KR20060090785A - 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 미생물에 관한 것으로, 본 발명의 유전자는 인간 암의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포{HUMAN CANCER SUPPRESSOR GENE, PROTEIN ENCODED THEREIN, EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME, AND CELL TRANSFORMED BY SAID VECTOR}

도 1a는 서열번호: 3의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP32와 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과; 1b는 서열번호7의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP7과 서열번호: 8의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과; 1c는 서열번호11의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP45와 서열번호: 12의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과; 1d는 서열번호15의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP40과 서열번호: 16의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과;1e는 서열번호19의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP30과 서열번호: 20의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과;1f는 서열번호23의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP40과 서열번호: 24의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과;1g는 서열번호 27의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP29와 서열번호: 28의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과; 및 1h는 서열번호 31의 5’ 13mer 임의 프라이머 H-AP32와 서열번호: 32의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과를 각각 보여주는 겔 사진을 나타낸다.

도 2a는 GIG12, 2b는 GIG17, 2c는 GIG19, 2d는 GIG20, 2e는 GIG22, 2f는 GIG25, 2g는 GIG36 및 2h는 GIG2의 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다.

도 3a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG12 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이며; 4a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG17 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 4b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과;5a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG19 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 5b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 6a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG20 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 6b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 7a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG22 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 7b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 8a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG25 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 8b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 9a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG36 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 9b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이며, 도 10a는 정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주에서 GIG2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 10b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 11a는 여러 정상 조직에서 GIG12 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 11b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 12는 여러 정상 조직에서 GIG17 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 12b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 13a는 여러 정상 조직에서 GIG19 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 13b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 14a는 여러 정상 조직에서 GIG20 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 14b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 15a는 여러 정상 조직에서 GIG22 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 15b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 16a는 여러 정상 조직에서 GIG25 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 16b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 도 17a는 여러 정상 조직에서 GIG36 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 17b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이며 도 18a는 여러 정상 조직에서 GIG 2유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 18b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 19a는 여러 암세포주들에서 GIG12 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 19b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과;20a는 여러 암세포주들에서 GIG17 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 20b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 21a는 여러 암세포주들에서 GIG19 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 21b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 22a는 여러 암세포주들에서 GIG20 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 22b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 23a는 여러 암세포주들에서 GIG22 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 23b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 24a는 여러 암세포주들에서 GIG25 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 24b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과; 25a는 여러 암세포주들에서 GIG36 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 도 25b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이며 도 26a는 여러 암세포주들에서 GIG2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 26b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.

도 27은 야생형 MCF-7 세포, GIG12의 유전자로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 MCF-7 세포의 성장 곡선(a); 야생형 HepG2 간암세포주, GIG17 유전자로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HepG2 세포의 성장 곡선(b);야생형 HepG2 간암세포주, GIG19 유전자로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HepG2 세포의 성장 곡선(c); 야생형 HepG2 간암세포주, GIG20 유전자로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HepG2 세포의 성장 곡선(d); 야생형 HepG2 간암세포주, GIG22 유전자로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HepG2 세포의 성장 곡선(e); 야생형 HepG2 간암세포주, GIG25 유전자로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HepG2 세포의 성장 곡선(f); 야생형 HepG2 간암세포주, GIG36 유전자로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HepG2 세포의 성장 곡선(g); 야생형A549 폐암세포주, GIG 2 유전자로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포의 성장 곡선(h)이다.

본 발명은 인간 암 억제 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.

암 억제 유전자(tumor suppressor gene) 산물은 정상 세포로부터 암 세포로의 형질전환을 억제하며, 이 기능이 상실되면 세포는 악성 형질전환에 이르게 된다(Klein, G., FASEB J., 7, 821-825 (1993)). 암세포가 암을 형성하기 위해서는 암 억제 유전자의 정상 카피수 기능이 상실되어야 한다. p53 암 억제 유전자의 코 딩 서열내 변형이 인간 암에서 가장 일반적인 유전적 변화로 밝혀졌다(Bishop, J.M., Cell, 64, 235-248 (1991); 및 Weinberg, R.A., Science, 254, 1138-1146 (1991)).

그러나 유방암에서 보고된 p53 변이는 30%의 범위에 불과하여(Keen, J.C. & Davidson, N. E., Cancer, 97, 825-833 (2003)) 및 Borresen-Dale, A-L., Human Mutation, 21, 292-300 (2003)) 유방암 조직의 일부만이 이러한 p53 변이를 보이는 것으로 생각된다.

간암의 경우에서 특히 아플라톡신 B1 (Aflatoxin B1)에 노출되거나 B 형 간염에 감염되는 빈도가 높은 지역에서 p53 변이는 무려 50% 이상에 이르며 주로 변이는 codon 249 에서 오인변이 (missense mutation)가 특징이다 (Montesano, R. et al., J. Natl . Cancer Inst., 89, 1844-1851 (1997); Szymanska, K. & Hainaut, P. Acta Biochimica Polonica , 50, 231-238 (2003)). 그러나 미국이나 서부 유럽에서의 간암에서 p53 변이는 30% 정도에 불과하며 변이가 자주 일어나는 핫 스폿 (hot spot)도 없다 (Szymanska, K. & Hainaut, P. Acta Biochimica Polonica , 50, 231-238 (2003)).

이에 본 발명자들은, 정상 유방 조직과 유방암 사이 또는 정상 간조직과 간암 사이에 차별적으로 발현되는 유전자를 보다 효율적으로 나타내는 mRNA 감별 전개법(mRNA differential display(DD) method) (Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))을 사용하여, 정상 유방조직에서 새로운 암 억제 유전자를 분리하고자 예의 연구하였다.

본 발명의 목적은 신규한 인간 암 억제 유전자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자에 의해 코딩되는 암 억제 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 데 있다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 12; GIG12로 명명함)를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 GIG12 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또 본 발명에서는 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 17; GIG17로 명명함)를 제공한다.

본 발명에서는 상기 GIG17 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또 본 발명에서는 서열번호: 9의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 19; GIG19로 명명함)를 제공한다.

본 발명에서는 상기 GIG19 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또 본 발명에서는 서열번호: 13의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 20; GIG20로 명명함)를 제공한다.

본 발명에서는 상기 GIG20 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또 본 발명에서는 서열번호: 17의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 22; GIG22로 명명함)를 제공한다.

본 발명에서는 상기 GIG22 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또 본 발명에서는 서열번호: 21의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 25; GIG25로 명명함)를 제공한다.

본 발명에서는 상기 GIG25 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또 본 발명에서는 서열번호: 25의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 36; GIG36로 명명함)를 제공한다.

본 발명에서는 상기 GIG36 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호: 26의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

또 본 발명에서는 서열번호: 29의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자(growth-inhibiting gene 2; GIG2로 명명함)를 제공한다.

