JP2016515134A - コレステロールレベルを変更する組成物および方法 - Google Patents

コレステロールレベルを変更する組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ポリヌクレオチド、一次転写物およびｍｍＲＮＡ分子を使用する組成物、方法およびキットに関する。本発明はまた、ポリヌクレオチド、一次転写物およびｍｍＲＮＡ分子を使用する、コレステロールレベルを変更するための組成物および方法に関する。

Description

本発明は、生物におけるコレステロールレベルを調節および／または変更するかあるいは生物におけるコレステロール輸送を変更するための組成物および方法を目的とする。一態様では、本発明は、治療薬中の修飾ＲＮＡなどのＲＮＡに関する。本発明のＲＮＡまたは修飾ＲＮＡは、ペプチド、ポリペプチドまたは複数のタンパク質をコードしてもよい。本発明のＲＮＡまたは修飾ＲＮＡはまた、目的のポリペプチドを生成するために使用してもよい。本発明の修飾ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであってもよく、したがって修飾ｍＲＮＡと称してもよい。目的のポリペプチドは、治療薬ならびに／または臨床および研究の場において使用してもよい。
高コレステロールは、心臓発作および脳卒中における複数のリスク因子のうちの１つである。粗末な食事および運動不足は、ＬＤＬＲの欠損によって誘発される、高いコレステロールジェネティック（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｇｅｎｅｔｉｃ）変化、例えば家族性高コレステロール血症（ｆａｍｉｌｉａｒ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）（ＦＨ）の一般的要因であるが、高コレステロールの原因であり得る。複数のコレステロール低下薬が現在市販されているが、それらは特定の条件または他の薬物療法の下で、リスクまたは禁忌を伴わないことはない。かかる薬剤は、スタチン、フィブラート、ナイアシン、胆汁酸捕捉剤（樹脂）、植物ステロール、あるいは脂肪の吸収を阻止し、コレステロールの吸収を低下させ、またはコレステロール輸送経路内の遺伝子を標的にする他の化合物、を含む。
核酸ベースのコレステロール低下薬としては、例えば、アポＢ（ＡｐｏＢ）−１００を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、ミポメルセンが挙げられ、これは、２０１３年１月、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＦＨ：ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）の治療用に認可された。２０１２年１２月、ＦＤＡはまた、同一条件におけるロミタピドを認可した。
より悩ましいことは、コレステロール標的化薬（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｒｕｇ）に関連した肝臓に関連する問題、特に血清トランスアミナーゼの上昇および肝脂肪の蓄積（または脂肪肝）である。例えば、ミポメルセンには潜在的に重要な安全性への懸念が取り巻いていることから、薬物は、肝毒性についての黒枠警告を添付し、ならびに処方者および薬剤師の認可を必要とし、ならびに薬剤が新しい処方の度ごとに適切に使用されていることが記録されることになる。ミポメルセンは、ＬＤＬコレステロールを低下させる場合に一般に有効であった（臨床試験における患者の過半数が、２０％を超えるＬＤＬレベルの低下を有し、ホモ接合性ＦＨ試験では、ＬＤＬが２４．７％低下した）。一方で、典型的なＦＨ患者は、４００〜１０００ｍｇ／ｄＬの間の平均ＬＤＬを有する。結果として、これらの患者における低下が十分である可能性は低い。また、心血管利益は、当然のことながら薬物の意図される究極の効果であるものの、試験は心血管転帰を評価する体制を整えるには十分に大規模ではなかった。さらに、心臓障害の重篤な有害事象が、第３相試験におけるミポメルセン群において発生した。
本発明は、ＬＤＬコレステロールレベルの上昇および肝機能の調節不全の両問題に、目的のポリペプチドをコードし、かつ当該技術分野における問題のうちの１つ以上を回避する構造的および／または化学的特徴を有する、核酸ベースの化合物またはポリヌクレオチ
ド（例えば、修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）を提供することによって対処する。
この目的のため、発明者らは、特定の修飾ｍＲＮＡ配列が、免疫応答を逃れるか、回避するかまたは低下させるだけに留まらない利益を伴う治療薬として有望であることを示している。かかる試験は、公開された同時係属出願の、２０１１年８月５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６８６１号明細書、２０１１年１０月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５４６３６号明細書、２０１１年１０月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５４６１７号明細書（これらの内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）の中に詳述されている。
本明細書に記載される事項は、コレステロールおよび／またはコレステロール輸送に関連した疾患および障害の治療、予防または診断において、修飾ＲＮＡなどのＲＮＡを用いるＲＮＡに関する組成物、方法およびキットである。
本発明によると、コレステロール輸送に関連した経路は、コレステロールの濃度、そのプロセシングまたは輸送のいずれかを変更する（酵素を含む）１つ以上のポリペプチドを提供することによって調節される。
一実施形態では、ＬＤＬコレステロールの血漿から肝細胞への輸送は、細胞により多くの受容体分子のいずれかを提供するかまたはＬＤＬ受容体の破壊を最小化することにより、増強される。第１の例では、ＬＤＬ受容体をコードするポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡが提供される。第２の例では、ＬＤＬ受容体の突然変異型は、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡによってコードされる。かかる突然変異体のＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−ＲまたはＬＤＬＲ）の場合、ＰＣＳＫ−９へのその結合の一部が欠損することになる。したがって、ＰＣＳＫ９結合が欠損したＬＤＬＲが、コレステロールを肝細胞に運ぶことになる。
ＬＤＬＲ突然変異体をコードするポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡが本明細書に提供される。一態様では、修飾ｍＲＮＡは、限定はされないが配列番号１９など、ＬＤＬＲのアミノ酸３１４〜３９３を含む領域内に、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み得るＬＤＬＲ突然変異体をコードしてもよい。一実施形態では、アミノ酸の領域は、配列番号１９のアミノ酸３１６〜３３９を含む。修飾ｍＲＮＡは、限定はされないが１−メチルシュードウリジン（ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）など、少なくとも１つのヌクレオシド修飾を含んでもよい。修飾ｍＲＮＡはまた、ヌクレオシド修飾５−メチルシトシンを含んでもよい。
対象における血清コレステロールを低下させる方法であって、限定はされないが配列番号１９など、ＬＤＬＲのアミノ酸３１４〜３９３を含む領域内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み得るＬＤＬＲ突然変異体をコードし得る修飾ｍＲＮＡを対象に投与するステップを含む、方法も本明細書に提供される。一実施形態では、アミノ酸の領域は、配列番号１９のアミノ酸３１６〜３３９を含む。
一実施形態では、肝細胞に、ＣＹＰ７Ａ１をコードする、および／または過剰発現する１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。ＣＹＰ７Ａ１は、胆汁酸合成における速度制限酵素であり、流入コレステロールの除去を促進する。高血漿低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）および肝臓コレステロール含量、ならびに胆汁酸排泄の欠乏に関連したＣＹＰ７Ａ１突然変異を有するヒトが存在する。
一実施形態では、２つのポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが送達されると、血漿コレステロールの低下とそれに伴うコレステロール処理の促進が生じる。
一実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、マイクロＲＮＡ結合部位またはシードを有するように３’ＵＴＲにおいて修飾される。本実施形態では、約３０分の通常の半減期を有するＣＹＰ７Ａ１ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−不安定化（詳細には肝細胞内に偏在するｍｉＲ１２２ａ）により転写依存性に作製してもよい。本実施形態によると、ｍｉＲ１２２ａ結合部位は、ｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中に組み込むことで、転写物の安定性を低下させ得る。この場合、構築物中に操作された結合部位の数に応じて、安定性の適定が可能になり、したがってコード化ＣＹＰ７Ａ１酵素の発現の制御が可能になる。ＣＹＰ７Ａ１をコードするポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡはまた、概念研究および基本研究の証拠として有用なマウスモデルを創出する場合に有用でありうる。これらの試験の場合、用量依存性の遺伝子治療をもたらすことに類似することになる。
一実施形態では、治療計画は、患者がスタチンに対して反応性が低下したＣＹＰ７Ａ１多型を呈する場合の希少な疾患に対して設計してもよい。この場合、本発明の有効な組成物に関する試験は、迅速に完了し、食事に基づく負荷に基づいてもよい。このように、本発明の組成物は、コレステロール関連疾患（希少性および流行性の双方）を含む疾患の試験および治療において有用である。
一実施形態では、本発明の組成物は、他の薬剤化合物とともに投与してもよい。かかる他の薬剤は、特にスタチンを含む。スタチンの例として、限定はされないが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、およびこれらの組み合わせ、が挙げられる。
本発明によると、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含む組成物は、希少な非アルコール性脂肪性肝疾患などの疾患を治療するのに有用である。この障害を治療する場合、肝臓のコレステロールをその天然の吸い込み口（ｓｉｎｋ）に駆動する（胆汁を通して体外へ）任意の治療薬であれば、より優れた治療成績を有することになると考えられる。結果的に、ＬＤＬＲをコードするポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを投与すると、肝細胞中のコレステロールを高めることになるが、ＣＹＰ７Ａ１をコードする第２のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを同時投与すれば、コレステロールを胆汁を通して外部に駆動し続け、それにより、既知の治療薬の場合に現在認められている脂肪肝症状を回避することになると考えられる。
さらに、少なくともＬＤＬＲまたはＰＣＳＫ９ ＬＤＬＲ突然変異体をＣＹＰ７Ａ１ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡと共に送達することに加えて、スタチンなどの追加的な薬剤を送達すると、本明細書に記載のＬＤＬＲ−ＣＹＰ７Ａ１治療に対して極めて相乗的なものになることが予想される。結果的に、コレステロール排出が促進され、新たな形成が阻害され、また血漿からの輸送が増加することになる。
一実施形態では、ｍｍＲＮＡの混合物であれば、コレステロール恒常性経路に沿って滴定され、コレステロールの体外への動員を促進することになる。
別の実施形態では、胆汁酸捕捉剤または脂溶性ビタミンは、同時投与してもよい。
さらに、明確化のため、別々の実施形態との関連で説明される、本開示の特定の特徴が、単一の実施形態中で組み合わせて提供することも可能であることは理解される。それに対し、明確化のため、単一の実施形態との関連で説明される、本開示の様々な特徴は、別々にまたは任意の適切な小結合の形態で提供することも可能である。
本発明の様々な実施形態の詳細は、下記において示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面と、特許請求の範囲から明らかになるだろう。
前述の他の目的、特徴および利点は、参照文字が異なる図面全体を通して同一部分を参照する様式で添付の図面中に図示されるように、本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかになるだろう。図面は、必ずしも拡大解釈するものではないが、その代わり、本発明の様々な実施形態の原則を例示する際には重視される。
本発明の一次構築物の概略図。 本発明の一次構築物の概略図。 肝細胞内でのコレステロール輸送の経路を示す図。 低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ：ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）修飾ｍＲＮＡのフローサイトメトリープロット。 ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡのフローサイトメトリープロット。 ＬＤＬＲ発現のグラフであって、添加されたＬＤＬＲ ｍＲＮＡに対する、細胞のＬＤＬ受容体発現を示す図。 ＬＤＬＲ発現のグラフであって、遺伝子導入後の細胞のＬＤＬ受容体発現を示す図。 ＬＤＬＲ発現のグラフであって、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）（登録商標）で標識されたＬＲＬの飽和を示す図。 ＬＤＬＲ発現のグラフであって、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬの細胞に対する結合親和性を示す図。 ＬＤＬＲ発現のグラフであって、各画分の総コレステロール含量を示す図。 ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡ産物のバイオアナライザー画像であって、レーン１、ヌクレオチド中のサイズマーカー；レーン２、ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡ。 ＨＥＫ２９３細胞内に遺伝子導入された８００ｎｇのＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡのフローサイトメトリープロット。 ＨＥＫ２９３細胞内に遺伝子導入されたＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡのフローサイトメトリープロット。 血清中のコレステロールレベルを示す図であって、プールされたＬＤＬＲノックアウトマウス（上部パネル）および野生型マウス（下部パネル）から得られたＦＰＬＣ画分の吸光度特性を示す図。 血清中のコレステロールレベルを示す図であって、各画分の総コレステロール含量を示す図。 ＨＥＫ２９３細胞内に遺伝子導入された変異ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡのフローサイトメトリープロット。 ＰＣＳＫ９の存在下または不在下での、ＨＥＫ２９３細胞内に遺伝子導入された変異ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡのフローサイトメトリープロット。 遺伝子導入された変異ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡのフローサイトメトリープロットであって、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬのＬＤＬＲ ｍＲＮＡトランスフェクト細胞への結合の曲線プロットを示す図。 遺伝子導入された変異ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡのフローサイトメトリープロットであって、最大半量の細胞のボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬとの会合を示す図。 ＬＤＬＲ ｍＲＮＡの遺伝子導入後の半減期に対する効果を示す図であって、野生型ＬＤＬＲ ｍＲＮＡを示す図。 ＬＤＬＲ ｍＲＮＡの遺伝子導入後の半減期に対する効果を示す図であって、４つのアミノ酸置換（Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１ＡおよびＹ３３６Ａ）を有する変異ＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ ｍＲＮＡを示す図。 ＬＤＬＲ ｍＲＮＡの遺伝子導入後の半減期に対する効果を示す図であって、１つのアミノ酸置換Ｙ３３６Ａを有する変異ＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ ｍＲＮＡを示す図。 ＬＤＬＲ ｍＲＮＡの遺伝子導入後の半減期に対する効果を示す図であって、１つのアミノ酸置換Ｅ３１７Ａを有する変異ＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ ｍＲＮＡを示す図。 ＬＤＬＲ ｍＲＮＡの遺伝子導入後の半減期に対する効果を示す図であって、１つのアミノ酸置換Ｎ３１６Ａを有する変異ＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ ｍＲＮＡを示す図。 ＬＤＬＲ ｍＲＮＡの遺伝子導入後の半減期に対する効果を示す図であって、１つのアミノ酸置換Ｌ３３９Ｄを有する変異ＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ ｍＲＮＡを示す図。 ＬＤＬＲ ｍＲＮＡの遺伝子導入後の半減期に対する効果を示す図であって、１つのアミノ酸置換Ｄ３３１Ｅを有する変異ＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ ｍＲＮＡを示す図。 ＰＣＳＫの量が変化する場合の細胞表面ＬＤＬＲに対する効果を示す図。
治療薬、診断薬、試薬の分野や生物検定において、核酸、例えば細胞内のリボ核酸（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を、インビトロ、インビボ、インサイチュまたはエクスビボのいずれかで送達し、例えば、核酸の細胞内翻訳および目的のコードポリペプチドの生成を誘発できることには、多大な関心が払われている。非組込み型（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ポリヌクレオチドの送達および機能は、特に重要である。
１つ以上の目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの設計、調製、作製および／または調合のための（医薬組成物を含む）組成物および方法が、本明細書に記載される。本明細書に記載の目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの選択、設計および／または利用のためのシステム、プロセス、デバイスおよびキットについても、提供される。
本発明によると、これらのポリヌクレオチドは、好ましくは、当該技術分野の他のポリペプチドをコードする分子の欠損を回避するように修飾される。故に、これらのポリヌクレオチドは、修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡと称される。
本明細書に提供されるのは、一部には、組織内での安定性および／またはクリアランス、受容体の取り込みおよび／または動力学、組成物による細胞への接近、翻訳機構への関与、ｍＲＮＡの半減期、翻訳効率、免疫回避、タンパク質産生能、分泌効率（適用可能な場合）、循環への接近可能性、タンパク質の半減期ならびに／あるいは細胞の状態、機能および／または活性の調節のうちの１つ以上を改良するように設計されている目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡである。詳細には、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、生体、特にヒト患者におけるコレステロールレベルまたはコレステロール輸送を変更する場合に有用である。
本発明によると、コレステロール輸送に関連した経路は、コレステロールの濃度、そのプロセシングまたは輸送のいずれかを変更する（酵素を含む）１つ以上のポリペプチドを提供することによって調節される。
一実施形態では、血漿から肝細胞へのＬＤＬコレステロールの輸送は、細胞にいずれかのさらに多くの受容体分子を提供するか、またはＬＤＬ受容体の破壊を最小にすることに
より、増強される。第１の例では、ＬＤＬ受容体をコードするポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡが提供される。第２の例では、ＬＤＬ受容体の突然変異型が、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡによってコードされる。かかる突然変異ＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−ＲまたはＬＤＬＲ）であれば、それらのＰＣＳＫ−９への結合が何らかの方法で欠損することになる。先行的には、ＰＣＳＫ−９の結合部位は、ＬＤＬＲのＥＧＦ−Ａ（またはＥＧＦ様リピート）ドメインに局在化されている（例えば、クウォン（Ｋｗｏｎ）ら著、「ＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体認識のための分子基盤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＳＫ９）」、ピーナス（ＰＮＡＳ）、２００８年、第１０５巻、第６号、ｐ．１８２０−１８２５；その内容はその全体が参照により本明細書に援用される）。したがって、ＰＣＳＫ９への結合が欠損したＬＤＬＲであれば、コレステロールを肝細胞に運ぶことになる。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＰＣＳＫ−９への結合が欠損した突然変異ＬＤＬＲをコードしてもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＰＣＳＫ−９結合部位に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む突然変異ＬＤＬＲをコードしてもよい。突然変異ＬＤＬＲは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１０個より多い突然変異を含んでもよい。
一実施形態では、突然変異ＬＤＬＲは、ＬＤＬＲのＥＧＦ−Ａドメイン（ＥＧＦ様リピートドメインとしても知られる）内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含んでもよい。非限定例として、ＥＧＦ−Ａドメインは、アミノ酸３１４〜３９３を含むＬＤＬＲの領域内に位置する。別の非限定例として、ＥＧＦ−Ａドメインは、アミノ酸３１４〜３９３を含む配列番号１９の領域である。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＥＧＦ様１ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む突然変異ＬＤＬＲをコードしてもよい。ＥＧＦ様１ドメインは、アミノ酸３１４〜３５３を含むＬＤＬＲの領域内に位置してもよい。非限定例として、ＥＧＦ様１ドメインは、アミノ酸３１４〜３５３を含む配列番号１９の領域である。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＥＧＦ様２ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む突然変異ＬＤＬＲをコードしてもよい。ＥＧＦ様２ドメインは、アミノ酸３５３〜３９３を含むＬＤＬＲの領域内に位置してもよい。非限定例として、ＥＧＦ様２ドメインは、アミノ酸３５３〜３９３を含む配列番号１９の領域である。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＰＣＳＫ−９への結合が欠損した突然変異ＬＤＬＲをコードしてもよい。ＰＣＳＫ−９への結合が欠損した突然変異ＬＤＬＲは、アミノ酸３１４〜３９３を含む配列番号１９の領域内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含んでもよい。非限定例として、少なくとも１つの突然変異は、アミノ酸３１４〜３５３の間に位置してもよい。別の非限定例として、少なくとも１つの突然変異は、アミノ酸３１５〜３４０の間に位置してもよい。さらに別の非限定例として、少なくとも１つの突然変異は、アミノ酸３５４〜３９３の間に位置してもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＰＣＳＫ−９結合領域内に少なくとも１つの突然変異を含む、ＰＣＳＫ−９への結合が欠損した突然変異ＬＤＬＲをコードしてもよい。突然変異は、アミノ酸３１４〜３９３を含む配列番号１９の領域内に位置してもよい。突然変異領域の非限定例として、突然変異は、３１４〜３５
３、３１５〜３４０および３５４〜３９３の領域内に位置してもよい。別の非限定例として、突然変異は、位置３１６、３１７、３３１、３３６または３３９に存在してもよい。さらに別の非限定例として、突然変異ＬＤＬＲは、位置３１６、３１７、３３１および３３６に突然変異を含んでもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、限定はされないが、３１６、３１７、３３１、３３６および／または３３９などのアミノ酸位置に少なくとも１つの突然変異を含む、ＰＣＳＫ−９への結合が欠損した突然変異ＬＤＬＲをコードしてもよい。非限定例として、ＰＣＳＫ−９への結合が欠損した突然変異ＬＤＬＲは、「Ｎ３１６Ａ」が位置３１６のアスパラギンがアラニンと置換されることを意味する場合、突然変異Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、Ｄ３３１Ｅ、Ｙ３３６Ａおよび／またはＬ３３９Ｄのうちの少なくとも１つを含んでもよい。別の非限定例として、ＰＣＳＫ−９への結合が欠損した突然変異ＬＤＬＲは、突然変異Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１ＡおよびＹ３３６Ａを含んでもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、限定はされないが、３１６、３１７、３３１、３３６および／または３３９などのアミノ酸位置に４つの突然変異を含む、ＰＣＳＫ−９への結合が欠損した突然変異ＬＤＬＲをコードしてもよい。非限定例として、ＰＣＳＫ−９への結合が欠損した突然変異ＬＤＬＲは、「Ｎ３１６Ａ」が位置３１６のアスパラギンがアラニンと置換されることを意味する場合、Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、Ｄ３３１Ｅ、Ｙ３３６Ａおよび／またはＬ３３９Ｄなどの突然変異のうちの任意の４つを含んでもよい。別の非限定例として、ＰＣＳＫ−９への結合が欠損した突然変異ＬＤＬＲは、突然変異Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１ＡおよびＹ３３６Ａを含んでもよい。
