KR100689286B1

KR100689286B1 - 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 및 이를포함하는 발현 벡터

Info

Publication number: KR100689286B1
Application number: KR1020060070018A
Authority: KR
Inventors: 김진우; 김현기
Original assignee: 김현기
Priority date: 2006-07-25
Filing date: 2006-07-25
Publication date: 2007-03-08
Also published as: KR20060090787A

Abstract

본 발명은 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 미생물에 관한 것으로, 본 발명의 유전자는 인간 암의 진단 및 예방 등에 유용하게 사용될 수 있다.

암 억제 단백질

Description

인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 및 이를 포함하는 발현 벡터{HUMAN CANCER SUPPRESSOR GENE, PROTEIN ENCODED THEREIN, EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME}

도 1a는 서열번호: 3의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP38과 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진; 1b는 서열번호: 7의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP32와 서열번호: 8의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진; 1c는 서열번호: 11의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP35와 서열번호: 12의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진; 1d는 서열번호: 15의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP34와 서열번호: 16의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진; 1e는 서열번호: 19의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP36과 서열번호: 20의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진; 1f는 서열번호: 23의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP35와 서열번호: 24의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진; 1g는 서열번호: 27의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP41과 서열번호: 28의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진; 1h는서열번호: 31의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP6과 서열번호: 32의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진; 1i는 서열번호: 35의 5’13mer 임의 프 라이머 H-AP6과 서열번호: 36의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진;도 1j는 서열번호: 39의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP36과 서열번호: 40의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진;도 1k는 서열번호: 43의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP21과 서열번호: 44의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진;도 1l은 서열번호: 47의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP24와 서열번호: 48의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진; 도 1m은 서열번호: 51의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP12와 서열번호: 52의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진; 도 1n은 서열번호: 55의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP13과 서열번호: 56의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진 및 ;도 1 o는 서열번호: 59의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP31과 서열번호: 60의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진이다.

도 2a는 GIG1 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진; 2b는 GIG3 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진;2c는 GIG4 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진; 2d는 GIG 5 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진;2e는 GIG 11 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진;2f는 MIG2 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진; 2g는 MIG4 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진; 2h는 PIG13 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진;2i는 PIG15 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진; 2j는 PIG8 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진; 도 2k는 MRG 1 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진; 도2 l은 PIG 22 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진;도2m은 MIG 9 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진;도2n은 MIG 11 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진; 및 도2 o는 MIG 15 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다.

도 3a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁암 조직 및 자궁암 세포주에서 GIG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도4a는 정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주에서 GIG3유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 4b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 5a는 정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주에서 GIG4유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 6a는 정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주에서 GIG5유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 6b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 7a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG11 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 7b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 8a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁암 조직 및 자궁암 세포주에서 MIG2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 8b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 9a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁암 조직 및 자궁암 세포주에서 MIG4 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 9b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 10a는 정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주에서 PIG13유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 10b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 11a는 정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주에서 PIG15유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 11b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 12a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁암 조직 및 자궁암 세포주에서 PIG8 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 12b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 13a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁암 조직 및 자궁암 세포주에서 MRG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 13b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 14a는 정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주에서 PIG22유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 14b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 15a는 정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주에서 MIG9유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 15b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 16a는 정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주에서 MIG11유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 16b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 17a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁암 조직 및 자궁암 세포주에서 MIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 17b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 18a는 여러 정상 조직에서 GIG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 18b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 19a는 여러 정상 조직에서 GIG3유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 19b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 20a는 여러 정상 조직에서 GIG4유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 20b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 21a는 여러 정상 조직에서 GIG5유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 21b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 22a는 여러 정상 조직에서 GIG11 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 22b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 23a는 여러 정상 조직에서 MIG2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 23b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 24a는 여러 정상 조직에서 MIG4 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 24b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 25a는 여러 정상 조직에서 PIG13유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 25b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 26a는 여러 정상 조직에서 PIG15유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 26b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 27a는 여러 정상 조직에서 PIG8 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 27b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 28a는 여러 정상 조직에서 MRG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 28b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 29a는 여러 정상 조직에서 PIG22유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 29b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 30a는 여러 정상 조직에서 MIG9유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 30b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 31a는 여러 정상 조직에서 MIG11유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 31b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 32a는 여러 정상 조직에서 MIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 32b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 33a는 여러 암세포주들에서 GIG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 33b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 34a는 여러 암세포주들에서 GIG3 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 34b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 35a는 여러 암세포주들에서 GIG4 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 35b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 36a는 여러 암세포주들에서 GIG5 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 36b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 37a는 여러 암세포주들에서 GIG11 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 37b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 38a는 여러 암세포주들에서 MIG2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 38b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 39a는 여러 암세포주들에서 MIG4 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 39b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 40a는 여러 암세포주들에서 PIG13 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 40b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 41a는 여러 암세포주들에서 PIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 41b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 42a는 여러 암세포주들에서 PIG8 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 42b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 43a는 여러 암세포주들에서 MRG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 43b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 44a는 여러 암세포주들에서 PIG22 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 44b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 45a는 여러 암세포주들에서 MIG9 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 45b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 46a는 여러 암세포주들에서 MIG11 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 46b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 47a는 여러 암세포주들에서 MIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 47b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 48a는 야생형 HeLa 세포, GIG1 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선; 도 48b는 야생형 A549 폐암세포주, GIG 3 유전자로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포의 성장 곡선;도 48c는 야생형 A549 폐암세포주, GIG 4 유전자로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포의 성장 곡선; 48d는 A549 폐암세포주, GIG 5 유전자로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포의 성장 곡선; 48e는 야생형 MCF-7 세포, GIG 11 유전자로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 MCF-7 세포의 성장 곡선; 48f는 야생형 HeLa 세포, MIG 2 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선; 48g는 야생형 HeLa 세포, MIG 4 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선;48h는 야생형 A549 폐암세포주, PIG 13 유전자로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포의 성장 곡선; 48i는 야생형 A549 폐암세포주, PIG 15 유전자로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포의 성장 곡선;도 48j는 야생형 HeLa 세포, PIG 8 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선; 도 48k는 야생형 HeLa 세포, MRG 1 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선; 도 48l은 야생형 A549 폐암세포주, PIG 22 유전자로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포의 성장 곡선; 도 48m은 야생형 A549 폐암세포주, MIG 9 유전자로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포의 성장 곡선; 도 48n은 야생형 A549 폐암세포주, MIG 11 유전자로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포의 성장 곡선; 도 48 o는 야생형 HeLa 세포, MIG 15 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다.

본 발명은 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 및 이를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

암 억제 유전자(tumor suppressor gene) 산물은 정상 세포로부터 암 세포로의 형질전환을 억제하며, 이 기능이 상실되면 세포는 악성 형질전환에 이르게 된다(Klein, G., FASEB J., 7, 821-825 (1993)). 암세포가 암을 형성하기 위해서는 암 억제 유전자의 정상 카피수 기능이 상실되어야 한다. p53 암 억제 유전자의 코딩 서열내 변형이 인간 암에서 가장 일반적인 유전적 변화로 밝혀졌다(Bishop, J.M., Cell, 64, 235-248 (1991); 및 Weinberg, R.A., Science, 254, 1138-1146 (1991)). 그러나 자궁경부암에서 보고된 p53 변이는 2 % 내지 11 %의 범위에 불과하여(Crook, T. et al., Lancet, 339, 1070-1073 (1992); 및 Busby-Earle, R.M.C. et al., Br . j. Cancer, 69, 732-737 (1994)), 자궁경부암 조직의 일부만이 이러한 p53 변이를 보이는 것으로 생각된다.

한편 폐암에서 비소세포성 폐암 (non-small-cell lung cancer)의 경우 약 50%에서 소세포성 폐암 (small-cell lung cancer)의 경우 70%까지 p53 종양억제 유전자의 변이가 보고되고 있다(Takahashi, T. et al., Science, 246, 491-494 1989; Bodner, S.M. et al., Oncogene, 7, 743-749 (1992); Mao, L. Lung Cancer, 34, S27-S34 (2001)). 폐암의 발생과 병의 진행에는 흡연이 가장 중요하게 작용하며 p53외에도 여러가지 다른 종양억제 유전자들과 암유전자들이 동시에 관계하고 있다 (Osada, H. & Takahashi, T. Oncogene, 21, 7421-7434 (2002)).

또 유방암에서 보고된 p53 변이는 30%의 범위에 불과하여(Keen, J.C. & Davidson, N. E., Cancer, 97, 825-833 (2003)) 및 Borresen-Dale, A-L., Human Mutation, 21, 292-300 (2003)) 유방암 조직의 일부만이 이러한 p53 변이를 보이는 것으로 생각된다.

이에 본 발명자들은, 정상 폐, 자궁 경부, 및 정상 유방 조직과 그 각각의 폐암, 자궁경부암, 유방암 사이에 차별적으로 발현되는 유전자를 보다 효율적으로 나타내는 mRNA 감별 전개법(mRNA differential display(DD) method) (Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966-6968 (1993))을 사용하여, 정상 폐, 자궁 경부, 및 정상 유방 조직에서 새로운 암 억제 유전자를 분리하고자 예의 연구하였다.