본 발명에서는 상기 GIG 2 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호: 30의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

1. GIG12

본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 36(GIG36)으로서, 서열번호: 1의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY493417 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 1일) 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_002343 호인 lactotransferrin 과는 서열이 일부 일치하는 유전자이다. lactotransferrin 은 주로 유즙과 혈청에 많이 분포하고 있으며 그기능은 제2 철분 (ferric-ion)의 운반체로만 알려져있다 (Kanyshkova, G.T., et al., Biochemistry ( Moscow ), 66, 1-7 (2001)). 동시에 lactotransferrin 은 강한 항박테리아 작용을 갖는것으로만 알려져있다 (Oppenheimer, J.S. J. Nutr., 131, 6165-6335 (2001); Shugars, C.D., et al., Gerontology, 47, 246-253 (2001)).

그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 lactotransferrin 은 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG12 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 1의 염기서열에는 염기번호 111 내지 2246(염기번호 2244-2246은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 711 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 2의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 78 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩 티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 3의 임의 프라이머 H-AP32 (5'AAGCTTCCTGCAA-3'및 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'AAGCTTTTTTTTTTTC-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 680 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 MCF-7 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명자들은 GIG12 전장 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG12/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 5월 24일자 기탁번호 KCTC 10642BP로 기탁하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 유방, 폐, 흉선, 간, 골격근, 신장, 비장, 심장, 태반, 및 말초혈액들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 2.4 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 유방암 조직 및 유방암 세포주 MCF-7 등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현된다.

본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

2. GIG17

본 발명의 유전자는 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 17(GIG17)으로서, 서열번호: 5의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY544122 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 M19922 호인 Human fructose 1,6-bisphosphatase 와는 서열이 3 base pair 부위에서 서로 다른 다형성 (polymorphism)을 가지고 있는 유전자이다.

당질대사에서 가장 중요한 작용은 fructose 1,6-bisphosphate 가 fructose-6-phosphate 로 가수분해되는 것이다 (Marcus, F. et al., Arch . Biol . Med . Exp ., 20, 371-378 (1987); Okar, D,A. & Lange, A.J. Biofactors, 10, 1-14 (1999)). 이 반응을 촉매화하는 효소가 human fructose 1,6-bisphosphatase 로서 모든 살아있는 생물에 존재한다.

그러나 기 보고된 당질대사와는 달리 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG17 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 5의 염기서열에는 염기번호 88내지 1104(염기번호 1102-1104)는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 338 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 6의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 37 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 5의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 7의 임의 프라이머 H-AP7 (5'AAGCTTAACGAGG-3'및 서열번호: 8의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'AAGCTTTTTTTTTTTG-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 250 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명자들은 GIG17 전장 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG17/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자 기탁번호 KCTC 10655BP로 기탁하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간, 신장, 비장 및 폐조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.3 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 간암 조직 및 간암 세포주 HepG2 등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된다.

본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

3. GIG19

본 발명의 유전자는 서열번호: 9의 염기서열을 갖는 인간 세포 증식 억제 유전자 19(GIG19)으로서, 서열번호: 9의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY544123 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 기존에 데이터베이스에 등록된 제 BC041593 호인 Homo sapiens alpha-1-microglobulin/bikunin precursor 과 제 X04225 호인 Human mRNA for protein HC (alpha-1-microglobulin) 들과 서열이 일치하는 유전자이다. alpha-1-microglobulin 은 HC 단백질로도 불리우며 면역억제능을 지닌 지질 단백질이다 (Akerstrom, B. et al., Biochimica Biophysica Acta, 1482, 172-184 (2002); Xu, S. & Venge, P., Biochimica Biophysica Acta, 1482, 298-307 (2002)). 그러나 기 보고된 기능과는 달리 금번 연구 결과 간암에서는 발현이 전무하고 반면에 여러 간 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG19 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 9의 염기서열에는 염기번호 61내지 1119(염기번호 59-61은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 352 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 10의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 39 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 9의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 11의 임의 프라이머 H-AP40 (5'AAGCTTGTCAGCC-3'및 서열번호: 12의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'AAGCTTTTTTTTTTTC-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 281 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명자들은 GIG19전장 cDNA를 발현벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG19/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자 기탁번호 KCTC 10656BP로 기탁하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.2 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 간암 조직 및 간암 세포주 HepG2 등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된다.

본 발명의 유전자가 도입된 간암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

4. GIG20

본 발명의 유전자는 서열번호: 13의 염기서열을 갖는 인간 세포 증식 억제 유전자 20(GIG20)으로서, 서열번호: 13의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅 크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY544124 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 기존에 데이터베이스에 등록된 제 BC041789 호인 Homo sapiens albumin과 서열이 일치하는 유전자이다. Albumin 은 영양공급을 담당하는 단백질로 알려져있다 (Grant, J.P., Ann . Surg., 220, 610-616 (1994)). 그러나 기 보고된 기능과는 달리 금번 연구 결과 간암에서는 발현이 전무하고 반면에 여러 간 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG20 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다. 종양억제 유전자라는 근거로는 정상 간세포는 알부민이라는 단백질을 만드는데 이유는 간세포 안의 핵 속에 알부민 유전자가 있기 때문이다. 정상 간세포라면 알부민 유전자가 정상으로 일을 잘하는 세포라야 하는데 알부민 수치가 정상 이하로 낮다면 간세포의 알부민 유전자가 정상으로 일하지 못하든지 정상 알부민 유전자 (정상 간세포) 숫자가 너무 많이 줄었기 때문일 것으로 간암일 경우에 발생할 수 있는 상황이다.

서열번호: 13의 염기서열에는 염기번호 8내지 1261 (염기번호 1259-1261은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으 로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 417 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 14의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 47 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 13의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 15의 임의 프라이머 H-AP40 (5'AAGCTTGTCAGCC-3'및 서열번호: 16의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'AAGCTTTTTTTTTTTC-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포 주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 256 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명자들은 GIG20전장 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG20/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자 기탁번호 KCTC 10657BP로 기탁하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 2.4 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 간암 조직 및 간암 세포주 HepG2 등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된다.

본 발명의 유전자가 도입된 간암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

5. GIG22

본 발명의 유전자는 서열번호: 17의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 22(GIG22)로서, 서열번호: 17의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY512565 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 5월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 AF126743 호인 Homo sapiens DNAJ domain-containing protein MCJ 서열과 일부 유전자 및 아미노산 서열이 다른 유전자로 Homo sapiens DNAJ domain-containing protein MCJ 유전자는 난소암에서 발현이 감소된다는 보고는 있지만 (Shridhar, V. et al., Cancer Res., 61, 4258-4265 (2001)), 달리 금번 연구 결과 간암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG22 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 17의 염기서열에는 염기번호 95내지 547(염기번호 545-547은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 150 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 18의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 16 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 17의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 19의 임의 프라이머 H-AP30 (5'AAGCTTCGTACGT-3' 및 서열번호: 20의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'AAGCTTTTTTTTTTTC-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 281 bp cDNA 단 편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명자들은 GIG22 전장 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG22/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자 기탁번호 KCTC 10658BP로 기탁하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 심장, 근육, 간, 신장, 태반, 비장, 폐, 대장, 소장, 비장, 흉선 및 백혈구 조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 0.6 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 간암 조직 및 간암 세포주 HepG2 등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된다.

