１（ＭＭＰ１１）、および、ムチン(mucin)４（ＭＵＣ４）［Varadhachary他（２００４年）；Fukushima他（２００４年）；Argani他（２００１年）；Jones他（２００４年）；Prasad他（２００５年）；および、Moniaux他（２００４年）参照］であり、ＤＮＡマイクロアレイ、ならびに、１３個のすい臓管腺がん、５個の正常すい臓組織、および、９８個のサンプル（乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、および、卵巣腫瘍に由来する）に係るパネルを用いて解析された。ＰＳＣＡのみが、適度な感受性（１３個中６個、すなわち、すい臓腫瘍のうち４６％を検出した）を、高い特異性（９８個のサンプル中９１個、すなわち、９３％が、すい臓が原発巣でないと正確に同定された）で示した（図１Ａ）。これに対して、ＫＲＴ７、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＭＭＰ１１、および、ＭＵＣ４は、それぞれ３８％、３１％、８５％および３１％の感受性を、それぞれ６６％、９１％、８２％および８１％の特異性で示した。これらのデータは、２７個のすい臓原発巣の転移、および、３９個の非すい臓原発巣の転移で、ＭＭＰ１１を除くすべてのマーカーについて実行したｑＲＴＰＣＲと十分一致した。ＭＭＰ１１は、ｑＲＴＰＣＲおよび転移に対して、より低い感受性とより低い特異性を示した。結論として、急速冷凍した原発組織におけるマイクロアレイデータは、ＦＦＰＥ転移がすい臓原発巣であることをｑＲＴＰＣＲによって同定することのできるマーカーの能力に対する良い指標として役立つ。しかし、更なるマーカーが最適な効果のために有用であるかもしれない。
すい臓管腺がんは、（大部分が腺房状細胞および膵島細胞である）すべてのすい臓細胞のうちのほんのわずかな割合を含む管上皮細胞から発達するため、および、すい臓腺がん組織は隣接する正常組織のうち相当量を含むため［Prasad他（２００５年）；および、Ishikawa他（２００５年）］、器官群からこの器官を識別することもできるすい臓がんマーカー（すなわち、がんにおいてアップレギュレートされたマーカー）を同定することは難しいことであった。ＣＵＰパネルにおける使用のために、このような識別は必要なことである。第１のクエリ方法(query method)（材料と方法参照）によって、６つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、凝固第５因子（Ｆ５）、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１０）と類似した仮想タンパク質ＦＬＪ２２０４１、β６インテグリン（ＩＴＧＢ６）、トランスグルタミナーゼ(transglutaminase)２（ＴＧＭ２）、異質核内リボ核タンパク質(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)Ａ０（ＨＮＲＰ０）、および、ＢＡＸデルタ（ＢＡＸ）であった。第２のクエリ方法（材料と方法参照）によって、８つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、Ｆ５、ＴＧＭ２、ペアードライクホメオドメイン転写因子(paired-like homeodomain transcription factor)１（ＰＩＴＸ１）、トリオアイソフォームｍＲＮＡ（ＴＲＩＯ）、ｐ７３ＨのためのｍＲＮＡ（ｐ７３）、ＭＧＣ：１０２６４に対する未知のタンパク質（ＳＣＤ）、および、クラウジン１８に対する２つのプローブ群であった。Ｆ５、および、ＴＧＭ２はクエリ結果の両方に存在し、この２つのうち、Ｆ５が最も有望なもののように思われた（図１Ｂ参照）。
＜ＦＦＰＥ組織を用いたサンプル準備およびｑＲＴＰＣＲの最適化＞
次に、マーカーパネル性能を検査する前に、固定組織を用いて、ＲＮＡ単離法、および、ｑＲＴＰＣＲ法を最適化した。まず、タンパク質分解酵素Ｋのインキュベーション時間を１６時間から３時間に短縮した効果を分析した。収率にはまったく変化はなかった。しかし、いくつかのサンプルで、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋステップを用いたときに、より長いＲＮＡ断片を示すものがあった（図２）。例えば、ＲＮＡを１年前の組織ブロック（Ｃ２２）から単離したとき、電気泳動図にはまったくちがいは見られなかった。しかし、ＲＮＡを５年前の組織ブロック（Ｃ２３）から単離したときには、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋ消化を用いた場合に、肩のこぶ（hump in the shoulder）によって解析されると、より高分子量のＲＮＡの区画がより多く観察された。この傾向は一般的に、ＦＦＰＥ転移の原発巣器官にかかわらず、他のサンプルを処理する際にも保持された。結論として、タンパク質分解酵素Ｋ消化時間の短縮は、ＲＮＡ収量を犠牲にしないし、そして、より長く、あまり分解されていないＲＮＡを単離する助けになるかもしれない。