一実施形態では、肝細胞には、ＣＹＰ７Ａ１をコードする、および／または過剰発現する１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。ＣＹＰ７Ａ１は、胆汁酸合成における律速酵素であり、流入コレステロールの除去を促進する。高血漿低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および肝臓コレステロール含量、ならびに胆汁酸排泄の欠乏に関連したＣＹＰ７Ａ１突然変異を有するヒトが存在する。
一実施形態では、２つのポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが送達されると、血漿コレステロールの低下とそれに伴うコレステロール廃棄の促進がもたらされる。
一実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、マイクロＲＮＡ結合部位またはシードを有するように３’ＵＴＲにおいて修飾される。本実施形態では、正常な約３０分の半減期を有するＣＹＰ７Ａ１ポリヌクレオチドは、ｍｉＲの不安定化（詳細には肝細胞内に偏在するｍｉＲ１２２ａ）により、転写依存性に作製することができる。本実施形態によると、ｍｉＲ１２２ａ結合部位をｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中に組み込むことで、転写物の安定性を低下させることができる。この場合、構築物に操作された結合部位の数に応じて、安定性を適定することが可能になり、ひいてはコード化ＣＹＰ７Ａ１酵素の発現を制御することが可能になる。ＣＹＰ７Ａ１をコードするポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡはまた、概念研究および基本研究の証拠として有用なマウスモデルを創出する際に有用であり得る。これらの試験の場合、用量依存性の遺伝子治療を生み出すことに類似することになる。
一実施形態では、治療計画は、患者が、スタチンに対して反応性が低下したＣＹＰ７Ａ１多型を示す場合の希少な疾患に対して設計することができる。この場合、本発明の有効な組成物に関する試験は、迅速に完了して、食事に基づく負荷に基づいてもよい。このよ
うに、本発明の組成物は、コレステロール関連疾患（希少性および流行性の双方）を含む疾患の試験および治療において有用である。
一実施形態では、本発明の組成物は、他の薬剤化合物とともに投与してもよい。かかる他の薬剤は、特にスタチンを含む。スタチンの例として、限定はされないが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
本発明によると、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含む組成物は、希少な非アルコール性脂肪性肝疾患などの疾患を治療するのに有用である。この障害を治療する場合、肝臓のコレステロールをその天然の吸い込み口に（胆汁を通して体外へ）駆動する任意の治療薬であれば、より優れた治療成績を有することになると考えられる。結果的に、ＬＤＬＲをコードするポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを投与すると、肝細胞内のコレステロールを増加させることになるが、ＣＹＰ７Ａ１をコードする第２のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを同時投与すれば、コレステロールを胆汁を通して体外へ駆動し続け、それにより、既知の治療薬の場合に現在認められる脂肪肝症状を回避することになると考えられる。
さらに、少なくともＬＤＬＲまたはＰＣＳＫ９ ＬＤＬＲ突然変異体をＣＹＰ７Ａ１ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡと共に送達することに加えて、スタチンなどの追加的な薬剤を送達すると、本明細書に記載のＬＤＬＲ−ＣＹＰ７Ａ１治療法に対して極めて相乗的なものになると予想される。その場合の結果としては、コレステロール排泄が促進され、新たな形成が阻害され、また血漿からの輸送が増加することになる。
一実施形態では、ｍｍＲＮＡの混合物であれば、コレステロール恒常性経路に沿って滴定され、コレステロールの体外への動員を促進することになる。
別の実施形態では、胆汁酸捕捉剤または脂溶性ビタミンは、同時投与してもよい。
さらに、明確化のために別々の実施形態との関連で説明される本開示の特定の特徴が、単一の実施形態中で組み合わせて提供され得ることは理解される。逆に、明確化のために単一の実施形態との関連で説明される本開示の様々な特徴は、別々にまたは任意の適切な小結合として提供され得る。
Ｉ．本発明の組成物（ｍｍＲＮＡ）
本発明は、１つ以上の目的のポリペプチドをコードする核酸分子、詳細にはポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡを提供する。用語「核酸」は、その最も広義には、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと称されることが多い。本発明の例示的な核酸またはポリヌクレオチドは、限定はされないが、リボ核酸（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、トレオース核酸（ＴＮＡ：ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール核酸（ＧＮＡ：ｇｌｙｃｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ロックド核酸（β−Ｄ−リボ立体配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ立体配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、および２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含むＬＮＡ）またはそれらのハイブリッドを含む。
好ましい実施態様では、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）である。本明細書で使用される用語「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、目的のポリペプチドをコードし、かつ、インビトロ、インビボ、インサイチュま
たはエクスビボで翻訳されて、目的のコード化ポリペプチドを生成する能力がある、任意のポリヌクレオチド、例えば合成ポリヌクレオチドを示す。
伝統的に、ｍＲＮＡ分子の基本成分は、少なくとも、コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップおよびポリＡテールを含む。本発明は、この野生型モジュラー構造で構築することで、モジュラー組織を維持するが、再プログラム化する（ｒｅｐｒｏｇｒａｒｍｍｉｎｇ）ポリヌクレオチドに対して、一部の実施形態ではポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の実質的誘導の欠如を含む有用な特性を与える、１つ以上の構造的および／または化学的な修飾または改変を含む、ポリヌクレオチドまたは一次ＲＮＡ構築物を提供することにより、伝統的なｍＲＮＡ分子の機能性の範囲を拡張する。このようなものとして、本発明の修飾ｍＲＮＡ分子、例えば合成修飾ｍＲＮＡ分子は、「ｍｍＲＮＡ」と称される。本明細書で使用される「構造的」特徴または修飾は、２つ以上の連結ヌクレオチドに対して、ヌクレオチド自体に対して有意な化学修飾がなく、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの中への挿入、欠失、複製、逆位または無作為化がなされる場合のものである。化学結合が、必然的に破壊され、再形成されることで、構造修飾を生じるようになることから、構造修飾は化学的性質を有し、それ故に化学修飾である。しかし、構造修飾は、ヌクレオチドの異なる配列を生じることになる。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に対して化学的に修飾され得る。同一のポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」へ構造的に修飾され得る。ここでは、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、結果的にポリヌクレオチドに対する構造修飾がもたらされる。
ｍｍＲＮＡの構造
本発明のｍｍＲＮＡは、本明細書中に実証されるように、核酸ベースの治療薬を使用した有効なポリペプチド生成に関する既存の問題を克服することに役立つという、その機能および／または構造設計の特徴において野生型ｍＲＮＡと区別される。
図１は、本発明の代表的なポリヌクレオチドの一次構築物１００を示す。本明細書で使用される用語「一次構築物」または「一次ｍＲＮＡ構築物」は、１つ以上の目的のポリペプチドをコードし、かつその中にコードされる目的のポリペプチドの翻訳を可能にするのに十分な構造的特徴および／または化学的特徴を保持するポリヌクレオチド転写物を示す。一次構築物は、本発明のポリヌクレオチドであってもよい。一次構築物は、構造的または化学的に修飾される場合、ｍｍＲＮＡと称してもよい。
図１に戻ると、ここでの一次構築物１００は、第１隣接領域１０４および第２隣接（ｆｌａｋｉｎｇ）領域１０６によって隣接された連結ヌクレオチドの第１領域１０２を有する。本明細書で使用される「第１領域」は、「コード領域」または「コードする領域」または単に「第１領域」と称してもよい。この第１領域は、限定はされないが、目的のコード化ポリペプチドを含んでもよい。目的のポリペプチドは、その５’末端にシグナル配列領域１０３によってコードされる１つ以上のシグナル配列を含んでもよい。隣接領域１０４は、１つ以上の完全または不完全な５’ＵＴＲ配列を含む連結ヌクレオチドの領域を含んでもよい。隣接領域１０４はまた、５’末端キャップ１０８を含んでもよい。第２隣接領域１０６は、１つ以上の完全または不完全な３’ＵＴＲを含む連結ヌクレオチドの領域を含んでもよい。隣接領域１０６はまた、３’テーリング配列１１０を含んでもよい。
第１領域１０２の５’末端と第１隣接領域１０４との架橋は、第１操作領域１０５である。伝統的には、この操作領域は開始コドンを含む。あるいは、操作領域は、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでもよい。
第１領域１０２の３’末端と第２隣接領域１０６との架橋は、第２操作領域１０７であ
る。伝統的には、この操作領域は終止コドンを含む。あるいは、操作領域は、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでもよい。本発明によると、複数の一連の終止コドンもまた、使用してもよい。
図２は、本発明の代表的なポリヌクレオチドの一次構築物１３０を示す。ポリヌクレオチドの一次構築物は、１つ以上の目的のポリペプチドをコードし、かつその中にコードされる目的のポリペプチドの翻訳を可能にするのに十分な構造的および／または化学的特徴を保持する、ポリヌクレオチド転写物を示す。目的のポリペプチドおよび目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの非限定例が、「生物製剤の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号明細書の表６；「生物製剤の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号明細書；「生物製剤の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書；「ヒト疾患に関連した生物製剤およびタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６２号明細書；「抗体の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号明細書；「抗体の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号明細書；「抗体の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号明細書；「修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６３号明細書；「ワクチンの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号明細書；「ワクチンの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号明細書；「ワクチンの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号明細書；「治療用タンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号明細書；「治療用タンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号明細書；「治療用タンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号明細書；「分泌タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号明細書；「分泌タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号明細書；「分泌タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号明細書；「分泌タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題のＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６４号明細書；「細胞膜タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号明細書；「細胞膜タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号明細書；「細胞膜タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号明細書；「膜タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００５９号明細書；「細胞質および細胞骨格タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号明細書；「細胞質および細胞骨格タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号明細書；「細胞質および細胞骨格タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号明細書；「細胞質および細胞骨格タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌ
ｅｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６６号明細書；「細胞内膜結合タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ
Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号明細書；「細胞内膜結合タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年７月５日に出願された米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号明細書；「細胞内膜結合タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号明細書；「細胞内膜結合タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号明細書；「核タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号明細書；「核タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号明細書；「核タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号明細書；「核タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６７号明細書；「タンパク質の作製のための修飾された
ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号明細書；「タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号明細書；「タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号明細書；「タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６０号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作
製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６１号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ
Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号明細書；「タンパク質のインビボ作製（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１３年３月１５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１８２１号明細書；「化粧品タンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，７２０号明細書；「化粧品タンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，２１３号明細書；「化粧品タンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６８号明細書；「腫瘍学に関連したタンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，７４２号明細書および「腫瘍学に関連したタンパク質ならびにペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００７０号明細書の中に記載されており、またそれらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
図２に戻ると、ここでのポリヌクレオチドの一次構築物１３０は、第１隣接領域１３４および第２隣接（ｆｌａｋｉｎｇ）領域１３６によって隣接される連結ヌクレオチドの第１領域１３２を有する。本明細書で使用される「第１領域」は、「コード領域」または「コードする領域」または単に「第１領域」と称してもよい。この第１領域は、限定はされないが、目的のコード化ポリペプチドを含んでもよい。一態様では、第１領域１３２は、限定はされないが、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでもよい。オープンリーディングフレームは、完全または部分的にコドン最適化してもよい。隣接領域１３４は、完全にコドン最適化されるかまたは部分的にコドン最適化されていてもよい、１つ以上の完全または不完全５’ＵＴＲ配列を含む、連結ヌクレオチドの領域を含んでもよい。隣接領域１３４は、限定はされないが、ｍｉＲ配列、テルザク（ＴＥＲＺＡＫ）（商標）配列および翻訳制御配列を含む、少なくとも１つの核酸配列を含んでもよい。隣接領域１３４はまた、５’末端キャップ１３８を含んでもよい。５’末端キャッピング領域１３８は、天然キャップ、合成キャップまたは最適化キャップを含んでもよい。最適化キャップの非限定例として、米国特許第７０７４５９６号明細書ならびに国際公開第２００８１５７６６８号パンフレット、国際公開第２００９１４９２５３号パンフレットおよび国際公開第２０１３１０３６５９号パンフレットにおけるローズ（Ｒｈｏａｄｓ）によって教示されるキャップが挙げられる。第２隣接領域１０６は、１つ以上の完全または不完全３’ＵＴＲを含む、連結ヌクレオチドの領域を含んでもよい。第２隣接領域１３６は、完全にコドン最適化するかまたは部分的にコドン最適化してもよい。隣接領域１３４は、限定はされないがｍｉＲ配列および翻訳制御配列を含む、少なくとも１つの核酸配列を含んでもよい。第２隣接領域１３６の後に、ポリヌクレオチドの一次構築物は、３’テーリング配列１４０を含んでもよい。３’テーリング配列１４０は、合成テーリング領域１４２および／または連鎖停止ヌクレオシド１４４を含んでもよい。合成テーリング領域の非限定例（Ｎｏｎ−ｌｉｍｉｎｇ ｅｘａｍｐｌｅｓ）として、ポリＡ配列、ポリＣ配列、ポリＡ−Ｇカルテットが挙げられる。連鎖停止ヌクレオシドの非限定例として、２’−Ｏメチル、Ｆおよびロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ
ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）が挙げられる。
第１領域１３２の５’末端と第１隣接領域１３４との架橋は、第１操作領域１４４である。伝統的には、この操作領域は開始コドンを含む。あるいは、操作領域は、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでもよい。
第１領域１３２の３’末端と第２隣接領域１３６との架橋は、第２操作領域１４６である。伝統的には、この操作領域は終止コドンを含む。あるいは、操作領域は、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでもよい。本発明によると、複数の一連の終止コドンもまた、使用してもよい。
一般に、本発明の一次構築物の第１領域の最短長は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、またはデカペプチドをコードするのに十分な核酸配列の長さであってもよい。別の実施形態では、長さは、２〜３０のアミノ酸、例えば、５〜３０、１０〜３０、２〜２５、５〜２５、１０〜２５、または１０〜２０のアミノ酸のペプチドをコードするのに十分であってもよい。長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５もしくは３０のアミノ酸のペプチド、または４０以下のアミノ酸、例えば、３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１もしくは１０以下のアミノ酸のペプチドをコードするのに十分であってもよい。ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例として、限定はされないが、カルノシンおよびアンセリンが挙げられる。
一般に、本発明の目的のポリペプチドをコードする第１領域の長さは、約３０ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００またはそれを超える、または１００，０００を含みそれ以下のヌクレオチド）。本明細書で使用される「第１領域」は、「コード領域」または「コードする領域」または単に「第１領域」と称してもよい。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約３０〜約１００，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０，１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、および２，０００〜１００，０００）を含む。
本発明によると、第１および第２隣接領域は、独立に、１５〜１，０００ヌクレオチド長の範囲（例えば、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、および９００ヌクレオチドを超えるまたは少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、および１，０００ヌクレオチド）であってもよい。
本発明によると、テーリング配列は、存在しないか、５００ヌクレオチド長までの範囲（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド）であってもよい。テーリング領域がポリＡテールである場合、長さは、ポリＡ結合タンパク質との結合の単位としてまたは機能として決定してもよい。本実施形態では、ポリＡテールは、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４つの単量体に結合する程度に十分に長い。ポリＡ結合タンパク質単量体は、約３８ヌクレオチドのストレッチに結合する。これに関連して、約８０ヌクレオチドおよび１６０ヌクレオチドのポリＡテールが機能的であることが認められている。
本発明によると、キャッピング領域は、単一のキャップまたはキャップを形成する一連のヌクレオチドを含んでもよい。本実施形態では、キャッピング領域は、１〜１０、例えば、２〜９、３〜８、４〜７、１〜５、５〜１０、または少なくとも２、または１０以下のヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、キャップは存在しない。
本発明によると、第１および第２操作領域は、３〜４０、例えば、５〜３０、１０〜２０、１５、または少なくとも４、または３０もしくはそれより短いヌクレオチド長の範囲であってもよく、開始および／または終止コドンに加えて、１つ以上のシグナルおよび／または制限配列（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を含んでもよい。
環状ｍｍＲＮＡ
本発明によると、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、環化されるか、またはコンカテマー化される（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚｅｄ）ことで、翻訳コンピテント分子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を生成し、ポリＡ結合タンパク質と５’末端結合タンパク質との相互作用を補助することができる。環化またはコンカテマー化（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の機構は、少なくとも３つの異なる経路、すなわち１）化学的なもの、２）酵素的なもの、および３）触媒化されたリボザイム、を通じて発生し得る。新規に形成される５’−／３’−結合は、分子内または分子間に存在する。
最初の経路では、核酸の５’末端および３’末端は、互いに接近すると、分子の５’末端と３’末端との間で新たな共有結合を形成する化学反応基を有する。５’末端は、ＮＨＳ−エステル反応基を有し、また３’末端は、有機溶媒中で、合成ｍＲＮＡ分子の３’末端上の３’−アミノ末端化ヌクレオチドが、新たな５’−／３’−アミド結合を形成する５’−ＮＨＳ−エステル部分に対して求核攻撃を受けることになるように、３’−アミノ末端化ヌクレオチドを有してもよい。
第２の経路では、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは、５’−リン酸化核酸分子を、新しいホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合を形成する核酸の３’−水酸基に酵素的に連結するために使用してもよい。反応例では、製造業者のプロトコルに従い、１μｇの核酸分子が、１〜１０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼとともに３７℃で１時間インキュベートされる（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）。ライゲーション反応は、酵素ライゲーション反応を補助するための、５’および３’領域の双方と並置して塩基対合可能な分割（ｓｐｌｉｔ）オリゴヌクレオチドの存在下で行ってもよい。
