CN1717413A - 新的pth应答基因 - Google Patents

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CN1717413A CNA2003801030625A CN200380103062A CN1717413A CN 1717413 A CN1717413 A CN 1717413A CN A2003801030625 A CNA2003801030625 A CN A2003801030625A CN 200380103062 A CN200380103062 A CN 200380103062A CN 1717413 A CN1717413 A CN 1717413A
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Abstract

本发明涉及新的PTH基因。本发明进一步涉及用于骨相关病症的筛选、诊断和疗法开发的方法。

Description

新的PTH应答基因
发明领域
本发明属于分子生物学领域。更具体地，本发明涉及用于骨相关病症的诊断、预后、预防、治疗和疗法评估的方法和组合物。
发明背景
动物，包括人和其他哺乳动物，会受到许多骨相关病症如骨质疏松症和Paget氏病的困扰。虽然骨相关病症的原因很不清楚，但可以确信的是可能在骨形成和骨吸收(骨分解)之间存在不平衡。例如，在患有骨质疏松状况的动物中，骨吸收超过了骨形成。骨形成和骨吸收的复杂过程可由两种细胞类型介导：成骨细胞，其参与骨形成，以及破骨细胞，其参与骨吸收。
试剂的施用将是用于骨相关病症治疗的一种有希望的治疗方法，该试剂设计用于以一定方式修饰骨形成速率和骨吸收速率之间的平衡，从而提高前者相对于后者的比率，导致没有净骨丢失。例如，骨丢失可通过抑制骨吸收(如，抑制破骨细胞的活性)或诱导骨形成(如，诱导成骨细胞的活性)而得以遏制。在此前出现的骨丢失恢复后，达到一种稳定的状态，其中骨产生速率和骨吸收速率相等。所述修饰可以通过刺激骨沉积的生理机制，即，骨形成，或通过延缓骨吸收的机制，或两者一起而实现。用于达到该目的的目前所用的或处于实验阶段的药物包括激素替补疗法，选择性雌激素受体调节剂(SERMs)(如，雷洛昔芬)，二膦酸盐(如，阿仑膦酸钠)以及降钙素。这些治疗法通过减少破骨细胞生成和降低破骨细胞活性而减少骨吸收(Canalis E，2000，J Clin Invest.，106(2)：pp 177-179)。虽然由此导致的骨吸收减少带来骨盐密度(BMD)的少量增高，但这些药物并没有增强骨基质沉积或骨量(Tashjian，A.H.，等，J.Bone Miner.Res.17：1151-1161.2002)。一种试剂，甲状旁腺激素(PTH)，每日施用一次能刺激骨基质形成(Cosman，F.等，Calcif.Tissue Int.62：475-480，1998，Neer，R.M.，等，N.Engl.J.Med.344：1434-1441，2001)。
PTH和其生物活性片段PTH 1-34从1930年起就已经被认为能发挥强的骨形成作用。在大量的临床研究表明PTH的骨形成活性主要在松质骨中而对密质骨只有很少的或没有影响后，在1970年代和1980年代对PTH的骨形成能力再次产生了兴趣(Bauer等，1929，J Exp Med，49：pp 145-162，Selye H，1932，Endocrinology，16：pp 547-558，Dempster等，1993，Endocrine Reviews，14(6)：pp 690-709，Bauer等，1929，J Exp Med，49：pp 145-162；Selye H，1932，Endocrinology，16：pp 547-558)。更多最新的工作表明通过PTH的骨形成的增强不仅增加骨量而且还改善骨结构和骨生物力学特性(Brommage，R.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.84：3757：3763，1999.，Sato，M.等，Osteoporos.Int.11：871-880，2000.，Burr，D.B.，等，J.Bone Miner.Res.16：157-165，2001.，Jerome，C.P.，等，Bone 28：150-159，2001)。虽然PTH具有这些合成代谢(骨形成)特性，但其作用仍是复杂的，因为在某些治疗方案中其具有分解代谢(骨降解)活性(Dempster，D.W.等，Endocrine Reviews，14：690-709，1993)。
存在重要的需求以鉴定新的基因及其蛋白产物，来用于阐明骨调节或骨形成分子机制、用于新药物的筛选和开发、用于骨发育和骨丢失病症的诊断、预后、预防和治疗，以及骨相关病症如骨质疏松症疗法的评估。此外，当前还存在对骨相关病症模型的工业需求，包括动物模型，以使得能够筛选和鉴定用于这些疾病治疗的化合物。本发明克服了这些问题且提供了所需的工具。
发明概述
本发明提供由PTH的合成代谢活性调节的新的PTH应答基因(PAIGB)和其变体。本发明进一步提供了编码PAIGB蛋白或其片段的分离的核酸片段。
本发明涉及编码PAIGB多肽的分离的核酸片段，其选自：(a)编码SEQ ID NO：2、4、6、8和10的分离的核酸片段，(b)编码与SEQ ID NO：2、4、6、8和10具有至少85％同一性的氨基酸序列的分离的核酸片段，(c)能与(a)的分离的核酸片段在6×SSC(1M NaCl)，45至50％甲酰胺，1％SDS中37℃的杂交条件，以及在0.5×至1×SSC中55至60℃的洗涤条件下杂交的分离的核酸分子；和(d)与(a)、(b)或(c)互补的分离的核酸片段。核酸分子及相应的多肽片段包含在附随的序列表中且在发明的简述中得以描述。
在另一实施方案中，本发明提供PAIGB多肽。
在另一实施方案中，本发明涉及编码PAIGB多肽的嵌合构建体。
在另外的实施方案中，本发明涉及包含编码PAIGB多肽的嵌合构建体的宿主细胞。
在另外的实施方案中，本发明提供获得编码PAIGB多肽的核酸片段的方法，包括：(a)用SEQ ID NO：3中所列核酸片段的全部或部分探测基因组文库；(b)鉴定与步骤(a)的核酸片段杂交的DNA克隆；以及确定包含步骤(b)中鉴定的DNA克隆的核酸片段的序列。
在另一实施方案中，本发明提供获得PAIGB多肽的方法。
在另一实施方案中，本发明提供用于在哺乳动物中调节骨形成活性的组合物，该组合物包含以下三者中的至少一个(i)PAIGB核酸片段，(ii)PAIGB多肽，或(iii)由所述多肽或其部分形成的抗体。
在另一实施方案中，本发明提供改变PAIGB基因或多肽表达的试剂。
在另一实施方案中，本发明提供确定试剂是否改变PAIGB mRNA表达的方法，该方法包括：a)测量存在于不与试剂接触的试样中PAIGB mRNA的水平；b)测量存在于与试剂接触的试样中PAIGB mRNA的水平；和c)当步骤a)中测量的PAIGB mRNA水平与步骤b)中测量的PAIGB mRNA水平不同时，确定该试剂改变PAIGB mRNA的表达。
在另一实施方案中，本发明提供筛选用于有效改变PAIGB核酸片段表达的试剂的方法，该方法包括：a)将包含PAIGB核酸片段的试样与试剂在适合PAIGB核酸片段表达的条件下接触，b)检测改变的PAIGB核酸片段的表达，和c)在各种量的试剂存在时以及不存在该化合物时比较PAIGB核酸片段的表达。
在另一实施方案中，本发明提供筛选用于治疗骨相关病症的试剂的方法，包括a)将试剂与经遗传工程改造可表达PAIGB基因的培养的宿主细胞接触和，b)检测在PAIGB基因、PAIGB mRNA或PAIGB多肽表达水平中的变化。
在另一实施方案中，本发明提供在受试者中评估骨相关病症的治疗功效的方法，包括：用给定的方案治疗受试者；评定PAIGB核酸片段或PAIGB多肽的表达水平，其中相对于治疗前的水平，治疗后PAIGB核酸片段或PAIGB多肽表达水平的变化指示了骨病症治疗的功效。
在另一实施方案中，本发明提供鉴定能结合PAIGB的多肽的方法，包括应用哺乳动物双杂交方法，其中编码所述PAIGB的序列由一个杂交载体携带，来自cDNA或基因组DNA文库的序列由第二杂交载体携带，随后载体用于转化宿主细胞，并且分离阳性转化细胞，接着提取所述的第二杂交载体以获得编码结合所述PAIGB的多肽的序列。
在另一实施方案中，本发明提供使用骨相关试剂监控治疗受试者的有效性，包括步骤(a)从施用试剂前的受试者中获得施用前的样品；(b)检测施用前的样品中PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平；(c)从受试者获得一个或多个施用后的样品；(d)检测施用后的样品中PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性；(e)比较施用前的样品中PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性与施用后的样品中PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性；和(f)相应地改变对受试者施用试剂。
在另一实施方案中，本发明提供含有本发明的PAIGB DNA的转基因动物。
在另一实施方案中，本发明提供转基因动物，其中所述动物为“基因敲除(knock-out)”动物，其动物PAIGB基因之一的一个或两个拷贝已经通过同源重组或基因寻靶被部分或完全地缺失，或已经通过外源序列的同源重组或基因寻靶的插入或取代而失活。
在另一实施方案中，本发明提供利用本发明的动物模型研究骨量决定因素，骨量的调节和/或PAIGB对骨病症的作用的方法。
附图简述和序列说明
本发明可从下列详细的描述和构成本申请一部分的附图和序列表得以更充分地理解。
图1显示通过PTH的间歇注射，胫骨中PTH 1-34对总BMD的作用(参见实施例1)。
图2A显示使用由间歇和连续施用PTH 1-34获得的大鼠胫骨RNA的RADE实验对PAIGB的鉴定(参见实施例2)。
图2B显示通过受间歇施用PTH 1-34调节的PAIGB的RNA印迹证明(参见实施例2和7)。
图3显示包括5’UTR直至终止密码子的人，小鼠和大鼠序列的PAIGBcDNA比对(参见实施例5)。
图4显示大鼠，小鼠和人PAIGB的蛋白比对(参见实施例5)。
图5显示证明PAIGB表达模式的小鼠多组织RNA印迹(参见实施例7)。
图6显示使用人Origene cDNA实验组的PAIGB全长和剪接变体的表达模式(参见实施例7)。
图7显示使用小鼠Origene cDNA实验组的PAIGB全长和剪接变体的表达模式(参见实施例7)。
图8显示非骨组织中PTH 1-34对PAIGB表达的调控的缺乏(参见实施例8)。
图9显示通过原位杂交分析得到的小鼠颅盖中PTH 1-34对PAIGB表达的诱导(参见实施例9)。
图10A显示在间歇的PTH 1-34处理过程中大鼠胫骨中PAIGB表达的时程(参见实施例10)。
图10B显示大鼠胫骨中通过皮下(sc)施用PTH 1-34的PAIGB表达调控是剂量依赖型的(参见实施例10)。
图11A显示ROS 17/2.8成骨细胞中PTH 1-34对PAIGB表达的调控是剂量依赖型的(参见实施例12)。
图11B显示ROS 17/2.8成骨细胞中PTH 1-34对PAIGB的诱导的时程(参见实施例12)。
图12显示蛋白激酶C(PKC)途径不参与PTH 1-34对PAIGB的调控(参见实施例13)。
图13显示ROS 17/2.8细胞中PTH 1-34通过腺苷酸环化酶和cAMP信号传导对PAIGB表达发挥作用(参见实施例13)。
图14显示ROS 17/2.8细胞中其他骨相关试剂对PAIGB表达的作用(参见实施例14)。
图15显示UMR106细胞中其他骨相关试剂对PAIGB表达的作用(参见实施例14)。
图16A显示通过RT-PCR得到的人U2OS和大鼠UMR成骨细胞中PTH1-34对PAIGB表达的诱导(参见实施例15)。
图16B显示通过TaqMan分析得到的人U2OS成骨细胞中PTH 1-34对PAIGB表达的诱导(参见实施例15)。
图17显示人U2OS成骨细胞中PAIGB的蛋白表达(参见实施例17)。
图18显示PAIGB兔多克隆抗体检测U2OS细胞中表达的PAIGB蛋白的能力(参见实施例17)。
图19显示使用PAIGB多克隆抗体通过免疫组织化学分析检测U2OS细胞中PAIGB蛋白表达的能力(参见实施例18)。
图20显示PTH 1-34处理的小鼠颅盖骨外膜和骨内膜中PAIGB蛋白的诱导(参见实施例19)。
图21显示来自PTH 1-34处理的小鼠颅盖的骨外膜成骨细胞中PAIGB蛋白的诱导(参见实施例19)。
图22显示来自PTH 1-34处理的小鼠颅盖的骨内膜成骨细胞中PAIGB蛋白的诱导(参见实施例19)。
图23通过实时RT-PCR的确定，证实来自系2和系54的杂合的PAIGB转基因小鼠相对于非转基因小鼠在胫骨中超表达PAIGB mRNA(参见实施例22)。
图24证实PAIGB杂合系2小鼠相对于非转基因小鼠在颅盖骨外膜成骨细胞中超表达PAIGB蛋白(参见实施例22)。
图25证实PAIGB杂合系2小鼠相对于非转基因小鼠在颅盖矢状缝区域成骨细胞中超表达PAIGB蛋白(参见实施例22)。
图26证实PAIGB杂合系2小鼠相对于非转基因小鼠在颅盖骨外膜和骨内膜中碱性磷酸酶活性增强。该图进一步显示相对于非转基因小鼠在杂合体中颅盖厚度增加(参见实施例22)。
图27证实PAIGB杂合系54小鼠相对于非转基因小鼠在颅盖骨外膜和骨内膜中碱性磷酸酶活性增强。该图进一步显示相对于非转基因小鼠在杂合体中颅盖厚度增加(参见实施例22)。
下列63条序列描述和附加在此的序列表符合在37 C.F.R.§1.821-1.825.(″Requirements for Patent Applications containing nucleotide sequences and/or AminoAcid Sequence Disclosure-the Sequence Rules″)中所列的在专利申请中指导核苷酸和/或氨基酸序列公开内容的规则且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求一致(Administrative Instructions中的Rules 5.2和49.5(a-bis)和Section 208以及Annex C)。根据在此引入作为参考的Nucleic Acid Res.13：3021-3030(1985)和Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中所描述的IUPAC-IUBMB的标准，上述序列描述中含有用于核苷酸序列符号的单字母密码和用于氨基酸序列的三字母密码。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37 C.F.R.§1.822的规则。
SEQ ID NO：1为大鼠PAIGB基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2为大鼠PAIGB基因编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3为人PAIGB基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4为人PAIGB基因编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5为人PAIGB外显子2剪接变体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6为人PAIGB外显子2剪接变体编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7为小鼠PAIGB基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8为小鼠PAIGB基因编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9为小鼠PAIGB外显子2剪接变体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10为小鼠PAIGB外显子2剪接变体编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11为用于免疫动物进行多克隆抗体生产的PAIGB氨基酸肽序列。
SEQ ID NO：12为用于免疫动物进行多克隆抗体生产的PAIGB氨基酸肽序列。
SEQ ID NO：13为用于免疫动物进行多克隆抗体生产的PAIGB氨基酸肽序列。
SEQ ID NO：14为用于免疫动物进行多克隆抗体生产的PAIGB氨基酸肽序列。
SEQ ID NO：15为用于筛选BAC克隆的小鼠核苷酸序列。
SEQ ID NO：16为大鼠PAIGB TaqMan探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO：17为用于TaqMan分析中的正向引物的大鼠PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：18为用于TaqMan分析中的反向引物的大鼠PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：19为用于TaqMan分析中的正向引物的小鼠PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：20为用于TaqMan分析中的反向引物的小鼠PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：21为用于TaqMan分析中的探针5’6FAM的小鼠PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：22为用于TaqMan分析中的正向引物的人PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：23为用于TaqMan分析中的反向引物的人PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：24为用于TaqMan分析中的探针5’6FAM的人PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：25为用于5’RACE的衔接引物AP1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：26为用于5’RACE的PAIGB核苷酸序列的基因特异性引物(GSP1)。
SEQ ID NO：27为用于5’RACE的PAIGB核苷酸序列的基因特异性引物(GSP2)。
SEQ ID NO：28为用于5’RACE的PAIGB核苷酸序列的基因特异性引物(GSP3)。
SEQ ID NO：29为用作正向RT-PCR引物以克隆小鼠PAIGB同系物的小鼠PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：30为用作反向RT-PCR引物以克隆小鼠PAIGB同系物的小鼠PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：31为用于克隆小鼠PAIGB的正向RT-PCR引物的PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：32为用于克隆小鼠PAIGB的RT-PCR反向引物的PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：33为人PAIGB的1,086bp核苷酸序列。
SEQ ID NO：34为用于PCR中克隆外显子剪接变体的PAIGB人正向引物。
SEQ ID NO：35为用于PCR中克隆外显子剪接变体的PAIGB人反向引物。
SEQ ID NO：36为用于Origene cDNA表达实验组的PCR中的PAIGB人正向引物。
SEQ ID NO：37为用于Origene cDNA表达实验组的PCR中的PAIGB人反向引物。
SEQ ID NO：38为在Origene cDNA表达实验组的PCR中用作正向引物的小鼠PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：39为在Origene cDNA表达实验组的PCR中用作反向引物的小鼠PAIGB核苷酸序列。
SEQ ID NO：40为用于产生原位RNA探针(riboprobe)的小鼠PAIGB克隆的核苷酸序列。
SEQ ID NO：41为用于RT-PCR的人PAIGB外显子2正向引物。
SEQ ID NO：42为用于RT-PCR的人PAIGB外显子2反向引物。
SEQ ID NO：43为用于RT-PCR的大鼠PAIGB外显子2正向引物。
SEQ ID NO：44为用于RT-PCR的大鼠PAIGB外显子2反向引物。
SEQ ID NO：45为用于TaqMan以评估转基因动物中PAIGB转基因表达的大鼠PAIGB外显子2正向引物。
SEQ ID NO：46为用于TaqMan以评估转基因动物中PAIGB转基因表达的大鼠PAIGB外显子2反向引物。
SEQ ID NO：47为用于TaqMan以评估转基因动物中PAIGB转基因表达的大鼠PAIGB探针。
SEQ ID NO：48为大鼠PAIGB siRNA有义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：49为针对SEQ ID NO：48的大鼠PAIGB siRNA反义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：50为大鼠PAIGB siRNA有义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：51为针对SEQ ID NO：50的大鼠PAIGB siRNA反义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：52为大鼠PAIGB siRNA有义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：53为针对SEQ ID NO：52的大鼠PAIGB siRNA反义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：54为大鼠PAIGB siRNA有义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：55为针对SEQ ID NO：54的大鼠PAIGB siRNA反义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：56为人PAIGB siRNA有义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：57为针对SEQ ID NO：56的人PAIGB siRNA反义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：58为人PAIGB siRNA有义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：59为针对SEQ ID NO：58的人PAIGB siRNA反义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：60为人PAIGB siRNA有义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：61为针对SEQ ID NO：60的人PAIGB siRNA反义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：62为人PAIGB siRNA有义链寡核苷酸。
SEQ ID NO：63为针对SEQ ID NO：62的人PAIGB siRNA反义链寡核苷酸。
发明详述
申请人成功地鉴定和表征了通过PTH的合成代谢活性调控的新的PTH应答基因及其变体。该新鉴定的基因称作骨中PTH合成代谢诱导的基因(PAIGB)。PAIGB基因基于人PTH的片段1-34间歇施用于大鼠时引起的PAIGB的表达以及用本领域熟知的算法将核苷酸序列与公开的NCBI数据库(GeneBank)进行比较而得到鉴定。
在一实施方案中，申请人提供证据表明PAIGB由PTH的合成代谢活性调控且应该代表介导合成代谢PTH活性的分子。当以间歇的方式施用PTH时骨中PAIGB的表达显著增强，而连续施用PTH并不诱导该新基因表达水平的任何变化。
在另一实施方案中，当通过TaqMan分析测量时正常未处理或未患病骨中PAIGB的表达非常低或检测不到。然而，在间歇PTH处理后，PAIGB的mRNA水平以剂量和时间依赖型方式得到显著诱导。此外，PTH的连续施用没有产生PAIGB表达的诱导。间歇PTH处理期间PAIGB增强的表达反应了由PTH处理诱导的增强的骨形成。本发明进一步描述了在PTH以一定方式处理以诱导骨形成时表达的基因的鉴定和参与该基因调控的信号传导事件。
在另一实施方案中，本发明新的PTH应答基因，PAIGB，以有限的方式在脑中高水平表达，而在肾和肺中低水平表达。间歇方式施用的PTH在肾、心脏和脑中没有诱导PAIGB信息的任何变化，该数据表明PTH诱导的PAIGB表达特异于骨组织。有趣的是，随着间歇施用PTH，骨中PAIGB的表达与BMD(骨盐密度)中的变化相关。PAIGB表达水平以及尤其在骨外膜中成骨细胞特异性的表达清楚地表明PAIGB的确切作用。
在另一实施方案中，PAIGB表达的PTH诱导是PTH受体特异性的。而且，PTH对PAIGB表达的作用通过cAMP累积以及随后的PKA活化介导；因此再一次证实PAIGB参与PTH骨形成活性中的分子机制。
在另一实施方案中，用各种技术如蛋白印迹、免疫组织化学法、免疫荧光显微术和流式细胞术检测PAIGB多肽的表达。
本发明涉及具有改变的PAIGB基因的遗传修饰的动物。这些动物是与骨疾病相关的PAIGB改变表达的模型，呈现以骨合成代谢功能为特征的主要表型，且可用于鉴定用于人类疾病治疗的化合物。因此，本发明还涉及用动物鉴定对骨相关病症治疗有效的化合物的方法以及化合物本身。
缩写和术语的定义：
提供下列定义用于充分理解本说明书中所用的术语和缩写。
如此处及附随的权利要求中使用的，除非上下文明确指明，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复数形式。因此，例如，“一个宿主细胞”的提法包括多个所述宿主细胞，“一个抗体”的提法指一个或多个抗体及本领域技术人员所知的其等价物，等等。
说明书中的缩写与下列测量单位、技术、特性或化合物相对应：“Sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“kg”表示千克，“g”表示克，“mg”表示毫克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“kDa”表示千道尔顿，“℃”表示摄氏度，“cm”表示厘米，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“pL”表示皮升，“mM”表示毫摩尔的，“M”表示摩尔的，“mmole”表示毫摩尔，“kb”表示千碱基对，“bp”表示碱基对，“RT”表示室温，“nm”表示纳米，“SEM”表示平均值的标准误，“Δ”表示变化，“ct”表示阈值周期，以及“IU”表示国际单位。
“高效液相色谱法”缩写为HPLC。
“差异表达基因的快速扩增”缩写为RADE。
“高通量筛选”缩写为HTS。
“聚丙烯酰胺凝胶电泳”缩写为PAGE。
“聚合酶链反应”缩写为PCR。
“逆转录酶聚合酶链反应”缩写为RT-PCR。
“酶联免疫吸附测定”缩写为ELISA。
“放射免疫测定”缩写为RIA。
“质谱法”缩写为MS。
“串联质谱法”缩写为MS/MS。
SQ 22536腺苷酸环化酶抑制剂缩写为SQInh。
液相色谱缩写为LC。
液相色谱串联质谱缩写为LC-MS-MS。
“十二烷基硫酸钠”缩写为SDS。
“Tris缓冲盐水Tween 20”缩写为TBST。
“Tris缓冲盐水”缩写为TBS。
“十二烷基硫酸钠”缩写为SDS。
“甘油醛-3-磷酸脱氢酶”缩写为GAPDH。
“非翻译区”缩写为UTR。
“可读框”缩写为ORF。
“甲状旁腺激素”缩写为PTH。
“骨中PTH合成代谢诱导的基因”缩写为PAIGB。
“骨盐密度”缩写为BMD。
“基因特异性引物”缩写为GSP。
“皮下的”缩写为sc或s.c.。
“前列腺素E2”缩写为PGE2。
“非转基因的”缩写为NTG。
“杂合的”缩写为HET。
在公开内容的上下文中，将使用大量术语。如此处使用的，术语“核酸分子”指核糖核苷酸(RNA分子)或脱氧核糖核苷酸(DNA分子)的磷酸酯形式，或任何磷酸酯类似物，其为单链形式，或双链螺旋。也可能是双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。术语核酸分子，尤其是DNA或RNA分子，指分子的一级和二级结构，而不限于任何特定的三级结构。因此，该术语包括了其中在线性(如，限制性内切酶酶切片段)或环状DNA分子，质粒和染色体中发现的双链DNA。在特定双链DNA分子结构讨论中，序列将按照正常惯例描述，仅沿着非转录DNA链在5’至3’方向给出序列(即，该链具有与mRNA同源的序列)。
“重组核酸分子”为经过分子生物学操作的核酸分子，即，非天然存在的核酸分子。此外，术语“重组DNA分子”指非天然存在的，或可通过两个不同地分离的序列片段人工组合制备的核酸序列，即，通过将通常不邻接的DNA片段连接在一起。“重组生产的”表示常通过化学合成方法，或通过分离的核酸片段的人工操作，如通过使用限制酶，连接酶的遗传工程技术，以及由，例如，Sambrook等(Molecular Cloning，second edition，Cold SpringHarbor Laboratory，Plainview，N.Y.；(1989))，Ausubel等Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols(1989)，以及DNA Cloning：A PracticalApproach，Volumes I and II(ed.D.N.Glover)IREL Press，Oxford，1985描述的类似的重组技术而实现的人工组合。通常用编码同样的或保守氨基酸的冗余密码子替代密码子，而一般引入或去除序列识别位点。或者，可将有所需功能的核酸片段连接在一起以产生一个单遗传实体，其包括所需的在普通天然形式中未发现的功能的组合。限制酶识别位点常是所述人工操作的靶，但其他位点特异的靶，如，启动子、DNA复制位点、调控序列、控制序列，或其他有用的特征可通过设计而整合在一起。重组核酸分子的实例包括重组载体，如包含编码phl基因蛋白的DNA序列的克隆或表达载体，该DNA序列为5’至3’方向(有义)或3’至5’方向(反义)。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、核酸、核酸分子、核酸序列、寡核苷酸，或其任何片段，指DNA和RNA中核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)系列，且表示任意的两个或多个核苷酸的链。核苷酸序列通常携带遗传信息，包括细胞机器用于生产蛋白和酶的信息。这些术语包括双链或单链基因组的以及cDNA、RNA、任何合成的和经遗传操作的多核苷酸，和有义和反义多核苷酸。这包括了单-或双链分子，即，DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA杂交体，以及通过将碱基与氨基酸主链缀合形成的“蛋白核酸”(PNA)。还包括了包含修饰过的碱基，例如硫尿嘧啶、硫代-鸟嘌呤和氟尿嘧啶，或包含碳水化合物，或脂类的核酸。
特定多核苷酸的“反义”拷贝指能以氢键与多核苷酸结合的互补序列，且因而能调节多核苷酸的表达。这些为DNA、RNA或其类似物，包括如前文所述的主链改变的类似物。反义拷贝结合的多核苷酸可以是单链形式或双链形式。以“反义方向”与启动子连接的DNA序列可以以一定方式与启动子连接以产生与靶基因的编码mRNA互补的RNA分子。
术语“有义”指与编码mRNA核酸序列同向的核酸序列。连接以“有义方向”与启动子连接的DNA序列，以使包含与mRNA相同序列的RNA分子得到转录。但产生的RNA分子不需要转录为功能蛋白。
“RNA转录物”是指RNA聚合酶催化DNA序列转录的产物。当RNA转录物与DNA序列完全互补时它被称为初级转录物，或者它可以是初级转录物转录后加工而来的RNA序列，并被称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”是指无内含子的RNA，其可以在细胞内翻译成多肽。“cDNA”是指和mRNA模板互补并且来源于mRNA模板的DNA。cDNA可以是单链，或用如DNA聚合酶I的克列诺(Klenow)片段可转化为双链形式。“有义RNA”指RNA转录物，其包括mRNA且可以在细胞内翻译成多肽。“反义RNA”是指RNA转录物，它可以和全部或部分靶初级转录物或mRNA互补，并阻断靶基因的表达(美国专利5,107,065，在此引用作为参考)。反义RNA的互补性可以针对特定核苷酸序列的任一部分，即5’-非编码区、3’-非编码区、内含子或编码序列。“功能RNA”是指有义RNA、反义RNA、核酶RNA或其他不被翻译但在细胞加工中有作用的RNA。
