JP2009509502A - 原発不明がんの原発巣を同定するための方法および材料 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、原発不明転移の原発巣を同定する方法を提供する。その方法は、転移性細胞を含むサンプルを入手し;少なくとも2つの異なるがんに関連するバイオマーカーを評価し;バイオマーカーから得られたデータを組み合わせ、あるアルゴリズムにして(そのアルゴリズムは、基準に対してバイオマーカーを標準化し;各々のバイオマーカーの感受性と特異性を最適化するカットオフを課し、それらのがんに係る罹患率を加重し、原発巣組織を選択する);そのアルゴリズムによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、そのがんが特定のがん集団に由来しないことを決定し;そして、任意に、1個以上の更なる、異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、更なるバイオマーカーに対してステップを反復する;ことによる。
【選択図】なし
Description
本発明は、原発不明がん(carcinoma of unknown primary origin)の原発巣を同定するための材料、方法、アルゴリズム、キット等を提供する。
原発不明がん(CUP)は、異種の、生検によって確認される悪性腫瘍の群であり、転移性の疾患が、同定可能な原発腫瘍部位、すなわち原発巣組織(tissue of origin)(ToO)なしで現れるものである。この問題は、すべてのがんのおよそ3〜5%に該当し、原発不明がんを七番目に一般的な悪性腫瘍にしている。Ghosh他(2005年);および、Mintzer他(2004年)参照。患者の予後診断および治療方法は、原発腫瘍の原因次第であり、そのため、原発腫瘍部位を同定する必要性が強調されている。Greco他(2004年);Lembersky他(1996年);および、Schlag他(1994年)参照。
本発明は、原発不明転移(metastasis of unknown origin)の原発巣を同定する方法を提供する。その方法は、転移性細胞を含むサンプルを入手し;少なくとも2つの異なるがん(carcinoma)に関連するバイオマーカー(biomarker)を評価し;バイオマーカーから得られたデータを組み合わせて、あるアルゴリズムにして(そのアルゴリズムは、基準に対してバイオマーカーを標準化し;そして、各々のバイオマーカーの感受性と特異性を最適化させるカットオフを課し、それらのがんの罹患率を加重し、原発巣組織を選択する);そのアルゴリズムによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、そのがんが特定のがん集団に由来しないことを決定し;そして、任意に、1個以上の更なる、異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、必要に応じて更なるバイオマーカーに対してステップを反復する;ことによる。
図1は、原発不明転移の原発巣を同定する先行技術方法の図である。
図2は、原発不明転移の原発巣を同定する先行技術方法の図である。
図3は、本発明に係るCUP診断アルゴリズムの図である。
図4は、組織パネルにおける2個の遺伝子の発現強度を示しているマイクロアレイデータの図である。(A)前立腺幹細胞抗原(PSCA)、(B)凝固第5因子(F5)である。棒グラフは、Y軸に強度、X軸に組織を表している。Panc Caはすい臓がん;Panc Nは正常なすい臓である。
図5は、Agilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。RNAを、3時間(A)、もしくは、16時間(B)のタンパク質分解酵素Kの消化により、FFPE組織から単離した。サンプルC22(赤色)は1年前のブロックであり、サンプルC23(青色)は5年前のブロックである。大きさを示すラダー(size ladder)を緑色で示す。
図7は、CUP解析プレートの図である。
図8は、RNA濃度範囲に渡る解析性能を示した一連のグラフである。
図9Aは、実験作業の流れ(マーカー候補の指定および確認)の図である。
図9Bは、実験作業の流れ(解析の最適化、ならびに、予測アルゴリズムの構築および試験)の図解を示す。
図10は、FFPE転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける、選ばれた10個の組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。各図表について、X軸は正規化マーカー発現値を表す。
図12は、239個のサンプルに係る10個のマーカーパネルの相対的な発現量を示すヒートマップである。赤色がより高い発現を表す。
原発不明の転移性がん(CUP)を有する患者の原発部位を同定することは、特異的な治療方法を提供することを可能にし、延命させるかもしれない。マーカー候補はそれから、特異性を決定するために、他のがんの種類から生じた転移で確認されたのと同様に、6つの組織から生じた205個のFFPE転移性がんで、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(reverse transcriptase polymerase chain reaction)(RT−PCR)によって確認された。10個の遺伝子特性が選ばれ、これら6つのがんの種類に対する転移性がんの原発巣組織を予測した。次に、RNA単離法およびqRTPCR法はこれらの10個のマーカーのために最適化され、そして、qRTPCR解析は260個の転移性腫瘍の群に適用され、全体では78%の確度を得た。最終的に、48個の転移性サンプルの独立した群が検査された。重要なことは、この群のうち37個のサンプルが、既知の原発腫瘍もしくは最初にCUPとして示されたもののどちらかであったが、その後解決され、その解析は78%の確度を示した。
は、分類器
を生成する。その分類器は、
であるサンプルを、その原発巣組織のラベル
へ位置付けする(maps)。予測は以前に解決された症例に基づく。その症例は、データベースに含まれており、ゆえに、訓練群を構成する。
、および、共分散Σy=0、Σy=1が与えられる場合に、平均値
、および、分散
を有するであろう、
の線形的な組み合わせを探す方法である。この分散は、分類群内の分散に対する分類群間の分散の割合を最大にするであろうものである。すなわち、
を満たす。
2)各サンプルに対して、各マーカーから対照サンプル特異的な平均を差し引くことにより、10個のマーカー遺伝子に係る値を標準化する。
3)訓練データ群は、原発巣部位がわかっている転移から構成され、各サンプルは標的マーカーのうち少なくとも1つ有する。この標的マーカーは、ラベルされた原発巣組織に特異的であり、CT値が5未満に標準化されている。
4)LDA法は(3)における訓練データから、2つのLDAモデルについての4つの群を構築する。各群において、1つのモデルは男性特異的なものであり、乳がん、および、卵巣がんに対して0に設定された事前確率(prior odds)を有し、同時に、前立腺がんに対しては、他の分類ラベルの事前確率と等価に設定された事前確率を有する。各対の他方のモデルは女性特異的なものであり、前立腺がんに対して0に設定された事前確率を有し、乳がん、および、卵巣がんに対しては、他の分類ラベルで見られた等価の事前確率に設定された事前確率を有する。
a.1番目の群は、結腸で見つかったCUPサンプルを試験するために用いられ、結腸がんに対する事前確率は0に設定されており、そして、他の非生殖的な分類ラベルはすべて、等価の事前確率に設定されている。
b.2番目のモデル群は、卵巣で見つかったCUPに特異的であり、卵巣がんに対して0に設定された事前確率を有し、そして、他の非生殖的な分類ラベルはすべて、等価の事前確率に設定されている。
c.3番目の群は、肺で見つかったCUPのためのものであり、肺がんに対して0に設定された事前確率を有する。他の非生殖的な分類ラベルはすべて、等価な事前確率を有する。
d.一般的なモデルは他のすべてのバックグラウンド組織に対して用いられる。すべての事前確率は、4において規定された群である生殖特異的な分類ラベルを除いて、等価に設定される。
2)両方の対照に係るサンプル特異的平均を生成する。
3)各サンプルに対して、各マーカーから差し引くために、サンプル特異的平均を用いる。
4)40の原CT値から生成された、すべての標準化CT値を、12で置換する。
5)試験群における各サンプルに対して、以下のことを試験する。
a.両方の対照に係る平均が34より大きい場合、その後、そのサンプルは事後確率が0である「CTR_FAILURE」とラベルされる。
b.バックグラウンドを、結腸、卵巣、もしくは、肺について調べる。もし一致が見られれば、それから性に対しても同様に調べる。バックグラウンドおよび性特異的なモデルは、それからサンプルを評価するために用いられる。
