JP2008525045A - ヒトプロトオンコ遺伝子およびそこにコードされるタンパク質 - Google Patents
ヒトプロトオンコ遺伝子およびそこにコードされるタンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008525045A JP2008525045A JP2007549263A JP2007549263A JP2008525045A JP 2008525045 A JP2008525045 A JP 2008525045A JP 2007549263 A JP2007549263 A JP 2007549263A JP 2007549263 A JP2007549263 A JP 2007549263A JP 2008525045 A JP2008525045 A JP 2008525045A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- tissue
- protooncogene
- expressed
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Abstract
新規なプロトオンコ遺伝子およびそこにコードされるタンパク質が開示される。ヒトの発癌に関与し、同時に癌転移を誘導する能力を有する新規な遺伝子である本発明のプロトオンコ遺伝子は、肺癌、白血病、子宮癌、リンパ腫、結腸癌、皮膚癌などを含む癌を診断すること、ならびに形質転換動物を作製する場合などのために効果的に使用してもよい。
Description
本発明は、以前に報告されたプロトオンコ遺伝子と相同性を有さないが、癌転移を誘導する能力を有する新規なプロトオンコ遺伝子;およびそこにコードされるタンパク質に関する。
背景技術
ヒトを含む高等動物は約30,000個の遺伝子を有しているが、しかし、これら遺伝子のうち約15パーセントのみが各々の対象において発現することが一般的に知られている。したがって、すべての生命現象、すなわち、発生、分化、恒常性、刺激に対する反応、細胞分裂周期の調節、老化およびアポトーシス(プログラム細胞死)などは、いずれの遺伝子が選択され、発現するかに依存して決定される(Liang,P.and A.B.Pardee,Science 257:967−971,1992)。
ヒトを含む高等動物は約30,000個の遺伝子を有しているが、しかし、これら遺伝子のうち約15パーセントのみが各々の対象において発現することが一般的に知られている。したがって、すべての生命現象、すなわち、発生、分化、恒常性、刺激に対する反応、細胞分裂周期の調節、老化およびアポトーシス(プログラム細胞死)などは、いずれの遺伝子が選択され、発現するかに依存して決定される(Liang,P.and A.B.Pardee,Science 257:967−971,1992)。
腫瘍形成のような病理学的現象は、遺伝的変異によって誘導され、遺伝子発現の変化を生じる。したがって、異なる細胞間における遺伝子発現の比較は、種々の生物学的メカニズムを理解するための基本的かつ基礎的な方法であり得る。例えば、Liang and Pardee(Liang,P.and A.B.Pardee,Science 257:967−971,1992)によって提案されたmRNAディファレンシャルディスプレイ法は、腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調節に関連する遺伝子、およびアポトーシスに関連する転写調節遺伝子などを検索するために有効に使用されており、また、1個の細胞においてのみ生じる種々の遺伝子の相関関係を特定するために広範に利用されている。
発癌の種々の結果を総合して、特定の染色体異型接合性の消失、プロトオンコ遺伝子の活性化、およびp53遺伝子を含む他の腫瘍抑制遺伝子の不活化のような種々の遺伝的変化が腫瘍組織に蓄積され、ヒト腫瘍を発生すると報告されている(Bishop,J.M.,Cell 64:235−248,1991;Hunter,T.,Cell 64:249−270,1991)。また、癌の10〜30%はプロトオンコ遺伝子を増幅することによって活性化されると報告された。結果として、プロトオンコ遺伝子の活性化は、多くの癌の病因学的研究において重要な役割を果たし、それにより、その役割を特定するための試みが行われてきた。
したがって、本発明者らは、肺癌および子宮頸癌が発生するためのメカニズムをプロトオンコ遺伝子レベルで研究し、その結果、ヒト移動−誘発(migration-inducing)遺伝子と命名されたプロトオンコ遺伝子が癌細胞中でのみ発現レベルの特異的な増加を示すことがわかった。プロトオンコ遺伝子は、肺癌、白血病、子宮癌、リンパ腫、結腸癌、皮膚癌のなど種々の癌を診断、予防および治療するために効果的に使用される場合がある。
発明の開示
したがって、本発明は、先行技術の問題を解決することを意図し、これにより、新規なプロトオンコ遺伝子およびそれらのフラグメントを提供することが本発明の目的である。
したがって、本発明は、先行技術の問題を解決することを意図し、これにより、新規なプロトオンコ遺伝子およびそれらのフラグメントを提供することが本発明の目的である。
プロトオンコ遺伝子およびそれらのフラグメントの各々を含む組換えベクター;およびその組換えベクターの各々によって形質転換した微生物を提供することが、本発明の別の目的である。
プロトオンコ遺伝子;およびそれらのフラグメントの各々によってコードされるタンパク質を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
プロトオンコ遺伝子またはそれらのフラグメントの各々を含む、癌および癌転移を診断するためのキットを提供することが、本発明のさらに別の目的である。
タンパク質またはそれらのフラグメントの各々を含む、癌および癌転移を診断するためのキットを提供することが、本発明のまたさらに別の目的である。
上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号1のDNA配列を有するプロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを提供する。
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター;およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
さらに別の目的において、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメントを提供する。
本発明は、配列番号5のDNA配列を有するプロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを提供する。
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター;およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
さらに別の目的において、本発明は、配列番号6のアミノ酸配列を有するタンパク質;またはそのフラグメントを提供する。
本発明は、配列番号9のDNA配列を有するプロトオンコ遺伝子;またはそのフラグメントを提供する。
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター;およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
さらに別の目的において、本発明は、配列番号10アミノ酸配列を有するタンパク質;またはそのフラグメントを提供する。
本発明は配列番号13のDNA配列を有するプロトオンコ遺伝子;またはそのフラグメントを提供する。
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター;およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
さらに別の目的において、本発明は、配列番号14のアミノ酸配列を有するタンパク質;またはそのフラグメントを提供する。
本発明は、配列番号17のDNA配列を有するプロトオンコ遺伝子;またはそのフラグメントを提供する。
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター;およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
さらに別の目的において、本発明は配列番号18のアミノ酸配列を有するタンパク質;またはそのフラグメントを提供する。
本発明は、配列番号21のDNA配列を有するプロトオンコ遺伝子;またはそのフラグメントを提供する。
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター;およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
さらに別の目的において、本発明は、配列番号22のアミノ酸配列を有するタンパク質;またはそのフラグメントを提供する。
本発明は、配列番号25のDNA配列を有するプロトオンコ遺伝子;またはそのフラグメントを提供する。
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター;およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
さらに別の目的において、本発明は、配列番号26のアミノ酸配列を有するタンパク質;またはそのフラグメントを提供する。
本発明は、配列番号29のDNA配列を有するプロトオンコ遺伝子;またはそのフラグメントを提供する。
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター;およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
さらに別の目的において、本発明は、配列番号30のアミノ酸配列を有するタンパク質;またはそのフラグメントを提供する。
本発明は配列番号33のDNA配列を有するプロトオンコ遺伝子;またはそのフラグメントを提供する。
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター;およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
さらに別の目的において、本発明は、配列番号34のアミノ酸配列を有するタンパク質;またはそのフラグメントを提供する。
さらに別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子およびそれらのフラグメントを含む、癌および癌転移を診断するためのキットを提供する。
さらに別の目的において、本発明は、上記プロトオンコタンパク質およびそれらのフラグメントを含む、癌および癌転移を診断するためのキットを提供する。
本発明の好ましい実施形態のこれらおよび他の特徴、態様、および利点を、添付の図面を参照して、上記の詳細な説明において、より完全に説明する。
本明細書において以下では、本発明の好ましい態様を添付の図面を参照して詳細に記載する。
1.MIG3
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子3(MIG3)(本明細書において以下では、MIG3プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号1に示される2,295bp全長DNA配列を有する。
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子3(MIG3)(本明細書において以下では、MIG3プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号1に示される2,295bp全長DNA配列を有する。
配列番号1のDNA配列において、89〜709位のヌクレオチド配列(707〜709位:終止コドン)に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号2に示され、206アミノ酸を含む(本明細書において以下では、「MIG3タンパク質」と呼ぶ。)。
配列番号1のDNA配列は、米国国立衛生研究所(U.S.National Institutes of Health)(NIH)のGenBankデータベースにアクセッション番号AY239293で寄託され(公開日:2004年12月31日)、DNA配列決定の結果は、そのDNA配列がアクセッション番号AK027166でこのデータベースに寄託されたHomo sapiens cDNA:FLJ23513 fis,クローンLNG03869遺伝子のDNA配列と類似していたことを明らかにした。本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は206アミノ酸を含み、そして配列番号2に示されるアミノ酸配列および約23kDaの分子量を有する。
2.MIG8
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子8(MIG8)(本明細書において以下では、MIG8プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号5に示される3,737bp全長DNA配列を有する。
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子8(MIG8)(本明細書において以下では、MIG8プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号5に示される3,737bp全長DNA配列を有する。
配列番号5のDNA配列において、113〜1627位のヌクレオチド配列(1625〜1627位:終止コドン)に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号6に示され、665アミノ酸を含む(本明細書において以下では、「MIG8タンパク質」と呼ぶ。)。
配列番号5のDNA配列は、米国国立衛生研究所(U.S.National Institutes of Health)(NIH)のGenBankデータベースにアクセッション番号AY311389で寄託され(公開日:2004年12月31日)、DNA配列決定の結果は、そのDNA配列がアクセッション番号NM_006595およびNM_021112でこのデータベースに寄託されたHomo sapiensアポトーシスインヒビター5(API5)遺伝子のDNA配列と同一であったが、そのDNA配列のいくつかはHomo sapiensアポトーシスインヒビター5(API5)遺伝子のDNA配列とは異なっていたことを明らかにした。
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は504アミノ酸を含み、そして配列番号6に示されるアミノ酸配列および約57kDaの分子量を有する。
3.MIG10
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子10(MIG10)(本明細書において以下では、MIG10プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号9に示される1,321bp全長DNA配列を有する。
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子10(MIG10)(本明細書において以下では、MIG10プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号9に示される1,321bp全長DNA配列を有する。
配列番号9のDNA配列において、23〜1276位のヌクレオチド配列(1274〜1276位:終止コドン)に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号10に示され、417アミノ酸を含む(本明細書において以下では、「MIG10タンパク質」と呼ぶ。)。
配列番号9のDNA配列は、米国国立衛生研究所(U.S.National Institutes of Health)(NIH)のGenBankデータベースにアクセッション番号AY423725で寄託され(公開日:2004年12月31日)、DNA配列決定の結果は、そのDNA配列がアクセッション番号BC023234およびNM_000291でそれぞれこのデータベースに寄託されたHomo sapiensホスホグリセリン酸キナーゼ1遺伝子およびHomo sapiensホスホグリセリン酸キナーゼ1(PGK1)遺伝子のDNA配列と同一であったことを明らかにした。
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は417アミノ酸を含み、そして配列番号10に示されるアミノ酸配列および約45kDaの分子量を有する。
4.MIG3
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子13(MIG13)(本明細書において以下では、MIG13プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号13に示される1,019bp全長DNA配列を有する。
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子13(MIG13)(本明細書において以下では、MIG13プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号13に示される1,019bp全長DNA配列を有する。
配列番号13のDNA配列において、11〜844位のヌクレオチド配列(842〜844位:終止コドン)に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号14に示され、277アミノ酸を含む(本明細書において以下では、「MIG13タンパク質」と呼ぶ。)。
配列番号13のDNA配列は、米国国立衛生研究所(U.S.National Institutes of Health)(NIH)のGenBankデータベースにアクセッション番号AY336090で寄託され(公開日:2004年12月31日)、DNA配列決定の結果は、そのDNA配列がアクセッション番号CR613087でこのデータベースに寄託されたHomo sapiens(ヒト)のB細胞(Ramos細胞株) Cot 25−標準化の全長cDNAクローンCS0DL001YE02の遺伝子のDNA配列と類似していたことを明らかにした。
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は277アミノ酸を含み、そして配列番号14に示されるアミノ酸配列および約31kDaの分子量を有する。
5.MIG14
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子14(MIG14)(本明細書において以下では、MIG14プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号17に示される1,142bp全長DNA配列を有する。
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子14(MIG14)(本明細書において以下では、MIG14プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号17に示される1,142bp全長DNA配列を有する。
配列番号17のDNA配列において、67〜1125位のヌクレオチド配列(1123〜1125位:終止コドン)に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号18に示され、206アミノ酸を含む(本明細書において以下では、「MIG14タンパク質」と呼ぶ。)。
配列番号17のDNA配列は、米国国立衛生研究所(U.S.National Institutes of Health)(NIH)のGenBankデータベースにアクセッション番号AY336091で寄託され(公開日:2004年12月31日)、DNA配列決定の結果は、そのDNA配列がアクセッション番号NM_003610およびCR626728でそれぞれこのデータベースに寄託されたHomo sapiens RAEl RNA搬出1ホモログ(S.pombe)(RAEl)およびHomo sapiens(ヒト)の胎盤 Cot 25−正常化の全長cDNAクローンCS0DI002YP18の遺伝子のDNA配列と同一であったことを明らかにした。
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は352アミノ酸を含み、そして配列番号18に示されるアミノ酸配列および約39kDaの分子量を有する。
6.MIG18
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子18(MIG18)(本明細書において以下では、MIG18プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号21に示される3,633bp全長DNA配列を有する。