“有义”链和“反义”链在用于相同上下文中时指相互互补的单链PAIGB多核苷酸。其可以是双链多核苷酸的相反链，或者一条链可以按照普遍公认的碱基配对原则从另一链预测出来。除非另有指定或暗示，可随意将一条链或另一条链指定为“有义”链或“反义”链。
“siRNA”指小干扰RNA，其能够引起干扰以及能在细胞中，例如，哺乳动物细胞(包括人细胞)和体内，例如，哺乳动物体(包括人)内引起特定基因的转录后沉默。RNA干扰现象在Bass，Nature 411：428-29(2001)；Elbahir等.，Nature 411：494-98(2001)；和Fire等.，Nature 391：806-11(1998)中描述和讨论，其中还讨论了制备干扰RNA的方法。“siRNA”或“RNAi”形成双链RNA，当siRNA在与基因或靶基因所在细胞相同的细胞中表达时，该双链RNA能减少或抑制基因或靶基因的表达。“siRNA”由此指由互补链形成的双链RNA。杂交以形成双链分子的siRNA的互补部分通常基本上或完全相同。在一个实施方案中，siRNA指与靶基因基本上或完全相同且形成双链siRNA的核酸。siRNA的序列可以对应于全长靶基因或其亚序列。
多核苷酸可以侧接天然调控(表达控制)序列，或与异源序列相连接，包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他核糖体结合位点序列、增强子、反应元件、抑制因子、信号序列、多腺苷酸化序列、内含子、5’和3’非编码区，等等。也可通过现有技术已知的多种方法修饰核酸。该修饰的非限制性实例包括甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然核苷酸，以及例如用不带电荷的键(如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和用带电荷的键(如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)进行核苷酸间修饰。多核苷酸可含有一个或多个另外的共价连接部分，例如蛋白(如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、嵌入剂(如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(如，金属、放射性金属、铁、氧化金属等)，以及烷基化剂。通过形成甲基或乙基磷酸三酯键或烷基氨基磷酸酯键而衍生核酸。此外，可用能够提供可检测信号的标记直接或间接修饰本发明的多核苷酸。示例性标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。
术语“核酸”或“核酸序列”、“核酸分子”、“核酸片段”或“多核苷酸”可以和基因、由基因编码的mRNA和cDNA互换使用。
术语“编码多肽的多核苷酸”包含仅包括编码序列的多核苷酸以及包括附加的编码或非编码序列的多核苷酸。
当核酸分子的单链形式能与另外的核酸分子在合适的温度和溶液离子强度条件下退火时，该核酸分子就与另一个核酸分子，如cDNA，基因组DNA或RNA是“可杂交的”(Sambrook，J.等eds.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.Vols.1-3(ISBN 0-87969-309-6)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格性”。为初步筛选同源核酸，可使用相应于55℃ Tm的低严格性杂交条件，例如，5×SSC，0.1％SDS，0.25％乳以及无甲酰胺；或30％甲酰胺，5×SSC，0.5％SDS)。中等严格性杂交条件对应于更高的Tm，例如，40％甲酰胺，5×或6×SCC。高严格性杂交条件对应于最高的Tm，例如，50％甲酰胺，5×或6×SCC。杂交需要两条核酸包含互补序列，虽然依赖于杂交严格性，但碱基间还可能有错配。核酸杂交的合适严格性依赖于核酸长度和互补程度，这是本领域众所周知的变量。两核苷酸序列间相似性或同源性程度越高，具有所述序列的核酸的杂交的Tm值就越高。核酸杂交的相对稳定性(相应于更高的Tm)以下列顺序降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。对于超过100个核苷酸长度的杂交体，得到了用于计算Tm的方程式(Sambrook等.eds.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.Vols.1-3.(ISBN 0-87969-309-6)，9.50-9.51)。为和更短核酸，即寡核苷酸杂交，错配的位置变得非常重要，且寡核苷酸的长度决定了其特异性(Sambrook等.eds.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.Vols.1-3.(ISBN 087969-309-6)，11.7-11.8)。
术语“互补”用于描述能互相杂交的核苷酸碱基间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
“同一性”或“相似性”，在本领域中已知是由序列比较所确定的两个或多个多肽序列间或两个或多个多核苷酸序列间的关系。本领域中，根据具体情况而定，同一性也表示通过这些序列链之间的匹配确定的多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度。同一性和相似性可以通过已知方法方便地计算，如以下描述的方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Computer Analysis ofSequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，NewJersey，1994；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，MStockton Press，New York，1991。常用于确定序列间同一性或相似性的方法包括但不限于Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J Applied Math.，48：1073(1988)中描述的方法。确定同一性和相似性的方法已编成可公开获得的计算机程序。确定两序列间同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包(Devereux，J.，等，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Atschul，S.F.等，J Molec.Biol.215：403(1990))。
“同源的”指两聚合物(即多肽分子或核酸分子)间序列相似性程度。此处提及的同源性百分数反映了两聚合物间最大可能的同源性，即，当两聚合物进行比较以获得匹配(同源的)位置的最大数值时的百分比同源性。
术语“百分比同源性”指多肽间氨基酸序列同一性的程度。任何两个多肽间的同源性是每个序列中给定位置上所匹配氨基酸总数的直接函数，如，如果每个序列中氨基酸总数的一半都相同就说这两个序列具有50％同源性。
涉及本发明多肽时(如，SEQ ID NO：2、4、6、8、10)，术语“片段”、“类似物”和“衍生物”指保留与所述多肽基本相同的生物学功能或活性的多肽。因而，类似物包括前体蛋白，其可通过前体蛋白部分的切割而激活以产生活性成熟多肽。本发明多肽(如，SEQ ID NO：2、4、6、8、10)的片段、类似物或衍生物可以是这样一种多肽，其中一个或多个氨基酸被保守的或非保守的氨基酸残基取代，而所述的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或者是这样一种多肽，其中一个或多个氨基酸残基包括取代基，或者是这样一种多肽，其中多肽与化合物如聚乙二醇融合以提高多肽的半衰期，或者是这样一种多肽，其中额外的氨基酸与多肽如信号肽或序列如多组氨酸标签融合，该多肽或序列用于多肽或前体蛋白的纯化。所述片段、类似物或衍生物被认为包括在本发明范围内。
多核苷酸序列的“保守”残基是在进行比较的两个或更多个相关序列的相同位置未发生改变的残基。相对保守的残基是在更相关序列中比序列中其它位置出现的残基更保守的残基。
相关多核苷酸是具有较大比例的相同残基的多核苷酸。
如果一个多核苷酸从根本上讲来源于另一个多核苷酸，那么这两个不同的多核苷酸互相“对应”。例如，信使RNA对应于其被转录的基因。cDNA对应于产生它的RNA，例如通过逆转录反应，或通过基于RNA序列信息的DNA生物合成产生。cDNA还对应于编码所述RNA的基因。如果多核苷酸在所对比的不同的物种、品系或变体中具有相似的功能，诸如编码相关多肽，那么所述多核苷酸也互相“对应”。
优选以分离的形式提供本发明的多肽和多核苷酸，且可通过本领域熟知的方法纯化至均一。
术语“分离的”表示材料从其本来的或天然的环境中(如，天然存在的自然环境)取出。因此，活体动物中天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但同样的多核苷酸和多肽，通过人为干预从天然系统中某些或全部共存材料中分离的，称为分离的。例如，“分离的核酸片段”为RNA或DNA的聚合物，它们是单链的或双链的，任选地含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成的DNA的一个或多个的片段组成，且可与碳水化合物、脂类、蛋白或其他材料结合。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且如果这种载体或组合物不是其天然环境的一部分，则其还是分离的。同样地，术语“基本纯化的”指通过人为干预，已从在自然界存在的直接化学环境中分离或另外取出的物质。基本纯化的多肽或核酸可通过本领域中通常所知的许多技术和方法获得或产生。
术语“基本纯的”和“分离的”并不排除多核苷酸和多肽与自然界中和多核苷酸或多肽不相关的物质的混合物。
“编码序列”或“编码”表达产物如RNA、多肽、蛋白或酶的序列，是核苷酸序列，当其表达时，生成RNA、多肽、蛋白或酶，即，该核苷酸序列编码所述多肽、蛋白或酶的氨基酸序列。
“密码子简并性”指遗传密码中的趋异，其允许改变多核苷酸序列而不影响编码的多肽的氨基酸序列。由此，本发明涉及编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10中所述PAIGB蛋白的氨基酸序列的全部或主要部分的任何核酸片段。本领域技术人员熟知由特定宿主细胞表现出的“密码子-偏倚”而使用核苷酸密码子来指定给定的氨基酸。因此，当合成用于提高宿主细胞中表达的基因时，就希望设计基因以使得其密码子使用频率达到宿主细胞优选密码子的使用频率。
氨基酸或核酸序列的“主要部分”包括足够的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列以提供该多肽或基因的推定性鉴定，这可以通过本领域技术人员进行的序列手工评价或借助算法如BLAST进行计算机自动序列比较和鉴定来实现(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，等，(1993)J.Mol.Biol.215：403-410；也可参见www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTO)。
因此，核苷酸序列的“主要部分”包括足够的序列来特异性鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了部分或完整的编码一个或多个特定PAIGB变体的氨基酸和核苷酸序列。本领域技术人员，利用在此处报道的序列，可将公开序列的所有或主要部分用于本领域技术人员所知的目的。因此，本发明包括附随的序列表中报道的完整序列，以及如前所定义的那些序列的主要部分。
“合成的基因”可从寡核苷酸结构单元装配，其使用本领域技术人员已知的方法进行化学合成。这些结构单元连接和退火以形成基因片段，随后经酶催化装配以构建完整基因。“化学合成”，当涉及DNA序列时，表示在体外装配核苷酸组分。可使用熟知的方法完成DNA的人工化学合成，或使用多种商业化机器中的一种进行自动化学合成。由此，在反映宿主细胞密码子偏倚的核苷酸序列最优化的基础上可裁剪基因以用于最佳的基因表达。如果密码子选择偏向于那些宿主偏爱的密码子，则技术人员能知晓基因成功表达的可能性。可在源于宿主细胞的基因调查的基础上确定优选的密码子，其中序列信息是可得的。
“基因”指可表达为一个特定蛋白的核酸片段，包括位于编码序列之前(5’非编码序列)及之后(3’-非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指在自然界发现的具有自身的调控序列的基因。“嵌合基因”或“嵌合构建体”是指任何基因或构建体，非天然基因，包括天然状态时不在一起的调控及编码序列。因此，嵌合基因或嵌合构建体包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或同一来源的但与天然状态排列的方式不同的调控序列及编码序列。“内源基因”指在有机体的基因组中位于其天然位置的天然基因。“外源”基因是指在宿主有机体中通常找不到的，但通过基因转移导入宿主有机体中的基因。外源基因包括插入非天然有机体的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是指通过转化方法导入基因组的基因。
“调控序列”指位于编码序列上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’-非编码序列)的核苷酸序列，其影响转录、RNA加工或稳定性，或相关编码序列的翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“基因控制序列”指用于起始基因转录以及调节转录起始速率的DNA序列。因此基因控制序列可由启动子和所有调节序列组成，其中普通转录因子和聚合酶在启动子处结合，基因调节蛋白与调节序列结合以控制它们在启动子处的结合过程的速率。例如，适于原核生物的控制序列可包括启动子，任选的操纵序列，以及核糖体结合位点。真核细胞可利用启动子、增强子和/或多腺苷酸化信号。
“启动子”指能控制编码序列或功能RNA表达的核苷酸序列。通常，编码序列位于启动子序列的3’。启动子序列由近端和更远端上游元件组成，后者常称为增强子。因此，“增强子”就是一段核苷酸序列，它可以刺激启动子活性，且可以是启动子的固有元件或插入的异源元件，以提高启动子的水平或组织特异性。启动子可以整体上来源于天然基因，或者由自然界存在的来源于不同启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的核苷酸片段。本领域的技术人员明白不同的启动子可以指导基因在不同组织或不同细胞类型中表达，或在不同发育阶段或对不同环境条件的应激下表达。
“骨特异性启动子”指例如由McVey等，J.Biol.Chem.，263：1，111-11，116(1988)描述的骨粘连蛋白启动子或BMP的启动子。
“3’-非编码序列”指位于编码序列下游的核苷酸序列，包括多腺苷酸化识别序列和其他编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的序列。多腺苷酸信号通常以影响向mRNA前体3’末端添加多腺苷酸序列段为特征。
“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于完全加工的mRNA中翻译起始序列的上游。翻译前导序列可以影响mRNA初级转录物的加工，mRNA的稳定性或翻译效率。
术语“可操作地连接的”指单核酸片段上两个或更多个核酸片段的结合，以使得其中一个的功能受另一个的影响。例如，当启动子能影响编码序列的表达时，其与该编码序列可操作地连接(即，编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可与调节序列以有义方向或反义方向可操作地连接。
“RNA转录物”指通过DNA序列的RNA聚合酶催化的转录得到的产物。当RNA转录物是DNA序列的精确互补拷贝时，它被称为初级转录物，或者它可以是初级转录物转录后加工而来的RNA序列，且被称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”是指无内含子的RNA，且可以翻译成多肽。“cDNA”是指双链DNA，它和mRNA互补并且来源于mRNA。“有义”RNA指RNA转录物，其包括mRNA，因此可以在细胞内翻译成多肽。“反义RNA”是指RNA转录物，它与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补，并阻断靶基因的表达(参见美国专利No.5,107,065，在此引用作为参考)。反义RNA的互补性可以针对特定核苷酸序列的任一部分，即5’-非编码区、3’-非编码区、内含子或编码序列。“功能RNA”是指有义RNA、反义RNA、核酶RNA或其他不被翻译但在细胞过程中有作用的RNA。
术语“表达”指源于本发明核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还指mRNA翻译为多肽。“反义抑制”指能抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物的生产。
“超表达”指有机体中基因产物的生产超过了正常或未转化有机体的生产水平。“共抑制”指能够抑制相同或基本相似的外源或内源基因表达的有义RNA转录物的产生(美国专利5,231,020，此处引入作为参考)。
“变化的水平”指有机体中基因产物的生产在量和比例上与正常或未转化有机体中的不同。本发明多肽的超表达可通过首先构建嵌合基因或嵌合构建体而完成，其中编码区与能指导基因或构建体在所需组织的所需发育时期表达的启动子可操作地连接。为了方便起见，嵌合基因或嵌合构建体可包括源于相同基因的启动子序列以及翻译前导序列。还可提供编码转录终止信号的3’非编码序列。为促进基因表达，嵌合基因或嵌合构建体还可包括一个或多个内含子。随后可构建包含嵌合基因或嵌合构建体的质粒载体。质粒载体的选择依赖于转化宿主细胞所用的方法。本领域技术人员很清楚质粒载体上必须有哪些遗传元件以便成功转化、选择及扩增含有嵌合基因或嵌合构建体的宿主细胞。熟练的技术人员也会认识到不同的独立转化事件会导致不同水平和模式的表达(Jones等(1985)EMBO J 4：2411-2418；DeAlmeida等(1989)Mol.Gen.Genetics 218：78-86)，这样，必须对多重事件进行筛选以获得所需表达水平和模式的系。这样的筛选可通过DNA的DNA印迹分析、mRNA表达的RNA印迹分析，蛋白表达的蛋白印迹分析或表型分析进行。
“盒”指可在确定的限制位点插入载体的用于编码表达产物的DNA编码序列或DNA片段。设计盒限制位点以确保盒插入合适的读框中。通常，外源DNA插入载体DNA的一个或多个限制位点，随后随着可传递的载体DNA通过载体一起带入宿主细胞。带有已插入或加入的DNA的DNA片段或序列，如表达载体，也可称作“DNA构建体”。
如此处使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括它们的子代，其为任何的和所有的后续世代。可以理解的是所有子代由于有意或无意突变可能不都一样。在表达异源核酸序列的情况中，不管其在体外还是在体内，“宿主细胞”均指原核或真核细胞(例如，如大肠杆菌(E.coli)的细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)。例如，宿主细胞可在转基因动物内。宿主细胞可作为载体的受体且可包括任何可转化的有机体，其能复制载体和/或表达由载体编码的异源核酸。
“克隆”指源于单个细胞或共同祖先的经有丝分裂的细胞群体。
术语“表达系统”指宿主细胞和在适当条件下相容的载体，所述条件例如，用于由载体携带的外源DNA编码的蛋白表达以及导入宿主细胞的条件。常见的表达系统包含但不限于大肠杆菌宿主细胞和质粒载体，昆虫宿主细胞和杆状病毒(Baculovirus)载体，和哺乳动物宿主细胞和载体。
术语“修饰的表型”指宿主细胞在一组特定的环境因素下表现的在形态、特征，或物理强度或生物化学特征中的变化。表型可通过给定的宿主细胞响应任何环境因素而呈现，所述环境因素包括，但不限于温度、暴露于某些分子或由胞外分子(如，激素)或其他细胞产生的信号传导。在某些实施方案中，给定的预定表型，以及该表型的任何修饰可以是那些在给定的宿主细胞中自然存在的表型。在另一些实施方案中，宿主细胞经过工程改造使得更容易检测的表型被替代进入目标转录途经中。例如，报道基因可与启动子可操作地结合而插入目标细胞调节途经中。无论那种情形，预期的目的表型，以及该表型的任何修饰优选为“预定的”，即，它们是已知的和已经很好地表征的，以及在用于筛选和/或选择本发明的表型调节分子的宿主细胞中很容易检测的。
“转化”指核酸片段转移入宿主有机体基因组，导致基因稳定的遗传。包含转化的核酸片段的宿主有机体称为“转基因”有机体。
术语“基因诱导型系统”指使用调节基因表达的配体。已开发出几个调节系统，所述系统利用小分子诱导基因表达(综述见Clackson T.Curr OpinChem Biol.1997；1：210-218；Lewandoski M.Nat Rev Genet.2001；2：743-755)。基因诱导型系统为一个分子工具，其允许在系统未激活时使靶基因降低至不可检测的基础表达，且在系统激活时提高靶基因的表达水平。
“成熟”蛋白指翻译后加工过的多肽；即，其中在初级翻译产物中存在的任何前肽或肽原已被去除的多肽。“前体”蛋白指mRNA翻译的初级产物；即，其中前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原包括但不限于胞内定位信号。
本发明的多肽也包括上述多肽的变体，包括所有等位形式和剪接变体。该多肽经保守的或非保守的插入、缺失以及取代，或其任何组合而不同于参照多肽。术语“变体”指“一个变体”或“多个变体”，指PAIGB分子的核酸或氨基酸序列的变异。PAIGB分子的核苷酸或氨基酸取代、添加或缺失包含于术语“变体”中。经化学修饰的天然和合成的PAIGB分子也包含在术语“变体”中。例如，变体可以指分别与参照多肽不同的多肽。通常，氨基酸序列与参照多肽不同的多肽与参照多肽的差异是有限的，从而参照和变体的氨基酸序列总体上密切相似，且在某些区域完全相同。变体和参照多肽可通过以任何组合出现的、可以是保守的或非保守的一个或多个取代、缺失、添加、融合和截短而在氨基酸序列上不同。例如，变体可以是那些多肽，其中几个，例如从50至30、从30至20、从20至10、从10至5、从5至3、从3至2、从2至1或1个氨基酸以任何组合进行插入、取代或缺失。另外，变体可以是本发明的多肽片段，其通过比参照序列更短，例如通过末端或内部缺失而与参照多肽序列不同。本发明的多肽变体还包括保留与所述多肽基本相同的生物学功能或活性的多肽，如，能通过前体部分的切割而产生活性成熟多肽的前体蛋白。这些变体可以是以编码蛋白的结构基因核苷酸序列差异为特征的等位变异，或可包含差异剪接或翻译后修饰。变体也包括具有基本相同的生物学活性，但获自不同物种的相关蛋白。
熟练的技术人员能生产具有单个或多个氨基酸取代、缺失、添加或替代的变体。这些变体其中可包括：(i)一种变体，其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代，且所述被取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸残基，或(ii)一种变体，其中一个或多个一个或多个氨基酸添加至多肽或蛋白中，或(iii)一种变体，其中一个或多个氨基酸残基包含取代基，或(iv)一种变体，其中成熟多肽与另一种化合物融合，如提高多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)，或(v)一种变体，其中额外的氨基酸融合至成熟多肽，如前导序列或分泌序列或用于成熟多肽纯化的序列或前体蛋白序列。多肽的变体也可以是天然存在的变体如天然存在的等位变体，或可以是对天然存在的未知的变体。在这一点上，多肽变体中的变体通过氨基酸取代、缺失或添加而与上述多肽不同。取代、缺失或添加可包含一个或多个氨基酸。氨基酸序列的改变可以是保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。所有以上定义的所述变体被认为包括在本领域技术人员从此处的教导以及现有技术的理解范围内。
本发明的多肽包括上述多肽的变体，包括所有等位形式和剪接变体。源于PAIGB(SEQ ID NO：5或9)核酸序列的剪接变体也包含在本发明中。剪接变体指通过基因组DNA初级转录物的差异加工而产生的变体PAIGB核酸和多肽，其导致产生超过一种类型的mRNA。源于差异加工的基因组DNA的cDNA编码带有氨基酸完全同一性区域和具有不同氨基酸序列的区域的PAIGB多肽。当初级RNA转录物进行剪接时，通常为了去除内含子，发生可变RNA剪接，其导致产生超过一个mRNA分子，每个可编码不同的氨基酸序列。因此，相同的基因组序列能导致多个相关的mRNA和蛋白的产生。得到的mRNA和蛋白在此均称为“剪接变体”。可在单个组织类型或组织间(组织特异性变体)发现剪接变体。
剪接变体可包括，例如，此处公开的PAIGB(SEQ ID NO：5、6、9或10)的任何一条序列。剪接变体也可包括可由本领域技术人员确定的PAIGB内含子/外显子的其他组合。通过实验例如，通过分离和分析细胞RNA(如，DNA印迹法或PCR)，或通过使用此处描述的PAIGB相关核酸探针或引物筛选cDNA文库，可确定剪接变体。在另一方法中，可使用本领域从业者可得的各种方法、计算机程序或计算机系统而预测剪接变体。
术语变体也可指序列与本发明的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1、3、5、7和9不同的多核苷酸。多核苷酸序列的趋异性可以由例如一个或多个核苷酸的缺失、取代、添加的突变而引起。每个这种突变在给定的序列中单独或联合，一次或多次地出现。
“突变蛋白”指氨基酸序列有较小变化的PAIGB蛋白或多肽，该变化是通过例如位点特异性诱变或其他操作；通过转录或翻译错误而引起的变化；或是通过理论设计合成制备的。这些较小的改变产生这样的氨基酸序列，其中蛋白或多肽的生物学活性与野生型或天然存在的多肽或蛋白相比发生改变。
“PAIGB分子”指PAIGB多肽、PAIGB肽、其片段或变体或PAIGB肽，以及编码PAIGB多肽、PAIGB肽、其片段或变体的核酸。“PAIGB分子”也指PAIGB多核苷酸、基因和其变体。
PAIGB DNA、RNA或多核苷酸的“类似物”指在形式和/或功能(如参与互利多核苷酸序列上碱基对的序列特异性氢键结合的能力)上类似于天然存在的多核苷酸，但不同于DNA或RNA，例如，具有不常见的或非天然的碱基或改变的主链的分子。参见例如，Uhlmann等0 990)ChemicalReviews 90：543-584。
术语“调节”指功能的抑制、增强或诱导。例如，基因表达的“调节”或“调控”指基因活性的变化。表达的调节可包括，但不限于，基因活化和基因抑制。
“调节”或“调控”也指提高或降低蛋白、酶、抑试剂、信号转导物、受体、转录激活物、辅因子等等的生物学活性的方法、条件或试剂。这种活性的变化可以是mRNA翻译、mRNA或DNA转录，和/或mRNA或蛋白降解的增强或降低，其可依次对应于生物学活性的增强或降低。所述增强作用或抑制作用可能在具体事件发生时是暂时的，所述事件如信号转导途径的活化，和/或可能仅在特定细胞类型中显示。调节剂意欲包括任何化合物，如抗体、小分子、肽、寡肽、多肽或蛋白，优选小分子或肽。
“受调节的活性”指例如，通过蛋白的生物活性形式调节的任何活性、状况、疾病或表型。通过影响生物活性蛋白的浓度而实现调节作用，例如，通过调控表达或降解，或通过直接的激动或拮抗作用，例如，通过抑制、活化、结合或释放底物，通过化学的或结构的修饰，或通过直接或间接的可能包括额外因子的相互作用。
术语“化合物”、“药物”、“药学活性剂”、“活性剂”、“试剂”、“组合物”或“药剂”在此处可以互换使用，指物质的化合物或复合物或组合物，其当施用于受试者(人或动物)时通过局部和/或全身作用诱导预期的药学和/或生理学效应。此处的试剂可诱导PAIGB分子以及可包含PTH合成代谢作用。
术语“药学可接受载体”包含任何药学载体，如磷酸缓冲盐溶液、水和乳剂，如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的润湿剂。组合物也可包括稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的例举，参见Martin，Remington′s Pharm.Sci.，5th Ed.(Mack Publ.Co.，Easton 0 975))。
术语“药学可接受盐”指从药学可接受的无毒性酸制得的盐，包括无机盐和有机盐。合适的无机盐包括但不限于无机和有机酸如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑璜酸、柠檬酸、乙烯磺酸(ethenesulfonic)、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、苹果酸、马来酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、扑酸(pamoic)、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等等。
“间歇”施用、注射或处理表示化合物或包含它们的组合物在服药或评估结果前的时期内零星地提供给受试者。例如，在施用化合物或组合物的任何两天之间可以有一天的间隔、三天的间隔或五天的间隔，或仅施用单剂，或在服药后直到评估结果前存在一个时期。就是说，虽然在第一天时可使用多剂(或仅一剂)，但在次日可能不再服药。或者如果剂量是每日一次基础的，则评估结果前允许没有间隔期。进行治疗的时间范围可以由起始施用和评估结果间的时间来衡量。对于本领域技术人员而言，间歇施用的多种改变是显而易见的；本发明意欲包含所述的改变。
如此处使用的，术语“治疗”定义为对受试者应用或施用试剂(如，治疗剂或治疗性组合物)，或对受试者或来自受试者的分离组织或细胞系应用或施用试剂，该受试者可能患有疾病、疾病的症状或疾病易感性，目的在于治疗、治愈、减轻、解除、改变、救治、改良、改善或影响疾病、疾病症状或疾病易感性。术语“治疗剂”指有助于例如骨相关病症的疾病治疗的任何分子、化合物，或处理。因此，治疗剂包括，但不限于，小分子、肽、抗体、核酶和反义寡核苷酸。
本发明的组合物也可包括药学可接受形式的、预防和/或减轻特定疾病、如骨相关病症症状的化合物。也预期以任何合适的形式提供本发明的治疗组合物。组合物的形式依赖于许多因素，包括施用模式。在其组分中，组合物可包含稀释剂、佐剂和赋形剂。
骨强度可通过骨密度(矿质grs/体积cm3)和骨质量(矿化、骨结构、骨更新，微骨折(microfracture))得以确定。作为骨强度的量度，常使用骨盐密度(BMD)。例如，如果BMD低于年轻白种成年妇女的BMD平均值的程度超过2.5标准差，则该骨可称为骨质疏松(World Health Organization，1994，Assessment of Fracture Risk and it′s Application to Screening for PostmenopausalOsteoporosis.Technical Report Series 843.Geneva：World Health Organization)。
术语“PTH”指甲状旁腺激素及其衍生物。本发明使用的甲状旁腺激素可以多种形式存在，如天然型的PTH、基因工程技术生产的PTH或化学合成的PTH。人PTH(1-84)由84个氨基酸残基组成。PTH衍生物的实例为上述定义的PTH的部分肽、可由其他氨基酸部分替代的PTH或其部分肽的组成氨基酸、可部分缺失的PTH或其部分肽的组成氨基酸以及具有至少一个氨基酸加至PTH或其部分肽的肽；作为PTH衍生物的肽与PTH自身具有相似的活性。PTH部分肽的实例包括人PTH(1-34)、人PTH(1-64)、人PTH(35-84)以及牛PTH(1-34)。PTH(1-34)指PTH的部分肽，其由从PTH的N末端数起的34个氨基酸组成。hPTH指人PTH。
“PTH应答基因”指表达受PTH影响的基因。
“骨相关病症或疾病”指骨形成病症，骨吸收病症和/或骨密度病症。骨相关病症的实例包括但不限于本领域技术人员已知的骨折和非骨折相关的状况，其对此处描述的组合物产生治疗性应答：变性骨病症、神经变性、肌变性、骨变性、骨量减少、骨质疏松症、骨癌、关节炎、佝偻病、骨折、牙周病、骨节段缺损、骨质溶解骨病、原发性和继发性甲状旁腺和能亢进症、Paget氏疾病、骨软化、骨肥厚或骨硬化病。