c.乳がん、すい臓がん、肺SCC(lungSCC)、もしくは、前立腺がんが、バックグラウンドラベルとして見出された場合、そのサンプルには「FAILURE_ineligible_sample」のラベルを付し、事後確率をすべて0に設定する。
d.男性もしくは女性のどちらかのための一般的モデルは、他のすべてのサンプルに対して用いられる。
材料と方法
<すい臓がんマーカー遺伝子の発見>
RNAを、すい臓腫瘍、正常すい臓組織、肺組織、結腸組織、乳房組織、および卵巣組織から、トリゾールを用いて単離した。そのRNAは、増幅され、標識されたRNAを生成するために用いられ[Lipshutz他(1999年)参照]、それから、その標識RNAをAffymetrix U133A array上にハイブリダイズさせた。それから、そのデータは2つの方法で分析された。
全体で260個のFFPE転移性組織および原発組織が、さまざまな業者から入手された。試験されたサンプルには、30個の乳がん転移、30個の結腸直腸がん転移、56個の肺がん転移、49個の卵巣がん転移、43個のすい臓がん転移、18個の前立腺原発腫瘍、および、2個の前立腺がん転移、ならびに、32個のその他の原発巣(6個の胃がん、6個の腎臓がん、3個の喉頭がん、2個の肝臓がん、1個の食道がん、1個の咽頭がん、1個の胆管がん、1個の胸膜がん、3個の膀胱がん、5個のメラノーマ、3個のリンパ腫)を含んだ。
パラフィン組織切片からのRNA単離は、以下の修正を伴うHigh Pure RNA Paraffin Kit manual(Roche)に記載された方法、および、試薬に基づいた。パラフィン包埋組織サンプルは、包埋された転移の大きさにしたがって切断され(大きさが2〜5mmであれば9×10μm、6〜8mmであれば6×10μm、8〜10mm以上であれば3×10μm)、1.5mLエッペンドルフチューブ(Eppendorf tubes)中のRNA分解酵素/DNA分解酵素の中に静置した。切片は、10〜20秒撹拌した後、室温で2〜5分間、1mLのキシレン中でインキュベーション(incubation)することで、脱パラフィン化した。その後、チューブを遠心分離し、上澄みを除去し、そして、脱パラフィン化のステップをくり返した。上澄みを除去した後、1mLのエタノールを加え、サンプルを1分間撹拌し遠心分離し、上澄みを除去した。この過程をもう一度くり返した。残存しているエタノールを除去し、ペレット(pellet)を55℃のオーブンで5〜10分間乾燥させ、100μLの組織溶解バッファー(tissue lysis buffer)、16μLの10%SDS、および、80μLのタンパク質分解酵素Kに再懸濁させた。サンプルを、400回転/分に設定したサーモミキサー(thermomixer)内で、55℃で2時間にわたり撹拌およびインキュベートした。325μLの結合バッファー(binding buffer)、および、325μLのエタノールを各々のサンプルに加え、そのサンプルをかき混ぜ、遠心分離し、そして、上澄みをフィルターカラムに加えた。フィルターカラムを収集チューブとともに、8000回転/分で1分間遠心分離し、流出物(flow through)を廃棄した。一連の洗浄を行った[500μLの洗浄バッファー(wash buffer)I→500μLの洗浄バッファーII→300μLの洗浄バッファーII]。その洗浄では、各々の溶液をカラムに加え、遠心分離し、そして、流出物を廃棄した。カラムをその後、最大速度で2分間遠心分離し、新しい1.5mLチューブ中に入れ、そして、90μLの溶出バッファー(elution buffer)を加えた。RNAは、室温で1分間のインキュベーション、および、その後の8000回転/分で1分間の遠心分離を行った後に得られた。サンプルは、10μLのDNA分解酵素インキュベーションバッファー(DNase incubation buffer)、2μLのDNA分解酵素Iを加えることによって、DNA分解酵素処理され、そして37℃で30分間インキュベートされた。DNA分解酵素は、20μLの組織溶解バッファー、18μLの10%SDSおよび40μLのタンパク質分解酵素Kを加えた後に、不活化された。再び、325μLの結合バッファー、および、325μLのエタノールを各々のサンプルに加え、そのサンプルをかき混ぜ、遠心分離し、そして、上澄みをフィルターカラムに加えた。一連の洗浄、および、RNAの溶出は、RNAを溶出するために50μLの溶出バッファーが用いられたことを除いては、前述のとおり行われた。カラムから持ち越されるガラス繊維による汚染を排除するために、RNAを最大速度で2分間遠心分離し、上澄みを新しい1.5mLエッペンドルフチューブ中に移した。サンプルを、分光光度計によって得られたOD 260/280の示度により定量し、50ng/μLに希釈した。単離されたRNAを、使用するまでRNA分解酵素の含まれない水中に−80℃で保管した。
適当なmRNA参照配列アクセッション番号(mRNA reference sequence accession numbers)が、Oligo 6.0とともに、TaqMan(登録商標)CUP解析[肺がんマーカー:ヒト肺サーファクタント関連タンパク質B(human surfactant, pulmonary-associated protein B)(HUMPSPBA)、甲状腺転写因子1(TTF1)、デスモグレイン3(DSG3)、結腸直腸がんマーカー:カドヘリン17(CHD17)、乳がんマーカー:マンマグロビン(MG)、前立腺由来ets転写因子(PDEF)、卵巣がんマーカー:ウィルムス腫1(WT1)、すい臓がんマーカー:前立腺幹細胞抗原(PSCA)、凝固第5因子(F5)、前立腺マーカー:カリクレイン3(KLK3)]、および、ハウスキーピング解析(housekeeping assays)[βアクチン、ハイドロキシメチルビラン合成酵素(hydroxymethylbilane synthase)(PBGD)]を開発するために用いられた。各解析のためのプライマー、および、加水分解プローブは、表2に列記されている。エキソン−イントロンスプライシング部位周辺に解析を設計することで、ゲノムDNA増幅を除去した。加水分解プローブは、5’末端のヌクレオチドにおいてFAM(レポーター染料)で、3’末端のヌクレオチドにおいてBHQ1−TT[インターナルクエンチング染料(internal quenching dye)]で標識された。
遺伝子特異的RNAの定量は、ABI Prism 7900HT配列検知システム(Applied Biosystems)の384ウェルプレート(well plate)において、実行された。各サーモサイクラー(thermo-cycler)の実行のために、キャリブレーターおよび標準曲線を増幅した。各マーカーためのキャリブレーターは、生体外転写産物中の標的遺伝子からなり、それらはラットの腎臓由来のキャリアRNA(carrier RNA)中で1×105コピーで希釈したものであった。ハウスキーピングマーカーための標準曲線は、生体外転写産物中の標的遺伝子からなり、それらはラットの腎臓由来のキャリアRNA中で1×107、1×105、1×103コピーで連続希釈したものであった。標的遺伝子がない対照(No target controls)も、周囲の汚染(environmental contamination)がないことを確かめるために、各解析の実行に含まれた。すべてのサンプルおよび対照は繰り返して実行された。qRTPCRは、10μLの反応物(10μl reaction)中で一般的な研究室で用いられる試薬で実行された。その10μLの反応物には、RT−PCRバッファー[50nMビシン/水酸化カリウムpH8.2、115nM酢酸カリウム、8%グリセロール、2.5mM塩化マグネシウム、3.5mM硫酸マンガン、各0.5mMのデオキシシチジン三リン酸(dCTP)、デオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)]、添加物[2mMトリス塩酸バッファー(Tris-Cl)pH8、0.2mMウシアルブミン、150mMトレハロース、0.002% Tween20]、酵素混合液[2U Tth(Roche)、0.4mg/μL Ab TP6−25]、プライマーおよびプローブ混合液(0.2μMプローブ、0.5μMプライマー)を含んだ。その後のサイクリングパラメータ(cycling parameter)は、95℃、1分間を1サイクル;55℃、2分間を1サイクル;温度上昇(Ramp)5%;70℃、2分間を1サイクル;95℃、15秒間、58℃、30秒間を40サイクル;であった。PCR反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したCt値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
