KR20090042036A

KR20090042036A - 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포

Info

Publication number: KR20090042036A
Application number: KR1020070107905A
Authority: KR
Inventors: 김진우; 김현기
Original assignee: 김현기
Priority date: 2007-10-25
Filing date: 2007-10-25
Publication date: 2009-04-29

Abstract

본 발명은 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 미생물에 관한 것으로, 본 발명의 유전자는 인간 암의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

암 억제 유전자, 암 억제 단백질

Description

인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포{HUMAN CANCER SUPPRESSOR GENE, PROTEIN ENCODED THEREIN, EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME, AND CELL TRANSFORMED BY SAID VECTOR}

본 발명은 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.

암 억제 유전자(tumor suppressor gene) 산물은 정상 세포로부터 암 세포로의 형질전환을 억제하며, 이 기능이 상실되면 세포는 악성 형질전환에 이르게 된다(Klein, G., FASEB J., 7, 821-825 (1993)). 암세포가 암을 형성하기 위해서는 암 억제 유전자의 정상 카피수 기능이 상실되어야 한다. p53 암 억제 유전자의 코딩 서열내 변형이 인간 암에서 가장 일반적인 유전적 변화로 밝혀졌다(Bishop, J.M., Cell, 64, 235-248 (1991); 및 Weinberg, R.A., Science, 254, 1138-1146 (1991)). 그러나 자궁경부암에서 보고된 p53 변이는 2 % 내지 11 %의 범위에 불과하여(Crook, T. et al., Lancet, 339, 1070-1073 (1992); 및 Busby-Earle, R.M.C. et al., Br. j. Cancer, 69, 732-737 (1994)), 자궁경부암 조직의 일부만이 이러한 p53 변이를 보이는 것으로 생각된다.　이에 본 발명자들은, 정상 자궁경부 조직과 자궁경부암 사이에 차별적으로 발현되는 유전자를 보다 효율적으로 나타내는 mRNA 감별 전개법(mRNA differential display(DD) method)을 사용하여, 정상 자궁경부 조직에서 새로운 암 억제 유전자를 분리하고자 예의 연구하였다.　

또한, 간암의 경우에서 특히 아플라톡신 B1 (Aflatoxin B1)에 노출되거나 B 형 간염에 감염되는 빈도가 높은 지역에서 p53 변이는 무려 50% 이상에 이르며 주로 변이는 codon 249 에서 오인변이 (missense mutation)가 특징이다 (Montesano, R. et al ., J. Natl . Cancer Inst., 89, 1844-1851 (1997); Szymanska, K. & Hainaut, P. Acta Biochimica Polonica , 50, 231-238 (2003)). 그러나 미국이나 서부 유럽에서의 간암에서 p53 변이는 30% 정도에 불과하며 변이가 자주 일어나는 핫 스폿 (hot spot)도 없다 (Szymanska, K. & Hainaut, P. Acta Biochimica Polonica , 50, 231-238 (2003)). 이에 본 발명자들은, 정상 간 조직과 간암 사이에 차별적으로 발현되는 유전자를 보다 효율적으로 나타내는 mRNA 감별 전개법(mRNA differential display(DD) method) (Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))을 사용하여, 정상 간조직에서 새로운 암 억제 유전자를 분리하고자 예의 연구하였다.

한편, 유방암에서 보고된 p53 변이는 30%의 범위에 불과하여(Keen, J.C. & Davidson, N. E., Cancer, 97, 825-833 (2003)) 및 Borresen-Dale, A-L., Human Mutation, 21, 292-300 (2003)) 유방암 조직의 일부만이 이러한 p53 변이를 보이는 것으로 생각된다. 이에 본 발명자들은, 정상 유방 조직과 유방암 사이에 차별적으 로 발현되는 유전자를 보다 효율적으로 나타내는 mRNA 감별 전개법(mRNA differential display(DD) method) (Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))을 사용하여, 정상 유방조직에서 새로운 암 억제 유전자를 분리하고자 예의 연구하였다.

본 발명의 목적은 신규한 인간 암 억제 유전자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자에 의해 코딩되는 암 억제 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 데 있다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 6; GIG6로 명명함)를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 3의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 27; GIG27로 명명함)를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 37; GIG37로 명명함)를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 7의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 45; GIG45로 명명함)를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

1. GIG6

본 발명의 GIG6 유전자는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 6으로서, 서열번호: 1의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 EU219623 호로 2007년 10월 14일에 등록되었으며(공개예정일: 2008년 11월 1일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NW_927128.1호인 Homo sapiens chromosome 1 genomic contig, alternate assembly (based on Celera assembly) 유전자와 서열이 유사한 유전자이다. 이유전자의 기능에 대하여서는 아직까지 밝혀진 바가 없다. 그러나, GIG6 유전자는 인간의 각종 암화 과정에 깊이 관련되어 있는 것으로 본 발명자들의 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 자궁암을 포함 한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 아주 약하거나 없는 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG6 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 1의 염기서열에는 염기번호 2386 내지 2598(염기번호 2596-2598은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 또한, 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 GIG6 유전자로부터 발현되는 단백질은 70 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 2의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 8 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴 리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 GIG6 유전자는 서열번호: 1의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 9의 임의 프라이머 H-AP38 (5'-AAGCTTCCAGTGC-3'및 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 315 bp cDNA 단편을 얻고 (2413bp-2727bp 에 해당), 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 혼성화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HeLa 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 GIG6 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 자궁, 심장 및 간에서 과 발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 2.4 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 자궁암 조직 및 자궁암 세포주들의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않거나 약하게 발현이 되며 정상 자궁 조직에서만 높게 차별적으로 발현된다.

본 발명의 GIG6 유전자가 도입된 자궁암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

2. GIG27

본 발명의 GIG27 유전자는 서열번호: 3의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 27로서, 서열번호: 4의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 DQ088979 호로 등록되었으며(공개예정일: 2007년 10월 30일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 NM_001014986호인 Homo sapiens folate hydrolase (prostate-specific membrane antigen) 1 (FOLH1), transcript variant 2 유전자와 제 NM_004476 호인 Homo sapiens folate hydrolase (prostate-specific membrane antigen) 1 (FOLH1), transcript variant 1 유전자와 유전자서열이 유사한 것으로 나타났다. 이유전자의 기능은 아직 알려져 있지 않으나, 이 유전자는 M28 peptidase family 에 속한 type II transmembrane glycoprotein을 encoding 하며 prostate, central and peripheral nervous system 과 신장에서 발현이 되고 있다고 보고되고 있다 (Israeli, R. S. et al ., Cancer Res., 53, 227-30 (1993); Israeli, R. S. et al., Cancer Res., 54, 1807-11 (1994); Troyer, J. K. et al., Int . J. Cancer, 5, 552-8 (1995)).

그러나, 본 발명자들은 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 간 정상조직에서는 발현이 매우 증가된 GIG27 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 3의 염기서열에는 염기번호 124내지 2283(염기번호 2281-2283은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 GIG27 유전자로부터 발현되는 단백질은 719 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 4의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 81 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 3의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 11의 임의 프라이머 H-AP8 (5'-AAGCTTTTACCGC-3' 및 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 356 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 혼성화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다. 본 발명자들은 GIG27 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG27/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 GIG27 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간조직에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 5.0 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 또한 동시에 약 2.0 kb의 mRNA 전사물도 발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 간암 조직 및 간암 세포주 HepG2 등의 암 조직 및 세포에서는 거의 발현되지 않으며 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된다.

본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

3. GIG 37

본 발명의 GIG37 유전자는 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 37로서, 서열번호: 5의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 EU219622 호로 2007년 10월 14일 등록되었으며(공개예정일: 2008년 11월 1일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_021117 호인 Homo sapiens cryptochrome 2 (photolyase-like) (CRY2)와는 서열이 유사한 유전자이다. 이 유전자는 그 기능이 인간의 24시간 주기 (circadian rhythms) 에 관여하는 것으로 알려져 있다 (van der Horst, G.T., et al ., Nature 398, 627-630 (1999)). 그러나 기 보고된 바와는 달리, 본 발명자들은 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 전혀 없는 반면, 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG37 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 5의 염기서열에는 염기번호 9 내지 1790(염기번호 1788-1790은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 GIG37 유전자로부터 발현되는 단백질은 593 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 6의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 67 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 GIG37 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 5의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 12의 임의 프라이머 H-AP29 (5'-AAGCTTAGCAGCA-3'및 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 534 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 혼성화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 MCF-7 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명자들은 GIG37 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG37/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 GIG37 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 심장, 골격근,및 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.5 kb의 mRNA 전사물과 약 4.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 유방암 조직 및 유방암 세포주 MCF-7 등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현된다.

4. GIG45

본 발명의 유전자는 서열번호: 7의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 45로서, 서열번호: 7의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 뗘219621 호로 2007년 10월 14일 등록되었으며(공개예정일: 2008년 11월 1일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_019105 호인 Homo sapiens tenascin XB (TNXB), transcript variant XB 유전자와 서열이 유사한 유전자이다. 이 유전자는 세포외 기질 단백질 (extracellular matrix proteins)인 tenascin family를 coding 하며 비유착성기능 (anti-adhesive effect)를 갖는다고 보고된 것 외에 다른 기능은 알려져 있지 않다 (Egging,D., et al., Arch . Dermatol . Res., 298, 389-396 (2007)). 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 GIG45는 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 본 발명자들에 의하여 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 전혀 없는 반면, 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG45 종양억제 유전자를 발굴하였다.