본 발명의 목적은 신규한 인간 암 억제 유전자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자에 의해 코딩되는 암 억제 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 데 있다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 1; GIG1로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또 본 발명에서는 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 3; GIG3으로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또 본 발명에서는 서열번호: 9의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 4; GIG4로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 13의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 5; GIG 5로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 17의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 11; GIG 11로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 21의 염기서열을 갖는 인간 암 억제유전자 (human migration-inducing gene 2; MIG2로 명명)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 25의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(migration-inducing gene 4; MIG4로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 26의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 29의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(proliferation-inducing gene 13; PIG13으로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 30의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 33의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(proliferation-inducing gene 15; PIG15로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 34의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 37의 염기서열을 갖는 인간 세포 성장유도 유전자(proliferation-inducing 8; PIG8로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 38의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 41의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(migration-related gene 1; MRG1으로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 45의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(proliferation-inducing 22; PIG22로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 49의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(migration-inducing 9; MIG 9로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 50의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 53의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(migration-inducing 11; MIG11로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호: 57의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(migration-inducing 15; MIG15로 명명함)를 제공한다. 본 발명에서는 서열번호: 58의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

1. GIG 1

본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 1(GIG1)으로서, 서열번호: 1의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY268890 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_000391 호인 Homo sapiens ceroid-lipofuscinosis, neuronal 2, late infantile (Jansky-Bielschowsky disease) (CLN2)과는 서열이 일부 일치하는 유전자이다. 이 유전자에 변이가 생기는 경우 late-infantile neuronal ceroid lipofuscinosis 라는 질환이 생긴다는 보고가 있다 (Sleat, D. E., et al ., Science, 277, 1802-1805 (1997) ; Liu, C. G., et al., Genomics, 50, 206-212 (1998)). 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 Homo sapiens ceroid-lipofuscinosis, neuronal 2, late infantile (Jansky-Bielschowsky disease) (CLN2) 유전자와 서열이 일부 일치하는 GIG1 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 아주 약하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG1 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 1의 염기서열에는 염기번호 800 내지 1762(염기번호 1760-1762은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으 로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 320 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 2의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 34 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 3의 임의 프라이머 H-AP38 (5'AAGCTTCCAGTGC-3') 및 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTG-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 382 bp cDNA 단 편을 얻고 (3109bp-3490bp에 해당), 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HeLa 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 자궁, 뇌, 골격근, 비장, 콩팥, 간, 태반, 폐 및 말초혈액 백혈구들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 4.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 3.0kb 의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 자궁암 조직 및 자궁암 세포주들의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않거나 약하게 발현이 되며 정상 자궁 조직에서만 높게 차별적으로 발현된다.

본 발명의 유전자가 도입된 자궁암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

2. GIG 3

본 발명의 유전자는 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 3(GIG3)으로서, 서열번호: 5의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423721 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_003824 호 인 Homo sapiens Fas (TNFRSF6)-associated via death domain (FADD)와 유전자서열이 일치하는 것으로 FADD는 death-domain 을 가지고 있는 단백질로써 Fas 의 death-domain (Baker, S. J. and Reddy, E. P., Oncogene, 12, 1-9 (1996)) 과 결합하여 apoptosis 를 유발하는 것으로 알려져있다 (Chinnaiyan, A. M., et al., Cell, 81, 505-512 (1995) ; Boldin, M. P., et al., J. Biol . Chem., 270, 7795-7798 (1995)). 즉 FADD 는 Fas와 결합하여 Fas의 신호전달에서 역할을 담당한다.

그러나 기 보고된 FADD 의 기능과는 달리 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 낮고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG3 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 5의 염기서열에는 염기번호 1내지 627(염기번호 625-627는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적 으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 208 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 6의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 23 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 5의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 7의 임의 프라이머 H-AP32 (5'AAGCTTCTTGCAA-3') 및 서열번호: 8의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTG-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 190 bp cDNA 단 편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 A549 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 폐, 심장, 근육, 콩팥, 및 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.3 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 0.7kb 의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 낮으며 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다. 본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

3. GIG 4

본 발명의 유전자는 서열번호: 9의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 4(GIG4)으로서, 서열번호: 9의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423722 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_002870 호 인 Homo sapiens RAB13, member RAS oncogene family (RAB13)와 유전자서열이 일치하는 것으로 RAB13 유전자는 인간 장 (human intestine)에서 발견된것으로 진핵세포 (eucaryotic cell) 의 생합성 (biosynthetic) 과 endocytic pathway 들 중에서 막 이동 (membrane traffic)를 조절하는 기능을 가진것으로 보고되고 있다 (Zahraoui, A., et al., J. Cell Biol., 124, 101-115 (1994)).

그러나 기 보고된 RAB13 의 기능과는 달리 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 낮고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG4 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 9의 염기서열에는 염기번호 2내지 613(염기번호 611-613은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 203 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 10의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 23 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 9의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 11의 임의 프라이머 H-AP35 (5'AAGCTTCAGGGCA-3')및 서열번호: 12의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTA-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현이 매우 약하면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 증가되는 187 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 폐, 심장, 근육, 콩팥, 및 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.3 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 낮으며 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다. 본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

4. GIG 5

본 발명의 유전자는 서열번호: 13의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 3(GIG3)으로서, 서열번호: 13의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423723 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 ACCESSION NM_014412호 인 Homo sapiens calcyclin binding protein (CACYBP), transcript variant 1 과 일치하며 이 유전자는 Sina-like protein (Siah)와 결합하는 Sigh-interacting protein (SIP)로 알려져있다 (Matsuzawa, S. I. and Reed, J. C., Molecular Cell, 7, 915-926 (2001)). SIP 은 Sgt1 과 관련된 molecule 로써 Siah family protein 들과 Skp1-Cullin-F-box ubiquitin ligase component Skp1 사이에서 물리적인 연결을 제공해준다고 보고되고 있다 (Matsuzawa, S. I., et al., J. Biol. Chem., 278, 1837-1840 (2003).

그러나 기 보고된 SIP의 기능과는 달리 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 낮고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 증가된 GIG5 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 13의 염기서열에는 염기번호 2내지 688(염기번호 686-688은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 228 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 14의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 26 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 13의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 15의 임의 프라이머 H-AP34 (5'AAGCTTCAGCAGC-3')및 서열번호: 16의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTG-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 212 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 폐, 심장, 근육, 콩팥, 및 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.2 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 2.0 kb 의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 낮으며 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다. 본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

5. GIG 11

본 발명의 유전자는 서열번호: 17의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 11(GIG11)으로서, 서열번호: 17의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY451236 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 CR614679 호인 full-length cDNA clone CS0DD008YG11 of Neuroblastoma Cot 50-normalized of Homo sapiens (human) 유전자와 이 데이터베이스에 등록된 제 BC000666 호인 Homo sapiens thioredoxin-related transmembrane protein 2 유전자 및 이 데이터베이스에 등록된 제 AF132965 호인 Homo sapiens CGI-31 protein mRNA 유전자들과는 서열이 일부 일치하나 단백질은 서로 다른 유전자들이다. 제 CR614679 호인 full-length cDNA clone CS0DD008YG11 of Neuroblastoma Cot 50-normalized of Homo sapiens (human)유전자, 제 BC000666 호인 Homo sapiens thioredoxin-related transmembrane protein 2 유전자 및 제 AF132965 호인 Homo sapiens CGI-31 protein mRNA 유전자들은 아직까지 기능이 규명되어있지 않다.

GIG11 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 약하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG11 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 17의 염기서열에는 염기번호 16 내지 768(염기번호 766-768은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동 일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 250 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 18의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 29 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 17의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 19의 임의 프라이머 H-AP36 (5'AAGCTTCGACGCT-3')및 서열번호: 20의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTA-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포 주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 298 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 MCF-7 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 뇌, 심장, 근육,흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 및 폐조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 유방암 조직 및 유방암 세포주 MCF-7 등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 약한 반면 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다.

본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

6. MIG 2

서열번호: 21의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY237654 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 D42043 호인 Homo sapiens KIAA0084 mRNA 및 제 NM_015150 XM_042841 호인 Homo sapiens raft-linking protein (RAFTLIN) 유전자와는 유전자 염기서열과 단백질서열이 유사함 확인되었다. KIA0084 유전자는 인간 미성숙 골수유래세포주인 KG-1에서 발견된 유전자이며 (Nagase, T., et al., DNA Res., 2, 37-43 (1995)), RAFTLIN 유전자는 지질의 형성과 유지에 중요하게 작용하면서 B-cell antigen receptor의 신호전달에 작용한다는 보고가 있다 (Saeki, K., et al., EMBO J., 22, 3015-3026 (2003)). 그러나 기 보고된 KIA0084 유전자와 RAFTLIN 유전자의 기능과는 달리 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 전혀 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 높은 MIG2 종양억제유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 21의 염기서열에는 염기번호 274 내지 2010(염기번호 2008-2010은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 578 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 22의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 63 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 21의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 23의 임의 프라이머 H-AP35 (5'AAGCTTCAGGGCA-3')및 서열번호: 24의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTA-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 311 bp cDNA 단편을 얻고 (2671bp-2981bp 에 해당), 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러 리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 자궁, 심장, 골격근, 콩팥, 및 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 5.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 2.0kb 의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 자궁암 조직 및 자궁암 세포주들의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않거나 약하게 발현이 되며 정상 자궁 조직에서만 높게 차별적으로 발현된다.