第３の経路では、ｃＤＮＡ鋳型の５’または３’末端のいずれかが、インビトロ転写の間、得られた核酸分子が、核酸分子の５’末端を核酸分子の３’末端にライゲートする能力がある活性のあるリボザイム配列を有し得るように、リガーゼリボザイム配列をコード
する。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、肝炎デルタウイルス、ヘアピンリボザイムに由来するか、またはセレックス（ＳＥＬＥＸ）（指数的濃縮によるリガンドの系統的進化）によって選択してもよい。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の間の温度で１〜２４時間行ってもよい。
ｍｍＲＮＡ多量体
本発明によると、複数の特徴的なポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、３’末端で修飾されるヌクレオチドを用いて、３’末端を介して互いに連結してもよい。化学的結合は、細胞への送達の化学量論を制御するため、用いてもよい。例えば、グリオキシル酸サイクル酵素、イソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸シンターゼは、ＨｅｐＧ２細胞に１：１の比で供給することで、細胞の脂肪酸代謝を変更することができる。この比は、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを、一方のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ種に対する３’−アジド末端化ヌクレオチド、および対向するポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ種に対するＣ５−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチド、を用いて化学的に結合することにより、制御可能である。修飾ヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従い、末端トランスフェラーゼを用いて、転写後に付加される（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）。３’−修飾ヌクレオチドの付加後、２つのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ種は、同文献に記載のように、銅の存在下または不在下、水溶液中で結合させることで、クリックケミストリー機構を介して新たな共有結合を形成することができる。
別の例として、３つ以上のポリヌクレオチドを、官能性リンカー分子を用いて互いに結合させてもよい。例えば、官能性糖分子は、複数の化学的反応基（ＳＨ−、ＮＨ２−、Ｎ３など）を有するように化学修飾することで、３’−官能性ｍＲＮＡ分子（すなわち、３’−マレイミドエステル、３’−ＮＨＳ−エステル、アルキニル）上の同種部分と反応させることができる。修飾糖上の反応基の数は、化学量論的方法で制御し、結合したポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの化学量論比を直接的に制御することができる。
ｍｍＲＮＡの抱合および組み合わせ
タンパク質の生成をさらに増強するため、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、他のポリヌクレオチド、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収ファシリテータ（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンド（ｃｏ−ｌｉｇａｎｄ）に対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、がん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、または薬物、に抱合するように設計してもよい。
抱合は、安定性の向上および／または半減期の延長をもたらし、細胞、組織または生物における特定の部位に向かうポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを標的化する場合に特に有用でありうる。
本発明によると、ｍｍＲＮＡまたは一次構築物は、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮ
Ａ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、トリプルヘリックス形成を誘発するＲＮＡ、アプタマーまたはベクターなどのうちの１つ以上とともに投与するか、またはさらにそれらをコードしてもよい。
二機能性ｍｍＲＮＡ
本発明の一実施形態には、二機能性ポリヌクレオチド（例えば、二機能性一次構築物または二機能性ｍｍＲＮＡ）がある。その名称が意味する通り、二機能性ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの機能を有するかまたは発揮する能力があるものである。これらの分子はまた、慣例により、多機能性と称してもよい。
二機能性ポリヌクレオチドの複数の機能性は、ＲＮＡによってコードされるか（機能はコード化産物が翻訳されるまで顕在化しない場合がある）またはポリヌクレオチド自体の特性であってもよい。それは、構造的なものまたは化学的なものであってもよい。二機能性修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合または静電気結合されるという機能を含んでもよい。さらに、２つの機能は、ｍｍＲＮＡと別の分子との複合体に関連して提供してもよい。
二機能性ポリヌクレオチドは、抗増殖性を示すペプチドをコードしてもよい。これらのペプチドは、線状、環状、束縛（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）またはランダムコイルであってもよい。それは、アプタマー、シグナリング分子、そのリガンドまたは模倣体またはミメティックとして機能し得る。抗増殖性ペプチドは、翻訳されると、３〜５０アミノ酸長であり得る。それらは、５〜４０、１０〜３０、または約１５アミノ酸長であり得る。それらは、一旦翻訳されると、一本鎖、多鎖または分岐状であり得、また複合体、凝集体または任意の多ユニット構造を形成し得る。
非コードポリヌクレオチドおよび一次構築物
本明細書に記載のように、部分的または実質的に翻訳不能な配列を有する、例えば非コード領域を有するポリヌクレオチドおよび一次構築物が提供される。かかる非コード領域は、一次構築物の「第１領域」であってもよい。あるいは、非コード領域は、第１領域以外の領域であってもよい。かかる分子は、一般に翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの１つ以上の翻訳機構成分への結合およびそれの隔離のうちの１つ以上により、タンパク質生成に対して効果を発揮し、それにより、細胞内でのタンパク質発現を効果的に低下させるか、あるいは細胞内の１つ以上の経路またはカスケードを調節し、それに続いてタンパク質レベルを変更することができる。ポリヌクレオチドまたは一次構築物は、１つ以上の長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ、またはｌｉｎｃＲＮＡ）またはその一部、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を有するかまたはコードしてもよい。
目的のポリペプチド
本発明によると、一次構築物は、１つ以上の目的のポリペプチドまたはその断片をコードするように設計される。目的のポリペプチドは、限定はされないが、全ポリペプチド、複数のポリペプチドまたはポリペプチドの断片を含んでもよく、それらは、独立に、１つ以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片または上記のいずれかの変異体によってコードされ得る。本明細書で使用される用語「目的のポリペプチド」は、本発明の一次構築物中にコードされるものとして選択される任意のポリペプチドを示す。本明細書で使用される「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに結合されることが最も多い（天然または非天然）アミノ酸残基のポリマーを意味する。同用語は、本明細書で使用される場合、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを示す。いくつかの例では、コード化ポリペプチドは約５０個未満のアミノ酸であり、そこでポリペプ
チドはペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、それは少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長になる。したがって、ポリペプチドは、上記の、遺伝子産物、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、断片および他の均等物、変異体、および類似体を含む。ポリペプチドは、単一分子であってもよく、または二量体、三量体または四量体などの多分子複合体（ｍｕｌｔｉ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）であってもよい。それらはまた、一本鎖または多鎖ポリペプチド、例えば抗体またはインスリンを含んでもよく、また会合または結合させてもよい。最も一般的には、ジスルフィド結合は、多鎖ポリペプチド中に見出される。ポリペプチドという用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的類似体である場合のアミノ酸ポリマーに適用してもよい。
用語「ポリペプチド変異体」は、そのアミノ酸配列が天然または参照配列と異なる分子を示す。アミノ酸配列変異体は、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有してもよい。通常、変異体は、天然または参照配列に対して少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有することになり、また好ましくは、それは天然または参照配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一（相同）になる。
一部の実施形態では、「変異模倣体」が提供される。本明細書で使用される用語「変異模倣体」は、活性化配列を模倣することになる１つ以上のアミノ酸を有するものである。例えば、グルタミン酸は、ホスホロ−トレオニンおよび／またはホスホロ−セリンに対する模倣体として役立つ場合がある。あるいは、変異模倣体は、非活性化をもたらすか、または模倣体を含有する不活化産物を生じる場合があり、例えば、フェニルアラニンは、チロシンに対する不活性化置換基として作用するか、またはアラニンは、セリンに対する不活性化置換基として作用する場合がある。
「相同性」は、アミノ酸配列に適用される場合、配列を整列し、ギャップを導入し（必要な場合）、最大パーセント相同性を得た後での、第２の配列のアミノ酸配列内の残基と同一であるアミノ酸配列候補における残基の百分率として定義される。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知である。相同性が、パーセント同一性の計算に左右されるが、計算に導入されたギャップおよびペナルティに起因し、値が異なる場合があることは理解されている。
「相同体」は、ポリペプチド配列に適用される場合、第２の種の第２の配列に対して実質的同一性を有する他種の対応する配列を意味する。
「類似体」は、１つ以上のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸残基の置換、付加または欠失の分だけ異なり、親または開始ポリペプチドの特性のうちの１つ以上を依然として維持するポリペプチド変異体を含むことを意味する。
本発明では、変異体および誘導体を含む、ポリペプチドベースの数種の組成物について検討される。これらは、置換、挿入、欠失および共有結合性の変異体および誘導体を含む。用語「誘導体」は、用語「変異体」と同義的に使用されるが、一般には、参照分子または開始分子に対して何らかの修飾および／または変更が施されている分子を示す。
そのようなものとして、参照配列に対して、置換、挿入および／または付加、欠失および共有結合修飾を有するポリペプチド、特に本明細書に開示されるポリペプチド配列をコードするｍｍＲＮＡは、本発明の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば１つ以上のリジンは、本発明のペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）付加してもよい。配列タグは、ペプチドの精製または局在化のために使用してもよい。リジンは、ペプチドの溶解度を高めるかまたはビオチン化を可能にするため、使用すること
ができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基は、任意選択的に欠失させ、切断された配列を提供することができる。あるいは、特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、例えば、可溶性のより大規模な配列の一部としての、または固体支持体に連結された配列の発現のような配列の使用に応じて欠失させてもよい。
「置換変異体」は、ポリペプチドを示す場合、天然または開始配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、かつ異なるアミノ酸が同一位置のその場所に挿入されているものである。置換は、分子中の唯一のアミノ酸が置換されている場合、単一であってもよく、または、２つ以上のアミノ酸が同一分子中で置換されている場合、置換は複数であってもよい。
本明細書で使用される用語「保存的アミノ酸置換」は、同様のサイズ、電荷、または極性の異なるアミノ酸の場合に配列内に常在するアミノ酸の置換を示す。保存的置換の例として、イソロイシン、バリンおよびロイシンなどの非極性（疎水性）残基と別の非極性残基との置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例として、１つの極性（親水性）残基と別の残基との置換、例えばアルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、およびグリシンとセリンとの置換が挙げられる。加えて、リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの塩基性残基と別の残基との置換、あるいはアスパラギン酸またはグルタミン酸などの１つの酸性残基と別の酸性残基との置換は、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例として、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基とシステイン、グルタミン、グルタミン酸またはリジンなどの極性（親水性）残基との置換および／または極性残基と非極性残基との置換が挙げられる。
「挿入変異体」は、ポリペプチドを示す場合、１つ以上のアミノ酸が天然または開始配列内の特定の位置のアミノ酸に直に隣接して挿入されているものを有するものである。アミノ酸に「直に隣接される」は、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかに接続されることを意味する。
「欠失変異体」は、ポリペプチドを示す場合、天然または開始アミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失変異体は、１つ以上のアミノ酸が分子の特定の領域内で欠失していることになる。
「共有結合誘導体」は、ポリペプチドを示す場合、天然または開始タンパク質の有機タンパク性または非タンパク性誘導体化剤による修飾、および／または翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、タンパク質の標的化アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することが可能な有機誘導体化剤と反応させるか、あるいは選択された組換え宿主細胞内で機能する翻訳後修飾の機構を利用することにより、伝統的に導入される。得られた共有結合誘導体は、生物学的活性、免疫測定、または組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の調製にとって重要な残基を同定するのに特化されたプログラムにおいて有用である。かかる修飾は、当業者の範囲内であり、過度な実験を行うことなく実施される。
特定の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に対して、翻訳後に脱アミド化されることが多い。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態は、本発明に従って生成されたポリペプチド中に存在する場合がある。
他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基の水
酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化を含む（Ｔ．Ｅ．クレイトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、「タンパク質：構造および分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．）、サンフランシスコ、ｐ．７９−８６（１９８３年））。
「特徴」は、ポリペプチドを示す場合、分子の特徴的なアミノ酸配列ベースの成分と定義される。本発明のｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの特徴は、表面発現（ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ）、局所立体構造形状、フォールド、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端またはそれらの任意の組み合わせ、を含む。
本明細書で使用される用語「表面発現」は、ポリペプチドを示す場合、最外側表面上に出現するタンパク質のポリペプチドベースの成分を示す。
本明細書で使用される用語「局所立体構造形状」は、ポリペプチドを示す場合、タンパク質の限定できる空間内部に位置するタンパク質のポリペプチドベースの構造の発現を意味する。
本明細書で使用される用語「フォールド」は、ポリペプチドを示す場合、エネルギー極小化時に得られたアミノ酸配列の立体構造を示す。フォールドは、フォールディング過程の二次または三次のレベルで生じ得る。二次レベルのフォールドの例として、βシートおよびαヘリックスが挙げられる。三次のフォールドの例として、エネルギーによる力の凝集または分離に起因して形成されるドメインおよび領域が挙げられる。このようにして形成される領域は、疎水性および親水性ポケットなどを含む。
本明細書で使用される用語「ターン」は、タンパク質立体構造に関する場合、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を変更するベンドを意味し、１つ、２つ、３つもしくはそれより多いアミノ酸残基を含んでもよい。
本明細書で使用される用語「ループ」は、ポリペプチドを示す場合、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を逆転させることに役立ち得るポリペプチドの構造的特徴を示す。ループがポリペプチド中に見出され、単に骨格の方向を変更する場合、それは４つ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。オリヴァ（Ｏｌｉｖａ）らは、少なくとも５つのクラスのタンパク質ループを同定している（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ）、第２６６巻、第４号、ｐ．８１４−８３０、１９９７年）。ループは、開鎖または閉鎖であり得る。閉鎖ループまたは「環状」ループは、架橋部分間に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより多いアミノ酸を含んでもよい。かかる架橋部分は、ジスルフィド架橋を有するポリペプチドに典型的なシステイン−システイン架橋（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を含んでもよく、あるいは架橋部分は、本明細書で使用されるジブロモジルイル剤（ｄｉｂｒｏｍｏｚｙｌｙｌ ａｇｅｎｔｓ）など、非タンパク質ベースであってもよい。
本明細書で使用される用語「ハーフループ」は、ポリペプチドを示す場合、元のループの少なくとも半数のアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）を有する同定されたループの一部を示す。ループが偶数のアミノ酸残基を常に有するとは限らない場合があることは理解されている。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含むかまたは含むことが同定されている場合、奇数化されたループのハーフループは、ループの整数部分または次の整数部分を含むことになる（ループのアミノ酸の数／２＋／−０．５アミノ酸）。例えば、７つのアミノ酸ループとして同定されたループであれば、３つのアミノ酸または４つのアミノ酸のハーフループを生成することができる（７／２＝３．５＋／−０．５は３または４である）
。
本明細書で使用される用語「ドメイン」は、ポリペプチドを示す場合、１つ以上の同定可能な構造的もしくは機能的特徴または特性（例えば、結合能、タンパク質−タンパク質相互作用のための部位として機能すること）を有するポリペプチドのモチーフを示す。
本明細書で使用される用語「ハーフドメイン」は、ポリペプチドを示す場合、元のドメインの少なくとも半数のアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）を有する同定されたドメインの一部を意味する。ドメインが偶数のアミノ酸残基を常に有するとは限らない場合があることは理解されている。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含むかまたは含むことが同定されている場合、奇数化されたドメインのハーフドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分を含むことになる（ドメインのアミノ酸の数／２＋／−０．５アミノ酸）。例えば、７つのアミノ酸ドメインとして同定されたドメインであれば、３つのアミノ酸または４つのアミノ酸のハーフドメインを生成することができる（７／２＝３．５＋／−０．５は３または４である）。また、サブドメインがドメインまたはハーフドメイン内で同定可能であり、これらのサブドメインは元のドメインまたはハーフドメインにおいて同定された構造的または機能的特性の全部未満を有することも理解されている。また、本明細書中のドメインタイプのいずれかを含むアミノ酸が、ポリペプチドの骨格に沿って近接する必要がない（すなわち、非隣接アミノ酸はドメイン、ハーフドメインまたはサブドメインを生成するように構造的に折り畳む場合がある）ことも理解されている。
本明細書で使用される用語「部位」は、ポリペプチドを示す場合、それがアミノ酸に基づく実施形態に関する場合、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義に用いられる。部位は、本発明のポリペプチドベースの分子内部での修飾、操作、変更、誘導体化または変動が可能であるペプチドまたはポリペプチド内部の位置を示す。
本明細書で使用される用語「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」または「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」は、ポリペプチドを示す場合、ペプチドまたはポリペプチドの末端を示す。かかる末端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最終部位のみに限定されることはないが、末端領域内の追加的なアミノ酸を含んでもよい。本発明のポリペプチドベースの分子は、（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終結される）Ｎ末端および（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸によって終結される）Ｃ末端の双方を有するものとして特徴づけることができる。本発明のタンパク質は、いくつかの場合、ジスルフィド結合または非共有結合力によって集められた複数のポリペプチド鎖で構成される（多量体、オリゴマー）。これらのタンパク質種は、複数のＮおよびＣ末端を有することになる。あるいは、ポリペプチドの末端は、場合によっては有機複合体などの非ポリペプチドベースの部分で開始または終結するように修飾してもよい。
一旦、特徴のいずれかが、同定されているか、あるいはポリペプチドの所望される成分が本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡによってコードされるものと定義されていると、これの特徴のいくつかの操作および／または修飾のいずれかは、移動、交換、逆位、欠失、無作為化または複製によって実施してもよい。さらに、特徴の操作が、本発明の分子に対する修飾と同じ結果をもたらす場合があることは理解されている。例えば、ドメインを欠失させることを含む操作であれば、ちょうど完全長未満の分子をコードする核酸の修飾の場合のように、分子の長さの変化をもたらすことになる。
修飾および操作は、限定はされないが部位特異的突然変異誘発などの当該技術分野で既知の方法により、行ってもよい。次いで、得られた修飾分子は、例えば本明細書に記載のインビトロまたはインビボアッセイあるいは当該技術分野で既知の任意の他の適切なスクリーニングアッセイを用いて、活性について試験してもよい。
本発明によると、ポリペプチドは、一連の実験を通じて発見される共通配列を含んでもよい。本明細書で使用される「共通」配列は、１つ以上の部位での変異性を可能にする配列の集団（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を示す単一の配列である。
当業者によって理解されているように、タンパク質断片、機能タンパク質ドメイン、および相同性タンパク質はまた、本発明の目的のポリペプチドの範囲内に含まれると考えられる。例えば、本明細書に提供されるのは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１００を超えるアミノ酸長の参照タンパク質の任意のタンパク質断片（ポリペプチド配列、参照ポリペプチド配列より短いが、それ以外では同一である、少なくとも１つのアミノ酸残基を意味する）である。別の例では、本明細書に記載の配列のいずれかに対して、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％同一である、約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００個のアミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質は、本発明に従って利用してもよい。特定の実施形態では、本発明に従って利用するべきポリペプチドは、本明細書に提供または参照される配列のいずれかに示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多い突然変異を含む。