서열번호: 7의 염기서열에는 염기번호 287 내지 1894(염기번호 1892-1894은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 GIG45 유전자로부터 발현되는 단백질은 535 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 8의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 59 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않 는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 GIG45 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 7의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 13의 임의 프라이머 H-AP32 (5'-AAGCTTCCTGCAA-3'및 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 325 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 혼성화화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

본 발명자들은 GIG45 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG45/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 간 등에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 2.2 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 유방암 조직 및 유방암 세포주 MCF-7 등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현된다.

본 발명의 GIG6 유전자는 인간 암의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

참조예 : 총 RNA 의 분리

신선한 조직 또는 배양된 세포로부터 총 RNA 분리 키트(RNeasy total RNA kit, Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 총 RNA를 분리한 후, 메시지 클린 키트(message clean kit, GenHunter Corp., MA, 미국)를 사용하여 RNA에 오염된 DNA를 제거하였다.

실시예 1: 총 RNA 의 분리 및 mRNA 감별 전개

정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.　 자궁 근종 환자로부터 자궁적출술(hysterectomy) 중에 정상 자궁경부(exocervical) 조직 시료를 얻었으며, 수술적 처치전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 자궁절제술(radical hysterectomy) 중에 원발성 자궁경부암 조직 및 전이성 장골 림프절 조직 시료를 얻었다.　 인간 자궁경부암 세포주로는 CUMC-6(Kim, J.W. et al., Gynecol . Oncol ., 62, 230-240 (1996))을 사용하였다.　 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 9의 5' 13mer 임의 프라이머인 H-AP38(RNAimage primer set 5, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1은 서열번호: 9의 5' 13mer 임의 프라이머 H-AP38과 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1열은 정상 자궁경부 조직이며, 제2열은 자궁경부암 조직이고, 제3열은 전이성 장골 림프절 조직이며, 제4열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6이다.　 도 1에서 보는 바와 같이, 자궁경부암 조직, 전이성 장골 림프절 조직 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6에서는 발현되지 않고 정상 자궁경부 조직에서만 차별적으로 발현된 256 bp cDNA 단편이 확인되었다.　 이 cDNA 단편을 HP116로 명명하였다.　

건조된 겔로부터 HP116 단편인 315 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 CC321a을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. cDNA 단편 CC321a은 서열번호: 14의 염 기서열을 나타내었다.

서열번호: 14의 염기서열을 BLAST 및 FASTA 프로그램을 이용하여 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에서 검색한 결과, 이 데이터베이스에 등록된 제 NW_927128.1호인 Homo sapiens chromosome 1 genomic contig, alternate assembly (based on Celera assembly) 유전자와 서열이 유사한 유전자이다.

실시예 2: cDNA 라이브러리 스크리닝

실시예 1에서 얻은 cDNA 단편 CC321a을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P-표지된 CC321a cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 GIG6의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 1과 같았다. 이 염기서열은 70 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 2와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 8 kDa이었다.

얻어진 GIG6전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/GIG6 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다.　 pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다.　 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다.　 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 2는 pBAD/thio-Topo/GIG6 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 23 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 23 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/GIG6 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 8 kDa의 GIG6 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 2는 GIG6 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이다. 도 2에서 제1열은 엘아라비노즈 에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 엘 아라비노즈에 의해 GIG6 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다

실시예 3: GIG6 유전자의 노던 블랏

GIG6 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직 시료 3개, 원발성 자궁경부암 조직 시료 3개 및 자궁경부암 세포주 시료 2개의 총 RNA 20 ㎍을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다.　 이어서 나일론 막을, 실시예 1에서 얻은 GIG6 전장 cDNA를 사용한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42 ℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다.　 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.　

도 3a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 GIG6 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3b는 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다.　 도 3a 및 3b에서, 제1열 내지 제3열은 정상 자궁경부 조직 시료이며, 제4열 내지 제6열은 자궁경부암 조직 시료이고, 제7열은 자궁경부암 세포주 HeLa 시료이며, 제8열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6 시료이다.　 도 3a 및 3b에서 보듯이, GIG6 유전자의 발현 수준은 정상 자궁경부 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 자궁경부암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 자궁경부암 세포주 시료 2개에서는 나타나지 않았다.　

도 4a는 여러 정상 조직에서 GIG6 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4a에서 보듯이 심장 및 간들에서 약 2.4 kb의 우점(dominant) GIG6 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 5a는 여러 암세포주들에서 GIG6 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG6 유전자의 발현은 전혀 나타나지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG6 유전자는 정상 자궁경부, 심장, 및 간들에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

실시예 4: 발현 벡터의 제작 및 형질 감염

GIG6 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG6 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG6을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HeLa 자궁경부암 세포주(ATCC CCL-2)에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG6 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하였다.

실시예 5: GIG6 유전자로 형질감염된 자궁암 세포의 성장 곡선

GIG6 유전자가 자궁경부암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해,　 1 x 10⁵개의 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 GIG6 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁 경부암 세포 및 pCDNA3.1(Invitrogen)으로 형질감염된 HeLa 세포를 각각 RPMI 배지에서 9일 동안 배양하였다.　 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclustion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 6은 정상 HeLa 세포, 실시예 4에서 얻은 GIG6 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포 및 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다.　 도 6에서 보듯이, GIG6 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 사멸률은 pCDNA3.1으로 형질감염된 HeLa 세포 및 정상 HeLa 세포의 경우보다 높게 나타났다.　 배양 후 9일째에는 정상 HeLa 세포와 비교할 때 GIG6로 형질감염된 HeLa 자궁경부암 세포의 50%만이 생존하였다.　 이러한 결과로부터, GIG6 유전자는 자궁경부암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.　

실시예 6: 간 조직 총 RNA 의 분리 및 mRNA 감별 전개

정상 간 조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

간암 환자로부터 조직 생검(biopsy) 중에 정상 간 및 간암 조직 시료를 얻었으며, 인간 간암 세포주로는 HepG2 (American Type Culture Collection; ATCC Number HB-8065) 간암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머 및 서열번호: 11의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP8(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용한 점을 제외하고는 실시예 1의 방법과 동일하게 RT-PCR을 수행하였다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 7은 서열번호: 11의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP8과 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 7에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 7에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주에서는 발현이 약하거나 거의 발현이 되지 않고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 356 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG27 전장 유전자서열의 2132bp에서부터 2487bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP116로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP116 단편인 356 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP116를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. cDNA 단편 HP116은 서열번호: 15의 염기서열을 나타내었다.

실시예 7: cDNA 라이브러리 스크리닝

실시예 6에서 얻은 cDNA 단편 HP116을 실시예 2의 방법과 유사하게 플라크 혼성화시켜, 인간 암 억제 유전자 GIG27의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 3과 같았다. 이 염기서열은 719 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 4와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 81 kDa이었다. 얻어진 GIG27 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG27/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG27 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 8은 GIG27 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 8에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG27 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 8에서 보듯이, 발현된 GIG27 단백질의 크기는 약 81 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

실시예 3: GIG27 유전자의 노던 블랏

GIG27 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시 하였다.

실시예 6에서 얻은 정상 간 조직 시료 3개, 원발성 간암 조직 시료 3개 및 간암 세포주 HepG2의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG27 전장 cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 혼성화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 9a는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG27 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 9b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 9a 및 9b에서 보듯이, GIG27 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 혼성화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 10a는 여러 정상 조직에서 GIG27 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 10b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 10a에서 보듯이 간 조직에서 약 5.0 kb의 우점(dominant) GIG27 mRNA 전사물이 과발현되었다. 또한 동시에 약 2.0 kb의 GIG27 mRNA 전사물도 발현되었다.

도 11a는 여러 암세포주들에서 GIG27 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 11b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 11a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG27 유전자가 전혀 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG27 유전자는 정상 간조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

실시예 9: 발현 벡터의 제작 및 형질 감염

GIG27 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 7에서 얻은 GIG27 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG27를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HepG2 간암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG27 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HepG2 세포를 사용하였다.

실시예 10: GIG27 유전자로 형질감염된 간암 세포의 성장 곡선

GIG27 유전자가 간암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 HepG2 세포, 실시예 9에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG27로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 12는 야생형 HepG2 세포, 실시예 9에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG27로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 12에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG27로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우 보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG27로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 60%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG27 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

실시예 11: 유방조직 총 RNA 의 분리 및 mRNA 감별 전개

정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

유방암 환자로부터 유방적출술(mastectomy) 중에 정상 유방 조직 시료를 얻었으며, 수술적 처치전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 유방절제술(radical mastectomy) 중에 원발성 유방 암조직 시료를 얻었다. 인간 유방암 세포주로는 MCF-7 (American Type Culture Collection; ATCC Number HTB-22) 유방암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머 및 서열번호: 12의 5' 13mer 임의 프라이머인 H-AP29(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용한 점을 제외하고는 실시예 1의 방법과 동일하게 PCR을 수행하였다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 13은 서열번호: 12의 5' 13mer 임의 프라이머 H-AP29와 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 13에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 13에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주에서는 발현되지 않고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현된 534 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG37 전장 유전자서열의 1755bp에서부터 2288bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC17로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC17 단편인 534 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC17을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. cDNA 단편 FC17은 서열번호: 16의 염기서열을 나타내었다.

