KR20060089873A - 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질 전환된 세포 - Google Patents

인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질 전환된 세포 Download PDF

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KR20060089873A KR1020060069820A KR20060069820A KR20060089873A KR 20060089873 A KR20060089873 A KR 20060089873A KR 1020060069820 A KR1020060069820 A KR 1020060069820A KR 20060069820 A KR20060069820 A KR 20060069820A KR 20060089873 A KR20060089873 A KR 20060089873A
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Abstract

본 발명은 신규 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 원암 유전자는 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 신장암, 간암, 대장암, 자궁내막암, 자궁경부암, 백혈병, 악성림프종 및 피부암 등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 및 RNAi와 같은 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를 포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질 전환된 세포{HUMAN PROTOONCOGENE AND PROTEIN ENCODED BY SAME, EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME, AND CELL TRANSFORMED BY SAID VECTOR}
도 1은 정상 유방 조직, 유방암 조직, 및 MCF-7 암세포에서 FC27(도1a), FC18(1b), 또는 FC9(도1c)의 발현여부 및 정상 간 조직, 간암 조직, 및 Hepg2 간암세포에서 HP37의 발현여부(도1d)를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이며;
도 2A는 유방암 조직들에서 PIG29 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 2B는 도 2A와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 3A는 유방암 조직들에서 PIG32 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 3B는 도 3A와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 4A는 유방암 조직들에서 PIG45 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며; 도 4B는 도 4A와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 5A는 인간 정상 간, 간암 및 간암세포주들에서 PIG34 원암 유전자의 발현 여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며 도 5B는 도 5A와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.
도 6A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG29 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며; 도 6B는 도 6A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 7A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG32 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며; 도 7B는 도 7A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 8A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG45 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며; 도 8B는 도 8A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 9A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG34 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며 도 9B는 도 9A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 10A는 인간 암 세포주들에서 PIG29 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며; 도 10B는 도 10A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 11A는 인간 암 세포주들에서 PIG32 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며; 도 11B는 도 11A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 12A는 인간 암 세포주들에서 PIG45 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며; 도 12B는 도 12A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 13A는 인간 암 세포주들에서 PIG34 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며 도 13B는 도 13A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 PIG29 원암 유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘-아라비노즈 (L-arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아마이드 겔(PAGE)에서 전기영동한 결과(14a); PIG32 원암 유전자를 상기와 같은 방법으로 전기영동한 결과(14b); PIG45 원암 유전자를 상기와 같은 방법으로 전기영동한 결과(14c); PIG34 원암 유전자를 상기와 같은 방법으로 전기영동한 결과이다(14d).
본 발명은 신규 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것이다.
인간을 포함한 고등동물들은 약 30,000 개의 유전자들을 갖고 있으나 이들중 약 15% 만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉, 발생, 분화, 항상성(homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화 및 아폽토시스(apoptosis; programmed cell death) 등이 결정된다(Liang, P. and A. B. Pardee, Science , 257: 967-971(1992)).
종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현들의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다.
예를 들면, 리앙과 파디(Liang and Pardee, 상기 문헌 참조)에 의해 제안된 mRNA 감별전개(differential display) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기(cell cycle)에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자(transcriptional regulatory gene) 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들의 상호 관련성의 규명에도 다양하게 활용되고 있다.
종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체부위의 소실(loss of chromosomal heterozygosity), 원암 유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다(Bishop, J. M., Cell , 64: 235-248(1991); 및 Hunter, T., Cell , 64: 249-270(1991)). 또한, 암의 10 내지 30%는 원암유전자가 증폭됨으로써 원암 유전자가 활성화되어 일어난다고 보고되어 있다.
원암유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 유방암, 간암 등의 발생기전을 원암 유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 세포 증식유도 유전자(proliferation-inducing gene)로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현이 증가된다는 것을 밝혀내었다. 상기 원암유전자는 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 신장암, 간암, 대장암, 자궁내막암, 자궁경부암, 백혈병, 악성림프종 및 피부암 등과 같은 다양한 암의 진단, 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 원암 유전자 및 그의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자에 의해 코드되는 단백질 및 그의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1의 염기 서열을 갖는 PIG29 원암 유전자; 서열번호: 5의 염기 서열을 갖는 PIG32 원암 유전자; 서열번호: 9의 염 기 서열을 갖는 PIG45 원암 유전자; 또는 서열번호: 13의 염기 서열을 갖는 PIG34 원암 유전자 또는 그들의 단편을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공된다.
상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 유전자들에 의하여 각각 번역된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 PIG29 단백질; 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 PIG32 단백질; 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 PIG45 단백질; 또는 서열번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 PIG34 단백질 또는 그들의 단편을 제공한다.
상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
1. PIG29
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 29(proliferation-inducing gene 29; PIG29, 이하,PIG29 원암유전자로 지칭함)는 서열번호: 1로 나타낸 바와 같은 2428 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 52 내지 2343 부위(2341-2343: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 2에 나타나 있으며 763개의 아미노산으로 이루어져 있다("PIG29 단백질").