본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

6. GIG25

본 발명의 유전자는 서열번호: 21의 염기서열을 갖는 인간 세포 증식 억제 유전자 25(GIG25)로서, 서열번호: 21의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY513276 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 기존에 데이터베이스에 등록된 제 BC0110530 호인 Homo sapiens serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3 유전자와 유전자 서열이 일부 다른 유전자이다. Alpha-1 antitrypsin 은 serine (or cysteine) proteinase inhibitor의 전형적인 성분 (member) 으로 급성기 단백질 (acute phase protein)로 알려져 있으며 염증반응시 3-4배 정도 증가한다 (Morgan, K., & Kalsherker, N.A., Int. J. Biochem . Cell Biol., 29, 1501-1511 (1997)). 그러나 기 보고된 기능과는 달리 금번 연구 결과 간암에서는 발현이 전무하고 반면에 여러 간 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG25 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 21의 염기서열에는 염기번호 436내지 1299(염기번호 434-436은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루 어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 287 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 22의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 33 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 21의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 23의 임의 프라이머 H-AP40 (5'AAGCTTGTCAGCC-3'및 서열 번호: 24의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'AAGCTTTTTTTTTTTC-3'를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 250 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 HepG2 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명자들은 GIG25장 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG25/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자 기탁번호 KCTC 10659BP로 기탁하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.5 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 간암 조직 및 간암 세포주 HepG2 등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된다.

본 발명의 유전자가 도입된 간암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

7. GIG36

본 발명의 유전자는 서열번호: 25의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 36(GIG36)으로서, 서열번호: 25의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY542304 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 이 데이터베이스에 등록된 제 M58549 호인 matrix Gla protein 과는 서열이 일치하며 제 BC005272호인 matrix Gla protein 과는 아미노산이 하나가 다른 유전자이다. matrix Gla protein 은 주로 혈관의 평활근세포 (Shanahan, C.M., et al., Crit . Rev . Eukaryot Gene Express., 8, 357-375 (1998)) 와 연골세포 (Hale, J.E., et al., J. Biol . Chem., 263, 5820-5824 (1988))에서 분비되는 단백질로 이의 기능은 mineralization 을 억제하는 것으로 보고되고 있다 (Luo, G., et al., Nature, 386, 78-81 (1997); Price, P.A., et al., Arterioscler . Thromb. Vasc . Biol ., 18, 1400-1407 (1998); Price, P.A., et al., Arterioscler . Thromb. Vasc . Biol ., 20, 317-327 (2000). 또한 난소암 (Colleen, D., et al., Cancer Res., 61, 3869-3876 (2001)) 과 유방암 (Chen, L., et al., Oncogene, 5, 1391-1395 (1990))을 포함한 일부암에서 matrix Gla 유전자 발현이 증가하였다는 보고는 있다. 그러나 기 보고된 바와는 달리 금번 연구 결과 유방암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 전무하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG36 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 25의 염기서열에는 염기번호 12 내지 323(염기번호 321-323은 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 103 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 26의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 12 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상 동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 25의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 27의 임의 프라이머 H-AP29 (5'AAGCTTAGCAGCA-3'및 서열번호: 28의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'AAGCTTTTTTTTTTTC-3'사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 182 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 MCF-7 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명자들은 GIG36 전장 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α /GIG36/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 5월 24일자 기탁번호 KCTC 10643BP로 기탁하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 간, 신장, 비장 및 폐조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암 및 피부암에서도 발현이 억제되어 암발생으,ㄹ 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.3 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 간암 조직 및 간암 세포주 HepG2 등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된다.

본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

8. GIG 2

본 발명의 유전자는 서열번호: 29의 염기서열을 갖는 인간 암 억제 유전자 2(GIG2)로서, 서열번호: 29의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423720 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 이 등록된 유전자는 데이터베이스에 등록된 제 X60111 호인 Homo sapiens mRNA for motility-related protein (MRP-1) 및 NM_001769호인 Homo sapiens CD9 antigen (p24) (CD9) 유전자와 서열이 일치하는 유전자로 즉 제 X60111 호인 Homo sapiens mRNA for motility-related protein (MRP-1) 유전자는 세포의 이동과 관계가 있다고 보고되고 있다 (Miyake, M., et al., J. Exp . Med., 174, 1347-1354 (1991)). 또한 NM_001769호인 Homo sapiens CD9 antigen (p24) (CD9) 유전자도 유방암 (Sauer, G. et al., Oncol . Rep., 10, 405-410 (2003)) 과 폐암 (Funakoshi, T. et al., Oncogene, 22, 674-687 (2003)).에서 세포의 이동 및 침습능에 관여한다고 보고되고 있다.

그러나 기 보고된 세포의 이동과 침습능과는 달리 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 오히려 발현이 낮거나 전무하고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG2 종양억제 유전자를 발굴하게 되었다.

서열번호: 29의 염기서열에는 염기번호 18내지 704(염기번호 702-704는 종료코돈임)에 해당하는 하나의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자로부터 발현되는 단백질은 228 개 아미노산 잔기로 이루어져 있고 서열번호: 30의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 25 kDa이다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 유전자 및 단백질은 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 29의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크리닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 31의 임의 프라이머 H-AP32 (5'-AAGCTTCTTGCAA-3')및 서열번호: 32의 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer) (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG-3')를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는240 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다.

이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 A549 세포주 등에 도입시킴으로써 상기 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명자들은 GIG2 전장 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG2/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 5월 31일자 기탁번호 제 KCTC 10641BP 호로 기탁하였다.

본 발명의 유전자는 정상 조직, 바람직하게는 뇌, 심장, 근육, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 백혈구조직들에서 과발현되어 발암을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 급성 백혈병 (HL-60 세포주) 과 악성림프종 (RaJi 암세포주)에서는 발현이 전무하여 그결과 암을 유도하는 것으로 보이고 그외 자궁암, 만성백혈병, 대장암, 폐암 및 피부암에서도 발현이 저하되어 암발생을 유도하는 것으로 보인다. 이 조직들에서 본 발명의 유전자는 대부분이 약 1.3 kb의 mRNA 전사물로 과발현된다. 특히, 본 발명의 유전자는 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는데, 예를 들어 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)등의 암 조직 및 세포에서는 발현되지 않으며 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현된다.

본 발명의 유전자가 도입된 암 세포주는 높은 사멸률을 보이므로, 본 발명의 유전자는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

참조예: 총 RNA의 분리

신선한 조직 또는 배양된 세포로부터 총 RNA 분리 키트(RNeasy total RNA kit, Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 총 RNA를 분리한 후, 메시지 클린 키트(message clean kit, GenHunter Corp., MA, 미국)를 사용하여 RNA에 오염된 DNA를 제거하였다.