次に、３つの異なる逆転写法を比較した。その３つの方法とは、ｑＰＣＲが後に続く、ランダムヘキサマーによる逆転写（２段階）；ｑＰＣＲが後に続く、遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階）；遺伝子特異的プライマーを用いた１段階のｑＲＴＰＣＲ；である。ＲＮＡは１１個の転移から単離され、この３つの方法すべてにわたって、βアクチン、ヒトサーファクタントタンパク質Ｂ（ＨＵＭＳＰＢ）、および、甲状腺転写因子（ＴＴＦ）（図３）に対するＣｔ値を比較した。すべての比較において、統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）があった。３個の遺伝子すべてについて、ｑＰＣＲが後に続くランダムヘキサマーによる逆転写（２段階反応）が最も高いＣｔ値を示し、一方、ｑＰＣＲが後に続く遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階反応）は、対応する１段階反応よりも、わずかに（しかし統計的には有意な）低いＣｔ値を示した。しかし、遺伝子特異的プライマーを用いた２段階のＲＴＰＣＲは、より長い逆転写段階を有した。各サンプルについて、ＨＵＭＳＰＢおよびＴＴＦのＣｔ値を、対応するβアクチンの値に対して標準化した場合、３つの方法すべてにわたって、標準化されたＣｔ値には、まったくちがいが見られなかった。結論として、ＲＴＰＣＲ反応条件の最適化により、より低いＣｔ値を生じることができ、これは、より古いパラフィンブロックを分析する手助けになるかもしれない［Cronin他（２００４年）参照］。そして、遺伝子特異的プライマーを用いた、１段階のＲＴＰＣＲ反応は、対応する２段階反応において生ずるＣｔ値に匹敵するＣｔ値を生ずることができる。
＜ＣＵＰ−ｑＲＴＰＣＲ解析の診断能＞
次に、１２個のｑＲＴＰＣＲ反応（１０個のマーカー、および、２個のハウスキーピング遺伝子）を２３９個のＦＦＰＥ転移に対して実行した。その解析に用いられたマーカーを表２に示す。肺がんマーカーは、ヒト肺サーファクタント関連タンパク質Ｂ（ＨＵＭＰＳＰＢ）、甲状腺転写因子１（ＴＴＦ１）、および、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）であった。結腸直腸がんマーカーは、カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）であった。乳がんマーカーは、マンマグロビン（ＭＧ）、および前立腺由来Ｅｔｓ転写因子（ＰＤＥＦ）であった。卵巣がんマーカーは、ウィルムス腫１（ＷＴ１）であった。すい臓がんマーカーは、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、および、凝固第５因子（Ｆ５）であり、前立腺マーカーは、カリクレイン３（ＫＬＫ３）であった。遺伝子の説明については、表１５参照のこと。
Figure 2009508493
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ヒートマップにおける標準化されたＣｔ値の分析は、乳がんマーカー、および、前立腺がんマーカーの高い特異性、結腸がんマーカー、肺がんマーカー、および、卵巣がんマーカーの中程度の特異性、ならびに、すい臓がんマーカーの幾分より低い特異性を明らかにした。標準化されたｑＲＴＰＣＲデータをコンピュータによる修正（refinement）と組み合わせることにより、マーカーパネルの性能が改良される。アルゴリズムと組み合わされた標準化されたｑＲＴＰＣＲデータから結果が得られ、ｑＲＴＰＣＲ解析の確度が決定された。
議論
本実施例において、マイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析は、転移に用いるための候補マーカーを同定するために、原発腫瘍に対して用いられる。転移に対する原発巣腫瘍マーカーを発見するために原発腫瘍を用いることができるという事実は、最近のいくつかの発見と一致する。例えば、Weigeltと同僚は、原発性乳房腫瘍の遺伝子発現プロファイルは、遠隔転移においても維持されるということを示した。Weigelt他（２００３年）参照。Italianoと共同研究者は、ＩＨＣによって判定されるＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）の状態が、８０個の原発性結腸直腸がん腫瘍、および、８０個の関係する転移においても同様であることを発見した。Italiano他（２００５年）参照。その８０個のうち５個のみが、ＥＧＦＲの状態において不一致を示した。Italiano他（２００５年）参照。Backusと同僚は、乳房組織およびその他の組織のゲノム規模遺伝子発現解析を用いて、乳がん転移を検出するための推測上のマーカーを同定し、そして、マンマグロビンおよびＣＫ１９が、９０％の感受性と９４％の特異性で、乳房センチネルリンパ節における臨床上有効な転移（clinically acctionable metastasis）を検出したことを明らかにした。Backus他（２００５年）参照。