서열번호: 16의 염기서열을 BLAST 및 FASTA 프로그램을 이용하여 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에서 검색한 결과, 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_021117 호인 Homo sapiens cryptochrome 2 (photolyase-like) (CRY2)와는 서열이 유사한 유전자이다.

실시예 12: cDNA 라이브러리 스크리닝

실시예 11에서 얻은 cDNA 단편 FC17 를 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal . Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 ³²P- 표지된 FC17 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 암 억제 유전자 GIG37의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 5와 같았다. 이 염기서열은 593 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 6과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 67 kDa이었다.

얻어진 GIG37 전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG37/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG37 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 14는 GIG37 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 14에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG37 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 14에서 보듯이, 발현된 GIG37 단백질의 크기는 약 67 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

실시예 13: GIG37 유전자의 노던 블랏

GIG37 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 11에서 얻은 정상 유방 조직 시료 3개, 원발성 유방암 조직 시료 3개 및 유방암 세포주 MCF-7의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG37 전장 cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 혼성화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 혼성화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 15a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG37 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 15b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다. 도 15a 및 15b에서 보듯이, GIG37 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 유방암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

도 16a는 여러 정상 조직에서 GIG37 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 16b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다. 도 16a에서 보듯이 심장, 골격근, 및 간 조직에서 약 1.5 kb의 우점(dominant) GIG37 mRNA 전사물이 과발현되었으며 동시에 약 4.5 kb의 GIG37 mRNA 전사물도 발현되었다.

도 17a는 여러 암세포주들에서 GIG37 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 17b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다. 도 17a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG37 유전자가 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG37 유전자는 정상 유방, 심장, 골격근, 간 조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

실시예 14: 발현 벡터의 제작 및 형질 감염

GIG37 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 12에서 얻은 GIG37 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG37을 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 MCF-7 유방암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG37 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 MCF-7 세포를 사용하였다.

실시예 15: GIG37 유전자로 형질감염된 유방암 세포의 성장 곡선

GIG37 유전자가 유방암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG37으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 18은 야생형 MCF-7 세포, 실시예 14에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG37으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 18에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG37로 형질감염된 MCF-7 유방 암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG37으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG37 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

실시예 16: 총 RNA 의 분리 및 mRNA 감별 전개

실시예 11과 동일한 방법으로 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 시료를 얻었다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여, 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 13의 5' 13mer 임의 프라이머인 H-AP32(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 11과 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 19는 서열번호: 13의 5' 13mer 임의 프라이머 H-AP32와 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 19에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 19에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주에서는 발현되지 않고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현된 325 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG45 전장 유전자서열의 1612bp에서부터 1936bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC89으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC89 단편인 325 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA 를 용출시킨 후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC89을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. cDNA 단편 FC89는 서열번호: 17의 염기서열을 나타내었다.

서열번호: 17의 염기서열을 BLAST 및 FASTA 프로그램을 이용하여 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에서 검색한 결과, 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_019105호인 Homo sapiens tenascin XB (TNXB), transcript variant XB 유전자와 유전자 서열이 유사한 유전자이며, 이유전자의 기능은 아직 암과 관련하여 밝혀져 있지 않다.

실시예 17: cDNA 라이브러리 스크리닝

실시예 16에서 얻은 cDNA 단편 FC89을 실시예 12와 유사한 방법을 사용하여 표지하여 ³²P-표지된 FC89 cDNA 프로브를 얻고, 실시예 12에서와 유사하게, 인간 암 억제 유전자 GIG45의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 7과 같았다. 이 염기서열은 535 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 8와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량 은 약 59 kDa이었다.

얻어진 GIG45전장 cDNA 클론을 원핵생물 발현용 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG45/pBAD/Thio-Topo로 명명하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG45 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 20은 GIG45 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 20에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 GIG45 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 20에서 보듯이, 발현된 GIG45 단백질의 크기는 약 59 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

실시예 18: GIG45 유전자의 노던 블랏

GIG45 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 16에서 얻은 정상 유방 조직 시료 3개, 원발성 유방암 조직 시료 3개 및 유방암 세포주 MCF-7의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시 스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG45 전장 cDNA의 부분서열인 FC89 cDNA로부터 제조한 ³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 혼성화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 혼성화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 21a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG45 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 21b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 21a 및 21b에서 보듯이, GIG45 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 유방암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

도 22a는 여러 정상 조직에서 GIG45 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노 던 블랏 결과이며 도 22b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다. 도 22a에서 보듯이 간에서 약 2.2 kb의 우점(dominant) GIG12 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 23a는 여러 암세포주들에서 GIG45 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 23b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 23a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG45 유전자가 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG45 유전자는 정상 유방, 간에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

실시예 19: 발현 벡터의 제작 및 형질 감염

GIG45 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 17에서 얻은 GIG45 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG45를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 MCF-7 유방암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG45 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 MCF-7 세포를 사용하였다.

실시예 20: GIG45 유전자로 형질감염된 유방암 세포의 성장 곡선

GIG45 유전자가 유방암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 10⁵개의 야생형 MCF-7 세포, 실시예 19에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG45로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 24는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 19에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG45로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 24에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG45로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG45로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG45 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

도 1은 서열번호: 9의 5' 13mer 임의 프라이머 H-AP38과 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진이다.

도 2는 본 발명의 GIG6 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다.

도 3a는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁암 조직 및 자궁암 세포주에서 GIG6 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 4a는 여러 정상 조직에서 GIG6 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 4b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 5a는 여러 암세포주들에서 GIG6 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 6은 야생형 HeLa 세포, 본 발명의 GIG6 유전자로 형질감염된 HeLa 자궁암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HeLa 세포의 성장 곡선이다.

도 7은 서열번호: 11의 5' 13mer 임의 프라이머 H-AP8과 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진이다.

도 8은 본 발명의 GIG27 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다.

도 9a는 정상 간 조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG27 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 9b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 10a는 여러 정상 조직에서 GIG27 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 10b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 11a는 여러 암세포주들에서 GIG27 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 11b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 12는 야생형 HepG2 간암세포주, 본 발명의 GIG27 유전자로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HepG2 세포의 성장 곡선이다.

도 13은 서열번호: 12의 5' 13mer 임의 프라이머 H-AP29와 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진이다.

도 14는 본 발명의 GIG37 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다.

도 15a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG37 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 15b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 16a는 여러 정상 조직에서 GIG37 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노 던 블랏 결과이며, 도 16b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 17a는 여러 암세포주들에서 GIG37 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 17b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 18은 야생형 MCF-7 세포, 본 발명의 GIG37 유전자로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 MCF-7 세포의 성장 곡선이다.

도 19는 서열번호: 13의 5' 13mer 임의 프라이머 H-AP32와 서열번호: 10의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 보여주는 겔 사진이다.

도 20은 본 발명의 GIG45 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다.

도 21a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG45 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 21b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 22a는 여러 정상 조직에서 GIG45 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 22b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 23a는 여러 암세포주들에서 GIG45 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 23b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 혼성화한 노던 블랏 결과이다.

도 24는 야생형 MCF-7 세포, 본 발명의 GIG45 유전자로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 MCF-7 세포의 성장 곡선이다.