“骨相关试剂”指影响骨代谢的试剂，如，骨形成或骨分解活性或两者都是。“骨相关试剂”可诱导合成代谢或分解代谢作用，可抑制骨吸收且导致BMD增加，或可维持骨形成和骨吸收之间的平衡。
骨形成活性可通过提高成骨细胞活性、成骨细胞从骨原细胞的分化，和提高成骨细胞增殖，降低成骨细胞的细胞凋亡和任何其组合而诱导。另外，“骨形成活性”指降低骨吸收或提高新骨形成或两者的组合。骨形成活性可在多种骨组织或细胞中诱导。
“骨合成代谢试剂”指诱导或提高骨形成活性的试剂，如，甲状旁腺激素。
甲状旁腺激素(PTH)和其信号传导系统是成人骨骼中骨重建的主要调节剂(Masiukiewicz和Insogna(1998)Aging 10：232-239；Mierke和Pellegrini(1999)Curr Pharm Des 5：21-36)。它对于血流中钙的内环境稳定有至关重要的作用，且体内PTH的急性效应是提高骨吸收，虽然在其循环水平的持续提高同时加速骨形成和吸收。PTH信号传导途径也参与骨形成期间软骨发生的调控(Vortkamp等(1996)Science273：613-622；Lanske等(1999)J Clin Invest104：399-407)。“PTH信号传导途径”指包含PTH的任何途径如PKC或PKA途径。骨细胞中通过PTH的这些途径的激活调节许多生物反应，其可通过本领域技术人员已知的多种方法得以测量。可测量的一些活性包括但不限于cAMP的诱导、肌醇三磷酸(IP3)的诱导、胞内游离Ca+2的诱导和许多报道基因基因转录的调节(综述见Swarthout，J.T.，Gene 282：1-17.2002)。
“骨组织”指钙化组织(如，颅盖、胫骨、股骨、椎骨、牙)、骨小梁、骨髓腔，其为不同于骨小梁的腔，密质骨，其覆盖骨梁和骨髓腔的外周，等等。骨组织还指通常定位在矿化胶原基质中的骨细胞；为骨细胞提供养分的血管；源于骨组织的骨髓吸出物、关节液、骨细胞；以及可包括脂肪骨髓。骨组织包括骨产物如全骨、全骨的节段、骨片、骨粉、骨组织活组织检查、胶原制剂，或其混合物。为了本发明的目的，除非另有申明，术语“骨组织”用于囊括所有上述提及的骨组织和产物，无论是人还是动物的。
术语“生物学样品”宽泛地定义为包括任何细胞、组织、生物流体、器官、多细胞有机体，等等。生物学样品可源于，例如，体外的细胞或组织培养物。或者，生物学样品可源于活的有机体或单细胞有机体的群体。生物学样品可以是活的组织如活的骨。术语“生物学样品”还预期包括样品，如分离自受试者的细胞、组织、生物流体，以及存在于受试者中的样品。就是说，本发明的检测方法可用于体外及体内检测生物学样品中的PAIGBmRNA、蛋白或基因组DNA。例如，体外用于检测PAIGB mRNA的技术包括RNA印迹杂交和原位杂交。体外用于检测PAIGB蛋白的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白印迹、免疫沉淀和免疫荧光。体外用于检测PAIGB基因组DNA的技术包括DNA印迹杂交。此外，体内用于PAIGB蛋白检测的技术包括将标记的抗PAIGB抗体导入受试者。例如，抗体可用放射性标记来标记，其在受试者中的存在和位置可通过标准成像技术得以检测。
“抗体”表示包括但不限于多克隆的、单克隆的、嵌合的、人的、人源化的、双特异性的、多特异性的、灵长类来源化的TM抗体。术语“抗体”优选指多克隆和/或单克隆抗体及其片段，以及其免疫结合等价物，其可结合到PAIGB蛋白和其片段或来自PAIGB区域或其部分的核酸序列。术语抗体不仅用于指同种分子实体，还指混合物如由多种不同分子实体组成的血清产物。可在蛋白合成仪中合成性制备蛋白，将其与载体分子偶联并在数月内注射入兔子。测试兔血清对PAIGB蛋白或其片段的免疫反应性。单克隆抗体可通过用蛋白，或其片段注射小鼠而得以制备。单克隆抗体通过ELISA进行筛选并测试对PAIGB蛋白或其片段的免疫反应性。Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1988)。
“测试样品”指来自目的受试者的生物学样品。例如，测试样品可以是细胞样品或组织样品。在此处“测试样品”和“生物学样品”可互换使用。
在一个实施方案中，生物学样品包含来自测试受试者的蛋白分子。或者，生物学样品可包含来自测试受试者的mRNA分子或基因组DNA分子。生物学样品可以是通过常规方法从受试者分离的骨样品。
在另一实施方案中，该方法进一步包含从对照受试者获得对照生物学样品，并将能检测PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的化合物或试剂与对照样品接触，以使得在生物学样品中检测PAIGB蛋白，mRNA或基因组DNA的存在，以及比较对照样品和测试样品中PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的存在。
“测试化合物”(此处与“测试试剂”互换使用)指化合物、组合物或提取物，其可通过本发明的至少一种方法，对如假定的调节生物过程或特异性结合能力的至少一种活性进行测试。
“测试化合物”可施予受试者以确定其对受试者的作用。以纯的制剂或混合物与一种或多种其他分子一起施用测试化合物。例如，测试化合物可组合，或溶解于促进受试者对化合物吸收的试剂，如有机溶剂，例如，DMSO或乙醇；或含水溶剂，例如，水或缓冲含水溶液；或食物。
“测试化合物”还指需对其影响特定生物化学系统的能力进行筛选的化合物或化合物的集合。测试化合物可包括很宽范围的不同化合物，包括化合物，化合物的混合物，如，多糖、小的有机或无机分子或其任意的结合；生物大分子，如，肽、蛋白，核酸如DNA、RNA或其组合，反义分子或核酶；或从生物材料如细菌、植物、真菌或动物细胞或组织制备的提取物、天然存在或合成的组合物、抗体或片段或其活性片段。包含核酸分子的测试化合物可以在载体中，如病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒或腺伴随病毒，脂质体、质粒中或与脂转染试剂一起提供。一旦测试化合物得以鉴定，则可以是靶的激动剂、拮抗剂、部分激动剂或反激动剂(inverseagonist)。依赖于已实施的特定实施方案，提供测试化合物，如注射的、在溶液中游离的，或任选附着到载体或固体支持物，如珠上的。许多合适的固体支持物用于固定测试化合物。合适的固体支持物的实例包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖(商业可得的，即，葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶)、羧甲基纤维素、聚苯乙烯、聚乙二醇(PEG)、滤纸、硝酸纤维素、离子交换树脂、塑料膜、玻璃珠、聚胺甲基乙烯基醚马来酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯马来酸共聚物、尼龙、丝等。另外，对于此处描述的方法，可单独或成组筛选测试化合物。
本发明进一步涉及用于检测生物学样品中PAIGB分子存在的试剂盒。例如，试剂盒可包括能检测生物学样品中PAIGB多肽或mRNA的标记化合物或试剂；确定样品中PAIGB量的方法；以及用于将样品中PAIGB的量与标准物进行比较的方法。该化合物或试剂可包装在合适的容器中。该试剂盒可进一步包括使用试剂盒检测PAIGB多肽或核酸的说明书。
本发明还涉及包括本发明核酸分子的载体、通过本发明载体如克隆载体或表达载体经遗传工程改造的宿主细胞以及经重组技术的本发明多肽的生产。
核酸分子：
本发明的核酸片段可用于从相同的或其他的物种中分离cDNA或基因。使用序列依赖型方案的同源基因的分离是本领域熟知的，且包括但不限于核酸杂交方法、DNA和RNA扩增方法如聚合酶链反应或连接酶链反应。具体地说，本发明的多核苷酸可用于鉴定在骨分化期间受调节的基因。例如，PAIGB可通过本领域已知方法下调(如，通过导入反义RNA或RNAi技术)且对分化相关基因的下调效应将指示该基因在骨合成的PTH诱导或PTH信号传导途径中的位置。
一般地，使用含10个或更多邻接氨基酸或30个或更多核苷酸的序列来推断性地鉴定与已知蛋白或基因同源的多肽或核酸序列。例如，对于核苷酸序列，含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可以用于依赖序列的基因鉴定(如，DNA印迹杂交)和分离(如，细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)方法。而且，12-15碱基的短寡核苷酸可作为PCR扩增引物用于获得含有引物的特定核酸片段。
此外，编码与本发明多肽类似多肽的基因，无论是cDNA还是基因组DNA，可以使用全部或部分的本发明的核酸片段作为DNA杂交探针，使用本领域技术人员熟知的方法，通过对来自任何所需来源如细菌、哺乳动物细胞、λ噬菌体的文库进行筛选，从而得以直接分离(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular.Cloning：A Laboratory Manual(1989)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(全部称为“Maniatis”))。而且，整个序列可通过技术人员熟知的方法如随机引物DNA标记或末端标记技术、切口平移直接用于合成DNA探针，或使用已知的体外转录系统合成RNA探针。另外，可设计及使用特异性探针来扩增本发明序列的部分或全长序列。得到的扩增产物可在扩增反应期间进行直接标记或在扩增反应后进行标记，并且用作探针以根据适当严格性条件分离全长cDNA或基因组片段。
本发明核苷酸序列的两个短片段可在聚合酶链反应方案中用于扩增来自DNA或RNA的编码同源基因的较长的核酸片段。或者，第二个引物序列可基于源自克隆载体的序列。例如，熟练技术人员可遵循RACE方案通过PCR扩增转录物中单个位点与3’或5’端之间的区域拷贝而产生cDNA。可从本发明序列设计定向于3’和5’方向的引物。使用商业可得的3’RACE或5’RACE系统(BRL)，可分离特异的3’或5’cDNA片段(Ohara等，PNASUSA(1989)86：5673；Loh等，Science(1989)243：217)。
在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列且相互不互补。依赖于预期的测试条件，可设计引物序列以提供靶核酸的有效和保真的复制。PCR引物设计的方法是本领域中常见的且熟知的。(Thein和Wallace，″Theuse of oligonucleotide as specific hybridization probes in the diagnosis of 12 geneticdisorders″(1986)pp.33-50，in Human Genetic Diseases：A Practical Approach，K.E.Davis(Ed.).ML Press，Herndon，Virginia)；Rychlik，W.，PCR Protocols：CurrentMethods and Applications.(1993)15：31-39.)或者，本发明序列可用作鉴定同系物的杂交试剂。核酸杂交测试的基本组分包括探针，怀疑包含目的基因或基因片段的样品，以及特定的杂交方法。本发明的探针一般为单链核酸序列，其与待检测的核酸序列互补。探针是与待检测的核酸序列(cDNA、基因组DNA或RNA)“可杂交的”。探针长度可在5个碱基至数万个碱基间变化，长度依赖于所要进行的特定测试。仅需探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列间的互补性不必完全一致。不完全互补的分子间发生杂交的结果是在杂交区的某些碱基片段没有与正确的互补碱基配对。
“聚合酶链反应”(“PCR”)是使用一个或多个引物以及聚合催化剂，如逆转录酶或DNA聚合酶，特别是热稳定聚合酶，来制备靶多核苷酸的复制拷贝的反应。
通常，PCR包括重复形成的三个步骤：“退火”，其中调节温度以使寡核苷酸引物和要扩增的多核苷酸形成双链体；“延伸”，其中调节温度以便使用与其形成双链体的多核苷酸作为模板，用DNA聚合酶延伸已形成双链体的寡核苷酸；以及“解链”，其中调节温度以便解离所述多核苷酸和延伸的寡核苷酸。然后重复循环直至获得需要量的扩增多核苷酸。在Mullis的US4,683,195和Mullis等的US4,683,202中教导了PCR方法。基因中的元件包括但不限于启动子区、增强子区、阻抑物结合区、转录起始位点、核糖体结合位点、翻译起始位点、蛋白编码区、内含子和外显子，以及转录和翻译的终止位点。
杂交方法在本领域熟知(Maniatis，具体是第11章和表11.1)。通常，探针和样品在允许核酸杂交的条件下混合。此包含了在合适的温度和离子强度条件下将探针与样品在无机或有机盐存在时接触。探针和样品核酸接触足够长的时间，从而使得探针与样品核酸间发生任何可能的杂交。混合物中探针或靶的浓度将决定发生杂交所需的时间。探针或靶的浓度越高，所需的杂交温育时间越短。任选地，可加入离液剂。离液剂通过抑制核酶活性稳定核酸。此外，离液剂允许在室温时短寡核苷酸探针的灵敏和严格的杂交(Van Ness等，Nucl.Acids Res.(1991)1，9：5143-5151)。合适的离液剂包括胍、氯化物、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、铷、四氯乙酸、碘化钾，和三氟乙酸铯，等等。通常，离液剂以终浓度约3M存在。如果需要，可向杂交混合物中加入甲酰胺，一般30-50％(v/v)。
可使用多种杂交溶液。通常，这些溶液包括从约20至60％体积的，即，优选30％的极性有机溶剂。普通的杂交溶液使用约30-50％v/v的甲酰胺，约0.15至1M氯化钠，约0.05至0.1M缓冲液，如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9)，约0.05至0.2％去污剂，如十二烷基硫酸钠或0.5-20mM的EDTA，FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500千道尔顿)，聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿)和血清清蛋白。一般杂交溶液还含有约0.1至5mg/mL的未标记载体核酸、片段化的核酸DNA，如，小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA，以及任选约0.5至2％ wt/vol的甘氨酸。也可含有其他添加剂，如体积排阻试剂，其包括多种极性水溶性或可膨胀的试剂，如聚乙二醇，阴离子糖类聚合物，如硫酸葡聚糖，以及阴离子聚合物，如聚丙烯酸酯或聚丙烯酸甲酯。
核酸杂交适合多种测定形式。最适合的一种为夹心测定形式。夹心测定尤其适合在非变性条件下的杂交。夹心测定的基本组分是固体支持物。固体支持物吸附或共价偶联固定的核酸探针，该探针是未被标记的且互补于序列的一部分。
本发明尤其预期在严格条件下与此处所述PAIGB编码序列及其互补序列杂交的核酸序列。为了本发明的目的，术语“严格条件”表示杂交仅发生于在核酸序列间具有至少80％且优选至少85％和最优选至少90％的同一性时。因此，本发明还包括与附随的序列表中报道的完整序列互补的分离的核酸片段、以及与所述序列具有至少90％同一性的核酸片段、以及具有与上述多核苷酸互补序列的多核苷酸。本发明与此处描述的PAIGB编码序列互补体杂交的多核苷酸，优选可编码基本保留了与SEQ ID NO：1、3、5、7和9的cDNA编码的PAIGB多肽相同的生物学功能或活性的多肽。
在某些应用中还需要降低或消除编码本发明多肽的基因的表达。为达到该目的，设计用于共抑制本发明多肽的嵌合基因或嵌合构建体，可通过将编码该多肽的基因或基因片段与启动子序列连接而构建。或者，设计用于表达针对本发明所有或部分核酸片段的反义RNA的嵌合基因或嵌合构建体，可通过将基因或基因片段与启动子反向连接而构建。共抑制或反义嵌合基因可通过转化导入所需的宿主细胞，其中相应内源基因的表达得以降低或消除。
本发明的多核苷酸，可以是RNA形式或DNA形式，其DNA包括cDNA和合成的DNA。DNA可以是单链或双链的。如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。编码序列可与SEQ ID NO：1、3、5、7、9的编码序列相同，或是不同的编码序列，其中该编码序列由于遗传密码的简并性或冗余性编码了相同的多肽。
本发明还包括上面所述多核苷酸的变体，其编码通过SEQ ID NO：5和9的推定的氨基酸序列表征的多核苷酸的片段，类似物和衍生物。多核苷酸的变体可以是该多核苷酸的天然存在的等位变体或该多核苷酸的非天然存在的变体。
本发明的多核苷酸，可具有如下编码序列，即通过SEQ ID NO：1和9的DNA序列表征的编码序列的天然存在的等位变体。等位变体是多核苷酸序列的替代形式，其具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加，且基本上没有改变所编码的多肽的功能。
编码成熟多肽，即PAIGB蛋白的多核苷酸，可仅包括成熟多肽的编码序列，或包括成熟多肽的编码序列和例如基因控制序列、调节或分泌序列的附加序列。
因此本发明包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可在相同的读框与有助于来自宿主细胞的多肽的表达和分泌的多核苷酸序列进行可操作地连接。该多核苷酸也可编码前体蛋白。
编码多肽的多核苷酸包括那些通过例如同源重组、定点诱变或PCR诱变而含有预定突变的多核苷酸，和其他动物物种的重组PAIGB蛋白或多肽片段，包括但不限于脊椎动物(如，兔、大鼠、鼠、猪、骆驼、爬行动物、公山羊、禽类、鱼、牛、绵羊、马和非人灵长类物种)和无脊椎动物，以及前述物种和人序列的PAIGB的等位基团或其他天然存在的变体和同系物。
本发明的多核苷酸还可以具有在基因3’或5’末端在框内与标记序列如六组氨酸标签(Qiagen Inc.)融合的编码序列，以使得能够纯化本发明的多肽。
宿主细胞：
可用本发明的载体工程改造宿主细胞。宿主有机体(重组宿主细胞)可以是任何真核或原核细胞，或多细胞有机体，它们可源于哺乳动物、酵母、真菌或病毒。合适的宿主细胞可包括但不限于哺乳动物细胞(如，猴肾(COS-7)、人肾(293)、仓鼠卵巢(CHO)、人肝(HepG2)、人宫颈(HeLa)、小鼠成纤维细胞(NIH3T3)、小鼠成纤维细胞(MG-63))、哺乳动物成骨细胞(如原代成骨细胞、人成骨细胞(如TE-85、U2OS和SAOS-2)、大鼠成骨细胞(如UMR 106、ROS 17/2.8)、小鼠成骨细胞(如MC3T3))、以及间充质干细胞。此外，大肠杆菌的各种菌株(如，DH5α、BL21、DH10B)、酵母细胞(如，裂殖糖酵母属(Schizasaccharomyces)、啤酒糖酵母(Saccharomyces Cerevisice)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia Pastoris)、甲醇毕赤氏酵母(Pichia Methanolica))和昆虫细胞SF9或SF21-草地夜蛾(SpodopteraFrugiperda)、S2 Schneider细胞、来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵的High FiveCells可用作宿主细胞用于分子生物学操作。
载体可以是克隆载体或表达载体，如质粒、粘粒或噬菌体形式，或在宿主细胞中能复制和生存的任何其他载体。工程改造的宿主细胞可在常规的适于激活启动子、选择转化体或扩增本发明多核苷酸的营养培养基中得以培养。适于用于选择表达多核苷酸的宿主细胞的培养条件，如pH、温度等等，是本领域普通技术人员已知的。
按照本领域技术人员熟知的标准命名规则，此处质粒一般以前面的小写字母“p”和/或随后的大写字母和/或数字表示。此处的质粒是商业化的，在不受限制的基础上可公开获得的，或通过已知的应用途径、公开的方法从可获得的质粒中得以构建。另外，可根据本发明使用的许多质粒和其他克隆和表达载体对于本领域技术人员是已知的且是很容易得到的。而且，技术人员很容易构建任何适用于本发明中的许多其他质粒。本发明中所述质粒以及其他载体的特性、构建和使用，根据本说明书对于技术人员是显而易见的。
合适的DNA序列可通过本领域已知的多种方法插入载体。
表达载体中的DNA序列可以可操作地连接到合适的表达控制元件，以指导mRNA合成。表达控制元件在本领域是已知的且包括，但不限于，诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号和其他调节元件。优选地，诱导型启动子容易得以控制，如对宿主细胞培养基中的养分产生应答。启动子的实例有SV40、人巨细胞病毒(CMV)启动子(如，pcDNA3.1载体或pcDNA系列的任何形式)、SP6、T7和T3 RNA聚合酶启动子。将基因置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)、合适的基因控制序列或调节序列的控制下以使编码蛋白的DNA序列可在由包含该表达构建体的载体转化的宿主细胞中转录为RNA。所述启动子包括但不限于SV40、人巨细胞病毒(CMV)启动子(如，pcDNA3.1载体或pcDNA系列的任何形式)、SP6、T7和T3 RNA聚合酶启动子。某些情形中需要添加序列，所述序列导致多肽从宿主细胞中分泌，随后分泌信号得以切除。
表达载体也可包括用于转录起始的核糖体结合位点、转录终止子，以及用于扩大表达的合适序列。表达载体也可包括一种或多种选择性标记基因以提供特定的表型用于已转化宿主细胞的选择，如真核细胞的新霉素抗性或大肠杆菌的氨苄青霉素抗性。
EP 73,675A中描述了适合用于酵母表达的载体和启动子。载体的实例包括但不限于pCMV SPORT6、pCDNA3.1D/V5-His-TOPO以及pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO。合适的非天然哺乳动物启动子可包括来自SV40的早期和晚期启动子(Fiers等，Nature，273：113(1978))或源于莫洛尼鼠类白血病病毒、小鼠肿瘤病毒、禽类肉瘤病毒、腺病毒II、牛乳头瘤病毒或多形瘤的启动子。另外，构建体可结合于可扩增基因(如，DHFR)以能制备基因的多个拷贝。对于合适的增强子和其他表达控制序列，也可参见Enhancers and Eukaryotic Gene Expression(Cold Spring Harboor Press，Cold SpringHarbor，NY，1983)。优选的骨相关启动子包括CMVb Actin或I型胶原启动子以驱动人HBM、Zmax1或LRP6 cDNA的表达。其他优选用于哺乳动物表达的启动子是来自巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、猿猴病毒40(SV40)以及EF-1a(人延伸因子1a-亚基)。
另外，在不同细胞系中PAIGB可在病毒启动子下超表达以鉴定其在各种细胞功能中的作用。例如，PAIGB可在成骨细胞系中超表达，然后其在钙化中的作用可通过标准技术得以监控。
此外，在骨分化时受调节的基因可在PAIGB超表达时得以监控。此外PAIGB对分化相关基因的下调作用(通过导入反义RNA或RNAi技术)将指示该蛋白在骨合成的PTH诱导中的位置。
使用cDNA或其他重组核酸生产重组肽或多肽：
本发明进一步涉及本发明多肽的生产方法。本发明的多肽可通过在目的多肽表达的条件下生长由上述表达载体转化的合适的宿主细胞而生产。随后可分离和纯化多肽。从细胞培养物纯化蛋白的方法是本领域已知的且包括但不限于硫酸铵沉淀、阴离子或阳离子交换层析以及亲和层析。
本发明的多肽可通过肽合成仪得以合成。另外，使用源于本发明核酸分子的RNA，可应用无细胞翻译系统生产本发明的多肽。
本发明的多肽包括全长PAIGB蛋白及其多肽片段。这些蛋白可以是哺乳动物蛋白和/或人蛋白。可选择的实施方案包括具有来自共同多肽序列的至少约3、5、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100个氨基酸残基的连续氨基酸序列的多肽片段；共同多肽序列的氨基酸序列变体，其中氨基酸残基已插入到所述多肽序列或其片段N或C末端或中间；以及共同多肽序列或其片段的氨基酸序列变体，其已经通过另一种保守残基而取代。
对于某些应用，指导本发明多肽到达不同的细胞区室，或促进其从细胞的分泌是有用的。因此可预想的是上述嵌合基因可进一步通过用合适的胞内靶向序列如添加的转运序列和/或目前已去除的靶向序列来改变编码本发明多肽的序列而补充。当引用的参考文献给出这些的每一个的实例时，列表并不是穷举的，并且将来将发现更多有用的靶向信号。
蛋白表达检测：
为检测蛋白表达，可在例如流式细胞术分析、免疫组织化学染色或免疫荧光显微术中使用特异于PAIGB多肽或其片段的抗体。用于PAIGB多肽片段、突变体或变体表达的筛选，可使用一些不同的测定的一种或多种得以完成。例如，合适的细胞，如人成骨细胞，可通过本领域已知的技术，如cDNA转染、病毒感染使用克隆变体而导入细胞。可使用直接或间接的免疫荧光和流式细胞术分析细胞的细胞表面PAIGB的表达。可使用与PAIGB多肽特异反应性的单克隆抗体来评估已转染细胞的细胞表面表达。可以理解的是，cDNA、合成产生的DNA或染色体DNA也可通过使用本领域技术人员已知的和熟练的方法和方案用于瞬时转染细胞。例如，使用PAIGB的抗体，细胞裂解物中PAIGB的蛋白水平可通过基于常规的ELISA和RIA的测定得以定量。用于ELISA或RIA测定的各种方法是很容易得到的，也是在本领域已知的。
抗体和抗体片段：
本发明核苷酸和所推断的氨基酸序列的可用性，促进了cDNA表达文库的免疫学筛选。通过本领域技术人员已知的方法，本发明的多肽或其表达细胞可用作免疫原来制备抗体。前述抗体可用在现有技术中已知的与PAIGB定位和活性有关的方法中，如，使用上述或本领域已知的任何检测技术的蛋白印迹、原位PAIGB成像，在合适的生理或生物学样品中测定其水平等等。在一个实施方案中，特异于PAIGB蛋白、并且干扰其活性的抗体，可用于调节或抑制PAIGB蛋白的功能。所述抗体可使用此处描述的标准技术，针对PAIGB蛋白本身或对应于蛋白部分的肽而生成。所述抗体包括但不限于多克隆的、单克隆的、Fab片段、单链抗体或嵌合抗体。
在另一实施方案中，本发明的抗体可在流式细胞术研究中、免疫组织化学染色中，以及免疫沉淀中得以使用，其用于帮助测定正常细胞或组织，或来自患有或易患骨疾病的受试者的细胞或组织中PAIGB的表达水平。例如，可合成代表本发明氨基酸序列部分的合成肽。这些肽可用于免疫动物以产生对包含该氨基酸序列的肽或蛋白有特异性的多克隆或单克隆抗体。这些抗体可随后用于筛选cDNA表达文库以分离目标全长cDNA克隆(Lerner，Adv.ImmunoL 36：1(1984)；和Maniatis)。
此外，SEQ ID NO：2、4、6、8、10的多肽或SEQ ID NO：2、4、6、8、10和/或由SEQ ID NO：1、3、5、7、9编码的任何部分或表达任何上述多肽的细胞可用作免疫原。这些抗体可以是多克隆的或单克隆的，且可包括嵌合的、单链的和Fab片段或Fab表达文库的产物。这些抗体用于在细胞中原位检测或在细胞提取物中体外检测本发明的多肽。
因此，表达了PAIGB多肽且生产了兔多克隆抗体。更具体的是，合成了RADAIEPRYYESWTRE(SEQ ID NO：11)、EDGLPSNGVPRS(SEQ IDNO：12)、EAKRDAKRMPAKE(SEQ ID NO：13)和QMDRSRRITKNCVN(SEQID NO：14)序列且用于免疫动物。生产的抗体是用于分析PAIGB在蛋白水平表达的有用工具。该分析的结果用作有价值的标记以在观察到BMD变化前快速监控骨合成代谢试剂的潜在有效性。
筛选、诊断和治疗：
本发明PAIGB的多种用途包括但不限于病理生理学PTH信号传导途径的治疗性调节(如，基因送递方法、基因沉默方法、蛋白治疗抗体治疗)、诊断用途、药物靶、激动剂或拮抗剂的鉴定，以及PTH作用的分子机制研究。
例如，本发明的多肽可用作靶以促进化合物的设计和/或鉴定，该化合物可用作药物用于治疗现有骨质疏松症或用于预防治疗以降低绝经前妇女中骨折和骨质疏松症的风险。
这些化合物可通过诱导骨形成用于治疗绝经期妇女的骨质疏松症以防止骨进一步退化。其可作为单一疗法和/或联合已有抑制骨损失的疗法，或作为雌激素的辅助疗法施用。
这些化合物可用于治疗骨相关病症，所述病症由参与通过PTH调节PAIGB表达的信号传导途径中的改变而引起。例如，以某种方式作用于PAIGB而改变其功能以支持骨形成的化合物，可用作男性或女性中的预防治疗以提高他们的骨强度以及降低骨折的风险。该化合物还可模拟PAIGB的功能以及增强骨形成活性。
另外，本发明的多核苷酸和多肽可用于鉴定另外的靶(如，相互作用蛋白)，所述靶可影响参与通过PTH调节PAIGB表达的信号传导途径。更具体的是，本发明的多核苷酸和多肽可作为用于开发能模拟PTH合成代谢作用的新化合物的靶。所述化合物代表一种新的治疗剂，其中因所开发化合物的活性特异于PTH的合成代谢活性，所以持续暴露于PTH的作用将不是一个问题。所述化合物可以是如前面定义的试剂或化合物。
在一个实施方案中，能与具有SEQ ID NO：1、3、5、7和9核酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸探针可用于检测源于哺乳动物宿主细胞样品中的PAIGB多核苷酸的诊断方法中，包括检测样品中PAIGB的存在或不存在。
此外，克隆的PAIGB的大规模生产将能够筛选大量的PAIGB类似物，且将在代谢骨病症的临床治疗中促进新的或改良的激动剂和/或拮抗剂化合物的开发。更具体的是，筛选大量有PAIGB活性的类似物将导致用于骨质疏松症或其他骨相关病症的临床治疗中改良药物的开发。
所有本发明的化合物可以是药学可接受的盐或酯的形式。盐可以是，例如，Na+、K+、Ca+2、Mg+2等等；酯通常是那些1-6碳的醇的酯。
用于激活筛选的PAIGB启动子：
对PAIGB的组织特异性调节应答的转录调节元件(启动子)的鉴定和分离，提供了用于筛选促进PAIGB表达的试剂(如，药物、化合物、肽)的工具。启动子的调节可通过调节不直接结合到反应元件但影响转录活性(反式作用因子)的因子(辅激活物或辅阻遏物)的表达和/或活性而实现。转录活性也可以通过调节直接结合到DNA调节反应元件(顺式作用因子)的因子的表达和/或活性而调节。高通量的筛选可包括对试剂激活PAIGB启动子内组织特异性调节元件的能力进行测试。该试剂可诱导PAIGB的转录水平，且用于治疗骨质疏松症。为了利用组织特异性PAIGBDNA调节元件来筛选试剂，使用本领域已知的技术和质粒，分离启动子元件并克隆入报道质粒中(萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素转移酶，等等)。在成骨细胞中选择性赋予完全转录活性的DNA调节元件，可通过在成骨细胞和非成骨细胞中瞬时表达包含该调节元件的DNA报道构建体得以鉴定。测量成骨细胞中的转录活性，所述细胞使用已知的成骨细胞分化试剂或能促进成骨细胞活性的试剂进行处理。这些试剂包括但不限于PTH、地塞米松、前列腺素E2、维生素D3和骨形态发生蛋白2(BMP-2)。通过本领域已知的方法，已分离了SPAIGB骨特异性启动子且导入成骨细胞中(瞬时地、稳定地、病毒性地)。可对任何试剂进行其激活该PAIGB启动子驱动的报道基因的能力的筛选。
基因诱导型系统：
根据本发明上述的核酸、载体和调节区的进一步的应用，是它们可用作多种靶基因的化学诱导型表达系统(基因诱导型系统或靶基因的受控表达)。最后，如上所述，核酸可以在宿主细胞中表达。靶基因被克隆入表达载体，其以带有调节区的合适启动子而提供。这些表达载体随后被导入宿主细胞。可诱导的稳定细胞系(基因诱导型系统)可用于：1)评估PAIGB超表达对成骨细胞功能(关于成骨细胞特异性基因的表达)、细胞增殖和细胞凋亡的作用，2)筛选与PAIGB相互作用且由此调节其活性的试剂，3)作为二级筛选以证实小分子的活性依赖于PAIGB的表达，4)当PAIGB高表达时，评估其他骨相关激素/因子(雌激素、PGE2、BMP’s、PTH、地塞米松、维生素D3等等)对成骨细胞功能的影响，5)作为PAIGB蛋白的来源，6)鉴定与PAIGB相互作用的蛋白，7)作为用于生物学验证的瞬时转染，8)表达PAIGB的不同形式，以及8)用于基因转移中(AbruzzeseRV等.Human Gene Therapy.1999；10：1499-1507；Abruzzese RA等.MolecularTherapy.2000；2：276-287)。
具体地说，PAIGB可用于在瞬时转染测定中的基因诱导型系统中以确定骨相关试剂是否对依赖于PAIGB分子表达的骨代谢有作用，或是否影响PTH信号传导途径。
PAIGB多核苷酸可用于基因诱导型系统以生成转基因动物。可从所述转基因动物的组织进一步建立稳定的细胞系。
本发明的基因诱导型系统可用于动物模型的开发，其中将Cre重组酶表达制成骨组织中MFP依赖型的(如，I型胶原、骨钙蛋白启动子)，用于floxed基因的临时受调节的骨特异性缺失(Andras Nagy，Genesis 26：99-109，2000)。