실시예 1: 총 RNA의 분리 및 mRNA 감별 전개

1-1. GIG12

정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

유방암 환자로부터 유방적출술(mastectomy) 중에 정상 유방 조직 시료를 얻었으며, 수술적 처치 전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 유방절제술(radical mastectomy) 중에 원발성 유방 암조직 시료를 얻었다. 인간 유방암 세포주로는 MCF-7 (American Type Culture Collection; ATCC Number HTB-22) 유방암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조 예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 3의 5'13mer 임의 프라이머인 H-AP32(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1a는 서열번호: 3의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP32와 서열번호: 4의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현되지 않고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현된 680 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG12 전장 유전자서열의 1614bp에서부터 2283bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC26으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC5 단편인 680 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC26을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 본 염기서열을 BLAST 및 FASTA 프로그램을 이용하여 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에서 검색한 결과, 이 데이터베이스에 등록된 제 M58549 호인 matrix Gla protein 및 제 BC005272호인 matrix Gla protein 과 유전자 서열이 일치하는 유전자이다.

1-2. GIG17

정상 간 조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

간암 환자로부터 조직 생검(biopsy) 중에 정상 간 및 간암 조직 시료를 얻었으며, 인간 간암 세포주로는 HepG2 (American Type Culture Collection; ATCC Number HB-8065) 간암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 8의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 7의 5'13mer 임의 프라이머인 H-AP7(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1b는 서열번호: 7의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP7과 서열번호: 8의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1b에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1b에서 보듯이, 간암 조직에서는 발현이 아주 약하고 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 250 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG17 전장 유전자서열의 721bp에서부터 970bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP24로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP24 단편인 250 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC5를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 본 염기서열을 BLAST 및 FASTA 프로그램을 이용하여 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에서 검색한 결과, 이 데이터베이스에 등록된 제 M19922 호인 Human fructose 1,6-bisphosphatase 와는 서열이 일치하는 유전자이다.

1-3. GIG19

정상 간 조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

간암 환자로부터 조직 생검(biopsy) 중에 정상 간 및 간암 조직 시료를 얻었으며, 인간 간암 세포주로는 HepG2 (American Type Culture Collection; ATCC Number HB-8065) 간암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 12의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 11의 5'13mer 임의 프라이머인 H-AP40 (RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1c는 서열번호: 11의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP40과 서열번호: 12의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1c에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1c에서 보듯이, 간암 조직 및 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 281 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG19 전장 유전자서열의 781bp에서부터 1061bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP48으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP48 단편인 281 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC5를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 본 염기서열을 BLAST 및 FASTA 프로그램을 이용하여 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에서 검색한 결과, 기존에 데이터베이스에 등록된 제 BC041593 호인 Homo sapiens alpha-1-microglobulin/bikunin precursor 과 제 X04225 호인 Human mRNA for protein HC (alpha-1-microglobulin) 들과 서열이 일치하는 유전자이다.

1-4. GIG20

정상 간 조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

간암 환자로부터 조직 생검(biopsy) 중에 정상 간 및 간암 조직 시료를 얻었으며, 인간 간암 세포주로는 HepG2 (American Type Culture Collection; ATCC Number HB-8065) 간암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 16의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 15의 5'13mer 임의 프라이머인 H-AP40 (RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1d는 서열번호: 15의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP40과 서열번호: 16의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1d에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1d에서 보듯이, 간암 조직 및 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 256 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG19 전장 유전자서열의 776bp에서부터 1031bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP50으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP50 단편인 256 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA 를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP50을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 본 염기서열을 BLAST 및 FASTA 프로그램을 이용하여 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에서 검색한 결과, 기존에 데이터베이스에 등록된 제 BC041789 호인 Homo sapiens albumin과 서열이 일치하는 유전자이다.

1-5. GIG22

정상 간 조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

간암 환자로부터 조직 생검(biopsy) 중에 정상 간 및 간암 조직 시료를 얻었으며, 인간 간암 세포주로는 HepG2 (American Type Culture Collection; ATCC Number HB-8065) 간암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 20의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 19의 5'13mer 임의 프라이머인 H-AP30(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1e는 서열번호: 19의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP30과 서열번호: 20의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1e에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1e에서 보듯이, 간암 조직과 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 281 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG22 전장 유전자서열의 262bp에서부터 542bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP59로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP59 단편인 281 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP59를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

1-6. GIG25

정상 간 조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

간암 환자로부터 조직 생검(biopsy) 중에 정상 간 및 간암 조직 시료를 얻었으며, 인간 간암 세포주로는 HepG2 (American Type Culture Collection; ATCC Number HB-8065) 간암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 24의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 23의 5'13mer 임의 프라이머인 H-AP40 (RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)을 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1f는 서열번호: 23의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP40과 서열번호: 24의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 간 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 간암 조직이고, 제7열은 간암 세포주 HepG2이다. 도 1f에서 보듯이, 간암 조직 및 간암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 간 조직에서만 차별적으로 발현된 250 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG25 전장 유전자서열의 1201bp에서부터 1450bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 HP74로 명명하였다.

건조된 겔로부터 HP74 단편인 250 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 HP74를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 본 염기서열을 BLAST 및 FASTA 프로그램을 이용하여 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에서 검색한 결과, 기존에 데이터베이스에 등록된 제 BC0110530 호인 Homo sapiens serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3 유전자와 유전자 서열이 일부 다른 유전자이다.

1-7. GIG36

정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

유방암 환자로부터 유방적출술(mastectomy) 중에 정상 유방 조직 시료를 얻었으며, 수술적 처치전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 유방절 제술(radical mastectomy) 중에 원발성 유방 암조직 시료를 얻었다. 인간 유방암 세포주로는 MCF-7 (American Type Culture Collection; ATCC Number HTB-22) 유방암세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 28의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 27의 5'13mer 임의 프라이머인 H-AP29(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1g는 서열번호: 27의 5'13mer 임의 프라이머 H-AP29와 서열번호: 28의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제1, 제2, 제3열은 정상 유방 조직이며, 제 4, 제5, 제6열은 유방암 조직이고, 제7열은 유방암 세포주 MCF-7이다. 도 1g에서 보듯이, 유방암 조직 및 유방암 세포주 에서는 발현되지 않고 정상 유방 조직에서만 차별적으로 발현된 182 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG36 전 장 유전자서열의 183bp에서부터 364bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 FC5로 명명하였다.

건조된 겔로부터 FC5 단편인 182 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 FC5를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 본 염기서열을 BLAST 및 FASTA 프로그램을 이용하여 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에서 검색한 결과, 이 데이터베이스에 등록된 제 M58549 호인 matrix Gla protein 및 제 BC005272호인 matrix Gla protein 과 유전자 서열이 일치하는 유전자이다.

1-8. GIG 2

정상 폐 조직, 원발성 폐암 조직, 폐암 전이 조직 및 폐암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다. 폐암 환자로부터 수술 중에 정상 폐조직, 폐암 조직 및 폐암 전이조직 시료를 얻었으며, 인간 폐암 세포주로는 A549 (American Type Culture Collection; ATCC Number CCL-185) 와 NCI-H358 (American Type Culture Collection; ATCC Number CRL-5807) 폐암 세포주를 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967-971 (1992); 및 Liang, P. et al., Cancer Res ., 52, 6966-6968 (1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2 ㎍의 총 RNA를 서열번호: 32의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, GenHunter)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 서열번호: 31의 5‘13mer 임의 프라이머인 H-AP32(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, 미국)를 사용하여 0.5mM [α-35S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmol)의 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 40 초, 40 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 40 초로 이루어진 반응을 모두 40 회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 동안 반응시켰다. 증폭된 단편을 6 % 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오 그래피하였다.