<110> KIM, Hyun-Kee <120> HUMAN CANCER SUPPRESSOR GENE, PROTEIN ENCODED THEREIN, EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME, AND CELL TRANSFORMED BY SAID VECTOR <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2820 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (2386)..(2595) <400> 1 aatattggca gctgagaggt aatcatacat gagatcttag atcaggaagg ggaacatgag 60 acaaaatata tatcactagc tggaaagaga tgtatccttc agtaagctcc tcacgaaaat 120 acctacatca tttgtgttgg ggatgtaggt atagaggctg atataatgat acataaatta 180 ctctagaaaa aatagcccaa aagattgatg agaatgacca gtattacaaa gactaacaat 240 taagataatt ttatactaaa gaatgacaac tcagtgggac agagtagttc agaaacagat 300 gcaaatactc acggaaatta aaagatgata aagatctttt gaagtaatga aatgaaaaat 360 aatttaataa atgacattag taccatggac aagctatttg gggggaaatg ataaaaatgg 420 atgccaacct tgctttttaa ataaaaataa attctgaaat gagcatattt taatgcaata 480 agaaggaata atcacaagac agaatttgat gccttaaata atagtaatac tcatttttac 540 atggagaacg gtctgagtat gacataaaac tcaggatcta tgaaagcata aacattattt 600 gaaaaaagag caactataaa taaagtcgta aaggcaaatg gtaaactggg aaagatatat 660 ttaacaccat aacaaagggc cattttcctt aatctaccaa gtccttatca catcaataag 720 aaataagcca atagaagaac aagtaagtca catgaccaga caattcacgg taaaattaat 780 tcagtgggct tgcaaatttg aaaagacgct cagcctctgt caaagtgaaa gaaatgcaaa 840 ttaaaacaat gaaaaaaaca ctttttacct atcaggtttg caaagtattc acgtttgtta 900 aaacccacag ttggtgaatt gatgggaaaa atcagcattt tcatgactct ggttgggagg 960 ttgaattgac aacaatttta gagaagtttt gtgacaccta tcaaattttt aagtatatat 1020 atcctttgac ctattaattc cactgctagt actttaccta aaggtttact cacaaacaag 1080 cctctgtatg ttcaagaaca ttagctgccc tcacaagcta ggaataatct aaatgatcat 1140 tagtagtgtc ctgattaagt cagttacgat aaatccataa caagtatgca tctgtttgaa 1200 aatgagagaa attcatgtat acagatatgg agagatatat aaattacatt ttaattaaat 1260 tacatttaat ttaaaaaaac aagatcttgg atcagtaatg ataggatcct aattgtgtga 1320 aattatatat acacaataat tcatattttt gatatgctgg aatatgcata acatttttct 1380 ggagggattt attcatagga cactgtgaac aaggattcct acaggggtag gaccatagat 1440 cacaggggaa agaaacttgt ttgcttttca ttttatagac tttactcctg tctgaattat 1500 tgatactatt tctttttacc ataggtattt ttttattttt aaaagcctaa gacagttttt 1560 tccccaccat gttatagaag ataatctgcc ttcagttatt cccacaatta gtataactac 1620 atgcagtgac tgttccctgg cagggaggag agaacagaac atacaggtgg ctgacctgag 1680 ggaattaaag gacagaggtt gagggaagct ctgctgaaac tcgatgttac attttgatcc 1740 actgcctgtt cttgagccat ttatttatag cccaaatctc ttatttgtgt aaagaagttt 1800 ttctgtattt aaaactttat cataaatgat cattaatata gaattgccca tccttcctct 1860 cctttaaaca agtattcttt tatttactaa tttagagagc ttcagacaag attgtcattc 1920 tttagctttt caatattaag cattttgttc tcttcccaac tttcttttta ataaaaaaaa 1980 tcttgagaat aaataactct caaatgaatt gcaggttagt taaaaattgg ggatacataa 2040 tagcttgctg acataaaaat attcactttt cttaggtcaa gattaaattt tcgaaggctt 2100 ggaacttcaa aaagggatgc ttttgatgga gaatgcaggg ggaaaaagct ttcaactcat 2160 ccttccacac atagttgaca gcagagcaaa tcatattgtt catgtgaaaa tcatctgtaa 2220 ttttcaacat ttcctgtcac gattgccgtt ctgaggtgtt tcacatgtga ctttgtggtt 2280 tccacgtgct agtgacctac ttggaggaca cggagtatca gagctgaaag gactctgatg 2340 ttcatggttg ttcatccata aacttaattc ctcaactgga agaaa atg cca tcc 2394 Met Pro Ser 1 cag tta caa atc cac agt ctt gta gat ttt ttt tat ttg tca agt gct 2442 Gln Leu Gln Ile His Ser Leu Val Asp Phe Phe Tyr Leu Ser Ser Ala 5 10 15 tat ata gca ctt ggc tat aaa tgc tat tgt ccc agg cat tgt ctc aag 2490 Tyr Ile Ala Leu Gly Tyr Lys Cys Tyr Cys Pro Arg His Cys Leu Lys 20 25 30 35 agc ttt aca aat att aac tca gta gtc tcc tac caa ctt tct gct gca 2538 Ser Phe Thr Asn Ile Asn Ser Val Val Ser Tyr Gln Leu Ser Ala Ala 40 45 50 ggt tgg cac tgc tat cat tcc cat ttt aca gat gag gaa act gag cta 2586 Gly Trp His Cys Tyr His Ser His Phe Thr Asp Glu Glu Thr Glu Leu 55 60 65 cca aga gtt tgagt aacttgtcat aagtcacaca gttaggaaga ggtgacactc 2640 Pro Arg Val 70 ttcaaccagt actctaagtt acactacctc acagatagta acttcattca tgcttctgtc 2700 attaatttta gtgctatttt tataccaggc actcgttaag gataaggctt gagtaagtac 2760 agtccctgcc ttcatggaat ttgcatggta agcacctttc tagaaattct gctaagctcg 2820 2820 <210> 2 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Ser Gln Leu Gln Ile His Ser Leu Val Asp Phe Phe Tyr Leu 1 5 10 15 Ser Ser Ala Tyr Ile Ala Leu Gly Tyr Lys Cys Tyr Cys Pro Arg His 20 25 30 Cys Leu Lys Ser Phe Thr Asn Ile Asn Ser Val Val Ser Tyr Gln Leu 35 40 45 Ser Ala Ala Gly Trp His Cys Tyr His Ser His Phe Thr Asp Glu Glu 50 55 60 Thr Glu Leu Pro Arg Val 65 70 <210> 3 <211> 2348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (124)..(2280) <400> 3 ggctgataag cgaggcatta gtgagattga gagagacttt accccgccgt ggtggttgga 60 gggcgcgcag tagagcagca gcacaggcgc gggtcccggg aggccggctc tgctcgcgcc 120 gag atg tgg aat ctc ctt cac gaa acc gac tcg gct gtg gcc acc 165 Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr 1 5 10 gcg cgc cgc ccg cgc tgg ctg tgc gct ggg gcg ctg gtg ctg gcg ggt 213 Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly 15 20 25 30 ggc ttc ttt ctc ctc ggc ttc ctc ttc ggg tgg ttt ata aaa tcc tcc 261 Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser 35 40 45 aat gaa gct act aac att act cca aag cat aat atg aaa gca ttt ttg 309 Asn Glu Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu 50 55 60 gat gaa ttg aaa gct gag aac atc aag aag ttc tta tat aat ttt aca 357 Asp Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr 65 70 75 cag ata cca cat tta gca gga aca gaa caa aac ttt cag ctt gca aag 405 Gln Ile Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys 80 85 90 caa att caa tcc cag tgg aaa gaa ttt ggc ctg gat tct gtt gag cta 453 Gln Ile Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu 95 100 105 110 gca cat tat gat gtc ctg ttg tcc tac cca aat aag act cat ccc aac 501 Ala His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn 115 120 125 tac atc tca ata att aat gaa gat gga aat gag att ttc aac aca tca 549 Tyr Ile Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser 130 135 140 tta ttt gaa cca cct cct cca gga tat gaa aat gtt tcg gat att gta 597 Leu Phe Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val 145 150 155 cca cct ttc agt gct ttc tct cct caa gga atg cca gag ggc gat cta 645 Pro Pro Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu 160 165 170 gtg tat gtt aac tat gca cga act gaa gac ttc ttt aaa ttg gaa cgg 693 Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg 175 180 185 190 gac atg aaa gtc aat tgc tct ggg aaa att gta att gcc aga tat ggg 741 Asp Met Lys Val Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly 195 200 205 aaa gtt ttc aga gga aat aag gtt aaa aat gcc cag ctg gca ggg gcc 789 Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala 210 215 220 aaa gga gtc att ctc tac tcc gac cct gct gac tac ttt gct cct ggg 837 Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly 225 230 235 gtg aag tcc tat cca gat ggt tgg aat ctt cct gga ggt ggt gtc cag 885 Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln 240 245 250 cgt gga aat atc cta aat ctg aat ggt gca gga gac cct ctc aca cca 933 Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro 255 260 265 270 ggt tac cca gca aat gaa tat gct tat agg cgt gga att gca gag gct 981 Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala 275 280 285 gtt ggt ctt cca agt att cct gtt cat cca att gga tac tat gat gca 1029 Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala 290 295 300 cag aag ctc cta gaa aaa atg ggt ggc tca gca cca cca gat agc agc 1077 Gln Lys Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser 305 