基因诱导型系统可以是一种分子工具，使得能够在系统未激活时降低到靶基因的检测不到的基本表达，而在系统激活时提高靶基因的表达水平，参见Clackson T.Curr Opin Chem Biol.1997；1：210-218，Lewandoski M.Nat Rev Genet.2001；2：743-755)。因此，组分包括可由结合效应物的配体和靶基因(PAIGB基因)激活的效应物(调节蛋白)。米非司酮诱导型系统基于截短的人孕酮受体(PR)配体结合结构域(LBD)，其已失去由孕酮激活的能力但获得了由抗孕酮(antiprogestin)如米非司酮(MFP)激活的能力。当孕酮受体截短的配体结合结构域与DNA结合(如，酵母GAL4)和激活结构域(如，VP16；人NFKB的p65亚基)连接时，产生了配体特异性转录因子(调节蛋白)，其特异诱导以同源GAL4 DNA结合位点与启动子连接的基因的转录(Wang Y等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1994；91：8180-8184；DelortJ等.Human Gene Therapy.1996；7：809-820)。
抗孕酮-调控系统是基因诱导型系统的例子，其能利用组成型启动子(例如CMV、TK)进行效应物的遍在表达，或利用组织特异性启动子来驱动效应物在优选组织(例如骨组织和细胞)的表达。在配体的存在下，效应物发生二聚化并结合到靶基因(PAIGB基因)中同源的DNA的结合序列，该靶基因含有最小E1b TATA启动子和一些拷贝的GAL4 DNA结合元件。当发生所述效应物的结合时，PAIGB基因的转录得以增加，从而导致PAIGB表达的增加。
可使用本领域公知的基因诱导技术制备转基因动物(Wang Y.等，NatureBiotechnol.1997；15：239-243)。
可使用如本领域所述的基因诱导型系统制备基因敲除的动物(Kellendonk C.等，J.Mol.Biol.1999；285：175-182，Minamino等，Circ.Res.2001，88：587-592)。
药物组合物
本发明还提供组合物，其含有任一的上述蛋白、突变蛋白、片段、抗体，编码所述蛋白、突变蛋白、抗体或其片段的核酸分子，和表达该核酸分子的载体和宿主细胞，以及可接受的固体或液体、载体缓冲液或稀释剂。
通过多种途径，包括但不限于静脉内、皮下、肌内、鞘内、颅内和局部施用，可将本发明的组合物施用于需要促进神经系统、肌肉软骨和骨生长的个体。通过体内或离体(ex vivo)方法，可将组合物直接施用于器官或器官细胞。
这些组合物可以是可溶的或微粒形式，或可合并入小球体或微泡，包括微团和脂质体。
本发明的药物组合物包括一种或多种附加活性成分和，优选地，包括药学上可接受的载体。可提供该附加活性成分以与如上所述的基于一种或多种PAIGBs的活性成分联合使用。在选择性实施方案中，由于通过与来自基于PAIGBs的那些活性分子的不同的作用模式，来作用于与PALGB相同的疾病或病症，或者附加活性分子可作用于存在于人或动物的其他疾病或病症，所以添加该附加活性成分。
在本发明的方法中用到的活性化合物能整合入适宜施用的药物组合物中。如此处所用的，术语“活性化合物”包括PAIGB核酸分子、PAIGB蛋白或其片段和抗-PAIGB抗体，以及调节PAIGB基因表达、合成和/或活性的鉴定的化合物。所述组合物一般包括化合物、核酸分子、蛋白、抗体和表达所述核酸分子的载体和宿主细胞，以及药学上可接受的载体。本发明的组合物可含有一种或多种其他活性化合物，其结合了一种或多种骨相关试剂。例如，诱导PAIGB分子的试剂可结合雌激素、二磷酸酯、组织选择性雌激素。
使用一种或多种活性成分的有效量，其足以完成所需的对骨形成活性或细胞凋亡活性的调节效果。通过常规的剂量反应曲线可确定所需活性的有效量。当组合物用于制药时，它们可结合“药学上可接受的载体”来用于诊断和治疗用途。对于本领域技术人员而言，所述组合物的配制是众所周知的。本发明的药物组合物可包括一种或多种附加活性成分且，优选地，包括药学上可接受的载体。
适宜的药学上可接受的载体和/或稀释剂，包括任意的和所有的常规溶剂、分散介质、填充物、固体载体、水溶液、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，等等。术语“药学上可接受的载体”指施用于患者而不会引起患者中变态反应或其他副作用的载体。适宜的药学上可接受的载体包括，例如，一种或多种水、盐水、磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等等，及其组合。药学上可接受的载体还包括少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其可提高保存期限或组合物的一种或多种活性成分的有效性。本领域中对于药物的活性物质而言，所述介质和试剂的用途是公知的。除非到了任意的常规介质或试剂与活性成分不相容的程度，它们在组合物中的用途是预期的。也可将附加的活性化合物整合入该组合物。
本发明的药物组合物可配制为与其预定的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用，例如静脉内施用、真皮内施用、皮下施用、口服、吸入、口腔施用、经皮(局部)施用、跨粘膜施用和直肠施用。用于肠胃外、真皮内或皮下施用的溶液或悬浮液，包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节紧张性的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。用酸或碱调整pH，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可密封于安瓿、一次性注射器或者玻璃或塑料制成的多剂的小瓶中。
适于注射用的药物组合物包括无菌水溶液(其中是水溶性的)，或者分散体和无菌粉末，其用于无菌注射型溶液或分散体的临时制备。对于静脉内施用，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)。载体是溶剂或分散介质，其含有，例如水、乙醇、多羟基化合物(如甘油、丙二醇，和聚乙二醇液体等等)，及其合适的混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，通过维持分散所需的粒子大小，以及通过使用表面活性剂，能维持适当的流动性。通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等，能预防微生物的作用。在许多情况下，组合物中优选包括等渗剂，例如糖，诸如甘露糖醇、山梨糖醇的多元醇，以及氯化钠。通过在组合物中加入可延迟吸收的试剂，例如一硬脂酸铝和明胶，可延长注射型组合物的吸收。
在某些实施方案中，可将与PAIGB蛋白的全部或部分结合的抗体用于组合物中，来治疗任意的骨相关疾病或病症。通过常规方法可制备多克隆和单克隆抗体。通常，针对特异于一种PAIGB蛋白(或多种蛋白)的氨基酸序列(a)和更像是抗原性的氨基酸序列(b)，产生抗体。通过进行序列分析和使用任意的用于序列比对和序列对比的常规程序，人们能选择对PAIGB多肽特异的序列。在一个或多个末端，优选是两端是亲水性的氨基酸序列，通常优选用于产生抗体。除了使用亲水性氨基酸，在优选的实施方案中亲水性氨基酸也是碱性的(非酸性的)。人们也可使用能提高抗原性的任意氨基酸。例如，通常将脯氨酸用于序列的中心部分。通过抗体量减少中的升高，可测量抗原性，所述抗体是针对起始测试序列生成抗体时所产生的，所述序列特定的PAIGB蛋白。在本发明的某些实施方案中，针对包含PAIGB蛋白的至少8个连续氨基酸的序列来产生抗体，并且优选是包含PAIGB蛋白的至少10个连续氨基酸的序列。在其它优选的实施方案中，针对包含约15至约30个氨基酸的氨基酸序列产生抗体。
使用PAIGB分子评价药效
本发明提供监控试剂(例如通过此处所述的筛选测定所鉴定的激动剂、拮抗剂、肽模拟物(peptidomimetic)、蛋白、肽、核酸、小分子，或其它候选药物)对受试者的疗效的方法，包括以下步骤：(a)在施用试剂前从受试者中获得施用前样品；(b)在施用前样品中检测PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平；(c)从受试者中获得一份或多份施用后样品；(d)在施用后样品中检测PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平；(e)比较施用前样品中的PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA，和施用后样品中的PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性水平；和(f)相应地改变对受试者施用的试剂。例如，增加施用试剂预期可促进PAIGB的表达水平或活性水平上升到超过在增加施用试剂前检测的mRNA表达水平，即，增加了试剂的有效性。根据所述的实施方案，甚至在缺乏可观察的表型响应时，PAIGB表达或活性也可用作试剂效果的指示。
本发明还提供评价药物功效和监控患者在治疗骨相关病症的临床试验中进展的方法。对试剂(如药物)对PAIGB蛋白的表达或活性的影响(如细胞增殖和/或迁移的调节)的监控，不仅应用于基础药物筛选，还能应用于临床试验中。例如，通过此处描述的筛选测定所确定的、可促进PAIGB基因表达或蛋白水平的试剂效果，能在受试者出现提高的PAIGB基因表达或蛋白表达水平的临床试验中得以监控。或者，通过筛选测定确定的、促进PAIGB基因表达或蛋白表达水平的试剂效果，能在受试者出现提高的PAIGB基因表达或蛋白表达水平的临床试验中得以监控。在所述临床试验中，PAIGB基因的表达或活性，以及涉及例如PAIGB相关病症的其他基因的表达或活性，可用作诸如骨的具体细胞表型的“示值读数”或标记。此外，PAIGB基因的表达，或PAIGB蛋白表达水平可用作对骨相关病状的具体药物或试剂效果的示值读数。
例如，且非限定性地，可以鉴定包括在细胞中通过用可调节PAIGB表达或活性(如在此处描述的筛选测定中所鉴定的)的试剂(例如化合物、药物或小分子)进行处理而得到调节的PAIGB的基因。因此，为了研究试剂对PAIGB相关病症(例如骨相关的)的作用，分别分离细胞、制备RNA、分析PAIGB和PAIGB相关病症涉及的其它基因的表达水平。通过本领域公知的RNA印迹法分析或实时定量RT-PCR，或可选择地通过测量所生成的蛋白量、通过本领域公知的一种方法或通过测量PAIGB或其它基因的活性水平，可对基因表达(例如基因表达模式)的水平进行定量。在此方式中，基因表达模式可作为指示细胞对试剂的生理应答的标记。因此，该应答状态可在使用试剂治疗个体之前或期间的各时间点得以确定。
使用PAIGB分子作为生物化学标记
本发明的PAIGB分子也可用作骨相关病症或疾病状态的标记、疾病状态前体的标记、疾病状态诱因的标记、药物活性的标记或受试者的药物基因组(pharmacogenomic)特征的标记。使用此处描述的方法，可检测本发明的PAIGB分子的存在、不存在和/或量，其并且与一种或多种体内生物学状态有关。例如，本发明的PAIGB分子可作为一种或多种骨病症或疾病状态或诱发疾病状态的状况的生物化学标记。如此处所用的，生物化学标记与疾病或病症的不存在或存在，或疾病或病症的进展(例如，BMD的降低)有关。因此，这些标记可用来指示具体疗程是否有效减轻疾病状态或病症。
本发明引入分子和细胞生物学领域公知的方法和技术作为参考。这些技术包括，但不限于以下出版物中描述的技术：Old，R.W.& S.B.Primrose，Principles of Gene Manipulation：An Introduction To Genetic Engineering(3d Ed.1985)Blackwell Scientific Publications，Boston.Studies in Microbiology；V.2：409pp.(ISBN 0-632-01318-4)，Sambrook，J.等，eds.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.Vols.1-3.(ISBN 0-87969-309-6)，Miller，J.H.& M.P.Calos eds.，Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(1987)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.169 pp.(ISBN 0-87969-198-0)。用于编码本发明的蛋白的DNA可以是任一的序列，前提是其包括用于编码本发明上述的蛋白的核苷酸序列。
鉴定具有潜在的骨合成代谢作用的试剂
在一个实施方案中，本发明包括鉴定可调节PAIGB活性的测试试剂或化合物的方法。在该方法中，通过首先温育样品，该样品包含了在含有测试试剂的测试培养基中的PAIGB，从而测定在哺乳动物中调节骨形成活性的试剂。下一步骤是确定PAIGB的活性，其中与单独的PAIGB相比活性的增加表明该试剂是PAIGB的激活剂，且活性减少表明该试剂是PAIGB抑试剂。
PAIGB mRNA的表达可用作能改变PAIGB分子表达的试剂的鉴定工具。在一个实例中，这些试剂(如PTH 1-34)是合成代谢的，并能提高骨组织中或诸如间充质谱系(如骨髓间充质干细胞、前成骨细胞或成熟成骨细胞，如ROS 17/2.9、UMR106、MC3T3、SAOS-2、MG-63、TE85和U2OS)的骨细胞中的PAIGB水平，所述骨组织或内细胞具有成骨或骨形成活性。具体地说，高通量筛选包括用诸如小分子化合物(如10-30μM)、基于该化合物的天然产品或肽的试剂，来处理这些成骨细胞。在含有10％ FBS的生长培养基中处理细胞4至18小时。除去培养基，并用PBS洗涤细胞，随后使用自动RNA提取仪(例如Applied Biosystems PRISM6700)分离总RNA。来自1×106细胞中的一般RNA产量是20μg总RNA。分离RNA后，通过本发明如前描述的实时PCR(TaqMan分析)或本领域其它的公知方法来分析100ng RNA。因此，可从受试者骨组织中分离总RNA，受试者优选是哺乳动物，更优选是人。可使用本领域公知的多种技术，例如骨髓抽吸或骨芯活组织检查，以提供用于分析的组织。诱导PAIGB mRNA表达的试剂将指示具有骨合成代谢潜能的试剂。
一旦PAIGB诱导性试剂得以鉴定，则可通过在骨髓间充质干细胞、前成骨细胞或成熟成骨细胞中诱导骨特异性基因(包括但不限于碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨涎蛋白和I型胶原)的表达，测定化合物诱导骨细胞机能活性的能力。使用骨髓干细胞、骨原细胞和成熟成骨细胞，如通过VonKossa或茜素红染色法评价的，也可测定化合物体外诱导矿化作用的能力。通过增加骨原细胞或成骨细胞增殖，或者通过对这些细胞的细胞凋亡抑制作用，也可激发骨合成代谢试剂的作用。本领域中有许多方法是商业上使用的，用来测量以下参数，其包括但不限于3H-胸苷掺入、5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)掺入、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓盐(MTS)测定、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3/7测定、TUNEL测定(末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记)(Darzynkiewicz，Z.等，Cytometry 27：1-20.1997)或膜联蛋白V测定(Martin，S.J.，等，J.Exp.Med.182：1545-1556，1995和Raynal，P.等，Biochim.Biophys.Acta.1197：63-93，1994)。然后可使用本领域公知的动物模型，其包括将试剂局部注射于小鼠颅盖、将试剂全身施用于成年小鼠或幼年大鼠以及对卵巢切除的具有确立的骨量减少的大鼠或小鼠进行全身施用，测定这些化合物体内促进骨形成的能力。
双杂交筛选
哺乳动物和酵母双杂交系统可用于研究蛋白与蛋白的相互作用，参见，例如US 6,251,602、US5,989,808，Chien等，Proc.Natl Acad.Sci USA 88：9578-82(1991)；Fields等，Trends Genetics 10：286-92(1994)；Harper等，Cell 75：805-16(1993)；Vojtek等，Cell 74：205-14(1993)；Luban等，Cell 73：1067-78(1993)；Li等，FASEB J.7：957-63(1993)；Zang等，Nature 364：308-13(1993)；Golemis等，Mol.Cell.Biol.12：3006-14(1992)；Sato等，Proc.Natl Acad.Sci USA 91：9238-42(1994)；Coghlan等，Science 267：108-111(1995)；Kalpana等，Science 266：2002-6(1994)；Helps等，FEBS Lett.340：93-8(1994)；Yeung等，Genes & Devel.8：2087-9(1994)；Durfee等，Genes & Devel.7：555-569(1993)；Paetkau等，Genes & Devel.8：2035-45；Spaargaren等，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：12609-13(1994)；和Ye等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 91：12629-33(1994)。
用于筛选酵母噬菌粒(参见，例如Harper，Cellular Interactions andDevelopment：A Practical Approach，153-179(1993)；Elledge等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 88：1731-5(1991))或质粒(Bartel，1993和Bartel，Cell 14：920-4(1993))；Finley等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 91：12980-4(1994))的cDNA文库，从而克隆相互作用蛋白以及用于研究已知的蛋白对的该系统的变形是可获得的。
具有整合了多种报道基因盒拷贝的酵母株，例如GAL.fwdarw.LacZ、GAL.fwdarw.HIS3或GAL.fwdarw.URA3(Bartel，in Cellular Interactions andDevelopment：A Practical Approach，153-179(1993)；Harper等，Cell 75：805-16(1993)；Fields等，Trends Genetics 10：286-92(1994))可与两个质粒共转化，每个质粒分别表达不同的融合蛋白。一个质粒编码在蛋白“X”和例如GAL4酵母转录激活因子的DNA结合结构域之间的融合物(Brent等，Cell 43：729-36(1985)；Ma等，Cell 48：847-53(1987)；Keegan等，Science 231：699-704(1986))，而另一个质粒编码在蛋白“Y”和GAL4的RNA聚合酶激活结构域之间的融合物(Keegan等，1986)。将质粒转化入含有报道基因的酵母株，所述报道基因例如调控区含有GAL4结合位点的lacZ。如果蛋白X和Y相互作用，那么通过将两个GAL4组分置于激活转录的充分接近的区域，将它们重组为功能性GAL4转录激活因子蛋白。
任何杂交蛋白不能单独激活报道基因的转录，DNA-结合结构域杂交体是因为不能提供激活功能，而激活结构域杂交体是因为不能定位于GAL4结合位点。两个测试蛋白的相互作用重组了GAL4的功能，并导致报道基因的表达。报道基因盒含有最小启动子，该启动子含有在其TATA框的5’克隆的GAL4 DNA识别位点(Johnson等，Mol.Cell.Biol.4：1440-8(1984)；Lorch等，J.Mol.Biol.186：821-824(1984))。通过测量β-半乳糖苷酶的表达或在基本培养基上的转化体的生长对转录激活进行记分，所述基本培养基缺乏能对转录产物进行营养缺陷选择的特别养分例如URA3(尿嘧啶选择)或HIS3(组氨酸选择)。参见如：Bartel，1993；Durfee等，Genes & Devel.7：555-569(1993)；Fields等，Trends Genet.10：286-292(1994)；和美国专利No.5,283,173。
双杂交分析或筛选的附加方法学对技术人员是显而易见的。参见，例如Finley等，″Two-Hybrid Analysis of Genetic Regulatory Networks，″ in The Yeast Two-Hybrid System(Paul L.Bartel等，eds.，Oxford，1997)；Meijia Yang，″Use of a Combinatorial Peptide Library in the Two-Hybrid Assay，″in The YeastTwo-Hybrid system(Paul L.Bartel等，eds.，Oxford，1997)；Gietz等，″Identificationof proteins that interact with a protein of interest：Applications of the yeast two-hybridsystem，″Mol.& Cell.Biochem.172：67-9(1997)；K.H.Young，″Yeast Two-Hybrid：So Many Interactions，(in)so Little Time，″Biol.Reprod.58：302-311(1998)；R.Brent等，″Understanding Gene and Allele Function with Two-Hybrid Methods，″Annu.Rev.Genet.31：663-704(1997)。可以理解的是：通过对激活结构域融合文库进行顺序筛选，可阐明蛋白网络。
一般地，这些方法可包括要检测相互作用的两种蛋白，所述蛋白作为细胞核中的杂交体得以表达。一种蛋白融合于转录因子的DNA结合结构域(DBD)，另一种蛋白融合于转录激活结构域(AD)。如果蛋白相互作用，它们将重组可激活一个或更多报道基因的功能性转录因子，所述报道基因含有DBD的结合位点。
例如，通过双杂交方法学可鉴别潜在的PAIGB的相互作用蛋白。制备含有转录因子DBD和蛋白X的载体。当与报道基因一起置于细胞中时，该融合蛋白能结合到报道基因的启动子上，但不能激活转录。将未知cDNAs置于转录因子激活结构域附近，从而制备第二载体。当该载体置于含有报道基因的细胞中时，由于其不具有DNA结合结构域，因而不能激活转录。当两种载体置于相同的细胞中时，形成了能激活报道基因的转录因子-如果由第二质粒制备的蛋白结合X蛋白的话。
将全长(长和短类型)或不同部分的PAIGB克隆入两种杂交载体。这些载体包括但不限于pAS、pAS2-1、pGBT9、pGBKT7。克隆的PAIGB作为已知或未知蛋白的饵，所述饵作为带有已知结合结构域(如GAL4或LexA)的融合蛋白得以表达(Serebriiskii I.G.，等，BioTechniques 30：634-655.2001)。克隆入激活结构域(如GAL4或VP16)(Serebriiskii I.G.等，BioTechniques 30：634-655.2001)载体的cDNA，可来自于由不同的表达PAIGB的成骨细胞系、骨、脑和其他的组织而制备的cDNA文库。
一旦鉴定了相互作用的配偶体，就可以分离和克隆全长cDNA。此外，该相互作用可在哺乳动物双杂交系统中得到证实。也可实施实验来更清楚地说明PAIGB中的结合结构域，以及PTH和/或其他骨形成剂是否调节该相互作用。
如果PAIGB相互作用的配偶体是在成骨细胞中表达的新基因，则可进行另外的实验来确定PTH信号传导中的蛋白位置。然而，如果PAIGB相互作用的配偶体是已知生物功能的已知基因，那么它可表明PAIGB在PTH信号传导和骨形成诱导中的作用。
具有对PAIGB基因的改变的遗传修饰动物
遗传工程构建的动物包括基因敲除、基因敲入(knock-in)和转基因动物。术语“动物”当涉及转基因动物时包括除人之外的所有脊椎动物。也包括含有胚胎期和胎儿期的所有发育时期的动物个体。“转基因动物”是含有一个或更多的具有直接或间接接收遗传信息的细胞的动物，其通过在亚细胞水平上进行精心的遗传操作而获得，例如通过微注射法或重组病毒感染法。这种导入的DNA分子可整合到染色体中，或者它可以为进行染色体外复制的DNA。
通过从基因组源分离、从所分离的RNA模板制备cDNA、通过直接合成或以上方法的组合，可制备基因。
为了得以表达，将基因可操作地连接于调节区。调节区，例如启动子，可用于提高、降低、调节或指示某一组织或某一发育时期的基因表达。启动子不必是天然存在的启动子。
能够将DNA导入细胞的方法是本领域广泛存在的和众所周知的方法。能够将DNA导入细胞的方法是本领域广泛存在的和众所周知的方法。可使用导入转基因的不同方法。通常地，受精卵是最合适的微注射靶。例如，在小鼠中，雄原核直径大约为20μm，可进行1-2 pL的DNA溶液的重复注射。受精卵作为靶用于基因转移具有较多的优点。在多数情况，所注射的DNA将在首次分裂前就整合到宿主基因中(Brinster等，1985)。因此，转基因非人类动物的几乎所有细胞都含有整合的转基因。通常，由于50％生殖细胞将包容转基因，从而导致转基因有效传递到建立者的子代中。对于本发明实施的转基因整合而言，受精卵微注射法是优选的方法。
逆转录病毒感染法也可用于将转基因导入非人类动物。发育中的非人胚胎可在体外培养至胚泡期。在此期间，卵裂球可作为逆转录病毒感染的靶(Jaenich，R.1976)。通过酶处理去除透明带可实现卵裂球的有效感染(Hogan等，1986)。用于导入转基因的病毒载体系统一般是携带转基因的复制缺陷型逆转录病毒(Jahner等，1985；Van der Putten等，1985)。通过在生产病毒的细胞的单层上培养卵裂球，可简便、有效地获得转染(前述Van der Putten；Stewart等，1987)。或者，可在更晚时期进行感染。病毒或病毒生产性细胞能注射于囊胚腔中(Jahner等，1982)。由于整合仅仅发生于形成转基因非人类动物的细胞亚组中，因此大多数建立者动物是转基因嵌合体。此外，建立者动物含有在基因组多个位置的转基因逆转录病毒插入；它们通常在子代发生分离。此外，尽管效率低，通过妊娠中期胚胎的逆转录病毒的子宫内注射，也可能将转基因导入生殖系中(前述Jahner等(1982))。
用于转基因导入的第三种类型的靶细胞通常用来开发基因敲除和基因敲入动物，其是胚胎干细胞(ES)。此处所用的“胚胎干细胞”或“ES细胞”通常是衍生于胚胎的细胞或细胞系，它们是多能的，意味着它们是未分化的细胞(Evans，M.J.等，1981；Bradley，A.等，1984；Gossler，等，1986；和Robertson，等，1986)。这些细胞也能够通过同源重组整合外源DNA，且当整合入宿主胚胎中时能随后发育为身体中的任何组织。通过本领域众所周知的方法，可以从除胚胎组织以外的其他来源中分离多能细胞。通过DNA转染或通过逆转录病毒介导的转导，可有效地将转基因导入ES细胞。随后所得的转化的ES细胞能结合来自非人类动物的胚泡。ES细胞在胚胎中定居，并促成所得的嵌合体动物的生殖系(参见Jaenisch，R.，1988)。
小鼠中的胚胎干细胞有助于研究者选择转基因细胞和进行基因寻靶。与其他的转基因技术相比，这使得遗传工程更可能实现。例如，小鼠ES细胞在体外相对容易生长为群落。通过25道标准程序转染所述细胞，并通过抗生素抗性克隆选择转基因细胞(参见：例如，Doetschman等，1994，Genetransfer in embryonic stem cells.：In Pinkert(Ed.)Transgenic Animal Technology：ALaboratory Handbook，Academic Press Inc.，New York，pp.115-146)。此外，该方法的效果在于：能够生产足够的(成百上千)转基因群落，以进行同源重组体的第二次选择。然后小鼠ES细胞能结合普通宿主胚胎，并因为它们能保留其能力，因此它们能在所得的嵌合体动物中发育为包括生殖细胞的所有组织。这种转基因修饰能传递5代。
用于从早期植入前小鼠胚胎体外衍生胚胎干细胞(ES)系的方法是众所周知的。参见例如，Evans等，1981 Nature 29：154-156和Martin，1981，Proc.Nat.Aca.Sci.USA′78：7634 7638。在存在10层纤维原细胞建立者或抑制分化的来源时，ES细胞就能在未分化状态下传代。术语“体细胞”表示不是精细胞或卵细胞或不能成为精细胞或卵细胞的任意动物细胞或人细胞。术语“生殖细胞”或“生殖系细胞”指精细胞或卵细胞或能发育为精或卵细胞的任意细胞，并因此可传递其遗传信息至子代。术语“生殖细胞系转基因动物”指遗传信息整合入生殖系细胞的转基因动物，因此赋予其将遗传信息传递给子代的能力。如果事实上该后代含有一些或所有的遗传信息，那么它们也是转基因动物。
遗传信息的遗传变化可以是受体所属的动物物种外源的，或仅仅对于特定的个体受体是外源的。在后一种情形中，改变的或导入的基因的表达不同于天然基因的表达。
如此处所用的，“转基因”是通过人类的干涉而导入动物的生殖系的DNA序列。
如此处所用的，“表型”指有机体可观察到的性质(与基因型，即有机体的遗传组成形成对比)。在一个实施方案中，“表型”指所有的物理、生物化学和生理的细胞组成，例如具有任意一个性状或任意的性状组。
制备转基因动物的一般方法是本领域公知的，并在以下得到描述：例如， Strategies in Transgenic Animal Science(Glenn M.Monastersky和James M.Robl eds.，ASM Press；Washington，DC，1995)； Transgenic Animal Technology： A Laboratory Handbook(Carl A.Pinkert ed.，Academic Press 1994)； Transgenic Animals(Louis Marie Houdebine，ed.，Harwood Academic Press，1997)；Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice(Chaim O.Jacob，ed.，Academic Press 1994)； Microinjection and Transgenesis：Strategies and Protocols(Springer Lab Manual)(Angel Cid-Arregui和Alejandro Garcia-Carranca，eds.，Springer Verlag 1998)；和 Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual(Brigid Hogan等，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1994)。对于本领域而言，评价所导入DNA的存在及其表达的方法也是容易得到的和众所周知的。所述的方法包括，但不限于用于检测外源DNA的DNA杂交(DNA印迹)、聚合酶链反应(PCR)、用于检测DNA、RNA和蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白印迹。方法还包括用于检测PAIGB基因表达的免疫学和组织化学技术。
为了确定PAIGB是否在骨相关病症中发挥作用，制备在骨中超表达全长基因(外显子1、2、3)的转基因小鼠。也可制备在骨中超表达上述序列的任一片段，例如外显子2的剪接变体的转基因小鼠。为实现在骨和非骨组织中广泛超表达PAIGB的两种形式，可以使用遍在启动子(例如CMVβ-肌动蛋白)。此外，可使用米非司酮依赖型基因型诱导系统使PAIGB表达成为条件性的。通过启动子，例如大鼠3.6kb I型胶原启动子或大鼠1.7kb骨钙蛋白启动子，可驱动大鼠cDNA的骨特异性超表达。大鼠3.6kb I型胶原启动子可用于提供在骨发育过程中的早期表达，然而大鼠1.7kb骨钙蛋白启动子提供更加骨限制性的表达模式。相同的构建体也可用于生产转基因大鼠。对于PAIGB的条件性表达，骨钙蛋白启动子(Capparelli，F.B.，Endocrinol.138：2109-2116，1997)驱动基因诱导型系统，以及Gal 4最小启动子驱动PAIGB。根据要求，杂交独立的转基因系，并用米非司酮处理双转基因小鼠以调节PAIGB表达。转基因动物的表型分析包括体内和离体测定的组合。通过microCT分析进行测定，所述的表型分析包括BMD分析(pQCT)、微结构分析(骨量、电导密度、小梁数、小梁间隙、小梁厚度等)。其他分析包括测定矿物质添附率，如通过整合入活性矿化骨中的钙黄绿素所确定的。此外，通过测量成骨细胞数、破骨细胞数、以及细胞凋亡的成骨细胞数，评价组织学水平上转基因对骨表型的作用。合成代谢作用提供了概念证据：PAIGB分子对骨质疏松症的确是潜在的新靶。此外，在建立的骨量减少模型中，这些转基因动物可用于确定PAIGB的超表达是否能拯救卵巢切除诱导的大鼠和小鼠的骨量减少(Y.P.Kharode等，J.BoneMin.Res.14(1)：S523，1999.，Y.P.Kharode等，J.Bone Min.Res.16(1)：S540，2001)。