7. MIG 4

본 발명의 유전자는 서열번호: 25의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (MIG4)으로서, 서열번호: 25의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY260745 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_000688 호인 Homo sapiens aminolevulinate, delta-, synthase 1 (ALAS1), transcript variant 1 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. ALAS1 유전자는 적혈구 형성과정 (erythropoiesis)에 필요한 단백질로 보고되고 있다 (Bawden, M. J., et al., Nucleic Acids Res., 15, 8563 (1987) ; Sadlon, T. J., et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 31, 1153-1167 (1999)). 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 금번 연구결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 아주 약하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 MIG4 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 25의 염기서열에는 염기번호 322 내지 2244(염기번호 320-322는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 640 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 26의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 70 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 25의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 27의 임의 프라이머 H-AP31 (5'AAGCTTGGTGAAC-3') 및 서열번호: 28의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTA-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 322 bp cDNA 단편을 얻고 (1908bp-2229bp 에 해당), 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 자궁, 뇌, 심장, 골격근, 대장, 비장, 콩팥, 간, 태반, 폐 및 말초혈액 백혈구들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 0.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 2.0kb 의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 자궁암 조직 및 자궁암 세포주들의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않거나 약하게 발현이 되며 정상 자궁 조직에서만 높게 차별적으로 발현된다.

8. PIG 13

본 발명의 유전자는 서열번호: 29의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (PIG13)으로서, 서열번호: 29의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY258286 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 AK056487 호인 Homo sapiens cDNA FLJ31925 fis, clone NT2RP7005493 유전자, 제 BC028567 호인 Homo sapiens chromosome 1 open reading frame 21, mRNA (cDNA clone MGC:16172 IMAGE:3635521) 유전자 및 제 AF312864 호인 Homo sapiens C1orf21 mRNA 유전자들과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 이들 유전자들은 유전자 서열은 밝혀져있지만 아직까지 기능은 보고되고 있지 않다. 그러나 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 낮고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG13 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 29의 염기서열에는 염기번호 391내지 756(염기번호 754-756은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 121 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 30의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 14 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 31의 임의 프라이머 H-AP6 (5'AAGCTTGCACCAT-3')및 서열번호: 32의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTG-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 296 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 폐, 심장, 근육, 비장, 콩팥, 및 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 4.5kb 의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 낮으며 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다. 본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

9. PIG 15

본 발명의 유전자는 서열번호: 33의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (PIG15)으로서, 서열번호: 33의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY258285 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 L20941 호인 Human ferritin heavy chain mRNA 유전자와 제 M97164 호인 Human ferritin heavy chain mRNA 유전자들과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 이들 유전자들은 섭취하는 음식물 주의 철분제재에 해당한다 (Dhar, M. et al., Gene, 126, 275-278 (1993) ; Theil, E. C., Annu . Rev . Nutr., 24, 327-343 (2004)). 그러나 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 낮고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG15 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 33의 염기서열에는 염기번호 794내지 1345(염기번호 1343-1345는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 183 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 34의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 21 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 33의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 35의 임의 프라이머 H-AP6 (5'AAGCTTGCACCAT-3') 및 서열번호: 36의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTG-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 327 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 폐, 심장, 근육, 비장, 콩팥, 및 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 낮으며 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다. 본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

10. PIG 8

본 발명의 유전자는 서열번호: 37의 염기서열을 갖는 인간 세포 성장유도 유전자 8(PIG8)으로서, 서열번호: 37의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY239292 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 D42054 호인 Homo sapiens KIAA0092 mRNA, 제 AP001877 호인 Homo sapiens genomic DNA, chromosome 11 clone:CTD-2564P9, 및 제 NM_014679 XM_374925 호인 Homo sapiens translokin (KIAA0092) 유전자와 서열이 일부 일치하는 유전자이다. 제 D42054 호인 Homo sapiens KIAA0092 mRNA 유전자와 제 AP001877 호인 Homo sapiens genomic DNA, chromosome 11 clone:CTD-2564P9 유전자는 유전자 구조만 밝혀져 있으며, 제 NM_014679 XM_374925 호인 Homo sapiens translokin 유전자는 섬유모세포 (basic fibroblast growth factor)의 세포내 이동의 매개체 (mediator)로 작용한다고 보고 되고 있다 ((Bossard, C., et al., Nat. Cell Biol., 5, 433-439 (2003)). 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 아주 약하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG8 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 37의 염기서열에는 염기번호 140 내지 1642(염기번호 1640-1642는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 500 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 38의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 57 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 37의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 39의 임의 프라이머 H-AP36 (5'AAGCTTCGACGCT-3') 및 서열번호: 40의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTA-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 362 bp cDNA 단편을 얻고 (2586bp-2947bp 에 해당), 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 자궁, 뇌, 심장, 골격근, 간, 태반, 및 말초혈액 백혈구들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 4.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 정상간 조직의 경우 약 2.2kb 의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 자궁암 조직 및 자궁암 세포주들의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않거나 약하게 발현이 되며 정상 자궁 조직에서만 높게 차별적으로 발현된다. 본 발명의 유전자가 도입된 자궁암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

11. MRG 1

본 발명의 유전자는 서열번호: 41의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (MRG1)으로서, 서열번호: 41의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423731 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_002436 호인 Homo sapiens membrane protein, palmitoylated 1, 55kDa (MPP1) 유전자, 제 BC002392 호인 Homo sapiens membrane protein, palmitoylated 1, 55kDa 유전자와 유전자서열이 일부 일치하는 유전자이다. MPP1 유전자는 적혈구 막의 palmitoylated 단백질을 구성하는 것으로 알려져있다 ((Ruff, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 6595-6599 (1991) ; Metzenberg, A. B. and Gitschier, j., Hum. Mol. Genet., 1, 97-101 (1992)). 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 MRG1 유전자는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 없고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 MRG1 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 41의 염기서열에는 염기번호 27 내지 1427(염기번호 1425-1427은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 466 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 42의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 52 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 41의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 43의 임의 프라이머 H-AP21 (5'AAGCTTTCTCTGG-3') 및 서열번호: 44의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTG-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 277 bp cDNA 단편을 얻고 (1123bp-1399bp 에 해당), 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 자궁, 뇌, 골격근, 비장, 콩팥, 간, 태반, 폐 및 말초혈액 백혈구들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 5.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 2.0kb 의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 자궁암 조직 및 자궁암 세포주들의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않거나 약하게 발현이 되며 정상 자궁 조직에서만 높게 차별적으로 발현된다. 본 발명의 유전자가 도입된 자궁암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

12. PIG 22

본 발명의 유전자는 서열번호: 45의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (PIG22)로서, 서열번호: 46의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423729 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 BC043209 호인 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:5295100 유전자, 제 AK023913 호인 Homo sapiens cDNA FLJ13851 fis, clone THYRO1000926, highly similar to Homo sapiens cAMP-specific phosphodiesterase 8B (PDE8B) 유전자, 및 제 AB085827 호인 Homo sapiens HSPDE8B4 mRNA for phosphodiesterase 8B4 유전자와 유전자서열이 일치하는 것으로 이들 유전자는 유전자 서열만 밝혀져있다. 그러나 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 낮고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG22 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 45의 염기서열에는 염기번호 11내지 1063(염기번호 1061-1063은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 350 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 46의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 40 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩 티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 45의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 47의 임의 프라이머 H-AP24 (5'AAGCTTCACTAGC-3') 및 서열번호: 48의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTA-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 242 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 폐, 심장, 근육, 간 및 태반조 직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 5 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 2 kb 의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 낮으며 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다. 본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

13. MIG 9

본 발명의 유전자는 서열번호: 49의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (MIG9)로서, 서열번호: 49의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423724 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_005980 호인 Homo sapiens S100 calcium binding protein P (S100P) 유전자, 제 AF539739 호인 Homo sapiens calcium-binding S100 protein mRNA 유전자 및 제 BC006819 호인 Homo sapiens S100 calcium binding protein P 유전자들과 유전자서열이 일치하는 것으로 이들 유전자는 칼슘결합 단백질로 알려져있다 ((Becker, T., et al., Eur. J. Biochem., 207, 541-547 (1992) ; Schafer, B. W. and Heizmann, C. W., Trends Biochem. Sci., 21, 134-140 (1996)). 그러나 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 낮고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 MIG9 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 49의 염기서열에는 염기번호 50내지 316(염기번호 314-316은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 88 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 50의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 10 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 49의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 51의 임의 프라이머 H-AP12 (5'AAGCTTGAGTGCT-3') 및 서열번호: 52의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTG-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현이 매우 약하고 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 강한 178 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 폐, 심장, 근육, 콩팥, 간, 태반, 및 말초혈액조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 5 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 2 kb 의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 낮으며 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다. 본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

14. MIG 11

본 발명의 유전자는 서열번호: 53의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 (MIG11)로서, 서열번호: 53의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423726 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_005943 Homo sapiens molybdenum cofactor synthesis 1 (MOCS1), transcript variant 1 유전자와 유전자서열이 일치하는 것으로 이 유전자는 결핍시 조기에 사망하거나 신경계의 이상을 초래하는 것으로 보고되고 있다 ((Reiss, J., et al., Nat. genet., 20, 51-53 (1990) ; Hanzelmann, P., et al., J Biol. Chem., 277, 18303-18312 (2002) ; Hanzelmann, P., et al., J Biol. Chem., 279, 34721-34732 (2004)). 그러나 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 낮고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 MIG11 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 53의 염기서열에는 염기번호 7내지 756(염기번호 754-756은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 249 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 54의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 27 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 53의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝 하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 55의 임의 프라이머 H-AP13 (5'AAGCTTCGGCATA-3') 및 서열번호: 56의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTA-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현이 매우 약하고 정상 조직에서만 차별적으로 발현이 강한 212 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 폐, 심장, 근육, 비장, 콩팥, 간, 태반, 및 말초혈액조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 5 kb의 mRNA 전사물로 과발현되며 이외에도 약 2 kb 의 전사물로도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)등의 암 조직 및 세포에서는 발현이 낮으며 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된다. 본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

