KR100675976B1

KR100675976B1 - 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질

Info

Publication number: KR100675976B1
Application number: KR1020060093073A
Authority: KR
Inventors: 김현기; 김진우
Original assignee: 김현기
Priority date: 2006-09-25
Filing date: 2006-09-25
Publication date: 2007-02-28
Also published as: KR20060107491A

Abstract

본 발명은 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 미생물에 관한 것으로, 본 발명의 유전자는 인간 암의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질{HUMAN CANCER SUPPRESSOR GENE, PROTEIN ENCODED THEREIN}

도 1은 서열번호: 3의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP33(a); 서열번호: 7의 H-AP10(b) ; 서열번호: 11의 H-AP5(c); 서열번호: 15의 H-AP2(d); 서열번호: 19의 H-AP8(e); 서열번호: 23의 H-AP7(f); 서열번호: 27의 H-AP11(g); 서열번호: 31의 H-AP3(h); 서열번호: 35의 H-AP4(i); 서열번호: 39의 H-AP8(j); 서열번호: 43의 H-AP33(k); 서열번호: 47의 H-AP35(l); 서열번호: 51의 H-AP3(m); 서열번호: 55의 H-AP12(n); 서열번호: 59의 H-AP12(o); 서열번호: 63의 H-AP7(p); 서열번호: 67의 H-AP8(q); 서열번호: 71의 H-AP10(r); 서열번호: 75의 H-AP16(s); 서열번호: 79의 H-AP2(t);서열번호: 83의 H-AP9(u); 서열번호: 87의 H-AP9(v); 서열번호: 91의; H-AP32(w); 서열번호: 95의 H-AP10(x); 서열번호: 99의 H-AP22(y); 서열번호: 103의 H-AP12(z); 서열번호: 107의 H-AP10(α); 서열번호: 111의 H-AP12(β) 또는 서열번호: 115의 H-AP4(γ)와 서열번호: 4;서열번호 8;서열번호 12; 서열번호 16; 서열번호 20; 서열번호 24 ;서열번호 28;서열번호 32; 서열번호 36; 서열번호 40; 서열번호: 44;서열번호 48;서열번호 52; 서열번호 56; 서열번호 60; 서열번호: 64;서열번호 68;서열번호 72; 서열번호 76; 서열번호 80; 서열번호: 84;서열번호 88;서열번호 92; 서열번호 96; 서열번호 100; 서열번호: 104;서열번호 108; 서열번호 112 또 는 서열번호 116의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진이다.

도 2는 본 발명의 GIG8 유전자 산물(a); GIG10 유전자 산물(b); GIG13 유전자 산물(c); GIG 15 유전자 산물(d); GIG 16 유전자 산물(e); GIG24 유전자 산물(f); GIG26 유전자 산물(g); GIG29 유전자 산물(h); GIG30 유전자 산물(i); GIG32 유전자 산물(j); GIG33 유전자 산물(k); GIG 34 유전자 산물(l); GIG 35 유전자 산물(m); GIG38 유전자 산물(n); GIG39 유전자 산물(o); GIG40 유전자 산물(p); GIG42 유전자 산물(q); GIG43 유전자 산물(r); GIG46 유전자 산물(s); PIG33 유전자 산물(t); PIG 35 유전자 산물(u); PIG 36 유전자 산물(v); MIG20 유전자 산물(w); PIG49 유전자 산물(x); PIG51 유전자 산물(y); MIG12 유전자 산물(z);PIG37(α);GIG44(β);GIG31(γ)의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다.

도 3은 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG8 유전자(a); GIG 10 유전자(b); GIG 13 유전자(c); GIG30 유전자(i); GIG 32 유전자(j); GIG 33 유전자(k); GIG34 유전자(l); GIG 35 유전자(m); GIG 38 유전자(n); GIG 39 유전자(o); PIG 49 유전자(x); PIG51 유전자 (y);GIG44 유전자(β);GIG31 유전자(γ)의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고,

도 3(d)는 정상 골수 조직, 백혈병환자 골수조직, 및 K562 백혈병 세포주에서 본 발명의 GIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고;

정상 간 조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG16 유전자 유전자(e); GIG24 유전자(f); GIG26 유전자(g); GIG29 유전자(h); GIG40 유전자(p); GIG42 유전자(q); PIG33 유전자(t); PIG35 유전자(u); PIG36 유전자(v); PIG37 유전자(α)의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고,

정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁암 조직 및 자궁암 세포주에서 GIG46 유전자(s); MIG20 유전자(w)차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며,

(z)는 정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주에서 MIG12유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3의 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 4는 여러 정상 조직에서 GIG 8 유전자(a); GIG 10 유전자(b); GIG 13 유전자(c); GIG 15 유전자(d); GIG16 유전자(e); GIG24 유전자(f); GIG26 유전자(g); GIG 29 유전자(h); GIG 30 유전자(i); GIG 32 유전자(j); GIG 33 유전자(k); GIG34 유전자(l); GIG35 유전자(m); GIG38 유전자(n); GIG 39 유전자(o); GIG 40 유전자(p); GIG 42 유전자(q); GIG 43 유전자(r); GIG46유전자(s); PIG33 유전자(t); PIG35 유전자(u); PIG 36 유전자(v); MIG20 유전자 (w); PIG49 유전자(x); PIG 51 유전자(y); MIG12 유전자 (z); PIG37 유전자(α);GIG44 유전자(β);GIG31 유전자(γ)의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 4 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 5는 여러 암세포주들에서 GIG8 유전자(a); GIG 10 유전자(b); GIG 13 유전자(c); GIG 15 유전자(d); GIG16 (e); GIG 24 유전자(f); GIG 26 유전자(g); GIG 29 유전자(h); GIG 30 유전자(i); GIG 32 유전자(j); GIG 33 유전자(k); GIG34 (l); GIG 35 유전자(m); GIG 38 유전자(n); GIG 39 유전자(o) ; GIG 40 유전자(p); GIG 42 유전자(q); GIG 43 유전자(r); GIG46 유전자(s); PIG33 유전자(t); PIG34 유전자(u); MIG20 유전자 (w); PIG49 유전자(x); PIG 51 유전자(y); MIG12 유전자 (z); PIG37 유전자(α);GIG44 유전자(β);GIG31 유전자(γ)의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도6은 야생형 MCF-7 세포, GIG8 유전자(a); GIG 10 유전자(b); GIG 13 유전자(c); GIG30 유전자(i); GIG 32 유전자(j); GIG 33 유전자(k); GIG34 유전자(l); GIG 35 유전자(m); GIG 38 유전자(n);GIG 39 유전자(o); PIG 49 유전자(x);PIG 33 유전자(y);GIG44 유전자(β);GIG31 유전자(γ)로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 MCF-7 세포의 성장 곡선이며,

(d)는 야생형 K562세포주 세포, GIG 15 유전자 형질감염된 K562 백혈병 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 K562 세포의 성장 곡선이고,

야생형 HepG2 간암세포주, GIG 16 유전자(e); GIG 24 유전자(f); GIG 26 유전자(g); GIG 29 유전자(h); GIG 40 유전자(p); GIG 42 유전자(q); GIG 43 유전자(r); PIG33 유전자(t); PIG35 유전자(u); PIG36 유전자(v); PIG37 유전자(α)로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HepG2 세포의 성장 곡선이며

야생형 HeLa 세포, GIG46 유전자(s); MIG20 유전자 (w)로 형질감염된 HeLa 자궁암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이고,

(z)는 야생형 A549 폐암세포주, MIG12 유전자로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포의 성장 곡선이다.

본 발명은 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.

암 억제 유전자(tumor suppressor gene) 산물은 정상 세포로부터 암 세포로의 형질전환을 억제하며, 이 기능이 상실되면 세포는 악성 형질전환에 이르게 된다(Klein, G., FASEB J., 7, 821-825 (1993)). 암세포가 암을 형성하기 위해서는 암 억제 유전자의 정상 카피수 기능이 상실되어야 한다. p53 암 억제 유전자의 코딩 서열내 변형이 인간 암에서 가장 일반적인 유전적 변화로 밝혀졌다(Bishop, J.M., Cell, 64, 235-248 (1991); 및 Weinberg, R.A., Science, 254, 1138-1146 (1991)).

그러나 유방암에서 보고된 p53 변이는 30%의 범위에 불과하여(Keen, J.C. & Davidson, N. E., Cancer, 97, 825-833 (2003)) 및 Borresen-Dale, A-L., Human Mutation, 21, 292-300 (2003)) 유방암 조직의 일부만이 이러한 p53 변이를 보이는 것으로 생각된다. 또 백혈병에서 보고된 p53 변이는 20% 이하의 범위에 불과하여(Boyapati, A., et al., Acta Haematol., 111(1-2), 100-106 (2004)) 백혈병조직의 일부만이 마찬가지로 이러한 p53 변이를 보이는 것으로 생각된다.

또 간암의 경우에서 특히 아플라톡신 B1 (Aflatoxin B1)에 노출되거나 B 형 간염에 감염되는 빈도가 높은 지역에서 p53 변이는 무려 50% 이상에 이르며 주로 변이는 codon 249 에서 오인변이 (missense mutation)가 특징이다 (Montesano, R. et al., J. Natl. Cancer Inst., 89, 1844-1851 (1997); Szymanska, K. & Hainaut, P. Acta Biochimica Polonica, 50, 231-238 (2003)). 그러나 미국이나 서부 유럽에서의 간암에서 p53 변이는 30% 정도에 불과하며 변이가 자주 일어나는 핫 스폿 (hot spot)도 없다 (Szymanska, K. & Hainaut, P. Acta Biochimica Polonica, 50, 231-238 (2003)).

한편 자궁경부암에서 보고된 p53 변이는 2 % 내지 11 %의 범위에 불과하여(Crook, T. et al., Lancet, 339, 1070-1073 (1992); 및 Busby-Earle, R.M.C. et al., Br. j. Cancer, 69, 732-737 (1994)), 자궁경부암 조직의 일부만이 이러한 p53 변이를 보이는 것으로 생각된다.

또한 폐암에서 비소세포성 폐암 (non-small-cell lung cancer)의 경우 약 50%에서 소세포성 폐암 (small-cell lung cancer)의 경우 70%까지 p53 종양억제 유전자의 변이가 보고되고 있다 (Takahashi, T. et al., Science, 246, 491-494 1989; Bodner, S.M. et al., Oncogene, 7, 743-749 (1992); Mao, L. Lung Cancer, 34, S27-S34 (2001)). 폐암의 발생과 병의 진행에는 흡연이 가장 중요하게 작용하며 p53외에도 여러가지 다른 종양억제 유전자들과 암유전자들이 동시에 관계하고 있다 (Osada, H. & Takahashi, T. Oncogene, 21, 7421-7434 (2002)).