310 315 tgg aga gga agt ctc aaa gtg ccc tac aat gtt gga cct ggc ttt act 1125 Trp Arg Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr 320 325 330 gga aac ttt tct aca caa aaa gtc aag atg cac atc cac tct acc aat 1173 Gly Asn Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn 335 340 345 350 gaa gtg aca aga att tac aat gtg ata ggt act ctc aga gga gca gtg 1221 Glu Val Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val 355 360 365 gaa cca gac aga tat gtc att ctg gga ggt cac cgg gac tca tgg gtg 1269 Glu Pro Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val 370 375 380 ttt ggt ggt att gac cct cag agt gga gca gct gtt gtt cat gaa att 1317 Phe Gly Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile 385 390 395 gtg agg agc ttt gga aca ctg aaa aag gaa ggg tgg aga cct aga aga 1365 Val Arg Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg 400 405 410 aca att ttg ttt gca agc tgg gat gca gaa gaa ttt ggt ctt ctt ggt 1413 Thr Ile Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly 415 420 425 430 tct act gag tgg gca gag gag aat tca aga ctc ctt caa gag cgt ggc 1461 Ser Thr Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly 435 440 445 gtg gct tat att aat gct gac tca tct ata gaa gga aac tac act ctg 1509 Val Ala Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu 450 455 460 aga gtt gat tgt aca ccg ctg atg tac agc ttg gta cac aac cta aca 1557 Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr 465 470 475 aaa gag ctg aaa agc cct gat gaa ggc ttt gaa ggc aaa tct ctt tat 1605 Lys Glu Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr 480 485 490 gaa agt tgg act aaa aaa agt cct tcc cca gag ttc agt ggc atg ccc 1653 Glu Ser Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro 495 500 505 510 agg ata agc aaa ttg gga tct gga aat gat ttt gag gtg ttc ttc caa 1701 Arg Ile Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln 515 520 525 cga ctt gga att gct tca ggc aga gca cgg tat act aaa aat tgg gaa 1749 Arg Leu Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu 530 535 540 aca aac aaa ttc agc ggc tat cca ctg tat cac agt gtc tat gaa aca 1797 Thr Asn Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr 545 550 555 tat gag ttg gtg gaa aag ttt tat gat cca atg ttt aaa tat cac ctc 1845 Tyr Glu Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu 560 565 570 act gtg gcc cag gtt cga gga ggg atg gtg ttt gag cta gcc aat tcc 1893 Thr Val Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser 575 580 585 590 ata gtg ctc cct ttt gat tgt cga gat tat gct gta gtt tta aga aag 1941 Ile Val Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys 595 600 605 tat gct gac aaa atc tac agt att tct atg aaa cat cca cag gaa atg 1989 Tyr Ala Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met 610 615 620 aag aca tac agt gta tca ttt gat tca ctt ttt tct gca gta aag aat 2037 Lys Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn 625 630 635 ttt aca gaa att gct tcc aag ttc agt gag aga ctc cag gac ttt gac 2085 Phe Thr Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp 640 645 650 aaa agc aag cat gtc atc tat gct cca agc agc cac aac aag tat gca 2133 Lys Ser Lys His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala 655 660 665 670 ggg gag tca ttc cca gga att tat gat gct ctg ttt gat att gaa agc 2181 Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser 675 680 685 aaa gtg gac cct tcc aag gcc tgg gga gaa gtg aag aga cag att tat 2229 Lys Val Asp Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr 690 695 700 gtt gca gcc ttc aca gtg cag gca gct gca gag act ttg agt gaa gta 2277 Val Ala Ala Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val 705 710 715 gcc taagaggatt ctttagagaa tccgtattga atttgtgtgg tatgtcactc 2330 Ala agaaagaatc gtaatggg 2348 <210> 4 <211> 719 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg 1 5 10 15 Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe 20 25 30 Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu 35 40 45 Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu 50 55 60 Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile 65 70 75 80 Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile 85 90 95 Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His 100 105 110 Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile 115 120 125 Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe 130 135 140 Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro 145 150 155 160 Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr 165 170 175 Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met 180 185 190 Lys Val Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val 195 200 205 Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly 210 215 220 Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys 225 230 235 240 Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly 245 250 255 Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr 260 265 270 Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly 275 280 285 Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys 290 295 300 Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg 305 310 315 320 Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn 325 330 335 Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val 340 345 350 Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro 355 360 365 Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly 370 375 380 Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg 385 390 395 400 Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile 405 410 415 Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr 420 425 430 Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala 435 440 445 Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val 450 455 460 Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu 465 470 475 480 Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser 485 490 495 Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile 500 505 510 Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu 515 520 525 Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn 530 535 540 Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu 545 550 555 560 Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val 565 570 575 Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val 580 585 590 Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala 595 600 605 Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr 610 615 620 Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr 625 630 635 640 Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser 645 650 655 Lys His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu 660 665 670 Ser Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val 675 680 685 Asp Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala 690 695 700 Ala Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala 705 710 715 <210> 5 <211> 4125 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (9)..