第一鎖合成は、1反応あたり、100ngのランダムヘキサマー、もしくは、遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いて実行した。第1段階目では、11.5μLの混合液1(プライマー、および、1μgの全RNA)を65℃まで5分間加熱し、その後、氷上で冷却した。8.5μLの混合液2[1×バッファー、0.01mMジチオトレイトール(DTT)、各0.5mM dNTP(dCTP、dATP、dGTP、dTTPを混合したもの)、0.25U/μL RNasin(登録商標)、10U/μL Superscript III]を混合液1に添加し、50℃で、60分間インキュベートした後、95℃で、5分間インキュベートした。cDNAを、使える状態になるまで、−20℃で保管した。2段階反応の第2段階目のqRTPCRは、サイクリングパラメータ、95℃、1分間を1サイクル;95℃、15秒間、58℃、30秒間を40サイクルで、前述のとおり実行した。1段階反応のためのqRTPCRは、前の段落に記載のとおり正確に実行された。1段階および2段階反応はともに、100ngの鋳型(RNA/cDNA)に対して実行された。PCR反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したCt値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
各サンプルのΔCtは、各々のCUPマーカーのCt値の平均値をとり、平均のハウスキーピングマーカーのCt値の平均値を引くことにより計算された[ΔCt=Ct(CUPマーカー)−Ct(平均のハウスキーピングマーカー)]。各々の原発巣組織(肺、乳、前立腺、結腸、卵巣、すい臓)マーカー群の最小のΔCtを、サンプルごとに決定した。全体の最小ΔCtを有する原発巣組織には得点1を与え、他のすべての原発巣組織には得点0を与える。データを病理学上の診断にしたがって分類した。Partek Proには修正された実現可能性データを投入し、強度プロット(intensity plot)を生成した。
<新規のすい臓原発巣腫瘍およびがん状況マーカーの発見>
まず、5つのすい臓マーカー候補が解析された。それらのマーカー候補は、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、セリンプロテイナーゼ阻害剤(serine proteinase inhibitor)、クレードAメンバー1(clade A member 1)(SERPINA1)、サイトケラチン(cytokeratin)7(KRT7)、マトリックスメタロプロテアーゼ(matrix meralloprotease)11(MMP11)、および、ムチン(mucin)4(MUC4)[Varadhachary他(2004年);Fukushima他(2004年);Argani他(2001年);Jones他(2004年);Prasad他(2005年);および、Moniaux他(2004年)参照]であり、DNAマイクロアレイ、ならびに、13個のすい臓管腺がん、5個の正常すい臓組織、および、98個のサンプル(乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、および、卵巣腫瘍に由来する)に係るパネルを用いて解析された。PSCAのみが、適度な感受性(13個中6個、すなわち、すい臓腫瘍のうち46%を検出した)を、高い特異性(98個のサンプル中91個、すなわち、93%が、すい臓が原発巣でないと正確に同定された)で示した(図4A)。これに対して、KRT7、SERPINA1、MMP11、および、MUC4は、それぞれ38%、31%、85%および31%の感受性を、それぞれ66%、91%、82%および81%の特異性で示した。これらのデータは、27個のすい臓原発巣の転移、および、39個の非すい臓原発巣の転移で、MMP11を除くすべてのマーカーについて実行したqRTPCRと十分一致した。MMP11は、qRTPCRおよび転移に対して、より低い感受性とより低い特異性を示した。結論として、急速冷凍した原発組織におけるマイクロアレイデータは、FFPE転移がすい臓原発巣であることをqRTPCRによって同定することのできるマーカーの能力に対する良い指標として役立つ。しかし、更なるマーカーが最適な効果のために有用であるかもしれない。
次に、マーカーパネル性能を検査する前に、固定組織を用いて、RNA単離法、および、qRTPCR法を最適化した。まず、タンパク質分解酵素Kのインキュベーション時間を16時間から3時間に短縮した効果を分析した。収率にはまったく変化はなかった。しかし、いくつかのサンプルで、より短い時間のタンパク質分解酵素Kステップを用いたときに、より長いRNA断片を示すものがあった(図5)。例えば、RNAを1年前の組織ブロック(C22)から単離したとき、電気泳動図にはまったくちがいは見られなかった。しかし、RNAを5年前の組織ブロック(C23)から単離したときには、より短い時間のタンパク質分解酵素K消化を用いた場合に、肩のこぶ(hump in the shoulder)によって解析されると、より高分子量のRNAの区画がより多く観察された。この傾向は一般的に、FFPE転移の原発巣器官にかかわらず、他のサンプルを処理する際にも保持された。結論として、タンパク質分解酵素K消化時間の短縮は、RNA収量を犠牲にしないし、そして、より長く、あまり分解されていないRNAを単離する助けになるかもしれない。
次に、12個のqRTPCR反応(10個のマーカー、および、2個のハウスキーピング遺伝子)を239個のFFPE転移に対して実行した。その解析に用いられたマーカーを表2に示す。肺がんマーカーは、ヒト肺サーファクタント関連タンパク質B(HUMPSPB)、甲状腺転写因子1(TTF1)、および、デスモグレイン3(DSG3)であった。結腸直腸がんマーカーは、カドヘリン17(CDH17)であった。乳がんマーカーは、マンマグロビン(MG)、および前立腺由来Ets転写因子(PDEF)であった。卵巣がんマーカーは、ウィルムス腫1(WT1)であった。すい臓がんマーカーは、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、および、凝固第5因子(F5)であり、前立腺マーカーは、カリクレイン3(KLK3)であった。遺伝子の説明については、表31参照のこと。
本実施例において、マイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析は、転移に用いるための候補マーカーを同定するために、原発腫瘍に対して用いられる。転移に対する原発巣腫瘍マーカーを発見するために原発腫瘍を用いることができるという事実は、最近のいくつかの発見と一致する。例えば、Weigeltと同僚は、原発性乳房腫瘍の遺伝子発現プロファイルは、遠隔転移においても維持されるということを示した。Weigelt他(2003年)参照。Italianoと共同研究者は、IHCによって判定されるEGFR(上皮成長因子受容体)の状態が、80個の原発性結腸直腸がん腫瘍、および、80個の関係する転移においても同様であることを発見した。Italiano他(2005年)参照。その80個のうち5個のみが、EGFRの状態において不一致を示した。Italiano他(2005年)参照。Backusと同僚は、乳房組織およびその他の組織のゲノム規模遺伝子発現解析を用いて、乳がん転移を検出するための推測上のマーカーを同定し、そして、マンマグロビンおよびCK19が、90%の感受性と94%の特異性で、乳房センチネルリンパ節における臨床上有効な転移(clinically acctionable metastasis)を検出したことを明らかにした。Backus他(2005年)参照。
CUP−FFPE全RNA単離プロトコル
(Highpure kitカタログ番号3270289)
目的:
FFPE組織からの全RNAの単離
<希釈標準溶液(working solution)の準備>
1.キットのタンパク質分解酵素K(PK)
凍結乾燥物(lyophilizate)を4.5mLの溶出バッファーに溶解する。等分し、−20℃で保管すれば、12ヶ月間安定である。
PK − 4×250mg(カタログ番号3115852)
凍結乾燥物を12.5mLの溶出バッファー[1×TEバッファー(pH7.4〜7)]に溶解する。
等分し、−20℃で保管する。
2.洗浄バッファーI
洗浄バッファーIに、60mLの無水エタノールを加え、室温で保管する。
3.洗浄バッファーII
洗浄バッファーIIに200mLの無水エタノールを加え、室温で保管する。
4.DNA分解酵素I
凍結乾燥物を400μLの溶出バッファーに溶解する。等分して、−20℃で保管すれば、12ヶ月間安定である。
ブロックから切り取られた切片は、RNA抽出のために即座に処理されなければならない。
1.ミクロトーム(Microtome)上の清潔で鋭利なかみそり刃を用い、切り出された組織ブロック(3〜4×5〜10mmのサイズ)から6×10ミクロン厚さの切片を切り出す。
注意:新たなブロック‐組織切片が得られるまでワックス切片を廃棄する。使用されたブロック‐最初の3個の組織切片を廃棄する。
2.切られた組織をすぐさま1.5mLのマイクロ遠心機のチューブに入れ、水分を最小限にするためにかたくふたを閉める。
3.表4に示すように、腫瘍の大きさに基づいて切片数を採取することを薦める。
1.1.0mLのキシレンを各サンプルに加え、10〜20秒間激しく撹拌し、室温で2〜5分インキュベートする。最大速度で2分間遠心分離する。上澄みを注意深く取り除く。