コード化ポリペプチド
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ペプチド（ｐｅｐｅｔｉｄｅｓ）およびタンパク質などの目的のポリペプチドをコードするように設計してもよい。
一実施形態では、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、参照ポリペプチド配列とのある程度の同一性を有する変異体ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用される「参照ポリペプチド配列」は、開始ポリペプチド配列を示す。参照配列は、野生型配列または別の配列の設計において参照がなされる任意の配列であってもよい。「参照ポリペプチド配列」は、任意のコードＬＤＬＲおよび／またはＣＹＰ７ａ１またはその変異体であってもよい。
当該技術分野で既知の用語「同一性」は、２つ以上のペプチドの配列間で、これらの配列を比較することによって決定される関係を示す。当該技術分野では、同一性は、また、２つ以上のアミノ酸残基の文字列間のマッチ数によって決定される、ペプチド間の配列関連性の度合いを意味する。同一性は、特定の数学的モデル若しくはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によるギャップアライメント（もしあれば）の２つ以上の配列の小さい方の間の同一マッチのパーセントを評価する。関連のペプチドの同一性は、既知の方法により、容易に計算することができる。かかる方法は、限定はされないが、「コンピュータによる分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスク Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８年；「バイオコンピューティング：インフォマティクスおよびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミス Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３年；「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）」、第一部、グリフィン Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）、およびグリフィン Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー、１９９４年；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、フォン・ハインヘ Ｇ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリブスコフ Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデヴリュー Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、エム・ストックトン・プレス（Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１年；およびカリリョ（Ｃａｒｉｌｌｏ）ら著、エスアイエイエム・ジャーナル・オン・アプライド・マスマティックス（ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、第４８巻、ｐ．１０７３（１９８８年）に記載のものを含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドと同一または類似の活性を有してもよい。あるいは、変異体は、参照ポリペプチドに対して変更された活性（例えば、増強または低下されたもの）を有してもよい。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが１００％未満の、本明細書に記載されかつ当業者に既知の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによる決定された配列同一性を有することになる。アラインメント用のかかるツールは、ＢＬＡＳＴスイート（ステフェン Ｆ．アルチュル（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、トーマス Ｌ．メイデン（Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ）、アレハンドロ Ａ．シャッファー（Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ）、ジンフイ・チャン（Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ）、チェン・チャン（Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ）、ウェッブ・ミラー（Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ）、およびデイビッド Ｊ．リプマン（Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ）（１９９７年）、「ギャップ化ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース探索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）、第２５巻、ｐ．３３８９−３４０２）の場合を含む。他のツールは、本明細書中に、詳細には「同一性」の定義において記載される。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムにおけるデフォルトパラメータは、例えば、期待閾値が１０、ワードサイズが２８、マッチスコアが１／ミスマッチスコアが−２、ギャップコストがリニア、を含む。任意のフィルタとともに種に特異的なリピートにおける選択（例えばヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）は適用可能である。
ペプチド
本明細書に開示される一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の検証された、または「試験中の」タンパク質またはペプチドをコードし得る。
本発明によると、現在市販されているかまたは開発中の１つ以上のタンパク質またはペプチドは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物または腫瘍関連（ｏｎｃｏｌｏｇｙ−ｒｅｌａｔｅｄ）ｍｍＲＮＡによってコードされ得る。理論に拘束されることは望まないが、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡに組み込む結果、少なくとも一部には、構築物設計の特異性、純度および選択性により、治療効果が改善されることになると考えられている。
ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、生物学的および／もしくは生理学的プロセスおよび／または化合物を変更し、例えば限定はされないが、疾患および／もしくは障害の進行を変更し（例えば緩徐化し）、コレステロールおよび／もしくは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールを低下させ、クリグラーネジャー症候群を改善し、ヘプシジンおよび／もしくはヘモクロマトーシス２型の機能を回復させて鉄の
取り込みを調節し、胆汁酸代謝を回復させ、家族性高コレステロール血症における冠動脈心疾患リスクを低下させ、角質増殖プラーク（ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）および角膜薄濁を予防し、それにより、手および／または足における角質増殖型プラークを治癒する可能性がある。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、欠失または突然変異遺伝子から生成されるタンパク質を置き換えることを意図して、細胞または組織内でポリペプチドを発現するために使用してもよい。
さらに、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、希少な肝臓疾患および／または障害に関する代謝障害を治療するために使用してもよい。
隣接領域：非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ：Ｕｎｓｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎ）は、転写されるが、翻訳されない。５’ＵＴＲは、転写開始部位に始まり、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まない一方、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性および翻訳の観点における、ＵＴＲによって発揮される調節的役割についての確固たる証拠が増えている。ＵＴＲの調節的特徴が、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡの中に組み込まれることで、分子の安定性が高まる可能性がある。さらに、その特有の特徴が組み込まれることで、望まれない器官の部位に誤って誘導される場合に、転写物の制御された下方制御が確実になる可能性がある。
５’ＵＴＲおよび翻訳開始
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始において幾つかの役割を果たすという特徴を有する。それは、リボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始させる場合のプロセスに関与することが一般的に知られている、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列のようなシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を内在する。コザック配列は、共通ＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（式中、Ｒは、別の「Ｇ」が後続する開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）である）を有する。５’ＵＴＲはまた、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
典型的には特定の標的器官で豊富に発現される遺伝子において見出される特徴を操作することにより、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの安定性およびタンパク質生成を高めることができる。例えば、肝臓で発現されたｍＲＮＡの５’ＵＴＲの導入は、例えばアルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子であれば、肝細胞株または肝臓における、核酸分子、例えばｍｍＲＮＡの発現を増強するために用いることができる。同様に、他の組織に特異的なｍＲＮＡ由来の５’ＵＴＲを、その組織における発現を高めるために使用することは、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン（Ｈｅｒｃｕｌｉｎ））、内皮細胞（Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄系細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）および肺上皮細胞（ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）の場合に可能である。
他の非ＵＴＲ配列は、５’ＵＴＲ（または３’ＵＴＲ）に組み込んでもよい。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの隣接領域に組み込んでもよい。イントロン配列の組み込みにより、タンパク質生成ならびにｍＲＮＡレベルが高まる可能性がある。
本発明における使用に選択可能な５’ＵＴＲは、構造化ＵＴＲ（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ
ＵＴＲ）、例えば限定はされないが、翻訳を制御するための５’ＵＴＲであってもよい。非限定例として、構造５’ＵＴＲは、「ＲＮＡ構築物を用いた異なる標的化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）」という表題の２０１３年１月３１日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／７５８，９２１号明細書；「ＲＮＡ構築物を用いた異なる標的化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）」という表題の２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８１，１３９号明細書；「末端が最適化されたＲＮＡ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＲＮＡｓ）」という表題の２０１２年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／７２９，９３３号明細書；「末端が最適化されたＲＮＡ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＲＮＡｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，２２４号明細書、および「末端が最適化されたＲＮＡ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＲＮＡｓ）」という表題の２０１３年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／８２９，３５９号明細書（これらの各々はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載の末端修飾のいずれかを用いる場合、有利でありうる。
３’ＵＴＲおよびＡＵリッチ領域
３’ＵＴＲは、その中に組み込まれたアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅｓ）およびウリジン（Ｕｒｉｄｉｎｅｓ）の区間を有することが知られている。これらのＡＵリッチのシグネチャーは、特に高い代謝回転速度を有する遺伝子中に頻出する。ＡＵリッチ領域（ＡＲＥ：ＡＵ ｒｉｃｈ ｅｌｅｍｅｎｔ）は、その配列の特徴および機能的特性に基づき、３つのクラスに分離可能である（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９５年）。すなわち、クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内に数個の散在したＡＵＵＵＡモチーフのコピーを有する。Ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏＤは、クラスＩ ＡＲＥを有する。クラスＩＩ ＡＲＥは、２つ以上の重なるＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。このタイプのＡＲＥを有する分子は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａを含む。クラスＩＩＩ ＡＲＥＳは、定義があまり十分ではない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを有しない。ｃ−Ｊｕｎおよびミオゲニンは、このクラスの２つの十分に研究された例である。ＡＲＥに結合する大部分のタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られている一方、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、中でも注目すべきＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を高めることが文書化されている。ＨｕＲは、３つすべてのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲに特異的な結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲ中に操作することにより、ＨｕＲの結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化が得られることになる。
３’ＵＴＲ ＡＵリッチ領域（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの安定性を調節するために用いてもよい。特定のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入することで、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡに対して、安定性を低下させ、それにより翻訳を抑制し、得られるタンパク質の生成を低下させ得る。同様に、ＡＲＥは、同定して除去するか、または変異導入することで、細胞内の安定性を高め、ひいては得られるタンパク質の翻訳および生成を高め得る。遺伝子導入実験は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて関連の細胞株において実施してもよく、またタンパク質生成は、遺伝子導入後の様々な時点でアッセイしてもよい。例えば、細胞への遺伝子導入は、様々なＡＲＥを操作した分子を用い、また関連のタンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを使用し、かつ遺伝子導入から６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７日経過後に生成されたタンパク質をアッセイすることによって行ってもよい。
マイクロＲＮＡ結合部位の組み込み
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、また遺伝子発現を、核酸分子の安定性を低下させるかまたは翻訳を阻害するかのいずれかにより下方制御する、１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡ結合部位、またはマイクロＲＮＡシードを含んでもよい。かかる配列は、任意の既知のマイクロＲＮＡ、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書および米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書に教示されるもの、または２０１３年１月３１日に出願された同時係属中の米国特許出願第６１／７５８，９２１号明細書（代理人整理番号２０３０．１０３９）の表７中に列挙されたもの（その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）に対応し得る。
マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟マイクロＲＮＡの位置２〜８の領域内の配列を含み、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン・クリックの相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの位置２〜８または２〜７を含んでもよい。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、７つのヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含んでもよく、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的における、シードに相補的な部位は、マイクロＲＮＡの１位に対抗するアデニン（Ａ）によって隣接される。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、６つのヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含んでもよく、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシードに相補的部位は、マイクロＲＮＡ位置１に対向するアデニン（Ａ）によって隣接される。例えば、グリムソン Ａ（Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ）、ファー ＫＫ（Ｆａｒｈ ＫＫ）、ジョンストン ＷＫ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ）、ガレット・エンゲレ Ｐ（Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ）、リム ＬＰ（Ｌｉｍ
ＬＰ）、バーテル ＤＰ（Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ）；モレキュラー・セル（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．）、２００７年７月６日；第２７巻、第１号、ｐ．９１−１０５を参照のこと。マイクロＲＮＡシードの塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。マイクロＲＮＡ標的配列を本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲに操作することにより、問題のマイクロＲＮＡが利用可能であるという条件で、分子の分解または翻訳低下について標的化することができる。このプロセスは、核酸分子送達に対するオフターゲット効果のハザードを低減することになる。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域、およびその発現パターンおよび生物学における役割の同定については、報告されている（ボナウアー（Ｂｏｎａｕｅｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ターゲッツ（Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ）、２０１０年１１月、ｐ．９４３−９４９；アーナンド（Ａｎａｎｄ）およびチェリッシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１−１７６；コントレラス（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ）およびラオ（Ｒａｏ）、ロイケミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、２０１２年、第２６巻、ｐ．４０４−４１３（２０１１年１２月２０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）、２００９年、第１３６巻、ｐ．２１５−２３３；ランドグラフ（Ｌａｎｄｇｒａｆ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、２００７年、第１２９巻、ｐ．１４０１−１４１４）。
例えば、核酸分子がｍＲＮＡであり、肝臓への送達は意図されないがそこに到達する場合、肝臓に豊富に存在するマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２は、ｍｉＲ−１２２の１つもしくは複数の標的部位がポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲの中に操作される場合、目的の遺伝子の発現を阻害し得る。異なるマイクロＲＮＡへの１つもしくは複数の結合部位の導入により、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの寿命、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに低下させるように操作することができる。
本明細書で使用される用語「マイクロＲＮＡ部位」は、マイクロＲＮＡ標的部位またはマイクロＲＮＡ認識部位、またはマイクロＲＮＡが結合または会合する任意のヌクレオチド配列を示す。「結合」が、伝統的なワトソン・クリックのハイブリダイゼーション則に従い得るか、あるいはマイクロＲＮＡ部位またはその近隣でのマイクロＲＮＡと標的配列との任意の安定な会合を示し得ることは理解されるべきである。
逆に、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを目的として、マイクロＲＮＡ結合部位は、特定の組織内でのタンパク質発現を増強するため、自然発生する配列から外へ操作（すなわち、配列から除去）することができる。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位は、肝臓におけるタンパク質発現を改善するため、除去してもよい。複数の組織内での発現の調節は、１個もしくは数個のマイクロＲＮＡ結合部位の導入または除去を通じて行うことができる。
マイクロＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、ひいてはタンパク質発現を調節することが知られている場合の組織の例として、限定はされないが、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄系細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）、が挙げられる。マイクロＲＮＡはまた、血管新生などの複雑な生物学的過程を調節し得る（ｍｉＲ−１３２）（アーナンド（Ａｎａｎｄ）およびチェリッシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１−１７６）。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡにおいては、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの発現を生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的過程の状況に適合させるため、かかる過程に関与するマイクロＲＮＡにおける結合部位は、除去または導入してもよい。
最後に、様々な細胞型におけるマイクロＲＮＡの発現パターンの理解を通じて、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、特定の細胞型におけるまたは単に特定の生物学的条件下で、より標的化された発現を意図して操作することができる。組織特異的なマイクロＲＮＡ結合部位の導入を介する場合、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、組織内または生物学的条件の状況下で、タンパク質発現を最適化するように設計することができる。
遺伝子導入実験は、関連の細胞株中で、操作されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて実施してもよく、またタンパク質生成は、遺伝子導入後の様々な時点でアッセイしてもよい。例えば、細胞に、様々なマイクロＲＮＡ結合部位の操作ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを遺伝子導入し、そこでは、ＥＬＩＳＡキットを関連のタンパク質に対して用い、遺伝子導入後の６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日間経過後に生成されたタンパク質をアッセイしてもよい。インビボ実験はまた、マイクロＲＮＡ結合部位の操作分子を用いて実施し、調合されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの組織特異的発現における変化を試験してもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ配列またはその変異体を含んでもよい。ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡにおいて使用されるｍｉＲ配列の不完全なリストが、同時係属中のＰＣＴ／ＵＳ１３／６２５３１号明細書（Ｍ０３７．２０）（その内容はその全体が