(1787) <400> 5 ggacagtc atg gcg gcg act gtg gcg acg gcg gca gct gtg gcc ccg gcg 50 Met Ala Ala Thr Val Ala Thr Ala Ala Ala Val Ala Pro Ala 1 5 10 cca gcg ccc ggc acg gac agc gcc tct tcg gtg cac tgg ttc cgc aaa 98 Pro Ala Pro Gly Thr Asp Ser Ala Ser Ser Val His Trp Phe Arg Lys 15 20 25 30 ggg ctg cga ctc cac gac aac ccg gcg ttg ctg gcg gcc gtg cgc ggg 146 Gly Leu Arg Leu His Asp Asn Pro Ala Leu Leu Ala Ala Val Arg Gly 35 40 45 gcg cgc tgc gtg cgc tgc gtt tac att ctc gac ccg tgg ttc gcg gcc 194 Ala Arg Cys Val Arg Cys Val Tyr Ile Leu Asp Pro Trp Phe Ala Ala 50 55 60 tcc tcc tca gtc ggg atc aac cga tgg agg ttc cta ctt cag tct ctg 242 Ser Ser Ser Val Gly Ile Asn Arg Trp Arg Phe Leu Leu Gln Ser Leu 65 70 75 gaa gat ttg gac aca agt tta agg aaa ctg aac tcc cgc ctg ttt gta 290 Glu Asp Leu Asp Thr Ser Leu Arg Lys Leu Asn Ser Arg Leu Phe Val 80 85 90 gtc cgg gga cag cca gcc gac gtg ttc cca agg ctg ttc aag gaa tgg 338 Val Arg Gly Gln Pro Ala Asp Val Phe Pro Arg Leu Phe Lys Glu Trp 95 100 105 110 gga gtg acc cgc ttg acc ttt gaa tat gac tct gaa ccc ttt ggg aaa 386 Gly Val Thr Arg Leu Thr Phe Glu Tyr Asp Ser Glu Pro Phe Gly Lys 115 120 125 gaa cgg gat gca gcc atc atg aag atg gcc aag gag gct ggt gtg gaa 434 Glu Arg Asp Ala Ala Ile Met Lys Met Ala Lys Glu Ala Gly Val Glu 130 135 140 gta gtg acg gag aat tct cat acc ctc tat gac ctg gac agg atc att 482 Val Val Thr Glu Asn Ser His Thr Leu Tyr Asp Leu Asp Arg Ile Ile 145 150 155 gag ctg aat ggg cag aag cca ccc ctt aca tac aag cgc ttt cag gcc 530 Glu Leu Asn Gly Gln Lys Pro Pro Leu Thr Tyr Lys Arg Phe Gln Ala 160 165 170 atc atc agc cgc atg gag ctg ccc aag aag cca gtg ggc ttg gtg acc 578 Ile Ile Ser Arg Met Glu Leu Pro Lys Lys Pro Val Gly Leu Val Thr 175 180 185 190 agc cag cag atg gag agc tgc agg gcc gag atc cag gag aac cac gac 626 Ser Gln Gln Met Glu Ser Cys Arg Ala Glu Ile Gln Glu Asn His Asp 195 200 205 gag acc tac ggc gtg ccc tcc ctg gag gag ctg ggg ttc ccc act gaa 674 Glu Thr Tyr Gly Val Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gly Phe Pro Thr Glu 210 215 220 gga ctt ggt cca gct gtc tgg cag gga gga gag aca gaa gct ctg gcc 722 Gly Leu Gly Pro Ala Val Trp Gln Gly Gly Glu Thr Glu Ala Leu Ala 225 230 235 cgc ctg gat aag cac ttg gaa cgg aag gcc tgg gtt gcc aac tat gag 770 Arg Leu Asp Lys His Leu Glu Arg Lys Ala Trp Val Ala Asn Tyr Glu 240 245 250 aga ccc cga atg aac gcc aac tcc ctc ctg gcc agc ccc aca ggc ctc 818 Arg Pro Arg Met Asn Ala Asn Ser Leu Leu Ala Ser Pro Thr Gly Leu 255 260 265 270 agc ccc tac ctg cgc ttt ggt tgt ctc tcc tgc cgc ctc ttc tac tac 866 Ser Pro Tyr Leu Arg Phe Gly Cys Leu Ser Cys Arg Leu Phe Tyr Tyr 275 280 285 cgc ctg tgg gac ctg tat aaa aag gtg aag cgg aac agc aca cct ccc 914 Arg Leu Trp Asp Leu Tyr Lys Lys Val Lys Arg Asn Ser Thr Pro Pro 290 295 300 ctc tcc cta ttt ggg caa ctc cta tgg cga gag ttc ttc tac acg gca 962 Leu Ser Leu Phe Gly Gln Leu Leu Trp Arg Glu Phe Phe Tyr Thr Ala 305 310 315 gct acc aac aac ccc agg ttt gac cgc atg gag ggg aac ccc atc tgc 1010 Ala Thr Asn Asn Pro Arg Phe Asp Arg Met Glu Gly Asn Pro Ile Cys 320 325 330 atc cag atc ccc tgg gac cgc aat cct gag gcc ctg gcc aag tgg gct 1058 Ile Gln Ile Pro Trp Asp Arg Asn Pro Glu Ala Leu Ala Lys Trp Ala 335 340 345 350 gag ggc aag aca ggc ttc cct tgg att gat gcc atc atg acc caa ctg 1106 Glu Gly Lys Thr Gly Phe Pro Trp Ile Asp Ala Ile Met Thr Gln Leu 355 360 365 agg cag gag ggc tgg atc cac cac ctg gcc cgg cat gcc gtg gcc tgc 1154 Arg Gln Glu Gly Trp Ile His His Leu Ala Arg His Ala Val Ala Cys 370 375 380 ttc ctg acc cgc ggg gac ctc tgg gtc agc tgg gag agc ggg gtc cgg 1202 Phe Leu Thr Arg Gly Asp Leu Trp Val Ser Trp Glu Ser Gly Val Arg 385 390 395 gta ttt gat gag ctg ctc ctg gat gca gat ttc agc gtg aac gca ggc 1250 Val Phe Asp Glu Leu Leu Leu Asp Ala Asp Phe Ser Val Asn Ala Gly 400 405 410 agc tgg atg tgg ctg tcc tgc agt gct ttc ttc cag cag ttc ttc cac 1298 Ser Trp Met Trp Leu Ser Cys Ser Ala Phe Phe Gln Gln Phe Phe His 415 420 425 430 tgc tac tgc cct gtg ggc ttt ggc cgt cgc acg gac ccc agt ggg gac 1346 Cys Tyr Cys Pro Val Gly Phe Gly Arg Arg Thr Asp Pro Ser Gly Asp 435 440 445 tac atc agg cga tac ctg ccc aaa ttg aaa gcg ttc ccc tct cga tac 1394 Tyr Ile Arg Arg Tyr Leu Pro Lys Leu Lys Ala Phe Pro Ser Arg Tyr 450 455 460 atc tat gag ccc tgg aat gcc cca gag tca att cag aag gca gcc aag 1442 Ile Tyr Glu Pro Trp Asn Ala Pro Glu Ser Ile Gln Lys Ala Ala Lys 465 470 475 tgc atc att ggt gtg gac tac cca cgg ccc atc gtc aac cat gcc gag 1490 Cys Ile Ile Gly Val Asp Tyr Pro Arg Pro Ile Val Asn His Ala Glu 480 485 490 acc agc cgg ctt aac att gaa cga atg aag cag att tac cag cag ctt 1538 Thr Ser Arg Leu Asn Ile Glu Arg Met Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Leu 495 500 505 510 tcg cgc tac cgg gga ctc tgt cta ctg gca tct gtc cct tcc tgt gtg 1586 Ser Arg Tyr Arg Gly Leu Cys Leu Leu Ala Ser Val Pro Ser Cys Val 515 520 525 gaa gac ctc agt cac cct gtg gca gag ccc agc tcg agc cag gct ggc 1634 Glu Asp Leu Ser His Pro Val Ala Glu Pro Ser Ser Ser Gln Ala Gly 530 535 540 agc atg agc agt gca ggc cca aga cca cta ccc agt ggc cca gca tcc 1682 Ser Met Ser Ser Ala Gly Pro Arg Pro Leu Pro Ser Gly Pro Ala Ser 545 550 555 ccc aaa cgc aag ctg gaa gca gcc gag gaa cca cct ggt gaa gaa ctc 1730 Pro Lys Arg Lys Leu Glu Ala Ala Glu Glu Pro Pro Gly Glu Glu Leu 560 565 570 agc aaa cgg gcc cgg gtg gca gag ttg cca acc cca gag ctg ccg agc 1778 Ser Lys Arg Ala Arg Val Ala Glu Leu Pro Thr Pro Glu Leu Pro Ser 575 580 585 590 aag gat gcc tga gactgcagag cccttgctcc gtgagcaaag cctgggtgcc 1830 Lys Asp Ala caagcagcca ccgcagcagc agagtacaac ctgcagagaa gctgatcacc gggcagagat 1890 agagcgagca tgtgtgtgtg tgtgcgcgtg tgcagaggag ggagtggtgt gcctgtttgt 1950 gtgtgcatgc atctgttgac actcatgatt ctgaatgttg cctgggctgg gggagtacct 2010 gtagcacgcc agtgctgttt cccggcctcc agacacaagg ctcgaggtta tggcagtgac 2070 tttcagctga gacctgttcc tgcaagccag ctgccttgtc tgaacagaac gtagtggtag 2130 gaccctagct gggattctgg catctgcctc cctagacctc cttccctccc tcctcacgtc 2190 aggctgtgga gcaggagcac agcagttctg gctgttgtcc aaagcatggg attctggagg 2250 cagccagagc cctgctgagt tcctgctttc tgacctggag gctgagcagg ccggagtgga 2310 tggatgctgt ccagacgtag ccacctggcc tctgtttctt attttaaaat tctctgctac 2370 tgggctcagt cccaggccct tccttgggct tctgggactg agcatgaggc catagacaga 2430 tctaaaaagt ttccaccacc ctacagaagt acacacagat acctgactgg tgtggggtat 2490 gcctggtact gtaataggag cctaagacag cacacctacc ttttcaggat ttagaaccta 2550 aaattagaaa gagaatccca gctgtcattg ttccttcccc agaagctaag agccagcctc 2610 agagcctacc caggagctgt gaaggggcaa gggtcaaact gactcactct accaggagga 2670 gaccaggttg cagtggcgta aggccccctg gtttctctgg ccacactcca aggcaccaca 2730 gtgctgccag tgaggacagc tgacacccag ccagggaaac cattctagtc tttattctgt 2790 tggcttccag ggcctgtcct ggacttgtca gcatccagac tgccatgtca gctatcccag 2850 tagctgagct ccaaggactc aggcagaggg actcagggat ggggactgcc aggggcagtt 2910 ggcaaaagtc caagtagaga ttacacccag cacaccattc cttccaggag cagtaggtgg 2970 gaggtttgac ccagagaagc caatccttgc attccaggag tggcctgtgc ctcccacctc 3030 ttccttccca ctgccaaagg cctgtgttga gaaagatgtc atgcaaaagg acgacggtgg 3090 ccaactaaag caagtcttcc ttccaccctg tggcctgcac ttgagccaca aagtgtgtgt 3150 gtgtgtgtgc gtgtgtggta cgtgtgtgtg tgtgtggcta tgaggctgat tcctgtttgg 3210 atttttgtcc tcacgtgtat cattaagctg gcctttgggc cttttccttt ctacctcccc 3270 tgtgaccttt cctagcctca gatctgttaa ttcttttggc cccagccctg tccctcactg 3330 tcctctgtcc ttggaccaga accctggggt cagacccatc tcctgtagct gtccatcaca 3390 ctgacaggct tcttcctgag atatcctcag gttttctcag ccagagagct gcctttagag 3450 tccaactgtt gtacgtatgt caccttcact agaaatgtcc catcatcgtg ggaggggagc 3510 agggcacagg ggatggtgtg cattcagagc attgggttgg gggcttccct gttccctcag 3570 ccccagtcga gaggaaagag aatcgggcca ctgccagaaa gagagtcaag caaacctgga 3630 agggcaaatc tgagagtggg aaggccaaag gccgaggccc agatttagta ttcactagca 3690 gcgccttcgg gtagcaggat gattcctttt cctgcctgtc tgctgctggc tctcttccct 3750 aaggtacagg ttggcaggac cacctccgcc tacttctcca ccatccctag cttgtcagcc 3810 cgttcccaga tcaacctgcc agtggagtca ggcagtgcac tcctggagcc