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子18(MIG18)(本明細書において以下では、MIG18プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号21に示される3,633bp全長DNA配列を有する。
配列番号21のDNA配列において、215〜2212位のヌクレオチド配列(2210〜2212位:終止コドン)に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号22に示され、665アミノ酸を含む(本明細書において以下では、「MIG18タンパク質」と呼ぶ。)。
DNA配列決定の結果は、本発明のMIG18プロトオンコ遺伝子が、c−Cbl遺伝子(Langdon,W.Y.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 86: 1168−1172, 1989)への結合によって上皮増殖因子に関連したシグナルを伝達するように機能するHomo sapiens SH3−ドメインキナーゼ結合タンパク質1(SH3KBP1)(GenBankアクセッション番号NM_031892) (Take,H.,et al.,Biochem.Biophy.Res.Comm.268:321−328,2000)と同じタンパク質配列を有していたが、そのDNA配列のいくつかは、Homo sapiens SH3−ドメインキナーゼ結合タンパク質1遺伝子の配列とは異なっていたことを明らかにした。
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は665アミノ酸を含み、そして配列番号22に示されるアミノ酸配列および約73kDaの分子量を有する。
7.MIG19
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子19(MIG19)(本明細書において以下では、MIG19プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号25に示される4,639bp全長DNA配列を有する。
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子19(MIG19)(本明細書において以下では、MIG19プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号25に示される4,639bp全長DNA配列を有する。
配列番号25のDNA配列において、65〜2965位のヌクレオチド配列(2963〜2965位:終止コドン)に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号26に示され、966アミノ酸を含む(本明細書において以下では、「MIG19タンパク質」と呼ぶ。)。
配列番号25のDNA配列は、米国国立衛生研究所(U.S.National Institutes of Health)(NIH)のGenBankデータベースにアクセッション番号AY450308で寄託され(公開日:2004年12月31日)、DNA配列決定の結果は、そのDNA配列がアクセッション番号NM_031862でこのデータベースに寄託されたHomo sapiens膜成分、17染色体、表面マーカー2 (卵巣癌抗原CA125)(M17S2)、転写変異体3遺伝子のDNA配列と同一であったが、その配列のいくつかは上記遺伝子の配列とは異なっていたことを明らかにした。
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は966アミノ酸を含み、そして配列番号26に示されるアミノ酸配列および約107kDaの分子量を有する。
8.MIG5
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子5(MIG5)(本明細書において以下では、MIG5プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号29に示される833bp全長DNA配列を有する。
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子5(MIG5)(本明細書において以下では、MIG5プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号29に示される833bp全長DNA配列を有する。
配列番号29のDNA配列において、159〜737位のヌクレオチド配列(735〜737位:終止コドン)に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号30に示され、192アミノ酸を含む(本明細書において以下では、「MIG5タンパク質」と呼ぶ。)。
配列番号29のDNA配列は、米国国立衛生研究所(U.S.National Institutes of Health)(NIH)のGenBankデータベースにアクセッション番号AY279384で寄託され(公開日:2004年12月31日)、DNA配列決定の結果は、そのDNA配列がアクセッション番号NM_006908でこのデータベースにそれぞれ寄託されたHomo sapiens ras関連C3ボツリヌス毒素基質1(rhoファミリー、低分子量GTP結合タンパク質Rac1)(RACl)、転写変異体Rac1遺伝子のDNA配列と同一であったことを明らかにした。
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は192アミノ酸を含み、そして配列番号30に示されるアミノ酸配列および約21kDaの分子量を有する。
9.MIG7
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子7(MIG7)(本明細書において以下では、MIG7プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号33に示される2,364bp全長DNA配列を有する。
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子7(MIG7)(本明細書において以下では、MIG7プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。)は、配列番号33に示される2,364bp全長DNA配列を有する。
配列番号33のDNA配列において、1435〜1865位のヌクレオチド配列(1683〜1685位:終止コドン)に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号34に示され、76アミノ酸を含む(本明細書において以下では、「MIG7タンパク質」と呼ぶ。)。
配列番号33のDNA配列は、米国国立衛生研究所(U.S.National Institutes of Health)(NIH)のGenBankデータベースにアクセッション番号AY305872で寄託され(公開日:2004年12月31日)、DNA配列決定の結果は、そのDNA配列のいくつかがアクセッション番号NG_001332で寄託された14染色体上のHomo sapiens T細胞受容体アルファデルタ遺伝子座(TCRA/TCRD)の遺伝子、アクセッション番号AE000658、AE000521およびU85195で寄託された完全ヌクレオチド配列の1〜250529塩基(5つのうちのセクション1)からのHomo sapiens T細胞受容体アルファデルタ遺伝子座、ならびにアクセッション番号AF283991で寄託されたHomo sapiens(N6−アデノシン)−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のDNA配列と同一であったことを明らかにした。
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は76アミノ酸を含み、そして配列番号34に示されるアミノ酸配列および約9kDaの分子量を有する。
一方、コドンの縮重のために、または生きている生物にとってのプロトオンコ遺伝子を発現するための優先度を考慮すると、本発明のプロトオンコ遺伝子は、コード領域から発現する発癌性タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなくコード領域中で様々に修飾されてもよく、そしてまた遺伝子発現に影響を与えない範囲でコード領域以外の領域中で様々に修飾もしくは変化してもよい。このような修飾された遺伝子もまた本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明はまた、プロトオンコ遺伝子およびプロトオンコ遺伝子のフラグメントと実質的に同じDNA配列を有するポリヌクレオチドを含む。「実質的に同じポリヌクレオチド」という用語は、同じ翻訳されるタンパク質産物をコードし、かつ本発明のプロトオンコ遺伝子と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、および最も好ましくは95%のDNA配列の相同性を有するポリヌクレオチドを意味する。
また、1つ以上のアミノ酸もまた、タンパク質の機能を変化させない範囲内で、そのタンパク質のアミノ酸配列の中で置換、付加、または欠失されてもよく、そしてそれらの用法に依存してタンパク質のある部分のみを使用してもよい。このような修飾されたアミノ酸配列もまた本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明はまた、発癌性タンパク質およびそのタンパク質のフラグメントと実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「実質的に同じポリペプチド」という用語は、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、および最も好ましくは95%の配列相同性を有するポリペプチドを意味する。
本発明のプロトオンコ遺伝子またはプロトオンコタンパク質は、ヒト組織から分離されるか、DNAまたはペプチドを合成するための既知の方法に従って合成してもよい。また、このように調製した遺伝子は、発現ベクターを得るために、当該分野において公知である微生物中での発現のためにベクターに挿入してもよく、その後、この発現ベクターは、適切な宿主、例えば、Escherichia coli、酵母細胞などに導入してもよい。本発明の遺伝子のDNAを大量に複製してもよく、またはそのタンパク質を、このような形質転換宿主において商業的な量で産生してもよい。
発現ベクターを構築する際に、プロモーターおよびターミネーター、自律的複製配列、分泌シグナルなどのDNA調節配列は、遺伝子またはタンパク質を産生する宿主細胞の種類に依存して、適切に選択および組み合わせしてもよい。
本発明の遺伝子は、肺癌の発生が可能である強力な発癌遺伝子であることが判明している。なぜなら、これらの遺伝子は、ノーザンブロッティングなどの分析方法において、正常肺細胞においてはほとんど発現しなかったが、肺癌組織および肺癌細胞株において過剰発現したからである。また、これらの遺伝子は、その発現が転移性リンパ節癌組織において増加していることを考慮すると、癌転移を誘導することが可能である癌転移関連遺伝子であることが判明している。肺癌などの上皮組織に加えて、本発明のプロトオンコ遺伝子は、白血病、子宮癌、リンパ腫、結腸癌、皮膚癌などの他の癌性腫瘍組織において高度に発現している。したがって、本発明のプロトオンコ遺伝子は、種々の発癌における共通の癌遺伝子であると見なされ、種々の癌を診断するため、および形質転換動物を作製するために使用してもよい。
例えば、プロトオンコ遺伝子を使用して癌を診断するための方法には、すべてまたはいくつかのプロトオンコ遺伝子がプローブとして使用し、被験体の体液から抽出した核酸とハイブリダイズした後で、種々の公知の方法においてプロトオンコ遺伝子を検出することによって、被験体が本発明のプロトオンコ遺伝子を有するか否かを決定する工程が含まれる。これらの遺伝子が組織試料中に存在することは、放射性同位元素、酵素などを用いて標識したプローブを使用することによって容易に確認することができる。したがって、本発明は、すべてまたはいくつかのプロトオンコ遺伝子を含む癌を診断するためのキットを提供する。
形質転換動物は、哺乳動物、例えば、ラットなどの齧歯類に本発明のプロトオンコ遺伝子を導入することによって得られてもよく、これらのプロトオンコ遺伝子は、好ましくは、少なくとも8細胞段階より前の受精卵段階で導入される。このように調製した形質転換動物は、発癌物質または抗癌物質、例えば、抗酸化剤を探索するために効果的に使用してもよい。
本発明のプロトオンコ遺伝子から導かれるタンパク質は、診断ツールとして抗体を産生するために効果的に使用してもよい。本発明の抗体は、本発明のプロトオンコ遺伝子またはそれらのフラグメントから発現したタンパク質を使用して、当該分野で公知の従来の方法に従って、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体として産生してもよく、この理由から、このような抗体は、当該分野において公知である方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、サンドイッチアッセイ、ウェスタンブロッティング、またはポリアクリルアミドゲル上でのイムノブロッティングなどを使用して、本発明のタンパク質が被験体の体液試料中で発現されているか否かを決定することによって、癌または癌転移を診断するために使用してもよい。
また、本発明のプロトオンコ遺伝子は、制御されない様式で増殖し続けることができる癌細胞株を樹立するために使用してもよく、このような細胞株は、例えば、プロトオンコ遺伝子でトランスフェクトした線維芽細胞を使用して、ヌードマウスの背部に発生させた腫瘍組織から産生してもよい。このような癌細胞株は、抗癌剤などを探索するために効果的に使用してもよい。
本明細書において以下では、本発明は好ましい実施例を参照して詳細に説明する。
しかし、本明細書で提案される説明は、例示的目的のための好ましい実施例に過ぎず、本明細書の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例1:腫瘍細胞の培養および総RNAの分離
1−1:MIG3、MIG10、MIG13およびMIG14
(工程1)腫瘍細胞の培養
mRNAディファレンシャルディスプレイ法を行うために、正常肺組織を入手し、そして原発性肺癌組織および右肺に転移した癌組織を、以前に外科手術の際に抗癌剤治療および/または放射線治療を受けていない癌患者から入手した。A549(アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection);ATCC番号CCL−185)をディファレンシャルディスプレイ法におけるヒト肺癌細胞株として使用した。
1−1:MIG3、MIG10、MIG13およびMIG14
(工程1)腫瘍細胞の培養
mRNAディファレンシャルディスプレイ法を行うために、正常肺組織を入手し、そして原発性肺癌組織および右肺に転移した癌組織を、以前に外科手術の際に抗癌剤治療および/または放射線治療を受けていない癌患者から入手した。A549(アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection);ATCC番号CCL−185)をディファレンシャルディスプレイ法におけるヒト肺癌細胞株として使用した。
入手した組織から得られた細胞およびA549肺癌細胞株は、2mMグルタミン、100 IU/mlペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシンおよび10%ウシ胎仔血清(Gibco,U.S)を含むWaymouth′s MB 752/1培地(Gibco)中で増殖させた。本実験で使用した培養細胞は対数増殖期にある細胞であり、トリパンブルー色素排除試験によって少なくとも95%の生存度を示す細胞をここで使用した(Freshney,「Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique」2nd Ed.,A.R.Liss,New York,1987)。
(工程2)RNAの分離およびmRNAディファレンシャルディスプレイ法
総RNA試料を、各々工程1から得られた正常肺組織、原発性肺癌組織、転移性肺癌組織およびA549細胞から、市販のシステムであるRNeasy total RNAキット(Qiagen Inc.,Germany)を使用して分離し、その後、DNA夾雑物をmessage cleanキット(GenHunter Corp.,Brookline,MA,U.S.)を使用してRNA試料から除去した。
総RNA試料を、各々工程1から得られた正常肺組織、原発性肺癌組織、転移性肺癌組織およびA549細胞から、市販のシステムであるRNeasy total RNAキット(Qiagen Inc.,Germany)を使用して分離し、その後、DNA夾雑物をmessage cleanキット(GenHunter Corp.,Brookline,MA,U.S.)を使用してRNA試料から除去した。
1−2:MIG8、MIG18、MIG19、MIG5およびMIG9
(工程1)腫瘍細胞の培養
mRNAディファレンシャルディスプレイ法を行うために、正常子宮外頸部(normal exocervical tissue)組織試料は子宮筋腫に罹患している患者から子宮摘出の間に入手し、原発性子宮頸部腫瘍組織試料および転移性腸骨リンパ節腫瘍組織試料は、外科手術の際に以前に放射線治療および抗癌剤治療を受けていない子宮癌患者から入手した。CUMC−6(Kim,J.W.et al,Gynecol.Oncol.62:230−240,1996)を、ディファレンシャルディスプレイ法におけるヒト子宮頸部癌細胞株として使用した。
(工程1)腫瘍細胞の培養
mRNAディファレンシャルディスプレイ法を行うために、正常子宮外頸部(normal exocervical tissue)組織試料は子宮筋腫に罹患している患者から子宮摘出の間に入手し、原発性子宮頸部腫瘍組織試料および転移性腸骨リンパ節腫瘍組織試料は、外科手術の際に以前に放射線治療および抗癌剤治療を受けていない子宮癌患者から入手した。CUMC−6(Kim,J.W.et al,Gynecol.Oncol.62:230−240,1996)を、ディファレンシャルディスプレイ法におけるヒト子宮頸部癌細胞株として使用した。
入手した組織から得られた細胞およびCUMC−6細胞株は、2mMグルタミン、100 IU/mlペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシンおよび10%ウシ胎仔血清(Gibco,U.S)を含むWaymouth′s MB 752/1培地(Gibco)中で増殖させた。本実験で使用した培養細胞は対数増殖期にある細胞であり、トリパンブルー色素排除試験によって少なくとも95%の生存度を示す細胞をここで使用した(Freshney,「Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique」2nd Ed.,A.R.Liss,New York,1987)。
(工程2)RNAの分離およびmRNAディファレンシャルディスプレイ法
総RNA試料を、各々工程1から得られた正常子宮外頸部組織、原発性子宮頸部癌組織、転移性リンパ節腫瘍組織およびCUMC−6細胞から、市販のシステムであるRNeasy total RNAキット(Qiagen Inc.,Germany)を使用して分離し、その後、DNA夾雑物をmessage cleanキット(GenHunter Corp.,Brookline,MA,U.S.)を使用してRNA試料から除去した。
総RNA試料を、各々工程1から得られた正常子宮外頸部組織、原発性子宮頸部癌組織、転移性リンパ節腫瘍組織およびCUMC−6細胞から、市販のシステムであるRNeasy total RNAキット(Qiagen Inc.,Germany)を使用して分離し、その後、DNA夾雑物をmessage cleanキット(GenHunter Corp.,Brookline,MA,U.S.)を使用してRNA試料から除去した。
実施例2:ディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)
2−1:MIG3
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Liang,P.and A.B.Pardeeによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を使用して実行した。
2−1:MIG3
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Liang,P.and A.B.Pardeeによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を使用して実行した。
最初に、逆転写を、実施例1−1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定(anchored)オリゴ−dTプライマーとして配列番号3に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11A(5−AAGCTTTTTTTTTTTC−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