도 1h는 서열번호: 31의 5’13mer 임의 프라이머 H-AP32와 서열번호: 32의 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1h에서 제1, 제2, 제3열은 정상 폐 조직이며, 제 4, 제5열은 폐암 조직이고, 제 6, 제7열은 폐암전이조직이고 제8열은 폐암 세포주 A549이고 제9열은 폐암 세포주 NCI-H358이다. 도 1h에서 보듯이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 에서는 발현이 되지 않고 정상 폐 조직에서만 차별적으로 발현된 240 bp cDNA 단편이 확인되었다 (GIG2 전장 유전자서열의 371bp에서부터 610bp 까지 임). 이 cDNA 단편을 L933으로 명명하였다.

건조된 겔로부터 L933 단편인 240 bp 밴드를 잘라내고 15 분 동안 끓여 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S]-표지된 dATP 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다. 재증폭된 cDNA 단편 L933을 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.

실시예 2: cDNA 라이브러리 스크리닝

실시예 1-1에서 얻은 cDNA 단편 FC26, 1-2에서 얻은 HP24, 1-3에서 얻은 HP48, 1-4에서 얻은 HP50, 1-5에서 얻은 HP59, 1-6에서 얻은 HP74, 또는 1-7에서 얻은 FC5 또는 1-8에서 얻은 L933을 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal. Biochem ., 132, 6-13 (1983))의 방법에 따라 표지하여 32P-표지된 cDNA 프로브를 얻고, 이를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989))와 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 각각 인간 암 억제 유전자 GIG12, 17, 19, 20, 22, 25, 36 또는 2의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 각각 서열번호: 1(GIG 12), 5(GIG 17), 9(GIG 19), 13(GIG 20), 17(GIG 22), 21(GIG 25), 25(GIG 36) 및 29(GIG 2)와 같았다.

GIG12 염기서열은 711 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포 함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 2와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 78 kDa이었다.

또한 GIG17 염기서열은 338 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 6와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 37 kDa이었다.

또 GIG19 염기서열은 352 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 10과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 39 kDa이었다.

또 GIG20 염기서열은 417 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 14와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 47 kDa이었다.

또 GIG22 염기서열은 150 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 18과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 16 kDa이었다.

또 GIG25 염기서열은 287 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 22와 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 33 kDa이었다.

또 GIG36 염기서열은 103 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 26과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 12 kDa이었다.

또 GIG2 염기서열은 228 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 30과 같다. 또한 유추된 단백질의 분자량은 약 25 kDa이었다.

얻어진 각각의 GIG 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG12/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 5월 24일자 기탁번호 KCTC 10642BP(GIG 12)로 기탁하였으며; 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG17/pcDNA3.1(GIG 17)로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자 기탁번호 KCTC 10655BP로 기탁하였으며; 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG19/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자 기탁번호 KCTC 10656BP(GIG 19)로 기탁하였으며; 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG20/pcDNA3.1 로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자 기탁번호 KCTC 10657BP(GIG 20)로 기탁하였으며; 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG22/pcDNA3.1 로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자 기탁번호 KCTC 10658BP(GIG 22)로 기탁하였으며; 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG25/pcDNA3.1 로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 6월 14일자 기탁번호 KCTC 10659BP(GIG 25)로 기탁하였으며; 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG36/pcDNA3.1 로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 5월 24일자 기탁번호 KCTC 10643BP(GIG 36)로 기탁하였으며; GIG2 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1(Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/GIG2/pcDNA3.1로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2004년 5월 31일자 기탁번호 제 KCTC 10641 BP(GIG2)로 기탁하였다.

형질전환된 대장균을 LB 브로쓰에서 배양한 후 0.2 M의 엘-아라비노즈 (L-arabinose, Sigma, USA)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 GIG36 유전자를 발현시켰다. 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory mannual , New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 2a는 GIG12, 2b는 GIG17, 2c는 GIG19, 2d는 GIG20, 2e는 GIG22, 2f는 GIG25, 2g는 GIG36, 2h는 GIG2 각각의 유전자 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 2에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 각각의 GIG 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 2에서 보듯이, 발현된 GIG12 단백질의 크기는 약 78 kDa으로 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치하고; 발현된 GIG17 단백질의 크기는 약 37 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치하며; 발현된 GIG19 단백질의 크기는 약 39 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치하고; 발현된 GIG20 단백질의 크기는 약 47 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치하며; 발현된 GIG22 단백질의 크기는 약 16 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치하고; 발현된 GIG25 단백질의 크기는 약 33 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치하며; 발현된 GIG36 단백질의 크기는 약 12 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치하며; GIG2 단백질의 크기는 약 25 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.

실시예 3: GIG 유전자의 노던 블랏

3-1. GIG12 유전자의 노던 블랏

GIG12 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 유방 조직 시료 3개, 원발성 유방암 조직 시료 3개 및 유방암 세포주 MCF-7의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG12 전장 cDNA의 부분서열인 FC26 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 3a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG12 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 3b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 3a 및 3b에서 보듯이, GIG12 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 유방암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 11a는 여러 정상 조직에서 GIG12 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 11b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 11a에서 보듯이 폐, 흉선, 간, 골격근, 신장, 비장, 심장, 태반, 및 말초혈액들에서 약 2.4 kb의 우점(dominant) GIG12 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 19a는 여러 암세포주들에서 GIG12 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 19b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 19a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG12 유전자가 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG12 유전자는 정상 유방, 폐, 흉선, 간, 골격근, 신장, 비장, 심장, 태반, 및 말초혈액들에서 종양 억제 자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-2. GIG17 유전자의 노던 블랏

GIG17 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 간 조직 시료 3개, 원발성 간암 조직 시료 3개 및 간암 세포주 HepG2의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG17 전장 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 4a는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG17 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 4b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 4a 및 4b에서 보듯이, GIG17 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비 장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 12a는 여러 정상 조직에서 GIG17 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 12b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 12a에서 보듯이 간, 신장, 비장 및 폐 조직에서 약 1.3 kb의 우점(dominant) GIG17 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 20a는 여러 암세포주들에서 GIG17 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 20b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 20a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG17 유전자가 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG17 유전자는 정상 간, 신장, 비장 및 폐 조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-3. GIG19 유전자의 노던 블랏

GIG19 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 간 조직 시료 3개, 원발성 간암 조직 시료 3개 및 간암 세포주 HepG2의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 HP48 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 5a는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG19 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 5b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 5a 및 5b에서 보듯이, GIG19 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개와 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 13a는 여러 정상 조직에서 GIG19 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 13b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 13a에서 보듯이 정상 간조직에서만 약 1.2 kb의 우점(dominant) GIG19 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 21a는 여러 암세포주들에서 GIG19 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 21b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 21a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG19 유전자가 전혀 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG19 유전자는 정상 간조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-4. GIG20 유전자의 노던 블랏