aagagggaag 3870 ggcagggtag agagggtatg tccagtagcc tggagctcca tggtggcttc atgcctccct 3930 tctcccagct caggtggccc tgagggctcc ctcggaacag tgcctcaaat cctgacccaa 3990 gggccagcat ggggaagaga tggttgcagg caaaatgcac tttatagaga ttttctattg 4050 ctgggaaggt gtgtttctcc cacaatttgt ttgtgaatat tcacttgttt tataaatgtc 4110 tgacctgtct tgagg 4125 <210> 6 <211> 593 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Ala Thr Val Ala Thr Ala Ala Ala Val Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Gly Thr Asp Ser Ala Ser Ser Val His Trp Phe Arg Lys Gly Leu 20 25 30 Arg Leu His Asp Asn Pro Ala Leu Leu Ala Ala Val Arg Gly Ala Arg 35 40 45 Cys Val Arg Cys Val Tyr Ile Leu Asp Pro Trp Phe Ala Ala Ser Ser 50 55 60 Ser Val Gly Ile Asn Arg Trp Arg Phe Leu Leu Gln Ser Leu Glu Asp 65 70 75 80 Leu Asp Thr Ser Leu Arg Lys Leu Asn Ser Arg Leu Phe Val Val Arg 85 90 95 Gly Gln Pro Ala Asp Val Phe Pro Arg Leu Phe Lys Glu Trp Gly Val 100 105 110 Thr Arg Leu Thr Phe Glu Tyr Asp Ser Glu Pro Phe Gly Lys Glu Arg 115 120 125 Asp Ala Ala Ile Met Lys Met Ala Lys Glu Ala Gly Val Glu Val Val 130 135 140 Thr Glu Asn Ser His Thr Leu Tyr Asp Leu Asp Arg Ile Ile Glu Leu 145 150 155 160 Asn Gly Gln Lys Pro Pro Leu Thr Tyr Lys Arg Phe Gln Ala Ile Ile 165 170 175 Ser Arg Met Glu Leu Pro Lys Lys Pro Val Gly Leu Val Thr Ser Gln 180 185 190 Gln Met Glu Ser Cys Arg Ala Glu Ile Gln Glu Asn His Asp Glu Thr 195 200 205 Tyr Gly Val Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gly Phe Pro Thr Glu Gly Leu 210 215 220 Gly Pro Ala Val Trp Gln Gly Gly Glu Thr Glu Ala Leu Ala Arg Leu 225 230 235 240 Asp Lys His Leu Glu Arg Lys Ala Trp Val Ala Asn Tyr Glu Arg Pro 245 250 255 Arg Met Asn Ala Asn Ser Leu Leu Ala Ser Pro Thr Gly Leu Ser Pro 260 265 270 Tyr Leu Arg Phe Gly Cys Leu Ser Cys Arg Leu Phe Tyr Tyr Arg Leu 275 280 285 Trp Asp Leu Tyr Lys Lys Val Lys Arg Asn Ser Thr Pro Pro Leu Ser 290 295 300 Leu Phe Gly Gln Leu Leu Trp Arg Glu Phe Phe Tyr Thr Ala Ala Thr 305 310 315 320 Asn Asn Pro Arg Phe Asp Arg Met Glu Gly Asn Pro Ile Cys Ile Gln 325 330 335 Ile Pro Trp Asp Arg Asn Pro Glu Ala Leu Ala Lys Trp Ala Glu Gly 340 345 350 Lys Thr Gly Phe Pro Trp Ile Asp Ala Ile Met Thr Gln Leu Arg Gln 355 360 365 Glu Gly Trp Ile His His Leu Ala Arg His Ala Val Ala Cys Phe Leu 370 375 380 Thr Arg Gly Asp Leu Trp Val Ser Trp Glu Ser Gly Val Arg Val Phe 385 390 395 400 Asp Glu Leu Leu Leu Asp Ala Asp Phe Ser Val Asn Ala Gly Ser Trp 405 410 415 Met Trp Leu Ser Cys Ser Ala Phe Phe Gln Gln Phe Phe His Cys Tyr 420 425 430 Cys Pro Val Gly Phe Gly Arg Arg Thr Asp Pro Ser Gly Asp Tyr Ile 435 440 445 Arg Arg Tyr Leu Pro Lys Leu Lys Ala Phe Pro Ser Arg Tyr Ile Tyr 450 455 460 Glu Pro Trp Asn Ala Pro Glu Ser Ile Gln Lys Ala Ala Lys Cys Ile 465 470 475 480 Ile Gly Val Asp Tyr Pro Arg Pro Ile Val Asn His Ala Glu Thr Ser 485 490 495 Arg Leu Asn Ile Glu Arg Met Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Leu Ser Arg 500 505 510 Tyr Arg Gly Leu Cys Leu Leu Ala Ser Val Pro Ser Cys Val Glu Asp 515 520 525 Leu Ser His Pro Val Ala Glu Pro Ser Ser Ser Gln Ala Gly Ser Met 530 535 540 Ser Ser Ala Gly Pro Arg Pro Leu Pro Ser Gly Pro Ala Ser Pro Lys 545 550 555 560 Arg Lys Leu Glu Ala Ala Glu Glu Pro Pro Gly Glu Glu Leu Ser Lys 565 570 575 Arg Ala Arg Val Ala Glu Leu Pro Thr Pro Glu Leu Pro Ser Lys Asp 580 585 590 Ala <210> 7 <211> 2010 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (287)..(1891) <400> 7 ggagcccagc accccctaca ggttcctcct ctatggcctc catgaaggga agcgcctggg 60 gcccctctca gctgagggca ccacagggct ggctcctgct ggtcagacct cagaggagtc 120 aaggccccgc ctgtcccagc tgtctgtgac tgacgtgacc accagttcac tgaggctcaa 180 ctgggaggcc ccaccggggg ccttcgactc cttcctgctc cgctttgggg ttccatcacc 240 aagcactctg gagccgcatc cgcgtccact gctgcagcgc gagctg atg gtg ccg 295 Met Val Pro 1 ggg acg cgg cac tcg gcc gtg ctc cgg gac ctg cgt tcc ggg act ctg 343 Gly Thr Arg His Ser Ala Val Leu Arg Asp Leu Arg Ser Gly Thr Leu 5 10 15 tac agc ctg aca ctg tat ggg ctg cga gga ccc cac aag gcc gac agc 391 Tyr Ser Leu Thr Leu Tyr Gly Leu Arg Gly Pro His Lys Ala Asp Ser 20 25 30 35 atc cag gga acc gcc cgc acc ctc agc cca gtt ctg gag agc ccc cgt 439 Ile Gln Gly Thr Ala Arg Thr Leu Ser Pro Val Leu Glu Ser Pro Arg 40 45 50 gac ctc caa ttc agt gaa atc agg gag acc tca gcc aag gtc aac tgg 487 Asp Leu Gln Phe Ser Glu Ile Arg Glu Thr Ser Ala Lys Val Asn Trp 55 60 65 atg ccc cca cca tcc cgg gcg gac agc ttc aaa gtc tcc tac cag ctg 535 Met Pro Pro Pro Ser Arg Ala Asp Ser Phe Lys Val Ser Tyr Gln Leu 70 75 80 gcg gac gga ggg gag cct cag agt gtg cag gtg gat ggc cag gcc cgg 583 Ala Asp Gly Gly Glu Pro Gln Ser Val Gln Val Asp Gly Gln Ala Arg 85 90 95 acc cag aaa ctc cag ggg ctg atc cca ggc gct cgc tat gag gtg acc 631 Thr Gln Lys Leu Gln Gly Leu Ile Pro Gly Ala Arg Tyr Glu Val Thr 100 105 110 115 gtg gtc tcg gtc cga ggc ttt gag gag agt gag cct ctc aca ggc ttc 679 Val Val Ser Val Arg Gly Phe Glu Glu Ser Glu Pro Leu Thr Gly Phe 120 125 130 ctc acc acg gtt cct gac ggt ccc aca cag ttg cgt gca ctg aac ttg 727 Leu Thr Thr Val Pro Asp Gly Pro Thr Gln Leu Arg Ala Leu Asn Leu 135 140 145 acc gag gga ttc gcc gtg ctg cac tgg aag ccc ccc cag aat cct gtg 775 Thr Glu Gly Phe Ala Val Leu His Trp Lys Pro Pro Gln Asn Pro Val 150 155 160 gac acc tat gac gtc cag gtc aca gcc cct ggg gcc ccg cct ctg cag 823 Asp Thr Tyr Asp Val Gln Val Thr Ala Pro Gly Ala Pro Pro Leu Gln 165 170 175 gcg gag acc cca ggc agc gcg gtg gac tac ccc ctg cat gac ctt gtc 871 Ala Glu Thr Pro Gly Ser Ala Val Asp Tyr Pro Leu His Asp Leu Val 180 185 190 195 ctc cac acc aac tac acc gcc aca gtg cgt ggc ctg cgg ggc ccc aac 919 Leu His Thr Asn Tyr Thr Ala Thr Val Arg Gly Leu Arg Gly Pro Asn 200 205 210 ctc act tcc cca gcc agc atc acc ttc acc aca ggg cta gag gcc cct 967 Leu Thr Ser Pro Ala Ser Ile Thr Phe Thr Thr Gly Leu Glu Ala Pro 215 220 225 cgg gac ttg gag gcc aag gaa gtg acc ccc cgc acc gcc ctg ctc act 1015 Arg Asp Leu Glu Ala Lys Glu Val Thr Pro Arg Thr Ala Leu Leu Thr 230 235 240 tgg act gag ccc cca gtc cgg ccc gca ggc tac ctg ctc agc ttc cac 1063 Trp Thr Glu Pro Pro Val Arg Pro Ala Gly Tyr Leu Leu Ser Phe His 245 250 255 acc cct ggt gga cag aac cag gag atc ctg ctc cca gga ggg atc aca 1111 Thr Pro Gly Gly Gln Asn Gln Glu Ile Leu Leu Pro Gly Gly Ile Thr 260 265 270 275 tct cac cag ctc ctt ggc ctc ttt ccc tcc acc tcc tac aat gca cgg 1159 Ser His Gln Leu Leu Gly Leu Phe Pro Ser Thr Ser Tyr Asn Ala Arg 280 285 290 ctc cag gcc atg tgg ggc cag agc ctc ctg ccg ccc gtg tcc acc tct 1207 Leu Gln Ala Met Trp Gly Gln Ser Leu Leu Pro Pro Val Ser Thr Ser 295 300 305 ttc acc acg ggt ggg ctg cgg atc ccc ttc ccc agg gac tgc ggg gag 1255 Phe Thr Thr Gly Gly Leu Arg Ile Pro Phe Pro Arg Asp Cys Gly Glu 310 315 320 gag atg cag aac gga gcc ggt gcc tcc agg acc agc acc atc ttc ctc 1303 Glu Met Gln Asn Gly Ala Gly Ala Ser Arg Thr Ser Thr Ile Phe Leu 325 330 335 aac ggc aac cgc gag cgg ccc ctg aac gtg ttt tgc gac atg gag act 1351 Asn Gly Asn Arg Glu Arg Pro Leu Asn Val Phe Cys Asp Met Glu Thr 340 345 350 355 gat ggg ggc ggc tgg ctg gtg ttc cag cgc cgc atg gat gga cag aca 1399 Asp Gly Gly Gly Trp Leu Val Phe Gln Arg Arg Met Asp Gly Gln Thr 360 365 370 gac ttc tgg agg gac tgg gag gac tat gcc cat ggt ttt ggg aac atc 1447 Asp Phe Trp Arg Asp Trp Glu Asp Tyr Ala His Gly Phe Gly Asn Ile 375 380 385 tct gga gag ttc tgg ctg ggc aat gag gcc ctg cac agc ctg aca cag 1495 Ser Gly Glu Phe Trp Leu Gly Asn Glu Ala Leu His Ser Leu Thr Gln 390 395 400 gca ggt gac tac tcc atg cgc gtg gac ctg cgg gct ggg