注意:もし組織が浮かんでくるようであれば、さらに2分間遠心分離する。
2.ステップ1をくり返す。
3.最大速度で2分間遠心分離する。上澄みを取り除く。
4.1mLの無水エタノールを加え、1分間激しく撹拌する。最大速度で2分間遠心分離する。上澄みを取り除く。
5.ステップ4をくり返す。
6.チューブを一時的にペーパータオルの上に並べ(blot)、残りのエタノールを除去する。
7.組織ペレットを55℃のオーブンで5〜10分間乾燥させる。
注意:エタノールは完全に取り除き、ペレットを十分に乾燥させることが重要である。残留したエタノールはPKによる消化を阻害する可能性がある。
注意:もしPKが−20℃中にあるならば、室温で20〜30分間あたためる。
1.1つの組織ペレットに、100μLの組織溶解バッファー、16μLの10%SDS、および、80μLのタンパク質分解酵素K希釈標準溶液を加え、適当な間隔で簡単に撹拌し、そして、400回転/分で振り混ぜながら55℃で2時間インキュベートする。
2.325μLの結合バッファーと325μLの無水エタノールを加える。ピペッティングで上下させることによりやさしく混和する。
3.溶解物を最大速度で2分間遠心分離する。
4.フィルターチューブと収集チューブ(12チューブ分)を組み合わせ、溶解物の上澄みをフィルターにピペットで入れる。
5.8000回転/分で30秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
注意:もしRNAをさらに2つの組織ペレット準備物から集める必要がある場合、ステップ4〜5をくり返すことができる。
6.8000回転/分で30秒間の遠心分離を繰り返し、フィルターを乾燥させる。
7.500μLの洗浄バッファーI希釈標準溶液をカラムに加え、8000回転/分で15〜30秒間遠心分離し、流出物は廃棄する。
8.500μLの洗浄バッファーII希釈標準溶液を加える。8000回転/分で15〜30秒間遠心分離し、流出物は廃棄する。
9.300μLの洗浄バッファーII希釈標準溶液を加え、8000回転/分で15〜30秒間遠心分離し、流出物は廃棄する。
10.High Pure filterを最大速度で2分間遠心分離する。
11.High Pure filterを新しい1.5mLチューブの中に入れ、90μLの溶出バッファーを加える。室温で1〜2分インキュベートする。8000回転/分で1分間遠心分離する。
12.溶出物に10μLの10×DNA分解酵素インキュベーションバッファー(DNase incubation buffer)、および、1.0μLのDNA分解酵素I希釈標準溶液を加え、混和する。37℃で45分間(2.0μLのDNA分解酵素Iに対しては、30分間)インキュベートする。
13.20μLの組織溶解バッファー、18μLの10%SDS、および、40μLのタンパク質分解酵素K希釈標準溶液を加える。軽く撹拌する。55℃で30分間(30〜60分間)インキュベートする。
14.325μLの結合バッファー、および、325μLの無水エタノールを加える。混和し、収集チューブと組み合わせた新しいHigh Pure filter tubeにピペットで入れる(12チューブ分)。
15.8000回転/分で30秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
16.8000回転/分で30秒間の遠心分離を繰り返し、フィルターを乾燥させる。
17.カラムに500μLの洗浄バッファーI希釈標準溶液を加える。8000回転/分で15秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
18.500μLの洗浄バッファーII希釈標準溶液を加える。8000回転/分で15秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
19.300μLの洗浄バッファーII希釈標準溶液を加える。8000回転/分で15秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
20.High Pure filterを最大速度で2分間遠心分離する。
21.High Pure filterチューブを新しい1.5mLチューブ中に入れる。50μLの溶出バッファーを加え;室温で1〜2分間インキュベートする。8000回転/分で1分間遠心分離し、溶出されたRNAを収集する。
22.溶出物を最大速度で2分間遠心分離し、底にあるガラス繊維をかき乱すことなしに、上澄みを新しいチューブに移す。
23.OD260/280の示度を採り、50ng/μLに希釈する。−80℃で保管する。
目的:CUPサンプルの原発巣組織を決定するためにqRTPCRを用いる。
対照設定:
1.陽性対照(表5、および、図7中プレート設定におけるプレートCを参照。)
チューブ当たり250μLの分割量、−20℃で凍結させる。
1.CUP原混合液(CUP Master Mix)(CMM):(表12〜14、および、図7中プレート設定におけるプレートAを参照。)
プレートへの充填:
1.384ウェルプレート設定:(図7のプレート設定におけるプレートDを参照。)
2μLのサンプルおよび8μLのCMMをプレートに充填する(サンプル=50ng/μL)。
4μLのサンプルおよび6μLのCMMをプレートに充填する(サンプル=25ng/μL)。
プレートは封をして、ラベルをはる。2000回転/分で1分間遠心分離する。
CUPアルゴリズム
HPT、MGB、PDEF、PSA、SP−B、TFF、DSG、WT1、PSCA、および、F5に対してΔCt値を標準化したアクチンを、もともと選ばれた原発巣組織に基づいた6つの群の中に置く。定数9.00、11.00、7.50、5.00、10.00、9.50、6.50、8.00、9.00、および、8.00のそれぞれが、各々のΔCtから差し引かれた。それから、各サンプルに対して、6つの群(HPT;MGB、もしくは、PDEFの最小値;PSA;SP−B、TFF、もしくは、DSGの最小値;WT1;および、PSCA、もしくは、F5の最小値)のそれぞれからの最小のCT値が、そのグループの代表的な変数として選択される。
このコードを実行するためには、CUP.MIN.NORMと呼ばれるデータフレームが、前記のように各原発巣組織群に対して計算された最小値を持つ訓練データを含むことが必要である。
CUPが解決されたサンプル
CUPが解決されたか、もしくは、解決されなかった48個のサンプルが、真のCUPサンプルに対する相関を決定するために比較された。用いられた方法は、実施例1〜3に記載の方法であった。得られた結果を表17に示す。解決されなかったCUPのうち、11個のサンプルが試験され、8個のサンプルで診断がなされ、3個のサンプルは他のカテゴリーであった。
CUP解析の限界範囲
図8は、CUP解析の限界範囲(limits)を決定するために、実施例1〜3において記載された方法を用いて得られた結果について示している。解析性能は、RNA濃度の範囲にわたって試験され、CUP解析は100〜12.5ngのRNAの範囲で効果的であることがわかった。
qRTPCR解析
材料と方法
<マイクロアレイ解析のための凍結組織サンプル>
全体で700個のヒト凍結原発組織が、遺伝子発現マイクロアレイプロファイル解析のために用いられた。サンプルは、さまざまな学術機関[Washington University(米国ミズーリ州セントルイス)、Erasmus Medical Center(オランダ国ロッテルダム)を含む]および、民間の組織バンク会社[Genomics Collaborative, Inc(米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)、Asterand(米国ミシガン州デトロイト)、Oncomatrix(米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ)、Clinomics Biosciences(米国マサチューセッツ州ピッツフィールド)を含む]から入手された。各々の標本に対して、患者の人口学上の情報、臨床上の情報、および、病理学上の情報も同様に収集された。各々のサンプルの組織病理学的特徴は、診断を確認するために、ならびに、サンプルの保存状態、および、腫瘍の内容を推定するために再検査された。
70%を超える腫瘍細胞、良性サンプル、および、正常サンプルを有する凍結がんサンプルを細断し、トリゾール試薬(Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド)中で、機械的なホモジェナイザー(homogenizer)(UltraTurrex T8、ドイツ国)によって均質化した。組織は、凍結組織からRNAを単離するための標準的なトリゾールプロトコルに従ってトリゾール試薬中で均質化された(Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド)。遠心分離後、上液相を収集し、−20℃でイソプロピルアルコールによって全RNAを沈降させた。RNAペレットを75%エタノールで洗浄し、水中に再び溶解して、使用するまで−80℃で保管した。