マイクロアレイに基づいた原発組織の研究は、既知のマーカーの特異性および感受性を確認した。結果として、Ｆ５は例外であるが、用いられたマーカーすべてが、本発明で調べられた組織に対して高い特異性を有する。Argani他（２００１年）；Backus他（２００５年）；Cunha他（２００５年）；Borgono他（２００４年）；McCarthy他（２００３年）；Hwang他（２００４年）；Fleming他（２０００年）；Nakamura他（２００２年）；および、Khoor他（１９９７年）参照。最近の研究は、ＩＨＣを用いると、ＰＳＣＡは前立腺がん転移において過剰発現されることを明らかにした。Lam他（２００５年）参照。Dennis他（２００２年）はまた、ＰＳＣＡがすい臓がんおよび前立腺がんに対する原発巣腫瘍マーカーとして用いられることができることを明らかにした。本明細書において示すように、ＰＳＣＡの強い発現は、いくつかの前立腺組織においても、ＲＮＡレベルで見出されるが、その解析にＰＳＡ（前立腺特異抗原）を含むことによって、前立腺がんとすい臓がんとを直ちに分離することができる。本発明で新規に発見されたことは、すい臓原発巣組織の（ＰＳＣＡに対して）補足的なマーカーとして、Ｆ５を用いるということである。原発組織のマイクロアレイデータ群、および、ＦＦＰＥ転移を用いたｑＲＴＰＣＲデータ群両方において、Ｆ５はＰＳＣＡを補足することが分かった（図４および表３）。
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従来の研究者たちは、ＩＨＣ、もしくは、マイクロアレイを用いたＣＵＰ解析を生み出してきた。Su他（２００１年）；Ramaswamy他（２００１年）；および、Bloom他（２００４年）参照。さらに最近では、ＳＡＧＥ法が、小規模のｑＲＴＰＣＲマーカーパネルと組み合わされてきた。Dennis（２００２年）；および、Buckhaults他（２００３年）参照。本研究は、マイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析を、ｑＲＴＰＣＲ解析の小規模のパネルと組み合わせた最初のものである。原発組織に対するマイクロアレイ研究は、これまでにＳＡＧＥ法によって同定されたのと同一の原発巣組織マーカーのうちのすべてではないが、一部を同定した。いくつかの研究は、ＳＡＧＥ法に基づいたプロファイル解析データとＤＮＡマイクロアレイに基づいたプロファイル解析データとが適度に一致することを示してきたし、そして、その相互関係がより高い発現量を伴う遺伝子に対して向上することを示してきた。van Ruissen他（２００５年）；および、Kim（２００３年）参照。例えば、Dennisと同僚は、ＰＳＡ、ＭＧ、ＰＳＣＡ、および、ＨＵＭＳＰＢを同定し、一方Buckhaultsと共同研究者［Dennis他（２００２年）参照］はＰＤＥＦを同定した。ｑＲＴＰＣＲを用いたＣＵＰ解析の実施は、それが強固な技術であるために、そして、ＩＨＣ以上の性能優位性を有するかもしれないために、好まれている。Al-Mulla他（２００５年）；および、Haas他（２００５年）参照。本明細書に示したように、ｑＲＴＰＣＲプロトコルは、１段階反応において遺伝子特異的プライマーを用いることにより改良された。このことは、遺伝子特異的プライマーを、ＦＦＰＥ組織での１段階ｑＲＴＰＣＲ反応に用いた最初の例である。他の研究者は、２段階ｑＲＴＰＣＲ（ｑＰＣＲが後に続く１反応でのｃＤＮＡ合成）を行ったか、または、ランダムヘキサマーもしくは先端を切った遺伝子特異的プライマー（truncated gene-specific primers）を用いたかのいずれかである。Abrahamsen他（２００３年）；Specht他（２００１年）；Godfrey他（２０００年）；Cronin他（２００４年）；および、Mikhitarian他（２００４年）参照。
〔実施例２〕
すい臓管腺がんは、正常なすい臓において、（大部分が腺房状細胞および膵島細胞である）すべてのすい臓細胞のうちの、ほんのわずかな割合を含む管上皮細胞から発生する。さらに、すい臓腺がん組織は、隣接する正常組織の相当量を含む［Prasad他（２００５年）；および、Ishikawa他（２００５年）］。このため、候補すい臓がんマーカーは、すい臓腺がんにおいて、正常なすい臓細胞と比較して遺伝子が増加しているため、濃縮されていた。第１のクエリ方法によって、６つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、凝固第５因子（Ｆ５）、ＦＫ５０６結合タンパク質と類似した仮想タンパク質ＦＬＪ２２０４１（ＦＫＢＰ１０）、β６インテグリン（ＩＴＧＢ６）、トランスグルタミナーゼ２（ＴＧＭ２）、異質核内リボ核タンパク質Ａ０（ＨＮＲＰ０）、および、ＢＡＸデルタ（ＢＡＸ）であった。第２のクエリ方法（詳しくは、材料と方法の節を参照）によって、８つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、Ｆ５、ＴＧＭ２、ペアードライクホメオドメイン転写因子１（ＰＩＴＸ１）、トリオアイソフォームｍＲＮＡ（ＴＲ１０）、ｐ７３ＨのためのｍＲＮＡ（ｐ７３）、ＭＧＣ：１０２６４に対する未知のタンパク質（ＳＣＤ）、および、クラウジン１８に対する２つのプローブ群であった。