이에 본 발명자들은, 정상 유방 조직과 유방암 사이, 정상 간 조직과 간암 사이, 정상 골수 조직과 백혈병환자 골수조직, 정상 자궁경부 조직과 자궁경부암 , 정상 폐 조직과 폐암 사이에 차별적으로 발현되는 유전자를 보다 효율적으로 나타내는 mRNA 감별 전개법(mRNA differential display(DD) method) (Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966-6968 (1993))을 사용하여, 정상 유방조직, 정상 간 조직, 정상 자궁경부 조직,정상 폐 조직 등에서 새로운 암 억제 유전자를 분리하고자 예의 연구하였다.

본 발명의 목적은 신규한 인간 암 억제 유전자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자에 의해 코딩되는 암 억제 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 데 있다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1; 서열번호: 5; 서열번호: 9; 서열번호: 13; 서열번호: 17; 서열번호: 21; 서열번호: 25; 서열번호: 29; 서열번호: 33; 서열번호: 37; 서열번호: 41; 서열번호: 45; 서열번호: 49; 서열번호: 53; 서열번호: 57; 서열번호: 61; 서열번호: 65; 서열번호: 69; 서열번호: 73; 서열번호: 77; 서열번호: 81; 서열번호: 85; 서열번호: 89; 서열번호: 93; 서열번호: 97; 서열번호: 101; 서열번호: 105; 서열번호: 109 또는 서열번호: 113의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 2; 서열번호: 6; 서열번호: 10; 서열번호: 14; 서열번호: 18; 서열번호: 22; 서열번호: 26; 서열번호: 30; 서열번호: 34; 서열번호: 38; 서열번호: 42; 서열번호: 46; 서열번호: 50; 서열번호: 54; 서열번호: 58; 서열번호: 62; 서열번호: 66; 서열번호: 70; 서열번호: 74; 서열번호: 78; 서열번호: 82; 서열번호: 86; 서열번호: 90; 서열번호: 94; 서열번호: 98; 서열번호: 102; 서열번호: 106; 서열번호: 110 또는 서열번호: 114의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

1. GIG 8

본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 8(GIG8)으로서, 서열번호: 1의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY634687 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_002166 호인 Homo sapiens DNA 결합 2 저해제, 도미넌트 네가티브 헬릭스-루프-헬릭스 단백질 (ID2) 유전자와 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 GIG8 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서 는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG8 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 1의 염기서열에는 염기번호 120 내지 524(염기번호 522-524는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 134 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 2의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 15 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩 티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 3의 임의 프라이머 H-AP33 (5’-AAGCTTGCTGCTC-3’)및 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 163 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 MCF-7 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 및 폐조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.3 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

2. GIG 10

본 발명의 유전자는 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 10(GIG10)으로서, 서열번호: 5의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY542305 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 AF230904호인 Homo sapiens c-Cbl-상호작용 단백질 (CIN85)유전자 등과 서열이 유사한 유전자이다.

그러나 GIG10 유전자는 인간의 각종 암화 과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG10 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 5의 염기서열에는 염기번호 52 내지 2049(염기번호 2047-2049는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전 자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 665 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 6의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 73 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 5의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 7의 임의 프라이머 H-AP10 (5’-AAGCTTCCACGTA-3’)및 서열번호: 8의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 321 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 뇌, 심장, 근육, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 및 폐조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 3.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

3. GIG 13

본 발명의 유전자는 서열번호: 9의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 13(GIG13)으로서, 서열번호: 9의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY493418 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_016831호인 Homo sapiens 피리어드 호모로그 3 (Drosophila) (PER3)유전자 등과 유전자서열이 유사한 유전자이 다.

그러나 GIG13 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG13 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다. 서열번호: 9의 염기서열에는 염기번호 72 내지 3677(염기번호 3675-3677은 종료 코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 1201 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 10의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 132 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단 백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 11의 임의 프라이머 H-AP5 (5’-AAGCTTAGTAGGC-3’)및 서열번호: 12의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 347 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방과 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.3 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 유방암 조직 및 유방암 세포주 MCF-7 등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 약하거나 없는 반면 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다.

4. GIG 15

본 발명의 유전자는 서열번호: 13의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 15(GIG15)로서, 서열번호: 13의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY927233 호로 등록되었으며(공개예정일: 2006년 10월 1일) 이 데이터베이스에 등록된 제 AC116533 호인 Homo sapiens 염색체 11, 클론 RP11-466H18 등과 유전자 서열이 유사하다. 그러나 GIG15 유전자는 인간의 각종 암화 과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 백혈병을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약한 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG15 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 13의 염기서열에는 염기번호 18 내지 338(염기번호 336-338은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 106 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 14의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 12 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 13의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝 하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 15의 임의 프라이머 H-AP2 (5’-AAGCTTCGACTGT-3’)및 서열번호: 16의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현이 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 133 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 K562 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 및 폐조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 0.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 백혈병 조직 및 백혈병 세포주 K562등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 약한 반면 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다.

5. GIG 16

본 발명의 유전자는 서열번호: 17의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 16(GIG16)로서, 서열번호: 17의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY513277 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_016527호인 Homo sapiens hydroxyacid oxidase 2 (long chain) (HAO2) 유전자 서열과 일부 유전자 서열이 다른 유전자로 HAO2 유전자는 2-hydroxyacid oxidase 활성을 갖는 3가지 유전자 중 하나로만 알려져 있다 ((Jones, J.M., et al., J. Biol. Chem. 275(17), 12590-12597 (2000)). 그러나 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG16 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 17의 염기서열에는 염기번호 41 내지 1096(염기번호 1094-1096은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함 한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 351 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 18의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 39 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 17의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 19의 임의 프라이머 H-AP8 (5’-AAGCTTTTACCGC-3’) 및 서열번호: 20의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 213 bp cDNA 단 편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다. 본 발명자들은 GIG16 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG16/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간, 신장조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 2.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 간암 조직 및 간암 세포주 HepG2 등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된다.

6. GIG 24

본 발명의 유전자는 서열번호: 21의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 24(GIG24)로서, 서열번호: 21의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY513275 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 AK093049호인 Homo sapiens cDNA FLJ35730 fis, ALPHA-1-ANTICHYMOTRYPSIN PRECURSOR 유전자 매우 유사성을 갖는 클론 TESTI200313 등과 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 간 정상조직에서는 발현이 매우 증가된 GIG24 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 21의 염기서열에는 염기번호 34내지 1305(염기번호 1303-1305는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 423 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 22의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 47 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 23의 임의 프라이머 H-AP7 (5’-AAGCTTAACGAGG-3’) 및 서열번호: 24의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 221 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다. 본 발명자들은 GIG24 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG24/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간, 심장 및 근육조직에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 2.4 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

7. GIG 26

본 발명의 유전자는 서열번호: 25의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 26(GIG26)으로서, 서열번호: 25의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY544126 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_153696호인 Homo sapiens 전립선-특이적 막 항원 유사 (PSMAL)유전자와 제 AF261715호인 Homo sapiens 전립선-특이적 막 항원 유사 단백질 (PSMAL/GCP III) mRNA 유전자와 유전자 서열이 유사한 유전자로 전립선-특이적 막 항원(PSMA) 유전자는 전립선 상피에 서 주로 발현되는 marker 단백질로 알려져있다 ((Lee,S.J., et al., J. Mol. Biol. 330(4), 749-760 (2003)). 그러나 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG26 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 25의 염기서열에는 염기번호 26 내지 1354(염기번호 1352-1354는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 442 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 26의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 50 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 25의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 27의 임의 프라이머 H-AP11 (5’-AAGCTTCGGGTAA-3’) 및 서열번호: 28의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 204 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다. 본 발명자들은 GIG26 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG26/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간, 신장, 뇌 및 심장조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 약 2.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

8. GIG 29

본 발명의 유전자는 서열번호: 29의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 29(GIG29)로서, 서열번호: 29의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY544127 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_003049호인 Homo sapiens 솔루트 캐리어 계 10 (sodium/bile acid 코트랜스포터 계열) 등과 유전자서열이 유사한 것으로 나타났다. 그러나 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 간 정상조직에서는 발현이 매우 증가된 GIG29 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 29의 염기서열에는 염기번호 62내지 1111(염기번호 1109-1111은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에 서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 349 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 30의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 38 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 29의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝 하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 31의 임의 프라이머 H-AP3 (5’-AAGCTTTGGTCAG-3’) 및 서열번호: 32의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 277 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다. 본 발명자들은 GIG29 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG29/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간조직에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.4 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

9. GIG 30

본 발명의 유전자는 서열번호: 33의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 30(GIG30)으로서, 서열번호: 33의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY524045 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 AY358814 호인 Homo sapiens clone DNA43305 RIPK2 (UNQ277)유전자 등과 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 GIG30 유전자는 인간의 각종 암화 과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG30 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 33의 염기서열에는 염기번호 88 내지 1710(염기번호 1708-1710은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함 한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 540 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 34의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 61 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 33의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 35의 임의 프라이머 H-AP4 (5’-AAGCTTCTCAACG-3’)및 서열번호: 36의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 278 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 심장, 근육, 및 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.9 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

10. GIG 32

본 발명의 유전자는 서열번호: 37의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 32(GIG32)으로서, 서열번호: 37의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY762103 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_001753호인 Homo sapiens caveolin 1, caveolae 단백질, 22kDa (CAV1) 유전자와 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 GIG32 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있으며 대다수 인간 암의 발생을 억제하는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직 들에서는 발현이 매우 증가된 GIG32 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 37의 염기서열에는 염기번호 43 내지 579(염기번호 577-579는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 178 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 38의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 20 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상 동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 37의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 39의 임의 프라이머 H-AP8 (5’-AAGCTTTTACCGC-3’)및 서열번호: 40의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 172 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 및 폐조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 4.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