次いで、PCR反応を、0.5mM[α−35S]dATP(1,200Ci/mmol)の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム5′−11−merプライマー(RNAimageプライマーセット1−5)H−AP1〜40の中の配列番号4に示されるDNA配列を有するプライマーH−AP22(5’−AAGCTTTTGATCC−3’)を使用して実行した。PCR反応を以下の条件下で行った:95℃で40秒間の変性工程、40℃で2分間のアニーリング工程、および72℃で40秒間の伸長工程から成る全体で40回の増幅サイクル、続いて72℃で5分間、1回の最終伸長工程。
PCR反応において増幅したフラグメントは、DNA配列のための6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
L276−811 cDNA(配列番号1の1862〜2166位の塩基)を有する305塩基対(bp)バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを15分間加熱してL276−811 cDNAを溶出させ、その後、PCR反応を、[α−35S]標識dATP(1,200Ci/mmol)および20μM dNTPをその中で使用しないこと以外はL276−811 cDNAを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
2−2:MIG8
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Liang,P.and A.B.Pardeeによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を使用して実行した。
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Liang,P.and A.B.Pardeeによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を使用して実行した。
最初に、逆転写を、実施例1−2の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号7に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11C(5−AAGCTTTTTTTTTTTC−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
次いで、PCR反応を、0.5mM[α−35S]dATP(1,200Ci/mmol)の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム5′−11−merプライマー(RNAimageプライマーセット1−5)H−AP1〜40の中の配列番号8に示されるDNA配列を有するプライマーH−AP23(5’−AAGCTTGGCTATG−3’)を使用して実行した。PCR反応を以下の条件下で行った:95℃で40秒間の変性工程、40℃で2分間のアニーリング工程、および72℃で40秒間の伸長工程から成る全体で40回の増幅サイクル、続いて72℃で5分間、1回の最終伸長工程。
PCR反応において増幅したフラグメントは、DNA配列のための6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
CC231 cDNA(配列番号5の3142〜3483位の塩基)を有する342塩基対(bp)バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを15分間加熱して、CC231 cDNAを溶出させ、その後PCR反応を、[α−35S]標識dATP(1,200Ci/mmol)および20μM dNTPをその中で使用しないこと以外は、CC231 cDNAを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
2−3:MIG10
最初に、逆転写を、実施例1−1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号11に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11C(5−AAGCTTTTTTTTTTTC−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
最初に、逆転写を、実施例1−1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号11に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11C(5−AAGCTTTTTTTTTTTC−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
次いで、PCR反応を、0.5mM[α−35S]dATP(1,200Ci/mmol)の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム5′−11−merプライマー(RNAimageプライマーセット1−5)H−AP1〜40の中の配列番号12に示されるDNA配列を有するプライマーH−AP23(5’−AAGCTTGGCTATG−3’)を使用して実行した。PCR反応を以下の条件下で行った:95℃で40秒間の変性工程、40℃で2分間のアニーリング工程、および72℃で40秒間の伸長工程から成る全体で40回の増幅サイクル、続いて72℃で5分間、1回の最終伸長工程。
PCR反応において増幅したフラグメントは、DNA配列のための6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
L789 cDNA(配列番号9の1022〜1305位の塩基)を有する284塩基対(bp)バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを15分間加熱してL789 cDNAを溶出させ、その後、PCR反応を、[α−35S]標識dATP(1,200Ci/mmol)および20μM dNTPをその中で使用しないこと以外はL789 cDNAを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
2−4:MIG13
最初に、逆転写を、実施例1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号15に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11C(5−AAGCTTTTTTTTTTTC−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
最初に、逆転写を、実施例1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号15に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11C(5−AAGCTTTTTTTTTTTC−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
次いで、PCR反応を、0.5mM[α−35S]dATP(1,200Ci/mmol)の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム5′−11−merプライマー(RNAimageプライマーセット1−5)H−AP1〜40の中の配列番号16に示されるDNA配列を有するプライマーH−AP21(5’−AAGCTTTCTCTGG−3’)を使用して実行した。PCR反応を以下の条件下で行った:95℃で40秒間の変性工程、40℃で2分間のアニーリング工程、および72℃で40秒間の伸長工程から成る全体で40回の増幅サイクル、続いて72℃で5分間、1回の最終伸長工程。
PCR反応において増幅したフラグメントは、DNA配列のための6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
L986 cDNA(配列番号13の685〜979位の塩基)を有する295塩基対(bp)バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを15分間加熱してL986 cDNAを溶出させ、その後、PCR反応を、[α−35S]標識dATP(1,200Ci/mmol)および20μM dNTPをその中で使用しないこと以外はL986 cDNAを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
2−5:MIG14
最初に、逆転写を、実施例1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号19に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11A(5−AAGCTTTTTTTTTTTA−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
最初に、逆転写を、実施例1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号19に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11A(5−AAGCTTTTTTTTTTTA−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
次いで、PCR反応を、0.5mM[α−35S]dATP(1,200Ci/mmol)の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム5′−11−merプライマー(RNAimageプライマーセット1−5)H−AP1〜40の中の配列番号20に示されるDNA配列を有するプライマーH−AP21(5’−AAGCTTTCTCTGG−3’)を使用して実行した。PCR反応を以下の条件下で行った:95℃で40秒間の変性工程、40℃で2分間のアニーリング工程、および72℃で40秒間の伸長工程から成る全体で40回の増幅サイクル、続いて72℃で5分間、1回の最終伸長工程。
PCR反応において増幅したフラグメントは、DNA配列のための6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
L1284 cDNA(配列番号17の823〜1098位の塩基)を有する276塩基対(bp)バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを15分間加熱してL1284 cDNAを溶出させ、その後、PCR反応を、[α−35S]標識dATP(1,200Ci/mmol)および20μM dNTPをその中で使用しないこと以外はL1284 cDNAを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
2−6:MIG18
最初に、逆転写を、実施例1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号23に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11A(5−AAGCTTTTTTTTTTTA−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
最初に、逆転写を、実施例1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号23に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11A(5−AAGCTTTTTTTTTTTA−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
次いで、PCR反応を、0.5mM[α−35S]dATP(1,200Ci/mmol)の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム5′−11−merプライマー(RNAimageプライマーセット1−5)H−AP1〜40の中の配列番号24に示されるDNA配列を有するプライマーH−AP36(5’−AAGCTTCGACGCT−3’)を使用して実行した。PCR反応を以下の条件下で行った:95℃で40秒間の変性工程、40℃で2分間のアニーリング工程、および72℃で40秒間の伸長工程から成る全体で40回の増幅サイクル、続いて72℃で5分間、1回の最終伸長工程。
PCR反応において増幅したフラグメントは、DNA配列のための6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
CA367 cDNA(配列番号21の2920〜3140位の塩基)を有する221塩基対(bp)バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを15分間加熱してCA367 cDNAを溶出させ、その後、PCR反応を、[α−35S]標識dATP(1,200Ci/mmol)および20μM dNTPをその中で使用しないこと以外はCA367 cDNAを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
2−7:MIG18
最初に、逆転写を、実施例1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号27に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11A(5−AAGCTTTTTTTTTTTA−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
最初に、逆転写を、実施例1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号27に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11A(5−AAGCTTTTTTTTTTTA−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
次いで、PCR反応を、0.5mM[α−35S]dATP(1,200Ci/mmol)の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム5′−11−merプライマー(RNAimageプライマーセット1−5)H−AP1〜40の中の配列番号28に示されるDNA配列を有するプライマーH−AP33(5’−AAGCTTGCTGCTC−3’)を使用して実行した。PCR反応を以下の条件下で行った:95℃で40秒間の変性工程、40℃で2分間のアニーリング工程、および72℃で40秒間の伸長工程から成る全体で40回の増幅サイクル、続いて72℃で5分間、1回の最終伸長工程。
PCR反応において増幅したフラグメントは、DNA配列のための6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
CA335 cDNA(配列番号25の4123〜4503位の塩基)を有する381塩基対(bp)バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを15分間加熱してCA335 cDNAを溶出させ、その後、PCR反応を、[α−35S]標識dATP(1,200Ci/mmol)および20μM dNTPをその中で使用しないこと以外はCA335 cDNAを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
2−8:MIG5
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Liang,P.and A.B.Pardeeによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を使用して実行した。
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Liang,P.and A.B.Pardeeによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を使用して実行した。
最初に、逆転写を、実施例1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号31に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11G(5−AAGCTTTTTTTTTTTG−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
次いで、PCR反応を、0.5mM[α−35S]dATP(1,200Ci/mmol)の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム5′−11−merプライマー(RNAimageプライマーセット1−5)H−AP1〜40の中の配列番号32に示されるDNA配列を有するプライマーH−AP26(5’−AAGCTTGCCATGG−3’)を使用して実行した。PCR反応を以下の条件下で行った:95℃で40秒間の変性工程、40℃で2分間のアニーリング工程、および72℃で40秒間の伸長工程から成る全体で40回の増幅サイクル、続いて72℃で5分間、1回の最終伸長工程。
PCR反応において増幅したフラグメントは、DNA配列のための6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
CG263 cDNA(配列番号29の476〜738位の塩基)を有する263塩基対(bp)バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを15分間加熱してCG263 cDNAを溶出させ、その後、PCR反応を、[α−35S]標識dATP(1,200Ci/mmol)および20μM dNTPをその中で使用しないこと以外はCG263 cDNAを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
2−9:MIG7
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Liang,P.and A.B.Pardeeによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を使用して実行した。
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Liang,P.and A.B.Pardeeによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を使用して実行した。
最初に、逆転写を、実施例1の工程1において得た各々の総RNA 0.2μgに対して、固定オリゴ−dTプライマーとして配列番号35に示されるDNA配列を有する固定プライマーH−T11G(5−AAGCTTTTTTTTTTTG−3’,RNAimageキット,Genhunter,Cor.,MA,U.S.)を使用して行った。
次いで、PCR反応を、0.5mM[α−35S]dATP(1,200Ci/mmol)の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム5′−11−merプライマー(RNAimageプライマーセット1−5)H−AP1〜40の中の配列番号36に示されるDNA配列を有するプライマーH−AP23(5’−AAGCTTGGCTATG−3’)を使用して実行した。PCR反応を以下の条件下で行った:95℃で40秒間の変性工程、40℃で2分間のアニーリング工程、および72℃で40秒間の伸長工程から成る全体で40回の増幅サイクル、続いて72℃で5分間、1回の最終伸長工程。
PCR反応において増幅したフラグメントは、DNA配列のための6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
CG233 cDNA(配列番号33の1903〜2229位の塩基)を有する327塩基対(bp)バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを15分間加熱してCG233 cDNAを溶出させ、その後、PCR反応を、[α−35S]標識dATP(1,200Ci/mmol)および20μM dNTPをその中で使用しないこと以外はCG233 cDNAを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
実施例3:クローニング
上記のようにすべて再増幅したL276−811 PCR産物;CC231 PCR産物;L789 PCR産物;L986 PCR産物;L1284 PCR産物;CA367 PCR産物;CA335 PCR産物;CG263 PCR産物;およびCG233 PCR産物を、製造業者のマニュアルに従ってTAクローニングシステム(Promega,U.S.)を使用して、それぞれpGEM−T EASYベクターに挿入した。
上記のようにすべて再増幅したL276−811 PCR産物;CC231 PCR産物;L789 PCR産物;L986 PCR産物;L1284 PCR産物;CA367 PCR産物;CA335 PCR産物;CG263 PCR産物;およびCG233 PCR産物を、製造業者のマニュアルに従ってTAクローニングシステム(Promega,U.S.)を使用して、それぞれpGEM−T EASYベクターに挿入した。