转基因动物能用于分析多种骨骼的骨表型的本领域已知的各种组织形态测量学参数，所述骨骼包括扁骨(头骨、肩胛骨、下颚骨和回肠)和长骨或轴向骨(axial bone)(胫骨、股骨和肱骨)等。骨表型以骨钙蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原的产成，以及骨量和骨参数中的变化为特征。骨钙蛋白、碱性磷酸酶和I型胶原是成骨细胞或骨组织的已知标记。
骨参数指骨密度、骨长度、小梁数、骨大小、骨组织连接度等。
此外，可以检验PAIGB转基因动物是否在多种骨丢失模型中免于丢失骨质，所述模型包括卵巢切除诱导的骨量减少、糖皮质激素诱导的骨量减少、多种废弃不用的模型以及本领域公知的模型。研究和确定多种骨合成代谢试剂(如鉴定的小分子)的组合的效果，从而以合成代谢方式(协同、辅助)或分解代谢方式中进一步修饰骨表型。
PAIGB转基因动物能用于鉴定治疗骨相关病症的试剂效果。将试剂施用于本发明中的转基因动物。测量在受处理动物的细胞中PAIGB表达的变化，并与在未受处理的对照动物中的PAIGB表达进行比较。
PAIGB转基因动物能用于研究PAIGB在共同影响骨形成的骨原细胞和成骨细胞的活性、增殖速率和细胞凋亡速率中的作用。
本发明也提供了PAIGB基因失活的动物。例如以小鼠作为测试模型，用于体内测试失活的PAIGB的结果。将野生型动物，即对应于基因敲除动物而无失活的PAIGB基团的动物中的结果，与基因敲除动物中的结果进行比较，以确定是否试剂或化合物得到测试。在现有技术中所给出的数据的基础上，如使用遗传修饰方法，也能实现基因敲除系统。例如，通过同源重组或基因导靶，动物PAIGB基因之一的一个或两个拷贝得以部分或完全缺失，或者通过外源序列的同源重组或基因寻靶进行插入或替代，所述拷贝得以失活。
在一个实施方案中，本发明提供用于开发基因敲除的PAIGB小鼠的基因信息。此外，通过将突变导入PAIGB序列来开发基因敲除小鼠，从而制备不再表达功能性PAIGB基因的动物。所述的基因敲除动物可应用于例如研究PAIGB在骨相关病症的作用。
为防止可能的致死问题，可使用cre/loxP系统(Andras Nagy，Genesis 26：99-109，2000)。该系统使得能够组织特异性或诱导性失活靶基因。
因此，制备条件性129Sv/Ev基因敲除小鼠，其依赖于骨中Cre重组酶的特异性表达。脑中表达的PAIGB基因和该组织中表达的无效等位基因导致胚胎致死。因此，选择条件性方法以生产PAIGB无效动物。通过将骨中特异性表达Cre的转基因小鼠与基因靶向的动物进行杂交，以在骨中缺失靶向的等位基因。通过大鼠3.6kb I型胶原启动子或大鼠1.7kb骨钙蛋白启动子驱动Cre表达，可制备129Sv/Ev转基因小鼠。通过与ROSA转基因小鼠(这些小鼠含有侧翼为lox P位点的报道基因Lac Z)进行杂交，杂交导致骨中Lac Z表达作为Cre活性的指示，测定这些Cre转基因动物的功能性。此外，可使用含有lacZ和EGFP的Z/EG双报道转基因小鼠。使用含有外显子1和附加的5’序列的790bp PAIGB探针(SEQ ID NO：15)，通过杂交筛选从Invitrogen获得的小鼠BAC克隆。如果确定存在PAIGB基因，则BAC克隆可用于构建基因靶向载体。基因靶向载体包括侧翼为frt位点(如果需要，可依赖flp重组酶切除)和lox P位点的新霉素选择盒，所述位点位于缺失区的上游和下游。
预计的表型是骨发育不正常或类似于在骨疾病中见到的骨丢失的表型。靶定的动物的表型分析包括体内和离体测定的组合。成人中不能正常发育正常骨或重构骨，提供了PAIGB在骨发育中的作用，即它作为研究骨相关病症的新靶。
基因敲除动物能用于分析多种骨骼的骨表型的本领域已知的各种组织形态测量学参数，所述骨骼包括扁骨(头骨、肩胛骨、下颚骨和回肠)和长骨或轴向骨(胫骨、股骨和肱骨)等。
此外，PAIGB基因敲除动物能用于分析多种试剂的效果、特异性和依赖性，例如调节PAIGB活性的小分子。
进一步地，PAIGB基因敲除动物能用于在不存在PAIGB时，评价骨原细胞和成骨细胞活性、增殖速率和细胞凋亡速率。
实施例
本发明进一步在以下实施例中得到说明，除非另外说明，其中所有的份和百分比是按重量计算的，度数是摄氏度。应该理解：这些实施例，当表示本发明优选的实施方案时，仅仅用于解释。从上述讨论，实施方案和这些实施例，本领域技术人员容易理解，在不实质上背离本发明的新教导的情况下可对示例性实施方案进行许多修改，且在不背离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明进行各种变化和修饰以使其适用于各种用途和情况。因此，所有此类修饰都被认为包括在后面的权利要求所限定的本发明范围内。
总的方法
差异表达基因的快速扩增(RADE)
分离总RNA，然后将每份RNA样品用20单位的DNA酶(Ambion，Austin，TX)进行处理。净化RNA后，样品分为3份进行逆转录反应(RT)。每份RT反应物含有4μg RNA、1000单位SuperScript II RT(Gibco)、100μMdNTPs和0.2μM锚定引物，并且最终体积为100μl。锚定引物序列为(5′→3′)T11A、T11C或T11G。对于差异显示，使用合适的锚定引物和80条任意引物中的一条引物(HAPs 1-80；Genhunter)，将各份cDNA样品一式两份，进行80次PCR反应。在终体积20μl的PCR反应物中，含有20ngcDNA、2μM dNTPs、0.2μM锚定引物、0.2μM任意引物、1单位Taq聚合酶(Applied Biosystems(AB)，Foster City，CA)，和2.5μCi[α-33P]dATP(2000Ci/mmole)。以下是PCR条件：1循环的92℃/2分钟，40循环的[92℃/15秒、40℃/2分钟、72℃/30秒]，1循环的72℃/5分钟。然后将PCR样品加样至50cm的6％测序凝胶上，恒压200V跑胶。从已干燥的凝胶上切下差异表达带。使用如最初反应中的相同引物和PCR条件，重新扩增从差异显示凝胶中回收得到的DNA样品。产物连接到pGem-T，Easy(PromegaMadison，WI)。
RNA分离
从骨中以及实验中用到的不同细胞系中进行RNA分离。按以下步骤从大鼠胫骨中分离RNA。在CO2窒息安死术之后，立即使用高压灭菌器械将胫骨切下并除去软组织，并以浸湿于乙醇的高压灭菌纱布进行擦拭，手工破坏近端生长面的骺并弃去。然后用切骨刀刚好在近端生长面的远端以及远端胫骨和腓骨关节的近端横切胫骨，露出松质骨和骨髓。用Lancer移液器(Oxford Labware，St.Louis，MO)吸取冰冷的无菌PBS漂洗松质骨和骨髓腔，以除去骨髓，并将清洗过的骨置于液氮保存。
使用经过100％乙醇漂洗并在液氮中预冷的Bessman组织粉碎机(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，一次将4根胫骨粉碎成骨粉，然后将骨粉转入含有4ml Trizol试剂(Gibco BRL，Rockville，MD)的50ml试管中。然后用手提式组织破碎匀浆器(Fisher scientific，Pittsburgh，PA)进一步匀浆骨粉，之后将试管置于干冰上直到能回收RNA。当天回收RNA，或将样品放于Trizol中于-80℃保存。
将冷冻样品置于室温并于12,000g离心10分钟，以除去过剩的矿物质。收集上清液，并以每1mL Trizol加入0.2mL氯仿。剧烈振荡试管并室温放置2-3分钟，然后于4℃12,000xg离心15分钟。然后将水层(上层)转移入新试管，并以每1mL所用Trizol加入0.5mL异丙醇。室温温育10分钟后，于4℃12,000xg离心10分钟。弃去上清液，用75％冷乙醇：25％无RNA酶水(每1mL所用Trizol加入1mL乙醇)涡旋洗涤RNA沉淀，然后于4℃7,500xg离心5分钟。弃去上清液后，简单干燥沉淀，重悬于无菌水中，并保存于-80℃。
在其他实验中，使用ROS 17/2.8和UMR106大鼠成骨细胞(ATCC#CRL1661)、C3HT101/2(来自ATCC# CCL226的小鼠成纤维细胞)和人U2OS成骨细胞(ATCC#HTB96)。将所处理的细胞用PBS洗涤两次，然后用Trizol(Invitrogen)或RNA-Bee试剂(TEL-TEST Inc，Friendswood，TX)分离RNA。根据厂商说明书进行RNA的最后分离。
RNA印迹
将分离的RNA在1×MOPS((3-[N-吗啉基]丙磺酸)缓冲液)和甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上电泳。RNA凝胶跑于1×MOPS(Sigma)。根据厂商提供的说明书(S&S)使用Turbo-blot将RNA转移至尼龙膜(S&S)上。根据提供的说明书，使用随机引发(prime)标记试剂盒(Gibco，BRL)对RADE片段和GAPDH或ciclophylin进行标记。使用ExpressHyb(Sigma)以标记探针，于68℃过夜杂交。在低严格性缓冲液(2×SSC，0.1％SDS)中于室温洗涤印迹2次，15分钟，在低严格性缓冲液(0.1×SSC，0.1％SDS)中于65℃洗涤印迹1次15分钟。使用柯达胶卷对印迹过夜曝光。
RT-PCR和实时PCR(TaqMan)
使用PAIGB多核苷酸序列和GAPDH以及18S核糖体RNA的探针和引物，对RNA样品进行RT-PCR和Taq-man分析。根据厂商的推荐，使用TaKaRa试剂盒(Panvera，Shiga，日本)进行RT-PCR。按以下条件实施RT反应：30℃ 10分钟，42℃ 50分钟，99℃ 5分钟以及4℃ 5分钟。PCR条件为：94℃ 5分钟，35循环的94℃ 2分钟、62℃ 30秒、72℃ 1分30秒，以及72℃ 10分钟。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分离。
本申请人使用购于Applied Biosystem(Foster City，CA)的基因特异性探针和引物，以及18S核糖体RNA探针和引物组，对先前DNA酶消化的样品进行多重实时PCR(TaqMan)分析。根据Ambion(无DNA试剂盒)提供的规程用DNA酶消化样品。通过Primer Express计算机程序鉴定PAIGB的TaqMan探针和引物。大鼠PAIGB TaqMan探针序列为：正向引物6FAM-5’CCCACATTCCTAAACACATCCTCCTGCAA(SEQ ID NO：16)，反向引物分别是5′CCATGCTCTGATATGGACCCTT 3′(SEQ ID NO：17)和5′TCAAACTCAGGCTGTGCCATAC 3′(SEQ ID NO：18)。对PAIGB和18S核糖体RNA或GAPDH的探针最终浓度分别是500nM和40nM。PAIGB的正向和反向引物浓度是500nM，而18S的正向引物和反向引物分别是10nM和20nM，或者GAPDH引物为40nM。从大鼠胫骨或脑RNA制备大鼠样品标准，其范围为250ng至0.1ng，同时小鼠特异性TaqMan的标准从小鼠脑RNA制备，以及从人脑RNA制备人标准(Clonetech，Palo Alto，CA)，其具有相同的浓度范围。小鼠PAIGB的引物和探针：正向5′TGTGAGGAGGCTTGGTACTCAG 3′(SEQ ID NO：19)，反向5′GAGATTCCACTGCAATCATTGG 3′(SEQ ID NO：20)，反义及探针5′6FAM-TGACACGGACCCTGTGGCACAAGA(SEQ ID NO：21)。人PAIGB引物和探针：正向5′ATGCTTGTGGCCAATGCA 3′(SEQ ID NO：22)，反向5′GATAGAGAGGGAAAACAGTCAAGAAGA 3′(SEQ ID NO：23)和探针5′6FAM-ACCCCTCAGGGCTCAGCTAGACATTGC3′(SEQ ID NO：24)。按以下条件使用ABI 7700序列探测仪进行Taq-Man分析：48℃ 30分钟，95℃ 10分钟，40循环的95℃ 15秒和60℃ 60秒。使用(Sequence Detector，Macintosh)程序进行实时PCR分析。
5’RACE
根据厂商的推荐，使用Clontech 5′RACE试剂盒，对来自大鼠脑和胫骨的RNA样品进行5′RACE。简要地，使用连接引物AP1 5′CCATCCTAATCAGA CTCACTATAGGGC 3′(SEQ ID NO：25)，和基因特异性引物：GSP1 5′GATTCCACTGCA ATGGTTGGTCCT 3′(SEQ ID NO：26)、GSP2 5′AACCGGGATGGTCGTCACCGCGTG 3′(SEQ ID NO：27)和GSP35′CTGTCCATCTGCCGGATATTCTCTG 3′(SEQ ID NO：28)，进行3轮5′RACE。多腺苷酸RNA用于合成第一条cDNA链。合成第二条cDNA链，并与连接物连接。使用AP1(连接引物1)，以及分别使用作为正向和反向引物的基因特异性引物进行5′RACE PCR，反应条件如下：94℃ 30秒，5循环的94℃ 5秒和72℃ 4分钟，5循环的94℃ 5秒和70℃ 4分钟，25循环的94℃ 5秒和68℃ 4分钟。将PCR反应物连接到T-A克隆载体。将从克隆中分离的、含有不同大小的插入片段的DNA进行测序。
筛选cDNA文库
使用λ-ZAP II大鼠脑cDNA文库以获得代表PAIGB的全长cDNA克隆。选择该文库，是因为它允许有效地在体内从λ-ZAP II载体上切除以及包含在λ载体中的任何克隆插入片段的再环化，以形成含有克隆插入片段的噬菌粒(pBluescript SK(-))。根据厂商建议(Stratagene，La Jolla，CA)进行文库筛选。使用RADE插入片段作为探针进行三轮筛库。一旦鉴别出阳性克隆，则使用T3和T7引物以及内部引物对插入片段进行测序。
细胞培养
在我们的实验中主要用到五种类型的细胞。表达中度水平的PTH受体1(Rodan等，Rev.Eukaryotic Gene Expression 1：85-98，1991)的大鼠成骨细胞系(ROS 17/2.8)用于进行体外实验。在标准细胞培养条件培养ROS细胞：含有养分混合物F-12(DMEM/F12)培养基、1％青霉素/链霉素和1％Glutamax的Dulbecco氏改良Eagle培养基中的10％热失活的FBS。在添加了10％热失活的FBS和1％青霉素/链霉素和1％Glutamax的Eagle基本必需培养基(EMEM)中，维持代表小鼠骨原细胞系的小鼠细胞系C3H10T(ATCC# CCL226)。在补充了10％热失活的FBS、1％青霉素/链霉素和1％Glutamax的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中，培养UMR106大鼠成骨细胞(ATCC#CRL1661)。在补充了10％FBS、1％青霉素/链霉素和1％ Glutamax的McCoy氏5A改良培养基(EMEM)中，培养U2OS人成骨细胞(ATCC# HTB96)。在补充了10％热失活的FBS和1％青霉素/链霉素及1％Glutamax的无酚红DMEM/F12培养基中，维持人HOB-O3-CE6细胞系(Bodine，V.N.P.等，J.Cell.Biochem.，65：368-387，1997)。
体外细胞培养实验中使用的化合物：人PTH(1-34)购于Biachem(Torrance，CA)，SQ 22536(Calbiochem La Jolla，CA)、福斯高林(Forskolin)、异丙基肾上腺素及前列腺素E2(PGE2)购于Sigma(St.Louis，MO)，降钙素(Salmon T-3660)(Sigma，St.Louis，MO)、骨形态发生蛋白2和6(BMP2、BMP6)以及PKC 19-27抑制剂购于Calbichem(La Jolla，CA)。
在近端胫骨测量全部骨和小梁骨BMD
使用配有XCT-960M(Stratec Medizintechnik，Pforzheim，德国)的外周定量断层显象(pQCT)，对已麻醉的大鼠评价近端胫骨的总密度。按照以下对已麻醉的大鼠测量基值和处理后值：将右后肢穿过直径25mm的聚碳酸酯试管，并以踝关节处于90°角和膝关节处于180°角捆绑于丙烯酸框架上。将聚碳酸酯试管固定于滑动平台，可保持其垂直于pQCT的缝隙。调节平台以使股骨远末端和胫骨近末端位于扫描视野中。以长度10mm和行分辨率0.2mm观察二维扫描视野。监视器显示扫描视野后，对胫骨近末端定位。从离该点3.4mm远处开始pQCT扫描。pQCT扫描是1mm深，voxel(三维象素)大小为0.140mm，且由穿过切片的145束投射组成。pQCT扫描完成后，显示器中显现图像。画出包括胫骨但除腓骨在外的目的区域的轮廓。使用迭代算法自动除去软组织。以mg/cm3报道剩余骨的密度(总密度)。通过减去处理后值和基值的总密度值，计算每个动物总密度的变化。
动物处理
用载体(盐水)和人PTH(1-34)、以40μg/kg体重的剂量处理4周龄的雌Wister大鼠八天。在施用PTH前，切除动物的卵巢(OVX)。OVX三周后，测量总BMD以确定是否出现骨量减少。一天一次皮下注射PTH，代表间歇施用PTH，而皮下植入具有40μg/kg/天的释放速率的渗透泵，代表连续施用PTH。八天的处理中，划破处理6小时后的动物，采集样品用于进一步分析。每个处理组包含8只动物。
实施例1
间歇施用PTH(1-34)对总BMP的效果
以间歇和连续性方式，对3周龄OVX大鼠以40μg/kg剂量八天施用PTH(1-34)，以分别诱导合成代谢和分解代谢PTH效果。如在 总的方法章节中所述，PTH的间歇施用表现为一天一次皮下注射PTH，而连续施用表现为皮下植入具有40μg/kg/天的释放速率的渗透泵。使用pQCT测量总骨密度。间歇注射PTH诱导总BMD的显著增长，ΔBMD为80gr/cm2(图1)。而在已有的骨量减少的骨中，连续施用PTH不诱导任何变化(图1)。因此，PTH依赖于其施用方式而对骨合成代谢和骨分解代谢发挥作用(即引起BMD下降)。
实施例2
RADE
间歇和连续施用后，分离来自骨样品的总RNA，并进行差异显示分析。24个差异表达基因被鉴定具有2倍或更多的差异变化。在来自间歇注射(图2)后的骨RNA中，诱导了来自RADE的PAIGB基因，而连续性PTH注射不诱导PAIGB表达水平的任何变化。参见图2A(泳道1、2、5、6)和2B(泳道1、3)，该基因的表达基础水平很低。我们的研究结果表明仅仅当以间歇方式施用PTH时，PAIGB表达才得以诱导。从RADE凝胶中分离代表PAIGB的DNA，并进行PCR。400bp带与来自RADE凝胶的PCR产物的估计大小十分相关。在T-A克隆之后，对400bp带进行测序并进行生物信息分析(BLAST search(NCBI))。最初的BLAST检索表明PAIGB与任意已知基因均不匹配。EST数据库检索鉴定出两条序列，一条来自大鼠Acc#AA850640，一条来自小鼠Acc#Al070533，其分别与PAIGB序列有98％和99％的同一性，因此进一步确认PAIGB是表达的基因。
实施例3
克降大鼠PAIGB
通过筛选脑λZAP cDNA文库(Startagene)以及使用5′RACE(Invitrogen)，克隆PAIGB的全长cDNA。对来自间歇PTH处理后的骨RNA样品，以及来自脑的RNA样品(最初对Clontech(CA)多重组织印迹进行的限制性RNA印迹分析，表明PAIGB在脑中表达)，进行三轮5′RACE。将最初放射性标记的PAIGB(400bp)用作文库筛选的探针。分离来自四组质粒的、含有不同大小插入片段的DNA，并从两个末端测序直至序列至少重叠100bp。在不同克隆之间，基于序列和比对结果获得含有ORF的2.2kb克隆。SEQ IDNO：1表示全长序列。
实施例4
克隆小鼠和人PAIGB
使用小鼠和人EST数据库，对大鼠PAIGB序列进行blast分析。在5’和3’末端鉴定出几个与大鼠PAIGB有98％的匹配的EST。人PAIGB的可读框(ORF)与大鼠和小鼠相比的DNA序列同一性为87％。此外，人PAIGB的氨基酸序列与大鼠和小鼠相比的同一性为82％。将大鼠PAIGB和小鼠的进行比较时，DNA序列在ORF区有95％的同一性，以及在氨基酸水平有97％的同一性。设计小鼠特异性引物(SEQ ID NO：29、30、31、32)，用于RT-PCR以克隆小鼠同源PAIGB(SEQ ID NO：7)。使用设计的内部引物克隆人PAIGB的1,086bp片段(SEQ ID NO：33)。随后从Invitrogen获得全长序列(SEQ ID NO：3)。cDNA克隆连同核苷酸序列一起，提供于pCMVSPORT6质粒中。比对人PAIGB序列和全长大鼠PAIGB序列，以评定同一性和相似性水平。
实施例5
人、大鼠和小鼠PAIGB的生物信息分析
来自人HOB O3-CE6 cDNA的人PAIGB序列(1,086bp，SEQ ID NO：33)用于检索公开数据库。使用Incyte LifeSeq Gold数据库(Incyte，Palo Alto，CA)检索到2824bp片段命中模板ID-474616.19。E值为0.0并且同一性为1093/1094(99％)。该片段编码145个氨基酸的蛋白。通过使用474616.19来对Celera人基因组序列数据库进行blastn，发现人全长PAIGB具有三个外显子，并且第一个甲硫氨酸位于外显子1中。
通过使用人蛋白序列对Celera小鼠基因组片段序列数据库进行blastn，找到了小鼠PAIGB。此外，测序全长大鼠克隆，并且该序列与人和小鼠直向同源物(orthologue)匹配。
为了确定转录起始区，从Celera数据库调出小鼠和人的5’端序列，并与大鼠序列三者两两比较。所有的三个物种中，第一个甲硫氨酸之前有段长的5’阅读框。使用474616.19对公开EST数据库进行blast，鉴定出ESTAU120917，其在5’末端多出了5bp且阅读框保持开放(期望值＝0.0，同一性＝740/744(99％))。然而，在高度同源于人5’转录序列的小鼠5’序列中，找到了终止密码子。这表明本申请人获得了在小鼠中的全长基因。图3和图4显示人、小鼠和大鼠的cDNA和蛋白的对比。
通过进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993)；也可参见www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，检索BLAST″nr″数据库(其包含所有非冗余性GenBank CDS翻译序列，和来自3维结构Brookhaven Protein Data Bank、SWISS-PROT蛋白序列数据库、EMBL和DDBJ数据库的序列)中的序列相似性，从而鉴定了所生成的基因序列。可利用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法，分析所得到的4.5×DNA序列。为了方便，此处以E值报道通过BLAST所计算的期望值，所述期望值代表cDNA序列与在检索的数据库中得到的序列仅偶然发生的匹配度。E值可评估匹配度的统计显著性，具体说明所给分的匹配数，所述匹配数是搜索该大小的数据库时完全偶然预期的匹配数。
实施例6
人和小鼠PAIGB剪接变体的鉴定和克隆
使用人和小鼠脑mRNA(Clontech，Palo Alto，CA)作为用于逆转录反应(Takara，Panvera，Shiga，日本)的模板，克隆人(SEQ ID NO：5)和小鼠PAIGB(SEQ ID NO：9)。使用人(SEQ ID NO：34、35)和小鼠(SEQ ID NO：31、32)的特异性引物、延长酶(elongase)(Invitrogen，Carlsbad，CA)以及补充GC Melt溶液(Clontech，Palo Alto，CA)，将逆转录反应物进行PCR扩增。PCR产物随后克隆入pCR Blunt II TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。克隆的序列包括人和小鼠PAIGB，其含有外显子1、3，但缺失外显子2。
实施例7
PAIGB表达的RNA印迹和RT-PCR分析
为确定来自RADE实验数据的结果，对来自受到间歇和连续注射PTH的大鼠胫骨的RNA样品，进行RNA印迹分析。如图2B所示，仅仅在来自间歇处理的大鼠的样品中检测到PAIGB表达，而在载体或受到连续PTH处理的大鼠中未检测出PAIGB表达。磷相仪(phosphorimager)分析表明，与载体处理的大鼠的胫骨RNA样品比较时提高36倍。此外，对商业性印迹法提供的样品进行多重组织RNA印迹。RNA印迹分析表明PAIGB在脑中大量表达，但在心脏和肺中很少表达。脾、肝、骨骼肌、肾和睾丸未见任何的PAIGB表达(图5)。
为了确定人和小鼠的PAIGB全长及类似物的表达模式，本申请人使用总的方法中描述的人和小鼠引物(SEQ ID NO：36、37、38、39)。使用来自24个人和小鼠源组织的Origene cDNA试验组。图6-7的数据表明：人和小鼠PAIGB的表达模式类似于在小鼠多重组织RNA印迹中所观察到的模式。在脑中高水平表达，而在心脏和肝中很少表达。此外，Origene试验组证实在成人肾上腺以及12.5和19天龄的胚胎样品中有PAIGB显著性水平的表达。这些数据显示了在胚胎发育后期中的PAIGB的表达。此外，数据表明在所检测的大部分组织中，全长PAIGB和外显子2剪接变体是共表达的。
实施例8
间歇注射PTH后对不同组织中PAIGB表达的效果
为了确定间歇施用PTH后，能否在脑、肾和心脏中也见到在骨中观察到的增加的PAIGB表达，在这些组织中也观察到PAIGB的表达，我们通过对来自组织的RNA进行实时PCR分析。如图8所示，在受测试的组织中，间歇注射PTH不能对PAIGB表达产生改变，表明对PAIGB表达的PTH效果是骨特异性。
实施例9
鉴定PTH处理前和处理后颅盖中的PAIGB表达-原位杂交
在受骨形成剂处理的多种动物物种中，包括人骨活组织检查样品，或来自小鼠、大鼠、狗的骨样品等，可评估PAIGB mRNA表达的原位杂交分析。以100μg/kg/天的皮下施用PTH 1-34或30天，对Swiss Webster小鼠进行处理。轻柔对切小鼠颅盖，并固定于4％低聚甲醛中。固定后，在TBD-2脱钙剂(Shandon Lipshaw，Pittsburgh，PA)中将骨脱钙7-8小时，然后在分级乙醇中脱水。随后垂直于穿过顶骨中心部的矢状缝，平行于人字缝和冠状缝，将颅盖对切，并包埋于石蜡(股骨和胫骨样品纵向包埋于石蜡)。切割4-6个5μm厚代表性的不连续的切片用于进一步分析。以苏木精和伊红(Shandon Lipshaw，Pittsburgh，PA)染色所选择的切片，并将邻近的切片用于原位杂交。通过用ECORI消化从pCR-Blunt II-TOPO质粒(Invitrogen)亚克隆小鼠PAIGB序列片段(398bp产物)(SEQ ID NO：40)并连接于pBluescript IISK质粒(Stragene)，制备用于原位杂交的探针。将Sal I位点用于线性化质粒，以随后分别用T3和T7 RNA聚合酶(Boehringer Mannheim)，以及0.5mCi的35S标记的α-UTP，生成反义和有义探针。以3×104cpm/μl的探针浓度进行切片杂交。严格洗涤后，将切片进行标准的放射自显影。使用Nikon显微镜在明或暗视野下评价mRNA的表达。如明和暗视野的图像所示，在PTH处理的小鼠骨外膜中，邻近于骨表面的成骨细胞的PAIGB得到诱导，而在OVX小鼠的颅盖中很少至没有PAIGB的表达(图9)。
实施例10
在对大鼠间歇施用PTH期间，PAIGB在骨中表达的时程
8天处理后，初始的实验测量了PAIGB在大鼠胫骨中表达。为了鉴定PTH作用于PAIGB表达的时程，对已间歇注射PTH(40μg/kg体重)的大鼠进行实验，并采集胫骨用于分离RNA以及评价BMD中变化。采集样品的时点是间歇施用PTH后的第6小时、第2天、第4天以及第8天。使用上述引物，对分离的RNA样品进行实时PCR分析。图10A所示的数据表明：在用PTH处理两天后，观察到PAIGB增长了大约20倍。在PTH处理后，在第4天和第8天也观察相同量级的PTH的作用。
在PTH处理的骨中所观察到增长的PAIGB表达，是剂量依赖型的(图10B)。对具有确定的骨量减少的OVX大鼠，进行5、10、20、40和80μg/kg体重的人PTH(1-34)增量浓度的处理，每天注射一次，连续8天。最后一次注射后6小时，划破动物，并采集骨样进行 实验步骤章节所述的RNA分离。PAIGB表达的实时PCR分析表明：5、10和20μg/kg的低剂量PTH对PAIGB表达没有任何作用，但40和80μg/kg的剂量分别带来10和20倍增长。这些数据与已公开的关于诱导骨形成(合成代谢PTH作用)的PTH剂量报道十分相关。
实施例11
PAIGB在骨中的表达
为了检查通过间歇PTH处理，PAIGB表达的变化是否与PTH对骨的作用有关，用PTH对来自大鼠的样品处理2、4和8天，并对样品进行总BMD和小梁骨(测量近端胫骨的小梁骨密度)的BMD测量。两天的PTH处理提高了PAIGB的表达。在相同时点，检测到小梁骨BMD的显著增加(Δ小梁骨密度：PTH处理的为6.98+/-17.90相对于载体处理的为-27.1+/-9.27)，而在总BMD中未有明显的变化(Δ总骨密度：PTH处理的为-9.15+/-2.94相对于载体处理的为0.69+/-4.10)(表1)。
间歇注射PTH的4天之后，PAIGB表达超过了载体处理大鼠的表达20倍。在相同的时点测量总BMD和小梁骨BMD。PTH可诱导总BMD(PTH处理的为10.56+/-3.11相对于载体处理的为-2.95+/-2.20)和小梁骨BMD(PTH处理的为8.70+/-9.98相对于载体处理的为-20.8+/-6.62)的显著增加(表2)。PAIGB在骨中的表达，与在PTH的间歇处理2天和4天后所观察BMD的变化十分相关(表1和表2)。
表1
在具有确定的骨量减少并卵巢切除的大鼠中，使用hPTH(1-34)对近端胫骨的总密度和小梁骨密度处理2天的效果
  处理   N   Δ总密度a   N   Δ小梁骨密度
  载体，sc(0.1％BSA：0.01％抗坏血酸(AA))   7   0.69±4.10   8   -27.10±9.27
  HPTH(1-34)，40μg/kg，sc   8   -9.15±2.94   8   6.98±17.90
a平均值(mg/cm3)+/-SEM
表2
在具有确定的骨量减少并卵巢切除的大鼠中，使用hPTH(1-34)对近端胫骨的总密度和小梁骨密度处理4天的效果
  处理   N   Δ总密度a   N   Δ小梁骨密度
  载体，sc(0.1％BSA：0.01％AA)   8   -2.95±2.20   8   -20.80±6.62
  HPTH(1-34)，40μg/kg，sc   8   -10.56±3.11*   8   8.70±9.98*
a平均值(mg/cm3)+/-SEM
*p＜0.05相对于对应的载体值
**p＜0.01相对于对应的载体值
实施例12
PTH处理ROS 17/2.8细胞
对表达PTH受体的ROS 17/2.8大鼠成骨细胞系(～80000受体/细胞)用以下PTH的增量进行处理：1nM、10nM、100nM和1000nM。使用大鼠特异性Taq-man探针和引物的实时PCR，用于检查受PTH处理后PAIGB表达的变化。如图11A所示，PTH的浓度增加可诱导在PAIGB信息中剂量依赖型的增加。
检查PTH诱导PAIGB表达的时程。用10nM PTH处理ROS 17/2.8细胞，并在处理后1、2、4、6、8和24小时收获RNA。PAIGB表达的最大增加是在第4小时的时点(2.66+/-0.3)。PTH对PAIGB表达的作用在处理后第8小时完全消失(图11B)。
实施例13
PTH调节PAIGB表达中涉及的信号传导途径
为了检测PTH调节PAIGB表达中涉及的信号传导途径，在存在或不存在SQ 22536(Calbiochem La Jolla，CA)即一种腺苷酸环化酶抑制剂和蛋白激酶C抑制剂(PKC)19-27即一种PKC信号传导途径抑制剂的情况下，本申请人使用受10nM PTH处理的ROS 17/2.8细胞。以200μM SQ 22536和10μMPKC抑制剂将细胞预处理2小时，并以PTH处理4小时。在此条件下，实时PCR用于检测PAIGB表达的变化。图12和13的PCK抑制剂和SQ22536所示的数据表明，由于PKC抑制剂对阻断PTH诱导的PAIGB具有很少或没有效果(图12)，所以PTH通过激活cAMP信号传导途径对PAIGB表达发挥作用。此外，通过SQ 22536化合物的预温育完全阻断了PTH对PAIGB的作用(图13)。这些数据与PTH 3-34的作用相一致，其中所述PTH 3-34对激活腺苷酸环化酶没有任何效果。