GIG20 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 간 조직 시료 3개, 원발성 간암 조직 시료 3개 및 간암 세포주 HepG2의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로 스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 HP50 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 6a는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG20 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 6b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 6a 및 6b에서 보듯이, GIG20 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개와 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 14a는 여러 정상 조직에서 GIG20 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노 던 블랏 결과이며 도 14b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 14a에서 보듯이 정상 간조직에서만 약 2.4 kb의 우점(dominant) GIG20 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 22a는 여러 암세포주들에서 GIG20 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 22b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 22a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG20 유전자가 전혀 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG20 유전자는 정상 간조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-5. GIG22 유전자의 노던 블랏

GIG22 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 간 조직 시료 3개, 원발성 간암 조직 시료 3개 및 간암 세포주 HepG2의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG22 전장 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로 브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 7a는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG22 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 7b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 7a 및 7b에서 보듯이, GIG22 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 15a는 여러 정상 조직에서 GIG22 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 15b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 15a에서 보듯이 심장, 근육, 간, 신장, 태반, 비장, 폐, 대장, 소장, 비장, 흉선 및 백혈구 조직에서 약 0.6 kb의 우점(dominant) GIG22 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 23a는 여러 암세포주들에서 GIG22 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 23b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 23a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG22 유전자가 전혀 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG22 유전자는 정상 심장, 근육, 간, 신장, 태반, 비장, 폐, 대장, 소장, 비장, 흉선 및 백혈구 조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양 형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-6. GIG25 유전자의 노던 블랏

GIG25유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 간 조직 시료 3개, 원발성 간암 조직 시료 3개 및 간암 세포주 HepG2의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 HP74 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 8a는 정상 간조직, 원발성 간암 조직 및 간암 세포주에서 GIG25 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 8b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 8a 및 8b에서 보듯이, GIG25 유전자의 발현 수준은 정상 간 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 간암 조직 시료 3개와 간암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 16a는 여러 정상 조직에서 GIG25 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 16b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 16a에서 보듯이 정상 간조직에서만 약 1.5 kb의 우점(dominant) GIG25 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 24a는 여러 암세포주들에서 GIG25 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 24b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 24a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG25 유전자가 전혀 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG25 유전자는 정상 간조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-7. GIG36 유전자의 노던 블랏

GIG36 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 유방 조직 시료 3개, 원발성 유방암 조직 시료 3개 및 유방암 세포주 MCF-7의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG36 전장 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 9a는 정상 유방 조직, 원발성 유방암 조직 및 유방암 세포주에서 GIG36 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 9b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 9a 및 9b에서 보듯이, GIG36 유전자의 발현 수준은 정상 유방 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 유방암 조직 시료 3개에서는 그 발현 정도가 정상 조직에 비하여 매우 낮았고, 유방암 세포주 시료 1개에서는 나타나지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 17a는 여러 정상 조직에서 GIG36 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 17b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 17a에서 보듯이 심장, 골격근, 신장, 폐, 대장, 소장, 간, 태반, 흉선 및 비장 조직에서 약 0.4 kb의 우점(dominant) GIG36 mRNA 전사물이 과발현되었다.

도 25a는 여러 암세포주들에서 GIG36 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 25b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 25a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 라지, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포주에서는 GIG36 유전 자가 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG36 유전자는 정상 유방, 심장, 골격근, 신장, 폐, 대장, 소장, 간, 태반, 흉선 및 비장 조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

3-8. GIG2 유전자의 노던 블랏

GIG 2 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1-8에서 얻은 정상 폐 조직 시료 3개, 원발성 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)의 총 RNA 20 ㎍씩을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 GIG2 전장 cDNA로부터 제조한 32P-표지 무작위 프라임 프로브와 42℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜mRNA 총량을 확인하였다.

도 10a는 정상 폐조직, 원발성 폐암 조직, 폐암전이조직 및 폐암 세포주에서 GIG2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 10b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 10a 및 10b에서 보듯이, GIG2 유전자의 발현 수준은 정상 폐 조직 시료 3개 모두에서 높게 나타났으며, 폐암 조직 시료 2개, 폐암전이조직 시료 2개 및 폐암 세포주 시료 2개에서는 나타나지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech)에 대해 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서는 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포들로부터 추출된 총 RNA 시료가 전이된 블랏(blot)들을 클론테크사(Clontech, 미국)로부터 구입하여 동일한 방법으로 하이브리드화하여 노던 블랏을 실시하였다.

도 18a는 여러 정상 조직에서 GIG2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 18b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 18a에서 보듯이 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 약 1.3 kb의 우점(dominant) GIG2 mRNA 전사물이 아주 높게 과발현되었다.

도 26a는 여러 암세포주들에서 GIG2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 26b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 도 26a에서 보듯이, 전 골수성 백혈병 HL-60, 버킷 림프종 라지 세포주에서는 GIG2 유전자가 발현되지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 GIG2 유전자는 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다. 동시에 자궁암, 만성백혈병, 대장암, 폐암 및 피부암등에서도 발현이 억제되어 종양형성을 유도하는 것으로 보아 종양 억제자(tumor suppresser) 기능을 가짐을 알 수 있다.

실시예 4: 발현 벡터의 제작 및 형질 감염

4-1. GIG12 및 GIG36

GIG12 또는 GIG36 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG12 또는 GIG36 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG12 또는 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG36를 얻었다. 이 발현벡터를 리포펙타민 (lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 MCF-7 유방암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG12 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 MCF-7 세포를 사용하였다.

4-2. GIG17 , 19, 20, 22, 또는 GIG 25 군

본 발명의 상기에 기재된 GIG 유전자 군 중 GIG12 및 GIG36을 제외한 나머지 상기 기재된 군들은 GIG 군 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG17, pcDNA3.1/GIG19, pcDNA3.1/GIG20, pcDNA3.1/GIG22,또는 pcDNA3.1/GIG25를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 HepG2 간암 세 포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HepG2 세포를 사용하였다.

4-3 GIG 2

GIG2 유전자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 실시예 2에서 얻은 GIG2 전장 cDNA 클론을 진핵생물 발현용 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen, 미국) 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3.1/GIG2를 얻었다. 이 발현 벡터를 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 A549 폐암 세포주에 형질감염시킨 후 0.6 ㎎/㎖의 G418(Gibco)이 포함된 DMEM 배지 중에서배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 이때 대조군으로는 GIG2 cDNA가 포함되지 않은 발현 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 A549 세포를 사용하였다.

