KR20010097640A - 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포 - Google Patents

인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포 Download PDF

Info

Publication number
KR20010097640A
KR20010097640A KR1020000021897A KR20000021897A KR20010097640A KR 20010097640 A KR20010097640 A KR 20010097640A KR 1020000021897 A KR1020000021897 A KR 1020000021897A KR 20000021897 A KR20000021897 A KR 20000021897A KR 20010097640 A KR20010097640 A KR 20010097640A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
cancer
expression vector
hccs
tissue
Prior art date
Application number
KR1020000021897A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100426455B1 (ko
Inventor
김진우
Original Assignee
김진우
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR10-2000-0021897A priority Critical patent/KR100426455B1/ko
Application filed by 김진우 filed Critical 김진우
Priority to AU2001220255A priority patent/AU2001220255A1/en
Priority to DE60027928T priority patent/DE60027928T2/de
Priority to CN008193843A priority patent/CN1216909C/zh
Priority to AT00983508T priority patent/ATE325812T1/de
Priority to CA002405983A priority patent/CA2405983A1/en
Priority to PCT/KR2000/001406 priority patent/WO2001081387A1/en
Priority to JP2001578474A priority patent/JP3749182B2/ja
Priority to US10/257,819 priority patent/US6977296B2/en
Priority to EP00983508A priority patent/EP1282641B1/en
Publication of KR20010097640A publication Critical patent/KR20010097640A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100426455B1 publication Critical patent/KR100426455B1/ko
Priority to HK04102793A priority patent/HK1060136A1/xx