11; GIG 33

본 발명의 유전자는 서열번호: 41의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 33(GIG33)으로서, 서열번호: 41의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY871273 호로 등록되었으며(공개예정일: 2006년 10월 1일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_000996 호인 Homo sapiens 리보좀 단백질 L35a (RPL35A) 유전자와 서열이 유사한 유전자이다. 이 리보좀 유전자는 단백질 합성을 촉매화하는 세포내 소기관으로서 작은 40S 소단위와 큰 60S 소단위로 구성되어 있다. 그러나 아직 이유전자의 기능은 규명되어 있지 않다 ((Herzog,H., et al., Nucleic Acids Res., 18(15), 4600 (1990) ; Kenmochi, N., et al., Genome Res., 8(5), 509-523 (1998) ; Lopez,C.D., et al., Cancer Lett. 180(2), 195-202 (2002)). 그러나 GIG33 유전자는 인간의 각종 암화 과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG33 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 41의 염기서열에는 염기번호 74 내지 406(염기번호 404-406은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질 의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 110 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 42의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 12 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 41의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 43의 임의 프라이머 H-AP33 (5’-AAGCTTGCTGCTC-3’)및 서열번호: 44의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 182 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초혈액 백혈구조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 0.6 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

12; GIG 34

본 발명의 유전자는 서열번호: 45의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 34(GIG34)으로서, 서열번호: 45의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY871274 호로 등록되었으며(공개예정일: 2006년 10월 1일) 이 데이터베이스에 등록된 제 BC018970호인 Homo sapiens ribosomal 단백질 L11 유전자 등과 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 GIG34 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG34 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 45의 염기서열에는 염기번호 5 내지 538(염기번호 536-538은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 177 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 46의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 20 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 45의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 47의 임의 프라이머 H-AP35 (5’-AAGCTTCAGGGCA-3’)및 서열번호: 48의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 205 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장 균 또는 MCF-7 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

13. GIG 35

본 발명의 유전자는 서열번호: 49의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 35(GIG35)으로서, 서열번호: 49의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY542307 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_001404호인 Homo sapiens 진핵 번역 연장 인자 1 감마(EEF1G)유전자와 서열이 유사한 유전자이다. 이 유전자는 아미노아실 tRNAs를 리보좀에 전달하는데 중요한 역할을 하는 연장 인자-1의 소단위 이다 ((Kumabe, T., et al., Nucleic Acids Res., 20(10), 2598 (1992)). 그러나 GIG35 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약한 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG35 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 49의 염기서열에는 염기번호 19 내지 1332(염기번호 1330-1332는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 437 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 50의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 50 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상 동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 49의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 51의 임의 프라이머 H-AP3 (5’-AAGCTTTGGTCAG-3’)및 서열번호: 52의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 212 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

14. GIG38

본 발명의 유전자는 서열번호: 53의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 38(GIG38)으로서, 서열번호: 53의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY550970 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_005870호인 Homo sapiens sin3-관련 폴리펩타이드, 18kDa (SAP18)유전자 등과 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 GIG38 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG38 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 53의 염기서열에는 염기번호 17 내지 478(염기번호 476-478은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동 일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 153 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 54의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 17 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 53의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 55의 임의 프라이머 H-AP12 (5’-AAGCTTGAGTGCT-3’)및 서열번호: 56의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포 주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 172 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 심장, 근육, 콩팥, 간, 및 태반조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 0.7 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

15. GIG39

본 발명의 유전자는 서열번호: 57의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 39(GIG39)로서, 서열번호: 57의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY550972 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 BC030531호인 Homo sapiens 염색체 1 오픈 리딩 프레임 24 유전자 등과 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 GIG39 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거 나 없고 반면에 일부 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG39 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 57의 염기서열에는 염기번호 70 내지 2856(염기번호 2854-2856은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 928 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 58의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 103 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩 티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 57의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 59의 임의 프라이머 H-AP12 (5’-AAGCTTGAGTGCT-3’)및 서열번호: 60의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 327 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방과 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 2.4 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

16. GIG40

본 발명의 유전자는 서열번호: 61의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 40(GIG40)으로서, 서열번호: 61의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY550966 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_005228호인 Homo sapiens 상피 세포 성장 인자 수용체(erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian) (EGFR) 등과 유전자서열이 유사한 것으로 밝혀졌다. 그러나 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 매우 약하고 반면에 간 정상조직에서는 발현이 매우 증가된 GIG40 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 61의 염기서열에는 염기번호 47내지 3679(염기번호 3677-3679는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함 한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 1210 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 62의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 134 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 61의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 63의 임의 프라이머 H-AP7 (5’-AAGCTTAACGAGG-3’) 및 서열번호: 64의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 275 bp cDNA 단 편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다. 본 발명자들은 GIG40 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG40/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간, 심장 및 근육조직에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

17. GIG42

본 발명의 유전자는 서열번호: 65의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 42(GIG42)로서, 서열번호: 65의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY550967 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 BC034023호인 Homo sapiens 알부민 유전자 등과 유전자서열이 유사한 것으로 나타났다. 그러나 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 간 정상조직에서는 발현이 매우 증가된 GIG42 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 65의 염기서열에는 염기번호 8내지 1837(염기번호 1835-1837은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 609 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 66의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 69 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단 백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 65의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 67의 임의 프라이머 H-AP8 (5’-AAGCTTTTACCGC-3’) 및 서열번호: 68의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 327 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다. 본 발명자들은 GIG42 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG42/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간조직에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 2.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

18. GIG43

본 발명의 유전자는 서열번호: 69의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 43(GIG43)으로서, 서열번호: 69의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY550971 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 BC028354호인 Homo sapiens 인지질 scramblase 4유전자 등과 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 GIG43 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG43 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 69의 염기서열에는 염기번호 96 내지 1085(염기번호 1083-1085는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 329 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 70의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 37 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 69의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 71의 임의 프라이머 H-AP10 (5’-AAGCTTCCACGTA-3’)및 서열번호: 72의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 273 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 심장, 콩팥, 간, 태반, 및 폐조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 3.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

19. GIG46

본 발명의 유전자는 서열번호: 73의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 1(GIG46)으로서, 서열번호: 73의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY692464 호로 등록되었으며(공개예정일: 2006년 5월 1일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_001613호인 Homo sapiens 액틴, 알파 2, 평활근, 대동맥(ACTA2) 유전자와 유전자 서열이 유사함이 밝혀졌다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 GIG46 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 아주 약하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG46 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 73의 염기서열에는 염기번호 393 내지 1526(염기번호 1524-1526은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 377 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 74의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 42 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 73의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 75의 임의 프라이머 H-AP16 (5’-AAGCTTTAGAGCG-3’)및 서열번호: 76의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 255 bp cDNA 단편을 얻고 (1323bp-1577bp 에 해당), 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HeLa 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 자궁, 뇌, 심장, 골격근, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초혈액 백혈구들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 2.0kb 의 전사물로도 발현된다.

20. PIG33

본 발명의 유전자는 서열번호: 77의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (PIG33)로서, 서열번호: 77의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY513278 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 BC033721호인 Homo sapiens SPARC-유사 1 (mast9, hevin) 유전자 등과 유전자 서열이 유사하다. 그러나 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하고 반면에 간 정상조직에서는 발현이 매우 증가된 PIG35 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 77의 염기서열에는 염기번호 81내지 2075(염기번호 2073-2075는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈 의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 664 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 78의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 75 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 77의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 79의 임의 프라이머 H-AP2 (5’-AAGCTTCGACTGT-3’) 및 서열번호: 80의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 256 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다. 본 발명자들은 PIG33 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG33/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간, 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장,콩팥, 소장, 태반 및 폐조직에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보 인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 3.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

21. PIG35

본 발명의 유전자는 서열번호: 81의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (PIG35)로서, 서열번호: 81의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY513280 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_002615호인 Homo sapiens 세린(또는 시스테인) 프로테이네이즈 저해제 등과 유전자서열이 유사하다. 그러나 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하고 반면에 간 정상조직에서는 발현이 매우 증가된 PIG35 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 81의 염기서열에는 염기번호 50내지 1306(염기번호 1304-1306은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으 로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 418 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 82의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 46 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 81의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 83의 임의 프라이머 H-AP9 (5’-AAGCTTCATTCCG-3’) 및 서열번호: 84의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포 주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 312 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다. 본 발명자들은 PIG35 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG35/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간, 심장, 근육, 뇌, 소장, 폐 및 태반조직에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.7 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

22. PIG36

본 발명의 유전자는 서열번호: 85의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (PIG36)로서, 서열번호: 85의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY544129 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_001685호인 Homo sapiens ATP 신쎄테이즈, H+ 트랜스포팅, 미토콘드리아 F0 복합체 소단위 F6 (ATP5J) 등과 유전자 서열이 유사하다. 그러나 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하고 반면에 간 정상조직에서는 발현이 매우 증가된 PIG36 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 85의 염기서열에는 염기번호 102내지 428(염기번호 426-428은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 108 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 86의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 13 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범 위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 87의 임의 프라이머 H-AP9 (5’-AAGCTTCATTCCG-3’) 및 서열번호: 88의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 162 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다. 본 발명자들은 PIG36 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG36/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간, 심장, 근육, 콩팥, 및 태반조직에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

23. MIG20

서열번호: 89의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY871271 호로 등록되었으며(공개예정일: 2006년 10월 1일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 BX537651호인 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp686C0390 유전자 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 전혀 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 높은 MIG20 종양억제유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 89의 염기서열에는 염기번호 8 내지 202(염기번호 200-202는 종료 코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 동시에 염기번호 233 내지 442(염기번호 440-442는 종료코돈임)에 해당하는 또다른 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 64 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 90의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 7 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 89의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 91의 임의 프라이머 H-AP32 (5’-AAGCTTCCTGCAA-3’)및 서열번호: 92의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 311 bp cDNA 단편을 얻고 (2067bp-2377bp 에 해당), 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 자궁, 심장, 골격근, 콩팥, 및 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명 의 유전자는 대부분이 약 4.4 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 2.4 및 1.5 kb 의 전사물로도 발현된다.

24. PIG49

본 발명의 유전자는 서열번호: 93의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (PIG49)으로서, 서열번호: 93의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY524047 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_005749호인 Homo sapiens 트랜스듀서인 ERBB2, 1 (TOB1) 유전자와 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 PIG49 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG49 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 93의 염기서열에는 염기번호 11 내지 1048(염기번호 1046-1048은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으 로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 345 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 94의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 38 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 93의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 95의 임의 프라이머 H-AP10 (5’-AAGCTTCCACGTA-3’)및 서열번호: 96의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포 주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 272 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 근육, 심장, 콩팥, 간, 및 태반조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 2.4 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 또한, 약 1.5 kb의 mRNA 전사물로도 발현된다.