肺組織、結腸組織、乳房組織、卵巣組織、および、前立腺組織に対する原発巣組織(ToO)マーカー候補を選択するために、全体で682個の、乳房、結腸、肺、卵巣、前立腺由来の正常組織、良性組織、および、がん性組織に及ぶRNAサンプルにおいて、プローブ群の発現量が測定された。組織特異的マーカー候補は、統計的クエリの数に基づいて選択された。
全体で386個の原発巣のわかっているFFPE転移性がん(ステージIII〜IV)、および、24個のFFPE原発性前立腺腺がんを、さまざまな業者[Proteogenex(米国カリフォルニア州ロサンゼルス)、Genomic Collaborative, Inc.(米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)、Asterand(米国ミシガン州デトロイト)、Ardais(米国マサチューセッツ州レキシントン)、および、Oncomatrix(米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ)を含む]から入手した。48個の原発腫瘍のわかっている転移性腺がん、および、CUP組織の独立した群については、Albany Medical College(米国ニューヨーク州オールバニー)から手に入れた。各々の標本に対して、患者の人口学上の情報、臨床上の情報、および病理学上の情報が収集された。各々のサンプルの組織病理学的特徴は、診断を確認するために、ならびに、サンプルの保存状態、および、腫瘍の内容を推定するために再検査された。転移サンプルに対する転移性がんおよびToOの診断は、患者の病歴、および、転移性がんを対応する原発腫瘍と比較することによる組織学的な評価に基づいて、明確に確立された。
パラフィン組織切片からのRNA単離は、以下の修正を伴うHigh Pure RNA Paraffin Kit manual(Roche)に記載されたようにした。パラフィン包埋組織サンプルは、包埋された転移の大きさにしたがって切断された(大きさが2〜5mmであれば9×10μm、6〜8mmであれば6×10μm、8〜10mm以上であれば3×10μm)。切片をキットマニュアルに記載のように脱パラフィン化し、組織ペレットを55℃のオーブンで5〜10分間乾燥させ、100μLの組織溶解バッファー、16μLの10%SDS、および、80μLのタンパク質分解酵素K中に再懸濁した。サンプルを55℃、400回転/分、2時間に設定したサーモミキサー内で、撹拌およびインキュベートした。その後のサンプル処理を、High Pure RNA Paraffin Kit manualにしたがって実行した。サンプルを、分光光度計によって得られたOD 260/280示度により定量し、50ng/μLに希釈した。単離されたRNAを、使用するまでRNA分解酵素の含まれない水中に−80℃で保管した。
各サンプル由来の1μgの全RNAを、業者(Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド)の取扱説明書にしたがって、Superscript II逆転写酵素を用いて、ランダムヘキサマーで逆転写した。試験される遺伝子マーカー候補、および、対照遺伝子ACTBのためのプライマーおよびMGB−プローブは、Primer Express software(Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ)を用いて設計し、ABI Assay-on-Demand(Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ)も用いられた。社内で設計されたプライマー、および、プローブはいずれも、90%を超える最適な増幅効率で試験された。RT−PCR増幅は、20mLの反応混合液[200ngの鋳型cDNA、2×TaqMan(登録商標)universal PCR master mix(10mL)(Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ)、500nMフォワードプライマー、および、リバースプライマー、ならびに、250nMプローブを含む]中で実行された。反応はABI PRISM 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ)上で行われた。サイクリング条件は、50℃、2分間のAmpErase UNGの活性化;95℃、10分のポリメラーゼの活性化;ならびに95℃、15秒間、および、アニーリング温度(60℃)、60秒間を50サイクル;である。各々の解析において、「鋳型のない(no-template)」対照が、鋳型cDNAとともに、目的の遺伝子と対照遺伝子両方に対して、2個ずつ含まれた。各標的遺伝子の相対的な発現は、標的遺伝子のCt値から対照遺伝子(ACTB)のCt値を差し引いた値に等しいΔCtとして表された。
適当なmRNA参照配列アクセッション番号が、Oligo 6.0とともに、TaqMan(登録商標)CUP解析[肺がんマーカー:ヒト肺サーファクタント関連タンパク質B(HUMPSPBA)、甲状腺転写因子1(TTF1)、デスモグレイン3(DSG3)、結腸直腸がんマーカー:カドヘリン17(CHD17)、乳がんマーカー:マンマグロビン(MG)、前立腺由来ets転写因子(PDEF)、卵巣がんマーカー:ウィルムス腫1(WT1)、すい臓がんマーカー:前立腺幹細胞抗原(PSCA)、凝固第5因子(F5)、前立腺マーカー:カリクレイン3(KLK3)]、および、ハウスキーピング解析[βアクチン(β−Actin)、ハイドロキシメチルビラン合成酵素(PBGD)]を開発するために用いられた。最適化された1段階qRT−PCR解析のための、遺伝子特異的プライマー、および、加水分解酵素プローブは、表2(配列番号11〜58)に列記されている。エキソン−イントロンスプライシング部位周辺に解析を設計することで、ゲノムDNA増幅を除外した。加水分解プローブは、5’末端のヌクレオチドにおいてFAM(レポーター染料)で、3’末端のヌクレオチドにおいてBHQ1−TT[インターナルクエンチング染料]で標識された。
2段階反応を1段階反応のRT−PCRと比較するために、2段階反応の第一鎖合成は、1反応あたり、100ngのランダムヘキサマー、もしくは、遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いて実行した。第1段階目では、11.5μLの混合液1(プライマー、および、1μgの全RNA)を65℃まで5分間加熱し、その後、氷上で冷却した。8.5μLの混合液2[1×バッファー、0.01mM DTT、各0.5mM dNTP、0.25U/μL RNasin(登録商標)、10U/μL Superscript III]を混合液1に添加し、50℃で、60分間インキュベートした後、95℃で、5分間インキュベートした。cDNAを、使用できる状態になるまで、−20℃で保管した。2段階反応の第2段階目のqRTPCRは、以下のサイクリングパラメータを用いて前述のとおり実行された:95℃、1分間を1サイクル;95℃、15秒間、58℃、30秒間を40サイクル。1段階反応のためのqRTPCRは、前の段落に記載のとおり正確に実行された。1段階および2段階反応はともに、100ngの鋳型(RNA/cDNA)に対して実行された。PCR反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したCt値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
線形判別器は、R言語(2.1.1版)におけるMASS(VenablesおよびRipley)ライブラリ関数「lda」を用いて構築された。用いられたモデルは、患者の性別に依存するのと同様に、転移が抽出された組織に依存する。肺の転移部位、結腸の転移部位、もしくは、卵巣の転移部位に遭遇する場合、その分類の事前確率は、転移部位に対して同等である分類に対して、0に設定される。さらに、男性患者においては、乳房分類および卵巣分類に対する事前確率は0に設定され、一方、女性患者においては、前立腺分類の事前確率は0に設定される。このモデルで用いられる他の事前確率はすべて等価である。さらに、各サンプルに対する分類分けは、各分類に対するモデルによって決定される最も高い事後確率に基づいている。モデル性能を推定するために、1つ取って置き交差検定(leave-one-out cross-validation)を行った。このことに加えて、データ群は、各分類間の比例関係を維持しながら、ランダムに半分に分けられ訓練群と試験群とされた。このランダムな分割を3回くり返した。
本発明の最終目的は、転移性がん原発巣組織を予測するためのqRTPCR解析を開発することである。実験的な作業は2つの主要な部分から成った。1番目の部分は、組織特異的なマーカー候補の指定、FFPE転移性がん組織上でのそれら候補の確認、および、解析のための10個のマーカーの選択を含んだ(図9A)。2番目の部分は、qRTPCR解析の最適化の後に、FFPE転移性がんの他の群に対する解析の実行、予測アルゴリズムの構築、そのアルゴリズムの交差検定、および、独立したサンプル群に対する確認を含んだ(図9B)。