参照により本明細書に援用される）の表９中に記載されている。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼまたはＰＣＳＫ９の非翻訳領域に結合し、それを阻害する、少なくとも１つのｍｉＲ配列を含んでもよい。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼまたはＰＣＳＫ９の非翻訳領域に結合し、それを阻害するｍｉＲ配列の非限定例が、国際公開第２０１３１５４７６６号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に援用される）中に記載されている。非限定例として、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−２２４またはその変異体を含むｍｉＲ配列を含んでもよい（例えば、国際公開第２０１３１５４７６６号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に援用される）を参照）。別の非限定例として、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、国際公開第２０１３１５４７６６号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に援用される）の配列番号１、配列番号２、配列番号１０および／または配列番号１１を含むかまたはコードするｍｉＲ配列を含んでもよい。さらに別の非限定例として、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−２２４またはその変異体を含むｍｉＲ配列を含んでもよい（例えば、国際公開第２０１３１５４７６６号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に援用される）を参照）。別の非限定例として、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐおよびｍｉＲ−２２４またはその変異体を含むｍｉＲ配列を含んでもよい（例えば、国際公開第２０１３１５４７６６号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に援用される）を参照）。
５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡ安定性を向上させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ：Ｃａｐ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合し、これは、ＣＢＰのポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して細胞におけるｍＲＮＡ安定性および翻訳適格性に関与し、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。さらに、キャップは、ｍＲＮＡスプライシング中での５’近位のイントロン除去という除去を支援する。
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端をキャップすることで、末端のグアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端の転写されたセンスヌクレオチドの間に５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸結合を生成することができる。次いで、この５’−グアニル酸キャップは、メチル化することで、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生成することができる。また、ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）での転写ヌクレオチドのリボース糖は、任意選択的に２’−Ｏ−メチル化してもよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を介した５’のキャップ除去は、核酸分子、例えばｍＲＮＡ分子の分解を標的にできる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡに対する修飾により、非加水分解性キャップ構造が得られ、それにより、キャップ除去を防止し、ひいてはｍＲＮＡの半減期を延長させることができる。キャップ構造の加水分解には５’−ｐｐｐ−５’ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合の切断が必要であることから、修飾ヌクレオチドは、キャッピング反応中に使用してもよい。例えば、ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（イプスウィッチ、マサチューセッツ州）製のワクシニアキャッピング酵素は、製造業者の使用説明書に従い、α−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに使用することで、５’−ｐｐｐ−５’キャップにおいてホスホロチオエート結合を生成する生じさせることができる。α−メチル−ホスホネートおよびセレノ−リン酸ヌクレオチド（ｓｅｌｅｎｏ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）などのさらなる修飾グアノシンヌクレオチドを使用してもよい。
さらなる修飾は、限定はされないが、糖環の２’−水酸基に対する（上記のような）ｍＲＮＡの５’末端および／または５’−末端前ヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化を含む。複数の異なる５’−キャップ構造を使用し、核酸分子、例えばｍＲＮＡ分子の５’−キャップを作製することができる。
キャップ類似体は、本明細書で合成キャップ類似体、化学的キャップ、化学的キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも称され、その化学構造において、天然（すなわち、内因性、野生型または生理学的）５’−キャップと異なる一方、キャップ機能を保持する。キャップ類似体は、化学的に（すなわち非酵素的に）または酵素的に合成し、核酸分子に連結させてもよい。
例えば、抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ：Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）のキャップは、５’−５’−三リン酸基によって結合された２つのグアニンを有し、ここで、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基および３’−Ｏ−メチル基（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ；同様に（ｅｑｕｉｖａｌｉｅｎｔｌｙ）３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと命名される場合がある）を有する。他方の非修飾グアニンの３’−Ｏ原子は、キャッピングされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに結合されるようになる。Ｎ７−および３’−Ｏ−メチル化（ｍｅｔｈｌｙａｔｅｄ）グアニンは、キャッピングされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。
別の典型的なキャップはｍＣＡＰであり、それはＡＲＣＡに類似するが、グアノシン上に２’−Ｏ−メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
キャップ類似体は、インビトロ転写反応において核酸分子に付随するキャッピングを可能にする一方、最大２０％の転写物がキャッピングされない状態を維持する。このことと、キャップ類似体の、内因性の細胞転写機構によってもたらされる核酸の内因性５’−キャップ構造との構造的差異は、翻訳適格性の低下および細胞安定性の低下をもたらし得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡはまた、より確証的な５’−キャップ構造を生じさせるため、転写後に、酵素を用いてキャッピングしてもよい。本明細書で使用される語句「より確証的な」は、構造的または機能的に内因性または野生型の特徴を厳密に写すかまたは模倣する特徴を示す。すなわち、「より確証的な」特徴は、内因性、野生型、天然のもしくは生理学的な細胞機能および／または構造の、先行技術の合成された特徴または類似体などより優れた典型であるか、あるいは、１つ以上の観点から、対応する内因性、野生型、天然のまたは生理学的な特徴を上回る。本発明のより確証的な５’キャップ構造の非限定例として、当該技術分野で既知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然のまたは生理学的な５’キャップ構造）に対して、数ある中でも、キャップ結合タンパク質の結合を増強させ、半減期を延長させ、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性を低下させ、および／または５’キャップ除去を低下させているものが挙げられる。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドの間に基準の５’−５’−三リン酸結合を生じさせることができ、ここで、キャップグアニンはＮ７メチル化を有し、またｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルを有する。かかる構造は、Ｃａｐ１構造と称される。このキャップは、例えば当該技術分野で既知の他の５’キャップ類似体構造に対して、翻訳適格性および細胞安定性の向上ならびに細胞の炎症促進性サイトカイン活性化の低下をもたらす。キャップ構造は、
７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（Ｃａｐ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（Ｃａｐ１）、および７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（Ｃａｐ２）を含む。
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡが転写後にキャッピング可能であり、またこのプロセスがより効率的であることから、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの約１００％がキャッピング可能である。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でｍＲＮＡに結合される場合の約８０％とは対照的である。
本発明によると、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含んでもよい。本発明によると、５’末端キャップは、グアニン類似体を含んでもよい。有用なグアニン類似体は、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンを含む。
ウイルス配列
限定はされないがオオムギ黄化萎縮ウイルス（ｂａｒｌｅｙ ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ）（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）の翻訳エンハンサー配列などのさらなるウイルス配列は、操作し、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲに挿入してもよく、インビトロおよびインビボで構築物の翻訳を刺激し得る。遺伝子導入実験は、関連の細胞株中で実施してもよく、またタンパク質生成は、遺伝子導入から１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日間経過後、ＥＬＩＳＡによりアッセイしてもよい。
ＩＲＥＳ配列
さらに、提供されるのは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を有し得るポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡである。ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａ ｖｉｒｕｓ）ＲＮＡの特徴として最初に同定されたＩＲＥＳは、５’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始する場合に重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として作用し得るか、またはｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位のうちの１つとして機能し得る。２つ以上の機能的リボソーム結合部位を有するポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、リボソームによって独立に翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（「マルチシストロン性（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）核酸分子」）。ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡにＩＲＥＳが提供される場合、さらに任意選択的に提供されるのは、第２の翻訳可能領域である。本発明に従って使用可能なＩＲＥＳ配列の例として、限定はされないが、ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ）（例えばＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ：ｐｏｌｉｏ ｖｉｒｕｓｅｓ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ：ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓｅｓ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ：ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓｅｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓｅｓ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ：ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ：ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ：ｃｒｉｃｋｅｔ ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）に由来するものが挙げられる。
ポリＡテール
ＲＮＡプロセシングの間、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）は、安定性を
向上させるため、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加してもよい。転写の直後、転写物の３’末端は、切断し、３’ヒドロキシルを遊離させてもよい。次いで、ポリＡポリメラーゼにより、アデニンヌクレオチドの鎖がＲＮＡに付加される。ポリアデニル化と称されるプロセスでは、１００〜２５０の間の残基長であり得るポリＡテールが付加される。
ユニークなポリＡテール長が、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡに対して特定の利点をもたらすことが発見されている。
一般に、本発明のポリＡテールの長さは、３０ヌクレオチド長より長い。別の実施形態では、ポリＡテールは、長さが３５ヌクレオチドを超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００ヌクレオチドまたはそれを超える）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約３０〜約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、および２，５００〜３，０００）を含む。
一実施形態では、ポリＡテールは、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの全長に関して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴または領域（第１または隣接領域など）の長さ、あるいはポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡから発現される最終産物の長さに基づいてもよい。
これに関連して、ポリＡテールは、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡあるいはその特徴よりも長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長くてもよい。ポリＡテールはまた、それが属するポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの一画分として設計してもよい。これに関連して、ポリＡテールは、構築物の全長または構築物ポリＡテールの全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上であってもよい。さらに、ポリＡ結合タンパク質に対するポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの操作された結合部位および抱合は、発現を増強し得る。
加えて、複数の異なるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ポリＡテールの３’末端での修飾ヌクレオチドを用いて、ＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）に３’末端を介して互いに連結してもよい。遺伝子導入実験は、関連の細胞株中で実施してもよく、またタンパク質生成は、遺伝子導入から１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日間後、ＥＬＩＳＡによりアッセイしてもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの一次構築物は、ポリＡ−Ｇカルテットを含むように設計される。Ｇ−カルテットは、ＤＮＡおよびＲＮＡの双方の中のＧリッチ配列によって形成可能な、４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。本実
施形態では、Ｇ−カルテットは、ポリＡテールの末端に取り込まれる。得られたｍｍＲＮＡ構築物は、安定性、タンパク質生成および様々な時点での半減期を含む他のパラメータについてアッセイされる。ポリＡ−Ｇカルテットが、１２０のヌクレオチドのポリＡテールを単独で用いて見られる場合の少なくとも７５％に相当するタンパク質生成をもたらすことが発見されている。
定量
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の体液に由来するエキソソーム中で定量化してもよい。本明細書で使用される「体液」は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液または尿道球腺液、汗、糞便物質、毛髪、涙、嚢胞液、胸水および腹水、心膜液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、月経液（ｍｅｎｓｅｓ）、膿汁、皮脂、嘔吐液（ｖｏｍｉｔ）、腟分泌物、粘膜分泌物（ｍｕｃｏｓａｌ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）、水様便（ｓｔｏｏｌ ｗａｔｅｒ）、膵液、洞腔（ｓｉｎｕｓ ｃａｖｉｔｉｅｓ）からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液（ｂｌａｓｔｏｃｙｌ ｃａｖｉｔｙ ｆｌｕｉｄ）、および臍帯血、を含む。あるいは、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から回収してもよい。
定量化方法では、２ｍＬ以下の試料は、対象から得られ、エキソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心、ナノメンブレン限界濾過、免疫吸着捕捉（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ｃａｐｔｕｒｅ）、親和性精製、マイクロ流体分離、またはその組み合わせ、により単離される。分析においては、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、不在、切断または改変であり得る。同レベルを１つ以上の臨床像またはヒト疾患のバイオマーカーのためのアッセイと相関させることは有利である。アッセイは、構築物に特異的なプローブ、細胞数測定、ｑＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはその組み合わせを用いて実施できる一方、エキソソームは、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）法などの免疫組織化学的方法を用いて単離してもよい。エキソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心、ナノメンブレン限界濾過、免疫吸着捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはその組み合わせによって単離してもよい。
これらの方法は、研究者に、残存するかまたは送達されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのレベルをリアルタイムに監視する能力を提供する。このことは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡが、構造または化学修飾が原因で内因性形態と異なることから可能である。
ＩＩ．ｍｍＲＮＡの設計および合成
本発明に従って使用されるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、限定はされないが、化学合成、酵素合成（一般にインビトロ転写（ＩＶＴ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）または長い方の前駆体の酵素的もしくは化学的切断などと称される）を含む任意の利用可能な技術によって調製してもよい。ＲＮＡを合成する方法は、当該技術分野で既知である（例えば、ゲイト，Ｍ．Ｊ．（Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．）（編）、「オリゴヌクレオチド合成：現実的アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）」、オックスフォード［オックスフォードシャー州］、ワシントンＤＣ：アイアールエル・プレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、１９８４年；およびヘルデウィーンＰ．（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．）（編）、「オリゴヌクレオチド合成：方法および用途（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２８８巻（クリフトン，ニュージャージー州（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．））、トトワ，ニュージャージー州（Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）：ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、２００５年を参照；これらの双方は参照により本明細書中に援用される）。
本発明の一次構築物の設計および合成の方法は、一般に、遺伝子構築、ｍＲＮＡ生成（修飾の存在下または不在下のいずれか）および精製のステップを含む。酵素的合成法では、目的のポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列が、増幅されてｃＤＮＡ鋳型を生成することになるベクターに組み込むため、最初に選択される。任意選択的には、標的ポリヌクレオチド配列および／または任意のフランキング配列は、コドン最適化してもよい。次いで、ｃＤＮＡ鋳型は、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介してｍＲＮＡを生成するために使用される。生成後、ｍＲＮＡには、精製およびクリーンアッププロセスを施してもよい。そのステップは、下記により詳細に提供される。
遺伝子構築
遺伝子構築のステップは、限定はされないが、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド直線化およびクリーンアップ、ならびにｃＤＮＡ鋳型合成およびクリーンアップを含んでもよい。
遺伝子合成
一旦、目的のポリペプチドまたは標的が生成のために選択されると、一次構築物が設計される。一次構築物内部の、目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１領域は、選択された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）転写物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を用いて構築してもよい。ＯＲＦは、野生型ＯＲＦ、アイソフォーム、変異体またはその断片を含んでもよい。本明細書で使用される「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、目的のポリペプチドをコードすることができる核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を示すことを意味する。ＯＲＦは、開始コドンＡＴＧで始まり、ナンセンスもしくは終止コドンまたはシグナルで終結することが多い。