15. MIG 15

서열번호: 57의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423730 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 BC000961 호인 Homo sapiens degenerative spermatocyte homolog 1, lipid desaturase (Drosophila), transcript variant 1, mRNA (cDNA clone MGC:5079 IMAGE:3450936) 유전자, 제 NM_003676 호인 Homo sapiens degenerative spermatocyte homolog 1, lipid desaturase (Drosophila) (DEGS1), transcript variant 1 유전자, 및 제 AF466375 호인 Homo sapiens sphingolipid delta 4 desaturase protein DES1 mRNA 유전자와 유전자 염기서열이 유사함 확인되었다. 이 유전자들은 membrane fatty acid desaturase family 에 속하며 지방산 (fatty acids) 에서 특이 위치 (specific position)에 double bonds 를 삽입시키는 역할을 한다고 보고되고 있다 ((Cadena, D. L., et al., Biochemistry, 36, 6960-6967 (1997) ; Ternes, P., et al., J. Biol. Chem., 277, 25512-25518 (2002)). 그러나 기 보고된 기능과는 달리 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 매우 약하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 높은 MIG15 종양억제유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 57의 염기서열에는 염기번호 78 내지 1049(염기번호 1047-1049는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈 의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 323 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 58의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 38 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 57의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 59의 임의 프라이머 H-AP31 (5'AAGCTTGGTGAAC-3') 및 서열번호: 60의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) 5'AAGCTTTTTTTTTTTC-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 327 bp cDNA 단편을 얻고 (1673bp-1999bp 에 해당), 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 자궁, 심장, 골격근, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 및 말초혈액조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 9.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 자궁암 조직 및 자궁암 세포주들의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않거나 약하게 발현이 되며 정상 자궁 조직에서만 높게 차별적으로 발현된다. 본 발명의 유전자가 도입된 자궁암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

참조예: 총 RNA의 분리

신선한 조직 또는 배양된 세포로부터 총 RNA 분리 키트(RNeasy total RNA kit, Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 총 RNA를 분리한 후, 메시지 클린 키트(message clean kit, GenHunter Corp., MA, 미국)를 사용하여 RNA에 오염된 DNA를 제거하였다.

실시예 1: 총 RNA의 분리 및 mRNA 감별 전개

1-1. GIG 1

정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다. 자궁 근종 환자로부터 자궁적출술(hysterectomy) 중에 정상 자궁경부(exocervical) 조직 시료를 얻었으며, 수술적 처치전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 자궁절제술(radical hysterectomy) 중에 원발성 자궁경부암 조직 및 전이성 장골 림프절 조직 시료를 얻었다. 인간 자궁경부암 세포주로는 CUMC-6(Kim, J.W. et al., Gynecol . Oncol ., 62, 230-240 (1996))을 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법 과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 3의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP38(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1a는 서열번호: 3의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP38과 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1a에서 제1열은 정상 자궁경부 조직이며, 제2열은 자궁경부암 조직이고, 제3열은 전이성 장골 림프절 조직이며, 제4열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6이다. 도 1a에서 보듯이, 자궁경부암 조직, 전이성 장골 림프절 조직 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6에서는 발현되지 않고 정상 자궁경부 조직에서만 차별적으로 발현된 382 bp cDNA 단편이 확인되었다. 이 cDNA 단편을 CG381로 명명하였다.

건조된 겔로부터 CG381 단편인 382 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 CG381을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-2. GIG 3

정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이 조직 및 폐암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다. 폐암 환자로부터 수술 중에 정상 폐조직, 폐암 조직 및 폐암 전이조직 시료를 얻었으며, 인간 폐암 세포주로는 A549 (American Type Culture Collection; ATCC Number CCL-185) 와 NCI-H358 (American Type Culture Collection; ATCC Number CRL-5807) 폐암 세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 8의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 7의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP32(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1b는 서열번호: 7의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP32와 서열번호: 8의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1b에서 제1열은 정상 폐 조직이며, 제 2열은 폐암 조직이고, 제 3열은 폐암 전이조직이고 제 4열은 폐암 세포주 A549이다. 도 1b에서 보듯이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현된 190 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG3 전장 유전자서열의 492bp에서부터 681bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 L935 로 명명하였다.

건조된 겔로부터 L935 단편인 190 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 L935를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-3 GIG 4

실시예 1-2와 같은 방법으로 폐암 환자로부터 수술 중에 정상 폐조직, 폐암 조직 및 폐암 전이조직 시료를 얻었으며, 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 12의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 11의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP35(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1c는 서열번호: 11의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP35와 서열번호: 12의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1c에서 제1열은 정상 폐 조직 이며, 제 2열은 폐암 조직이고, 제 3열은 폐암 전이조직이고 제 4열은 폐암 세포주 A549이다. 도 1c에서 보듯이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 에서는 발현이 약하고 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 187 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG4 전장 유전자서열의 435bp에서부터 621bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 L951 로 명명하였다.

건조된 겔로부터 L951 단편인 187 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 L951을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-4 GIG 5

정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이 조직 및 폐암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다. 폐암 환자로부터 수술 중에 정상 폐조직, 폐암 조직 및 폐암 전이조직 시료를 얻었으며, 인간 폐암 세포주로는 A549 (American Type Culture Collection; ATCC Number CCL-185) 와 NCI-H358 (American Type Culture Collection; ATCC Number CRL-5807) 폐암 세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였 다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 16의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 15의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP32(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1d는 서열번호: 15의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP34와 서열번호: 16의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1d에서 제1열은 정상 폐 조직이며, 제 2열은 폐암 조직이고, 제 3열은 폐암 전이조직이고 제 4열은 폐암 세포주 A549이다. 도 1d에서 보듯이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현된 212bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG5 전장 유전자서열의 497bp에서부터 708bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 L952 로 명명하였다.

건조된 겔로부터 L952 단편인 212 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 L952를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-5: GIG 11

정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

유방암 환자로부터 유방적출술(mastectomy) 중에 정상 유방 조직 시료를 얻었으며, 수술적 처치 전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 유방절제술(radical mastectomy) 중에 원발성 유방 암조직 시료를 얻었다. 인간 유방암 세포주로는 MCF-7 (American Type Culture Collection; ATCC Number HTB-22) 유방암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조 예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 20의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 19의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP36(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1e는 서열번호: 3의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP36과 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1e에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1e에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현이 매우 약하고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현이 증가된 298 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG11 전장 유전자서열의 741bp에서부터 1038bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 BBCC311N으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 BBCC311N 단편인 298 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 BBCC311N 을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-6: MIG 2

정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다. 자궁 근종 환자로부터 자궁적출술(hysterectomy) 중에 정상 자궁경부(exocervical) 조직 시료를 얻었으며, 수술적 처치전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 자궁절제술(radical hysterectomy) 중에 원발성 자궁경부암 조직 및 전이성 장골 림프절 조직 시료를 얻었다. 인간 자궁경부암 세포주로는 CUMC-6(Kim, J.W. et al., Gynecol . Oncol ., 62, 230-240 (1996))을 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 24의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 23의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP35(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재 하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1f는 서열번호: 23의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP35와 서열번호: 24의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1f에서 제1열은 정상 자궁경부 조직이며, 제2열은 자궁경부암 조직이고, 제3열은 전이성 장골 림프절 조직이며, 제4열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6이다. 도 1f에서 보듯이, 자궁경부암 조직, 전이성 장골 림프절 조직 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6에서는 발현되지 않고 정상 자궁경부 조직에서만 차별적으로 발현된 311 bp cDNA 단편이 확인되었다. 이 cDNA 단편을 CA352로 명명하였다.

건조된 겔로부터 CA352 단편인 311 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 CA352를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-7: MIG 4

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 28의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 27의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP31(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1g는 서열번호: 27의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP31과 서열번호: 28의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1g에서 제1열은 정상 자궁경부 조직이며, 제2열은 자궁경부암 조직이고, 제3열은 전이성 장골 림프절 조직이며, 제4열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6이다. 도 1g에서 보듯이, 자궁경부암 조직, 전이성 장골 림프절 조직 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6에서는 발현되지 않고 정상 자궁경부 조직에서만 차별적으로 발현된 322 bp cDNA 단편이 확인되었다. 이 cDNA 단편을 MA41로 명명하였다.

건조된 겔로부터 MA41 단편인 322 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 MA41을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-8: PIG 13

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 32의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 31의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP6(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1h는 서열번호: 31의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP6과 서열번호: 32의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1h에서 제1열은 정상 폐 조직이며, 제 2열은 폐암 조직이고, 제 3열은 폐암 전이조직이고 제 4열은 폐암 세포주 A549이다. 도 1h에서 보듯이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 에서는 발현이 되지 않거나 약하고 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현된 296 bp cDNA 단편 이 확인되었다 (PIG13 전장 유전자서열의 643bp에서부터 938bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 L50-211 로 명명하였다.