全体で700個の凍結原発組織サンプル由来のRNAが、遺伝子発現プロファイル解析、および、組織の種類特異的な遺伝子の同定に用いられた。サンプルには、545個の原発がん(29個の肺がん、13個のすい臓がん、315個の乳がん、128個の結腸直腸がん、38個の前立腺がん、22個の卵巣がん)、37個の良性病変(1個の肺病変、4個の結腸直腸病変、6個の乳房病変、26個の前立腺病変)、および、118個の正常組織(36個の肺組織、5個のすい臓組織、36個の結腸直腸組織、14個の乳房組織、3個の前立腺組織、24個の卵巣組織)が含まれた。
5つの原発組織の種類(肺、結腸、乳房、卵巣、前立腺)の遺伝子発現プロファイルの分析の結果、qRTPCR試験のための13個の組織特異的マーカー候補が指定された。上位の候補は限局された場所での(in situ)従来のがん研究において同定されてきたものであった。Argani他(2001年);Backus他(2005年);Cunha他(2005年);Borgono他(2004年);McCarthy他(2003年);Hwang他(2004年);Fleming他(2000年);Nakamura他(2002年);および、Khoor他(1997年)参照。マイクロアレイデータの分析に加えて、2個のマーカーが文献から選択された。それらには、補足的な肺扁平上皮がん(lung squamous cell carcinoma)マーカーDSG3、および、乳がんマーカーPDEFを含む。Backus他(2005年)参照。マイクロアレイデータにより、これらのマーカーの高い感受性、および、特異性が確認された。
次に、マーカーパネルの性能を検査する前に、固定組織を用いて、RNA単離法、および、qRTPCR法を最適化した。まず、タンパク質分解酵素Kのインキュベーション時間を16時間から3時間に短縮した効果を分析した。収率にはまったく変化はなかった。しかし、いくつかのサンプルで、より短い時間のタンパク質分解酵素Kステップを用いたときに、より長いRNA断片を示すものがあった(図11A、図11B)。例えば、RNAを1年前の組織ブロック(C22)から単離したとき、電気泳動図にはまったくちがいは見られなかった。しかし、RNAを5年前の組織ブロック(C23)から単離したときには、より短い時間のタンパク質分解酵素K消化を用いた場合に、肩のこぶによって解析されると、より高分子量のRNAの区画がより多く観察された。この傾向は一般的に、FFPE転移の原発巣器官にかかわらず、他のサンプルを処理する際にも保持された。結論として、タンパク質分解酵素K消化時間の短縮は、RNA収量を犠牲にしないし、そして、より長く、あまり分解されていないRNAを単離する助けになるかもしれない。
12個のqRTPCR反応(10個のマーカー、および、2個のハウスキーピング遺伝子)を260個のFFPE転移の新たな群に対して実行した。21個のサンプルがハウスキーピング遺伝子に対して高いCt値を示したため、239個のサンプルのみが、ヒートマップ分析に用いられた。ヒートマップにおける標準化されたCt値の分析は、乳がんマーカー、および、前立腺がんマーカーの高い特異性、結腸がんマーカー、肺がんマーカー、および、卵巣がんマーカーの中程度の特異性、ならびに、すい臓がんマーカーの幾分より低い特異性を明らかにした(図12)。標準化されたqRTPCRデータをコンピュータによる修正と組み合わせることにより、マーカーパネルの性能が改良される。
本研究において、原発腫瘍におけるマイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析は、転移に用いるための候補マーカーを同定するために用いられた。転移に対する原発巣腫瘍マーカーを発見するために、原発腫瘍を用いることができるという事実は、最近のいくつかの発見と一致する。例えば、Weigeltと同僚は、原発性乳房腫瘍の遺伝子発現プロファイルは、遠隔転移においても維持されるということを示した。Weigelt他(2003年)参照。Backusと同僚は、乳房組織およびその他の組織のゲノム規模遺伝子発現解析を用いて、乳がん転移を検出するための推測上のマーカーを同定し、そして、マンマグロビンおよびCK19が、90%の感受性と94%の特異性で、乳房センチネルリンパ節における臨床上有効な転移を検出したことを明らかにした。Backus他(2005年)参照。
本研究において、遺伝子マーカーポートフォリオを用いる分類器は、平均分散最適化(MVO)から選ぶことによって、ならびに、原発巣組織、および、乳がん、結腸がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がんを含む5つの主要ながんの種類に対するがんの状態を予測するためにこの分類器を用いることによって構築された。378個の原発がん、23個の良性増殖上皮病変、および、103個の急速冷凍された正常なヒト組織標本が、Affymetrix human U133A GeneChipを用いて分析された。白血球サンプルもまた、白血球バックグラウンド細胞における共発現によって、潜在的に隠される遺伝子発現を差し引くために分析された。新規のMVOに基づくバイオインフォマティクスの手法は、原発巣組織およびがんの状態に対する遺伝子マーカーポートフォリオを選択するために開発された。そのデータによって、26個の遺伝子のパネルを、5つのがんの種類間の原発巣組織、および、がんの状態を正確に予測するための分類器として用いることができるということがわかった。このように、さまざまながんの分類法を、かなり少ない数の遺伝子マーカーの遺伝子発現プロファイルを決定することによって得ることができる。
マーカーを同様の尺度上に置き;最小値を各組織特異的な群から選択することにより、変数の数を12個から8個に減らし;1個のサンプルを除き;残りのサンプルからモデルを構築し;除いたサンプルをテストし;100%のサンプルが試験されるまで繰り返し;ランダムにサンプルのうち〜50%(組織当たり〜50%)を除き;残りのサンプルからモデルを構築し;サンプルのうち〜50%のサンプルについて試験し;それから、3つの異なるランダムな分割群について反復する。
原発巣組織を予測するための原発部位不明転移性がんCUPの予想される遺伝子特徴についての研究
本研究の具体的なねらいは、10個の遺伝子特徴の能力、すなわち、原発不明がん(CUP)を有する患者における転移性がんの原発巣組織を予測する能力を決定することであった。
ECOG一般状態0〜2を有する、少なくとも18歳の患者でなければならない。腺がん、もしくは、若干分化したがんを有すると診断された患者が採用された。腺がん患者のグループには、高分化の腫瘍、中分化の腫瘍、および、低分化の腫瘍を含む。
本研究において、CUPと診断された患者が採用された。これらの患者は最も利用可能な転移性病変のコアニードル生検、もしくは切除生検を経験してきた者たちである。FNA生検が行われた患者のみが適切ではなかった。試験対象患者基準に合致し、かつ、研究に同意した、最初の60名の継続患者が登録された。再度の生検がMDACCにおいて治療のための診断の目的で必要である場合、患者から同意が得られれば、更なる組織が本発明のために入手された。すべての参加者が、institutional Protocol Data Management System(PDMS)におけるプロトコルに登録された。
本研究には、CUP患者から収集したホルマリン固定されパラフィン包埋された転移性がん標本を含んだ。
全RNAが、前記のプロトコルを用いて各組織サンプルから抽出された。標準量の組織から1μgを超える全RNAを生ずるサンプルのみが、その後のRT−PCR試験のために用いられた。RNA収量のあまりないサンプルは劣化していると考えられ、その後の実験からは除外された。ハウスキーピング発現に基づくRNAの完全性対照(integrity control)は、標準のVeridexの方法にしたがって、劣化したRNAを有するサンプルを除外するために行われた。
60人の患者の限定されたサンプル大きさは、予備的研究の診査の本質のために研究された。これまでに、22人の患者が試験された。ある患者サンプルはRT−PCR試験のための十分なRNAを生成することができず、そして、3個のサンプルが対照遺伝子によるRT−PCRによって判定されたQC対照を通過できなかった。全体で18人の患者が、患者の転移性病変の確率を決定するために用いられた。
(1)原発不明転移の原発巣を同定する方法において、
a.転移性細胞を含むサンプルを入手するステップと、
b.少なくとも2つの異なるがんに関連するバイオマーカーを評価するステップと、
c.前記バイオマーカーから得られたデータを組み合わせて、あるアルゴリズムにするステップであって、前記アルゴリズムは、
i.前記バイオマーカーを基準に対して標準化し、
ii.各々のバイオマーカーの感受性および特異性を最適化するカットオフを課し、前記がんに係る罹患率を加重し、原発巣組織を選択する、
ステップと、
d.前記アルゴリズムによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、前記がんが特定のがん群に由来しないことを決定するステップと、