25. PIG51

본 발명의 유전자는 서열번호: 97의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (PIG51)으로서, 서열번호: 97의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY542308 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 BC007054 호인 Homo sapiens TBC1 도메인 계열 멤버 7 유전자와 유전자서열이 유사한 유전자이다. 이유전자의 특이적 기능은 아직 규명이 되지 않고 있다. 그러나 PIG51 유전자는 인간의 각종 암화 과 정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG51 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 97의 염기서열에는 염기번호 59 내지 802(염기번호 800-802는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 247 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 98의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 28 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 97의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 99의 임의 프라이머 H-AP22 (5’-AAGCTTTTGATCC-3’)및 서열번호: 100의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 211 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 심장, 근육, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 태반 및 백혈구조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

26. MIG12

본 발명의 유전자는 서열번호: 101의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (MIG12)로서, 서열번호: 101의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY453400 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 BC016731호인 Homo sapiens thymosin, beta 10 유전자 등과 유전자서열이 유사하다. 그러나 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 낮고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 MIG12 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 101의 염기서열에는 염기번호 29내지 163(염기번호 161-163은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동 일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 44 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 102의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 5 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 101의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 103의 임의 프라이머 H-AP12 (5’-AAGCTTGAGTGCT-3’)및 서열번호: 104의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포 주에서는 발현이 매우 약하고 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 강한 161 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 A549 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 폐, 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 및 말초혈액조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 0.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 1.0 및 0.8 kb 의 전사물로도 발현된다.

27. PIG37

본 발명의 유전자는 서열번호: 105의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (PIG37)로서, 서열번호: 105의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY513281 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_002221호인 Homo sapiens 이노시톨 1,4,5-삼인산 3-카이네이즈 B (ITPKB)유전자와 유전자 서열이 유사하다. 그러나 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하 고 반면에 간 정상조직에서는 발현이 매우 증가된 PIG37 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 105의 염기서열에는 염기번호 4 내지 1422(염기번호 1420-1422는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 472 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 106의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 53 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩 티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 105의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 107의 임의 프라이머 H-AP10 (5’-AAGCTTCCACGTA-3’) 및 서열번호: 108의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 263 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다. 본 발명자들은 PIG33 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽 입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG37/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간, 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장,콩팥, 소장, 태반 및 폐조직에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 7.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

28. GIG44

본 발명의 유전자는 서열번호: 109의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 44(GIG44)으로서, 서열번호: 109의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY971350 호로 등록되었으며(공개예정일: 2006년 5월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 BC042127호인 Homo sapiens 추정 인슐린-유사 성장 인자 II 관련 단백질 유전자 등과 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 GIG44 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG44 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 109의 염기서열에는 염기번호 59 내지 400(염기번호 398-400은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 113 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 110의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 12 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 109의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로 닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 111의 임의 프라이머 H-AP12 (5’-AAGCTTGAGTGCT-3’)및 서열번호: 112의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 221 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 심장, 콩팥, 간, 태반, 및 폐조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

29. GIG31

본 발명의 유전자는 서열번호: 113의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 31(GIG31)으로서, 서열번호: 113의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY971351 호로 등록되었으며(공개예정일: 2006년 5월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_002923호인 Homo sapiens G-단백질 시그널링 2 유전자의 조절자 등과 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 GIG31 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하거나 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG31 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 113의 염기서열에는 염기번호 14 내지 649(염기번호 647-649는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 211 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 114의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 24 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 113의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 115의 임의 프라이머 H-AP4 (5’-AAGCTTCTCAACG-3’)및 서열번호: 116의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않거나 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 되는 223 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 심장, 대장, 비장, 소장, 태반, 폐 및 백혈구조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.4 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다.

특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 유방암 조직 및 유방암 세포주 MCF-7, 백혈병 조직 및 백혈병 세포주 K562, 간암 조직 및 간암 세포주 HepG2 , 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주, 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 약하거나 없는 반면 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다.

본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

참조예: 총 RNA의 분리

신선한 조직 또는 배양된 세포로부터 총 RNA 분리 키트(RNeasy total RNA kit, Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 총 RNA를 분리한 후, 메시지 클린 키트(message clean kit, GenHunter Corp., MA, 미국)를 사용하여 RNA에 오염된 DNA를 제거하였다.

실시예 1: 총 RNA의 분리 및 mRNA 감별 전개

정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

유방암 환자로부터 유방적출술(mastectomy) 중에 정상 유방 조직 시료를 얻었으며, 수술적 처치 전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 유방절제술(radical mastectomy) 중에 원발성 유방 암조직 시료를 얻었다. 인간 유방암 세포주로는 MCF-7 (American Type Culture Collection; ATCC Number HTB-22) 유방암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조 예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

또 GIG 15의 경우에는 mRNA의 감별 전개를 위하여, 정상인의 골수 (bone marrow) 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지 않은 백혈병환자로부터 골수조직생검사 (bone marrow biopsy)에 원발성 백혈병 골수조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 만성 골수성 백혈병 세포주로 K-562 (Americal Type Cell Collection; ATCC Number CCL-243)를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조 예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

한편 간암 관련 유전자의 경우에는 정상 간 조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

간암 환자로부터 조직 생검(biopsy) 중에 정상 간 및 간암 조직 시료를 얻었으며, 인간 간암 세포주로는 HepG2 (American Type Culture Collection; ATCC Number HB-8065) 간암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

또한 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다. 자궁 근종 환자로부터 자궁적출술(hysterectomy) 중에 정상 자궁경부(exocervical) 조직 시료를 얻었으며, 수술적 처치전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 자궁절제술(radical hysterectomy) 중에 원발성 자궁경부암 조직 및 전이성 장골 림프절 조직 시료를 얻었다. 인간 자궁경부암 세포주로는 CUMC-6(Kim, J.W. et al., Gynecol. Oncol., 62, 230-240 (1996))을 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

또 정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이 조직 및 폐암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다. 폐암 환자로부터 수술 중에 정상 폐조직, 폐암 조직 및 폐암 전이조직 시료를 얻었으며, 인간 폐암 세포주로는 A549 (American Type Culture Collection; ATCC Number CCL-185) 와 NCI-H358 (American Type Culture Collection; ATCC Number CRL-5807) 폐암 세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다.

1-1; GIG 8

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 3의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP33(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1a는 서열번호: 3의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP33과 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1a에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 163 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG8 전장 유전자서열의 317bp에서부터 479bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC33으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC33 단편인 163 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC33 을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-2; GIG 10

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 8의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 7의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP10(RNAimage primer set 2, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1b는 서열번호: 7의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP10과 서열번호: 8의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1b에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1b에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 321 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG10 전장 유전자서열의 1716bp에서부터 2036bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC42로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC42 단편인 321 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC42를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-3; GIG 13

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 12의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 11의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP5(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1c는 서열번호: 11의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP5와 서열번호: 12의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1c에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF- 7이다. 도 1c에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 347 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG13 전장 유전자서열의 3253bp에서부터 3599bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC59로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC59 단편인 347 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC59를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-4; GIG 15

mRNA의 감별 전개를 위하여, 정상인의 골수 (bone marrow) 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지 않은 백혈병환자로부터 골수조직생검사 (bone marrow biopsy)에 원발성 백혈병 골수조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 만성 골수성 백혈병 세포주로 K-562 (Americal Type Cell Collection; ATCC Number CCL-243)를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조 예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966- 6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 16의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 15의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP2(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1d는 서열번호: 15의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP2와 서열번호: 16의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 정상 골수 조직, 백혈병 조직 및 K-562 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1d에서 알 수 있는 바와 같이, 133 bp cDNA 단편인 GV2(GIG15 전장 유전자서열의 212bp에서부터 344bp 까지 임)는 백혈병 조직 및 K-562 세포에서는 발현이 약하였으나, 정상 골수조직에서는 발현이 매우 강하였다. 이 cDNA 단편을 GV2로 명명하였다. 건조된 겔로부터 GV2 단편인 133 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 GV2를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-5; GIG 16

정상 간 조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 20의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 19의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP8(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1e는 서열번호: 19의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP8과 서열번호: 20의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1e에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 213 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG16 전장 유전자서열의 867bp에서부터 1079bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP8로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP8 단편인 213 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP8을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-6; GIG 24

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 24의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 23의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP7(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1f는 서열번호: 23의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP7과 서열번호: 24의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1f에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 221 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG42 전장 유전자서열의 1057bp에서부터 1277bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP71로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP71 단편인 221 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭 시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP71을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-7; GIG 26

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 28의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 27의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP11(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1g는 서열번호: 27의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP11과 서열번호: 28의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1g에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 204 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG26 전장 유전자서열의 1036bp에서부터 1239bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP115로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP115 단편인 204 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP115를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-8; GIG 29

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 32의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 31의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP3(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1h는 서열번호: 31의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP3과 서열번호: 32의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1h에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 277 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG29 전장 유전자서 열의 823bp에서부터 1099bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP3으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP3 단편인 277 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP3을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-9; GIG 30

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 36의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 35의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP4(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1i는 서열번호: 35의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP4와 서열번호: 36의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF- 7이다. 도 1i에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 278 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG30 전장 유전자서열의 1462bp에서부터 1739bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC48으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC48 단편인 278 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC48 을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-10; GIG 32

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 40의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 39의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP8(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1j는 서열번호: 39의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP8과 서열번호: 40의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1j에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 172 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG32 전장 유전자서열의 428bp에서부터 599bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC82로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC82 단편인 172 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC82를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-11; GIG 33

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 44의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 43의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP33(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1k는 서열번호: 43의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP33과 서열번호: 44의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1k에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 182 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG33 전장 유전자서열의 216bp에서부터 397bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC86으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC86 단편인 182 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC86을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-12; GIG 34

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 48의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프 라이머 및, 서열번호: 47의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP35(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1(l)은 서열번호: 47의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP35와 서열번호: 48의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1(l)에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 205 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG34 전장 유전자서열의 343bp에서부터 547bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC35로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC42 단편인 205 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC35를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-13; GIG 35

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 52의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 51의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP3(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1m은 서열번호: 51의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP3과 서열번호: 52의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1m에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 212 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG35 전장 유전자서열의 1108bp에서부터 1319bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC38로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC38 단편인 212 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC38 을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega) 을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-14; GIG38

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 56의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 55의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP12(RNAimage primer set 2, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1n은 서열번호: 55의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP12와 서열번호: 56의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1n에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 172 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG38 전장 유전자서열의 328bp에서부터 499bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC122로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC122 단편인 172 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC122를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-15; GIG39

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 60의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 59의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP12(RNAimage primer set 2, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1(o)는 서열번호: 59의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP12와 서열번호: 60의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1(o)에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 327 bp cDNA 단편이 확 인되었다 (GIG39 전장 유전자서열의 2533bp에서부터 2859bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC126으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC126 단편인 327 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC126 을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-16; GIG40