由于另一种G-偶联的蛋白受体(β-肾上腺素能受体)的激动剂(异丙基肾上腺素)仅使PAIGB表达增加2倍，而相比之下10nM PTH的诱导可增加6倍(数据未公开)，因此申请人显示PTH诱导PAIGB表达是PTH受体特异性的。使用福斯高林和磷酸二酯酶IV抑制剂咯利普兰，在ROS17/2.8和UMR 106成骨细胞中，观察到PAIGB表达的增加(数据未公开)，表明通过这些试剂而观察到的PAIGB表达的增加，是由于在细胞cAMP水平上的增加。总的来说，该结果表明PTH对PAIGB表达的作用是由cAMP介导的而非由PKC介导的。
实施例14
骨形成剂对PAIGB表达的作用
为了检查增加的PAIGB表达是否是PTH活性的直接结果或骨形成诱导的结果，在ROS细胞中测试不同的合成代谢试剂。用以下试剂处理ROS细胞：雌激素(10nM)、复合PTH的雌激素、单独的以及复合PTH的三苯氧胺(0.1μM)、降钙素(5ng/ml)、前列腺素E2(PGE2)(使用10nM和10μM的两种浓度)和地塞米松(100nM)。处理细胞4小时，并分离RNA用于实时PCR分析。此外，用BMP2(骨形态发生蛋白2)(300ng/ml)处理ROS细胞。BMP2的处理进行4小时和24小时。使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)，从处理的细胞系中分离细胞总RNA。通过DNA酶(Qiagen无RNA酶的DNA酶，Valencia，CA)的处理，除去基因组DNA污染物，随后根据生产商说明，使用Oiagen RNeasy试剂盒净化RNA。根据 总的 方法章节所述，对样品进行TaqMan分析。分析诱导PAIGB mRNA表达的试剂。
处理4小时后，雌激素、三苯氧胺、BMP2(骨形态发生蛋白2)和降钙素对PAIGB表达没有任何效果(图14)。即使在处理24小时后，BMP2也不能诱导PAIGB表达。PGE2仅以低剂量的PGE2诱导PAIGB mRNA的表达。此外，地塞米松处理可导致PAIGB表达的2-3倍增长。在UMR106细胞中，也观察到测试的骨相关试剂中的类似应答(图15)。然而，与ROS17/2.8细胞相比，这些应答强度在UMR106细胞中更强烈。此外，在UMR106细胞中，维生素D3(VitD3)和较低程度的BMP6可诱导PAIGB表达。已知PGE2、维生素D3和地塞米松可诱导cAMP的积累，这样可解释为何PAIGB表达受这些试剂的诱导。总的来说，这些数据明显证实：由于其它已知的合成代谢试剂对PAIGB表达的作用较小，因此PAIGB诱导优选是通过PTH对成骨细胞的合成代谢作用介导的。
实施例15
在人U2OS成骨细胞中，通过PTH 1-34诱导PAIGB表达
使用1或10nM PTH 1-34处理人U2OS成骨细胞和大鼠UMR 106细胞。使用人外显子2(SEQ ID NO：41和42)和大鼠PAIGB(SEQ ID NO：43，44)的引物进行的RT-PCR分析，表明与对照大鼠UMR 106成骨细胞相比，人U2OS成骨细胞中PAIGB表达的诱导(图16A)。图16B表明如实时PCR测量的、U2OS细胞中PAIGB表达的诱导作用。这些结果表明PTH 1-34能在人成骨细胞中诱导PAIGB表达。
实施例16
鉴定可诱导PAIGB mRNA的试剂
对诱导PAIGB mRNA表达的试剂的高通量筛选，包括处理间充质细胞谱系细胞。这些细胞是具有小分子化合物(一般是10-30μM)、天然产物或基于肽的化合物的非分化干细胞、前成骨细胞或成熟成骨细胞。细胞在含有10％ FBS的生长培养基中处理4至18小时。除去培养基，用PBS洗涤细胞，随后使用RNA自动提取仪(如Applied Biosystems PRISM 6700)分离总RNA。1×106细胞的RNA一般产量是20μg总RNA。分离RNA之后，如总的方法章节所述，通过实时PCR(Taq Man分析)分析约100ng RNA。
实施例17
PAIGB蛋白表达和使用抗体检测生骨表达表达或骨合成代谢活性
图17的蛋白印迹显示：如v5单克隆抗体(Invitrogen)的免疫印迹所示的，在U2OS成骨细胞中标记的全长PAIGB-v5蛋白(外显子1、2、3)的表达。图18显示PAIGB多克隆抗体检测PAIGB蛋白的能力。图18表示从转染了人PAIGB ORF(即含有外显子1、2、3的全长序列，SEQ ID NO：3)的U2OS细胞中分离的核和细胞质提取物的蛋白印迹。泳道2、4、6和8是来自PAIGB转染的细胞的提取物，而泳道1、3、5和7是来自对照质粒细胞的提取物。泳道1、2、5和6是细胞质提取物，而泳道3、4、7和8是核提取物。如泳道6和8和箭标所示，与PAIGB多克隆抗体(针对SEQID NO：11产生)免疫印迹的泳道5-8，显示对PAIGB的特异反应性。泳道1-4是用作为对照的免疫前血清进行蛋白印迹的。具体地说，图17和18中，在100mm皿中以3.1×106细胞接种U2OS细胞，24小时后使用稀释于OptiMEM(Invitrogen)的10μg人PAIGB ORF载体或对照载体(pcDNA3.1-v5标记的，Invitrogen)，通过Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行转染。收集条件培养基，并如以前所述制备细胞质和核提取物(Henry B.Sadowski和Michael Z.Gilman.Nature.362：79-83.1993.)。简要地，将冷的低渗缓冲液(20mM HEPES pH 7.9、20mM NaF、1mM NaH2PO4、1mM EDTA、1mMEGTA、1mM二硫苏糖醇、0.5mM苯甲磺酰氟以及哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma cat.8340))与0.2％ NP40一起加入培养皿中以溶解细胞。以16,000xg离心样品20秒以沉淀核。上清液加入5M NaCl以得到终浓度为120mM NaCl。然后以16,000xg离心样品20分钟，并向上清液中加入甘油(终浓度10％v/v)。将样品中核的沉淀部分重悬于溶于0.2％Nonidet P 40(NP40)中的高渗缓冲液(含420mM NaCl和20％甘油的低渗缓冲液)(Sigma，St.Louis，MO)。沉淀在高渗缓冲液中于4℃温育30分钟，并以16,000xg离心20分钟，收集上清液。在12％Bis Tris SDS-PAGE(Invitrogen)中，每泳道跑上14μg总蛋白，进行蛋白印迹分析，随后将蛋白转移至硝酸纤维素(Invitrogen)。使用抗兔Western Breeze试剂盒(如生产商所述，Invitrogen)，以1∶1000稀度的v5单克隆抗体或5μg/ml纯化的PAIGB兔多克隆抗体，进行免疫印迹。
实施例18
通过免疫荧光显微镜和流式细胞仪的免疫组织化学方法，分析PAIGB 蛋白的表达
为了进行PAIGB蛋白表达的免疫组组织化学学分析，细胞在Labtek 2或Labtek 8孔室载玻片(Nunc)中以2×104至5×104细胞进行接种(图19)，并于生长培养基中过夜培养。抽取培养基后加入新鲜培养基，随后使用如实施例17所述的商业化试剂以PAIGB cDNA进行瞬时转染。温育24-48小时后，细胞用冷的TBS(Tris缓冲盐水)洗涤3次，并随后用冷的甲醇固定30分钟。样品于室温风干5-10分钟，再以TBS漂洗3次。样品用Vectastain(Vector Laboratories，Burlingame，CA)ABC-AP封闭血清的TBS溶液室温封闭20分钟，然后用含1％BSA的TBS漂洗。然后将样品和已稀释于DAKO抗体稀释剂(DAKO Corp.Carpinteria，CA)的2.5μg/ml的第一抗体，室温温育30分钟。随后样品在TBS中洗涤3次，并和稀释的生物素化第二抗体(VectorLaboratories)温育30分钟，然后在TBS中洗涤。如生产商所述，将样品在Vectastain(Vector Laboratories，Burlingame，CA)ABC-AP试剂中温育30分钟。如生产商所述，然后用TBS洗涤样品，并通过样品与碱性磷酸酶底物(Vector Laboratories，Burlingame，CA)温育来观察染色。
实施例19
体内免疫组织化学方法
在多种动物中评定PAIGB蛋白表达的免疫组织化学分析，如人骨活组织检查样品、小鼠、大鼠或狗的骨样品等，这些样品都经过潜在的骨合成代谢剂的处理。例如，以20μg/kg/天对颅盖皮下施用PTH 1-34，来处理Swiss Webster小鼠18天。18天后，收获颅盖样品，并用PAIGB多克隆抗体分析PAIGB蛋白表达(图20、图21和22)。使用20×物镜，图20显示PTH 1-34在颅盖骨髓腔的骨外膜和骨内膜诱导PAIGB。使用100×物镜，图21显示，PTH 1-34主要在成骨细胞中诱导PAIGB蛋白的表达，所述成骨细胞邻近于颅盖骨外膜中的骨表面。使用100×物镜，图22显示，在邻近于骨内膜骨表面的成骨细胞中、而非骨髓腔的基质细胞中，发现PTH诱导PAIGB蛋白的表达。
轻轻切开小鼠颅盖，固定于10％磷酸盐缓冲的福尔马林中。固定后，在TBD-2脱钙剂(SHANDON，Cat.#6764003)中将颅盖脱钙7-8小时，然后在分级乙醇中脱水，并包埋于石蜡中。随后垂直于穿过顶盖中心部的矢状缝，平行于人字缝和冠状缝将颅盖对切，并包埋于石蜡。切割4-6个5μm厚代表性的不连续的切片用于进一步分析。用苏木精和伊红染色(H&E)(Sigma，St.Louis，MO)各个切片，并将邻近的切片用于免疫组织化学分析。然后将骨样品在二甲苯中脱蜡，并在分级乙醇和PBS中再水化。用0.3％H2O2/甲醇室温处理切片30分钟，然后于37℃用蛋白酶K(Invitrogen)消化30分钟。用普通马血清封闭30分钟后，将切片与兔多克隆抗体(其针对氨基酸序列RADAIEPRYYESWTRE(SEQ ID NO：11)而产生，其识别人、大鼠和小鼠PAIGB蛋白)于4℃温育过夜。用PBS洗涤切片3次，每次10分钟。使用生物素化第二抗体(马抗兔)和抗生物素蛋白链接的过氧化物酶试剂盒(Vectastain Universal Elite ABC试剂盒，PK-6200，VectorLaboratories)，测定抗体结合表位。对照包括抗体-过氧化物酶试剂盒中的样品，但没有PAIGB多克隆抗体。使用过氧化物酶底物试剂盒DAB(SK-4100，Vector Laboratories)检测过氧化物酶。
实施例20
PAIGB蛋白水平的定量分析
对于基于竞争性的ELISA测定，使用溶于0.5M NaHCO3 pH 9.5的、10μg/ml PAIGB的单克隆抗体或多克隆抗体，于4℃过夜涂覆96孔平板。然后用含0.05％ Tween 20(TBST)的TBS将孔洗涤2次，再用含1％ BSA的TBST于室温封闭1小时。然后用TBST将平板洗涤3次。将未知样品和PAIGB蛋白标准(稀释于TBST)加入合适的孔中，随后加入固定量的生物素化PAIGB蛋白。室温温育2.5小时后，用TBST洗涤平板3次。然后加入抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶Vectastain ABC试剂(Vector Laboratories)，室温温育1小时。用TBST洗涤3次后，如生产商所述，每孔加入3，3′，5，5′-四甲联苯胺(TMB)底物(Vector Laboratories)。10-20分钟后，用4M H2SO4终止反应，并用标准平板读数器读出450nm的吸收度。
通过对PAIGB蛋白进行碘化(125I)而不是生物素化处理，修饰竞争性ELISA以进行RIA。在此方式中，如上所述，将未知样品或未标记的PAIGB蛋白标准样品置于合适的孔中，随后加入固定量的125I PAIGB蛋白。温育2.5小时后，洗涤平板，并使用标准γ计数器计量剩余的放射性强度。
此外，使用PAIGB的两种抗体来开发基于夹心的ELISA，所述两种抗体识别两个不同的表位。在该实例中，方法类似于上述具有如下修饰的ELISA分析。在使用合适的单克隆或多克隆PAIGB抗体涂覆96孔的平板以及使用含封闭缓冲液的BSA封闭平板之后，在合适的孔中加入未知样品和PAIGB标准，室温放置2.5小时。洗涤平板，随后加入第二PAIGB抗体(该抗体识别不同表位，并且该抗体是示所涂覆抗体不同的种类)，室温放置1小时。洗涤平板，随后加入复合了辣根过氧化物酶(Vector Laboratories)的第二抗体(抗兔或抗小鼠)，室温放置1小时。洗涤平板，按照如上所述加入TMB底物。停止反应后，使用标准平板读数器读出平板在450nm的吸收度。
实施例21
PAIGB相互作用蛋白-质谱分析
为了鉴定PAIGB功能涉及的蛋白或与PAIGB多肽相互作用的蛋白，以及进一步确定这些配偶体蛋白如何调节PAIGB活性，可使用本领域已知的多种方法，例如双杂交和/或免疫沉淀法。例如，进行一组免疫沉淀pulldown实验，随后对复合物进行质谱分析。
对于这些实验，PAIGB在成骨细胞系中瞬时超表达。简要地，如生产商所述，用V5标记的PAIGB表达质粒和Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)，一起转染在150mm皿中培养到95％汇合的U2OS成骨细胞。转染后48小时，以冷的PBS漂洗细胞2次，并使用由以下成分组成的裂解缓冲液收获细胞蛋白：50mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、1％NP40和哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂混合物I和磷酸酶抑制剂混合物II(Sigma，St.Louis，MO)。将细胞的裂解物(0.5ml)于4℃、3,000rpm离心10分钟。以每1mL裂解物加入250μl的琼脂糖凝胶CL-4B(Sigma，St.Louis，MO)预先净化裂解物。将样品在定轨旋转器中于4℃温育30分钟，然后于4℃、3,000rpm离心10分钟。
为进行免疫沉淀，将上清液转移入新试管中，并将每1mg蛋白提取物80μl的抗V5缀合的琼脂糖(Sigma，St.Louis，MO)加入样品中，在定轨旋转器中4℃温育1.5小时。将样品以4℃、1,000rpm离心1分钟，并弃去上清液。琼脂糖沉淀用含350mM NaCl(1ml/100μl树脂)的细胞裂解缓冲液洗涤3次，随后于4℃、1,000rpm离心1分钟。然后样品在免疫沉淀(IP)缓冲液中洗涤3次(1mL/100μl初始树脂体积)，每次洗涤于4℃、1,000rpm离心1分钟。在最后的洗涤之后，去除上清液，直至小珠上面剩余约10μl。相互作用蛋白在以1mg/ml的终浓度含V5肽(Sigma，St.Louis MO)(在1％乙酸中重建)的IP缓冲液(等体积于初始树脂体积)中进行洗脱。样品于定轨旋转器中室温温育60分钟，随后于室温、1,000rpm离心1分钟。收集含有PAIGB相互作用蛋白的上清液。
在总体积1.4ml中，使用过量V5肽，从抗V5亲和基质中，洗脱V5标记的PAIGB蛋白复合物。以相同方式处理未含PAIGB的对照转染产物，获得1.4ml的对照样品。通过添加DTT和SDS将样品还原和变性，以在随后的浓缩步骤中，使得可从复合物中分离释放蛋白并抑制沉淀形成及抑制蛋白与膜结合。对于还原/变性，将溶液制成20mM的DTT并随后添加8μl的10％SDS，并于37℃温育20分钟。用Microcon 3离心超滤仪器(Amicon，Beverly，MA)将样品浓缩至40μl。浓缩后，加入含有50mM DTT和20mM巯基乙醇酸钠的10μl的5×SDS Laemmli加样缓冲液，并将溶液于37℃温育20分钟。
为了从PAIGB复合物中分离蛋白，在8-16％Laemmli SDS凝胶(HoefferMedium Format，14cm×14cm，凝胶来自Jule Inc.)上分离浓缩的样品(PAIGB和对照)。使用质谱信息回收的优化方法，对固定凝胶进行银染(Shevchenko等，Anal Chem.1996 Mar 1；68(5)：850-8.)。在一个实验中，PAIGB和对照样品的全部泳道，分割成40条凝胶带。通常，切下对照泳道的带以及PAIGB样品泳道的带。
为了对蛋白进行消化、质谱分析和蛋白鉴定，从凝胶上切下蛋白带，并使用凝胶消化自动设备(Abimed，Langenfeld，德国)自动还原、烷基化、消化蛋白带。然后从凝胶上洗脱并浓缩胰蛋白酶肽(SpeedVac，SavantInstruments)。将20-30％浓缩的胰蛋白酶消化产物注射至微细管C18柱(75um×10cm)，直接洗脱至Finnigan DECA Xp离子阱质谱仪(ThermoFinnigan，San Jose，CA)中。使用配有分流器的ABI 140C系统，送递HPLC梯度级分，以将柱的流速降低至200纳升/分钟。使用FAMOS自动进样器(LC Packings)，自动进行注射加样。以数据依赖型模式运行离子阱，其中肽在自动引发收集该肽的CID数据的完整扫描中得以检测。可使用具有动力排斥特点的附加软件。在这种模式中，一旦肽作为CID的靶，即被添加到应舍弃的列表中，以用于运行额外2分钟来防止重新获得重复性光谱。一般地，在一个60分钟的LC-MS-MS实验中，可收集1000个碎片的光谱。每条凝胶带产生单独的LC-MS-MS文件。使用在PC组上运行的SEQUEST搜索算法，对多个NCBI蛋白数据库(非冗余性蛋白数据库和翻译的Unigene Cluster数据库)检索LcQ数据文件。
实验中用到的数据库包括非冗余性NCBI蛋白数据库(NR)和翻译的Unigene Cluster数据库。对于来自一般实验的所有凝胶带，该方法在数据中以各种精确度获得了几万个与肽条目匹配的光谱。Sequest使用交叉相关系数(Xcorr)作为精确度的度量。使用基于Oracle的软件，将与数据库中Xcorr＞2.0的肽条目匹配的光谱，装配成代表鉴定的蛋白的共有组。通常，尽管对蛋白鉴定了几个Xcorr＞2.0的肽，但该蛋白还是一个确信的赋值。一些显著的蛋白被超过40个代表肽捕获。对于这样的差示实验，所有对照泳道中所检测的数百个蛋白的全部集合，从在PAIGB样品中所发现的那些蛋白减去。结果是一列样品中特异性检测的蛋白，其通过推理直接与PAIGB相互作用。
实施例22
评估PAIGB转基因小鼠
开发以骨组织特异性方式超表达PAIGB的转基因小鼠。所述开发通过使用3.6kb I型胶原启动子驱动大鼠的PAIGB转基因表达而得以实现。我们开发了两种PAIGB转基因构建体，一个含有PAIGB可读框和1.6kb 3′UTR，另一个PAIGB转基因含有可读框。这里我们证实在小鼠C57/BL6品系中有两个PAIGB转基因系，指定一个为系2(来源于全长cDNA转基因)，而指定第二个为系54(来源于可读框)。小鼠的组织学表征包括分析PAIGB蛋白的表达以及在颅盖骨切片中碱性磷酸酶的活性。如实施例19所述，对PAIGB转基因小鼠中PAIGB蛋白表达进行免疫组织化学分析。使用Vector Red(Vector Laboratories，Burlingame，CA)染色法，对颅盖切片中的碱性磷酸酶活性(AP)进行组织学分析。简要地，将固定于70％乙醇的小鼠顶骨切成6μm切片，随后用PBS洗涤，然后用0.1M Tris-HCl pH 8.2缓冲液进行洗涤。如生产商所述，将切片用Vector Red底物于37℃染色30分钟。
通过收获每只小鼠的胫骨以及去除骨剩余的软组织，可获得来自小鼠骨总RNA的PAIGB mRNA表达。切去骨的最远端和最近端，并用注射器以PBS漂洗骨髓腔。合并每只小鼠的两根胫骨，并通过置于液氮中然后用粉磨机研磨，将骨制成细粉末。细粉末转入试管，加入0.3ml变性溶液(Ambion，Austin TX)，并置于冰上。将样品匀浆30秒，然后于4℃、12,000xg离心10分钟，收集上清液。如前所述，用变性溶液再次提取沉淀，然后离心。合并两次上清液，加入1.1体积的Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)，室温温育5分钟。每份样品中加入氯仿(0.2ml/1ml Trizol)，剧烈振荡15秒，然后室温温育2-3分钟。以4℃、12,000xg离心样品15分钟，上层的水相转入新试管中，并向样品中加入1μg糖原(Ambion，Austin TX)。加入一体积异丙醇，于-20℃温育24小时。于4℃，以最大转速离心样品20分钟，然后用70％冷的乙醇洗涤沉淀。再次离心样品，并弃去上清液，将样品重溶于水中，随后进行DNA酶(Ambion，Austin TX)处理。使用合适的大鼠PAIGB引物(SEQ ID 45、46)和探针(SEQ ID 47)，进行实时RT-PCR。
图23表示如实时PCR所示，与非转基因对照相比，杂合小鼠系2和系54超表达PAIGB mRNA的实例。如图24所示，与同窝出生的非转基因对照小鼠相比，系2(全长转基因)PAIGB杂合小鼠在颅盖骨外膜中超表达PAIGB蛋白。同样应该指出的是，与非转基因对照小鼠相比，PAIGB蛋白超表达还发生在杂合小鼠颅盖的矢状缝区(图25)。PAIGB蛋白增加的结果，导致与非转基因对照小鼠相比，杂合小鼠的颅盖骨外膜及骨内膜的碱性磷酸酶活性得以提高(图26)。此外，与非转基因小鼠对照相比，碱性磷酸酶活性的提高也与杂合小鼠颅盖厚度的增加有关联。在杂合的PAIGB超表达的小鼠中所示的碱性磷酸酶活性的提高和颅盖厚度的增加是骨合成代谢表型的指示。在第二种PAIGB转基因小鼠系54(可读框转基因)中也证实：这种合成代谢作用包括碱性磷酸酶活性的提高和颅盖厚度的增加(图27)。
实施例23
评估PAIGB功能的PAIGB压低(knockdown)技术
小分子干扰RNAs(siRNA)的用途是转录后沉默目的基因表达的序列特异性方法(综述参见Gregory Hannon.Nature 418：244-251.2002)。近年来，在哺乳动物系统中成功开发了该技术以用于分析基因功能(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.，Yalcin，A.，Weber，K.，Tuschl，T.Nature 411：494-498.2001.Yu，J.Deruiter，S.L.，Turner，D.L.PNAS 99：6047-6052.2002.)。因此，PAIGB siRNA用于估计PAIGB表达的阻断对成骨细胞机能及基因表达的作用。例如，在所示时点收获分别转染了PAIGB siRNA 24、48和72小时的成骨细胞，并测量骨形成标记在mRNA水平和蛋白水平的表达，所述标记例如碱性磷酸酶、骨钙蛋白和I型胶原。此外，类似的实验进一步扩展为包括通过使用Affymetrix基因芯片技术(Affymetrix，Santa Clara，CA)，分离RNA以用于随后的表达模式分析。由此引起的表达模式可鉴别除了PAIGB可能调节的PTH途径之外的多种信号转导途径。类似的实验也可于存在和不存在PTH 1-34时得以进行。由于PTH 1-34诱导PAIGB表达，有人预测在用PAIGB siRNA处理PTH之前，转染成骨细胞将阻断PAIGB表达的诱导作用。结果，如果没有其它功能性冗余的PAIGB样基因，那么PAIGB siRNA将阻断PTH对其靶基因的作用(例如MMP13、连接蛋白43、I型胶原和碱性磷酸酶(Swarthout，J.T.，D′Alonzo，R.C.，Selvamurugan，N.，Partridge，N.C.GENE，282：1-17.2002))，如果PTH诱导的这些基因的调节作用是依赖于PAIGB的表达的话。
除了确定PAIGB对成骨细胞机能的重要性之外，使用PAIGB siRNA还可评价PAIGB对成骨细胞增殖和细胞凋亡的影响。PAIGB是PTH信号传导的下游靶，并且已知PTH影响成骨细胞的数量和细胞凋亡，以及PTH是促进骨形成的重要因素(Stavros C.Manolagas.Endocrine Reviews.21：115-137，2000.Tashjian，A.H.，Chabner，B.A.J.Bone Miner.Res.17：1151-1161.2002)。在存在和不存在PTH 1-34以及在多种成骨细胞和基质细胞系的情况下实施类似于上文所述的实验。如本申请前述，分析成骨细胞或基质细胞的数量以及细胞凋亡。基于在PTH诱导的骨合成代谢信号传导中的作用，PAIGBsiRNA可阻断PTH对成骨细胞数量和细胞凋亡的作用。
用于大鼠和人PAIGB(SEQ ID 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63)的多条21个核苷酸的siRNA，作为进一步研究PAIGB在骨细胞机能中作用的工具得以开发。类似于以前所描述的(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.，Yalcin，A.，Weber，K.，Tuschl，T.Nature，411：494-498.2001.)且基于以下标准，选择siRNA：1)G/C含量为35-55％，2)不超过4个连续相同的碱基，3)在BLAST检索中该序列是唯一的和4)已确定该序列具有形成二级结构(环和发夹结构)的最小潜力。
为了siRNA的瞬时转染，转染前一天成骨细胞以在生长培养基中约80％的汇合铺平板。在转染的当天，例如在6孔平板中，将siRNA(10-100nM)加入含1ml无血清基本培养基的试管中，随后加入4μl至7.5μl的Transfast(Promega，Madison，WI)或如生产商所述。也可使用其它转染试剂，例如Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)和Ribojuice(Novagen，Madison，WI)。加入Transfast后，将样品于室温温育30分钟。温育的同时，除去细胞上的生长培养基，并用无血清基本培养基进行替换。温育30分钟后，除去细胞上的基本培养基，然后将含有siRNA的混合物加入细胞中，并于37℃温育4小时。然后除去转染混合物，并用生长培养基替换，温育过夜。第二天在多个时点使用或不用PTH 1-34(1-100nM)处理细胞，所述时点依赖于实验终点如前所述是基因表达还是细胞数量或细胞凋亡分析。
                             序列表
<110>Robinson，John Allen
    Stojanovic-Susulic，Vedrana
    Babij，Philip
    Murrills，Richard John
<120>新的PTH应答基因
<130>AM100401
<150>US 60/425,532
<151>2002-11-12
<160>63
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>2146
<212>DNA
<213>大鼠
<400>1
ccgggctgag ccgcagccgc agccgcaagc cgaacggccg ctgggcgcgc ccgcaacagg      60
ggaggatggg ctgcggcggg agccgagccg atgccatcga gccccgctac tatgagagct     120
ggacccggga gaccgagtcc acctggctca cctacaccga ctcggacgcg ctgcccagcg     180
ccgcagccac ggacagcggc cccgaggcgg gcggcctgca cgcgggtgtg ctggaagacg     240
ggccgtcctc taacggtgtg ctccgacctg cagccccagg tggaatagcc aacccagaga     300
agaagatgaa ctgtgggacc caatgtccca actcacagag cctcagctca ggccctctga     360
cccagaagca gaatggcctt tggaccacag aggctaaaag ggatgccaag cgaatgtctg     420
caagagaagt cgctatcagc gtcacagaga atatccggca gatggacaga agtaaaaggg     480
tcacaaagaa ctgcatcaat tagcagtgtc tgggtgtgga agcacatgaa cttctttgtg     540
gcgtccagtc aaagaatatt gaagaagtgg gtgtcactca ctgaacgtgg atgcctctga     600
gcgacgcacg gccacccacg cggtgacgac catcccggtt tcctgtttat cacatacaga     660
aaatacatcg aaaagtcctg gaatatgttc acagattgcc aaactatggt ttgtttttcc     720
tctctgcagc ttccgtagca gggtctgctg taaccatggt gaagcccgtg ggcctgtgaa     780
tgaatattgg aatccccggg gcaaggagct cacgctagcg tagaaatttc acagtgcgtg     840
gtttcggaca agctcccttt tcctcctttc tttttaaata cggccattgt tttcacttaa     900
gagctggctc tcaccaactc taaactcaaa aatacaagaa tcagagaaac agagagactc     960
agaatgagat tcatcagtcc tagcttcacg tgctgactcc ccggtgccta tgcggtgcct    1020
ttaggaggtg tctatgacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac    1080
acacacctgt tcctcctcta cctggaaagg tctcccaggc tggcatcagg cattggcttc    1140
cgaatcacaa tgtcacatgt ttggggccct tgcacccaac ctgcacccgc tttgggacct    1200
agctccatgt ggcttttccc atagctttct agttccctgt tcttctcatg gactttgtac    1260
tccagtcagg tcatttgcag ctgtaatcaa agactggaca ccactcccgg gggaaggtga    1320
cctaggaaca catggtgaca cacacgatgc ccccttggcc tttctgtaca cagccccaag    1380
gaccgtgtta ttttggtatc tgcaaagcaa ttagtttgga aagccagagc ctggttgatg    1440
tatattcctg ctgacatcag accaagaagg cactgtattg gaaagcaggc agccaacaca    1500
gccaagccat gctctgatat ggaccctttc cccacattcc taaacacatc ctcctgcaaa    1560
gtatggcaca gcctgagttt gaaaggaccg ttcacttgct tgggcttatt aaaggtatag    1620
tccaagttgt gtcaaactgt atcaacagac tccacatcta gcagcaagag cagtctggtg    1680
acatgtttat acgacacagt ccaagagaag taacctaagc gggctaaaat gcagatgctc    1740
acgcctgtct ctgaagtgat ttctccaaca cagacagaac tgtaaactgt gcgtttattc    1800
gtattaaaat tcactgccaa tcttgtgcca gctacagtaa cagacacaga gggggttgga    1860
gtctggcagt cacgaccgta catctgactc tatggggagg cttgagactc aggagaatga    1920
cctgaaccct gcggcacagg accaaccatt gcagtggaat ctcacttcta ggttaaaggt    1980
agctttctat ccatcgcaaa tgtatgtctt ctcctctgcc rtgtagacta cagttttccc    2040
caacctctct caccttgact ccttgtcaaa gggcttttag ggaacttcat gttctgacaa    2100
tttaactaat aaaacaaaag caagccccgt gaaaaaaaaa ccgggc                   2146
<210>2
<211>145
<212>PRT
<213>大鼠
<400>2
Met Gly Cys Gly Gly Ser Arg Ala Asp Ala Ile Glu Pro Arg Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Glu Ser Trp Thr Arg Glu Thr Glu Ser Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Asp