e.任意に、1個以上の更なる、異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、前記更なるバイオマーカーに対してc)およびd)のステップを反復するステップと、
を含む、方法。
(2)実施態様1に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、
i.SP−B、TTF、DSG3、KRT6F、p73H、もしくは、SFTPC;
ii.F5、PSCA、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10、もしくは、FKBP10;または、
iii.CDH17、CDX1、もしくは、FABP1;
に対応する群のうち少なくとも1つから選ばれる、方法。
(3)実施態様2に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、SP−B、TTF、DSG3、KRT6F、p73H、もしくは、SFTPCである、方法。
(4)実施態様3に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、SP−B、TTF、および、DSG3である、方法。
(5)実施態様4に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、KRT6F、p73H、および/もしくは、SFTPCをさらに含むか、または、KRT6F、p73H、および/もしくは、SFTPCによって置き換えられる、方法。
(6)実施態様2に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、F5、PSCA、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10、もしくは、FKBP10である、方法。
(7)実施態様6に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、F5、および、PSCAである、方法。
(8)実施態様7に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10、および/もしくは、FKBP10をさらに含むか、または、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10、および/もしくは、FKBP10によって置き換えられる、方法。
(9)実施態様1に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、CDH17、CDX1、もしくは、FABP1である、方法。
(10)実施態様9に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、CDH17である、方法。
前記マーカー遺伝子は、CDX1、および/もしくは、FABP1をさらに含むか、または、CDX1、および/もしくは、FABP1によって置き換えられる、方法。
(12)実施態様1〜11のいずれかに記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号11〜58のうちの少なくとも1個の配列を用いて、評価される、方法。
(13)実施態様2に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、性特異的マーカーからさらに選ばれ、
前記性特異的マーカーは、
i.男性患者の場合、KLK3、KLK2、NGEP、もしくは、NPY;あるいは、
ii.女性患者の場合、PDEF、MGB、PIP、B305D、B726、もしくは、GABA−π;および/または、WT1、PAX8、STAR、もしくは、EMX2;
のうちの少なくとも1個から選ばれる、方法。
(14)実施態様13に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、KLK2である、方法。
(15)実施態様14に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、KLK3である、方法。
(16)実施態様15に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、NGEP、および/もしくは、NPYをさらに含むか、または、NGEP、および/もしくは、NPYによって置き換えられる、方法。
(17)実施態様13に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、PDEF、MGB、PIP、B305D、B726、もしくは、GABA−πである、方法。
(18)実施態様17に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、PDEF、および、MGBである、方法。
(19)実施態様18に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、PIP、B305D、B726、もしくは、GABA−πをさらに含むか、または、PIP、B305D、B726、もしくは、GABA−πによって置き換えられる、方法。
(20)実施態様13に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、WT1、PAX8、STAR、もしくは、EMX2である、方法。
前記マーカー遺伝子は、WT1である、方法。
(22)実施態様21に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、PAX8、STAR、もしくは、EMX2をさらに含むか、または、PAX8、STAR、もしくは、EMX2によって置き換えられる、方法。
(23)実施態様13〜22のいずれかに記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号11〜58のうちの少なくとも1個の配列を用いて、評価される、方法。
(24)実施態様1もしくは2に記載の方法において、
がんの原発巣を決定するために、転移部位を含む、更なる臨床情報をさらに得るステップ、
を含む、方法。
(25)がんに対する最適なバイオマーカー群を得る方法において、
原発巣がわかっている転移を用いるステップと、
前記転移に対するバイオマーカーを決定するステップと、
前記バイオマーカーを原発不明転移のバイオマーカーと比較するステップと、
を含む、方法。
(26)治療方針を提示する方法において、
実施態様1〜3のいずれかにしたがって、原発不明転移の原発巣を決定すること、および、前記原発巣に対して適切な治療法を特定することによって、治療方針を提示する、方法。
(27)予後診断を提示する方法において、
実施態様1〜3のいずれかにしたがって、原発不明転移の原発巣を決定すること、および、前記原発巣に対して対応する予後を特定することによって、予後診断を提示する、方法。
(28)バイオマーカーを発見する方法において、
特定の転移におけるマーカー遺伝子の発現量を決定することと、
前記マーカー遺伝子の発現を決定するために前記マーカー遺伝子に対するバイオマーカーを評価することと、
実施態様1にしたがって、前記マーカー遺伝子の前記発現を分析することと、
前記マーカー遺伝子が原発腫瘍に対して効果的に特異的であるかどうかを決定するステップと、
を含む、方法。
(29)組成物において、
配列番号11〜58から選ばれる、少なくとも1個の単離された配列を含む、組成物。
(30)実施態様1〜3のいずれかにしたがって解析を実施するためのキットにおいて、
バイオマーカー検出試薬、
を含む、キット。
実施態様1〜3のいずれかに記載の方法を実行するための、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ。
(32)診断上の/予後上のポートフォリオにおいて、
実施態様2〜11もしくは13〜22のいずれかにしたがった遺伝子の組み合わせに係る、単離された核酸配列、前記核酸配列の相補配列、もしくは、前記核酸配列の部分配列、
を含み、
前記遺伝子の組み合わせは、異なるがん由来の細胞、もしくは、正常組織由来の細胞と比較して、転移性細胞を有する生物学的サンプルにおける遺伝子発現を評価するために十分であるか、もしくは、前記遺伝子発現を特徴付けるために十分である、診断上の/予後上のポートフォリオ。
(33)実施態様2〜11もしくは13〜22のいずれかに記載の方法において、
前記サンプルにおいて構成的に発現する、少なくとも1個の遺伝子の発現を評価すること、
をさらに含む、方法。
Claims (33)
- 原発不明転移の原発巣を同定する方法において、
a.転移性細胞を含むサンプルを入手するステップと、
b.少なくとも2つの異なるがんに関連するバイオマーカーを評価するステップと、
c.前記バイオマーカーから得られたデータを組み合わせて、あるアルゴリズムにするステップであって、前記アルゴリズムは、
i.前記バイオマーカーを基準に対して標準化し、
ii.各々のバイオマーカーの感受性および特異性を最適化するカットオフを課し、前記がんに係る罹患率を加重し、原発巣組織を選択する、