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 64의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 63의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP7(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1p는 서열번호: 63의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP7과 서열번호: 64의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1p에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주 에서는 발현이 약하고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 275 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG40 전장 유전자서열의 3112bp에서부터 3386bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP79로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP79 단편인 275 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP79를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-17; GIG42

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 68의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 67의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP8(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1q는 서열번호: 67의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP8과 서열번호: 68의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1q에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 327 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG42 전장 유전자서열의 1473bp에서부터 1799bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP85로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP85 단편인 327 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP85를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-18; GIG43

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 72의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 71의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP10(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동 안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1r은 서열번호: 71의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP10과 서열번호: 72의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1r에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 273 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG43 전장 유전자서열의 727bp에서부터 999bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC102로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC102 단편인 273 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC102를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-19; GIG46

정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다. 자궁 근종 환자로부터 자궁적출술(hysterectomy) 중에 정상 자궁경부(exocervical) 조직 시료를 얻었으며, 수술 적 처치전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 자궁절제술(radical hysterectomy) 중에 원발성 자궁경부암 조직 및 전이성 장골 림프절 조직 시료를 얻었다. 인간 자궁경부암 세포주로는 CUMC-6(Kim, J.W. et al., Gynecol. Oncol., 62, 230-240 (1996))을 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 76의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 75의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP16(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1s는 서열번호: 75의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP16과 서열번호: 76의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1열은 정상 자궁경부 조직이며, 제2열은 자궁경부암 조직이고, 제3열은 전이성 장골 림프절 조직이며, 제4열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6이다. 도 1s에서 보듯이, 자궁경부암 조직, 전 이성 장골 림프절 조직 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6에서는 발현되지 않고 정상 자궁경부 조직에서만 차별적으로 발현된 255 bp cDNA 단편이 확인되었다. 이 cDNA 단편을 CA161로 명명하였다.

건조된 겔로부터 CA161 단편인 255 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 CA161을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-20; PIG33

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 80의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 79의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP2(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1t는 서열번호: 79의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP2와 서열번호: 80의 고 정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1t에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않거나 약하고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 256 bp cDNA 단편이 확인되었다 (PIG33 전장 유전자서열의 1623bp에서부터 1878bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP29으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP29 단편인 256 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP29를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-21; PIG35

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 84의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 83의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP9(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동 안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1u는 서열번호: 83의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP9와 서열번호: 84의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1u에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않거나 약하고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 312 bp cDNA 단편이 확인되었다 (PIG35 전장 유전자서열의 966bp에서부터 1277bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP95으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP95 단편인 312 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP95를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-22; PIG36

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 88의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 87의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP9(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1v는 서열번호: 87의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP9와 서열번호: 88의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1v에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않거나 약하고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 162 bp cDNA 단편이 확인되었다 (PIG36 전장 유전자서열의 238bp에서부터 399bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP96으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP96 단편인 162 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP96을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-23; MIG20

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 92의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 91의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP32(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1w는 서열번호: 91의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP32와 서열번호: 92의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1열은 정상 자궁경부 조직이며, 제2열은 자궁경부암 조직이고, 제3열은 전이성 장골 림프절 조직이며, 제4열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6이다. 도 1w에서 보듯이, 자궁경부암 조직, 전이성 장골 림프절 조직 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6에서는 발현되지 않고 정상 자궁경부 조직에서만 차별적으로 발현된 311 bp cDNA 단편이 확인되었다. 이 cDNA 단편을 CA324로 명명하였다.

건조된 겔로부터 CA324 단편인 311 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 CA324를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키 트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-24; PIG49

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 96의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 95의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP10(RNAimage primer set 2, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1x는 서열번호: 95의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP10과 서열번호: 96의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1x에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 272 bp cDNA 단편이 확인되었다 (PIG49 전장 유전자서열의 767bp에서부터 1038bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC101로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC101 단편인 272 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태 에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC101을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-25; PIG51

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 100의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 99의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP22(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1y는 서열번호: 99의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP22와 서열번호: 100의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1y에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 211 bp cDNA 단편이 확인되었다 (PIG51 전장 유전자서열의 519bp에서부터 729bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC22로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC22 단편인 211 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC22를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-26; MIG12

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 104의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 103의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP12(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1z는 서열번호: 103의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP12와 서열번호: 104의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1열은 정상 폐 조직이며, 제 2열은 폐암 조직이고, 제 3열은 폐암 전이조직이고 제 4열은 폐암 세포주 A549이다. 도 1z에서 보듯이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 에서는 발현이 약하고 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현된 161 bp cDNA 단편이 확인되었다 (MIG12 전장 유전자서열의 35bp에서부터 195bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 L927 로 명명하였다.

건조된 겔로부터 L927 단편인 161 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 L927을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-27; PIG37

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 108의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 107의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP10(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1a1는 서열번호: 107의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP10과 서열번호: 108의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1a1에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않거나 약하고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 263 bp cDNA 단편이 확인되었다 (PIG37 전장 유전자서열의 1217bp에서부터 1479bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP102로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP102 단편인 263 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP102를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-28; GIG44

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 112의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 111의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP12(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1b1는 서열번호: 111의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP12와 서열번호: 112의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1b1에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 221 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG44 전장 유전자서열의 179bp에서부터 399bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC123으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC123 단편인 221 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC123을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-29; GIG31

0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 116의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프 라이머 및, 서열번호: 115의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP4(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1c1는 서열번호: 115의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP4와 서열번호: 116의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1c1에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 223 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG31 전장 유전자서열의 445bp에서부터 667bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC47으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC47 단편인 223 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC47 을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

실시예 2: cDNA 라이브러리 스크리닝

실시예 1에서 얻은 cDNA 단편 FC33; FC42;FC59;GV2;H-AP8;HP71;HP115;HP3;FC48;FC82;FC86;FC35;FC38;FC122;FC126;HP79;HP85;FC102;CA161 ;HP29;HP95;HP96;CA324;FC101;FC22;L927;HP102;FC123 또는 FC47을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal. Biochem., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 32P-표지된 FC33; FC42;FC59;GV2;H-AP8;HP71;HP115;HP3 ;FC48;FC82 ;FC86 ;FC35;FC38 ;FC122;FC126;HP79;HP85;FC102;CA161;HP29;HP95;HP96;CA324;FC101;FC22;L927; P102 ;FC123 또는 FC47 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 GIG의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 GIG8의 결과는 서열번호: 1과 같았다. 이 염기서열은 134 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 2와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 15 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으 로써 GIG8 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2a는 GIG8 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG8 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2a에서 보듯이, 발현된 GIG8 단백질의 크기는 약 15 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG10의 결과는 서열번호: 5와 같았다. 이 염기서열은 665 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 6과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 73 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG10 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2b는 GIG10 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG10 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2b에서 보듯이, 발현된 GIG10 단백질의 크기는 약 73 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG13 유전자의 결과는 서열번호: 9와 같았다. 이 염기서열은 1201 개 아미 노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 10과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 132 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG13 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2c는 GIG13 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG13 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2c에서 보듯이, 발현된 GIG13 단백질의 크기는 약 132 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG15 유전자의 결과는 서열번호: 13과 같았다. 이 염기서열은 106 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 14와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 12 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG15 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2d는 GIG15 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2d에 서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG15 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2d에서 보듯이, 발현된 GIG15 단백질의 크기는 약 12 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG16 유전자의결과는 서열번호: 17과 같았다. 이 염기서열은 351 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 18과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 39 kDa이었다. 얻어진 GIG16 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG16/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG16 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2e는 GIG16 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2e에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG16 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2e에서 보듯이, 발현된 GIG16 단백질의 크기는 약 39 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG24 유전자의 결과는 서열번호: 21과 같았다. 이 염기서열은 423 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 22와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 47 kDa이었다. 얻어진 GIG24 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG24/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG24 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2f는 GIG24 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2f에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG24 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2f에서 보듯이, 발현된 GIG24 단백질의 크기는 약 47 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG26 유전자의 결과는 서열번호: 25와 같았다. 이 염기서열은 442 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 26과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 50 kDa이었다. 얻어진 GIG26 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG26/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG26 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2g는 GIG26 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2g에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG26 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2g에서 보듯이, 발현된 GIG26 단백질의 크기는 약 50 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG29 유전자의 결과는 서열번호: 29와 같았다. 이 염기서열은 349 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 30과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 38 kDa이었다. 얻어진 GIG29 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG29/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG29 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2h는 GIG29 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2h에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG29 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2h에서 보듯이, 발현된 GIG29 단백질의 크기는 약 38 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG30 유전자의 결과는 서열번호: 33과 같았다. 이 염기서열은 540 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 34와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 61 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG30 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2i는 GIG30 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2i에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG30 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2i에서 보듯이, 발현된 GIG30 단백질의 크기는 약 61 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG32 유전자의 결과는 서열번호: 37과 같았다. 이 염기서열은 178 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 38과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 20 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG32 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2j는 GIG32 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2j에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG32 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2j에서 보듯이, 발현된 GIG32 단백질의 크기는 약 20 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG33 유전자의 결과는 서열번호: 41과 같았다. 이 염기서열은 110 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 42와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 12 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG34 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2k는 GIG33 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2k에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG33 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2k에서 보듯이, 발현된 GIG33 단백질의 크기는 약 12 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG34 유전자의 결과는 서열번호: 45와 같았다. 이 염기서열은 177 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 46과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 20 kDa이었다.

도 2(l)은 GIG34 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2(l)에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG34 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2(l)에서 보듯이, 발현된 GIG34 단백질의 크기는 약 20 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG35 유전자의 결과는 서열번호: 49와 같았다. 이 염기서열은 437 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 50과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 50 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으 로써 GIG35 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2m은 GIG35 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2m에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG35 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2m에서 보듯이, 발현된 GIG35 단백질의 크기는 약 50 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG38 유전자의 결과는 서열번호: 53과 같았다. 이 염기서열은 153 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 54와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 17 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG38 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2n은 GIG38 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2n에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG38 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2n에서 보듯이, 발현된 GIG38 단백질의 크기는 약 17 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG39 유전자의 결과는 서열번호: 57과 같았다. 이 염기서열은 928 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 58과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 103 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG39 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2(o)는 GIG39 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2(o)에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG39 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2(o)에서 보듯이, 발현된 GIG39 단백질의 크기는 약 103 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG40 유전자의 결과는 서열번호: 61과 같았다. 이 염기서열은 1210 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 62와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 134 kDa이었다. 얻어진 GIG40 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG40/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오 갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG40 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2p는 GIG40 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2p에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG40 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2p에서 보듯이, 발현된 GIG40 단백질의 크기는 약 134 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG42 유전자의 결과는 서열번호: 65와 같았다. 이 염기서열은 609 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 66과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 69 kDa이었다. 얻어진 GIG42 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG42/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG42 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2q는 GIG42 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2q에 서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG42 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2q에서 보듯이, 발현된 GIG42 단백질의 크기는 약 69 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG43 유전자의 결과는 서열번호: 69와 같았다. 이 염기서열은 329 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 70과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 37 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG43 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2r은 GIG43 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2r에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG43 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2r에서 보듯이, 발현된 GIG43 단백질의 크기는 약 37 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG46 유전자의 결과는 서열번호: 73과 같았다. 이 염기서열은 377 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 74와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 42 kDa이었다.