(工程1)ライゲーション反応
実施例2においてすべて再増幅したL276−811 PCR産物;CC231 PCR産物;L789 PCR産物;L986 PCR産物;L1284 PCR産物;CA367 PCR産物;CA335 PCR産物;CG263 PCR産物;およびCG233 PCR産物各2μl、pGEM−T EASYベクター1μl(50ng)、T4 DNAリガーゼ(10×緩衝液)1μl、ならびにT4 DNAリガーゼ(3ワイス(weiss)単位/μl;Promega)1μlを0.5ml試験管に取り、蒸留水をそこに加えて最終容量を10μlにした。ライゲーション反応混液を14℃で一晩インキュベートした。
実施例2においてすべて再増幅したL276−811 PCR産物;CC231 PCR産物;L789 PCR産物;L986 PCR産物;L1284 PCR産物;CA367 PCR産物;CA335 PCR産物;CG263 PCR産物;およびCG233 PCR産物各2μl、pGEM−T EASYベクター1μl(50ng)、T4 DNAリガーゼ(10×緩衝液)1μl、ならびにT4 DNAリガーゼ(3ワイス(weiss)単位/μl;Promega)1μlを0.5ml試験管に取り、蒸留水をそこに加えて最終容量を10μlにした。ライゲーション反応混液を14℃で一晩インキュベートした。
(工程2)TAクローンの形質転換
E.coli JM109 (Promega,WI,U.S.)を、LBブロス(バクト−トリプトン10g、バクト−酵母抽出物5g、NaCl 5g)10ml中で、600nmにおける光学密度が0.3〜0.6に達するまでインキュベートした。このインキュベートした混液を約10分間氷上に保持し、4,000rpmで10分間、4℃にて遠心分離し、その後上清を廃棄し、そして細胞を収集した。収集した細胞ペレットを0.1M氷冷CaCl210mlに約30分間から約1時間曝露し、コンピテント細胞を生成する。この生成物を再度4,000rpm、10分間、4℃にて再度遠心分離し、その後、上清を廃棄し、細胞を収集し、0.1M氷冷CaCl22mlに懸濁した。
E.coli JM109 (Promega,WI,U.S.)を、LBブロス(バクト−トリプトン10g、バクト−酵母抽出物5g、NaCl 5g)10ml中で、600nmにおける光学密度が0.3〜0.6に達するまでインキュベートした。このインキュベートした混液を約10分間氷上に保持し、4,000rpmで10分間、4℃にて遠心分離し、その後上清を廃棄し、そして細胞を収集した。収集した細胞ペレットを0.1M氷冷CaCl210mlに約30分間から約1時間曝露し、コンピテント細胞を生成する。この生成物を再度4,000rpm、10分間、4℃にて再度遠心分離し、その後、上清を廃棄し、細胞を収集し、0.1M氷冷CaCl22mlに懸濁した。
コンピテント細胞懸濁液200μlを新たな微量遠心管に移し、工程1で調製したライゲーション反応生成物2μlをそこに加えた。得られた混液を42℃で90秒間ウォーターバス中でインキュベートし、その後0℃でクエンチした。SOC培地(バクト−トリプトン2.0g、バクト−酵母抽出物0.5g、1M NaCl 1ml、1M KCl 0.25ml、TDW 97ml、2M Mg2+ 1ml、2Mグルコース1ml)800μlをそこに加え、得られた混液を37℃で45分間、220rpmの回転振盪インキュベーター中でインキュベートした。
X−gal 25μl(ジメチルホルムアミド40mg/ml中に保存)を、アンピシリンを補充しかつ事前に37℃のインキュベーター中に置いたLBプレート上にガラス棒を用いて広げ、形質転換細胞25μlをそこに加え、再度ガラス棒を用いて広げ、その後37℃でインキュベートした。インキュベーション後、3〜4個の白色コロニーを選択し、選択した細胞の各々をアンピシリンを補充したLBプレート中で種培養した。プラスミドを構築するために、ライゲーション反応生成物が導入されたコロニーと見なされるコロニー、すなわち、形質転換したJM109/L276−811;JM109/CC231;JM109/L789;JM109/L986;JM109/L1284;JM109/CA367;JM109/CA335;JM109/CG263;およびJM109/CG233をそれぞれ選択し、テリフィック(terrific)ブロス(TDW 900ml、バクト−トリプトン12g、バクト−酵母抽出物24g、グリセロール4ml、0.17M KH2PO4、0.72N K2HPO4 100ml)10ml中でインキュベートした。
実施例4:リコンビナントプラスミドDNAの分離
L276−811プラスミドDNA;CC231プラスミドDNA;L789プラスミドDNA;L986プラスミドDNA;L1284プラスミドDNA;CA367プラスミドDNA;CA335プラスミドDNA;CG263プラスミドDNA;およびCG233プラスミドDNAの各々を、製造業者のマニュアルに従ってWizard(商標) Plus Minipreps DNA精製キット(Promega,U.S.)を使用して形質転換E.coli株から分離した。
L276−811プラスミドDNA;CC231プラスミドDNA;L789プラスミドDNA;L986プラスミドDNA;L1284プラスミドDNA;CA367プラスミドDNA;CA335プラスミドDNA;CG263プラスミドDNA;およびCG233プラスミドDNAの各々を、製造業者のマニュアルに従ってWizard(商標) Plus Minipreps DNA精製キット(Promega,U.S.)を使用して形質転換E.coli株から分離した。
分離した各プラスミドDNAの一部を制限酵素ECoRIで処理し、L276−811;CC231;L789;L986;L1284;CA367;CA335;CG263;およびCG233の部分配列をそれぞれプラスミドに挿入したことを、2%ゲル中で電気泳動を行うことによって確認した。
実施例5:DNA配列決定分析
5−1:MIG3
実施例2で得たL276−811 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたL276−811 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
5−1:MIG3
実施例2で得たL276−811 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたL276−811 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
上記遺伝子のDNA配列は配列番号1の1862〜2166位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「L276−811」と名付けた。
上記で得られた305bp cDNAフラグメント、例えば、L276−811は、5′ランダムプライマーH−AP22および3′固定プライマーH−T11Aを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
図1に示されるように、この遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびA549肺癌細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ(DD)から明らかにされた。図1において見られるように、305bp cDNAフラグメントL276−811は、肺癌組織、転移性肺癌組織、およびA549肺癌組織において発現したが、正常肺組織においては発現されなかった。L276−811遺伝子は癌細胞、特に転移性癌組織において最も高度に発現した。
5−2:MIG8
実施例2で得たCC231 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたCC231 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
実施例2で得たCC231 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたCC231 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
上記遺伝子のDNA配列は配列番号5の3142〜3483位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「CC231」と名付けた。
上記で得られた342bp cDNAフラグメント、例えば、CC231は、5′ランダムプライマーH−AP23および3′固定プライマーH−T11Cを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
図2に示されるように、この遺伝子が正常子宮外頸部組織、転移性リンパ節組織、およびCUMC−6細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ(DD)から明らかにされた。図2において見られるように、342bp cDNAフラグメントCC231は、子宮頸部癌、転移性リンパ節組織、およびCUMC−6細胞において発現したが、正常組織においては発現されなかった。
5−3:MIG10
実施例2で得たL789 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたL789 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
実施例2で得たL789 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたL789 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
上記遺伝子のDNA配列は配列番号9の1022〜1305位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「L789」と名付けた。
上記で得られた284bp cDNAフラグメント、例えば、L789は、5′ランダムプライマーH−AP23および3′固定プライマーH−T11Cを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
図3に示されるように、この遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびA549肺癌細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ(DD)から明らかにされた。図3において見られるように、255bp cDNAフラグメントL276は、肺癌組織、転移性肺癌組織、およびA549肺癌組織において発現したが、正常肺組織においては発現されなかった。L276遺伝子は癌細胞、特に転移性癌組織において最も高度に発現した。
5−4:MIG3
実施例2で得たL986 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたL986 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
実施例2で得たL986 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたL986 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
上記遺伝子のDNA配列は配列番号13の685〜979位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「L986」と名付けた。
上記で得られた295bp cDNAフラグメント、例えば、L986は、5′ランダムプライマーH−AP21および3′固定プライマーH−T11Cを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
図4に示されるように、この遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびA549肺癌細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ(DD)から明らかにされた。図4において見られるように、295bp cDNAフラグメントL986は、肺癌組織、転移性肺癌組織、およびA549肺癌組織において発現したが、正常肺組織においては発現されなかった。L276−811遺伝子は癌細胞、特に転移性癌組織において最も高度に発現した。
5−5:MIG14
実施例2で得たL1284 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたL1284 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
実施例2で得たL1284 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたL1284 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
上記遺伝子のDNA配列は配列番号17の823〜1098位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「L1284」と名付けた。
上記で得られた276bp cDNAフラグメント、例えば、L1284は、5′ランダムプライマーH−AP21および3′固定プライマーH−T11Aを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
図5に示されるように、この遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびA549肺癌細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ(DD)から明らかにされた。図5において見られるように、276bp cDNAフラグメントL1284は、肺癌組織、転移性肺癌組織、およびA549肺癌組織において発現したが、正常肺組織においては発現されなかった。L1284遺伝子は癌細胞、特に転移性癌組織において最も高度に発現した。
5−6:MIG18
実施例2で得たCA367 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたCA367 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
実施例2で得たCA367 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたCA367 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
上記遺伝子のDNA配列は配列番号21の2920〜3140位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「CA367」と名付けた。
上記で得られた221bp cDNAフラグメント、例えば、CA367は、5′ランダムプライマーH−AP36および3′固定プライマーH−T11Aを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
図6に示されるように、この遺伝子が正常子宮外頸部組織、転移性リンパ節組織、およびCUMC−6細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ(DD)から明らかにされた。図6において見られるように、221bp cDNAフラグメントA367は、子宮頸部癌、転移性リンパ節組織、およびCUMC−6細胞において発現したが、正常組織においては発現されなかった。
5−7:MIG19
実施例2で得たCA335 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたCA335 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
実施例2で得たCA335 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたCA335 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
上記遺伝子のDNA配列は配列番号25の4123〜4503位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「CA335」と名付けた。
上記で得られた381bp cDNAフラグメント、例えば、CA335は、5′ランダムプライマーH−AP33および3′固定プライマーH−T11Aを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
図7に示されるように、この遺伝子が正常子宮外頸部組織、転移性リンパ節組織、およびCUMC−6細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ(DD)から明らかにされた。図7において見られるように、381bp cDNAフラグメントCA335は、子宮頸部癌、転移性リンパ節組織、およびCUMC−6細胞において発現したが、正常組織においては発現されなかった。
5−8:MIG5
実施例2で得たCG263 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたCG263 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
実施例2で得たCG263 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたCG263 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
上記遺伝子のDNA配列は配列番号29の476〜738位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「CG263」と名付けた。
上記で得られた263bp cDNAフラグメント、例えば、CG263は、5′ランダムプライマーH−AP26および3′固定プライマーH−T11Gを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
図8に示されるように、この遺伝子が正常子宮外頸部組織、転移性リンパ節組織、およびCUMC−6細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ(DD)から明らかにされた。図8において見られるように、263bp cDNAフラグメントCG263は、子宮頸部癌、転移性リンパ節組織、およびCUMC−6細胞において発現したが、正常組織においては発現されなかった。
5−9:MIG7
実施例2で得たCG233 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたCG233 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
実施例2で得たCG233 PCR産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたCG233 PCR産物を、Sequenase version 2.0 DNAシークエンシングキット(United States Biochemical,Cleveland,OH,U.S.)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
上記遺伝子のDNA配列は配列番号33の1903〜2229位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「CG233」と名付けた。
上記で得られた327bp cDNAフラグメント、例えば、CG233は、5′ランダムプライマーH−AP23および3′固定プライマーH−T11Gを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
図9に示されるように、この遺伝子が正常子宮外頸部組織、転移性リンパ節組織、およびCUMC−6細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ(DD)から明らかにされた。図9において見られるように、327bp cDNAフラグメントCG233は、子宮頸部癌、転移性リンパ節組織、およびCUMC−6細胞において発現したが、正常組織においては発現されなかった。
実施例6:全長プロトオンコ遺伝子のcDNA配列
6−1:MIG3
32P標識したL276−811をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入されている2295bpフラグメントの全長MIG3 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年2月19日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY239293で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
6−1:MIG3