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 763개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2와 같은 서열을 가지며 크기는 약 84 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서 열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서는 PIG29 전장 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG29/pcDNA3.1로 명명하고 대한민국 대전시 유성구 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자로 기탁번호 제KCTC 10660BP로 기탁하였다.
2. PIG32
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 32(proliferation-inducing gene 32; PIG32, 이하, PIG32 원암유전자로 지칭함)는 서열번호: 5로 나타낸 바와 같은 4486 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 5의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 34 내지 4356 부위(4354-4356: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 6에 나타나 있으며 1440개의 아미노산으로 이루어져 있다("PIG32 단백질").
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 5의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 1440개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 6과 같은 서열을 가지며 크기는 약 163 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공 지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서는 PIG32 전장 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG32/pcDNA3.1로 명명하고 대한민국 대전시 유성구 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자로 기탁번호 제KCTC 10661BP로 기탁하였다.
3. PIG 45
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 45(proliferation-inducing gene 45; PIG45, 이하, PIG45 원암유전자로 지칭함)는 서열번호: 9로 나타낸 바와 같은 640 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 9의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 2 내지 601 부위(599-601: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 10에 나타나 있으며 199개의 아미노산으로 이루어져 있다("PIG45 단백질").
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코 딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 9의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 199개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 10과 같은 서열을 가지며 크기는 약 21 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서는 PIG45 전장 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG45/pcDNA3.1로 명명하고 대한민국 대전시 유성구 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 5월 24일자로 기탁번호 제KCTC 10644BP로 기탁하였다.
4. PIG34
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 34(proliferation-inducing gene 34; PIG34, 이후 PIG34 원암유전자로 지칭함)는 서열번호: 13로 나타낸 바와 같은 688 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 13의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 86 내지 613 부위(611-613: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 14에 나타나 있으며 175개의 아미노산으로 이루어져 있다("PIG34 단백질").
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유 전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 13의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 175개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 14와 같은 서열을 가지며 크기는 약 19 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서는 PIG34 전장 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG34/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 17일자 기탁번호 제 KCTC 10662BP 호로 기탁하였다.
상기 PIG군에 대한 벡터의 제작시에는, 상기 원암 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.
본 발명의 유전자는 노던 블롯(northern blot) 등의 분석방법에서 정상 유방조직 또는 간 조직에서는 발현이 거의 확인되지 않은 반면 유방암 조직과 유방암 세포주들 또는 간암 조직과 간암 세포주에서는 그 과발현이 확인되므로 유방암 또는 간암을 유발시키는 강력한 발암 유전자로 판단된다. 유방암과 같은 상피성 조직외에도, 본 발명의 원암 유전자는 폐암, 난소암, 위암, 신장암, 간암, 대장암, 자궁내막암, 자궁경부암, 백혈병, 악성림프종 및 피부암등과 같은 많은 다른 암 종양들에서 높게 발현된다. 따라서, 본 발명의 원암유전자는 다양한 암의 발생에 공통된 발암유전자일 것으로 판단되며, 다양한 암의 진단, 형질전환된 동물의 제조 및 안티센스 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
상기 원암 유전자를 이용한 암의 진단 방법은, 예를 들어, 상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 이를 검출하므로써 대상자가 본 발명의 원암 유전자를 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 암 진단용 키트를 역시 제공한다.
형질전환 동물은 본 발명의 원암 유전자를 포유동물, 예를 들어, 래트 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 안티센스 유전자를 제공한다. 본 발명에서 "안티-센스 유전자"는 서열번호: 1, 서열번호 5, 서열번호 9 또는 서열번호 13의 원암 유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA의 단백질 결합부위에 결합하여 원암유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)을 파괴할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 원암 유전자의 발현으로 인한 암을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 원암 유전자로부터 유도되는 단백질은 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 원암 유전자로부터 발현된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당분야에 공지된 효소 면역측정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 원암 유전자를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 예를 들어, 상기 원암 유전자가 형질도입된 섬유모세포를 이용하여 누드 마우스 등에 형성시킨 종양조직으로부터 제조할 수 있다. 이러한 암 세포주는 항암제 등의 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 종양세포 배양 및 총 RNA 의 분리
(단계 1) 종양세포 배양
1-1 유방 종양 세포 배양
mRNA의 감별 전개를 위하여, 유방적출술(mastectomy)을 받은 유방암 환자로부터 정상유방 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지않은 유방암 환자로부터 수술시에 원발성 유방 종양조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 유방암 세포주로 MCF-7 (American Type Culture Collection; ATCC Number HTB-22) 유방암세포주를 사용하였다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 도중의 세포들로서 트리판 블루(trypan blue) 염료로 염색할 때 95% 이상의 생존도를 보이는 세 포를 이용하였다(프레쉬니(Freshney), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York(1987) 참조).