全体で２３個の組織特異的なマーカー候補が、転移性がんＦＦＰＥ組織上の更なるＲＴ−ＰＣＲ確認のために、ｑＲＴ−ＰＣＲによって選ばれた。マーカー候補は、肺、すい臓、結腸、乳房、卵巣、前立腺、および、前立腺原発性がん由来の２０５個のＦＦＰＥ転移性がんに対して試験された。表４はＲＴ−ＰＣＲ確認のために選ばれた組織特異的マーカーの遺伝子記号を提供し、そしてまた、これらのマーカーで実行された試験結果をまとめている。
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２３個の試験マーカーのうち、１３個が、それらの交差反応性、対応する転移性組織における低い発現量、もしくは、重複に基づいて棄却された。１０個のマーカーが最終的な解析のために選ばれた。肺がんマーカーは、ヒト肺サーファクタント関連タンパク質Ｂ（ＨＵＭＰＳＰＢ）、甲状腺転写因子１（ＴＴＦ１）、および、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）であった。すい臓がんマーカーは、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、および、凝固第５因子（Ｆ５）、そして、前立腺がんマーカーは、カリクレイン３（ＫＬＫ３）であった。結腸直腸がんマーカーは、カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）であった。乳がんマーカーは、マンマグロビン（ＭＧ）、および、前立腺由来Ｅｔｓ転写因子（ＰＤＥＦ）であった。卵巣がんマーカーは、ウィルムス腫１（ＷＴ１）であった。
＜ＦＦＰＥ組織を用いたサンプル準備およびｑＲＴ−ＰＣＲの最適化＞
次に、マーカーパネルの性能を検査する前に、固定組織を用いて、ＲＮＡ単離法、および、ｑＲＴＰＣＲ法を最適化した。まず、タンパク質分解酵素Ｋのインキュベーション時間を１６時間から３時間に短縮した効果を分析した。収率にはまったく変化はなかった。しかし、いくつかのサンプルで、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋステップを用いたときに、より長いＲＮＡ断片を示すものがあった（図４Ａ、図４Ｂ）。例えば、ＲＮＡを１年前の組織ブロック（Ｃ２２）から単離したとき、電気泳動図にはまったくちがいは見られなかった。しかし、ＲＮＡを５年前の組織ブロック（Ｃ２３）から単離したときには、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋ消化を用いた場合に、肩のこぶによって解析されると、より高分子量のＲＮＡの区画がより多く観察された。この傾向は一般的に、ＦＦＰＥ転移の原発巣器官にかかわらず、他のサンプルを処理する際にも保持された。結論として、タンパク質分解酵素Ｋ消化時間の短縮は、ＲＮＡ収量を犠牲にしないし、そして、より長い、あまり分解されていないＲＮＡを単離する助けになるかもしれない。
次に、３つの異なる逆転写法を比較した。その３つの方法とは、ｑＰＣＲが後に続く、ランダムヘキサマーによる逆転写（２段階）；ｑＰＣＲが後に続く、遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階）；遺伝子特異的プライマーを用いた１段階のｑＲＴＰＣＲ；である。ＲＮＡは１１個の転移から単離され、この３つの方法すべてにわたって、βアクチン、ＨＵＭＳＰＢ（図４Ｃ、図４Ｄ）、および、ＴＴＦに対するＣｔ値を比較した。その結果は、すべての比較において、統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）を示した。両方の遺伝子について、ｑＰＣＲが後に続くランダムヘキサマーによる逆転写（２段階反応）が最も高いＣｔ値を示し、一方、ｑＰＣＲが後に続く遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階反応）は、対応する１段階反応よりも、わずかに（しかし統計的には有意な）低いＣｔ値を示した。しかし、遺伝子特異的プライマーを用いた２段階のＲＴＰＣＲは、より長い逆転写段階を有した。各サンプルについて、ＨＵＭＳＰＢのＣｔ値を、対応するβアクチンの値に対して標準化した場合、３つの方法すべてにわたって、標準化されたＣｔ値には、まったくちがいが見られなかった。結論として、ＲＴＰＣＲ反応条件の最適化により、より低いＣｔ値を生じることができ、これは、より古いパラフィン組織ブロックを分析する助けになる［Cronin他（２００４年）参照］。そして、遺伝子特異的プライマーを用いた、１段階のＲＴＰＣＲ反応は、対応する２段階反応において生ずるＣｔ値に匹敵するＣｔ値を生ずることができる。