32P標識したL276−811をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入されている2295bpフラグメントの全長MIG3 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年2月19日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY239293で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
λpCEVベクターに挿入されているMIG3クローンを制限酵素NotIによって切断し、アンピシリン耐性pCEV−LACファージミドベクターの型でファージから単離した(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)。
MIG3遺伝子を含むpCEV−LACベクターはT4 DNAリガーゼによってライゲーションを行ってMIG3プラスミドDNAを得て、その後E.coli DH5αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
配列番号1のDNA配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは89〜709位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号2の206アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
6−2:MIG8
32P標識したCC231をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された3737bpフラグメントの全長MIG8 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年6月1日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY311389で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
32P標識したCC231をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された3737bpフラグメントの全長MIG8 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年6月1日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY311389で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
λpCEVベクターに挿入されたMIG8クローンを制限酵素NotIによって切断し、アンピシリン耐性pCEV−LACファージミドベクターの型でファージから単離した(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)。
MIG8遺伝子を含むpCEV−LACベクターはT4 DNAリガーゼによってライゲーションを行ってMIG8プラスミドDNAを得て、その後E.coli DH5αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
3737bpから成るMIG18の全長DNA配列は配列番号5に示した。
配列番号5のDNA配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは113〜1627位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号6の504アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
6−3:MIG10
32P標識したL789をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された1321bpフラグメントの全長MIG10 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年9月26日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY423725で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
32P標識したL789をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された1321bpフラグメントの全長MIG10 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年9月26日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY423725で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
λpCEVベクターに挿入されたMIG10クローンを制限酵素NotIによって切断し、アンピシリン耐性pCEV−LACファージミドベクターの型でファージから単離した(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)。
MIG10遺伝子を含むpCEV−LACベクターはT4 DNAリガーゼによってライゲーションを行ってMIG10プラスミドDNAを得て、その後E.coli DH5αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
配列番号9のDNA配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは23〜1276位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号10の417アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
6−4:MIG13
32P標識したL986をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された1019bpフラグメントの全長MIG13 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年7月7日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY336090で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
32P標識したL986をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された1019bpフラグメントの全長MIG13 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年7月7日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY336090で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
λpCEVベクターに挿入されたMIG13クローンを制限酵素NotIによって切断し、アンピシリン耐性pCEV−LACファージミドベクターの型でファージから単離した(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)。
MIG13遺伝子を含むpCEV−LACベクターはT4 DNAリガーゼによってライゲーションを行ってMIG13プラスミドDNAを得て、その後E.coli DH5αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
配列番号13のDNA配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは11〜844位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号14の277アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
6−5:MIG14
32P標識したL1284をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された1142bpフラグメントの全長MIG14 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年7月4日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY336091で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
32P標識したL1284をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された1142bpフラグメントの全長MIG14 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年7月4日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY336091で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
λpCEVベクターに挿入されたMIG14クローンを制限酵素NotIによって切断し、アンピシリン耐性pCEV−LACファージミドベクターの型でファージから単離した(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)。
MIG14遺伝子を含むpCEV−LACベクターはT4 DNAリガーゼによってライゲーションを行ってMIG14プラスミドDNAを得て、その後E.coli DH5αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
配列番号17のDNA配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは67〜1125位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号18の352アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
6−6:MIG18
32P標識したCA367をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された3633bpフラグメントの全長MIG18 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年9月30日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY423734で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
32P標識したCA367をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された3633bpフラグメントの全長MIG18 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年9月30日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY423734で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
λpCEVベクターに挿入されたMIG18クローンを制限酵素NotIによって切断し、アンピシリン耐性pCEV−LACファージミドベクターの型でファージから単離した(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)。
MIG18遺伝子を含むpCEV−LACベクターはT4 DNAリガーゼによってライゲーションを行ってMIG18プラスミドDNAを得て、その後E.coli DH5αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
3633bpから成るMIG18の全長DNA配列は配列番号21に示した。
配列番号21のDNA配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは215〜2212位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号22の665アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
6−7:MIG19
32P標識したCA335をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された4639bpフラグメントの全長MIG19 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年10月26日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY450308で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
32P標識したCA335をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された4639bpフラグメントの全長MIG19 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年10月26日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY450308で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
λpCEVベクターに挿入されたMIG19クローンを制限酵素NotIによって切断し、アンピシリン耐性pCEV−LACファージミドベクターの型でファージから単離した(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)。
MIG19遺伝子を含むpCEV−LACベクターはT4 DNAリガーゼによってライゲーションを行ってMIG19プラスミドDNAを得て、その後E.coli DH5αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
4639bpから成るMIG19の全長DNA配列は配列番号25に示した。
配列番号25のDNA配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは65〜2965位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号26の966アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
6−8:MIG5
32P標識したCG263をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。833bpフラグメントのpCEV−LACベクターに挿入された全長MIG5 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年4月19日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY279384で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
32P標識したCG263をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。833bpフラグメントのpCEV−LACベクターに挿入された全長MIG5 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年4月19日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY279384で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
λpCEVベクターに挿入されたMIG5クローンを制限酵素NotIによって切断し、アンピシリン耐性pCEV−LACファージミドベクターの型でファージから単離した(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)。
MIG5遺伝子を含むpCEV−LACベクターはT4 DNAリガーゼによってライゲーションを行ってMIG5プラスミドDNAを得て、その後E.coli DH5αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
833bpから成るMIG5の全長DNA配列は配列番号29に示した。
配列番号29のDNA配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは159〜737位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号30の192アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
6−9:MIG7
32P標識したCG233をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された2364bpフラグメントの全長MIG7 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年5月24日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY305872で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
32P標識したCG233をプローブとして使用して、バクテリオファージλgt11ヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリー(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)をスクリーニングした。pCEV−LACベクターに挿入された2364bpフラグメントの全長MIG7 cDNAクローンをヒト肺胚性線維芽細胞cDNAライブラリーから得て、その後これを2003年5月24日にU.S.NIHのGenBankデータベースにアクセッション番号AY305872で寄託した(公開日:2004年12月31日)。
λpCEVベクターに挿入されたMIG7クローンを制限酵素NotIによって切断し、アンピシリン耐性pCEV−LACファージミドベクターの型でファージから単離した(Miki,T.et al,Gene 83:137−146,1989)。
MIG7遺伝子を含むpCEV−LACベクターはT4 DNAリガーゼによってライゲーションを行ってMIG7プラスミドDNAを得て、その後E.coli DH5αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。2364bpからなるMIG7の全長DNA配列は配列番号33に示した。
配列番号33のDNA配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは1435〜1665位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号4の76アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
実施例7:種々の細胞における遺伝子のノーザンブロッティング分析
7−1:MIG3、MIG10、MIG13およびMIG14
総RNA試料を、正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、ならびにA549肺癌細胞株およびNCL−H358肺癌細胞株(アメリカンタイプカルチャーコレクション;ATCC番号CRL−5807)から、実施例1におけるものと同じ様式で抽出した。
7−1:MIG3、MIG10、MIG13およびMIG14
総RNA試料を、正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、ならびにA549肺癌細胞株およびNCL−H358肺癌細胞株(アメリカンタイプカルチャーコレクション;ATCC番号CRL−5807)から、実施例1におけるものと同じ様式で抽出した。
MIG3;MIG1O;MIG13およびMIG14の遺伝子の各々の発現レベルを決定するために、各々の組織および細胞株から抽出した各々の総変性RNA試料20μgを1%ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動し、その後、得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン(Boehringer−Mannheim,Germany)に転写した。次いで、このブロットを、Rediprime II ランダムプライムラベリングシステム(Amersham,United Kingdom)を使用して調製した、32P−標識されかつランダムプライムされた全長MIG cDNAプローブとハイブリダイズした。ノーザンブロッティング手順を2回反復し、こうして得られたブロットをデンシトメーターを用いて定量し、そしてβ−アクチンを用いて標準化した。