1-2. 간 종양 세포 배양
mRNA의 감별 전개를 위하여, 간 조직생검 (liver biopsy)을 받은 환자로부터 정상간 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지않은 간암 환자로부터 조직생검시에 원발성 간 종양조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 간암 세포주로 HepG2 (American Type Culture Collection) 간암세포주를 사용하였다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 도중의 세포들로서 트리판 블루(trypan blue) 염료로 염색할 때 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다(프레쉬니(Freshney), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York(1987) 참조).
(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법
상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트(Qiagen Inc., 독일)을 사용하여 단계 1-1에서 얻은 정상 유방 조직, 원발성 유방암조직, 및 MCF-7 세포로부터 총 RNA를 추출하였고 단계 1-2에서 얻은 정상 간 조직, 원발성 간암조직, 및 HepG2 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트(Message clean kit)(GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.
실시예 2: 감별 전개 역전사 중합효소 연쇄반응( differential display reverse transcription(DDRT)-PCR)
감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.
먼저, PIG29의 경우 실시예 1의 단계 1-1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 H-T11G, H-T11C 또는 H-T11A의 세 가지 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 중 하나인 서열번호 : 3의 H-T11C 고정 프라이머 5'AAGCTTTTTTTTTTTC-3'를 사용하여 역전사를 수행하였다이어서, 0.5mM [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 13프라이머(RNAimage primer sets 1-4, H-AP 1-32들 중 H-AP32 프라이머(서열번호: 4) 5'AAGCTTCCTGCAA-3'를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장(final extension)을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.
PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
PIG32의 경우 PIG29와 마찬가지로 H-T11G, H-T11C 또는 H-T11A의 세 가지 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 중 하나인 서열번호 : 7의 H-T11C 고정 프라이머 (5'AAGCTTTTTTTTTTTC-3')를 사용하여 역전사를 수행하였으며, 차이가 있다면 무작위 5' 13프라이머(RNAimage primer sets 1-4, H-AP 들중 H-AP40 프라이머(서열번호: 8) 5'AAGCTTGTCAGCC-3'를 사용한 것을 제외하곤 PIG29와 같은 공정을 거쳤다.
PIG45의 경우 H-T11G, H-T11C 또는 H-T11A의 세 가지 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 중 하나인 서열번호 : 11의 H-T11A 고정 프라이머 (5'AAGCTTTTTTTTTTTA-3')를 사용하여 역전사를 수행하였고, 무작위 5' 13프라이머(RNAimage primer sets 1-4, H-AP 1-32들중 H-AP31 프라이머(서열번호: 12) 5'AAGCTTGGTGAAC-3'를 사용하여 PCR을 수행한 것을 제외하면 나머지 공정은 PIG29와 동일하였다.
PIG 34의 경우 먼저, 실시예 1의 단계 1-2에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 H-T11G, H-T11C 또는 H-T11A의 세 가지 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 중 하나인 서열번호 : 15의 H-T11C 고정 프라이머 (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')를 사용하여 역전사를 수행하였다.
PIG 34의 경우에는 이어서, 0.5mM [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 13프라이머(RNAimage primer sets 1-5, H-AP 1-40들중 H-AP37 프라이머(서열번호: 16) (5'-AAGCTTGGGCCTA-3')를 사용하여 PCR을 수행한 것을 제외하면 나머지 공정은 PIG29와 동일하였다.
PIG29의 경우 건조된 겔로부터 329 염기쌍(bp) 크기의 밴드, FC27 cDNA (서열번호: 1의 2041-2369 bp); PIG32의 경우 건조된 겔로부터 278 염기쌍(bp) 크기의 밴드, FC18 cDNA (서열번호: 5의 3311-3588 bp); PIG45의 경우 건조된 겔로부터 230 염기쌍(bp) 크기의 밴드, FC9 cDNA (서열번호: 9의 361-590 bp), PIG34의 경우 건조된 겔로부터 185 염기쌍(bp) 크기의 밴드, HP37 cDNA (서열번호: 13의 487-671 bp)를 도려내었다.
15분간 가열하여 FC27, FC18 FC9 또는 HP37 cDNA를 각각 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
실시예 3: 클로닝
상기에서 얻은 재증폭된 FC27, FC18 FC9 또는 HP37 PCR 산물을 TA클로닝 시스템(Promega, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 pGEM-T 이지(EASY) 벡터에 삽입하였다.
(단계 1) 연결반응
실시예 2에서 얻은 재증폭된 각각의 FC27, FC18, FC9 또는 HP37 PCR 산물 2㎕, pGEM-T 이지 벡터(50 ng) 1 ㎕, T4 DNA 연결효소 10X 완충액 1㎕ 및 T4 DNA 연결효소(3 weiss units/ul; T4 DNA ligase, Promega) 1 ㎕를 0.5㎖ 시험관에 넣은 후, 증류수를 가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 하였다. 연결 반응 혼합물은 14℃에서 밤새 배양하였다.