＜最適化されたｑＲＴＰＣＲ解析の診断能＞
１２個のｑＲＴＰＣＲ反応（１０個のマーカー、および、２個のハウスキーピング遺伝子）を２６０個のＦＦＰＥ転移の新たな群に対して実行した。２１個のサンプルがハウスキーピング遺伝子に対して高いＣｔ値を示したため、２３９個のサンプルのみが、ヒートマップ分析に用いられた。ヒートマップにおける標準化されたＣｔ値の分析は、乳がんマーカー、および、前立腺がんマーカーの高い特異性、結腸がんマーカー、肺がんマーカー、および、卵巣がんマーカーの中程度の特異性、ならびに、すい臓がんマーカーの幾分より低い特異性を明らかにした（図５）。標準化されたｑＲＴＰＣＲデータをコンピュータによる修正と組み合わせることにより、マーカーパネルの性能が改良される。
２個のハウスキーピング遺伝子の発現の平均に対して標準化された発現値を用いて、転移性原発巣組織を予測するためのアルゴリズムが、標準化されたｑＲＴＰＣＲデータをそのアルゴリズムと組み合わせることによって開発された。そして、そのアルゴリズムは、１つ取って置き交差検定(leave-one-out-cross-validation test)（ＬＯＯＣＶ）を実行することによって、ｑＲＴＰＣＲ解析の確度を決定した。解析に含まれる６つの組織の種類に対して、サンプルが、解析に含まれるその他の腫瘍の種類（例えば、すい臓がんを結腸がん）として誤って推測される場合の偽陽性コール（false-positive calls）の数、および、サンプルが解析組織の種類（その他）に含まれるものとして予測されなかった回数の両方が、別々に推定された。ＬＯＯＣＶの結果を表５に示す。
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原発巣組織は、２６０個の試験サンプル中２０４個に対して、全体で７８％の確度でもって、正しく予測された。偽陽性コールのかなりの部分は、組織学的に同質な組織におけるマーカーの交差反応性のためである。例えば、咽頭、喉頭、および、食道から生じる３つの扁平上皮転移がんは、それらの組織におけるＤＳＧ３の発現のために、肺がんとして誤って予測された。胃およびすい臓を含む、結腸ＧＩがん以外におけるＣＤＨ１７の陽性発現によって、試験した６個の胃がんのうちの４個、そして、試験した４３個のすい臓がん転移のうちの３個が、結腸がんとして誤って分類分けされた。
ＬＯＯＣＶ検定に加えて、データを３つの別々の訓練群および試験群の対に、ランダムに分割した。各々の分割には、各分類からのサンプルのうち約５０％のサンプルが含まれた。３つの別々の訓練群および試験群の対における等分の分割（50/50 splits）において、解析全体の分類確度は、７７％、７１％、および、７５％であり、このことは解析能の安定性を確認している。
最後に、原発巣のわかった転移性がん、ＩＨＣを含む病理学的な評価によって原発巣組織診断がなされたＣＵＰ標本、および、ＩＨＣ試験後もＣＵＰのままであるＣＵＰ標本を含んだ、４８個のＦＦＰＥ転移性がんの別の独立した群を試験した。原発巣組織の予測確度は、サンプルカテゴリーごとに個別に推定された。表６にその解析結果をまとめる。
Figure 2009508493
原発巣組織の予測は、ほんのわずかな例外を除いて、既知の原発巣、もしくは、ＩＨＣを含む臨床的／病理学的な評価によって判定された原発巣組織診断と一致した。訓練群と同様に、その解析は、異なる原因から生じる扁平上皮がんを識別することができず、そして、それらを肺がんとして誤って予測をした。
解析はまた、標準的な診断試験の後にＣＵＰのままであった１１個のサンプルのうち８個に対して、推定上の原発巣組織診断をした。ＣＵＰ症例のうちの１個は、特に興味深いものであった。前立腺がんの病歴を持つ男性患者が、肺および胸膜における転移性がんと診断された。血清ＰＳＡ検査、および、転移性組織上へのＰＳＡ抗体によるＩＨＣは陰性であり、そのため、病理学者の診断は、胃腸腫瘍の傾向があるＣＵＰというものであった。その解析は強く（事後確率０．９９で）その原発巣組織は結腸であると予測した。
議論
本研究において、原発腫瘍におけるマイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析は、転移に用いるための候補マーカーを同定するために用いられた。転移に対する原発巣腫瘍マーカーを発見するために、原発腫瘍を用いることができるという事実は、最近のいくつかの発見と一致する。例えば、Weigeltと同僚は、原発性乳房腫瘍の遺伝子発現プロファイルは、遠隔転移においても維持されるということを示した。Weigelt他（２００３年）参照。Backusと同僚は、乳房組織およびその他の組織のゲノム規模遺伝子発現解析を用いて、乳がん転移を検出するための推測上のマーカーを同定し、そして、マンマグロビンおよびＣＫ１９が、９０％の感受性と９４％の特異性で、乳房センチネルリンパ節における臨床上有効な転移を検出したことを明らかにした。Backus他（２００５年）参照。