얻어진 GIG46전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio- Topo/GIG46 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 2s는 pBAD/thio-Topo/GIG46 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 57 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 57 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/GIG46 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 42 kDa의 GIG46 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 2s는 GIG46 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 엘아라비노즈 에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 엘 아라비노즈에 의해 GIG46 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다.

PIG33 유전자의 결과는 서열번호: 77과 같았다. 이 염기서열은 664 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 78과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 75 kDa이었다. 얻어진 PIG33 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG33/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 PIG33 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2t는 PIG33 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2t에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG33 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2t에서 보듯이, 발현된 PIG33 단백질의 크기는 약 75 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

PIG35 유전자의 결과는 서열번호: 81과 같았다. 이 염기서열은 418 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 82와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 46 kDa이었다. 얻어진 PIG35 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG35/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으 로써 PIG35 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2u는 PIG35 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG35 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2u에서 보듯이, 발현된 PIG35 단백질의 크기는 약 46 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

PIG36 유전자의 결과는 서열번호: 85와 같았다. 이 염기서열은 108 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 86과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 13 kDa이었다. 얻어진 PIG36 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG36/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 PIG36 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2v는 PIG36 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG36 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2v에서 보듯이, 발현된 PIG36 단백질의 크기는 약 13 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

MIG20 유전자의 결과는 서열번호: 89와 같았다. 이 염기서열은 64 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 90과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 7 kDa이었다.

얻어진 MIG20전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/MIG20 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 2w는 pBAD/thio-Topo/MIG20 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 22 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 22 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG20 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 7 kDa의 MIG20 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 2w는 MIG20 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 엘아라비노즈 에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 엘 아라비노즈에 의해 MIG20 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다

PIG49 유전자의 결과는 서열번호: 93과 같았다. 이 염기서열은 345 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 94와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 38 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 PIG49 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2x는 PIG49 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG49 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2x에서 보듯이, 발현된 PIG49 단백질의 크기는 약 38 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

PIG51 유전자의 결과는 서열번호: 97과 같았다. 이 염기서열은 247 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 98과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 28 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 PIG51 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2y는 PIG51 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG51 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2y에서 보듯이, 발현된 PIG51 단백질의 크기는 약 28 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

MIG12 유전자의 결과는 서열번호: 101과 같았다. 이 염기서열은 44 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 102와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 5 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 MIG12 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2z는 MIG12 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 MIG12 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2z에서 보듯이, 발현된 MIG12 단백질의 크기는 약 5 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

PIG37의 결과는 서열번호: 105과 같았다. 이 염기서열은 472 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 106과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 53 kDa이었다. 얻어진 PIG37 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/PIG37/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 PIG37 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2a1는 PIG37 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG37 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2a1에서 보듯이, 발현된 PIG37 단백질의 크기는 약 53 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG 44 결과는 서열번호: 109와 같았다. 이 염기서열은 113 개 아미노산 잔 기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 110과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 12 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG44 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2b1는 GIG44 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG44 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2b1에서 보듯이, 발현된 GIG44 단백질의 크기는 약 12 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

GIG31의 결과는 서열번호: 113과 같았다. 이 염기서열은 211 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 114와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 24 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG31 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2c1는 GIG31 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG31 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2c1에서 보듯이, 발현된 GIG31 단백질의 크기는 약 24 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

실시예 3: GIG 유전자의 노던 블랏

3-1; GIG8 , GIG10 , GIG13 , GIG30 , GIG32,GIG33,GIG34,GIG35,GIG38,GIG39,GIG43,PIG49,PIG51,GIG44,GIG31

GIG 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 유방 조직 시료 3개, 원발성 유방암 조직 시료 3개 및 유방암 세포주 MCF-7의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG 전장 cDNA의 부분서열인 FC33; FC42 ;FC59; ;FC48;FC82 ;FC86;FC35;FC38;FC122;FC126;FC 102;FC101; FC22; FC123 또는 FC47 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 3a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG8 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3a 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3a 및 3a 하단에서 보듯이, GIG8 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 4a는 여러 정상 조직에서 GIG8 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4a 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4a에서 보듯이 뇌, 심장, 근육,대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초혈액조직들에서 약 1.3 kb의 우점(dominant) GIG8 mRNA 전사물이 과발현되었다. 동시에 약 2.5 kb의 GIG8 mRNA 전사물도 정상간 및 말초혈액에서 발현이 확인되었다. 도 5a는 여러 암세포주들에서 GIG8 유전자의 차별 발현 수 준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5a 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG8 유전자의 발현수준이 없었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG8 유전자는 정상 유방, 뇌, 심장, 근육,흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐, 대장 및 말초혈액들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3b는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG10 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3b 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3b에서 보듯이, GIG10 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블 랏을 실시하였다.

도 4b는 여러 정상 조직에서 GIG10 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4b 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4b에서 보듯이 뇌, 심장, 근육, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초혈액조직들에서 약 3.5 kb의 우점(dominant) GIG10 mRNA 전사물이 과발현되었다. 그러나 정상 대장에서는 발현이 확인되지 않았다. 동시에 약 2.2 kb의 GIG10 mRNA 전사물도 정상 심장 및 태반에서 발현이 확인되었다. 도 5b는 여러 암세포주들에서 GIG10 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5b 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5b에서 보듯이, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG8 유전자의 발현수준이 없었으나 전 골수성 백혈병 HL-60, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, 및 SW480 결장암 세포주에서는 GIG8 유전자의 발현이 확인되었다.

이러한 결과로부터 본 발명의 GIG10 유전자는 정상 유방, 뇌, 심장, 근육,흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐, 및 말초혈액들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3c는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG13 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3c 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3c에서 보듯이, GIG13 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

도 4c는 여러 정상 조직에서 GIG13 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4c 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4c에서 보듯이 정상 간조직에서만 약 1.3 kb의 우점(dominant) GIG13 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 5c는 여러 암세포주들에서 GIG13 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5c 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5c에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG13 유전자의 발현수준이 없었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG13 유전자는 정상 유방과 간조직들에서 종양 억제 자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3i는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG30 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3i하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3i에서 보듯이, GIG30 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

도 4i는 여러 정상 조직에서 GIG30 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4i하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4i에서 보듯이 심장, 근육, 및 간조직들에서 약 1.9 kb의 우점(dominant) GIG30 mRNA 전사물이 과발현되었다. 동시에 약 1.0 kb의 GIG30 mRNA 전사물도 정상간 및 말초혈액에서 발현이 확인되었다. 도 5i는 여러 암세포주들에 서 GIG30 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5i하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5i에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG30 유전자의 발현수준이 없었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG30 유전자는 정상 유방, 심장, 근육, 및 간들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3j는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG32 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3j하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3j에서 보듯이, GIG32 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블 랏을 실시하였다.

도 4j는 여러 정상 조직에서 GIG32 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4j하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4j에서 보듯이 근육,대장, 흉선, 비장, 콩팥, 태반, 폐 및 말초혈액조직들에서 약 4.0 kb의 우점(dominant) GIG32 mRNA 전사물이 과발현되었다. 동시에 약 1.0 kb의 GIG32 mRNA 전사물도 정상 근육 및 대장에서 발현이 확인되었다. 도 5j는 여러 암세포주들에서 GIG32 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5j 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5j에서 보듯이, HeLa 자궁경부암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG32 유전자의 발현수준이 확인되었으나 전 골수성 백혈병 HL-60, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, 및 SW480 결장암 세포주에서는 GIG32 유전자의 발현수준이 없었다.

이러한 결과로부터 본 발명의 GIG32 유전자는 정상 유방, 근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 태반, 및 말초혈액들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3(l)은 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG34 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3(l) 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3(l)에서 보듯이, GIG34 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었 고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 4(l)은 여러 정상 조직에서 GIG34 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4(l) 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4(l)에서 보듯이 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초혈액조직들에서 약 0.6 kb의 우점(dominant) GIG34 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 5(l)은 여러 암세포주들에서 GIG34 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5(l) 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5(l)에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포주, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG34 유전자의 발현수준이 약하였다.

이러한 결과로부터 본 발명의 GIG34 유전자는 정상 유방, 뇌, 심장, 근육,대 장,흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐, 및 말초혈액들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3m은 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG35 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3m하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3m에서 보듯이, GIG35 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 낮았고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

도 4m은 여러 정상 조직에서 GIG35 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4m 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4m에서 보듯이 뇌, 심장, 근육,대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초혈액조직들에서 약 1.3 kb의 우점(dominant) GIG35 mRNA 전 사물이 과발현되었다. 도 5m은 여러 암세포주들에서 GIG35 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5m 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5m에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG35 유전자의 발현수준이 낮았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG35 유전자는 정상 유방, 뇌, 심장, 근육,흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐, 대장 및 말초혈액들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3n은 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG38 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3n 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3n에서 보듯이, GIG38 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

도 4n은 여러 정상 조직에서 GIG38 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4n 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4n에서 보듯이 심장, 근육,콩팥, 간, 및 태반조직들에서 약 0.7 kb의 우점(dominant) GIG38 mRNA 전사물이 과발현되었다. 동시에 약 1.5 kb 및 약 2.0 kb의 GIG38 mRNA 전사물도 정상심장 및 근육에서 발현이 확인되었다. 도 5n은 여러 암세포주들에서 GIG38 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5n 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5n에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG38 유전자의 발현수준이 매우 약하거나 거의 없었다. 정상조직들에서 확인된 약 1.5 kb 및 약 2.0 kb의 GIG38 mRNA 전사물은 암세포주들에서는 모두 발현이 확인되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG38 유전자는 정상 유방, 심장, 근육, 콩팥, 간, 및 태반들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3(o)는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG39 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3(o) 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3(o)에서 보듯이, GIG39 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

도 4(o)는 여러 정상 조직에서 GIG39 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4(o) 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4(o)에서 보듯이 간조직에서만 약 2.4 kb의 우점(dominant) GIG39 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 5(o)는 여러 암세포주들에서 GIG39 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5(o) 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5(o)에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG39 유전자의 발현수준이 없었다. 이러 한 결과로부터 본 발명의 GIG39 유전자는 정상 유방과 간에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3r은 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG43 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3r 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3r에서 보듯이, GIG43 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

도 4r은 여러 정상 조직에서 GIG43 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4r 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4r에서 보듯이 심장, 콩팥, 간, 태반, 및 폐 조직들에서 약 3.5 kb의 우점(dominant) GIG43 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 5r은 여러 암세포 주들에서 GIG43 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5r 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5r에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG8 유전자의 발현수준이 없었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG8 유전자는 정상 유방, 심장, 콩팥, 간, 태반, 및 폐들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3x는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 PIG49 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3x 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3x에서 보듯이, PIG49 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

도 4x는 여러 정상 조직에서 PIG49 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4x 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4x에서 보듯이 심장, 근육, 콩팥, 간, 및, 태반조직들에서 약 2.4 kb의 우점(dominant) PIG49 mRNA 전사물이 과발현되었다. 동시에 약 1.5 kb의 PIG49 mRNA 전사물도 정상 근육에서 발현이 확인되었다. 도 5x는 여러 암세포주들에서 PIG49 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5x 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5x에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포주. A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 PIG49 유전자의 발현수준이 없거나 매우 약하였다.