(단계 2) TA 클로닝 형질전환
대장균 JM109(Promega, WI, USA)를 10 ㎖의 LB 브로쓰(박토-트립톤 10 g, 박토-효모 추출물 5 g, NaCl 5 g) 중에서 600㎚에서의 광학밀도 값이 약 0.3 - 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양 혼합물을 얼음에 약 10분간 방치한 후, 4℃에서 10 분간 4000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 수집하였다. 수집한 세포 펠릿을 10 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl2에 30분 내지 1시간 가량 노출시켜 컴피턴트(competent) 세포를 제조하였다. 결과물을 4℃, 4000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 모아서 2 ml의 빙냉 0.1 M CaCl2에 현탁시켰다.
컴피턴트 세포 현탁액 200 ㎕를 새로운 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브에 옮기고, 여기에 단계 1에서 제조한 연결 반응 산물 2㎕를 가하였다. 혼합물을 42℃의 수욕(water bath)에서 90초간 배양시킨 후, 0℃에서 급냉시켰다. 여기에, SOC 배지(박토-트립톤 2.0 g, 박토-효모 추출물 0.5 g, 1 M NaCl 1 ml, 1 M KCl 0.25 ml, TDW 97 ml, 2M Mg2+ 1 ml, 2 M 글루코스 1 ml) 800 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 220 rpm의 회전진탕 배양기에서 45분간 배양시켰다.
37℃ 배양기에 미리 넣어둔, 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 X-gal(40㎎/㎖ 디메틸포름아미드에 저장) 25 ㎕를 유리봉으로 확산시킨 후, 여기에 25 ㎕의 형질전환된 세포를 넣어서 다시 유리봉으로 확산시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 형성된 백색 콜로니를 3-4개 선택하여 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 각각의 선택된 클론들을 심었다. 플라스미드를 제조하기 위하여 이들 중 삽입이 확인된 콜로니, 즉, 형질전환된 대장균 JM109/FC27, JM109/FC18, JM109/FC9 또는JM109/HP37을 선택하여 10 ml의 테리픽 브로쓰(terrific broth; TDW 900 ml, 박토-트립톤 12 g, 박토-효모 추출물 24 g, 글리세롤 4 ml, 0.17 M KH2PO4, 0.72 N K2HPO4 100 ml)에서 배양하였다.
실시예 4: 재조합 플라스미드 DNA 의 분리
위저드 플러스 미니프렙스 DNA 정제 키트(WizardTM Plus Minipreps DNA Purificatin Kit, Promega, USA)를 사용해서 제조사의 지시에 따라 형질전환된 대 장균으로부터 FC27, FC18 FC9 또는 HP37 플라스미드 DNA를 분리하였다.
분리된 플라스미드 DNA의 일부를 ECoRI 효소로 처리한 후, 2% 겔에서 전기영동을 실시하여 FC27, FC18 FC9 또는 HP37 부분서열이 플라스미드에 삽입되었음을 확인하였다.
실시예 5: DNA 염기서열 분석
실시예 2에서 수득한 FC27, FC18 FC9 또는 HP37 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR시킨 후, 클로닝되고 재증폭된 FC27, FC18 FC9 또는 HP37 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 2041 내지 2369에 해당하며, 본원에서 "FC27"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP32 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 329 bp cDNA 단편, 즉, FC27을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 정상 유방 조직, 유방암 조직 및 MCF-7 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1a에서 알 수 있는 바와 같이, 329 bp cDNA 단편인 FC27은 유방 암, 및 MCF-7 암 세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현되지 않았다. 상기 DNA의 염기 서열은 본원에서 "FC18"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP40 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에 서 수득한 278 bp cDNA 단편, 즉, FC18을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 정상 유방 조직, 유방암 조직 및 MCF-7 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1b에서 알 수 있는 바와 같이, 278 bp cDNA 단편인 FC18은 유방 암, 및 MCF-7 암 세포에서는 강하게 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 아주 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 번호 361 내지 590에 해당하며, 본원에서 "FC9"으로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP31 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 230 bp cDNA 단편, 즉, FC9을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기영동으로 확인하였다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, 정상 유방 조직, 유방암 조직 및 MCF-7 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1c에서 알 수 있는 바와 같이, 230 bp cDNA 단편인 FC9은 유방 암, 및 MCF-7 암 세포에서는 강하게 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 아주 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 13의 뉴클레오티드 번호 487 내지 671에 해당하며, 본원에서 "HP37"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP37 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 185 bp cDNA 단편, 즉, HP37을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1d에 나타낸 바와 같이, 정상 간 조직, 간암 조직 및 HepG2 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1d에서 알 수 있는 바와 같이, 185 bp cDNA 단편인 HP37은 간암, 및 HepG2 암 세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현되지 않았다.
실시예 6: PIG 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석
6-1. PIG29 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석
32P-표지된 FC27을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2428 bp가 삽입된 전체 PIG29 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 2월 5일자로 AY542306 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다.