本解析の開発中、選択は、ＣＵＰの中で最も一般的な肺がん、すい臓がん、および、結腸がん［Ghosh他（２００５年）；および、Pavlidis他（２００５年）］、ならびに、治療が患者にとって最も有益である可能性がある乳がん、卵巣がん、および、前立腺がんを含む、６つのがんの種類に焦点を当ててきた。Ghosh他（２００５年）参照。しかし、解析の全体の確度に欠陥が生じない限り、そして、もし適用可能ならば、ＲＴＰＣＲ反応のロジスティクスが妨げられない限り、更なる組織の種類、および、マーカーをパネルに追加することができる。
マイクロアレイに基づいた原発組織の研究は、既知のマーカーの特異性および感受性を確認した。結果として、組織特異的マーカーの大部分が、本発明で調べられた組織に対して高い特異性を有する。最近の研究では、ＩＨＣを用いると、ＰＳＣＡは前立腺がん転移において過剰発現されることがわかった。Lam他（２００５年）参照。Dennis他（２００２年）はまた、ＰＳＣＡがすい臓がんおよび前立腺がんに対する原発腫瘍マーカーとして用いることができることを明らかにした。ＰＳＣＡの強い発現は、一部の前立腺組織において、ＲＮＡレベルで見出されるが、その解析にＰＳＡを含むために、前立腺がんとすい臓がんとを直ちに分離することができる。本研究で新規に発見されたことは、すい臓原発巣組織の（ＰＳＣＡに対して）補足的なマーカーとして、Ｆ５を用いるということである。原発組織のマイクロアレイデータ群、および、ＦＦＰＥ転移のｑＲＴＰＣＲデータ群両方において、Ｆ５はＰＳＣＡを補足することが見出された。
従来の研究者たちは、ＩＨＣ［Brown他（１９９７年）；De Young他（２０００年）；および、Dennis他（２００５年ａ）参照］、もしくは、マイクロアレイ［Su他（２００１年）；Ramswamy他（２００１年）；および、Bloom他（２００４年）参照］を用いたＣＵＰ解析を生み出してきた。さらに最近では、ＳＡＧＥ法が、小規模のｑＲＴＰＣＲマーカーパネルと組み合わされてきた。Dennis他（２００２年）；および、Buckhaults他（２００３年）参照。本研究は、マイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析を、ｑＲＴＰＣＲ解析の小規模のパネルと組み合わせた最初のものである。原発組織に対するマイクロアレイ研究は、これまでにＳＡＧＥ法によって同定されたのと同一の原発巣組織マーカーのうちのすべてではないが、一部を同定した。所与の研究は、ＳＡＧＥ法に基づいたプロファイル解析データとＤＮＡマイクロアレイに基づいたプロファイル解析データとが適度に一致すること、および、その相互関係が、より高い発現量を伴う遺伝子に対して向上することを示してきた研究を考慮すれば、この発見は驚くほどのことではない。van Ruissen他（２００５年）；および、Kim他（２００３年）参照。例えば、Dennisと同僚は、ＰＳＡ、ＭＧ、ＰＳＣＡ、および、ＨＵＭＳＰＢを同定し、一方、Buckhaultsと共同研究者［Buckhaults他（２００２年）参照］はＰＤＥＦを同定した。ＣＵＰ解析の実施はｑＲＴＰＣＲによるものであるのが好ましい。というのは、それが強固な技術であり、ＩＨＣ以上の性能優位性を有するかもしれないからである。Al-Mulla他（２００５年）；および、Haas他（２００５年）参照。さらに、本明細書に示したように、ｑＲＴＰＣＲプロトコルは、１段階反応において遺伝子特異的プライマーを用いることにより改良されてきた。このことは、遺伝子特異的プライマーを、ＦＦＰＥ組織での１段階ｑＲＴＰＣＲ反応に用いた最初の例である。他の研究者は、２段階ｑＲＴＰＣＲ（ｑＰＣＲが後に続くう１反応でのｃＤＮＡ合成）を行ったか、または、ランダムヘキサマーもしくは先端を切った遺伝子特異的プライマーを用いたかのいずれかである。Abrahamsen他（２００３年）；Specht他（２００１年）；Godfrey他（２０００年）；Cronin他（２００４年）；および、Mikhitarian他（２００４年）参照。
要約すると、６つの組織の種類に対する７８％の総体的解析確度は、他の研究と比較して優れている。Brown他（１９９７年）；De Young他（２０００年）；Dennis他（２００５年ａ）；Su他（２００１年）；Ramaswamy他（２００１年）；および、Bloom他（２００４年）参照。
〔実施例３〕
本研究において、遺伝子マーカーポートフォリオを用いる分類器は、平均分散最適化（ＭＶＯ）から選ぶことによって、ならびに、原発巣組織、および、乳がん、結腸がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がんを含む５つの主要ながんの種類に対するがんの状態を予測するためにこの分類器を用いることによって構築された。３７８個の原発がん、２３個の良性増殖上皮病変、および、１０３個の急速冷凍された正常なヒト組織標本が、Affymetrix human U133A GeneChipを用いて分析された。白血球サンプルもまた、白血球バックグラウンド細胞における共発現によって、潜在的に隠される遺伝子発現を差し引くために分析された。新規のＭＶＯに基づくバイオインフォマティクスの手法は、原発巣組織およびがんの状態に対する遺伝子マーカーポートフォリオを選択するために開発された。そのデータによって、２６個の遺伝子のパネルを、５つのがんの種類間の原発巣組織、および、がんの状態を正確に予測するための分類器として用いることができるということがわかった。このように、さまざまながんの分類法を、かなり少ない数の遺伝子マーカーの遺伝子発現プロファイルを決定することによって得ることができる。