건조된 겔로부터 L50-211 단편인 296 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 L50-211 을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-9: PIG 15

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966- 6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 36의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 35의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP6(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1i는 서열번호: 35의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP6과 서열번호: 36의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1i에서 제1열은 정상 폐 조직이며, 제 2열은 폐암 조직이고, 제 3열은 폐암 전이조직이고 제 4열은 폐암 세포주 A549이다. 도 1i에서 보듯이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 에서는 발현이 되지 않거나 약하고 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현된 327 bp cDNA 단편이 확인되었다 (PIG15 전장 유전자서열의 1373bp에서부터 1699bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 L50 으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 L50 단편인 327 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭 시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 L50 을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-10: PIG 8

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 40의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 39의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP36(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1j는 서열번호: 39의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP36과 서열번호: 40의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1j에서 제1열은 정상 자궁경부 조직이며, 제2열은 자궁경부암 조직이고, 제3열은 전이성 장골 림프절 조직이며, 제4열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6이다. 도 1j에서 보듯이, 자궁경부암 조직, 전이성 장골 림프절 조직 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6에서는 발현되지 않고 정상 자궁경부 조직에서만 차별적으로 발현된 362 bp cDNA 단편이 확인되었다. 이 cDNA 단편을 CA361로 명명하였다.

건조된 겔로부터 CA361 단편인 362 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 CA361을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-11: MRG 1

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 44의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 43의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP21(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1k는 서열번호: 43의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP21과 서열번호: 44의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1k에서 제1열은 정상 자궁경부 조직이며, 제2열은 자궁경부암 조직이고, 제3열은 전이성 장골 림프절 조직이며, 제4열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6이다. 도 1k에서 보듯이, 자궁경부암 조직, 전이성 장골 림프절 조직 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6에서는 발현되지 않고 정상 자궁경부 조직에서만 차별적으로 발현된 277 bp cDNA 단편이 확인되었다. 이 cDNA 단편을 MG21로 명명하였다.

건조된 겔로부터 MG21 단편인 277 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 MG21을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-12: PIG 22

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 48의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 47의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP24(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1l은 서열번호: 47의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP24와 서열번호: 48의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1l에서 제1열은 정상 폐 조직이며, 제 2열은 폐암 조직이고, 제 3열은 폐암 전이조직이고 제 4열은 폐암 세포주 A549이다. 도 1l에서 보듯이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 에서는 발 현이 약하고 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현된 242 bp cDNA 단편이 확인되었다 (PIG22 전장 유전자서열의 738bp에서부터 979bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 L989 로 명명하였다.

건조된 겔로부터 L989 단편인 242 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 L989를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-13: MIG 9

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 52의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 51의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP12(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1m은 서열번호: 51의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP12와 서열번호: 52의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1m에서 제1열은 정상 폐 조직이며, 제 2열은 폐암 조직이고, 제 3열은 폐암 전이조직이고 제 4열은 폐암 세포주 A549이다. 도 1m에서 보듯이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 에서는 발현이 약하고 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현된 178 bp cDNA 단편이 확인되었다 (MIG9 전장 유전자서열의 132bp에서부터 309bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 L741 로 명명하였다.

건조된 겔로부터 L741 단편인 178 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 L741을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-14: MIG 11

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 56의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 55의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP13(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1n은 서열번호: 55의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP13과 서열번호: 56의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1n에서 제1열은 정상 폐 조직이며, 제 2열은 폐암 조직이고, 제 3열은 폐암 전이조직이고 제 4열은 폐암 세포주 A549이다. 도 1n에서 보듯이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 에서는 발현이 약하고 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현된 212 bp cDNA 단편이 확인되었다 (MIG11 전장 유전자서열의 568bp에서부터 779bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 L861 로 명명하였다.

건조된 겔로부터 L861 단편인 212 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 L861을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-15: MIG 15

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 60의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 59의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP31(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1 o는 서열번호: 59의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP31과 서열번호: 60의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1 o에서 제1열은 정상 자궁경부 조직이며, 제2열은 자궁경부암 조직이고, 제3열은 전이성 장골 림프절 조직이며, 제4열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6이다. 도 1 o에서 보듯이, 자궁경부암 조직, 전이성 장골 림프절 조직 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6에서는 발현이 약하고 정상 자궁경부 조직에서만 차별적으로 발현된 327 bp cDNA 단편이 확인되었다. 이 cDNA 단편을 CC312로 명명하였다.

건조된 겔로부터 CC312 단편인 327 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 CC312를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

실시예 2: cDNA 라이브러리 스크리닝

2-1: GIG 1

실시예 1-1에서 얻은 cDNA 단편 CG381을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P- 표지된 FC26 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 GIG1의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 1과 같았다. 이 염기서열은 320 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 2와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 34 kDa이었다.

얻어진 GIG1전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/GIG1 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 2a는 pBAD/thio-Topo/GIG1 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 49 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 49 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/GIG1 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 34 kDa의 GIG1 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 2a는 GIG1 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2a에서 제1열은 엘아라비노즈 에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 엘 아라비노즈에 의해 GIG1 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다.

2-2: GIG 3

실시예 1-2에서 얻은 cDNA 단편 L935를 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 L935 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 GIG3의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 5와 같았다. 이 염기서열은 208 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 6와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량 은 약 23 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG2 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2b는 GIG3 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2b에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG3 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2b에서 보듯이, 발현된 GIG3 단백질의 크기는 약 23 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

2-3: GIG 4

실시예 1-3에서 얻은 cDNA 단편 L951을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 L951 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 GIG4의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 9와 같았다. 이 염기서열은 203 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 10과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 23 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG4 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2c는 GIG4 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2c에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG4 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2c에서 보듯이, 발현된 GIG4 단백질의 크기는 약 23 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

2-4: GIG 5

실시예 1-4에서 얻은 cDNA 단편 L952를 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 L952 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 GIG5의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 13과 같았다. 이 염기서열은 228 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 14와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 26 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG5 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2d는 GIG5 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2d에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG5 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2d에서 보듯이, 발현된 GIG5 단백질의 크기는 약 26 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

2-5: GIG 11

실시예 1-5에서 얻은 cDNA 단편 BBCC311N 을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P- 표지된 BBCC311N cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 GIG11의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 17과 같았다. 이 염기서열은 250 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 18과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 29 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG11 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2e는 GIG11 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2e에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG11 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2e에서 보듯이, 발현된 GIG11 단백질의 크기는 약 29 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

2-6: MIG 2

실시예 1-6에서 얻은 cDNA 단편 CA352를 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 FC26 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 MIG2의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 21과 같았다. 이 염기서열은 578 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 22와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 63 kDa이었다.

얻어진 MIG2전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/MIG2 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 엘 아라비노즈 유도 전 후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE).

도 2f는 pBAD/thio-Topo/MIG2 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 78 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 78 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG2 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 63 kDa의 GIG1 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 2f는 MIG2 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2f에서 제1열은 엘아라비노즈 에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 엘 아라비노즈에 의해 MIG2 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다.

2-7: MIG 4

실시예 1-7에서 얻은 cDNA 단편 MA41을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 FC26 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 MIG4의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 25와 같았다. 이 염기서열은 640 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 26과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 70 kDa이었다.

어진 MIG4전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/MIG4 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 2g는 pBAD/thio-Topo/MIG4 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 85 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 85 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG4 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 70 kDa의 MIG4 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 2g는 MIG4 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2g에서 제1열은 엘아라비노즈 에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 엘 아라비 노즈에 의해 MIG4 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다.

2-8: PIG 13

실시예 1-8에서 얻은 cDNA 단편 L50-211 을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 L50-211 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 PIG13의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 29와 같았다. 이 염기서열은 121 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 30과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 14 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 PIG13 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2h는 PIG13 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2h에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG13 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2h에서 보듯이, 발현된 PIG13 단백질의 크기는 약 14 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

2-9: PIG 15

실시예 1-9에서 얻은 cDNA 단편 L50 을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 L50 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 PIG15의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 33과 같았다. 이 염기서열은 183 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 34와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 21 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으 로써 PIG15 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2i는 PIG15 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2i에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG15 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2i에서 보듯이, 발현된 PIG15 단백질의 크기는 약 21 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

2-10: PIG 8

실시예 1-10에서 얻은 cDNA 단편 CA361을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 FC26 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 PIG8의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 37과 같았다. 이 염기서열은 500 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 38과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 57 kDa이었다.

얻어진 PIG8전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/PIG8 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 2j는 pBAD/thio-Topo/PIG8 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 72 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 72 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG8 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 57 kDa의 PIG8 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 2j는 PIG8 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2j에서 제1열은 엘아라비노즈 에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 엘 아라비노즈에 의해 PIG8 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다.

2-11: MRG 1

실시예 1-11에서 얻은 cDNA 단편 MG21을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 FC26 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 MRG1의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 41과 같았다. 이 염기서열은 466 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 42와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 52 kDa이었다.

얻어진 MRG1전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/MRG1 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴 리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 2k는 pBAD/thio-Topo/MRG1 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 67 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 67 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/GIG1 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 52 kDa의 MRG11 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 2k는 MRG1 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2k에서 제1열은 엘아라비노즈 에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 엘 아라비노즈에 의해 MRG1 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다.