실시예 5:

5-1. GIG12 유전자로 형질감염된 유방암 세포의 성장 곡선

GIG12 유전자가 유방암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 105개의 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG12로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 27a는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG12로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 27a에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG12로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG12로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG12 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-2. GIG17 유전자로 형질감염된 간암 세포의 성장 곡선

GIG17 유전자가 간암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 105개의 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG17으로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 27b는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG17으로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 27b에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG17으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG17으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 45%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG17 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-3. GIG19 유전자로 형질감염된 간암 세포의 성장 곡선

GIG19 유전자가 간암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 105개의 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG19로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 27c는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG19로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 27c에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG19로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG19로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 40%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG19 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-4. GIG20 유전자로 형질감염된 간암 세포의 성장 곡선

GIG20 유전자가 간암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 105개의 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG20으로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 27d는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG20으로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 27d에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG20으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG20으로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 35%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG20 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-5. GIG22 유전자로 형질감염된 간암 세포의 성장 곡선

GIG22 유전자가 간암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 105개의 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG22로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 27e는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG22로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 27e에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG22로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG22로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 40%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG22 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-6. GIG25 유전자로 형질감염된 간암 세포의 성장 곡선

GIG25 유전자가 간암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 105개의 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG25로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 27f는 야생형 HepG2 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG25로 형질감염된 HepG2 간암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 HepG2 세포의 성장 곡선이다. 도 27f에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG25로 형질감염된 HepG2 간암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 HepG2 세포 및 야생형 HepG2 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 HepG2 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG25 형질감염된 HepG2 간암 세포의 약 35만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG25 유전자는 간암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-7. GIG36 유전자로 형질감염된 간암 세포의 성장 곡선

GIG36 유전자가 유방암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 105개의 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG36으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 27g는 야생형 MCF-7 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG36으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 MCF-7 세포의 성장 곡선이다. 도 27g에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG36으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 MCF-7 세포 및 야생형 MCF-7 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 MCF-7 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG36으로 형질감염된 MCF-7 유방암 세포의 50%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG36 유전자는 유방암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

5-8: GIG2 유전자로 형질감염된 폐암 세포의 성장 곡선

GIG2 유전자가 폐암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 x 105개의 야생형 A549 세포, 실시예 4에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG2로 형질감염된 A549 폐암세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포를 각각 DMEM 배지에서 9일 동안 배양하였다. 각 배양액에서 플라스크에 부착된 세포를 트립신(Sigma) 처리하여 유리시킨 후 생존한 세포를 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion, Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))에 따라 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 계수하였다.

도 27h는 야생형 A549 세포, 실시예 4-3에서 얻은 벡터 pcDNA3.1/GIG2로 형질감염된 A549 폐암 세포 및 벡터 pcDNA3.1로만 형질감염시킨 A549 세포의 성장 곡선이다. 도 27h에서 보듯이, 벡터 pcDNA3.1/GIG2로 형질감염된 A549 폐암 세포의 사멸률은 벡터 pcDNA3.1으로 형질감염된 A549 세포 및 야생형 A549 세포의 경우보다 높게 나타났다. 배양 후 9일째에는 야생형 A549 세포와 비교할 때 벡터 pcDNA3.1/GIG2로 형질감염된 A549 폐암 세포의 약 40%만이 생존하였다. 이러한 결과로부터, GIG2 유전자는 폐암 세포의 성장을 억제함을 알 수 있다.