AY542306 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 U74613 호인 forkhead box M1B (FOXM1B) 유전자와는 서열이 유사하며 일부 아미노산 서열이 다른 유전자이다. Forkhead box M1B 유전자는 전사인자로서 주로 세포의 증식, 분화 및 수명과 관계가 있다고 보고되고 있으나 주로 간과 폐 세포들에 대한 연구에 한정되어 왔다 (Wang, X. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 99, 16881-16885 (2002); Krupczak-Hollis, K. et al., Hepatology, 38, 1552-1562 (2003); Kalinichenko, V. V., et al., J. Biol . Chem., 278, 37888-37894 (2003)). 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 forkhead box M1B (FOXM1B) 유전자는 특히 유방암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연 구 결과 유방조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 여러 유방암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG29 원암유전자를 발굴하게 되었다.
얻어진 PIG29 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG29/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행 (한국생명공학연구소 유전자 은행(Korea Collection for Type Cultures(KCTC), 한국생명공학연구소(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB), 대한민국 대전 305-333 유성구 어은동 #52)에 2004년 6월 14일자로 기탁번호 제KCTC 10660BP로 기탁하였다.
2428 bp로 이루어진 PIG29의 전체 서열은 서열번호: 1에 나타내었다. 서열번호: 1의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 52 내지 2343에 해당하며, 서열번호: 2의 763개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-2. PIG32 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석
32P-표지된 FC18을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 4486 bp가 삽입된 전체 PIG32 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 12월 1일자로 AY493416 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다.
AY493416 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_004446 호인 Homo sapiens glutamyl-prolyl-tRNA synthetase (EPRS) 유전자와는 서열이 유사한 유전자이다. glutamyl-prolyl-tRNA synthetase 유전자는 class I aminoacil-tRNA synthetase에 해당하며 그구조와 촉매작용에 있어서 glutaminyl-tRNA synthetase 유전자와 유사한 점을 가진다 (Freist, W. et al., Biol . Chem., 378, 11313-1329 (1997)). Aminoacil-tRNA synthetase 들은 동종의 아미노산들과 함께 tRNA들을 충전 (charge) 시키는 기능을 갖는다 (Fett, R. & Knippers, R., J. Biol . Chem., 266, 1448-1455 (1991)). 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 glutamyl-prolyl-tRNA synthetase 유전자는 특히 유방암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 오히려 발현이 거의 없고 반면에 여러 유방암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG32 원암유전자를 발굴하게 되었다.
얻어진 PIG32 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG32/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행 (한국생명공학연구소 유전자 은행(Korea Collection for Type Cultures(KCTC), 한국생명공학연구소(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB), 대한민국 대전 305-333 유성구 어은동 #52)에 2004년 6월 14일자로 기탁번호 제KCTC 10661BP로 기탁하였다.
4486 bp로 이루어진 PIG32의 전체 서열은 서열번호: 5에 나타내었다.
서열번호: 5의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 34 내지 4356에 해당하며, 서열번호: 6의 1440개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-3. PIG45 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석
32P-표지된 FC9을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 640 bp가 삽입된 전체 PIG45 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 2월 5일자로 AY513285 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다.
AY513285 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 BC022244 호인 Homo sapiens pyrroline-5-carboxylate reductase 1 유전자와는 서열이 유사하며 일부 아미노산 서열이 다른 유전자이다. Pyrroline-5-carboxylate reductase 1 유전자는 NAD(P)H 의존성 반응으로 pyrroline-5-carboxylate 가 proline 으로 환원되는 것을 촉매화시키며 (Phang, J.M., Curr . Topics Cell Regul., 25, 91-132 (1985); Dougherty, K.M., et al., J. Biol . Chem., 267, 871-875 (1992)), 세포의 교원질 (collagen) 합성을 촉진시킨다고 보고되고 있다 (Karna, E. et al., Comp . Biochem. Physiol . B Biochem . Mol . Biol.,130, 23-32 (2001)). 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 pyrroline-5-carboxylate reductase 1 유전자는 특히 유방암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 여러 유방암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG45 원암유전자를 발굴하게 되었다.
얻어진 PIG45 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG45/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행 (한국생명공학연구소 유전자 은행(Korea Collection for Type Cultures(KCTC), 한국생명공학연구소(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB), 대한민국 대전 305-333 유성구 어은동 #52)에 2004년 5월 24일자로 기탁번호 제KCTC 10644BP로 기탁하였다.
640 bp로 이루어진 PIG45의 전체 서열은 서열번호: 9에 나타내었다.