            20                  25                  30
Ser Asp Ala Leu Pro Ser Ala Ala Ala Thr Asp Ser Gly Pro Glu Ala
        35                  40                  45
Gly Gly Leu His Ala Gly Val Leu Glu Asp Gly Pro Ser Ser Asn Gly
    50                  55                  60
Val Leu Arg Pro Ala Ala Pro Gly Gly Ile Ala Asn Pro Glu Lys Lys
65                  70                  75                  80
Met Asn Cys Gly Thr Gln Cys Pro Asn Ser Gln Ser Leu Ser Ser Gly
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Gln Lys Gln Asn Gly Leu Trp Thr Thr Glu Ala Lys Arg
            100                 105                 110
Asp Ala Lys Arg Met Ser Ala Arg Glu Val Ala Ile Ser Val Thr Glu
        115                 120                 125
Asn Ile Arg Gln Met Asp Arg Ser Lys Arg Val Thr Lys Asn Cys Ile
    130                 135                 140
Asn
145
<210>3
<211>2847
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
gcccggacta ggggcggcgg gcaccgcagg agctccgcgc ggctgcagcg cgggcgggag      60
cggggacgcg atgtcgccgc cgccgcctcc ttgcgggccg gggctgcgcc tccggggctg     120
agccgccgcc agagccgaca gccgagcagc cgctgggcgc tcccgcggcg caggaggatg     180
ggctgcggcg ggagccgggc ggatgccatc gagccccgct actacgagag ctggacccgg     240
gagacagaat ccacctggct cacctacacc gactcggacg cgccgcccag cgccgccgcc     300
ccggacagcg gccccgaagc gggcggcctg cactcgggca tgctggaaga tggactgccc     360
tccaatggtg tgccccgatc tacagcccca ggtggaatac ccaacccaga gaagaagacg     420
aactgtgaga cccagtgccc aaatccccag agcctcagct caggccctct gacccagaaa     480
cagaatggcc ttcagaccac agaggctaaa agagatgcta agagaatgcc tgcaaaagaa     540
gtcaccatta atgtaacaga tagcatccaa cagatggaca gaagtcgaag aatcacaaag     600
aactgtgtca actagcagag agtccaagca gaagggcaga tggacttctt cagtgtcctt     660
cacggcactg gatcccatca aagaaccttg aagaagtggc tgccccttgc tggacctgaa     720
ttctactgag tccctggcaa gactgtctta cctggcagca aactgctgcc tgatttgttg     780
ggaccttctg agccttctac ttatcatgta aatgtattgg cacagtgctt acatatgtta     840
ataaactgca aatgtgcagt tcagtttgtc tctttgcaac tcctgtaata cggtctggtg     900
taaaagtagt gagttaaagc tacaggtcag tttatgaaac agaaaagtag gaatgcattt     960
tctgggtgaa agagtcacac cttagtgcta taactctcct gcccatgata gtgtattctg    1020
tttcaggcaa gcttattctt tccttctttc attttaaata ttgtcattac aaatcttacc    1080
aggttcactt aaaagctggc tttcatccaa ctctaaaccc acatattgaa aaaatcaagg    1140
tacaggaaaa ctccttgtta tccttgtttc cttagcttgg tatgagacag atcggatcca    1200
gtttcccatg caccaaccca ctgcccatgg catgtctttg ggaggtgtct gtgaagcagt    1260
catacctgct cctcatctgc ctggaaagtc ctcctattcc agtgtccatg ttggcctcca    1320
gtccttaatg tcaccatgct tgtggccaat gcatccaaat aaggataccc ctcagggctc    1380
agctagacat tgcaattttg catagctttc cagttccctt tgcttgtctt cttgactgtt    1440
ttccctctct atcggggtca cttgcaattg ttaatcaaag attgaacact gcgtaggaga    1500
gggagatgat ccagagacat gtggcagcag gcatggcttc cccttggcct ctctgtacac    1560
tgccccagga ctgtcatttt ggcatctgca aaggaatcac tttagaaagc cagcacctgg    1620
ttgatgtgta ttcatactga cattagattg atgtgcactg cattagaaat gaggtagctg    1680
acacagaaaa aggatgtttt gataggaata attttctagt atgtcttgaa acatgttcat    1740
ctggaagtat tttcctccaa agtaatgtag catgattttt caaggattgt taacatgcct    1800
gggattggga aagataggac taaagttgtg ccaaactata tcaataaatt ccatgtttag    1860
cagaaatagg cagcctattg gtgttatgtt tatgtaacat agtccagaga actgacatgc    1920
aggtcaaaag tcagatacgc aacctcctta tctgctaact ctgttattct tcaaacacaa    1980
gtgggtagtg tcatttttcc ttccttcctt ccattggcag attgtatatt tattcacaaa    2040
acattaaatg tccatcctgt gccaggtact atgcagatgt tgagggattt ggggtctggt    2100
tagtcgtgac tatctatcct gaatctaaca gtgacttcat aactaggaga ctgaattaga    2160
cccttaaggt atagtgtgtg ttgcaaatca ctctgcaatg gaaactttta tattcagggt    2220
aggtttgtgt cttaaactag gtgttctaat caatgtacaa gactttacca tacacgcaac    2280
tttagttttt ctaaaccttc atcattttgt gattctttga gaaagggctt ttaggaactt    2340
tatgttctaa aaaatgtttt taacaataat aagataaaag aaaaacctgt gattcatatg    2400
tccccactgg cattactcag caggagcccc cagctgccaa aggttggcag tgatcctgca    2460
agttcaaggg ctctttctcc ctggggatgt gctttgtggc ttctctttac agctttgttt    2520
ctgcatcagt tcactgctgc atgttgtttg gaatttatca ccttaagaaa gtgtctctgt    2580
tttatataga aacactttct cacttacagg ggagaaggaa atgcagggca catgatctgg    2640
ccctccccag aacaatctgg atttcacgga gacagcaacc agaagttaaa ccatgtgact    2700
aaaaatgcat ctggctactt tttcatgtat gtatgagaca gaaactaatc cttactatcc    2760
tattaggata ccacttttca ttgcaaagtt tgtgtcaata aagtcattaa ttttaaacat    2820
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaag                                        2847
<210>4
<211>145
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Met Gly Cys Gly Gly Ser Arg Ala Asp Ala Ile Glu Pro Arg Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Glu Ser Trp Thr Arg Glu Thr Glu Ser Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Asp
            20                  25                  30
Ser Asp Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ala Pro Asp Ser Gly Pro Glu Ala
        35                  40                  45
Gly Gly Leu His Ser Gly Met Leu Glu Asp Gly Leu Pro Ser Asn Gly
    50                  55                  60
Val Pro Arg Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ile Pro Asn Pro Glu Lys Lys
65                  70                  75                  80
Thr Asn Cys Glu Thr Gln Cys Pro Asn Pro Gln Ser Leu Ser Ser Gly
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Gln Lys Gln Asn Gly Leu Gln Thr Thr Glu Ala Lys Arg
            100                 105                 110
Asp Ala Lys Arg Met Pro Ala Lys Glu Val Thr Ile Asn Val Thr Asp
        115                 120                 125
Ser Ile Gln Gln Met Asp Arg Ser Arg Arg Ile Thr Lys Asn Cys Val
    130                 135                 140
Asn
145
<210>5
<211>271
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
atgggctgcg gcgggagccg ggcggatgcc atcgagcccc gctactacga gagctggacc      60
cgggagacag aatccacctg gctcacctac accgactcgg acgcgccgcc cagcgccgcc     120
gccccggaca gcggccccga agcgggcggc ctgcactcgg gctaaaagag atgctaagag     180
aatgcctgca aaagaagtca ccattaatgt aacagatagc atccaacaga tggacagaag     240
tcgaagaatc acaaagaact gtgtcaacta g                                    271
<210>6
<211>54
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
Met Gly Cys Gly Gly Ser Arg Ala Asp Ala Ile Glu Pro Arg Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Glu Ser Trp Thr Arg Glu Thr Glu Ser Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Asp
            20                  25                  30
Ser Asp Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ala Pro Asp Ser Gly Pro Glu Ala
        35                  40                  45
Gly Gly Leu His Set Gly
50
<210>7
<211>1988
<212>DNA
<213>小鼠
<400>7
gcagcagcca cagccgcaag ccgagcggcc gccgggcgcg cccgcaacac gggaggatgg      60
gctgcggcgg gagccgagcc gatgccatcg agccccgcta ctacgagagt tggacccggg     120
agacggagtc cacctggctc acctacaccg actcggacgc gctgcccagc gccgcagcca     180
cggacagcgg ccccgaggcg ggcggcctgc acgcgggtgt gctggaagac ggactgtcct     240
ctaacggggt gctccgacct gcagccccgg gtggaatagc caacccagag aagaagatga     300
actgtgggac ccaatgtccc aactcacaga acctcagctc aggccctctg acccagaaac     360
agaatggcct ctgggccaca gaggctaaga gggatgctaa gcggatgtct gcaagagaag     420
tggctattaa cgttacagag aatattcggc agatggacag aagtaaaagg gtcaccaaga     480
actgcatcaa ttagcagtgc ccggatgtgg aggcagatga acttcttggt ggagtctagt     540
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ggccacccaa cgctgtgacg aacatctcgg tttcctgttt atcacatata gaaaatacat     660
cgaaaagtcc tgaaatatgt tcatagattg ccaaaatgtg gtttgttttt tcccctctgc     720
agcttccata gcatggtctg ctgtagccat ggcgactggc acagaaaggc tggagtaacg     780
gaatccctgt caaggagctc acactcgtgc agagctttct cagtgtgtgg ttgcagacaa     840
actccttctt tcctcctttc cttttaaata cggccaccac aaaatttact gttttcactt     900
aagagctggc tcccagccaa ctctaaatcc agaaatacaa gaatccaaaa aaccagagag     960
actcggaacg agctgaatca gtcccagctt cacgtgctgg ctccccggtg cctactcggt    1020
gtctttgaga ggtgtctatg agacacgcac atgcacacgc acacacacac acatacctgt    1080
ttctcctcta cctggaaagg actcccaggc tagcatccag gcgttggctt ccaaaccaga    1140
atgtcacatg tctgtggcct ttgctccctt tgggacctag cttcatgttg cttttcccca    1200
tagctttcca gttccctatt gttctggtgg gctttgtacc ttcagtcagg tggtcatttg    1260
cagctggaca ccactcacag gggggaaagt gacctaggaa cacatggtgg cacacgtgat    1320
acccctttgg cccttctgta cacagcccca aggaccatgt tatttttggt atctgcagag    1380
taattagttt ggaaagccag aggctggttg atgtatattc ctgttgacat agtctaacaa    1440
ggcactcact gtattgaaaa acaggcacca acatggtaaa gcgatgcttt gataggaacc    1500
cttccccagc attcctaagc acaccttcct gcagagtatg ttgacacagc atgagtctga    1560
aaggactgtt aacatgcttg ggcttattaa ggtccaagtc atatcaaact gtaccaacaa    1620
actcacatct agcagcaata gtagtctggc ggcatgctta cgtgacagtt caagagaagt    1680
cacccaagcg gattaagatg cagatgctca ctgctgtctc tgacttattt ctccaacaca    1740
agtagaactg tagactgtat gtttattagt gttaagattc actgccaacc ttgtgccagc    1800
tacagtaaca gtcgcagagg gatttggagt cgggaagtca cgactgtact tctgactctg    1860
tgaggaggct tggtactcag gagactgaca cggaccctgt ggcacaagac caatgattgc    1920
agtggaatct cacacttagg taaaggtagc tttctgtcaa tcacagatgt atgtcttctc    1980
ctttgccg                                                             1988
<210>8
<211>145
<212>PRT
<213>小鼠
<400>8
Met Gly Cys Gly Gly Ser Arg Ala Asp Ala Ile Glu Pro Arg Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Glu Ser Trp Thr Arg Glu Thr Glu Ser Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Asp
            20                  25                  30
Ser Asp Ala Leu Pro Ser Ala Ala Ala Thr Asp Ser Gly Pro Glu Ala
        35                  40                  45
Gly Gly Leu His Ala Gly Val Leu Glu Asp Gly Leu Ser Ser Asn Gly
    50                  55                  60
Val Leu Arg Pro Ala Ala Pro Gly Gly Ile Ala Asn Pro Glu Lys Lys
65                  70                  75                  80
Met Asn Cys Gly Thr Gln Cys Pro Asn Ser Gln Asn Leu Ser Ser Gly
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Gln Lys Gln Asn Gly Leu Trp Ala Thr Glu Ala Lys Arg
            100                 105                 110
Asp Ala Lys Arg Met Ser Ala Arg Glu Val Ala Ile Asn Val Thr Glu
        115                 120                 125
Asn Ile Arg Gln Met Asp Arg Ser Lys Arg Val Thr Lys Asn Cys Ile
    130                 135                 140
Asn
145
<210>9
<211>1821
<212>DNA
<213>小鼠
<400>9
gcagcagcca cagccgcaag ccgagcggcc gccgggcgcg cccgcaacac gggaggatgg      60
gctgcggcgg gagccgagcc gatgccatcg agccccgcta ctacgagagt tggacccggg     120
agacggagtc cacctggctc acctacaccg actcggacgc gctgcccagc gccgcagcca     180
cggacagcgg ccccgaggcg ggcggcctgc acgcgggcta agagggatgc taagcggatg     240
tctgcaagag aagtggctat taacgttaca gagaatattc ggcagatgga cagaagtaaa     300
agggtcacca agaactgcat caattagcag tgcccggatg tggaggcaga tgaacttctt     360
ggtggagtct agtcaaagaa tcctgaagaa gttgatgtca ctcgatgagt gtggatgcct     420
ctgagtgaca cacggccacc caacgctgtg acgaacatct cggtttcctg tttatcacat     480
atagaaaata catcgaaaag tcctgaaata tgttcataga ttgccaaaat gtggtttgtt     540
ttttcccctc tgcagcttcc atagcatggt ctgctgtagc catggcgact ggcacagaaa     600
ggctggagta acggaatccc tgtcaaggag ctcacactcg tgcagagctt tctcagtgtg     660
tggttgcaga caaactcctt ctttcctcct ttccttttaa atacggccac cacaaaattt     720
actgttttca cttaagagct ggctcccagc caactctaaa tccagaaata caagaatcca     780
aaaaaccaga gagactcgga acgagctgaa tcagtcccag cttcacgtgc tggctccccg     840
gtgcctactc ggtgtctttg agaggtgtct atgagacacg cacatgcaca cgcacacaca     900
cacacatacc tgtttctcct ctacctggaa aggactccca ggctagcatc caggcgttgg     960
cttccaaacc agaatgtcac atgtctgtgg cctttgctcc ctttgggacc tagcttcatg    1020
ttgcttttcc ccatagcttt ccagttccct attgttctgg tgggctttgt accttcagtc    1080
aggtggtcat ttgcagctgg acaccactca caggggggaa agtgacctag gaacacatgg    1140
tggcacacgt gatacccctt tggcccttct gtacacagcc ccaaggacca tgttattttt    1200
ggtatctgca gagtaattag tttggaaagc cagaggctgg ttgatgtata ttcctgttga    1260
catagtctaa caaggcactc actgtattga aaaacaggca ccaacatggt aaagcgatgc    1320
tttgatagga acccttcccc agcattccta agcacacctt cctgcagagt atgttgacac    1380
agcatgagtc tgaaaggact gttaacatgc ttgggcttat taaggtccaa gtcatatcaa    1440
actgtaccaa caaactcaca tctagcagca atagtagtct ggcggcatgc ttacgtgaca    1500
gttcaagaga agtcacccaa gcggattaag atgcagatgc tcactgctgt ctctgactta    1560
tttctccaac acaagtagaa ctgtagactg tatgtttatt agtgttaaga ttcactgcca    1620
accttgtgcc agctacagta acagtcgcag agggatttgg agtcgggaag tcacgactgt    1680
acttctgact ctgtgaggag gcttggtact caggagactg acacggaccc tgtggcacaa    1740
gaccaatgat tgcagtggaa tctcacactt aggtaaaggt agctttctgt caatcacaga    1800
tgtatgtctt ctcctttgcc g                                              1821
<210>10
<211>54
<212>PRT
<213>小鼠
<400>10
Met Gly Cys Gly Gly Ser Arg Ala Asp Ala Ile Glu Pro Arg Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Glu Ser Trp Thr Arg Glu Thr Glu Ser Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Asp
            20                  25                  30
Ser Asp Ala Leu Pro Ser Ala Ala Ala Thr Asp Ser Gly Pro Glu Ala
        35                  40                  45
Gly Gly Leu His Ala Gly
    50
<210>11
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>11
Arg Ala Asp Ala Ile Glu Pro Arg Tyr Tyr Glu Ser Trp Thr Arg Glu
1               5                   10                  15
<210>12
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>12
Glu Asp Gly Leu Pro Ser Asn Gly Val Pro Arg Ser
1               5                   10
<210>13
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>13
Glu Ala Lys Arg Asp Ala Lys Arg Met Asp Ala Lys Glu
1               5                   10
<210>14
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>14
Gln Met Asp Arg Ser Arg Arg Ile Thr Lys Asn Cys Val Asn
1               5                   10
<210>15
<211>792
<212>DNA
<213>小鼠
<400>15
tttgctggtg ttgttcatcc atcgctttta gaacaagtgg ccagaaaact tgggaggggg      60
atttttgtga gcttcggagc tacccagaac agaaagatgg ttttaaagag gggtggatag     120
gtaggtggat gactggatcc gtgggtggat gcacaggtgg acagatgagg gatggatgga     180
tggatggatg ggagcccagg aggtcgactg aagactgaag agggaccctt tttcttcttc     240
ccaccacctg tctgctactc tgttgcaccg catctgccag aacactgaag aagggactgg     300
cggctgggcg gtgggagagg cgaggttgag gggtgctggg gaaggaaagt ggagaggagg     360
agggccttgg agacagagag gaggggcccc cgggagcccg gcgctggcag cggctctggc     420
ggttagggga ccaatgtcgc tgccgccgcc tcctcctcgg gggccggagc tgcgtcgccc     480
gggctgagca gcagccacag ccgcaagcgg agcggccgcc gggcgcgccc gcaacacggg     540
aggatgggct gcggcgggag ccgagccgat gccatcgagc cccgctacta cgagagttgg     600