상기의 구성에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 GIG 유전자들은 인간 암의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> KIM, HYUN KEE <120> HUMAN CANCER SUPPRESSOR GENE, PROTEIN ENCODED THEREIN, EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME, AND CELL TRANSFORMED BY SAID VECTOR <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2291 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agggaagggg tgtctattgg gcaacagggc ggcaaagccc tgaataaagg ggcgcagggc 60 aggcgcaagt gcagagcctt cgtttgccaa gtcgcctcca gaccgcagac atgaaacttg 120 tcttcctcgt cctgctgttc ctcggggccc tcggactgtg tctggctggc cgtaggagaa 180 ggagtgttca gtggtgcgcc gtatcccaac ccgaggccac aaaatgcttc caatggcaaa 240 ggaatatgag aaaagtgcgt ggccctcctg tcagctgcat aaagagagac tcccccatcc 300 agtgtatcca ggccattgcg gaaaacaggg ccgatgctgt gacccttgat ggtggtttca 360 tatacgaggc aggcctggcc ccctacaaac tgcgacctgt agcggcggaa gtctacggga 420 ccgaaagaca gccacgaact cactattatg ccgtggctgt ggtgaagaag ggcggcagct 480 ttcagctgaa cgaactgcaa ggtctgaagt cctgccacac aggtcttcgc aggaccgctg 540 gatggaatgt ccctataggg acacttcgtc cattcttgaa ttggacgggt ccacctgagc 600 ccattgaggc agctgtggcc aggttcttct cagccagctg tgttcccggt gcagataaag 660 gacagttccc caacctgtgt cgcctgtgtg cggggacagg ggaaaacaaa tgtgccttct 720 cctcccagga accgtacttc agctactctg gtgccttcaa gtgtctgaga gacggggctg 780 gagacgtggc ttttatcaga gagagcacag tgtttgagga cctgtcagac gaggctgaaa 840 gggacgagta tgagttactc tgcccagaca acactcggaa gccagtggac aagttcaaag 900 actgccatct ggcccgggtc ccttctcatg ccgttgtggc acgaagtgtg aatggcaagg 960 aggatgccat ctggaatctt ctccgccagg cacaggaaaa gtttggaaag gacaagtcac 1020 cgaaattcca gctctttggc tcccctagtg ggcagaaaga tctgctgttc aaggactctg 1080 ccattgggtt ttcgagggtg cccccgagga tagattctgg gctgtacctt ggctccggct 1140 acttcactgc catccagaac ttgaggaaaa gtgaggagga agtggctgcc cggcgtgcgc 1200 gggtcgtgtg gtgtgcggtg ggcgagcagg agctgcgcaa gtgtaaccag tggagtggct 1260 tgagcgaagg cagcgtgacc tgctcctcgg cctccaccac agaggactgc atcgccctgg 1320 tgctgaaagg agaagctgat gccatgagtt tggatggagg atatgtgtac actgcaggca 1380 aatgtggttt ggtgcctgtc ctggcagaga actacaaatc ccaacaaagc agtgaccctg 1440 atcctaactg tgtggataga cctgtggaag gatatcttgc tgtggcggtg gttaggagat 1500 cagacactag ccttacctgg aactctgtga aaggcaagaa gtcctgccac accgccgtgg 1560 acaggactgc aggctggaat atccccatgg gcctgctctt caaccagacg ggctcctgca 1620 aatttgatga atatttcagt caaagctgtg cccctgggtc tgacccgaga tctaatctct 1680 gtgctctgtg tattggcgac gagcagggtg agaataagtg cgtgcccaac agcaacgaga 1740 gatactacgg ctacactggg gctttccggt gcctggctga gaatgctgga gacgttgcat 1800 ttgtgaaaga tgtcactgtc ttgcagaaca ctgatggaaa taacaatgac gcatgggcta 1860 aggatttgaa gctggcagac tttgcgctgc tgtgcctcga tggcaaacgg aagcctgtga 1920 ctgaggctag aagctgccat cttgccatgg ccccgaatca tgccgtggtg tctcggatgg 1980 ataaggtgga acgcctgaaa caggtgttgc tccaccaaca ggctaaattt gggagaaatg 2040 gatctgactg cccggacaag ttttgcttat tccagtctga aaccaaaaac cttctgttca 2100 atgacaacac tgagtgtctg gccagactcc atggcaaaac aacatatgaa aaatatttgg 2160 gaccacagta tgtcgcaggc attactaatc tgaaaaagtg ctcaacctcc cccctcctgg 2220 aagcctgtga attcctcagg aagtaaaacc gaagaagatg gcccagctcc ccaagaaagc 2280 ctcagccatt c 2291 <210> 2 <211> 711 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser 20 25 30 Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys 35 40 45 Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln 50 55 60 Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp 65 70 75 80 Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro 85 90 95 Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr 100 105 110 Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu 115 120 125 Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly 130 135 140 Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly 145 150 155 160 Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser 165 170 175 Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu 180 185 190 Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro 195 200 205 Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly 210 215 220 Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp 225 230 235 240 Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg 245 250 255 Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser 260 265 270 His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp 275 280 285 Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro 290 295 300 Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe 305 310 315 320 Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser 325 330 335 Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg 340 345 350 Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys 355 360 365 Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu 370 375 380 Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys 385 390 395 400 Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly 405 410 415 Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala 420 425 430 Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val 435 440 445 Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser 450 455 460 Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His 465 470 475 480 Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu 485 490 495 Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser 500 505 510 Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile 515 520 525 Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg 530 535 540 Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly 545 550 555 560 Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly 565 570 575 Asn Asn Asn Asp Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala 580 585 590 Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser 595 600 605 Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp 610 615 620 Lys Val Glu Arg Leu Lys 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Asp Leu Ile Lys Asn Leu Asp 50 55 60 Ser Gln Thr Met Met Val Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys 65 70 75 80 Trp Glu Met Pro Phe Asp Pro Gln Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr 85 90 95 Leu Asn Lys Lys Lys Trp Val Met Val Pro Met Met Ser Leu His His 100 105 110 Leu Thr Ile Pro Tyr Phe Arg Asp Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val 115 120 125 Glu Leu Lys Tyr Thr Gly Asn Ala Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp 130 135 140 Gln Asp Lys Met Glu Glu Val Glu Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu 145 150 155 160 Lys Arg Trp Arg Asp Ser Leu Glu Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr 165 170 175 Leu Pro Lys Phe Ser Ile Ser Arg Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu 180 185 190 Leu Gln Leu Gly Ile Glu Glu Ala Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser 195 200 205 Gly Ile Thr Gly Ala Arg Asn Leu Ala Val Ser Gln Val Val His Lys 210 215 220 Ala Val Leu Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr 225 230 235 240 Ala Val Lys Ile Thr Leu Leu Ser Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile 245 250 255 Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr 260 265 270 Gln Asn Ile Phe Phe Met Ser Lys Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala 275 280 285 <210> 23 <211> 13 <212> DNA <213> Primer H-AP40 <400> 23 aagcttgtca gcc 13 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> anchored oligo-dT primer <400> 24 aagctttttt tttttc 16 <210> 25 <211> 394 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 aggacgaaac catgaagagc ctgatccttc ttgccatcct ggccgcctta gcggtagtaa 60 ctttgtgtta tgaatcacat gaaagcatgg aatcttatga acttaatccc ttcattaaca 120 ggagaaatgc aaataccttc atatcccctc agcagagatg gagagctaaa gtccaagaga 180 ggatccgaga acgctctaag cctgtccacg agctcaatag ggaagcctgt gatgactaca 240 gactttgcga acgctacgcc atggtttatg gatacaatgc tgcctataat cgctacttca 300 ggaagcgccg agggaccaaa tgagactgag ggaagaaaaa aaatctcttt ttttctggag 360 gctggcacct gattttgtat ccccctgtag cagc 394 <210> 26 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Lys Ser Leu Ile Leu Leu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Ala Val Val 1 5 10 15 Thr Leu Cys Tyr Glu Ser His Glu Ser Met Glu Ser Tyr Glu Leu Asn 20 25 30 Pro Phe Ile Asn Arg Arg Asn Ala Asn Thr Phe Ile Ser Pro Gln Gln 35 40 45 Arg Trp Arg Ala Lys Val Gln Glu Arg Ile Arg Glu Arg Ser Lys Pro 50 55 60 Val His Glu Leu Asn Arg Glu Ala Cys Asp Asp Tyr Arg Leu Cys Glu 65 70 75 80 Arg Tyr Ala Met Val Tyr Gly Tyr Asn Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Phe 85 90 95 Arg Lys Arg Arg Gly Thr Lys 100 <210> 27 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-AP29 <400> 27 aagcttagca gca 13 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anchored oligo-dT primer <400> 28 aagctttttt tttttc 16 <210> 29 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ctaagttagc cctcaccatg ccggtcaaag gaggcaccaa gtgcatcaaa tacctgctgt 60 tcggatttaa cttcatcttc tggcttgccg ggattgctgt ccttgccatt ggactatggc 120 tccgattcga ctctcagacc aagagcatct tcgagcaaga aactaataat aataattcca 180 gcttctacac aggagtctat attctgatcg gagccggcgc cctcatgatg ctggtgggct 240 tcctgggctg ctgcggggct gtgcaggagt cccagtgcat gctgggactg ttcttcggct 300 tcctcttggt gatattcgcc attgaaatag ctgcggccat ctggggatat tcccacaagg 360 atgaggtgat taaggaagtc caggagtttt acaaggacac ctacaacaag ctgaaaacca 420 aggatgagcc ccagcgggaa acgctgaaag ccatccacta tgcgttgaac tgctgtggtt 480 tggctggggg cgtggaacag tttatctcag acatctgccc caagaaggac gtactcgaaa 540 ccttcaccgt gaagtcctgt cctgatgcca tcaaagaggt cttcgacaat aaattccaca 600 tcatcggcgc agtgggcatc ggcattgccg tggtcatgat atttggcatg atcttcagta 660 tgatcttgtg ctgtgctatc cgcaggaacc gcgagatggt ctaga 705 <210> 30 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Gly 1 5 10 15 Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly 20 25 30 Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu 35 40 45 Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile 50 55 60 Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly 65 70 75 80 Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu 85 90 95 Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser 100 105 110 His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr 115 120 125 Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys 130 135 140 Ala Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu 145 150 155 160 Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe 165 170 175 Thr Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys 180 185 190 Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile 195 200 205 Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn 210 215 220 Arg Glu Met Val 225 <210> 31 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-AP32 <400> 31 aagcttcttg caa 13 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anchored oligo-dT primer <400> 32 aagctttttt tttttg 16

Claims (8)

1. 서열번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 인간 암 억제 단백질.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 암은 정상 유방, 폐, 흉선, 간, 골격근, 신장, 비장, 심장, 태반, 및 말초혈액 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 암인 것을 특징으로 하는 단백질.
3. 제 1 항의 단백질들을 코딩하는 서열번호: 21의 서열을 갖는 인간 암 억제 유전자.
4. 제 3 항에 있어서,

   상기 암은 정상 유방, 폐, 흉선, 간, 골격근, 신장, 비장, 심장, 태반, 및 말초혈액 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 암인 것을 특징으로 하는 유전자.
5. 제 3 항의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
6. 제 5 항의 벡터로 형질전환된 세포.
7. 제 6 항에 있어서,

   미생물 또는 동물 세포인 세포.
8. 제 7 항에 있어서, 상기의 세포는 대장균 DH5@/GIG25/pcDNA3.1(기탁번호 KCTC 10659BP)인 것을 특징으로 하는 세포.

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