2-12: PIG 22

실시예 1-12에서 얻은 cDNA 단편 L989를 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 L935 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 PIG22의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 45와 같았 다. 이 염기서열은 350 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 46과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 40 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 PIG22 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2l는 PIG22 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2l에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG22 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2l에서 보듯이, 발현된 PIG22 단백질의 크기는 약 40 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

2-13: MIG 9

실시예 1-13에서 얻은 cDNA 단편 L741을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal. Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 L935 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리 드화시켜, 인간 암 억제 유전자 MIG9의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 49와 같았다. 이 염기서열은 88 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 50과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 10 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 MIG9 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2m은 MIG9 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2m에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 MIG9 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2m에서 보듯이, 발현된 MIG9 단백질의 크기는 약 10 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

2-14: MIG 11

실시예 1-14에서 얻은 cDNA 단편 L861을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 L935 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 MIG11의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 53과 같았다. 이 염기서열은 249 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 54와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 27 kDa이었다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 MIG11 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2n은 MIG11 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2n에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 MIG11 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2n에서 보듯이, 발현된 MIG11 단백질의 크기는 약 27 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

2-15: MIG 15

실시예 1-15에서 얻은 cDNA 단편 CC312를 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 CC312 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 MIG15의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 57과 같았다. 이 염기서열은 323 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 58과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 38 kDa이었다.

얻어진 MIG15전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/MIG15 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데 실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 2는 pBAD/thio-Topo/MIG15 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 53 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 53 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG15 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 38 kDa의 MIG15 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 2 o는 MIG15 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2 o에서 제1열은 엘아라비노즈 에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 엘 아라비노즈에 의해 MIG15 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다

실시예 3: 유전자의 노던 블랏

3-1. GIG 1

GIG1 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1-1에서 얻은 정상 자궁경부 조직 시료 3개, 원발성 자궁경부암 조직 시료 3개 및 자궁경부암 세포주 시료 2개의 총 RNA 20 ㎍을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 실시예 1-1에서 얻은 GIG1 전장 cDNA를 사용한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42 ℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하 였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 3a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 GIG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3b는 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다. 도 3a 및 3b에서, 제1열 내지 제3열은 정상 자궁경부 조직 시료이며, 제4열 내지 제6열은 자궁경부암 조직 시료이고, 제7열은 자궁경부암 세포주 HeLa 시료이며, 제8열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6 시료이다. 도 3a 및 3b에서 보듯이, GIG1 유전자의 발현 수준은 정상 자궁경부 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 자궁경부암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 자궁경부암 세포주 시료 2개에서는 나타나지 않았다.

도 18a는 여러 정상 조직에서 GIG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 18b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 18a에서 보듯이 뇌, 심장, 골격근, 비장, 콩팥, 간, 태반, 폐 및 말초백혈구들에서 약 4.0 kb의 우점(dominant) GIG1 mRNA 전사물이 과발현되었으며, 이외에 3.0 kb의 전사물도 나타났다.

도 33a는 여러 암세포주들에서 GIG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 33b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 33a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG1 유전자 의 발현은 약하게 나타났다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG1 유전자는 정상 자궁경부, 뇌, 심장, 골격근, 비장, 콩팥, 간, 태반, 폐 및 말초백혈구들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-2: GIG 3

GIG3 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 폐 조직 시료 3개, 원발성 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG3 전장 cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 4a는 정상 폐조직, 원발성 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주에서 GIG3 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 4b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4a 및 4b에서 보듯이, GIG3 유전자의 발현 수준은 정상 폐 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 시료 2개에서는 나타나지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 19a는 여러 정상 조직에서 GIG3 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 19b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 19a에서 보듯이 정상 폐, 심장, 근육, 콩팥, 및 간조직에서 약 1.3 kb의 우점(dominant) GIG2 mRNA 전사물이 높게 과발현되었다. 이외에도 약 0.7kb 의 전사물로도 발현된다.

도 34a는 여러 암세포주들에서 GIG3 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 34b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 34a에서 보듯이, 정상조직들에서 나타나는 약 1.3 kb의 우점(dominant) GIG3 mRNA 전사물은 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들에서는 전혀 발현이 되지 않고 약 2.0kb 또는 약 0.5 kb 크기의 다른 전사물들이 약하게 발현되고 있다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG3 유전자는 정상 폐, 심장, 근육, 콩팥, 및 간조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-3: GIG4

GIG4 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 폐 조직 시료 3개, 원발성 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG4 전장 cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 5a는 정상 폐조직, 원발성 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주에서 GIG4 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5a 및 5b에서 보듯 이, GIG4 유전자의 발현 수준은 정상 폐 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 시료 2개에서는 발현이 낮게 나타났다.

도 20a는 여러 정상 조직에서 GIG4 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 20b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 20a에서 보듯이 정상 심장, 근육, 비장, 콩팥, 및 간조직에서 약 1.3 kb의 우점(dominant) GIG4 mRNA 전사물이 높게 과발현되었다. 이외에도 대장, 소장, 및 태반에서도 발현된다.

도 35a는 여러 암세포주들에서 GIG4 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 35b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 35a에서 보듯이, 정상조직들에서 나타나는 약 1.3 kb의 우점(dominant) GIG4 mRNA 전사물은 HeLa 자궁경부암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들에서는 약하게 발현이 되고 있으나 전 골수성 백혈병 HL-60, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, 및 SW480 결장암 세포들에서는 전혀 발현이 되지 않고 있다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG4 유전자는 정상 폐, 심장, 근육, 비장, 콩팥, 간, 대장, 소장 및 태반조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-4: GIG 5

GIG5 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 폐 조직 시료 3개, 원발성 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG5 전장 cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 6a는 정상 폐조직, 원발성 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주에서 GIG5 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 6b는 동일 블랏 을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 6a 및 6b에서 보듯이, GIG5 유전자의 발현 수준은 정상 폐 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 시료 2개에서는 나타나지 않았다.

도 21a는 여러 정상 조직에서 GIG5 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 21b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 21a에서 보듯이 심장, 및 근육조직에서 약 1.2 kb의 우점(dominant) GIG2 mRNA 전사물이 높게 과발현되었으며 이외에도 약 2.0kb 의 전사물로도 높게 발현된다. 또한, 정상 뇌, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 및 태반 조직에서도 약하게 발현되고 있다.

도 36a는 여러 암세포주들에서 GIG5 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 36b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 36a에서 보듯이, 정상조직들에서 나타나는 약 1.3 kb의 우점(dominant) GIG5 mRNA 전사물과 약 2.0kb 의 전사물들은 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들에서는 발현이 아주 약하거나 또는 전혀 발현이 되지 않고 있다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG5 유전자는 정상 폐, 심장, 및 근육조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-5: GIG 11

GIG11 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 유방 조직 시료 3개, 원발성 유방암 조직 시료 3개 및 유방암 세포주 MCF-7의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG11 전장 cDNA의 부분서열인 BBCC311N cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 7a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG11 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 7b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 7a 및 7b에서 보듯이, GIG11 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 유방암 세포주 시료 1개에서도 발현이 매우 낮았다.

도 22a는 여러 정상 조직에서 GIG11 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 22b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 22a에서 보듯이 유방, 뇌, 심장, 근육,흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 및 폐조직들에서 약 1.5 kb의 우점(dominant) GIG11 mRNA 전사물이 과발현되었다. 정상대장 및 말초혈액에서도 발현이 확인되었다.

도 37a는 여러 암세포주들에서 GIG11 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 37b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 37a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG11 유전자의 발현수준이 매우 낮았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG11 유전자는 정상 유방, 뇌, 심장, 근육,흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐, 대장 및 말초혈액들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-6: MIG 2

MIG2 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직 시료 3개, 원발성 자궁경부암 조직 시료 3개 및 자궁경부암 세포주 시료 2개의 총 RNA 20 ㎍을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 실시예 1에서 얻은 MIG 2 전장 cDNA를 사용한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42 ℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 8a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 MIG2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 8b는 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다. 도 8a 및 8b에서, 제1열 내지 제3열 은 정상 자궁경부 조직 시료이며, 제4열 내지 제6열은 자궁경부암 조직 시료이고, 제7열은 자궁경부암 세포주 HeLa 시료이며, 제8열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6 시료이다. 도 8a 및 8b에서 보듯이, MIG2 유전자의 발현 수준은 정상 자궁경부 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 자궁경부암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 자궁경부암 세포주 시료 2개에서는 나타나지 않았다.

도 23a는 여러 정상 조직에서 MIG2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 23b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 23a에서 보듯이 심장, 골격근, 콩팥, 및 간조직들에서 약 5.0 kb의 우점(dominant) MIG2 mRNA 전사물이 과발현되었으며, 이외에 2.0 kb의 전사물도 나타났다.

도 38a는 여러 암세포주들에서 MIG2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 38b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 38a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 MIG2 유전자의 발현은 나타나지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 MIG2 유전자는 정상 자궁경부, 심장, 골격근, 콩팥, 간, 폐 및 말초백혈구들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-7: MIG4

MIG4 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직 시료 3개, 원발성 자궁경부암 조직 시료 3개 및 자궁경부암 세포주 시료 2개의 총 RNA 20 ㎍을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 실시예 1에서 얻은 MIG4 전장 cDNA를 사용한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42 ℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 9a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 MIG4 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 9b는 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다. 도 9a 및 9b에서, 제1열 내지 제3열은 정상 자궁경부 조직 시료이며, 제4열 내지 제6열은 자궁경부암 조직 시료이고, 제7열은 자궁경부암 세포주 HeLa 시료이며, 제8열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6 시료이다. 도 9a 및 9b에서 보듯이, MIG4 유전자의 발현 수준은 정상 자궁경부 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 자궁경부암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 자궁경부암 세포주 시료 2개에서는 나타나지 않았다.