이러한 결과로부터 본 발명의 PIG49 유전자는 정상 유방, 심장, 근육,콩팥, 간, 및 태반들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3y는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 PIG51 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3y 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3y에서 보듯이, PIG51 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

도 4y는 여러 정상 조직에서 PIG51 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4y 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4y에서 보듯이 정상 심장, 근육, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 태반 및 백혈구조직에서 약 1.0 kb의 우점(dominant) PIG51 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 5y는 여러 암세포주들에서 PIG51 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5y 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5y에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 PIG51 유전자의 발현수준이 없었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 PIG51 유전자는 정상 유방과 심장, 근육, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 태반 및 백혈구조직들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3b1는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG44 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3b1 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3b1에서 보듯이, GIG44 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

도 4b1는 여러 정상 조직에서 GIG44 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4b1 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4b1에서 보듯이 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 백혈구 조직들에서 약 1.0 kb의 우점(dominant) GIG44 mRNA 전사물이 과발현되었다. 또한 정상조직들에서는 약 0.5 kb의 GIG44 mRNA 전사물도 과발현되었다.

도 5b1는 여러 암세포주들에서 GIG44 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5b1 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5b1에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG44 유전자의 발현수준이 매우 약하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG44 유전자는 정상 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 백혈구 조직들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3c1는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG31 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3c1 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3c1에서 보듯이, GIG31 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮거나 없었고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

도 4c1는 여러 정상 조직에서 GIG31 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4c1 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4c1에서 보듯이 유방, 심장, 대장, 비장, 소장, 태반, 폐 및 백혈구조직들에서 약 1.4 kb의 우점(dominant) GIG31 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 5c1는 여러 암세포주들에서 GIG31 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5c1 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5c1에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG31 유전자의 발현수준이 없었으며 HeLa 자궁경부암 세포와 A549 폐암 세포주에서는 GIG31 유전자의 발현수준이 매우 약하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG31 유전자는 정상 유방, 심장, 대장, 비장, 소장, 태반, 폐 및 백혈구조직들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-2; GIG 15

GIG15 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다. 실시예 1에서와 같이, 정상 골수 조직, 백혈병 골수조직 및 K-562 세포로 부터 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG15 전장 cDNA의 부분서열인 GV2 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 3d는 정상 골수 조직, 백혈병 골수조직 및 K-562 세포로부터 GIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3d 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3d에서 보듯이, GIG15 유전자의 발현 수준은 정상 골수 조직 시료 모두에서 높게 나타났으며, 백혈병 골수 조직 시료에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 낮았고, 백혈병 세포주 시료 1개에서도 발현이 낮았다.

도 4d는 여러 정상 조직에서 GIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4d 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4d에서 보듯이 뇌, 심장, 근육,대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초혈액조직들에서 약 0.5 kb의 우점(dominant) GIG15 mRNA 전사물이 과발현되었다. 동시에 약 1.0 kb의 GIG15 mRNA 전사물도 정상간 및 신장에서 발현이 확인되었다. 도 5d는 여러 암세포주들에서 GIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5d 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5d에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG15 유전자의 발현수준이 낮았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG15 유전자는 정상 골수, 뇌, 심장, 근육,흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐, 대장 및 말초혈액들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-3; GIG 16, GIG 24, GIG 26, GIG 29, GIG 40, GIG42 , PIG33 , PIG35 , PIG36 , PIG37

GIG 또는 PIG 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 간 조직 시료 3개, 원발성 간암 조직 시료 3개 및 간암 세포주 HepG2의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG 또는 PIG 전장 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 3e는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG16 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3e 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3e에서 보듯이, GIG16 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

도 4e는 여러 정상 조직에서 GIG16 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노 던 블랏 결과이며 도 4e 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4e에서 보듯이 간, 및 신장조직에서 약 2.0 kb의 우점(dominant) GIG16 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 5e는 여러 암세포주들에서 GIG16 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5e 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5e에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG16 유전자가 전혀 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG16 유전자는 정상 간, 신장조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3f는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG24 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3f 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3f에서 보듯이, GIG24 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블 랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 4f는 여러 정상 조직에서 GIG24 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4f 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4f에서 보듯이 간, 심장 및 근육 조직에서 약 2.4 kb의 우점(dominant) GIG24 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 5f는 여러 암세포주들에서 GIG24 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5f 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5f에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG24 유전자가 전혀 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG24 유전자는 정상 간, 심장 및 근육조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능 을 가짐을 알 수 있다.

도 3g는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG26 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3g 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3g에서 보듯이, GIG26 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

도 4g는 여러 정상 조직에서 GIG26 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4g 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4g에서 보듯이 간조직에서 약 2.0 kb의 우점(dominant) GIG26 mRNA 전사물이 과발현되었으며 동시에 약 2.5 kb와 1.5 kb의 GIG26 mRNA 전사물도 신장, 뇌 및 심장조직에서 발현되었다. 도 5g는 여러 암세포주들에서 GIG26 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5g 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5g에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG26 유전자가 전혀 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG26 유전자는 정상 간, 신장, 뇌 및 심장조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3h는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG29 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3h 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3h에서 보듯이, GIG29 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

도 4h는 여러 정상 조직에서 GIG29 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4h 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4h에서 보듯이 간 조직에서 약 1.4 kb의 우점(dominant) GIG29 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 5h는 여러 암세포주들에서 GIG29 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5h 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5h에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG29 유전자가 전혀 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG29 유전자는 정상 간조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3p는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG40 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3p 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3p에서 보듯이, GIG40 유전자 의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

도 4p는 여러 정상 조직에서 GIG40 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4p 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4p에서 보듯이 간, 심장 및 근육 조직에서 약 1.5 kb의 우점(dominant) GIG40 mRNA 전사물이 과발현되었다. 또한 약 5.0 kb의 GIG40 mRNA 전사물도 발현되었다

도 5p는 여러 암세포주들에서 GIG40 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5p 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5p에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG40 유전자가 매우 약하게 발현되었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG40 유전자는 정상 간, 심장 및 근육조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3q는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG42 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3q 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3q에서 보듯이, GIG42 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

도 4q는 여러 정상 조직에서 GIG42 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4q 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4q에서 보듯이 간 조직에서 약 2.5 kb의 우점(dominant) GIG42 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 5q는 여러 암세포주들에서 GIG42 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5q 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5q에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG42 유전자가 전혀 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG42 유전자는 정상 간조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3t는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 PIG33 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3t 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3t에서 보듯이, PIG33 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

도 4t는 여러 정상 조직에서 PIG33 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4t 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4t에서 보듯이 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 및 폐 조직에서 약 3.0 kb의 우점(dominant) PIG33 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 5t는 여러 암세포주들에서 PIG33 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5t 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5t에서 보듯이, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 PIG33 유전자가 전혀 발현이 되지 않았으며 전 골수성 백혈병 HL-60, 및 버킷 림프종 라지에서는 발현이 약하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 PIG33 유전자는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소 장, 태반, 및 폐 조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3u는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 PIG35 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3u 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3u에서 보듯이, PIG35 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

도 4u는 여러 정상 조직에서 PIG35 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노 던 블랏 결과이며 도 4u 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4u에서 보듯이 정상 뇌, 심장, 골격근, 간, 소장, 태반, 및 폐 조직에서 약 1.7 kb의 우점(dominant) PIG35 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 5u는 여러 암세포주들에서 PIG35 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5u 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5u에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 PIG35 유전자가 전혀 발현이 되지 않았으나 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562에서는 발현이 약하게 나타났다. 이러한 결과로부터 본 발명의 PIG35 유전자는 정상 정상 뇌, 심장, 골격근, 간, 소장, 태반, 및 폐 조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3v는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 PIG36 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3v 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3v에서 보듯이, PIG36 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

도 4v는 여러 정상 조직에서 PIG36 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4v 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4v에서 보듯이 간 조직에서 약 1.0 kb의 우점(dominant) PIG36 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 5v는 여러 암세포주들에서 PIG36 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5v 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5v에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 PIG36 유전자가 전혀 발현이 되지 않거나 약하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 PIG36 유전자는 정상 간, 심장, 근육, 콩팥, 및 태반 조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장 암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3a1는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 PIG37 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3a1 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3a1에서 보듯이, PIG37 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

도 4a1는 여러 정상 조직에서 PIG37 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4a1하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4a1에서 보듯이 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 및 폐 조직에서 약 7.0 kb의 우점(dominant) PIG33 mRNA 전 사물이 과발현되었다. 동시에 약 2.0 및 1.0 kb의 PIG37 mRNA 전사물이 정상조직들에서 과발현되었다.

도 5a1는 여러 암세포주들에서 PIG37 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5a1 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5a1에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, SW480 결장암 세포, 및 A549 폐암 세포 및 에서는 PIG37 유전자가 거의 발현이 되지 않았으며 HeLa 자궁경부암 세포, 버킷 림프종 라지 및 G361 흑색종 세포주에서는 발현이 약하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 PIG37 유전자는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 및 폐 조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-4; GIG46 , MIG20

GIG 또는 MIG 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직 시료 3개, 원발성 자궁경부암 조직 시료 3개 및 자궁경부암 세포주 시료 2개의 총 RNA 20 ㎍을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 실시예 1에서 얻은 GIG46, MIG 20 전장 cDNA를 사용한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42 ℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 3s는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 GIG46 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3s 하단은 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다. 도 3s에서, 제1열 내지 제3열은 정상 자궁경부 조직 시료이며, 제4열 내지 제6열은 자궁경부암 조직 시료이고, 제7열은 자궁경부암 세포주 HeLa 시료이며, 제8열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6 시료이다. 도 3s에서 보듯이, GIG46 유전자의 발현 수준은 정상 자궁경부 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 자궁경부암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 자궁경부암 세포주 시료 2개에서는 나타나지 않았다.