서열번호: 9의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 2 내지 601에 해당하며, 서열번호: 10의 199개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-4. PIG34 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석
32P-표지된 HP37을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝 하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 688 bp가 삽입된 전체 PIG34 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 2월 8일자로 AY544128 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31일). AY542306 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 ACCESSION NM_138938 호인 Homo sapiens pancreatitis-associated protein (PAP), transcript variant 2 유전자와는 서열이 유사한 유전자이다. Homo sapiens pancreatitis-associated protein (PAP), transcript variant 2 유전자는 급성 췌장염 (acute pancreatitis)환자와 일부 만성 췌장염 환자에서 증가되는 소견을 보아 Homo sapiens pancreatitis-associated protein (PAP), transcript variant 2 유전자는 염증과정에서 증가되는 것으로 급성 췌장염의 생물학적 표지자로 이용가능성이 있다고 보고되고 있다 (Orelle, B. et al ., J. Clin. Invest., 90, 2284-2291 (1992). 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 PIG34 원암유전자는 특히 인간의 간암 암화과정에 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 정상 간 조직들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 여러 간암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG34 원암유전자를 발굴하게 되었다. 얻어진 PIG34 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG34/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행 (한국생명공학연구소 유전자 은행(Korea Collection for Type Cultures(KCTC), 한국생명공학연구소(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB), 대한민국 대전 305-333 유성구 어은동 #52)에 2004년 6월 17일자 기탁번호 제 KCTC 10662 BP 호로 기탁하였다. 688 bp로 이루어진 PIG34의 전체 서열은 서열번호: 13에 나타내었다. 서열번호: 13의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 86 내지 613에 해당하며, 서열번호: 14의 175개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
실시예 7 : 다양한 세포에서의 PIG29 , 32, 34 또는 45 유전자의 노던 블롯 분석
7-1 PIG 29, 32 또는 45 유전자의 노던 블럿 분석
실시예 1에서와 같이, 정상 유방조직, 유방암 조직, 및 유방암 세포주 MCF-7으로부터 총 RNA를 추출하였다.
PIG29, 32 또는 45 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막(Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 FC27, FC18 또는 FC9 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계(densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴(actin)으로 표준화시켰다.
도 2A는 정상 유방 조직, 유방암조직 및 유방암 세포주(MCF-7)들에서 PIG29 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2A에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직 및 유방암 세포주인 MCF-7 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2A에서, 정상(Normal)열은 정상 유방 조직을, 암(Cancer)열은 유방암 조직을, 그리고 MCF-7열은 유방암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3A는 정상 유방 조직, 유방암조직 및 유방암 세포주(MCF-7)들에서 PIG32 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 3A에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직 및 유방암 세포주인 MCF-7 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 3A에서, 정상(Normal)열은 정상 유방 조직을, 암(Cancer)열은 유방암 조직을, 그리고 MCF-7열은 유방암 세포주를 각각 나타낸다. 도 3B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 4A는 정상 유방 조직, 유방암조직 및 유방암 세포주(MCF-7)들에서 PIG45 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 4A에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직 및 유방암 세포주인 MCF-7 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 4A에서, 정상(Normal)열은 정상 유방 조직을, 암(Cancer)열은 유방암 조직을, 그리고 MCF-7열은 유방암 세포주를 각각 나타낸다. 도 4B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 6A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉 선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG29 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 6A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG29 mRNA(약 4.0 kb)은 여러 정상조직들에서 발현이 되지 않고 있다.
도 7A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG32 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 7B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 7A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG32 mRNA(약 5.0 kb)은 근육조직에서는 발현이 확인되었으나 다른 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮았다.
도 8A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG45 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 8B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 8A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG45 mRNA(약 2.0 kb)은 여러 정상조직들에서 발현이 되지 않고 있다.
도 10A는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG29 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 10B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 10A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG29는 HeLa 자궁암 세포주, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562들의 순서로 높게 발현되고 있으며 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361들에서도 약하게 발현되었다.
도 11A는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG32 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 11B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 11A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG32는 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, HeLa 자궁암 세포주, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60들에서 발현이 매우 높게 나타났으며 그외 대장암세포주 SW480, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 피부암세포주 G361 및 폐암세포주 A549 들에서도 강하게 발현되었다.
도 12A는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG45 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 12B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 12A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG45는 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, HeLa 자궁암 세포주, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 대장암세포주 SW480, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 피부암세포주 G361 및 폐암세포주 A549 들의 순서로 강하게 발현 되었다.
7-2 PIG 34 유전자의 노던 블럿 분석
실시예 1에서와 같이, 정상 간조직, 간암 조직, 및 간암 세포주 HepG2로부터 총 RNA를 추출하였다. PIG34 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막(Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 HP37 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계(densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴(actin)으로 표준화시켰다. 도 5A는 정상 간조직, 간암조직 및 간암 세포주(HepG2)들에서 PIG34 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 5A에서 알 수 있는 바와 같이, 간암 조직 및 간암 세포주인 HepG2 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현이 되지 않았다. 도 5B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 9A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG34 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 9B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 9A에 서 알 수 있는 바와 같이, PIG34 mRNA(약 0.7 kb)은 정상 간조직에서와 같이 여러 다른 정상조직들에서도 발현이 되지 않고 있으나 소장 (small intestine)에서만 발현이 확인되었다. 도 13A는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG29 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 13B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 13A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG34는 간암이 아닌 HeLa 자궁암 세포주, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361들에서 전혀 발현되지 않아 조직 특이적인 즉 간암 특이적인 발현 양상을 보여주고 있다.
실시예 8: 상기 PIG 원암유전자를 대장균에 형질감염시킨 후 발현되는 단백질의 크기결정
서열번호: 1의 PIG29,서열번호: 5의 PIG32, 서열번호: 9의 PIG45 및 서열번호 13의 PIG 34 원암유전자 중 하나의 원암 유전자 전체를 pBAD/Thio-TOPO 벡터(Invitrogen)의 다중 클로닝 부위에 삽입한 후, 대장균에 형질감염시켰다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간동안 배양하였다. 여기에 0.2 mM의 엘-아라비노즈 (L-arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 엘-아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔에 서 전기영동하였다(SDS-PAGE).