도 24a는 여러 정상 조직에서 MIG4 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노 던 블랏 결과이며 도 24b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 24a에서 보듯이 뇌, 심장, 골격근, 대장, 비장, 콩팥, 간, 태반, 폐 및 말초혈액 백혈구들에서 약 0.5 kb의 우점(dominant) MIG4 mRNA 전사물이 과발현되었으며, 이외에 2.0 kb의 전사물도 나타났다.

도 39a는 여러 암세포주들에서 MIG4 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 39b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 39a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 MIG4 유전자의 발현은 없었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 MIG4 유전자는 정상 자궁경부, 뇌, 심장, 골격근, 대장, 비장, 콩팥, 간, 태반, 폐 및 말초혈액 백혈구들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-8: PIG 13

PIG13 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 폐 조직 시료 3개, 원발성 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 PIG13 전장 cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 10a는 정상 폐조직, 원발성 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주에서 PIG13 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 10b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 10a 및 10b에서 보듯이, PIG13 유전자의 발현 수준은 정상 폐 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 시료 2개에서는 발현이 아주 약하거나 나타나지 않았다.

도 25a는 여러 정상 조직에서 PIG13 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노 던 블랏 결과이며 도 25b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 25a에서 보듯이 정상 폐, 뇌,심장, 근육, 대장, 비장,콩팥, 간, 및 소장조직들에서 약 1.0 kb의 우점(dominant) PIG13 mRNA 전사물이 높게 과발현되었다. 이외에도 약 4.5kb 의 전사물로도 발현된다.

도 40a는 여러 암세포주들에서 PIG13 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 40b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 40a에서 보듯이, 정상조직들에서 나타나는 약 1.0 kb의 우점(dominant) PIG13 mRNA 전사물은 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들에서는 전혀 발현이 되지 않고 있다. 이러한 결과로부터 본 발명의 PIG13 유전자는 정상 폐, 뇌, 심장, 근육, 대장, 비장, 콩팥, 간, 및 소장조직들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-9: PIG 15

PIG15 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 폐 조직 시료 3개, 원발성 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 PIG15 전장 cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 11a는 정상 폐조직, 원발성 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주에서 PIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 11b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 11a 및 11b에서 보듯이, PIG13 유전자의 발현 수준은 정상 폐 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 시료 2개에서는 발현이 아주 약하거나 나타나지 않았다.

도 26a는 여러 정상 조직에서 PIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 26b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 26a에서 보듯이 정상 폐, 뇌,심장, 근육, 대장, 비장,콩팥, 간, 및 소장조직들에서 약 1.0 kb의 우점(dominant) PIG15 mRNA 전사물이 높게 과발현되었다.

도 41a는 여러 암세포주들에서 PIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 41b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 41a에서 보듯이, 정상조직들에서 나타나는 약 1.0 kb의 우점(dominant) PIG15 mRNA 전사물은 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들에서는 전혀 발현이 되지 않고 있다. 이러한 결과로부터 본 발명의 PIG15 유전자는 정상 폐, 뇌, 심장, 근육, 대장, 비장, 콩팥, 간, 및 소장조직들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-10: PIG 8

PIG8 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직 시료 3개, 원발성 자궁경부암 조직 시료 3개 및 자궁경부암 세포주 시료 2개의 총 RNA 20 ㎍을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 실시예 1에서 얻은 PIG8 전장 cDNA를 사용한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42 ℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 12a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 PIG8 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 12b는 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다. 도 12a 및 12b에서, 제1열 내지 제3열은 정상 자궁경부 조직 시료이며, 제4열 내지 제6열은 자궁경부암 조직 시료이고, 제7열은 자궁경부암 세포주 HeLa 시료이며, 제8열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6 시료이다. 도 12a 및 12b에서 보듯이, PIG8 유전자의 발현 수준은 정상 자궁경부 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 자궁경부암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 자궁경부암 세포주 시료 2개에서는 나타나지 않았다.

도 27a는 여러 정상 조직에서 PIG8 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 27b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 27a에서 보듯이 뇌, 심장, 골격근, 간, 태반, 및 말초백혈구들에서 약 4.5 kb의 우점(dominant) PIG8 mRNA 전사물이 과발현되었으며, 이외에 정상간 조직의 경우 2.2 kb의 전사물도 나타났다.

도 42a는 여러 암세포주들에서 PIG8 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노 던 블랏 결과이고, 도 42b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 42a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 PIG8 유전자의 발현은 나타나지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 PIG8 유전자는 정상 자궁경부, 뇌, 심장, 골격근, 간, 태반, 및 말초백혈구들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-11: MRG 1

MRG1 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직 시료 3개, 원발성 자궁경부암 조직 시료 3개 및 자궁경부암 세포주 시료 2개의 총 RNA 20 ㎍을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 실시예 1에서 얻은 MRG1 전장 cDNA를 사용한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42 ℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 13a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 MRG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 13b는 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다. 도 13a 및 13b에서, 제1열 내지 제3열은 정상 자궁경부 조직 시료이며, 제4열 내지 제6열은 자궁경부암 조직 시료이고, 제7열은 자궁경부암 세포주 HeLa 시료이며, 제8열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6 시료이다. 도 13a 및 13b에서 보듯이, MRG1 유전자의 발현 수준은 정상 자궁경부 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 자궁경부암 조직 시료 3개에서는 그 발현dl 되지 않았고, 자궁경부암 세포주 시료 2개에서도 나타나지 않았다.

도 28a는 여러 정상 조직에서 MRG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 28b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 28a에서 보듯이 심장, 골격근,콩팥, 간, 및 태반들에서 약 5.0 kb의 우점(dominant) MRG1 mRNA 전사물이 과발현되었으며, 이외에 2.0 kb의 전사물도 나타났다.

도 43a는 여러 암세포주들에서 MRG1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 43b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 43a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 MRG1 유전자의 발현은 없었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 MRG1 유전자는 정상 자궁경부, 심장, 골격근, 콩팥, 간, 태반, 폐 및 말초백혈구들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-12: PIG 22

PIG22 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시 하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 폐 조직 시료 3개, 원발성 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 PIG22 전장 cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 14a는 정상 폐조직, 원발성 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주에서 PIG22 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 14b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 14a 및 14b에서 보듯이, PIG22 유전자의 발현 수준은 정상 폐 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 시료 2개에서는 발현이 약하였다.

도 29a는 여러 정상 조직에서 PIG22 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 29b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 29a에서 보듯이 정상 심장, 근육, 간, 및 태반조직에서 약 5 kb의 우점(dominant) PIG22 mRNA 전사물이 높게 과발현되었다. 이외에도 약 2 kb 의 전사물로도 발현된다.

도 44a는 여러 암세포주들에서 PIG22 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 44b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 44a에서 보듯이, 정상조직들에서 나타나는 약 1.3 kb의 우점(dominant) PIG22 mRNA 전사물은 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들에서는 발현이 되지 않거나 매우 약하게 발현되었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 PIG22 유전자는 정상 폐, 심장, 근육, 간 및 태반조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-13: MIG 9

MIG9 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 폐 조직 시료 3개, 원발성 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 MIG9 전장 cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 15a는 정상 폐조직, 원발성 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주에서 MIG9 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 15b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 15a 및 15b에서 보듯이, MIG9 유전자의 발현 수준은 정상 폐 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 시료 2개에서는 발현이 약하였다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비 장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 30a는 여러 정상 조직에서 MIG9 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 30b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 30a에서 보듯이 정상 심장, 근육, 콩팥,간, 태반 및 말초혈액조직에서 약 5 kb의 우점(dominant) MIG9 mRNA 전사물이 높게 과발현되었다. 이외에도 약 2 kb 의 전사물로도 발현된다.

도 45a는 여러 암세포주들에서 MIG9 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 45b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 45a에서 보듯이, 정상조직들에서 나타나는 약 5 kb의 우점(dominant) MIG9 mRNA 전사물은 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들에서는 발현이 되지 않거나 매우 약하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 MIG9 유전자는 정상 폐, 심장, 근육, 콩팥, 간, 태반 및 말초혈액조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-14: MIG 11

MIG11 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 폐 조직 시료 3개, 원발성 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 MIG11 전장 cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 16a는 정상 폐조직, 원발성 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주에서 MIG11 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 16b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 16a 및 16b에서 보듯이, MIG1 유전자의 발현 수준은 정상 폐 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 시료 2개에서는 발현이 약하였다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블 랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 31a는 여러 정상 조직에서 MIG11 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 31b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 31a에서 보듯이 정상 심장, 근육, 비장, 콩팥,간, 태반 및 말초혈액조직에서 약 5 kb의 우점(dominant) MIG 11 mRNA 전사물이 높게 과발현되었다. 이외에도 약 2 kb 의 전사물로도 발현된다.

도 46a는 여러 암세포주들에서 MIG11 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 46b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 46a에서 보듯이, 정상조직들에서 나타나는 약 5 kb의 우점(dominant) MIG11 mRNA 전사물은 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들에서는 발현이 되지 않거나 매우 약하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 MIG11 유전자는 정상 폐, 심장, 근육, 비장, 콩팥, 간, 태반 및 말초혈액조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-15: MIG 15

MIG15 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직 시료 3개, 원발성 자궁경부암 조직 시료 3개 및 자궁경부암 세포주 시료 2개의 총 RNA 20 ㎍을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 실시예 1에서 얻은 MIG15 전장 cDNA를 사용한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42 ℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 17a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 MIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 17b는 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다. 도 17a 및 17b에서, 제1열 내지 제3열은 정상 자궁경부 조직 시료이며, 제4열 내지 제6열은 자궁경부암 조직 시료이고, 제7열은 자궁경부암 세포주 HeLa 시료이며, 제8열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6 시료이다. 도 17a 및 17b에서 보듯이, MIG15 유전자의 발현 수준은 정상 자궁경부 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 자궁경부암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 자궁경부암 세포주 시료 2개에서 발현이 약하였다.