도 4s는 여러 정상 조직에서 GIG46 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4s 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4s에서 보듯이 자궁, 뇌, 심장, 골격근, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초혈액 백혈구들에서 약 1.5 kb의 우점(dominant) GIG46 mRNA 전사물이 과발현되었으며, 이외에 2.0 kb의 전사물도 나타났다.

도 5s는 여러 암세포주들에서 GIG46 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5s 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노 던 블랏 결과이다. 도 5s에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG46 유전자의 발현은 약하게 나타났다. 그러나 정상에서 발현이 확인되었던 2.0 kb의 전사물은 암세포주들에서는 발현이 되지 않았다.

이러한 결과로부터 본 발명의 GIG46 유전자는 정상 자궁, 뇌, 심장, 골격근, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초혈액 백혈구들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

도 3w는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 MIG20 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3w 하단은 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다. 도 3w에서, 제1열 내지 제3열은 정상 자궁경부 조직 시료이며, 제4열 내지 제6열은 자궁경부암 조직 시료이고, 제7열은 자궁경부암 세포주 HeLa 시료이며, 제8열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6 시료이다. 도 3w에서 보듯이, MIG20 유전자의 발현 수준은 정상 자궁경부 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 자궁경부암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 자궁경부암 세포주 시료 2개에서는 나타나지 않았다.

도 4w는 여러 정상 조직에서 MIG20 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4w 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4w에서 보듯이 심장, 골격근, 및 간조직들에서 약 4.4 kb의 우점(dominant) MIG20 mRNA 전사물이 과발현되었으며, 이외에 2.4 및 1.5 kb의 전사물도 나타났다.

도 5w는 여러 암세포주들에서 MIG20 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5w 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5w에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 MIG20 유전자의 발현은 나타나지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 MIG2 유전자는 정상 자궁경부, 심장, 골격근, 간조직들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-5; MIG12

MIG12 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 폐 조직 시료 3개, 원발성 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 MIG12 전장 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터 로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 3z는 정상 폐조직, 원발성 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주에서 MIG12 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3z 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3z에서 보듯이, MIG9 유전자의 발현 수준은 정상 폐 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 시료 2개에서는 발현이 약하였다.

도 4z는 여러 정상 조직에서 MIG12 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4z 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4z에서 보듯이 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 약 0.5 kb의 우 점(dominant) MIG12 mRNA 전사물이 높게 과발현되었다. 이외에도 심장, 근육, 간 및 콩팥에서 약 1.0과 0.8 kb 의 전사물로도 발현된다.

도 5z는 여러 암세포주들에서 MIG12 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5z 하단은 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5z에서 보듯이, 정상조직들에서 나타나는 약 0.5 kb의 우점(dominant) MIG12 mRNA 전사물은 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들에서는 발현이 약하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 MIG12 유전자는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

실시예 4: 발현 벡터의 제작 및 형질 감염

4-1; GIG8 , GIG10 , GIG13 , GIG30,GIG32,GIG33,GIG34,GIG35,GIG38,GIG39,GIG43,PIG49,PIG51,GIG44,GIG31

GIG 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG8; pcDNA3.1/GIG10; pcDNA3.1/GIG13; pcDNA3.1/GIG30; pcDNA3.1/GIG32; pcDNA3.1/GIG33; pcDNA3.1/GIG34;pcDNA3.1/GIG35;pcDNA3.1/GIG38;pcDNA3.1/GIG39;pcDNA3.1/GIG43;pc DNA3.1/PIG49 ;pcDNA3.1/PIG51; pcDNA3.1/GIG44 또는 pcDNA3.1/GIG31을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 MCF-7 유방암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 MCF-7 세포를 사용하였다.

4-2; GIG 15

GIG 15유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG15 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG15를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 K562 백혈병 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 K562 세포를 사용하였다.

4-3; GIG 16, GIG 24, GIG 26, GIG 29, GIG40 , GIG42 , PIG33 , PIG35 , PIG36 , PIG37

GIG 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG16, GIG 24, GIG 26, GIG 29,GIG40,GIG42,PIG33, PIG35,PIG36,또는 PIG37 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG16 ; pcDNA3.1/GIG 24;pcDNA3.1/GIG26 ;pcDNA3.1/GIG29; ;pcDNA3.1/GIG40 ;pcDNA3.1/GIG42;pcDNA3.1/PIG33 ;pcDNA3.1/PIG35 ;pcDNA3.1/PIG36; 또는 pcDNA3.1/PIG37을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HepG2 간암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HepG2 세포를 사용하였다.

4-4; GIG46 , MIG20

GIG 또는 MIG 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG46 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG46;또는 pcDNA3.1/MIG20을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HeLa 자궁경부암 세포주(ATCC CCL-2)에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG46 또는 MIG20 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하였다.

4-5; MIG12

MIG12 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 MIG12 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/MIG12를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 A549 폐암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배 양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 MIG12 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포를 사용하였다.

실시예 5: GIG 유전자로 형질감염된 유방암 세포의 성장 곡선

5-1; GIG8 , GIG 10, GIG 13, GIG 30, GIG 32, GIG 33,GIG34,GIG35,GIG38,GIG39,GIG43,PIG49,PIG51,GIG44,GIG31

GIG 유전자가 유방암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG8; pcDNA3.1/GIG10; pcDNA3.1/GIG13; pcDNA3.1/GIG30; pcDNA3.1/GIG32; pcDNA3.1/GIG33;pcDNA3.1/GIG34;pcDNA3.1/GIG35;pcDNA3.1/GIG38;pcDNA3.1/GIG39;pcDNA3.1/GIG43;pcDNA3.1/PIG49 ;pcDNA3.1/PIG51;pcDNA3.1/GIG44 또는 pcDNA3.1/GIG31로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 6a는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG8로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6a에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG8로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG8로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 30%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG8 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6b는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG10으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6b에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG10으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG10으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 40%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG10 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6c는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG13으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6c에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG13으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG13으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 30%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG13 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6i는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG30으로 형 질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6i에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG30으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG30으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 30%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG30 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6j는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG32로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6j에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG32로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG32로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG32 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6k는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG33으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6k에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG33으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG33으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 70%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG33 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6(l)은 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG34으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6(l)에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG34으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG34으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 80%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG34 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6m은 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG35로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6m에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG35로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG35로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 70%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG35 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6n은 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG38로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6n에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG38로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG38로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 60%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG38 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6(o)는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG39로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6(o)에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG39로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG39로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 40%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG39 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6r은 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG43으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6r에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG43으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG43으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 60%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG43 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6x는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG49로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6x에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/PIG49로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/PIG49로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 60%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, PIG49 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6y는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG51으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6y에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/PIG51으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/PIG51으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 40%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, PIG51 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6b1는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG44으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6b1에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG44으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG44으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 60%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG44 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6c1는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG31으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 6c1에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG31으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG31으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 약 70%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG31 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-2; GIG 15,

GIG 유전자가 백혈병 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 K562 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG15로 형질감염된 K562 백혈병 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 K562 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 6d는 야생형 K562 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG15로 형질감염된 K562 백혈병세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 K562 세포의 성장 곡선이다. 도 6d에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG15로 형질감염된 K562 세포의 사멸률 은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 K562 세포 및 야생형 K562 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 K562 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG15로 형질감염된 K562 세포의 약 80%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG15 유전자는 백혈병 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-3; GIG 16, GIG 24, GIG 26, GIG29 , GIG40 , GIG42 , PIG33 , PIG35 , PIG36 , PIG37

GIG 또는 PIG 유전자가 간암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG16; pcDNA3.1/GIG24 ; pcDNA3.1/GIG26; pcDNA3.1/GIG29; pcDNA3.1/GIG40 ; pcDNA3.1/GIG42; pcDNA3.1/PIG33 ;pcDNA3.1/PIG35 ;pcDNA3.1/PIG36 또는 pcDNA3.1/PIG37로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 6e는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG16으로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 6e에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG16으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포 의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG16으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 70%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG16 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6f는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG24로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 6f에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG24로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG24로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 60%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG24 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6g는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG26으로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 6g에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG26으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG26으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG26 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6h는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG29로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 6h에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG29로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG29로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 70%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG29 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6p는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG40으로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 6p에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG40으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG40으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 80%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG40 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6q는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG42로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 6q에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG42로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG42로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 60%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG42 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6t는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG33으로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 6t에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/PIG33으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/PIG33으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 60%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, PIG33 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6u는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG35로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 6u에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/PIG35로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/PIG35로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 70%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, PIG35 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6v는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG36으로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 6v에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/PIG36으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/PIG36으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 60%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, PIG36 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6a1는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG37으로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 6a1에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/PIG37으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/PIG37으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 70%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, PIG37 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-4; GIG46 , MIG20

GIG 유전자가 자궁경부암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 GIG46 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1(Invitrogen)으로 형질감염된 HeLa 세포를 각각 RPMI 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclustion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 6s는 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 GIG46 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다. 도 6s에서 보듯이, GIG46 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 사멸률은 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포 및 정상 HeLa 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 정상 HeLa 세포와 비교할 때 GIG46으로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 80%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG46 유전자는 자궁경부암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 6w는 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 MIG20 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다. 도 6w에서 보듯이, MIG20 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 사멸률은 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포 및 정상 HeLa 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 정상 HeLa 세포와 비교할 때 MIG20으로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 약 60%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, MIG20 유전자는 자궁경부암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-5; MIG12

MIG12 유전자가 폐암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/MIG12로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 6z은 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/MIG12로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포의 성장 곡선이다. 도 6z에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/MIG12로 형질감염된 A549 폐암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 A549 세포 및 야생형 A549 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 A549 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/MIG12로 형질감염된 A549 폐암 세포의 약 70%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, MIG12 유전자는 폐암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

본 발명의 GIG, PIG 또는 MIG 유전자는 인간 암의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호: 90의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질.
제 1 항에 있어서,

상기 암은 정상 유방, 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐, 및 말초혈액 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 암인 단백질.
제1항의 원암 단백질을 코딩하는 서열번호: 89로 표시되는 인간 암 억제 유전자.
제 3 항에 있어서,

상기 암은 정상 유방, 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐, 및 말초혈액 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 암인 유전자.