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호: 1로 표시되는 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 미생물 또는 동물 세포에 관한 것으로, 본 발명의 유전자는 인간 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포{HUMAN CANCER SUPPRESSOR GENE, PROTEIN ENCODING BY SAME, EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME, AND CELL TRANSFORMED BY SAID VECTOR}
본 발명은 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.
암 억제 유전자(tumor suppressor gene) 산물은 정상 세포로부터 암 세포로의 형질전환을 억제하며, 이 기능이 상실되면 세포는 악성 형질전환에 이르게 된다(Klein, G.,FASEB J.,7, 821-825 (1993)). 암세포가 암을 형성하기 위해서는 암 억제 유전자의 정상 카피수 기능이 상실되어야 한다. p53 암 억제 유전자의 코딩 서열내 변형이 인간 암에서 가장 일반적인 유전적 변화로 밝혀졌다(Bishop, J.M.,Cell,64, 235-248 (1991); 및 Weinberg, R.A.,Science,254, 1138-1146 (1991)).
그러나 자궁경부암에서 보고된 p53 변이는 2 % 내지 11 %의 범위에 불과하여(Crook, T. et al.,Lancet,339, 1070-1073 (1992); 및 Busby-Earle, R.M.C. et al.,Br. j. Cancer,69, 732-737 (1994)), 자궁경부암 조직의 일부만이 이러한 p53 변이를 보이는 것으로 생각된다.
이에 본 발명자들은, 정상 자궁경부 조직과 자궁경부암 사이에 차별적으로 발현되는 유전자를 보다 효율적으로 나타내는 mRNA 감별 전개법(mRNA differential display(DD) method)을 사용하여, 정상 자궁경부 조직에서 새로운 암 억제 유전자를 분리하고자 예의 연구하였다.
본 발명의 목적은 신규한 인간 암 억제 유전자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자에 의해 코딩되는 암 억제 단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 데 있다.
도 1은 서열번호: 3의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP37와 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진이다.
도 2는 본 발명의 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다.
도 3a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 HCCS-1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3b는 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다.
도 4a는 여러 정상 조직에서 HCCS-1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 4b는 β-액틴의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이다.
도 5a는 여러 암세포주들에서 HCCS-1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5b는 β-액틴의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이다.
도 6은 정상 HeLa 세포, 본 발명의 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 벡터 pCR 3.1로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1로 표시되는 인간 암 억제 유전자 HCCS-1을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 2로 표시되는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.
상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열로 표시되는 인간 암 억제 유전자 1(HCCS-1)로서, 서열번호: 1의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIHGenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AF249277 호로 등록되었으며(공개예정일: 2000년 7월 26일) 이 데이터베이스에 등록된 다른 염기서열과는 유사성이 거의 없는 신규 유전자이다.
서열번호: 1의 염기서열에는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 79 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 2의 아미노산 서열을 가지며 크기는 9 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크린닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 3의 임의 프라이머 H-AP37 및 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 193 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다. 본 발명자들은 이 전장 cDNA 클론을 발현벡터 pCEV-LAC(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))에 삽입한 후 대장균 JM109에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 JM109/HCCS1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000년 4월 10일자 기탁번호 제 KCTC 0768BP 호로 기탁하였다.
이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HeLa 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.
본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 정상 자궁경부, 태반, 신장, 간, 골격근 및 심장 조직, 더욱 바람직하게는 정상 자궁경부 조직에서 고발현되어 발암을 억제한다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 0.6 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며, 이외에 1.6 및 1.0 kb의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 자궁경부암 조직, 전이성 장골 림프절 조직(metastatic common iliac lymph node tissue) 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6 등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 자궁경부 조직에서만 차별적으로 발현된다.
본 발명의 유전자는 HeLa 자궁경부암 세포 외에도 전 골수성 백혈병 세포주 HL-60, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 버킷 림프종 Raji 및 림프아세포 백혈병 MOLT-4, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포를 포함한 인간 백혈병 및 림프종 세포주에서는 발현되지 않는다.
본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
참조예: 총 RNA의 분리
신선한 조직 또는 배양된 세포로부터 총 RNA 분리 키트(RNeasy total RNA kit, Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 총 RNA를 분리한 후, 키트(message clean kit, GenHunter Corp., MA)를 사용하여 RNA에 오염된 DNA를 제거하였다.
실시예 1: 총 RNA의 분리 및 mRNA 감별 전개
정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.
자궁 근종 환자로부터 자궁적출술(hysterectomy) 중에 정상 자궁경부(exocervical) 조직 시료를 얻었으며, 수술적 처치전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 자궁절제술(radical hysterectomy) 중에 원발성 자궁경부암 조직 및 전이성 장골 림프절 조직 시료를 얻었다. 인간 자궁경부암 세포주로는 CUMC-6(Kim, J.W. et al.,Gynecol. Oncol.,62, 230-240 (1996))을 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.