gac gag gct 1543 Ala Gly Asp Tyr Ser Met Arg Val Asp Leu Arg Ala Gly Asp Glu Ala 405 410 415 gtg ttc gcc cag tac gac tcc ttc cac gta gac tcg gct gcg gag tac 1591 Val Phe Ala Gln Tyr Asp Ser Phe His Val Asp Ser Ala Ala Glu Tyr 420 425 430 435 tac cgc ctc cac ttg gag ggc tac cac ggc acc gca ggg gac tcc atg 1639 Tyr Arg Leu His Leu Glu Gly Tyr His Gly Thr Ala Gly Asp Ser Met 440 445 450 agc tac cac agc ggc agt gtc ttc tct gcc cgt gat cgg gac ccc aac 1687 Ser Tyr His Ser Gly Ser Val Phe Ser Ala Arg Asp Arg Asp Pro Asn 455 460 465 agc ttg ctc atc tcc tgc gct gtc tcc tac cga ggg gcc tgg tgg tac 1735 Ser Leu Leu Ile Ser Cys Ala Val Ser Tyr Arg Gly Ala Trp Trp Tyr 470 475 480 agg aac tgc cac tac gcc aac ctc aac ggg ctc tac ggg agc aca gtg 1783 Arg Asn Cys His Tyr Ala Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Gly Ser Thr Val 485 490 495 gac cat cag gga gtg agc tgg tac cac tgg aag ggc ttc gag ttc tcg 1831 Asp His Gln Gly Val Ser Trp Tyr His Trp Lys Gly Phe Glu Phe Ser 500 505 510 515 gtg ccc ttc acg gaa atg aag ctg aga cca aga aac ttt cgc tcc cca 1879 Val Pro Phe Thr Glu Met Lys Leu Arg Pro Arg Asn Phe Arg Ser Pro 520 525 530 gcg ggg gga ggc tgagctgct gcccacctct ctcgcacccc agtatgactg 1930 Ala Gly Gly Gly 535 ccgagcactg aggggtcgcc ccgagagaag agccagggtc cttcaccacc cagccgctgg 1990 aggaagcctt ctctgccagc 2010 <210> 8 <211> 535 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Val Pro Gly Thr Arg His Ser Ala Val Leu Arg Asp Leu Arg Ser 1 5 10 15 Gly Thr Leu Tyr Ser Leu Thr Leu Tyr Gly Leu Arg Gly Pro His Lys 20 25 30 Ala Asp Ser Ile Gln Gly Thr Ala Arg Thr Leu Ser Pro Val Leu Glu 35 40 45 Ser Pro Arg Asp Leu Gln Phe Ser Glu Ile Arg Glu Thr Ser Ala Lys 50 55 60 Val Asn Trp Met Pro Pro Pro Ser Arg Ala Asp Ser Phe Lys Val Ser 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Ala Asp Gly Gly Glu Pro Gln Ser Val Gln Val Asp Gly 85 90 95 Gln Ala Arg Thr Gln Lys Leu Gln Gly Leu Ile Pro Gly Ala Arg Tyr 100 105 110 Glu Val Thr Val Val Ser Val Arg Gly Phe Glu Glu Ser Glu Pro Leu 115 120 125 Thr Gly Phe Leu Thr Thr Val Pro Asp Gly Pro Thr Gln Leu Arg Ala 130 135 140 Leu Asn Leu Thr Glu Gly Phe Ala Val Leu His Trp Lys Pro Pro Gln 145 150 155 160 Asn Pro Val Asp Thr Tyr Asp Val Gln Val Thr Ala Pro Gly Ala Pro 165 170 175 Pro Leu Gln Ala Glu Thr Pro Gly Ser Ala Val Asp Tyr Pro Leu His 180 185 190 Asp Leu Val Leu His Thr Asn Tyr Thr Ala Thr Val Arg Gly Leu Arg 195 200 205 Gly Pro Asn Leu Thr Ser Pro Ala Ser Ile Thr Phe Thr Thr Gly Leu 210 215 220 Glu Ala Pro Arg Asp Leu Glu Ala Lys Glu Val Thr Pro Arg Thr Ala 225 230 235 240 Leu Leu Thr Trp Thr Glu Pro Pro Val Arg Pro Ala Gly Tyr Leu Leu 245 250 255 Ser Phe His Thr Pro Gly Gly Gln Asn Gln Glu Ile Leu Leu Pro Gly 260 265 270 Gly Ile Thr Ser His Gln Leu Leu Gly Leu Phe Pro Ser Thr Ser Tyr 275 280 285 Asn Ala Arg Leu Gln Ala Met Trp Gly Gln Ser Leu Leu Pro Pro Val 290 295 300 Ser Thr Ser Phe Thr Thr Gly Gly Leu Arg Ile Pro Phe Pro Arg Asp 305 310 315 320 Cys Gly Glu Glu Met Gln Asn Gly Ala Gly Ala Ser Arg Thr Ser Thr 325 330 335 Ile Phe Leu Asn Gly Asn Arg Glu Arg Pro Leu Asn Val Phe Cys Asp 340 345 350 Met Glu Thr Asp Gly Gly Gly Trp Leu Val Phe Gln Arg Arg Met Asp 355 360 365 Gly Gln Thr Asp Phe Trp Arg Asp Trp Glu Asp Tyr Ala His Gly Phe 370 375 380 Gly Asn Ile Ser Gly Glu Phe Trp Leu Gly Asn Glu Ala Leu His Ser 385 390 395 400 Leu Thr Gln Ala Gly Asp Tyr Ser Met Arg Val Asp Leu Arg Ala Gly 405 410 415 Asp Glu Ala Val Phe Ala Gln Tyr Asp Ser Phe His Val Asp Ser Ala 420 425 430 Ala Glu Tyr Tyr Arg Leu His Leu Glu Gly Tyr His Gly Thr Ala Gly 435 440 445 Asp Ser Met Ser Tyr His Ser Gly Ser Val Phe Ser Ala Arg Asp Arg 450 455 460 Asp Pro Asn Ser Leu Leu Ile Ser Cys Ala Val Ser Tyr Arg Gly Ala 465 470 475 480 Trp Trp Tyr Arg Asn Cys His Tyr Ala Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Gly 485 490 495 Ser Thr Val Asp His Gln Gly Val Ser Trp Tyr His Trp Lys Gly Phe 500 505 510 Glu Phe Ser Val Pro Phe Thr Glu Met Lys Leu Arg Pro Arg Asn Phe 515 520 525 Arg Ser Pro Ala Gly Gly Gly 530 535 <210> 9 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aagcttccag tgc 13 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anchored oligo-dT primer <400> 10 aagctttttt tttttg 16 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer H-AP8 <400> 11 aagcttttac cgc 13 <210> 12 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer H-AP29 <400> 12 aagcttagca gca 13 <210> 13 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer H-AP32 <400> 13 aagcttcctg caa 13 <210> 14 <211> 315 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cttgtagatt ttttttattt gtcaagtgct tatatagcac ttggctataa atgctattgt 60 cccaggcatt gtctcaagag ctttacaaat attaactcag tagtctccta ccaactttct 120 gctgcaggtt ggcactgcta tcattcccat tttacagatg aggaaactga gctaccaaga 180 gtttgagtaa cttgtcataa gtcacacagt taggaagagg tgacactctt caaccagtac 240 tctaagttac actacctcac agatagtaac ttcattcatg cttctgtcat taattttagt 300 gctattttta tacca 315 <210> 15 <211> 217 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 caggggagtc attcccagga atttatgatg ctctgtttga tattgaaagc aaagtggacc 60 cttccaaggc ctggggagaa gtgaagagac agatttatgt tgcagccttc acagtgcagg 120 cagctgcaga gactttgagt gaagtagcct aagaggattc tttagagaat ccgtattgaa 180 tttgtgtggt atgtcactca gaaagaatcg taatggg 217 <210> 16 <211> 534 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ttgccaaccc cagagctgcc gagcaaggat gcctgagact gcagagccct tgctccgtga 60 gcaaagcctg ggtgcccaag cagccaccgc agcagcagag tacaacctgc agagaagctg 120 atcaccgggc agagatagag cgagcatgtg tgtgtgtgtg cgcgtgtgca gaggagggag 180 tggtgtgcct gtttgtgtgt gcatgcatct gttgacactc atgattctga atgttgcctg 240 ggctggggga gtacctgtag cacgccagtg ctgtttcccg gcctccagac acaaggctcg 300 aggttatggc agtgactttc agctgagacc tgttcctgca agccagctgc cttgtctgaa 360 cagaacgtag tggtaggacc ctagctggga ttctggcatc tgcctcccta gacctccttc 420 cctccctcct cacgtcaggc tgtggagcag gagcacagca gttctggctg ttgtccaaag 480 catgggattc tggaggcagc cagagccctg ctgagttcct gctttctgac ctgg 534 <210> 17 <211> 325 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ctaccacggc accgcagggg actccatgag ctaccacagc ggcagtgtct tctctgcccg 60 tgatcgggac cccaacagct tgctcatctc ctgcgctgtc tcctaccgag gggcctggtg 120 gtacaggaac tgccactacg ccaacctcaa cgggctctac gggagcacag tggaccatca 180 gggagtgagc tggtaccact ggaagggctt cgagttctcg gtgcccttca cggaaatgaa 240 gctgagacca agaaactttc gctccccagc ggggggaggc tgagctgctg cccacctctc 300 tcgcacccca gtatgactgc cgagc 325

Claims

서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5 및 서열번호: 7로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자.
제 1 항의 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질.
제 2 항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 및 서열번호: 8로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인간 암 억제 단백질.
제 1 항의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
제 4 항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 5 항에 있어서, 숙주세포는 미생물 또는 동물세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 1 항에 있어서, 유전자는 서열번호: 1의 염기서열을 가지며, 상기 암은 자궁, 뇌, 심장, 골격근, 비장, 콩팥, 간, 태반, 폐 및 말초백혈구 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인간 암 억제 유전자.
제 1 항에 있어서, 유전자는 서열번호: 3의 염기서열을 가지며, 상기 암은 간암, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암, 피부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인간 암 억제 유전자.
제 1 항에 있어서, 유전자는 서열번호: 5 또는 서열번호: 7의 염기서열을 가지며, 상기 암은 유방, 심장, 골격근, 신장, 폐, 대장, 소장, 간, 태반, 흉선 및 비장 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인간 암 억제 유전자.