表７は、指定された原発巣組織について同定されたマーカーを示している。遺伝子の説明については表１５を参照のこと。
Figure 2009508493
サンプル群は、全体で２９９個の転移性結腸がん、転移性乳がん、転移性すい臓がん、転移性卵巣がん、転移性前立腺がん、転移性肺がん、および、その他のがん、ならびに、原発性前立腺がんのサンプルを含んだ。組織学的な評価、対照遺伝子βアクチンのＲＮＡ収量、および、その発現に基づく性質確認（ＱＣ）が行われた。他のサンプルカテゴリーは胃がん（５個）、腎臓がん（６個）、胆管／胆のうがん（４個）、肝臓がん（２個）、頭頸部がん（４個）、回腸がん（１個）から生じた転移、および、１個の中皮種を含んだ。結果を表８にまとめる。
Figure 2009508493
上記サンプルを試験することによって、結果的に表９のマーカー群にまで削減された。その結果を表１０に示す。
Figure 2009508493
Figure 2009508493
その結果は、表１１のように、２０５個のパラフィン包埋転移性腫瘍のうち；１６６個のサンプル（８１％）が最終的な分析結果を有したということを示した。
Figure 2009508493
偽陽性結果のうち、表１２のように、多くの誤りが、組織学的および発生学的に類似の組織に由来した。
Figure 2009508493
以下のパラメータが、モデル開発のために検討された。
女性群、および、男性群におけるマーカーを分離し、ならびに、男性患者、および、女性患者についてのＣＵＰ確率を別々に計算する。男性群には、ＳＰ＿Ｂ、ＴＴＦ１、ＤＳＧ３、ＰＳＣＡ、Ｆ５、ＰＳＡ、ＨＰＴ１を含み；女性群には、ＳＰ＿Ｂ、ＴＴＦ１、ＤＳＧ３、ＰＳＣＡ、Ｆ５、ＨＰＴ１、ＭＧＢ、ＰＤＥＦ、ＷＴ１を含んだ。バックグラウンドの発現（すなわち、肺：ＳＰ＿Ｂ、ＴＴＦ１、ＤＳＧ３；卵巣：ＷＴ１、および、結腸：ＨＰＴ１）は、解析結果から除外された。
ＣＵＰモデルは、そのＣＵＰの罹患率（％）（すなわち、肺がん２３％、すい臓がん１６％、結腸直腸がん９％、乳がん３％、卵巣がん４％、前立腺がん２％、その他のがん４３％）に調整された。乳がんおよび卵巣がんに対する罹患率は、男性患者については０％に調整され、そして、前立腺がんの罹患率は、女性患者については０％に調整された。
以下のステップが採用された。
マーカーを同様の尺度上に置き；最小値を各組織特異的な群から選択することにより、変数の数を１２個から８個に減らし；１個のサンプルを除き；残りのサンプルからモデルを構築し；除いたサンプルをテストし；１００％のサンプルが試験されるまで繰り返し；ランダムにサンプルのうち〜５０％（組織当たり〜５０％）を除き；残りのサンプルからモデルを構築し；サンプルのうち〜５０％のサンプルについて試験し；それから、３つの異なるランダムな分割群について反復する。
分類確度は、がんの種類の罹患率に調整された。結果は表１３にまとめられ、原データを表１４に示す。
本発明は、理解を明確にする目的で、図および実施例の形である程度詳細に説明したが、その説明および実施例を、発明の範囲を限定するものとして解釈するべきではない。
Figure 2009508493
Figure 2009508493
Figure 2009508493
Figure 2009508493
〔実施の態様〕
（１）すい臓がんを同定する方法において、
ａ 転移性細胞を含むサンプルを入手するステップと、
ｂ マーカー遺伝子Ｆ５、ＰＳＣＡ、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、もしくは、ＦＫＢＰ１０の発現と関連するバイオマーカーを評価するステップと、
を含み、
事前決定されたカットオフ水準を超えるか、もしくは、カットオフ水準を下回る前記マーカー遺伝子の発現量は、前記サンプルにおけるすい臓がんの存在を示す、方法。
（２）実施態様１に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、Ｆ５、および、ＰＳＣＡである、方法。
（３）実施態様３に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０をさらに含むか、または、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０によって置き換えられる、方法。
（４）実施態様１〜３のいずれかに記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号３９〜４１および４３〜４５のうち少なくとも１個の配列を用いて評価される、方法。
（５）組成物において、