각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B.,Science,257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al.,Cancer Res.,52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 4 내지 6 중의 하나의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimagae kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 임의 프라이머 5'13mer인 H-AP 1 내지 40(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국) 중의 하나의 프라이머를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR를 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오그래피하였다.
도 1은 서열번호: 3의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP37와 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1열은 정상 자궁경부 조직이며, 제2열은 자궁경부암 조직이고, 제3열은 전이성 장골 림프절 조직이며, 제4열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6이다. 도 1에서 보듯이, 자궁경부암 조직, 전이성 장골 림프절 조직 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6에서는 발현되지 않고 정상 자궁경부 조직에서만 차별적으로 발현된 193 bp cDNA 단편이 확인되었다. 이 cDNA 단편을 CG373으로 명명하였다.
건조된 겔로부터 CG373 단편인 193 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 CG373을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States BiochemicalCo.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. cDNA 단편 CG373은 서열번호: 7의 염기서열을 나타내었다.
서열번호: 7의 염기서열을 BLAST 및 FASTA 프로그램을 이용하여 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에서 검색한 결과, 이 데이터베이스에 등록된 염기서열과는 유사성이 거의 없었다.
실시예 2: cDNA 라이브러리 스크린닝
실시예 1에서 얻은 cDNA 단편 CG373을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B.,Anal. Biochem.,132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 얻은32P-표지된 CG373 cDNA 프로브를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(한양 대학교 정 일엽 교수로부터 얻음)와 문헌(Sambrook, J. et al.,Molecular Cloning: A Laboratory mannual,New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 자궁경부암 억제 유전자 HCCS-1의 전장 cDNA 클론을 얻었다.
이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 1과 같았다. 이 염기서열에는 79 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 2와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 9 kDa이었다.
얻어진 HCCS-1 전장 cDNA 클론을 원핵생물용 발현벡터 pCEV-LAC(Miki, T. etal.,Gene, 83, 137-146 (1989))에 삽입한 후 대장균 JM109에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 JM109/HCCS1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000년 4월 10일자 기탁번호 제 KCTC 0768BP 호로 기탁하였다.
또한 HCCS-1 전장 cDNA 클론이 삽입된 발현벡터 pCEV-LAC를 서열번호: 7 및 8의 프라이머와 함께 PCR을 수행하여 전장 cDNA의 코딩 영역만을 증폭시켰다. 증폭된 347 bp의 PCR 산물을 pET-32C 벡터(Novagen, 미국)에 삽입한 후 얻어진 벡터로 대장균 BL21을 형질전환시킨 다음 HCCS-1 유전자를 발현시켰다. 발현 조건은 1mM 의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al.,Molecular Cloning: A Laboratory mannual,New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.
도 2는 HCCS-1 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 HCCS-1 단백질의 발현을 유도한 후 단백질 시료이다. 도 2에서 보듯이, 발현된 단백질의 크기는 약 27 kDa으로서 이중 벡터 pET에서 유래하는 영역인 18 kDa를 제외하면, 발현된 HCCS-1 단백질은 약 9 kDa의 분자량을 보이며, 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.
실시예 3: HCCS-1 유전자의 노던 블랏
HCCS-1 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.
실시예 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직 시료 3개, 원발성 자궁경부암 조직 시료 3개 및 자궁경부암 세포주 시료 2개의 총 RNA 20 ㎍을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 실시예 1에서 얻은 HCCS-1 전장 cDNA를 사용한32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42 ℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.
도 3a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 HCCS-1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3b는 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다. 도 3a 및 3b에서, 제1열 내지 제3열은 정상 자궁경부 조직 시료이며, 제4열 내지 제6열은 자궁경부암 조직 시료이고, 제7열은 자궁경부암 세포주 HeLa 시료이며, 제8열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6 시료이다. 도 3a 및 3b에서 보듯이, HCCS-1 유전자의 발현 수준은 정상 자궁경부 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 자궁경부암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 낮았고, 자궁경부암 세포주 시료 2개에서는 나타나지 않았다.
정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech) 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로서 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장,간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포로부터 참조예의 방법에 따라 총 RNA 시료를 분리한 후 상기와 동일하게 노던 블랏을 실시하였다.
도 4a는 여러 정상 조직에서 HCCS-1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4b는 β-액틴의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이다. 도 4a 및 4b에서 제1열 내지 12열은 각각 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직 시료이다. 도 4a에서 보듯이, 정상 태반, 신장, 간, 골격근 및 심장 조직에서도 약 0.6 kb의 우점(dominant) HCCS-1 mRNA 전사물이 과발현되었으며, 이외에 1.6 및 1.0 kb의 전사물들도 나타났다.
도 5a는 여러 암세포주들에서 HCCS-1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고 도 5b는 β-액틴의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이다. 도 5a 및 5b에서 제1열 내지 제8열은 각각 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포 시료이다. 도 5a 및 5b에서 보듯이, HeLa 자궁경부암 세포 외에 전 골수성 백혈병 HL-60, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 버킷 림프종 라지 및 림프아세포 백혈병 MOLT-4, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포, G361 흑색종 세포를 포함한 인간 백혈병 및 림프종세포주에서는 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 HCCS-1 유전자는 정상 자궁경부 상피, 태반, 신장, 간, 골격근 및 심장에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.