図10(a)は、MIG3プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、肺癌組織、転移性肺癌組織、および肺癌細胞株(A549およびNCI−H358)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図10(a)に示されるように、MIG3プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、肺癌組織、転移性肺癌組織、ならびにA549肺癌細胞株およびNCI−H358肺癌細胞株において有意に増加したが、正常肺組織においては極めて低く検出されるかまたは検出されなかったことが明らかにされた。図10(a)において、「正常」レーンは正常肺組織を表し、「癌」レーンは肺癌組織を表し、「転移」レーンは転移性肺癌組織を表し、そして「A549」レーンおよび「NCI−H358」レーンの各々は肺癌細胞株を表す。図10(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
図24(a)は、MIG3プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織(Clontech)、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図24(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図24(a)に示されるように、MIG3 mRNA転写物(約4.0kb)は正常組織において極めて弱く発現したことが明らかにされた。
図38(a)は、MIG3プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、HL−60、HeLa、K−562、MOLT−4、Raji、SW480、A549、およびG361(Clontech)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図38(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図38(a)に示されるように、MIG3プロトオンコ遺伝子は、前骨髄球性白血病細胞株HL−60、HeLa子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株K−562、リンパ芽球性白血病株MOLT−4、バーキットリンパ腫細胞株Raji、結腸癌細胞株SW480、肺癌細胞株A549、および皮膚癌細胞株G361において極めて高度に発現したことが明らかにされた。
図13(a)は、MIG10プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、肺癌組織、転移性肺癌組織、および肺癌細胞株(A549およびNCI−H358)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図13(a)に示されるように、MIG10プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、肺癌組織、転移性肺癌組織、ならびにA549肺癌細胞株およびNCI−H358肺癌細胞株において有意に増加したが、正常肺組織においては極めて低く検出されるかまたは検出されなかったことが明らかにされた。図13(a)において、「正常」レーンは正常肺組織を表し、「癌」レーンは肺癌組織を表し、「転移」レーンは転移性肺癌組織を表し、そして「A549」レーンおよび「NCI−H358」レーンの各々は肺癌細胞株を表す。図13(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
図27(a)は、MIG10プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織(Clontech)、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図27(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図27(a)に示されるように、MIG10 mRNA転写物(約2.0kb)は正常組織において極めて弱く発現したことが明らかにされた。
図41(a)は、MIG10プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、HL−60、HeLa、K−562、MOLT−4、Raji、SW480、A549、およびG361(Clontech)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図41(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図41(a)に示されるように、MIG10プロトオンコ遺伝子は、前骨髄球性白血病細胞株HL−60、HeLa子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株K−562、リンパ芽球性白血病株MOLT−4、バーキットリンパ腫細胞株Raji、結腸癌細胞株SW480、肺癌細胞株A549、および皮膚癌細胞株G361において極めて高度に発現したことが明らかにされた。2.9kb mRNA転写物に加えて、約2.4kbのmRNA転写物もまた発現したこともまた認められた。
図14(a)は、MIG13プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、肺癌組織、転移性肺癌組織、および肺癌細胞株(A549およびNCI−H358)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図14(a)に示されるように、MIG13プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、肺癌組織、転移性肺癌組織、ならびにA549肺癌細胞株およびNCI−H358肺癌細胞株において有意に増加したが、正常肺組織においては極めて低く検出されるかまたは検出されなかったことが明らかにされた。図14(a)において、「正常」レーンは正常肺組織を表し、「癌」レーンは肺癌組織を表し、「転移」レーンは転移性肺癌組織を表し、そして「A549」レーンおよび「NCI−H358」レーンの各々は肺癌細胞株を表す。図14(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
図28(a)は、MIG13プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織(Clontech)、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図28(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図28(a)に示されるように、MIG13 mRNA転写物(約1.7kbの優性転写物および1.4kbの転写物)は正常組織において極めて弱く発現したかまたは検出されなかったことが明らかにされた。
図42(a)は、MIG13プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、HL−60、HeLa、K−562、MOLT−4、Raji、SW480、A549、およびG361(Clontech)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図42(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図42(a)に示されるように、MIG14 mRNA転写物(約1.7kbの優性転写物および1.4kbの転写物)は、前骨髄球性白血病細胞株HL−60、HeLa子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株K−562、リンパ芽球性白血病株MOLT−4、バーキットリンパ腫細胞株Raji、結腸癌細胞株SW480、肺癌細胞株A549、および皮膚癌細胞株G361において極めて高度に発現したことが明らかにされた。
図15(a)は、MIG14プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、肺癌組織、転移性肺癌組織、および肺癌細胞株(A549およびNCI−H358)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図15(a)に示されるように、MIG14プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、肺癌組織、転移性肺癌組織、ならびにA549肺癌細胞株およびNCI−H358肺癌細胞株において有意に増加したが、正常肺組織においては極めて低く検出されるかまたは検出されなかったことが明らかにされた。図15(a)において、「正常」レーンは正常肺組織を表し、「癌」レーンは肺癌組織を表し、「転移」レーンは転移性肺癌組織を表し、そして「A549」レーンおよび「NCI−H358」レーンの各々は肺癌細胞株を表す。図15(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
図29(a)は、MIG14プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織(Clontech)、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図29(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図29(a)に示されるように、MIG14 mRNA転写物(約1.3kbの優性転写物および2kbの転写物)は正常組織において極めて弱く発現したかまたは検出されなかったことが明らかにされた。
図43(a)は、MIG14プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、HL−60、HeLa、K−562、MOLT−4、Raji、SW480、A549、およびG361(Clontech)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図43(b)は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図43(a)に示されるように、MIG14 mRNA転写物(約1.3kbの優性転写物および2kbの転写物)は、前骨髄球性白血病細胞株HL−60、HeLa子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株K−562、リンパ芽球性白血病株MOLT−4、バーキットリンパ腫細胞株Raji、結腸癌細胞株SW480、肺癌細胞株A549、および皮膚癌細胞株G361において極めて高度に発現したことが明らかにされた。
7−2:MIG8、MIG18、MIG19、MIG5およびMIG7
総RNA試料を、正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、ならびに子宮頸部癌細胞株CaSki(ATCC CRL 1550)およびCUMC−6から、実施例1におけるものと同じ様式で抽出した。
総RNA試料を、正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、ならびに子宮頸部癌細胞株CaSki(ATCC CRL 1550)およびCUMC−6から、実施例1におけるものと同じ様式で抽出した。
MIG8;MIG18;MIG19;MIG5およびMIG7の遺伝子の各々の発現レベルを決定するために、各々の組織および細胞株から抽出した各々の総変性RNA試料20μgを1%ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動し、その後、得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン(Boehringer−Mannheim,Germany)に転写した。次いで、このブロットを、Rediprime II ランダムプライムラベリングシステム(Amersham,United Kingdom)を使用して調製した、32P−標識されかつランダムプライムされた全長MIG cDNAプローブとハイブリダイズした。ノーザンブロッティング手順を2回反復し、こうして得られたブロットをデンシトメーターを用いて定量し、そしてβ−アクチンを用いて標準化した。
図11は、MIG8プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株(CaSkiおよびCUMC−6)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図11に示されるように、MIG8プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、子宮頸部癌組織ならびに子宮頸部癌細胞株CaSkiおよびCUMC−6において増加し、すなわち、約4.0kbのMIG8 mRNA転写物および約1.3kbのMIG8 mRNA転写物が過剰発現され、そしてMIG8プロトオンコ遺伝子は、とりわけ転移性子宮頸部リンパ節組織において最も高く発現したが、正常組織においては極めて低く発現したことが明らかにされた。図11において、「正常」レーンは正常子宮外頸部組織を表し、「癌」レーンは子宮頸部癌組織を表し、「転移」レーンは転移性子宮頸部リンパ節組織を表し、そして「CaSki」レーンおよび「CUMC−6」レーンの各々は子宮癌細胞株を表す。図12は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
図25は、MIG8プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織(Clontech)、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図26は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図25に示されるように、MIG8 mRNA転写物(約4.0kbの優性MIG8 mRNA転写物および約1.3kbのMIG8 mRNA転写物)は、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球などの正常組織において極めて弱く発現したことが明らかにされた。
図39は、MIG8プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、HL−60、HeLa、K−562、MOLT−4、Raji、SW480、A549、およびG361(Clontech)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図40は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図39に示されるように、MIG8 mRNA転写物(約4.0kbの優性MIG8 mRNA転写物および約1.3kbのMIG8 mRNA転写物)は、前骨髄球性白血病細胞株HL−60、HeLa子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株K−562、リンパ芽球性白血病株MOLT−4、バーキットリンパ腫細胞株Raji、結腸癌細胞株SW480、肺癌細胞株A549、および皮膚癌細胞株G361において極めて高度に発現したことが明らかにされた。しかし、約1.3kbのMIG8 mRNA転写物は、皮膚癌細胞株G361において発現されなかった。
図16は、MIG18プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株(CaSkiおよびCUMC−6)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図16に示されるように、MIG18プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、子宮頸部癌組織ならびに子宮頸部癌細胞株CaSkiおよびCUMC−6において増加し、そしてMIG18プロトオンコ遺伝子は、とりわけ転移性子宮頸部リンパ節組織において最も高く発現したが、正常組織においては極めて低く発現したことが明らかにされた。図16および17において、「正常」レーンは正常子宮外頸部組織を表し、「癌」レーンは子宮頸部癌組織を表し、「転移」レーンは転移性子宮頸部リンパ節組織を表し、そして「CaSki」レーンおよび「CUMC−6」レーンの各々は子宮癌細胞株を表す。図17は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
図30は、MIG18プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織(Clontech)、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図31は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図30に示されるように、MIG18 mRNA転写物(約4.0kb)は、心臓、筋肉、および肝臓などの正常組織において弱く発現したことが明らかにされた。
図44は、MIG18プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、HL−60、HeLa、K−562、MOLT−4、Raji、SW480、A549、およびG361(Clontech)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図45は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図44に示されるように、MIG18 mRNA転写物は、HeLa子宮癌細胞株および慢性骨髄性白血病細胞株K−562において極めて高度に発現され、そしてまた、前骨髄球性白血病細胞株HL−60、リンパ芽球性白血病株MOLT−4、バーキットリンパ腫細胞株Raji、結腸癌細胞株SW480、肺癌細胞株A549、および皮膚癌細胞株G361においてもまた増加レベルで発現したことが明らかにされた。
図18は、MIG19プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株(CaSkiおよびCUMC−6)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図18に示されるように、MIG19プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、子宮頸部癌組織ならびに子宮頸部癌細胞株CaSkiおよびCUMC−6において増加し、すなわち、約4.7kbの優性MIG19 mRNA転写物が過剰発現され、そしてMIG19プロトオンコ遺伝子は、とりわけ転移性子宮頸部リンパ節組織において最も高く発現したが、正常組織においては極めて低く発現したことが明らかにされた。図18および19において、「正常」レーンは正常子宮外頸部組織を表し、「癌」レーンは子宮頸部癌組織を表し、「転移」レーンは転移性子宮頸部リンパ節組織を表し、そして「CaSki」レーンおよび「CUMC−6」レーンの各々は子宮癌細胞株を表す。図19は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
図32は、MIG19プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織(Clontech)、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図33は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図32に示されるように、MIG19 mRNA転写物(約4.7kbの優性mRNA転写物)は、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球などの正常組織において極めて弱く発現したかまたは検出されなかったことが明らかにされた。
図46は、MIG19プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、HL−60、HeLa、K−562、MOLT−4、Raji、SW480、A549、およびG361(Clontech)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図47は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図46に示されるように、MIG19 mRNA転写物(約4.7kbの優性mRNA転写物)は、前骨髄球性白血病細胞株HL−60、HeLa子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株K−562、リンパ芽球性白血病株MOLT−4、バーキットリンパ腫細胞株Raji、結腸癌細胞株SW480、肺癌細胞株A549、および皮膚癌細胞株G361において非常に増加したレベルで発現したことが明らかにされた。しかし、約1.3kbのMIG8 mRNA転写物は、皮膚癌細胞株G361において発現されなかった。