配列番号３９〜４１および４３〜４５から選ばれる少なくとも１個の単離された配列、
を含む、組成物。
（６）実施態様１〜３のいずれかにしたがって解析を実施するためのキットにおいて、
バイオマーカー検出試薬、
を含む、キット。
（７）マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップにおいて、
実施態様１〜３のいずれかに記載の方法を実行するための、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ。
（８）診断上の／予後上のポートフォリオにおいて、
実施態様１〜３のいずれかにしたがった遺伝子の組み合わせに係る、単離された核酸配列、前記核酸配列の相補配列、もしくは、前記核酸配列の部分配列、
を含み、
前記遺伝子の組み合わせは、異なるがん由来の細胞、もしくは、正常組織由来の細胞と比較して、転移性細胞を有する生物学的サンプルにおける遺伝子発現を評価するために十分であるか、もしくは、前記遺伝子発現を特徴付けるために十分である、診断上の／予後上ポートフォリオ。
（９）実施態様１〜３のいずれかに記載の方法において、
前記サンプルにおいてさらに構成的に発現する、少なくとも１個の遺伝子の発現を評価するステップ、
をさらに含む、方法。
〔参照文献〕
Figure 2009508493

Figure 2009508493

Figure 2009508493
組織パネルにおける２個の遺伝子の発現強度を示しているマイクロアレイデータの図である。 Agilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。 異なる３つのｑＲＴＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。 解析の最適化の図である。 ２３９個のサンプルに係る１０個のマーカーパネルの相対的な発現量を示すヒートマップである。

Claims (9)

  1. すい臓がんを同定する方法において、
    ａ．転移性細胞を含むサンプルを入手するステップと、
    ｂ．マーカー遺伝子Ｆ５、ＰＳＣＡ、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、もしくは、ＦＫＢＰ１０の発現と関連するバイオマーカーを評価するステップと、
    を含み、
    事前決定されたカットオフ水準を超えるか、もしくは、カットオフ水準を下回る前記マーカー遺伝子の発現量は、前記サンプルにおけるすい臓がんの存在を示す、方法。
  2. 請求項１に記載の方法において、
    前記マーカー遺伝子は、Ｆ５、および、ＰＳＣＡである、方法。
  3. 請求項２に記載の方法において、
    前記マーカー遺伝子は、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０をさらに含むか、または、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０によって置き換えられる、方法。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法において、
    遺伝子発現は、配列番号３９〜４１および４３〜４５のうち少なくとも１個の配列を用いて評価される、方法。
  5. 組成物において、
    配列番号３９〜４１および４３〜４５から選ばれる少なくとも１個の単離された配列、
    を含む、組成物。
  6. 請求項１〜３のいずれか１項にしたがって解析を実施するためのキットにおいて、
    バイオマーカー検出試薬、
    を含む、キット。
  7. マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップにおいて、
    請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を実行するための、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ。
  8. 診断上の／予後上のポートフォリオにおいて、
    請求項１〜３のいずれか１項にしたがった遺伝子の組み合わせにの、単離された核酸配列、前記核酸配列の相補配列、もしくは、前記核酸配列の部分配列、
    を含み、
    前記遺伝子の組み合わせは、異なるがん由来の細胞、もしくは、正常組織由来の細胞と比較して、転移性細胞を有する生物学的サンプルにおける遺伝子発現を評価するために十分であるか、もしくは、前記遺伝子発現を特徴付けるために十分である、診断上の／予後上ポートフォリオ。
  9. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法において、
    前記サンプルにおいてさらに構成的に発現する、少なくとも１個の遺伝子の発現を評価するステップ、
    をさらに含む、方法。
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