실시예 4: 발현 벡터의 제작 및 형질 감염
HCCS-1 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다.
먼저 실시예 2에서 얻은 HCCS-1 전장 cDNA가 포함된 원핵생물용 발현벡터 pCEV-LAC를 SalI으로 절단하여 HCCS-1 cDNA 전체를 포함하는 단편을 얻었다. 이어서 pCDNA3(Invitrogen)을 XhoI으로 절단하여 SalI과 상용성인 말단을 만든 후, 여기에 HCCS-1 cDNA 전체를 포함하는 SalI 단편을 삽입하였다.
얻어진 발현벡터 pCDNA3/HCCS-1을 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HeLa 자궁경부암 세포주(ATCC CCL-2)에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 RPMI 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 HCCS-1이 포함되지 않은 pCDNA3로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하였다.
실시예 5: HCCS-1 유전자로 형질감염된 자궁경부암 세포의 성장 곡선
HCCS-1 유전자가 자궁경부암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해,1 x 105개의 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 HCCS-1 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3(Invitrogen)으로 형질감염된 HeLa 세포를 각각 RPMI 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclustion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일 및 7일째에 계수하였다.
도 6은 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 HCCS-1 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3으로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다. 도 6에서 보듯이, HCCS-1 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 사멸률은 pCDNA3으로 형질감염된 HeLa 세포 및 정상 HeLa 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 정상 HeLa 세포와 비교할 때 HCCS-1로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, HCCS-1 유전자는 자궁경부암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.
본 발명의 HCCS-1 유전자는 인간 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 서열번호: 1로 표시되는 인간 암 억제 유전자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 암이 자궁경부, 태반, 신장, 간, 골격근 및 심장 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 암인 유전자.
  3. 서열번호: 2로 표시되는 인간 암 억제 단백질.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 암이 자궁경부, 태반, 신장, 간, 골격근 및 심장 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 암인 단백질.
  5. 제 1 항의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
  6. 제 5 항의 벡터로 형질전환된 세포.
  7. 제 6 항에 있어서,
    미생물 또는 동물 세포인 세포.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 미생물이 대장균 JM109/HCCS1(기탁번호 제 KCTC 0768BP 호)인 세포.
KR10-2000-0021897A 2000-04-25 2000-04-25 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포 KR100426455B1 (ko)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2000-0021897A KR100426455B1 (ko) 2000-04-25 2000-04-25 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포
DE60027928T DE60027928T2 (de) 2000-04-25 2000-12-04 MENSCHLICHES, ZERVIKALKREBS-SPEZIFISCHES SUPPRESSORPROTEIN, FüR DAS PROTEIN CODIERENDES POLYNUKLEOTID, MIT DEM POLYNUKLEOTID TRANSFORMIERTE ZELLE UND VERFAHREN ZUR UNTERDRÜCKUNG DER PROLIFERATION VON KREBSZELLEN UNTER VERWENDUNG DES EXPRESSIONSVEKTORS
CN008193843A CN1216909C (zh) 2000-04-25 2000-12-04 人子宫颈癌抑制蛋白,编码该蛋白的多核苷酸,用该多核苷酸转化的细胞和用表达载体抑制癌细胞增殖的方法
AT00983508T ATE325812T1 (de) 2000-04-25 2000-12-04 Menschliches, gebärmutterkrebs-spezifisches suppressorprotein, für das protein kodieres polynukleotid, mit dem polynukleotid transformierte zelle und verfahren zur unterdrückung der proliferation von krebszellen unter verwendung des expressionsvektors
AU2001220255A AU2001220255A1 (en) 2000-04-25 2000-12-04 Human cervical cancer suppressor protein, polynucleotide encoding the protein, cell transformed with the polynucleotide and method for suppressing proliferationof cancer cell using the expression vector
CA002405983A CA2405983A1 (en) 2000-04-25 2000-12-04 Human cervical cancer suppressor protein, polynucleotide encoding the protein, cell transformed with the polynucleotide and method for suppressing proliferation of cancer cell using the expression vector
PCT/KR2000/001406 WO2001081387A1 (en) 2000-04-25 2000-12-04 Human cervical cancer suppressor protein, polynucleotide encoding the protein, cell transformed with the polynucleotide and method for suppressing proliferation of cancer cell using the expression vector
JP2001578474A JP3749182B2 (ja) 2000-04-25 2000-12-04 ヒト子宮頸癌抑制タンパク質、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドで形質転換された細胞およびその発現ベクターを用いて癌細胞の増殖を抑制する方法
US10/257,819 US6977296B2 (en) 2000-04-25 2000-12-04 Human cervical cancer suppressor protein, polynucleotide encoding the protein, cell transformed with the polynucleotide and method for suppressing proliferation of cancer cell using the expression vector
EP00983508A EP1282641B1 (en) 2000-04-25 2000-12-04 Human cervical cancer suppressor protein, polynucleotide encoding the protein, cell transformed with the polynucleotide and method for suppressing proliferation of cancer cell using the expression vector
HK04102793A HK1060136A1 (en) 2000-04-25 2004-04-21 Human cervical cance suppressor protein, polynucleotide encoding the protein, cell transformed with the polynucleotide and method for suppressing proliferation of cancer cell using the expression vector