さらに、第１領域のヌクレオチド配列は、コドン最適化してもよい。コドン最適化方法は、当該技術分野で既知であり、いくつかの目標のうちの１つ以上を達成するための努力において有用であり得る。これらの目標は、標的および宿主生物におけるコドン頻度を整合させ、適切なフォールディングを確実にする、ＧＣ含量にばらつきを持たせ、ｍＲＮＡの安定性を向上させるかまたは二次構造を低減する、遺伝子構築または発現を障害し得る縦列反復コドンまたは塩基ランを最小化する、転写および翻訳制御領域をカスタマイズする、タンパク質輸送配列を挿入または除去する、コード化タンパク質中の翻訳後修飾部位（例えば糖鎖付加部位）を除去／付加する、タンパク質ドメインを付加、除去またはシャッフルする、制限部位を挿入するかまたは欠失させる、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾する、翻訳速度を調節し、タンパク質の様々なドメインが適切にフォールドすることを可能にする、あるいはｍＲＮＡ内部の二次構造の問題を低減または排除することを含む。コドン最適化ツール、アルゴリズムおよびサービスは、当該技術分野で既知であり、非限定例として、ジーンアート（ＧｅｎｅＡｒｔ）（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））および／またはディーエヌエー２．０（ＤＮＡ２．０）（メンローパーク、カリフォルニア州）からのサービスが挙げられる。一実施形態では、ＯＲＦ配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。各アミノ酸におけるコドンの選択肢は、表１に示される。
表１．コドンオプション
一実施形態では、修飾ｍＲＮＡヌクレオチド配列の少なくとも一部は、当該技術分野で既知および／または本明細書に記載の方法により、コドン最適化してもよい。配列は、コドン最適化された後、制限部位を有する領域についてさらに評価してもよい。制限部位を配列から除去するため、制限部位領域内の少なくとも１つのヌクレオチドは、別のヌクレオチドと置換してもよいが、ヌクレオチドの置換は、コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を変更することになる。
本発明の一部の実施形態において有利であると考えられる場合がある特徴は、一次構築物によってコードされ得、また第１または第２隣接領域としてＯＲＦに隣接し得る。隣接領域は、ＯＲＦの最適化の前および／または後に一次構築物中に組み込んでもよい。一次構築物が５’および３’隣接領域の双方を有することは必要ではない。かかる特徴の例として、限定はされないが、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、および検出可能なタグが挙げられ、またＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローニング部位を挙げてもよい。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、隣接領域として提供してもよい。複数の５’または３’ＵＴＲは、隣接領域内に含めてもよく、また同一または異なる配列であってもよい。何も含まない隣接領域の任意の部分は、コドン最適化してもよく、またいずれも、コドン最適化の前および／または後に、１つ以上の異なる構造または化学修飾を独立に有してもよい。特徴の組み合わせは、第１および第２隣接領域内に含ませてもよく、他の特徴の中に含ませてもよい。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含み得る５’ＵＴＲおよび／またはポリＡテールの鋳型的付加のためにオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲにより、隣接させてもよい。
２０１２年１２月１４日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書の表２および３は、隣接領域として本発明の一次構築物において利用可能な典型的なＵＴＲのリストを提供している。５’または３’ＵＴＲの変異体は利用してもよく、ここで、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを含む１つ以上のヌクレオチドは、末端に添加されるかまたは除去される。
列挙されたものは例であり、任意の遺伝子に由来する任意のＵＴＲが一次構築物の各々の第１または第２隣接領域中に組み込み可能であることは理解されるべきである。さらに、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲは、利用してもよい。野生型遺伝子の変異体でない人工的ＵＴＲを提供することも、本発明の範囲内に含まれる。これらのＵＴＲまたはそれらの一部は、それらが選択された元である転写物の場合と同一の方向に配置してもよく、あるいは方向または位置において変更してもよい。それ故、５’または３’ＵＴＲは、反転させ、短縮し、延長し、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲとキメラを作製してもよい。本明細書で使用される用語「変更された」は、ＵＴＲ配列に関する場合、ＵＴＲが参照配列に対して何らかの方法で変化していることを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上で教示のように方向または位置における変化により、野生型または天然ＵＴＲに対して変更してもよくあるいは、追加的なヌクレオチドの封入、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換または転位により変更してもよい。「変更された」ＵＴＲ（３’または５’のいずれか）をもたらすこれらの変化のいずれかは、変異体ＵＴＲを含む。
一実施形態では、５または３’ＵＴＲなどの二重、三重または四重ＵＴＲは使用してもよい。本明細書で使用される「二重」ＵＴＲは、同一ＵＴＲの２つのコピーが順番にまたは実質的に順番にコードされるものである。例えば、二重β−グロビン３’ＵＴＲは、米国特許出願公開第２０１００１２９８７７号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のように使用してもよい。
また、パターン化されたＵＴＲを有することは、本発明の範囲内に含まれる。本明細書で使用される「パターン化されたＵＴＲ」は、反復または交互パターン、例えば、１回、２回、または３回より多く反復される、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはその変異体を示すＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルでの異なるＵＴＲを示す。
一実施形態では、隣接領域は、タンパク質が一般的な機能、構造、特性の特徴を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞内、組織内または発生中の随時、発現されるタンパク質のファミリーに属してもよい。これらの遺伝子のいずれかに由来するＵＴＲは、タンパク質の同じまたは異なるファミリーの任意の他のＵＴＲと交換し、新しいキメラ一次転写物を作製してもよい。本明細書で使用される「タンパク質のファミリー」は、最も広い意味では、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する２つ以上の目的のポリペプチド群を示すように使用される。
一次構築物成分は、（必要に応じて）最適化後、限定はされないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体などのベクターに再構成され、形質転換される。例えば、最適化された構築物は、高コピーのプラスミド様構造または染色体構造が本明細書に記載の方法によって生じる場合、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、酵母、パンカビ（ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、トウモロコシ、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）などに再構成し、形質転換することができる。
終止コドン
一実施形態では、本発明の一次構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含んでもよい。終止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧから選択してもよい。一実施形態では、本発明の一次構築物は、終止コドンＴＧＡおよび１つの追加的な終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加的な終止コドンは、ＴＡＡであってもよい。
別の実施形態では、本発明の一次構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に３つの終止コドンを含んでもよい。
ベクター増幅
次いで、一次構築物を有するベクターは増幅され、限定はされないが、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ハイピュア・マキシプレップ・キット（ＨｉＰｕｒｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア州）を用いるマキシプレップ（ｍａｘｉ ｐｒｅｐ）など、当該技術分野で既知の方法を用いて、プラスミドは単離され、精製される。
プラスミドの直線化
次いで、プラスミドは、限定はされないが制限酵素および緩衝液の使用などの当該技術分野で既知の方法を用いて直線化してもよい。直線化反応は、例えばインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア州）を含む方法、ならびに、限定はされないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）およびインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製の標準のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲキット（ＰＣＲ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア州）などのＨＰＬＣに基づく精製方法を用いて精製してもよい。精製方法は、実施された直線化反応のサイズに応じて変更してもよい。次いで、直線化プラスミドは、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応用のｃＤＮＡを作製するために使用される。
ｃＤＮＡ鋳型の合成
ｃＤＮＡ鋳型は、直線化プラスミドにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を施すことによって合成してもよい。２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書の表４は、本発明のＰＣＲ反応において有用であり（ｕｓｅｆｕｌｌｙ）得るプライマーおよびプローブのリストを提供する。リストが完全ではなく、また任意の増幅におけるプライマー−プローブ設計が当業者の範囲内であることは理解されるべきである。プローブはまた、標的分子に対する塩基対合の忠実度および塩基対合強度を高めるため、化学修飾塩基を有してもよい。
一実施形態では、ｃＤＮＡは、転写を施す前に配列決定分析に供してもよい。
ｍＲＮＡ生成
ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ生成のプロセスは、限定はされないが、インビトロ転写、ｃＤＮＡ鋳型除去およびＲＮＡクリーンアップ、およびｍＲＮＡキャッピングおよび／またはテーリング反応を含んでもよい。
インビトロ転写
先行ステップにおいて生成されたｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を用いて転写してもよい。同系は、典型的には転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リボヌクレアーゼ阻害剤およびポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、内製するか、供給者から選択するか、または本明細書に記載のように合成してもよい。ＮＴＰは、限定はされないが、天然および非天然（修飾）ＮＴＰを
含む本明細書に記載のものから選択してもよい。ポリメラーゼは、限定はされないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよび限定はされないが修飾核酸を組み込むことが可能なポリメラーゼなどの変異体ポリメラーゼから選択してもよい。
ＲＮＡポリメラーゼ
本発明の一次構築物の設計においては、ＲＮＡポリメラーゼまたは変異体は、数を問わず使用してもよい。
ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入するかまたは欠失させることにより、修飾することができる。非限定例として、ＲＮＡポリメラーゼは、未修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’−修飾ヌクレオチド三リン酸を組み込む能力の増強を示すように修飾してもよい（国際公開第２００８０７８１８０号パンフレットおよび米国特許第８，１０１，３８５号明細書を参照；それら全体が参照により本明細書に援用される）。
変異体は、ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸および／または核酸配列を最適化することにより、かつ／あるいは当該技術分野で既知の他の方法を用いることにより、得ることができる。非限定例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、エスベルト（Ｅｓｖｅｌｔ）ら著（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（２０１１年）、第４７２巻、第７３４４号、ｐ．４９９−５０３；その全体が参照により本明細書に援用される）によって提示された持続的定向進化システム（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて進化されることができ、ここでは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、限定はされないが、トレオニンと置換される位置９３のリジン（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１ＮまたはＬ８６４Ｆなど、少なくとも１つの突然変異をコードし得る。別の非限定例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、少なくとも米国特許出願公開第２０１００１２００２４号明細書および米国特許出願公開第２００７０１１７１１２号明細書（それら全体が参照により本明細書に援用される）に記載の突然変異をコードし得る。ＲＮＡポリメラーゼの変異体はまた、限定はされないが、置換変異体、保存的アミノ酸置換、挿入変異体、欠失変異体および／または共有結合誘導体を含んでもよい。
一実施形態では、一次構築物は、野生型または変異体ＲＮＡポリメラーゼとして認識されるように設計してもよい。そのように行う場合、一次構築物は、野生型または親の一次構築物からの配列変化の部位または領域を有するように修飾してもよい。
一実施形態では、一次構築物は、少なくとも１つの置換および／または挿入を、ＲＮＡポリメラーゼ結合または認識部位の上流、ＲＮＡポリメラーゼ結合または認識部位の下流、ＴＡＴＡボックス配列の上流、一次構築物のＴＡＴＡボックス配列の下流であるが一次構築物のコード領域の上流、５’ＵＴＲ内部、５’ＵＴＲの前および／または５’ＵＴＲの後、に含むように設計してもよい。
一実施形態では、一次構築物の５’ＵＴＲは、同一塩基のヌクレオチドの少なくとも１
つの領域および／またはストリングの挿入によって置換してもよい。ヌクレオチドの領域および／またはストリングは、限定はされないが、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのヌクレオチドを含んでもよく、またヌクレオチドは、天然および／または非天然であり得る。非限定例として、ヌクレオチド群は、５〜８のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのいずれかのストリング、および／またはそれらの組み合わせ、を含んでもよい。
一実施形態では、一次構築物の５’ＵＴＲは、限定はされないが、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのいずれかおよび／またはその組み合わせなどの２つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域および／またはストリングの挿入によって置換してもよい。例えば、５’ＵＴＲは、５〜８のアデニン塩基の挿入、次いで５〜８のシトシン塩基の挿入により、置換してもよい。別の例では、５’ＵＴＲは、５〜８のシトシン塩基の挿入、次いで５〜８のアデニン塩基の挿入により、置換してもよい。
一実施形態では、一次構築物は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識可能な転写開始部位の下流に、少なくとも１つの置換および／または挿入を含んでもよい。非限定例として、少なくとも１つの置換および／または挿入は、転写開始部位の下流で、転写開始部位のすぐ下流の領域（例えば限定はされないが、＋１〜＋６）内の少なくとも１つの核酸を置換することによって生じ得る。転写開始部位のずぐ下流のヌクレオチドの領域に対する変化は、開始速度に影響し、見かけ上のヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応定数値を増加させ、また初期転写を硬化させる転写複合体からの短い転写物の解離を増大させ得る（ブリエバ（Ｂｒｉｅｂａ）ら著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（２００２年）、第４１巻、ｐ．５１４４−５１４９；その全体が参照により本明細書に援用される）。少なくとも１つの核酸の修飾、置換および／または挿入は、核酸配列のサイレント突然変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列における突然変異を引き起こし得る。
一実施形態では、一次構築物は、転写開始部位の下流に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、または少なくとも１３個のグアニン塩基の置換を含んでもよい。
一実施形態では、一次構築物は、転写開始部位のすぐ下流の領域内に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個のグアニン塩基の置換を含んでもよい。非限定例として、同領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のアデニンヌクレオチドによって置換してもよい。別の非限定例では、同領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のシトシン塩基によって置換してもよい。別の非限定例では、同領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のチミン、および／または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかによって置換してもよい。
一実施形態では、一次構築物は、開始コドンの上流に、少なくとも１つの置換および／または挿入を含んでもよい。明確さを目的として、当業者であれば、開始コドンが、タンパク質コード領域の最初のコドンである一方、転写開始部位が、転写が開始する部位であることを理解するであろう。一次構築物は、限定はされないが、ヌクレオチド塩基の、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少
なくとも６個、少なくとも７個または少なくとも８個の置換および／または挿入を含んでもよい。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流の、１つ、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの位置で、挿入または置換してもよい。挿入および／または置換がなされたヌクレオチドは、同一塩基（例えば、すべてがＡまたはすべてがＣまたはすべてがＴまたはすべてがＧ）、２つの異なる塩基（例えば、ＡおよびＣ、ＡおよびＴ、またはＣおよびＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、ＣおよびＴまたはＡ、ＣおよびＴ）あるいは少なくとも４つの異なる塩基であってもよい。非限定例として、一次構築物におけるコード領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかと置換してもよい。別の非限定例では、一次構築物におけるグアニン塩基の置換は、１つのグアニン塩基を転写開始部位の下流でかつ開始コドンの前の領域内に残すように設計してもよい（エスベルト（Ｅｓｖｅｌｔ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（２０１１年）、第４７２巻（第７３４４号）、ｐ．４９９−５０３；その全体が参照により本明細書に援用される）。非限定例として、少なくとも５個のヌクレオチドは、転写開始部位の１つ下流の位置であるが開始コドンの上流に挿入してもよく、少なくとも５個のヌクレオチドは、同一塩基型であってもよい。
ｃＤＮＡ鋳型除去およびクリーンアップ
ｃＤＮＡ鋳型は、限定はされないがデオキシリボフクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）による処理などの当該技術分野で既知の方法を用いて除去してもよい。ＲＮＡクリーンアップはまた、限定はされないが、ベックマン・コルター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）（ダンバース、マサチューセッツ州）製のアジェンコート（ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ）（登録商標）クリーンセック（ＣＬＥＡＮＳＥＱ）（登録商標）システムなどの精製方法、限定はされないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）などのＨＰＬＣに基づく精製方法を含んでもよい。
キャッピングおよび／またはテーリング反応
一次構築物またはｍｍＲＮＡにはまた、キャッピングおよび／またはテーリング反応を施してもよい。キャッピング反応は、５’キャップを一次構築物の５’末端に付加するように当該技術分野で既知の方法により実施してもよい。キャッピングのための方法は、限定はされないが、ワクシニアキャッピング酵素（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）を使用することを含む。
ポリＡテーリング反応は、当該技術分野で既知の方法、例えば限定はされないが２’Ｏ−メチルトランスフェラーゼにより、また本明細書に記載の方法により、実施してもよい。ｃＤＮＡから作製された一次構築物がポリＴを含まない場合、一次構築物が浄化される前にポリＡテーリング反応を実施することは有利であり得る。
ｍＲＮＡ精製
一次構築物またはｍｍＲＮＡの精製は、限定はされないが、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡのクリーンアップ、品質保証および品質管理を含んでもよい。ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡのクリーンアップは、限定はされないが、アジェンコート（ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ）（登録商標）ビーズ（ベックマン・コルター・ジェノミクス（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ダンバース、マサチューセッツ州）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（エキシコン（登録商標）インコーポレイテッド（（ＥＸＩＱＯＮ）（登録商標）Ｉｎｃ）、ベズベック、デンマーク）あるいはＨＰＬＣに基づく精製方法、例えば限定はされないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）な
ど、当該技術分野で既知の方法により、実施してもよい。用語「精製された」は、「精製されたｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ」など、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、少なくとも１つの汚染物質から分離されたものを示す。本明細書で使用される「汚染物質」は、別の物質を不適合にするか、不純にするかまたは劣化させる任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、天然に見出される場合と異なる形態または設定、あるいは処理または精製方法を施す前に存在した場合と異なる形態または設定で存在する。
品質保証および／または品質管理検査は、限定はされないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析ＨＰＬＣなどの方法を用いて実施してもよい。
別の実施形態では、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、限定はされないが逆転写酵素ＰＣＲを含む方法により、配列決定してもよい。
一実施形態では、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、限定はされないが、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を用いて定量化してもよい。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定例が、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（登録商標）分光計（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）である。定量化されたｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡが適切なサイズでありうるか否かを判定し、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡの分解が全く生じていないことを検査するため、分析してもよい。ｍＲＮＡおよび／またはｍｍＲＮＡの分解は、限定はされないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣに基づく精製方法、例えば限定はされないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）ならびにキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法により、検査してもよい。
シグナル配列
一次構築物またはｍｍＲＮＡはまた、ポリペプチドの治療関連部位への輸送を促進するさらなる特徴をコードしてもよい。タンパク質輸送を助ける１つのかかる特徴は、シグナル配列である。本明細書で使用される「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は各々、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、それは約９〜２００ヌクレオチド（３〜６０アミノ酸）長であり、各々、コード領域またはコード化ポリペプチドの５’（またはＮ末端）に取り込まれる。これらの配列の付加により、コード化ポリペプチドの小胞体への１つ以上の分泌経路を介した輸送がもたらされる。一部のシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後、シグナルペプチターゼによりタンパク質から切断される。