이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.
도 14a는 PIG 29 단백질, 14b는 PIG 32 단백질, 14c는 PIG 45, 14d는 PIG 34 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 14에서 제1열은 엘-아라비노즈에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 엘-아라비노즈에 의해 PIG 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 14에서 보듯이, 발현된 PIG 29 단백질의 크기는 약 84 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치하고 발현된 PIG32 단백질의 크기는 약 163 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치하며 발현된 PIG45 단백질의 크기는 약 21 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다. 발현된 PIG34 단백질의 크기는 유도 후에 약 34 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 34 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG34 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 19 kDa의 PIG34 단백질을 함유하고 있는 것이다.
본 발명의 원암 유전자는 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 신장암, 간암, 대장암, 자궁내막암, 자궁경부암, 백혈병, 악성림프종 및 피부암등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 및 안티센스 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
<110> KIM, HYUN KEE <120> HUMAN PROTOONCOGENE AND PROTEIN ENCODED BY SAME, EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME, AND CELL TRANSFORMED BY SAID VECTOR <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2428 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggagggtcca cacttgtgat tctcaatgga gagtgaaaac gcagattcat aatgaaaact 60 agcccccgtc ggccactgat tctcaaaaga cggaggctgc cccttcctgt tcaaaatgcc 120 ccaagtgaaa catcagagga ggaacctaag agatcccctg cccaacagga gtctaatcaa 180 gcagaggcct ccaaggaagt ggcagagtcc aactcttgca agtttccagc tgggatcaag 240 attattaacc accccaccat gcccaacacg caagtagtgg ccatccccaa caatgctaat 300 attcacagca tcatcacagc actgactgcc aagggaaaag agagtggcag tagtgggccc 360 aacaaattca tcctcatcag ctgtggggga gccccaactc agcctccagg actccggcct 420 caaacccaaa ccagctatga tgccaaaagg acagaagtga ccctggagac cttgggacca 480 aaacctgcag ctagggatgt gaatcttcct agaccacctg gagccctttg cgagcagaaa 540 cgggagacct gtgcagatgg tgaggcagca ggctgcacta tcaacaatag cctatccaac 600 atccagtggc ttcgaaagat gagttctgat ggactgggct cccgcagcat caagcaagag 660 atggaggaaa aggagaattg tcacctggag cagcgacagg ttaaggttga ggagccttcg 720 agaccatcag cgtcctggca gaactctgtg tctgagcggc caccctactc ttacatggcc 780 atgatacaat tcgccatcaa cagcactgag aggaagcgca tgactttgaa agacatctat 840 acgtggattg aggaccactt tccctacttt aagcacattg ccaagccagg ctggaagaac 900 tccatccgcc acaacctttc cctgcacgac atgtttgtcc gggagacgtc tgccaatggc 960 aaggtctcct tctggaccat tcaccccagt gccaaccgct acttgacatt ggaccaggtg 1020 tttaagccac tggacccagg gtctccacaa ttgcccgagc acttggaatc acagcagaaa 1080 cgaccgaatc cagagctccg ccggaacatg accatcaaaa ccgaactccc cctgggcgca 1140 cggcggaaga tgaagccact gctaccacgg gtcagctcat acctggtacc tatccagttc 1200 ccggtgaacc agtcactggt gttgcagccc tcggtgaagg tgccattgcc cctggcggct 1260 tccctcatga gctcagagct tgcccgccat agcaagcgag tccgcattgc ccccaaggtg 1320 ctgctagctg aggaggggat agctcctctt tcttctgcag gaccagggaa agaggagaaa 1380 ctcctgtttg gagaagggtt ttctcctttg cttccagttc agactatcaa ggaggaagaa 1440 atccagcctg gggaggaaat gccacactta gcgagaccca tcaaagtgga gagccctccc 1500 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cctggcagtc cgcctcgggg cccaggccct cctgggggct gccaagatgc tgctgcactc 300 agaacagcac ccaggccagc tcaaggacaa cgtcagctct cctggtgggg ccaccatcca 360 tgccttgcat gtgctggaga gtgggggctt ccgctccctg ctcatcaacg ctgtggaggc 420 ctcctgcatc cgcacacggg agctgcagtc catggctgac caggagcagg tgtcaccagc 480 cgccatcaag aagaccatcc tggacaaggt gaagctggac tcccctgcag ggaccgctct 540 gtcgccttct ggccacacca agctgctccc ccgcagcctg gccccagcgg gcaaggattg 600 acacgtcctg cctgaccacc atcctgccac caccttctct 640 <210> 10 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Thr Asn Thr Pro Val Val Val Arg Glu Gly Ala Thr Val Tyr Ala 1 5 10 15 Thr Gly Thr His Ala Gln Val Glu Asp Gly Arg Leu Met Glu Gln Leu 20 25 30 Leu Ser