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2000-0021897A KR100426455B1 (ko) 2000-04-25 2000-04-25 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010097640A true KR20010097640A (ko) 2001-11-08
KR100426455B1 KR100426455B1 (ko) 2004-04-13

Family

ID=36251014

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2000-0021897A KR100426455B1 (ko) 2000-04-25 2000-04-25 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6977296B2 (ko)
EP (1) EP1282641B1 (ko)
JP (1) JP3749182B2 (ko)
KR (1) KR100426455B1 (ko)
CN (1) CN1216909C (ko)
AT (1) ATE325812T1 (ko)
AU (1) AU2001220255A1 (ko)
CA (1) CA2405983A1 (ko)
DE (1) DE60027928T2 (ko)
HK (1) HK1060136A1 (ko)
WO (1) WO2001081387A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100434591B1 (ko) * 2002-04-16 2004-06-04 김진우 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100426452B1 (ko) * 2001-01-02 2004-04-13 김진우 인간 원암 유전자로 형질전환된 포유동물 및 이 유전자를이용한 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암 진단용 키트
MXPA03009622A (es) * 2001-04-23 2005-03-07 Amaxa Gmbh Solucion amortiguadora para electroporacion y metodo que comprende el uso de la misma.
KR100664589B1 (ko) * 2004-12-28 2007-01-04 김현기 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 및이를 포함하는 발현 벡터
KR101161923B1 (ko) * 2006-10-03 2012-07-03 유니버시티 오브 메디신 앤드 덴티스트리 오브 뉴 저지 Ａｔａｐ 펩티드, 상기 펩티드를 엔코딩하는 핵산 및 이들과 관련된 사용 방법
KR101815322B1 (ko) * 2010-01-12 2018-01-05 서울대학교산학협력단 항암 펩타이드 서열

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR960034413A (ko) * 1995-03-24 1996-10-22 권계홍 아폽토시스 조절 유전자
CA2245503A1 (en) * 1996-02-14 1997-08-21 Novartis Ag Gene therapy of entothelial cells with anti-apoptotic proteins for transplantation and inflammatory conditions
JP2002516099A (ja) * 1998-05-28 2002-06-04 インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド 腫瘍サプレッサー
CA2296792A1 (en) * 1999-02-26 2000-08-26 Genset S.A. Expressed sequence tags and encoded human proteins

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100434591B1 (ko) * 2002-04-16 2004-06-04 김진우 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포

Also Published As

Publication number Publication date
EP1282641B1 (en) 2006-05-10
EP1282641A1 (en) 2003-02-12
US20040086974A1 (en) 2004-05-06
HK1060136A1 (en) 2004-07-30
JP3749182B2 (ja) 2006-02-22
AU2001220255A1 (en) 2001-11-07
WO2001081387A1 (en) 2001-11-01
DE60027928D1 (de) 2006-06-14
US6977296B2 (en) 2005-12-20
JP2003534783A (ja) 2003-11-25
ATE325812T1 (de) 2006-06-15
EP1282641A4 (en) 2004-05-19
DE60027928T2 (de) 2007-01-04
CA2405983A1 (en) 2001-11-01
KR100426455B1 (ko) 2004-04-13
CN1451016A (zh) 2003-10-22
CN1216909C (zh) 2005-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100426453B1 (ko) 인간 자궁경부암 2 원암 유전자 및 이에 의해 코딩되는단백질, 이를 포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질전환된세포
KR100426455B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포
US20090155896A1 (en) Human Cancer Suppressor Gene, Protein Encoded Therein, Expression Vector Containing The Same, And Cell Transformed By The Vector
KR100689276B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질
KR100426456B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포
KR100434591B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포
KR100426457B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포
JP2008534007A (ja) ヒトのプロトオンコジーンｔｒｇおよび該プロトオンコジーンにコード化されるタンパク質
KR100675976B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질
KR100664589B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 및이를 포함하는 발현 벡터
JP2008525045A (ja) ヒトプロトオンコ遺伝子およびそこにコードされるタンパク質
KR100653835B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포
KR100689286B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 및 이를포함하는 발현 벡터
KR100653836B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 및 이를포함하는 발현 벡터
KR100653839B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 및 이를포함하는 발현 벡터
KR100653837B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 및 이를포함하는 발현 벡터
KR100653838B1 (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 및 이를포함하는 발현 벡터
KR100453478B1 (ko) 인간 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질
KR100503567B1 (ko) 인간 원암유전자 ｈｌｃ-2 및 이에 의해 코드되는 단백질
KR100454065B1 (ko) 인간 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질
KR20090042036A (ko) 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포
KR20020081773A (ko) 인간 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121213

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140106

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160303

Year of fee payment: 13

LAPS Lapse due to unpaid annual fee