도 32a는 여러 정상 조직에서 MIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 32b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 32a에서 보듯이 심장, 골격근, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 및 말초혈액조직들에서 약 9.5 kb의 우점(dominant) MIG15 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 47a는 여러 암세포주들에서 MIG15 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 47b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 47a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 MIG15 유전자의 발현은 나타나지 않았으며 HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 및 림프아세포 백혈병 MOLT-4 세포주에서는 MIG15 유전자의 발현은 매우 약하였다.

이러한 결과로부터 본 발명의 MIG15 유전자는 정상 자궁경부, 심장, 골격근, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 및 말초혈액조직들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

실시예 4: 발현 벡터의 제작 및 형질 감염

4-1: GIG 1

GIG1 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG1 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG1을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HeLa 자궁경부암 세포주(ATCC CCL-2)에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG1 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하였다.

4-2: GIG 3

GIG3 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG3 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG3를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 A549 폐암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG3 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포를 사용하였다.

4-3: GIG 4

GIG4 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG4 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG4를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 A549 폐암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG4 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포를 사용하였다.

4-4: GIG 5

GIG5 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG5 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG5를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 A549 폐암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG5 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포를 사용하였다.

4-5: GIG 11

GIG11 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG11 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG11을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 MCF-7 유방암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG11 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 MCF-7 세포를 사용하였다.

4-6: MIG 2

MIG2 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 MIG2 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/MIG2를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HeLa 자궁경부암 세포주(ATCC CCL-2)에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 MIG2 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하였다.

4-7: MIG 4

MIG4 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 MIG4 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/MIG4를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HeLa 자궁경부암 세포주(ATCC CCL-2)에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 MIG4 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하였다.

4-8: PIG 13

PIG13 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 PIG13 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/PIG13 을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 A549 폐암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 PIG13 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포를 사용하였다.

4-9: PIG 15

PIG15 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 PIG15 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/PIG15 를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 A549 폐암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 PIG15 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포를 사용하였다.

4-10: PIG 8

PIG8 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 PIG8 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/PIG8을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HeLa 자궁경부암 세포주(ATCC CCL-2)에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 PIG8 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하였다.

4-11: MRG 1

MRG1 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 MRG1 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/MRG1을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HeLa 자궁경부암 세포주(ATCC CCL-2)에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 MRG1 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하였다.

4-12: PIG 22

PIG22 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 PIG22 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/PIG22를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 A549 폐암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 PIG22 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포를 사용하였다.

4-13: MIG 9

MIG9 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 MIG9 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/MIG9을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 A549 폐암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 MIG9 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡 터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포를 사용하였다.

4-14: MIG 11

MIG11 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 MIG11 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/MIG11을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 A549 폐암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 MIG11 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포를 사용하였다.

4-15: MIG 15

MIG15 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 MIG15 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/MIG15를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HeLa 자궁경부암 세포주(ATCC CCL-2)에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 MIG15 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하였다.

실시예 5: 유전자로 형질감염된 세포의 성장 곡선

5-1: GIG 1

GIG1 유전자가 자궁경부암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 GIG1 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1(Invitrogen)으로 형질감염된 HeLa 세포를 각각 RPMI 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclustion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48a는 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 GIG1 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다. 도 48a에서 보듯이, GIG1 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 사멸률은 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포 및 정상 HeLa 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 정상 HeLa 세포와 비교할 때 GIG1으로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG1 유전자는 자궁경부암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-2: GIG3

GIG3 유전자가 폐암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG3로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48b는 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG3로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포의 성장 곡선이다. 도 48b에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG3로 형질감염된 A549 폐암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 A549 세포 및 야생형 A549 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 A549 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG3로 형질감염된 A549 폐암 세포의 약 70%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG3 유전자는 폐암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-3: GIG 4

GIG4 유전자가 폐암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG4로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48c는 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG4로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포의 성장 곡선 이다. 도 48c에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG4로 형질감염된 A549 폐암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 A549 세포 및 야생형 A549 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 A549 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG4로 형질감염된 A549 폐암 세포의 약 70%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG4 유전자는 폐암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-4: GIG 5

GIG5 유전자가 폐암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG5로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48d는 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG5로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포의 성장 곡선이다. 도 48d에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG5로 형질감염된 A549 폐암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 A549 세포 및 야생형 A549 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 A549 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG5로 형질감염된 A549 폐암 세포의 약 70%만이 생존하였다. 이러한 결 과로부터, GIG5 유전자는 폐암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-5: GIG11

GIG11 유전자가 유방암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG11로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48e는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG11로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 48e에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG11로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG11로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG11 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-6: MIG 2

MIG2 유전자가 자궁경부암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 MIG2 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1(Invitrogen)으로 형질감염된 HeLa 세포를 각각 RPMI 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclustion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48f는 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 MIG2 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다. 도 48f에서 보듯이, MIG2 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 사멸률은 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포 및 정상 HeLa 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 정상 HeLa 세포와 비교할 때 GIG1으로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 약 20%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, MIG2 유전자는 자궁경부암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-7: MIG4

MIG4 유전자가 자궁경부암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 MIG4 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1(Invitrogen)으로 형질감염된 HeLa 세포를 각각 RPMI 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclustion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48g는 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 MIG4 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다. 도 48g에서 보듯이, MIG4 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 사멸률은 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포 및 정상 HeLa 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 정상 HeLa 세포와 비교할 때 MIG4로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, MIG4 유전자는 자궁경부암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-8: PIG 13

PIG13 유전자가 폐암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG13으로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48h는 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG13으로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포의 성장 곡선이다. 도 48h에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/PIG13으로 형질감염된 A549 폐암 세 포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 A549 세포 및 야생형 A549 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 A549 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/PIG13으로 형질감염된 A549 폐암 세포의 약 30%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, PIG13 유전자는 폐암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-9: PIG15

PIG15 유전자가 폐암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG15로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48i는 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG15로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포의 성장 곡선이다. 도 48i에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/PIG15로 형질감염된 A549 폐암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 A549 세포 및 야생형 A549 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 A549 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/PIG15로 형질감염된 A549 폐암 세포의 약 30%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, PIG15 유전자는 폐암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-10: PIG 8

PIG8 유전자가 자궁경부암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 PIG8 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1(Invitrogen)으로 형질감염된 HeLa 세포를 각각 RPMI 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclustion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48j는 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 PIG8 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다. 도 48j에서 보듯이, PIG8 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 사멸률은 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포 및 정상 HeLa 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 정상 HeLa 세포와 비교할 때 PIG8로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, PIG8 유전자는 자궁경부암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-11: MRG 1

MRG1 유전자가 자궁경부암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 MRG1 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1(Invitrogen)으로 형질감염된 HeLa 세포를 각각 RPMI 배지 에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclustion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48k는 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 MRG1 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다. 도 48k에서 보듯이, MRG1 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 사멸률은 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포 및 정상 HeLa 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 정상 HeLa 세포와 비교할 때 MRG1으로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 40%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, MRG1 유전자는 자궁경부암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-12: PIG 22

PIG22 유전자가 폐암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG22로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48 l은 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/PIG22로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포의 성장 곡선이다. 도 48 l에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/PIG22로 형질감염된 A549 폐암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 A549 세포 및 야생형 A549 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 A549 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/PIG22로 형질감염된 A549 폐암 세포의 약 40%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, PIG22 유전자는 폐암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-13: MIG 9

MIG9 유전자가 폐암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/MIG9으로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48m은 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/MIG9으로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포의 성장 곡선이다. 도 48m에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/MIG9으로 형질감염된 A549 폐암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 A549 세포 및 야생형 A549 세포의 경우보 다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 A549 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/MIG9으로 형질감염된 A549 폐암 세포의 약 40%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, MIG9 유전자는 폐암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-14: MIG 11

MIG11 유전자가 폐암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/MIG11로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48n은 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/MIG11로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포의 성장 곡선이다. 도 48n에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/MIG11로 형질감염된 A549 폐암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 A549 세포 및 야생형 A549 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 A549 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/MIG11로 형질감염된 A549 폐암 세포의 약 30%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, MIG11 유전자는 폐암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-15: MIG 15

MIG15 유전자가 자궁경부암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 MIG15 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1(Invitrogen)으로 형질감염된 HeLa 세포를 각각 RPMI 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclustion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 48 o는 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 MIG15 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다. 도 48 o에서 보듯이, MIG15 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 사멸률은 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포 및 정상 HeLa 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 정상 HeLa 세포와 비교할 때 MIG15로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 약 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, MIG15 유전자는 자궁경부암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

상기의 구성에서 알 수 있듯이 본 발명의 유전자들은 인간 암의 진단, 예방 등에 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
서열번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 코딩하는 서열번호: 21로 표시되는 인간 암 억제 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암은 정상 폐, 심장, 근육, 콩팥, 자궁, 유방 및 간조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 암인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
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서열번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 포함하는 암 진단용 키트.
서열번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 코딩하는 서열번호: 21로 표시되는 인간 암 억제 유전자를 포함하는 암 진단용 키트.