ステップと、
d.前記アルゴリズムによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、前記がんが特定のがん群に由来しないことを決定するステップと、
e.任意に、1個以上の更なる、異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、前記更なるバイオマーカーに対してc)およびd)のステップを反復するステップと、
を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、
i.SP−B、TTF、DSG3、KRT6F、p73H、もしくは、SFTPC;
ii.F5、PSCA、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10、もしくは、FKBP10;または、
iii.CDH17、CDX1、もしくは、FABP1;
に対応する群のうち少なくとも1つから選ばれる、方法。 - 請求項2に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、SP−B、TTF、DSG3、KRT6F、p73H、もしくは、SFTPCである、方法。 - 請求項3に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、SP−B、TTF、および、DSG3である、方法。 - 請求項4に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、KRT6F、p73H、および/もしくは、SFTPCをさらに含むか、または、KRT6F、p73H、および/もしくは、SFTPCによって置き換えられる、方法。 - 請求項2に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、F5、PSCA、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10、もしくは、FKBP10である、方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、F5、および、PSCAである、方法。 - 請求項7に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10、および/もしくは、FKBP10をさらに含むか、または、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10、および/もしくは、FKBP10によって置き換えられる、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、CDH17、CDX1、もしくは、FABP1である、方法。 - 請求項9に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、CDH17である、方法。 - 請求項10に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、CDX1、および/もしくは、FABP1をさらに含むか、または、CDX1、および/もしくは、FABP1によって置き換えられる、方法。 - 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号11〜58のうちの少なくとも1個の配列を用いて、評価される、方法。 - 請求項2に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、性特異的マーカーからさらに選ばれ、
前記性特異的マーカーは、
i.男性患者の場合、KLK3、KLK2、NGEP、もしくは、NPY;あるいは、
ii.女性患者の場合、PDEF、MGB、PIP、B305D、B726、もしくは、GABA−π;および/または、WT1、PAX8、STAR、もしくは、EMX2;
のうちの少なくとも1個から選ばれる、方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、KLK2である、方法。 - 請求項14に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、KLK3である、方法。 - 請求項15に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、NGEP、および/もしくは、NPYをさらに含むか、または、NGEP、および/もしくは、NPYによって置き換えられる、方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、PDEF、MGB、PIP、B305D、B726、もしくは、GABA−πである、方法。 - 請求項17に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、PDEF、および、MGBである、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、PIP、B305D、B726、もしくは、GABA−πをさらに含むか、または、PIP、B305D、B726、もしくは、GABA−πによって置き換えられる、方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、WT1、PAX8、STAR、もしくは、EMX2である、方法。 - 請求項20に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、WT1である、方法。 - 請求項21に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、PAX8、STAR、もしくは、EMX2をさらに含むか、または、PAX8、STAR、もしくは、EMX2によって置き換えられる、方法。 - 請求項13〜22のいずれか1項に記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号11〜58のうちの少なくとも1個の配列を用いて、評価される、方法。 - 請求項1もしくは2に記載の方法において、
がんの原発巣を決定するために、転移部位を含む、更なる臨床情報をさらに得るステップ、
を含む、方法。 - がんに対する最適なバイオマーカー群を得る方法において、
原発巣がわかっている転移を用いるステップと、
前記転移に対するバイオマーカーを決定するステップと、
前記バイオマーカーを原発不明転移のバイオマーカーと比較するステップと、
を含む、方法。 - 治療方針を提示する方法において、
請求項1〜3のいずれか1項にしたがって、原発不明転移の原発巣を決定すること、および、前記原発巣に対して適切な治療法を特定することによって、治療方針を提示する、方法。 - 予後診断を提示する方法において、
請求項1〜3のいずれか1項にしたがって、原発不明転移の原発巣を決定すること、および、前記原発巣に対して対応する予後を特定することによって、予後診断を提示する、方法。 - バイオマーカーを発見する方法において、
特定の転移におけるマーカー遺伝子の発現量を決定することと、
前記マーカー遺伝子の発現を決定するために前記マーカー遺伝子に対するバイオマーカーを評価することと、
請求項1にしたがって、前記マーカー遺伝子の前記発現を分析することと、
前記マーカー遺伝子が原発腫瘍に対して効果的に特異的であるかどうかを決定することと、
を含む、方法。 - 組成物において、
配列番号11〜58から選ばれる、少なくとも1個の単離された配列を含む、組成物。 - 請求項1〜3のいずれか1項にしたがって解析を実施するためのキットにおいて、
バイオマーカー検出試薬、
を含む、キット。 - マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップにおいて、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法を実行するための、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ。 - 診断上の/予後上のポートフォリオにおいて、
請求項2〜11もしくは13〜22のいずれか1項にしたがった遺伝子の組み合わせに係る、単離された核酸配列、前記核酸配列の相補配列、もしくは、前記核酸配列の部分配列、
を含み、
前記遺伝子の組み合わせは、異なるがん由来の細胞、もしくは、正常組織由来の細胞と比較して、転移性細胞を有する生物学的サンプルにおける遺伝子発現を評価するために十分であるか、もしくは、前記遺伝子発現を特徴付けるために十分である、診断上の/予後上のポートフォリオ。 - 請求項2〜11もしくは13〜22のいずれか1項に記載の方法において、
前記サンプルにおいて構成的に発現する、少なくとも1個の遺伝子の発現を評価すること、
をさらに含む、方法。
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