acccgggaga cggagtccac ctggctcacc tacaccgact cggacgcgct gcccagcgcc     660
gcagccacgg acagcggccc cgaggcgggc ggcctgcacg cgggtgagtg agccccgcgc     720
ccgcgaggcc cggctgcctg cagcgagctg gagctgcagg ggagcctggg ggtagccagc     780
aaccctatgg ca                                                         792
<210>16
<211>29
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>16
cccacattcc taaacacatc ctcctgcaa                                        29
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>17
ccatgctctg atatggaccc tt                                               22
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>18
tcaaactcag gctgtgccat ac                                               22
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>19
tgtgaggagg cttggtactc ag                                               22
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>20
gagattccac tgcaatcatt gg                                               22
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>21
tgacacggac cctgtggcac aaga                                             24
<210>22
<211>18
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>22
atgcttgtgg ccaatgca                                                    18
<210>23
<211>27
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>23
gatagagagg gaaaacagtc aagaaga                                          27
<210>24
<211>27
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>24
acccctcagg gctcagctag acattgc                                          27
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>25
ccatcctaat cagactcact atagcgc                                          27
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>26
gattccactg caatggttgg tcct                                             24
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>27
aaccgggatg gtcgtcaccg cgtg                                             24
<210>28
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>28
ctgtccatct gccggatatt ctctg                                            25
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>29
ttccccagca ttcctaagca ca                                               22
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>30
tacggcaaag gagaagacat acat                                             24
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>31
gcaggagcca cagccgcaag                                                  20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>32
cggcaaagga gaagacatac                                                  20
<210>33
<211>1086
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>33
ctctgaccca gaaacagaat ggccttcaga ccacagaggc taaaagagat gctaagagaa      60
tgcctgcaaa agaagtcacc attaatgtaa cagatagcat ccaacagatg gacagaagtc     120
gaagaatcac aaagaactgt gtcaactagc agagagtcca agcagaaggg cagatggact     180
tcttcagtgt ccttcacggc actggatccc atcaaagaac cttgaagaag tggctgcccc     240
ttgctggacc tgaattctac tgagtccctg gcaagactgt cttacctggc agcaaactgc     300
tgcctgattt gttgggacct tctgagcctt ctacttatca tgtaaatgta ttggcacagt     360
gcttacatat gttaataaac tgcaaatgtg cagttcagtt tgtctctttg caactcctgt     420
aatacggtct ggtgtaaaag tagtgagtta aagctacagg tcagtttatg aaacagaaaa     480
gtagggatgc attttctggg tgaaagagtc acaccttagt gctataactc tcctgcccat     540
gatagtgtat tctgtttcag gcaagcttat tctttccttc tttcatttta aatattgtca     600
ttacaaatct taccaggttc acttaaaagc tggctttcat ccaactctaa acccacatat     660
tgaaaaaatc aaggtacagg aaaactcctt gttatccttg tttccttagc ttggtatgag     720
acagatcgga tccagtttcc catgcaccaa cccactgccc atggcatgtc tttgggaggt     780
gtctgtgaag cagtcatacc tgctcctcat ctgcctggaa agtcctccta ttccagtgtc     840
catgttggcc tccagtcctt aatgtcacca tgcttgtggc caatgcatcc aaataaggat     900
acccctcagg gctcagctag acattgcaat tttgcatagc tttccagttc cctttgcttg     960
tcttcttgac tgtcttccct ctctatcggg gtcacttgca attgttaatc aaagattgaa    1020
cactgcgtag gagagggaga tgatccagag acatgtggca gcaggcatgg cttccccttg    1080
gcctct                                                               1086
<210>34
<211>31
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>34
gaagatctcc accatgggct gcggcgggag c                                     31
<210>35
<211>28
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>35
gaagatctct agttgacaca gttctttg                                         28
<210>36
<211>18
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>36
atgggctgcg gcgggagc                                                    18
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>37
gatcaactgt gtcaagaaac                                                  20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>38
ccccgctact acgagagttg                                                  20
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>39
ctacgtcaag aaccactggg                                                  20
<210>40
<211>397
<212>DNA
<213>小鼠
<400>40
gccccgctac tacgagagtt ggacccggga gacggagtcc acctggctca cctacaccga      60
ctcggacgcg ctgcccagcg ccgcagccac ggacagcggc cccgaggcgg gcggcctgca     120
cgcgggtgtg ctggaagacg gactgtcctc taacggggtg ctccgacctg cagccccggg     180
tggaatagcc aacccagaga agaagatgaa ctgtgggacc caatgtccca actcacagaa     240
cctcagctca ggccctctga cccagaaaca gaatggcctc tgggccacag aggctaagag     300
ggatgctaag cggatgtctg caagagaagt ggctattaac gttacagaga atattcggca     360
gatggacaga agtaaaaggg tcaccaagaa ctgcatc                              397
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>41
gctggaagat ggactgccct c                                                21
<210>42
<211>22
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>42
ctctgtggtc tgaaggccat tc                                               22
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>43
gaagacgggc cgtcctctaa c                                                21
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>44
gtccaaaggc cattctgctt c                                                21
<210>45
<211>18
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>45
acgggccgtc ctctaacg                                                    18
<210>46
<211>22
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>46
acattgggtc ccacagttca tc                                               22
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>47
agccccaggt ggaatagcca accc                                             24
<210>48
<211>21
<212>RNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>48
uagccaaccc agagaagaau u                                                21
<210>49
<211>21
<212>RNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>49
uucuucucug gguuggcuau u                                                21
<210>50
<211>21
<212>RNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>50
cucacagagc cucagcucau u                                                21
<210>51
<211>21
<212>RNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>51
ugagcugagg cucugugagu u                                                21
<210>52
<211>21
<212>RNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>52
gaacugcauc aauuagcagu u                                                21
<210>53
<211>21
<212>RNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>53
cugcuaauug augcaguucu u                                                21
<210>54
<211>21
<212>RNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>54
cuucuuugug gcguccaguu u                                                21
<210>55
<211>21
<212>RNA
<213>大鼠
<220>
<223>寡核苷酸
<400>55
acuggacgcc acaaagaagu u                                                21
<210>56
<211>21
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>56
uccaccuggc ucaccuacau u                                                21
<210>57
<211>21
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>57
uguaggugag ccagguggau u                                                21
<210>58
<211>21
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>58
uacccaaccc agagaagaau u                                                21
<210>59
<211>21
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>59
uucuucucug gguuggguau u                                                21
<210>60
<211>21
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>60
gagaugcuaa gagaaugccu u                                                21
<210>61
<211>21
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>61
ggcauucucu uagcaucucu u                                                21
<210>62
<211>21
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>62
gcagaagggc agauggacuu u                                                21
<210>63
<211>21
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>寡核苷酸
<400>63
aguucaucug cccuucugcu u                                                21

Claims (87)

1.编码PAIGB多肽的分离的核酸片段，其选自：
(a)编码SEQ ID NO：2、4、6、8和10的分离的核酸片段，
(b)编码与SEQ ID NO：2、4、6、8和10具有至少85％同一性的氨基酸序列的分离的核酸片段，
(c)与(a)的分离的核酸片段杂交的分离的核酸分子，其中杂交条件为6×SSC(1M NaCl)、45至50％的甲酰胺、1％SDS，于37℃，以及55至60℃下在0.5×至1×SSC中洗涤；和，
(d)与(a)、(b)或(c)互补的分离的核酸片段。
2.权利要求1的分离的核酸片段，其选自于SEQ ID NO：1、3、5、7和9。
3.权利要求1的分离的核酸片段，其中分离的核酸片段是DNA。
4.权利要求1的分离的核酸片段，其中分离的核酸片段是RNA。
5.权利要求1的核酸片段，其中核酸片段编码参与PTH信号传导途径的多肽。
6.权利要求1的核酸片段，当超表达时其诱导骨组织中的骨形成活性。
7.权利要求1的分离的核酸片段，其响应于间歇施用PTH得到超表达。
8.由权利要求1的分离的核酸片段编码的多肽。
9.权利要求8的多肽，其选自于SEQ ID NO：2、4、6、8和10。
10.权利要求8的多肽，其参与PTH信号传导途径。
11.权利要求8的多肽，当超表达时其诱导骨组织中的骨形成活性。
12.权利要求8的多肽，其响应于间歇施用PTH得到超表达。
13.包含可操作地连接到合适的调控序列上的权利要求1的分离的核酸片段的嵌合构建体。
14.用权利要求13的嵌合构建体转化的宿主细胞。
15.权利要求14的宿主细胞，其中宿主细胞选自真核细胞、原核细胞和多细胞有机体。
16.权利要求15的宿主细胞，其中宿主细胞是哺乳动物细胞。
17.权利要求16的宿主细胞，其中宿主细胞是哺乳动物成骨细胞。
18.权利要求16的宿主细胞，其中宿主细胞选自COS-7(猴肾)、293(人肾)、CHO(仓鼠卵巢)、HepG2(人肝)、HeLa(人子宫颈)、NIH3T3(小鼠成纤维细胞)、原代成骨细胞、TE-85(人成骨细胞)、MG-63(人成骨细胞)、SAOS-2(人成骨细胞)、UMR 106(大鼠成骨细胞)、ROS 17/2.8(大鼠成骨细胞)、MC3T3(小鼠成骨细胞)和U2OS(人成骨细胞)。
19.权利要求15的宿主细胞，其中宿主细胞是人成骨细胞。
20.权利要求15的宿主细胞，其中宿主细胞是大肠杆菌。
21.权利要求20的宿主细胞，其中宿主细胞选自DH5α、BL21和DH10B。
22.权利要求15的宿主细胞，其中宿主细胞是酵母细胞。
23.权利要求22的宿主细胞，其中宿主细胞选自裂殖糖酵母属、啤酒糖酵母、巴斯德毕赤氏酵母和甲醇毕赤氏酵母。
24.权利要求15的宿主细胞，其中宿主细胞是昆虫细胞。
25.权利要求24的宿主细胞，其中宿主细胞选自SF、SF21-草地夜蛾、S2 Schneider细胞和来自粉纹液蛾卵的High Five Cells。
26.包含权利要求1的核酸片段的载体。
27.权利要求26的载体，其中载体是质粒。
28.包含权利要求26的载体的转化细胞。
29.权利要求28的转化细胞，其中宿主微生物选自真核细胞、原核细胞和多细胞有机体。
30.权利要求29的转化细胞，其中宿主微生物是哺乳动物细胞。
31.权利要求30的宿主细胞，其中宿主细胞是哺乳动物成骨细胞。
32.权利要求28的转化细胞，其中宿主微生物是大肠杆菌。
33.权利要求28的转化细胞，其中宿主微生物是酵母细胞。
34.编码权利要求8的多肽的核酸片段的制备方法，该方法包括：
(a)用如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：9所示核酸片段的全长或部分探测基因组文库，
(b)鉴定与步骤(a)的核酸片段杂交的DNA克隆；和
(c)确定包含步骤(b)中所鉴定的DNA克隆的核酸片段的序列。
35.权利要求8的多肽的制备方法，方法包括：
(a)将权利要求26的载体导入合适的宿主细胞；
(b)培养所得的细胞以产生多肽；
(c)回收步骤(b)中产生的多肽；和
(d)分离回收的多肽。
36.在生物学样品中，检测权利要求1的核酸片段的存在的方法，包括：
(a)将生物学样品与权利要求1的核酸片段进行接触；
(b)确定核酸片段是否结合生物学样品中的核酸分子，从而检测样品中权利要求1的核酸片段的存在。
37.特异性结合权利要求8-12的PAIGB多肽的一个或多个表位的抗体。
38.用于调节哺乳动物中骨形成活性的组合物，其包括至少一种：
(i)权利要求1-7的核酸片段；
(ii)权利要求8-12的多肽；
(iii)由所述多肽或其部分形成的抗体。
39.根据权利要求38的组合物，其中所述PAIGB来源于人成骨细胞。
40.根据权利要求38的组合物，其中骨形成活性是骨生长调节。
41.根据权利要求38的组合物，其中骨形成活性是骨密度调节。
42.根据权利要求38-41的组合物，其中PAIGB具有SEQ ID NO：2、4、6、8、和10所列的氨基酸序列。
43.改变PAIGB基因或多肽表达的试剂。
44.权利要求43的试剂，其中试剂是多核苷酸。
45.权利要求43的试剂，其中试剂是多肽。
46.权利要求43的试剂，其中所述试剂是化学小分子。
47.权利要求43的试剂，其中所述试剂是肽。
48.权利要求43的试剂，其中试剂诱导骨形成活性。
49.权利要求43的试剂，其中试剂显示以下至少一种：
(a)诱导骨形成活性，
(b)促进来自骨原细胞的成骨细胞分化，
(c)促进成骨细胞活性，
(d)促进成骨细胞增殖，或
(e)减少成骨细胞的细胞凋亡。
50.包含权利要求43的试剂的组合物。
51.确定试剂是否改变PAIGB mRNA表达的方法，该方法包括：
(a)测量存在于不与所述试剂接触的测试样品中的PAIGB mRNA水平；
(b)测量存在于与所述试剂接触的测试样品中的PAIGB mRNA水平；和
(c)当步骤(a)中测量的PAIGB mRNA水平不同于步骤(b)中测量的PAIGB mRNA水平时，确定试剂改变了PAIGB mRNA的表达。
52.筛选用于有效改变权利要求1的核酸片段表达的试剂的方法，该方法包括：
(a)在适于权利要求1的核酸片段表达的条件下，使包含权利要求1的核酸片段的测试样品与试剂进行接触；
(b)检测改变的权利要求1的核酸片段的表达；和
(c)在存在各种量试剂和不存在该化合物的情况下，比较权利要求1的核酸片段的表达。
53.权利要求51和52的方法，其中测试样品选自骨组织活组织检查、骨髓吸出物和关节液。
54.筛选用于治疗骨相关病症的试剂的方法，包括：
(a)使试剂与经遗传工程改造表达PAIGB基因的培养的宿主细胞进行接触，其中PAIGB基因编码权利要求8的多肽，和
(b)检测PAIGB基因、PAIGB mRNA或PAIGB多肽的表达水平中的变化。
55.权利要求54的方法，其中试剂诱导骨细胞的功能活性。
56.权利要求55的方法，其中通过诱导骨特异性细胞的表达，来诱导骨的功能活性。
57.权利要求54的方法，其中试剂是骨合成代谢试剂。
58.评价受试者的骨相关病症治疗效果的方法，包括：以给定的方案治疗受试者；评定权利要求1限定的PAIGB核酸分子或权利要求8的多肽的表达水平，其中相对于治疗前的水平，治疗后PAIGB核酸或PAIGB多肽的表达水平的变化指示了骨病症的治疗效果。
59.鉴定能结合PAIGB的多肽的方法，包括：应用哺乳动物双杂交方法，其中编码所述PAIGB的序列由一个杂交载体携带，来自cDNA或基因组DNA文库的序列由第二杂交载体携带，然后将载体用于转化宿主细胞，并分离阳性转化细胞，随后提取所述的第二杂交载体以获得编码结合所述PAIGB的多肽的序列。
60.使用骨相关试剂监控治疗受试者的有效性的方法，包括：
(a)从施用所述试剂前的受试者中获得施用前的样品；
(b)检测施用前样品中的PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平；
(c)从受试者获得一个或多个施用后的样品；
(d)检测施用后样品中的PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性；
(e)将施用前样品中的PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性，与施用后一个样品或多个样品中的PAIGB蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性进行比较；和
(f)相应地改变对受试者施用试剂。
61.包括权利要求的1的DNA的转基因动物。
62.权利要求61的转基因动物，其中动物是啮齿动物。
63.权利要求61的转基因动物，其中动物是小鼠。
64.权利要求61的转基因动物，其中动物是大鼠。
65.权利要求61的转基因动物，其具有体细胞和/或生殖细胞，包含含有能指导动物和/或人细胞中蛋白表达的启动子区的核酸，其中启动子区可操作地连接到包括SEQ ID NO：1、3、5、7或9或其片段中至少15个邻接核苷酸的序列。
66.权利要求61的转基因动物，其具有体细胞和/或生殖细胞，包含含有编码权利要求6的多肽的序列的核酸，且其中核酸还含有可操作地连接到能指导动物和/或人细胞中蛋白表达的启动子区。
67.权利要求61的转基因动物，其具有体细胞和/或生殖细胞，包含含有指导动物和/或人细胞中蛋白表达的启动子区的核酸，该启动子区可操作地连接到包括SEQ ID NO：1、3、5、7或9中至少15个邻接核苷酸的序列，其中骨量相对于同物种的非转基因动物，以多于一种骨参数得以调节。
68.权利要求61的转基因动物，其中转基因动物表达人PAIGB多肽。
69.权利要求68的转基因动物，其中人PAIGB多肽是在骨组织中最高表达的。
70.权利要求61的转基因动物，其表现出骨表型。
71.权利要求61的转基因动物，其中骨量相对于同物种的非转基因动物，以选自骨密度、骨长度、小梁数、骨大小、骨组织连接度的多于一种骨参数得以调节。
72.用于研究调节骨密度的动物模型，包括由权利要求61的转基因动物组成的第一组动物，和作为对照的第二组动物。
73.转基因小鼠，所述转基因小鼠具有包含PAIGB的编码基因的改变的基因组，其中改变通过同源重组、将用于基因寻靶的核酸导入胚胎干细胞或多能细胞而引起，所述核酸包含同源于小鼠PAIGB基因的第一片段和同源于另一片段的小鼠PAIGB基因的第二片段，第一和第二片段之间的中间片段含有PAIGB基因一部分基因工程的缺失、核酸序列改变或核酸插入，其中所述核酸与内源性基因能进行同源重组。
74.权利要求73的转基因小鼠，其中用于基因寻靶的核酸的中间片段包含ATG起始密码子的基因工程缺失、基因工程的移码突变、基因工程的终止密码子、新霉素抗性序列、环重组位点或合成的转录中止序列。
75.权利要求73的转基因小鼠，其中用于基因寻靶的核酸还包含小鼠PAIGB基因的内含子和外显子序列。
76.转基因动物，其中内源性PAIGB的表达受到改变的基因控制序列调节，所述序列通过同源或非同源重组导入。
77.权利要求61的转基因动物，其中PAIGB基因是可诱导的。
78.根据权利要求61的转基因动物，其中所述动物是“基因敲除”动物，其中动物PAIGB基因之一的一个或两个拷贝，已通过同源重组或基因寻靶，得以部分或全部缺失，或者通过外源序列的同源重组或基因寻靶而引起的插入或取代而失活。
79.研究骨量决定因素的方法，包括步骤：
(a)根据权利要求1提供第一组转基因动物；和
(b)在转基因动物中，测量至少一种骨发育参数。
80.研究骨量调节的方法，包括步骤：
(a)根据权利要求1提供第一组转基因动物；
(b)施用测试化合物或实验步骤；和
(c)在施用测试化合物的转基因动物中，测量至少一种骨发育参数。
81.研究PAIGB对骨病症的效果的方法，包括步骤：
(a)提供具有骨相关病症表型的动物胚胎；
(b)将权利要求1的任一核酸导入第一组胚胎中；
(c)将胚胎转入假孕小鼠中；和
(d)在所得小鼠中，测量至少一种发育参数。
82.鉴定用于治疗骨相关病症的试剂效果的方法，包括将所述试剂施用于根据权利要求61的转基因动物，在所述动物细胞中测量PAIGB的表达，将PAIGB的表述与未处理的对照动物的PAIGB表达进行比较。
83.权利要求82的方法，其中所述试剂联合其它骨相关试剂施用。
84.鉴定试剂是否具有骨形成活性的方法，包括步骤：
(a)将试剂施用于权利要求61的转基因动物；和
(b)在施用试剂后，检测转基因动物以确定动物BMD是否发生变化。
85.权利要求84的方法，其中所述试剂联合其他骨相关试剂施用。
86.权利要求85的方法，其中联合施用导致骨盐密度得以提高。
87.包含两个构建体的稳定转染的细胞系，第一构建体包含连接到DNA结合结构域的配体结合结构域，所述DNA结合结构域连接于激活结构域，它们的表达均由组成型启动子驱动，第二构建体包含多拷贝的、连接到最小启动子的DNA结合元件，所述最小启动子连接到PAIGB cDNA，其中在添加了化学诱导物后，PAIGB基因的转录得以诱导。
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