図20は、MIG5プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株(CaSkiおよびCUMC−6)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。
図20に示されるように、MIG5プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、子宮頸部癌組織ならびに子宮頸部癌細胞株CaSkiおよびCUMC−6において増加し、すなわち、約5.5kbの優性MIG5 mRNA転写物が過剰発現され、そしてMIG19プロトオンコ遺伝子は、とりわけ転移性子宮頸部リンパ節組織において最も高く発現したが、正常組織においては発現されなかったことが明らかにされた。図20および21において、「正常」レーンは正常子宮外頸部組織を表し、「癌」レーンは子宮頸部癌組織を表し、「転移」レーンは転移性子宮頸部リンパ節組織を表し、そして「CaSki」レーンおよび「CUMC−6」レーンの各々は子宮癌細胞株を表す。図21は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
図34は、MIG19プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織(Clontech)、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図35は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図34に示されるように、MIG5 mRNA転写物(約5.5kbの優性mRNA転写物)は、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球などの正常組織においては発現されなかったことが明らかにされた。
図48は、MIG5プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、HL−60、HeLa、K−562、MOLT−4、Raji、SW480、A549、およびG361(Clontech)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図49は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図48に示されるように、MIG5 mRNA転写物(約5.5kbの優性mRNA転写物)は、前骨髄球性白血病細胞株HL−60、HeLa子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株K−562、リンパ芽球性白血病株MOLT−4、バーキットリンパ腫細胞株Raji、結腸癌細胞株SW480、肺癌細胞株A549、および皮膚癌細胞株G361において非常に増加したレベルで発現したことが明らかにされた。しかし、約1.3kbのMIG8 mRNA転写物は、皮膚癌細胞株G361において発現されなかった。
図22は、MIG19プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株(CaSkiおよびCUMC−6)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図22に示されるように、MIG7プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、子宮頸部癌組織ならびに子宮頸部癌細胞株CaSkiおよびCUMC−6において増加し、すなわち、約10kbの優性MIG7 mRNA転写物が過剰発現され、そしてMIG7プロトオンコ遺伝子は、とりわけ転移性子宮頸部リンパ節組織において最も高く発現したが、正常組織においては極めて低く発現したことが明らかにされた。図22および23において、「正常」レーンは正常子宮外頸部組織を表し、「癌」レーンは子宮頸部癌組織を表し、「転移」レーンは転移性子宮頸部リンパ節組織を表し、そして「CaSki」レーンおよび「CUMC−6」レーンの各々は子宮癌細胞株を表す。図23は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
図36は、MIG19プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織(Clontech)、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図37は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図36に示されるように、MIG7 mRNA転写物(約10kbの優性mRNA転写物)は、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球などの正常組織においては弱く発現したかまたは検出されなかったことが明らかにされた。
図50は、MIG7プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、HL−60、HeLa、K−562、MOLT−4、Raji、SW480、A549、およびG361(Clontech)において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図51は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってmRNA転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図50に示されるように、MIG7 mRNA転写物(約10kbの優性mRNA転写物)は、HeLa子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株K−562、リンパ芽球性白血病株MOLT−4、バーキットリンパ腫細胞株Raji、結腸癌細胞株SW480、および肺癌細胞株A549において非常に増加したレベルで発現したことが明らかにされた。
実施例8:ヒトプロトオンコ遺伝子でE.coliを形質転換した後に発現したタンパク質のサイズ決定
配列番号1のMIG3;配列番号5のMIG8;配列番号9のMIG10;配列番号13のMIG13;配列番号17のMIG14;配列番号21のMIG18;配列番号25のMIG19;配列番号29のMIG5;および配列番号33のMIG7を、pBAD/thio−Topoベクター(Invitrogen,U.S.)のマルチクローニングサイトに挿入し、その後、E.coli Top10(Invitrogen,U.S.)を、得られたpBAD/thio−Topo/MIGベクターの各々で形質転換した。発現させるタンパク質HT−チオレドキシンを、pBAD/thio−Topoベクターのマルチクローニングサイトの上流領域に挿入した。形質転換したE.coli株の各々を、振盪しながらLBブロス中でインキュベートし、その後、得られた培養物の各々を1/100の比率で希釈し、3時間インキュベートした。0.5mM L−アラビノース(Sigma)をそこに加えて、タンパク質の産生を促した。
配列番号1のMIG3;配列番号5のMIG8;配列番号9のMIG10;配列番号13のMIG13;配列番号17のMIG14;配列番号21のMIG18;配列番号25のMIG19;配列番号29のMIG5;および配列番号33のMIG7を、pBAD/thio−Topoベクター(Invitrogen,U.S.)のマルチクローニングサイトに挿入し、その後、E.coli Top10(Invitrogen,U.S.)を、得られたpBAD/thio−Topo/MIGベクターの各々で形質転換した。発現させるタンパク質HT−チオレドキシンを、pBAD/thio−Topoベクターのマルチクローニングサイトの上流領域に挿入した。形質転換したE.coli株の各々を、振盪しながらLBブロス中でインキュベートし、その後、得られた培養物の各々を1/100の比率で希釈し、3時間インキュベートした。0.5mM L−アラビノース(Sigma)をそこに加えて、タンパク質の産生を促した。
E.coli細胞をL−アラビノース誘導の前後で超音波処理し、その後、超音波処理したホモジネートを12%ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動(SDS−PAGE)に供した。
図52は、pBAD/thio−Topo/MIG3ベクターで形質転換したE.coli Top10株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのSDS−PAGEの結果を示し、ここで、約38kDaの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、L−アラビノース誘導後に明確に観察された。この38kDaタンパク質は、約15kDaの分子量を有するHT−チオレドキシンおよび約23kDaの分子量を有するMIG3タンパク質を含む。各々のタンパク質はpBAD/thio−Topo/MIG3ベクターに挿入されている。
図53は、pBAD/thio−Topo/MIG8ベクターで形質転換したE.coli Top10株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのSDS−PAGEの結果を示し、ここで、約72kDaの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、L−アラビノース誘導後に明確に観察された。この72kDaタンパク質は、約15kDaの分子量を有するHT−チオレドキシンタンパク質および約57kDaの分子量を有するMIG8タンパク質を含む。各々のタンパク質はpBAD/thio−Topo/MIG8ベクターに挿入されている。
図54は、pBAD/thio−Topo/MIG10ベクターで形質転換したE.coli Top10株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのSDS−PAGEの結果を示し、ここで、約60kDaの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、L−アラビノース誘導後に明確に観察された。この60kDaタンパク質は、約15kDaの分子量を有するHT−チオレドキシンタンパク質および約45kDaの分子量を有するMIG10タンパク質を含む。各々のタンパク質はpBAD/thio−Topo/MIG10ベクターに挿入されている。
図55は、pBAD/thio−Topo/MIG13ベクターで形質転換したE.coli Top10株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのSDS−PAGEの結果を示し、ここで、約46kDaの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、L−アラビノース誘導後に明確に観察された。この46kDaタンパク質は、約15kDaの分子量を有するHT−チオレドキシンタンパク質および約31kDaの分子量を有するMIG13タンパク質を含む。各々のタンパク質はpBAD/thio−Topo/MIG10ベクターに挿入されている。
図56は、pBAD/thio−Topo/MIG14ベクターで形質転換したE.coli Top10株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのSDS−PAGEの結果を示し、ここで、約54kDaの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、L−アラビノース誘導後に明確に観察された。この54kDaタンパク質は、約15kDaの分子量を有するHT−チオレドキシンタンパク質および約39kDaの分子量を有するMIG14タンパク質を含む。各々のタンパク質はpBAD/thio−Topo/MIG14ベクターに挿入されている。
図57は、pBAD/thio−Topo/MIG18ベクターで形質転換したE.coli Top10株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのSDS−PAGEの結果を示し、ここで、約88kDaの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、L−アラビノース誘導後に明確に観察された。この88kDaタンパク質は、約15kDaの分子量を有するHT−チオレドキシンタンパク質および約73kDaの分子量を有するMIG18タンパク質を含む。各々のタンパク質はpBAD/thio−Topo/MIG18ベクターに挿入されている。
図58は、pBAD/thio−Topo/MIG19ベクターで形質転換したE.coli Top10株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのSDS−PAGEの結果を示し、ここで、約122kDaの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、L−アラビノース誘導後に明確に観察された。この122kDaタンパク質は、約15kDaの分子量を有するHT−チオレドキシンタンパク質および約107kDaの分子量を有するMIG19タンパク質を含む。各々のタンパク質はpBAD/thio−Topo/MIG19ベクターに挿入されている。
図59は、pBAD/thio−Topo/MIG5ベクターで形質転換したE.coli Top10株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのSDS−PAGEの結果を示し、ここで、約36kDaの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、L−アラビノース誘導後に明確に観察された。この36kDaタンパク質は、約15kDaの分子量を有するHT−チオレドキシンタンパク質および約21kDaの分子量を有するMIG5タンパク質を含む。各々のタンパク質はpBAD/thio−Topo/MIG5ベクターに挿入されている。
図60は、pBAD/thio−Topo/MIG7ベクターで形質転換したE.coli Top10株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのSDS−PAGEの結果を示し、ここで、約24kDaの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、L−アラビノース誘導後に明確に観察された。この24kDaタンパク質は、約15kDaの分子量を有するHT−チオレドキシンタンパク質および約9kDaの分子量を有するMIG7タンパク質を含む。各々のタンパク質はpBAD/thio−Topo/MIG7ベクターに挿入されている。
産業上の利用可能性
上記のように、ヒトの発癌に関与し、同時に癌転移を誘導する能力を有する新規な遺伝子である本発明のプロトオンコ遺伝子は、肺癌、白血病、子宮癌、リンパ腫、結腸癌、皮膚癌などを含む癌を診断すること、ならびに形質転換動物を作製することなどのために効果的に使用してもよい。
上記のように、ヒトの発癌に関与し、同時に癌転移を誘導する能力を有する新規な遺伝子である本発明のプロトオンコ遺伝子は、肺癌、白血病、子宮癌、リンパ腫、結腸癌、皮膚癌などを含む癌を診断すること、ならびに形質転換動物を作製することなどのために効果的に使用してもよい。
図面の説明は以下の通りである。
L276811 DNA フラグメントが正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびA549肺癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)の結果を示すゲルダイアグラムである。
CC231 DNAフラグメントが正常子宮外頸部組織、子宮頸部腫瘍組織、転移性リンパ節腫瘍組織、およびCUMC−6癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)の結果を示すゲルダイアグラムである。
L789 DNAフラグメントが正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびA549肺癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)の結果を示すゲルダイアグラムである。
L986 DNAフラグメントが正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびA549肺癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)の結果を示すゲルダイアグラムである。
L1284 DNAフラグメントが正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびA549肺癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)の結果を示すゲルダイアグラムである。
CA367 DNAフラグメントが正常子宮外頸部組織、子宮頸部腫瘍組織、転移性リンパ節腫瘍組織、およびCUMC−6癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)の結果を示すゲルダイアグラムである。
CA335 DNAフラグメントが正常子宮外頸部組織、子宮頸部腫瘍組織、転移性リンパ節腫瘍組織、およびCUMC−6癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)の結果を示すゲルダイアグラムである。
CG263 DNAフラグメントが正常子宮外頸部組織、子宮頸部腫瘍組織、転移性リンパ節腫瘍組織、およびCUMC−6癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)の結果を示すゲルダイアグラムである。
CG233 DNAフラグメントが正常子宮外頸部組織、子宮頸部腫瘍組織、転移性リンパ節腫瘍組織、およびCUMC−6癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(DDRT−PCR)の結果を示すゲルダイアグラムである。
図10(a)は、本発明のMIG3プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、ならびにA549肺癌細胞株およびNCI−H358肺癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すゲルダイアグラムであり、図10(b)は、図10(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG8プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングを示すゲルダイアグラムである。
図11におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図13(a)は、本発明のMIG10プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、ならびにA549肺癌細胞株およびNCI−H358肺癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すゲルダイアグラムであり、図13(b)は、図13(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図14(a)は、本発明のMIG13プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、ならびにA549肺癌細胞株およびNCI−H358肺癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すゲルダイアグラムであり、図14(b)は、図14(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図15(a)は、本発明のMIG14プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、ならびにA549肺癌細胞株およびNCI−H358肺癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すゲルダイアグラムであり、図15(b)は、図15(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG18プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングを示すゲルダイアグラムである。
図16におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG19プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングを示すゲルダイアグラムである。
図18におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG5プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングを示すゲルダイアグラムである。