Ser Val Gly Phe Cys Thr Glu Val Glu Glu Asp Leu Ile Asp 35 40 45 Ala Val Thr Gly Leu Ser Gly Ser Gly Pro Ala Tyr Ala Leu Thr Ala 50 55 60 Leu Asp Ala Leu Ala Asp Gly Gly Val Lys Met Gly Leu Pro Arg Arg 65 70 75 80 Leu Ala Val Arg Leu Gly Ala Gln Ala Leu Leu Gly Ala Ala Lys Met 85 90 95 Leu Leu His Ser Glu Gln His Pro Gly Gln Leu Lys Asp Asn Val Ser 100 105 110 Ser Pro Gly Gly Ala Thr Ile His Ala Leu His Val Leu Glu Ser Gly 115 120 125 Gly Phe Arg Ser Leu Leu Ile Asn Ala Val Glu Ala Ser Cys Ile Arg 130 135 140 Thr Arg Glu Leu Gln Ser Met Ala Asp Gln Glu Gln Val Ser Pro Ala 145 150 155 160 Ala Ile Lys Lys Thr Ile Leu Asp Lys Val Lys Leu Asp Ser Pro Ala 165 170 175 Gly Thr Ala Leu Ser Pro Ser Gly His Thr Lys Leu Leu Pro Arg Ser 180 185 190 Leu Ala Pro Ala Gly Lys Asp 195 <210> 11 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-T11A <400> 11 aagctttttt ttttta 16 <210> 12 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-AP31 <400> 12 aagcttggtg aac 13 <210> 13 <211> 688 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atgaggcagt ggggtatctg tgtgttctcc cactgaccac gctttcttta gtgactcctg 60 attgcctcct caagtcgcag acactatgct gcctcccatg gccctgccca gtgtatcttg 120 gatgctgctt tcctgcctca tgctgctgtc tcaggttcaa ggtgaagaac cccagaggga 180 actgccctct gcacggatcc gctgtcccaa aggctccaag gcctatggct cccactgcta 240 tgccttgttt ttgtcaccaa aatcctggac agatgcagat ctggcctgcc agaagcggcc 300 ctctggaaac ctggtgtctg tgctcagtgg ggctgaggga tccttcgtgt cctccctggt 360 gaagagcatt ggtaacagct actcatacgt ctggattggg ctccatgacc ccacacaggg 420 caccgagccc aatggagaag gttgggagtg gagtagcagt gatgtgatga attactttgc 480 atgggagaga aatccctcca ccatctcaag ccccggccac tgtgcgagcc tgtcgagaag 540 cacagcattt ctgaggtgga aagattataa ctgtaatgtg aggttaccct atgtctgcaa 600 gttcactgac tagtgcagga gggaagtcag cagcctgtgt ttggtgtgca actcatcatg 660 ggcatgagac cagtgtgagg actcaccc 688 <210> 14 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Leu Pro Pro Met Ala Leu Pro Ser Val Ser Trp Met Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Met Leu Leu Ser Gln Val Gln Gly Glu Glu Pro Gln Arg Glu 20 25 30 Leu Pro Ser Ala Arg Ile Arg Cys Pro Lys Gly Ser Lys Ala Tyr Gly 35 40 45 Ser His Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser Pro Lys Ser Trp Thr Asp Ala 50 55 60 Asp Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Val Ser Ser Leu Val Lys Ser Ile Gly 85 90 95 Asn Ser Tyr Ser Tyr Val Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly 100 105 110 Thr Glu Pro Asn Gly Glu Gly Trp Glu Trp Ser Ser Ser Asp Val Met 115 120 125 Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Arg Asn Pro Ser Thr Ile Ser Ser Pro Gly 130 135 140 His Cys Ala Ser Leu Ser Arg Ser Thr Ala Phe Leu Arg Trp Lys Asp 145 150 155 160 Tyr Asn Cys Asn Val Arg Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Thr Asp 165 170 175 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-T11C <400> 15 aagctttttt tttttc 16 <210> 16 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-AP37 <400> 16 aagcttgggc cta 13

Claims (9)

  1. 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 원암 단백질.
  2. 제1항의 단백질을 코딩하는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 원암 유전자.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호: 1의 염기 번호 52 내지 2343에 해당하는 염기서열을 지닌 인간 원암 유전자.
  4. 제 2 항 또는 제3항의 원암 유전자를 포함하는 벡터.
  5. 제 4 항의 벡터에 의해 형질전환된 미생물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 미생물은 대장균 DH5α/PIG29/pcDNA3.1(기탁번호 제KCTC 10660BP)인 미생물.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항의 미생물을 이용하여 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제조하는 방법.
  8. 제 1항의 원암 단백질을 포함하는 암 진단용 키트.
  9. 제 2항 또는 제 3 항의 원암 유전자를 포함하는 암 진단용 키트.
KR1020060069820A 2006-07-25 2006-07-25 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질 전환된 세포 KR20060089873A (ko)

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