図20におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG7プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングを示すゲルダイアグラムである。
図22におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図24(a)は、本発明のMIG3プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図24(b)は、図24(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG8プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図25におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図27(a)は、本発明のMIG10プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図27(b)は、図27(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図28(a)は、本発明のMIG13プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図28(b)は、図28(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図29(a)は、本発明のMIG14プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図29(b)は、図29(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG18プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図30におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG19プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図32におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG5プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図34におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG7プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト12レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図36におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図38(a)は、本発明のMIG3プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図38(b)は、図38(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG8プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図39におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図41(a)は、本発明のMIG10プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図41(b)は、図41(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図42(a)は、本発明のMIG13プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図42(b)は、図42(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図42(a)は、本発明のMIG13プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図42(b)は、図42(a)におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG18プロトオンコ遺伝子がヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図44におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG19プロトオンコ遺伝子がヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図46におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG5プロトオンコ遺伝子がヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図48におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
本発明のMIG7プロトオンコ遺伝子がヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図50におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
図52〜60は、本発明のMIG3、MIG8、MIG10、MIG18、MIG13、MIG14、MIG19、MIG5、およびMIG7プロトオンコ遺伝子をそれぞれEscherichia coliに形質転換した後、L−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)の結果を示すダイアグラムである。
図52〜60は、本発明のMIG3、MIG8、MIG10、MIG18、MIG13、MIG14、MIG19、MIG5、およびMIG7プロトオンコ遺伝子をそれぞれEscherichia coliに形質転換した後、L−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)の結果を示すダイアグラムである。
図52〜60は、本発明のMIG3、MIG8、MIG10、MIG18、MIG13、MIG14、MIG19、MIG5、およびMIG7プロトオンコ遺伝子をそれぞれEscherichia coliに形質転換した後、L−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)の結果を示すダイアグラムである。
図52〜60は、本発明のMIG3、MIG8、MIG10、MIG18、MIG13、MIG14、MIG19、MIG5、およびMIG7プロトオンコ遺伝子をそれぞれEscherichia coliに形質転換した後、L−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)の結果を示すダイアグラムである。
図52〜60は、本発明のMIG3、MIG8、MIG10、MIG18、MIG13、MIG14、MIG19、MIG5、およびMIG7プロトオンコ遺伝子をそれぞれEscherichia coliに形質転換した後、L−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)の結果を示すダイアグラムである。
図52〜60は、本発明のMIG3、MIG8、MIG10、MIG18、MIG13、MIG14、MIG19、MIG5、およびMIG7プロトオンコ遺伝子をそれぞれEscherichia coliに形質転換した後、L−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)の結果を示すダイアグラムである。
図52〜60は、本発明のMIG3、MIG8、MIG10、MIG18、MIG13、MIG14、MIG19、MIG5、およびMIG7プロトオンコ遺伝子をそれぞれEscherichia coliに形質転換した後、L−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)の結果を示すダイアグラムである。
図52〜60は、本発明のMIG3、MIG8、MIG10、MIG18、MIG13、MIG14、MIG19、MIG5、およびMIG7プロトオンコ遺伝子をそれぞれEscherichia coliに形質転換した後、L−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)の結果を示すダイアグラムである。
図52〜60は、本発明のMIG3、MIG8、MIG10、MIG18、MIG13、MIG14、MIG19、MIG5、およびMIG7プロトオンコ遺伝子をそれぞれEscherichia coliに形質転換した後、L−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)の結果を示すダイアグラムである。
Claims (6)
- 配列番号2、配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18、配列番号22、配列番号26、配列番号30、および配列番号34から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するヒトプロトオンコタンパク質。
- 配列番号1のヌクレオチド配列の89〜709位に対応するDNA配列、配列番号5のヌクレオチド配列の113〜1627位に対応するDNA配列、配列番号9のヌクレオチド配列の23〜1276位に対応するDNA配列、配列番号13のヌクレオチド配列の11〜844位に対応するDNA配列、配列番号17のヌクレオチド配列の67〜1125位に対応するDNA配列、配列番号21のヌクレオチド配列の215〜2212位に対応するDNA配列、配列番号25のヌクレオチド配列の65〜2965位に対応するDNA配列、配列番号29のヌクレオチド配列の159〜737位に対応するDNA配列、および配列番号33のヌクレオチド配列の1435〜1685位に対応するDNA配列から成る群より選択されるDNA配列を有し、前記DNA配列の各々が請求項1で定義される前記ヒトプロトオンコタンパク質をコードする、ヒトプロトオンコ遺伝子。
- 配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号13、配列番号17、配列番号21、配列番号25、配列番号29および配列番号33から成る群より選択されるDNA配列を有する、請求項2に記載のヒトプロトオンコ遺伝子。
- 請求項2または3に定義される前記プロトオンコ遺伝子の各々を含むベクター。
- 請求項1に定義される前記プロトオンコタンパク質の各々を含む癌および癌転移を診断するためのキット。
- 請求項2または3に定義される前記プロトオンコ遺伝子の各々を含む癌および癌転移を診断するためのキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020040114281A KR100664588B1 (ko) | 2004-12-28 | 2004-12-28 | 인간 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질 |
PCT/KR2005/004617 WO2006071080A1 (en) | 2004-12-28 | 2005-12-28 | Human protooncogene and protein encoded therein |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008525045A true JP2008525045A (ja) | 2008-07-17 |
Family
ID=36615159
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007549263A Pending JP2008525045A (ja) | 2004-12-28 | 2005-12-28 | ヒトプロトオンコ遺伝子およびそこにコードされるタンパク質 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20080213764A1 (ja) |
EP (1) | EP1838728A4 (ja) |
JP (1) | JP2008525045A (ja) |
KR (1) | KR100664588B1 (ja) |
CN (1) | CN101133081A (ja) |
CA (1) | CA2592466A1 (ja) |
WO (1) | WO2006071080A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130315934A1 (en) * | 2010-10-28 | 2013-11-28 | Yale University | Methods and Compositions for Assessing and Treating Cancer |
JP6339063B2 (ja) | 2012-03-15 | 2018-06-06 | エスエヌユー アールアンドディービー ファウンデーション | グレムリン−1に対する抗体 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20040056105A (ko) * | 2002-12-23 | 2004-06-30 | 김진우 | 인간 원암유전자 hlc-8 및 이에 의해 코드되는 단백질 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6812339B1 (en) * | 2000-09-08 | 2004-11-02 | Applera Corporation | Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof |
JP2009523404A (ja) * | 2003-01-30 | 2009-06-25 | アプレラ コーポレイション | 慢性関節リウマチに関連する遺伝的多型、その検出方法および使用 |
-
2004
- 2004-12-28 KR KR1020040114281A patent/KR100664588B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-12-28 CA CA002592466A patent/CA2592466A1/en not_active Abandoned
- 2005-12-28 EP EP05822701A patent/EP1838728A4/en not_active Withdrawn
- 2005-12-28 US US11/794,402 patent/US20080213764A1/en not_active Abandoned
- 2005-12-28 JP JP2007549263A patent/JP2008525045A/ja active Pending
- 2005-12-28 WO PCT/KR2005/004617 patent/WO2006071080A1/en active Application Filing
- 2005-12-28 CN CNA2005800487632A patent/CN101133081A/zh active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20040056105A (ko) * | 2002-12-23 | 2004-06-30 | 김진우 | 인간 원암유전자 hlc-8 및 이에 의해 코드되는 단백질 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1838728A4 (en) | 2008-12-03 |
US20080213764A1 (en) | 2008-09-04 |
KR100664588B1 (ko) | 2007-01-04 |
KR20060075482A (ko) | 2006-07-04 |
EP1838728A1 (en) | 2007-10-03 |
CN101133081A (zh) | 2008-02-27 |
CA2592466A1 (en) | 2006-07-06 |
WO2006071080A1 (en) | 2006-07-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20090221794A1 (en) | Human Protooncogene and Protein Encoded By Same | |
US20090123918A1 (en) | Human Protooncogene TRG and Protein Encoded Therein | |
JP2008525045A (ja) | ヒトプロトオンコ遺伝子およびそこにコードされるタンパク質 | |
JP2008534006A (ja) | ヒト癌抑制遺伝子、その中にコードされるタンパク質 | |
US20080213763A1 (en) | Human Protooncogene and Protein Encoded by Same, and Expression Vector Containing Same | |
KR100545076B1 (ko) | 인간 원암유전자 hpp1 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100503559B1 (ko) | 인간 원암유전자 hlc-8 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100664586B1 (ko) | 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질 전환된 세포 | |
KR100453478B1 (ko) | 인간 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100675975B1 (ko) | 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100503567B1 (ko) | 인간 원암유전자 hlc-2 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100675973B1 (ko) | 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100675974B1 (ko) | 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100675972B1 (ko) | 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100689284B1 (ko) | 인간 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100689285B1 (ko) | 인간 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100503564B1 (ko) | 인간 원암유전자 hcc-9 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100915609B1 (ko) | 인간 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR100454064B1 (ko) | 인간 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR20060089873A (ko) | 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질 전환된 세포 | |
KR20030001805A (ko) | 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포 | |
KR20020081773A (ko) | 인간 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR20020083777A (ko) | 인간 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
KR20030001804A (ko) | 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100427 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100715 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100723 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101026 |