シグナル配列は、２０１２年１２月１４日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書（その内容は参照により本明細書中に援用される）中に挙げられるうちのいずれかから選択してもよい。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡをコードするように取り込まれ得るタンパク質シグナル配列は、α−１−抗トリプシン、Ｇ−ＣＳＦ、第ＩＸ因子、プロラクチン、アルブミン、ＨＭＭＳＰ３８、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、チトクロームＣオキシダーゼサブユニット８Ａ、タイプＩＩＩ、細菌、ウイルス、分泌シグナル、Ｖｒｇ−６、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＳＴＩ、ＳＴＩＩ、アミラーゼ、α因子、エンドグルカナーゼＶ、分泌シグナル、真菌およびフィブロネクチンに由来するシグナル配列を含む。
表において、ＳＳは分泌シグナルであり、ＭＬＳはミトコンドリアのリーダーシグナルである。本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、シグナル配列または断片またはその変異体のいずれかをコードするように設計してもよい。これらの配列は、ポリペプチドコード領域の最初、中間または末端または代わりに隣接領域に含まれる場合がある。
本発明において利用可能なさらなるシグナル配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／またはｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／において見出されるようなデータベース中で教示されるものを含む。米国特許第８，１２４，３７９号明細書；米国特許第７，４１３，８７５号明細書および米国特許第７，３８５，０３４号明細書の中に記載のものもまた、本発明の範囲内に含まれ、各々の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
標的選択
本発明によると、一次構築物は、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの少なくとも第１領域を含む。本発明の目的のポリペプチドまたは「標的」は、下の表２に列挙される。表２に示されるのは、目的のポリペプチドをコードする遺伝子の名称および説明に加えて、アンサンブル転写物番号（ＥＮＳＥＭＢＬ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ＩＤ）（ＥＮＳＴ）、アンサンブルタンパク質番号（ＥＮＳＥＭＢＬ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ）（ＥＮＳＰ）や、利用可能な場合、最適化配列番号（ＯＰＴ ＳＥＱ
ＩＤ）である。任意の特定の遺伝子においては、１つ以上の変異体またはアイソフォームが存在し得る。これらは、存在する場合、同様に表中に示される。表中に開示されるのが有望な隣接領域であることは当業者によって理解されるであろう。これらは、各ＥＮＳＴ転写物中でＯＲＦまたはコード領域の５’（上流）または３’（下流）のいずれかにコードされる。コード領域は、ＥＮＳＰ配列を教示することにより、明確かつ詳細に開示されている。その結果、タンパク質をコードする、隣接が示される配列は、隣接領域と考えられる。１つ以上の利用可能なデータベースまたはアルゴリズムを利用することにより、５’および３’隣接領域をさらに特徴づけることも可能である。データベースでは、ＥＮＳＴ転写物の隣接領域内に含まれる特徴が注釈付けられており、これらは当該技術分野で利用可能である。
表２．標的
一実施形態では、本発明の標的は、「生物製剤の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号明細書；「生物製剤の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号明細書；「生物製剤の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書；「抗体の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号明細書；「抗体の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆ
ｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号明細書；「抗体の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号明細書；「ワクチンの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号明細書；「ワクチンの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号明細書；「ワクチンの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号明細書；「治療用タンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号明細書；「治療用タンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号明細書；「治療用タンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号明細書；「分泌タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号明細書；「分泌タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号明細書；「分泌タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号明細書；「細胞膜タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号明細書；「細胞膜タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号明細書；「細胞膜タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号明細書；「細胞質および細胞骨格タンパク質の作製のための修飾されたポリヌク
レオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号明細書；「細胞質および細胞骨格タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号明細書；「細胞質および細胞骨格タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号明細書；「細胞内膜結合タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号明細書；「細胞内膜結合タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年７月５日に出願された米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号明細書；「細胞内膜結合タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号明細書；「細胞内膜結合タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号明細書；「核タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号明細書；「核タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号明細書；「核タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号明細書；「タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号明細書；「タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号明細書；「タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の
２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号明細書；「ヒト疾患に関連した生物製剤およびタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６２号明細書；「修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６３号明細書；「分泌タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題のＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６４号明細書；「膜タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０
３００５９号明細書；「細胞質および細胞骨格タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６６号明細書；「核タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６７号明細書；「タンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６０号明細書；「ヒト疾患に関連したタンパク質の作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６１号明細書；「化粧品タンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６８号明細書；「腫瘍学に関連したタンパク質およびペプチドの作製のための修飾されたポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という表題の２０１３年３月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００７０号明細書；「タンパク質のインビボ作製（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という表題の２０１３年３月１５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１８２１号明細書（それらの各々の内容はその全体が参照により本明細書に援用される）の中に記載の標的のいずれかであってもよい。
タンパク質切断シグナルおよび部位
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質切断部位を有する少なくとも１つのタンパク質切断シグナルを含んでもよい。タンパク質切断部位は、Ｎ末端、Ｃ末端、Ｎ末端とＣ末端の間の任意の空間、例えば限定はされないが、Ｎ末端とＣ末端の中間、Ｎ末端とその中間点の間、その中間点とＣ末端の間、およびこれらの組み合わせなどに位置してもよい。
本発明のポリペプチドは、限定はされないが、プロタンパク質転換酵素（またはプロホルモン転換酵素）、トロンビンまたは第Ｘａ因子タンパク質切断シグナル、を含んでもよい。プロタンパク質転換酵素は、プロホルモン転換酵素１／３（ＰＣ１／３）、ＰＣ２、フューリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、対合された塩基性アミノ酸切断酵素４（ＰＡＣＥ４）およびＰＣ７として知られる酵母ケキシンに関連する７つの塩基性アミノ酸に特異的なスブチリシン様セリンプロテイナーゼ、ならびにスブチリシンケキシンアイソザイム１（ＳＫＩ−１）およびプロタンパク質転換酵素（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）スブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）と称される、非塩基性残基で切断する２つの他のスブチラーゼを含む、９種のプロテイナーゼのファミリーである。
一実施形態では、本発明の一次構築物およびｍｍＲＮＡは、一次構築物またはｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのコード化タンパク質切断シグナルを有するように操作することができる。コード化タンパク質切断シグナルは、開始コドンの前、開始コドンの後、コード領域の前、コード領域内、例えば限定はされないがコード領域内の中間、開始コドンとその中間点の間、その中間点と終止コドンの間、コード領域の後、終止コドンの前、２つの
終止コドンの間、終止コドンの後、およびこれらの組み合わせ、に位置し得る。
一実施形態では、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのタンパク質切断部位を有する少なくとも１つのコード化タンパク質切断シグナルを含んでもよい。コード化タンパク質切断シグナルは、限定はされないが、プロタンパク質転換酵素（またはプロホルモン転換酵素）、トロンビンおよび／または第Ｘａ因子タンパク質切断シグナル、を含んでもよい。当業者は、上記の表１または他の既知の方法を用いて、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡ中に含むのに適切なコード化タンパク質切断シグナルを決定することができる。例えば、シグナル配列から開始し、表１のコドンを考慮することで、得られたポリペプチドにおけるタンパク質シグナルを生成可能な一次構築物におけるシグナルを設計することができる。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含む。
非限定例として、米国特許第７，３７４，９３０号明細書および米国特許出願公開第２００９０２２７６６０号明細書（それら全体が参照により本明細書に援用される）では、細胞のゴルジ装置から発現産物中のＧＬＰ−１のＮ末端メチオニンを切断する、フューリン切断部位が用いられる。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドがＧＬＰ−１でないという条件で、少なくとも１つのタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含む。
一実施形態では、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのコード化タンパク質切断シグナルおよび／または部位を含む。
一実施形態では、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのコード化タンパク質切断シグナルおよび／または部位を、一次構築物またはｍｍＲＮＡがＧＬＰ−１をコードしないという条件で含む。
一実施形態では、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、２つ以上のコード領域を含んでもよい。複数のコード領域が本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡ中に存在する場合、複数のコード領域は、コード化タンパク質切断部位によって分離され得る。非限定例として、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、整理されたパターンで署名され得る。かかるパターンでは、ＡＸＢＹ形態に従い、これは、ＡおよびＢが、同じかまたは異なるコード領域であり得、および／あるいは同じかまたは異なるポリペプチドをコードし得るコード領域であり、かつ、ＸおよびＹが、同じかまたは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコード化タンパク質切断シグナルである場合である。第２のかかるパターンは、ＡＸＹＢＺ形態に従い、これは、ＡおよびＢが、同じかまたは異なるコード領域であり得、および／あるいは同じかまたは異なるポリペプチドをコードし得るコード領域であり、かつ、Ｘ、ＹおよびＺが、同じかまたは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコード化タンパク質切断シグナルである場合である。第３のパターンは、ＡＢＸＣＹに従い、これは、Ａ、ＢおよびＣが、同じかまたは異なるコード領域であり得、および／あるいは同じかまたは異なるポリペプチドをコードし得るコード領域であり、かつ、ＸおよびＹが、同じまたは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコード化タンパク質切断シグナルである場合である。
一実施形態では、ポリペプチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡはまた、ポリペプチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡが、タンパク質切断部位に特異的なプロテアーゼによる処理によって担体領域または融合パートナーから放出され得るように、タンパク質切断部位をコードする配列を有してもよい。
ＩＩＩ．修飾
本明細書中で、ポリヌクレオチド（一次構築物またはｍＲＮＡ分子など）における用語「修飾」または必要に応じて「修飾された」は、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣリボヌクレオチドに対する修飾を示す。一般に、本明細書におけるこれらの用語は、天然５’末端のｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を示すように意図されていない。ポリペプチドにおける用語「修飾」は、古典的な２０のアミノ酸セット（部分）に対する修飾を示す。
修飾は、様々な特徴的な修飾であってもよい。一部の実施形態では、コード領域、隣接領域および／または末端領域は、１個、２個、またはそれより多い（任意選択的に異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を有してもよい。一部の実施形態では、細胞に導入される修飾ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、未修飾のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに対して、細胞内での分解の低下を示し得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、例えば、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合（例えば、連結するリン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格）に対する任意の有用な修飾を含んでもよい。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、任意選択的に置換されたアミノ、任意選択的に置換されたチオール、任意選択的に置換されたアルキル（例えば、メチルまたはエチル）、またはハロ（例えば、クロロまたはフルオロ）と交換または置換してもよい。特定の実施形態では、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖およびヌクレオシド間結合の各々において存在する。本発明による修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそれらのハイブリッド）への修飾であってもよい。追加的な修飾については、本明細書に記載される。
本明細書に記載のように、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘発しない。誘導される自然免疫応答の特徴は、１）炎症促進性サイトカインの発現の増加、２）タンパク質翻訳における細胞内ＰＲＲｓ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５など、および／または３）の終結または低下の活性化、を含む。
特定の実施形態では、細胞内に導入される修飾核酸分子を細胞内で分解するのが望ましい場合がある。例えば、修飾核酸分子の分解は、タンパク質生成の正確なタイミングが所望される場合、好ましい場合がある。したがって、一部の実施形態では、本発明は、細胞内で直接的な様式で作用を受け得る分解ドメインを有する修飾核酸分子を提供する。
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、任意選択的に、他の作用物質（例えば、ＲＮＡｉ誘発性の作用物質、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、ｔＲＮＡや、トリプルヘリックス形成、アプタマー、ベクターなどを誘発するＲＮＡ）を含んでもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド（例えば、ｍｍＲＮＡ分子）を含んでもよい。これらのポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡにおける詳細は、以下の通りである。
ポリヌクレオチドおよび一次構築物
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１領域、第１領域の５’末端に位置する第１隣接領域、および第１領域の３’末端に位置する第２隣接領域を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１領域、第１隣接領域、または第２隣接領域）は、任意の塩基、糖、骨格、構成要素または他の構造もしくは式（限定はされないが、２０１２年１０月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１２／５８５１９号明細書（代理人整理番号：Ｍ００９．２０）（その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）中に記載の式Ｉ〜ＩＸのものまたはその任意の部分構造を含む）を有するいくつかの連結ヌクレオシドを含む。かかる構造は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合、またはその組み合わせに対する修飾を含む。
化学修飾の組み合わせは、例えば限定はされないが、２０１２年１０月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１２／５８５１９号明細書（代理人整理番号：Ｍ００９．２０）（その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）中に記載のものに教示されたものを含む。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの合成は、２０１２年１０月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１２／５８５１９号明細書（代理人整理番号：Ｍ００９．２０）（その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）中に記載の方法に従ってもよい。
一部の実施形態では、核酸塩基は、シトシン、グアニン、アデニン、およびウラシルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとして、プソイドウリジン（Ψ）、ピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎ）−４−１リボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル（ｔａｕｒｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミン（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｎｅ）を有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１Ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン（ｄｉｈｙｄｒｏｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−
ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ））ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（Ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキチミジン、２’−Ｆ−ａｒａ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル（ｃａｒｂｏｍｅｔｈｏｘｙｖｉｎｙｌ））ウリジン、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ（ｐｒｏｐｅｎｙｌａｍｉｎｏ））ウリジン、が挙げられる。
一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとして、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｉｄｉｎｅ）、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、ライシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４ ２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−アラ−シチジン、が挙げられる。
一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとして、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉ
ｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイル（ｔｈｒｅｏｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６ ２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル（ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｒｖａｌｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６ ２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ｒｉｂｏｓｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル（ｐｅｎｔａｏｘａｎｏｎａｄｅｃｙｌ））−アデノシン、が挙げられる。
一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとして、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｅｔｈｙｌｗｙｏｓｉｎｅ）（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｓｏｗｙｏｓｉｎｅ）（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペロキシワイブトシン（ｐｅｒｏｘｙｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ｈｙｄｒｏｘｙｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）（ＯＨｙＷ）、修飾過程の（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｅｐｏｘｙｑｕｅｕｏｓｉｎｅ）（ｏＱ）、ガラクトシル−キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−キューオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ）（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２ ２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、ｌ−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２ ２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、および２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ｒｉｂｏｓｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ）（リン酸）（Ｇｒ（ｐ））、が挙げられる。
ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体から独立に選択してもよい。例えば核酸塩基は各々、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはヒポキサンチンから独立に選択してもよい。別の実施形態では、核酸塩基はまた、例えば、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならび
にアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例えば、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ａ］１，３，５トリアジノン、９−デアザプリン、イミダゾ［４，５−ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン、ピラジン（ｐｙｒａｚｉｎ）−２−オン類，１，２，４−トリアジン、ピリダジン；および１，３，５トリアジンを含む、塩基の天然および合成誘導体を含んでもよい。ヌクレオチドが略記Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵを用いて示される場合、各文字は、代表的な塩基および／またはその誘導体を示し、例えばＡは、アデニンまたはアデニン類似体、例えば７−デアザアデニン）を含む。
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、構成要素分子）は、オガタ（Ｏｇａｔａ）ら著、ザ・ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、第７４巻、ｐ．２５８５−２５８８（２００９年）；プルマル（Ｐｕｒｍａｌ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第２２巻、第１号、ｐ．７２−７８（１９９４年）；フクハラ（Ｆｕｋｕｈａｒａ）ら著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１巻、第４号、ｐ．５６３−５６８（１９６２年）；およびシュ（Ｘｕ）ら著、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、第４８巻、第９号、ｐ．１７２９−１７４０（１９９２年）（これらの各々はその全体が参照により援用される）に記載の合成方法に従って調製してもよい。
本発明のポリペプチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、同分子の全長に沿って、均一に修飾されるかまたは修飾されなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ以上またはすべてのタイプ（例えば、プリンまたはピリミジン、あるいはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃの任意の１つ以上またはすべて）は、本発明のポリヌクレオチド、またはその所与の予め定められた配列領域（例えば、図１中に示される配列領域の１つ以上）において、均一に修飾されるかまたは修飾されなくてもよい。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（またはその所与の配列領域）におけるすべてのヌクレオチドＸは修飾され、ここでＸは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちの任意の１つ、またはＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣまたはＡ＋Ｇ＋Ｃの組み合わせのうちの任意の１つであってもよい。
異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、および／またはヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの中の様々な位置に存在し得る。当業者は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの機能が実質的に低下しないように、ヌクレオチド類似体または他の修飾が、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの任意の位置に位置し得ることを理解するであろう。修飾はまた、５’または３’末端修飾であってもよい。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、（全ヌクレオチド含量に対して、または１つ以上のヌクレオチド型、すなわち、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣのいずれか１つ以上に対して）約１％〜約１００％の修飾ヌクレオチド、あるいは任意の中間の百分率（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜
９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％）を有してもよい。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、修飾ピリミジン（例えば、修飾ウラシル／ウリジン／Ｕまたは修飾シトシン／シチジン／Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子の中のウラシルまたはウリジン（一般にＵ）は、約１％〜約１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン）と置換してもよい。修飾ウラシルまたはウリジンは、単一のユニークな構造を有する化合物または異なる構造（例えば、本明細書に記載の、２つ、３つ、４つまたはそれより多いユニークな構造）を有する複数の化合物によって置換してもよい。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子の中のシトシンまたはシチジン（一般にＣ）は、約１％〜約１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン）と置換してもよい。修飾シトシンまたはシチジンは、単一のユニークな構造を有する化合物または異なる構造（例えば、本明細書に記載の、２つ、３つ、４つまたはそれより多いユニークな構造）を有する複数の化合物によって置換してもよい。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、翻訳可能である。
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの他の成分は、任意選択的であり、また一部の実施形態において有利である。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’ＵＴＲが提供され、ここでその一方または双方は、１つ以上の異なるヌクレオチド修飾を独立に有してもよい。かかる実施形態では、ヌクレオチド修飾はまた、翻訳可能領域内に存在してもよい。また、コザック配列を有するポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡが提供される。
一部の実施形態では、シトシンの少なくとも２５％が、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）の化合物によって置換される（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくと
も約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
一部の実施形態では、ウラシルの少なくとも２５％が、式（ｂ１）〜（ｂ９）の化合物によって置換される（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
一部の実施形態では、シトシンの少なくとも２５％が、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）の化合物によって置換され、またウラシルの少なくとも２５％が、式（ｂ１）〜（ｂ９）の化合物によって置換される（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
ＩＶ．医薬組成物
調合、投与、送達および投薬
本発明は、ポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡ組成物ならびに１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を組み合わせた複合体を提供する。医薬組成物は、任意選択的に、１つ以上の追加的な活性物質、例えば治療および／または予防活性物質を含んでもよい。医薬品の製剤および／または作製における一般的検討事項は、例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、リッピンコット、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（その全体が参照により本明細書中に援用される）において見出され得る。
一部の実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示を目的として、語句「活性成分」は、一般に、本明細書に記載のように送達されるべきポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを示す。
本明細書に提供される医薬組成物の説明は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物を指しているが、かかる組成物が、一般に任意の他の動物、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳類への投与に適していることは当業者によって理解されるだろう。組成物を様々な動物への投与に適合させることを目的としたヒトへの投与に適した医薬組成物の修飾は、十分に理解されており、また当業者である獣医薬理学者は、かかる修飾を、単に通常の（もしあれば）実験を用いて設計し、および／または実施することができる。医薬組成物が投与される対象は、限定はされないが、ヒトおよび／または他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラットなどの商業的に重要な哺乳類を含む哺乳類；および／または家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウなどの商業的に重要なトリを含むトリ、を含むことが企図される。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知である方法または今後開発される任意の方法により調製してもよい。一般に、かかる予備的な方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の付属成分と会合させるステップと、次いで、必要でありかつ／または望ましい場合、生成物を、所望される単一または複数投薬単位に分割し、形成し、および／または包装するステップと、を含む。
本発明に従う医薬組成物は、単回単位用量、および／または複数の単回単位用量として、調製し、包装し、ならびに／あるいはバルク売りしてもよい。本明細書で使用される「単位用量」は、活性成分の所定量を含む医薬組成物の分割量である。活性成分の量は、一般に、場合によって対象に投与されることになる活性成分の用量および／またはかかる用量の便利な割合、例えばかかる用量の半分もしくは３分の１などに等しい。
本発明に従う医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の付加的成分の相対量は、アイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、サイズ、および／または治療されている対象の状態に応じて、またさらに、組成物が投与されるべき経路に応じて、変化することになる。例として、組成物は、０．１％〜１００％の間、例えば、０．５〜５０％の間、１〜３０％の間、５〜８０％の間、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよい。
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡのいずれかは、「修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸組成物（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）」という表題の２０１２年１２月１４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に援用される）中に記載のように調合してもよい。
製剤
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、（１）安定性を高める；（２）細胞への遺伝子導入を増強する；（３）（例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのデポー製剤からの）徐放または遅延放出を可能にする；（４）体内分布を変更する（例えば、特定の組織または細胞型へのポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを標的化する）；（５）インビボでのコード化タンパク質の翻訳を増強する；および／または（６）インビボでのコード化タンパク質の放出特性を変更する、といったことを意図して、１つ以上の賦形剤を用いて調合してもよい。あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤などの伝統的な賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、限定はされないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質（例えば対象への移植を意図して）ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが遺伝子導入された細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｍｉｍｉｃｓ）およびそれらの組み合わせ、を含んでもよい。したがって、本発明の製剤は、１つ以上の賦形剤を、相まって、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を高める、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる細胞への遺伝子導入を増強する、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにコードされたタンパク質の発現を高める、および／あるいはポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにコードされたタンパク質の放出特性を変更するといった量で各々、含んでもよい。さらに、本発明の一次構築物およびｍｍＲＮＡは、自己組織化した核酸ナノ粒子を使用して調合してもよい。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知であるかまたは今後開発される任意の方法により調製してもよい。一般に、かかる予備的な方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の付属成分と会合させるステップを含む。
本開示に従う医薬組成物は、単回単位用量および／または複数の単回単位用量として、調製し、包装し、および／またはバルク売りしてもよい。本明細書で使用される「単位用量」は、活性成分の所定量を含む医薬組成物の分割量を示す。活性成分の量は、一般に、
場合によって対象に投与されることになる活性成分の用量および／またはかかる用量の便利な割合、例えば限定はされないが、かかる用量の半分もしくは３分の１に等しくしてもよい。
本開示に従う医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の付加的成分の相対量は、アイデンティティ、サイズ、および／または治療されている対象の状態に応じて、またさらに、組成物が投与されるべき経路に応じて変化し得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１つのｍｍＲＮＡを含有してもよい。非限定例として、製剤は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのｍｍＲＮＡを含有してもよい。一実施形態では、製剤は、限定はされないが、ヒトタンパク質、動物タンパク質、細菌タンパク質、生体タンパク質、抗体、免疫原性タンパク質、治療ペプチドおよびタンパク質、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質、細胞質および細胞骨格タンパク質、細胞内（ｉｎｔｒａｎｃｅｌｌｕｌａｒ）膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質、および／または非ヒト疾患に関連したタンパク質などのカテゴリから選択されるタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含有してもよい。一実施形態では、製剤は、タンパク質をコードする少なくとも３つの修飾ｍＲＮＡを含有する。一実施形態では、製剤は、タンパク質をコードする少なくとも５つの修飾ｍＲＮＡを含有する。
医薬製剤は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤などを含む、所望される特定の剤形に適合するような薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよい。医薬組成物を調合するための様々な賦形剤および組成物を調製するための技術は、当該技術分野で既知である（レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著、「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）、リッピンコット、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ボルティモア、メリーランド州、２００６年；参照により本明細書中に援用される）。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の従来の賦形剤媒体が、例えば任意の望ましくない生物学的効果をもたらすか、またはその他として医薬組成物の任意の他の成分と有害な方法で相互作用することにより、物質またはその誘導体と適合できない場合を除き、本開示の範囲内に含まれると考えてもよい。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の粒径は、増加させ、および／または減少させてもよい。粒径の変化は、限定はされないが炎症などの生物学的反応に対抗することを援助でき得るか、または哺乳類に送達された修飾ｍＲＮＡの生物学的効果を高め得る。
医薬組成物の作製において使用される薬学的に許容可能な賦形剤は、限定はされないが、不活性希釈剤、表面活性剤および／または乳化剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、および／または油、を含む。かかる賦形剤は、任意選択的に本発明の医薬製剤中に含めてもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、コレステロールなどの分子を隔離することができるナノ構造の中でまたはそれを伴って投与するか、その中に調合するか、あるいはそれを伴って送達してもよい。これらのナノ構造およびこれらのナノ構造を作製する方法の非限定例が、米国特許出願公開第２０１３０１９５７５９号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。これらのナノ構造の例示的な構造は、米国特許出願公開第２０１３０１９５７５９号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に援用される）の図１中に示され、コアおよびコアを囲むシェルを含んでもよい。
リピドイド
リピドイドの合成は、広範に記載がなされており、これらの化合物を含有する製剤は、特にポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの送達に適している（マホン（Ｍａｈｏｎ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．）、２０１０年、第２１巻、ｐ．１４４８−１４５４；シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら著、ジャーナル・オブ・インターナル・メディシン（Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．）、２０１０年、第２６７巻、ｐ．９−２１；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１−５６９；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ），２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４−１８６９；シーグワルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２９９６−３００１を参照（これらのすべてはそれら全体が本明細書に援用される））。
これらのリピドイドは、齧歯類および非ヒト霊長類において二本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子を有効に送達するために使用されている一方（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１−５６９；フランク・カメネツキ−（Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２００８年、第１０５巻、ｐ．１１９１５−１１９２０；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２−８７９；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４−１８６９；ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５−１０１０を参照（これらのすべてはそれら全体が本明細書に援用される））、本開示では、一本鎖ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの送達におけるその調合および使用について記載している。複合体、ミセル、リポソームまたは粒子は、これらのリピドイドを含有するように調製可能であり、その結果、リピドイド製剤の局所および／または全身投与経路を介した注射後のコード化タンパク質の生成によって判断されるように、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの有効な送達をもたらし得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのリピドイド複合体は、限定はされないが、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含む様々な手段により、投与してもよい。
核酸のインビボ送達は、限定はされないが、製剤組成物、粒子ペグ化の性質、負荷の程度、オリゴヌクレオチド対脂質比、および粒径などの生物物理学的パラメータを含む多数のパラメータによって影響されうる（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２−８７９；その全体が参照により本明細書に援用される）。例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質の錨鎖長における小さな変化は、インビボでの有効性に対して有意な効果を生じうる。異なるリピドイド、例えば限定はされないが、ペンタ［３−（１−ラウリルアミンプロピオニル（ｌａｕｒｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）］−トリエチレンテトラミンヒドロクロリド（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ；別名９８Ｎ１２−５、マルガイアー（Ｍｕｒｕｇａｉａｈ）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４０１巻、ｐ．６１（２０１０年）を参照）、Ｃ１２−２００（誘導体および変異体を含む）、およびＭＤ１を有する製剤は、インビボでの活性について試験することができる。
本明細書で「９８Ｎ１２−５」と称されるリピドイドは、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著
、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２−８７９に開示されており、その全体が参照により援用される。
本明細書で「Ｃ１２−２００」と称されるリピドイドは、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４−１８６９ならびにリウ（Ｌｉｕ）およびファン（Ｈｕａｎｇ）、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）、２０１０年、ｐ．６６９−６７０（これら双方はその全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。リピドイド製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに加えて、３つまたは４つまたは５つ以上のいずれかの成分を含む粒子を含んでもよい。例として、特定のリピドイドを有する製剤は、限定はされないが、９８Ｎ１２−５を含み、４２％のリピドイド、４８％のコレステロールおよび１０％のＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）を含有してもよい。別の例として、特定のリピドイドを有する製剤は、限定はされないが、Ｃ１２−２００を含み、５０％のリピドイド、１０％のジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）、３８．５％のコレステロール、および１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含有してもよい。
一実施形態では、全身静脈内投与のためにリピドイドと調合されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、肝臓を標的にし得る。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを使用し、かつ４２％の９８Ｎ１２−５、４８％のコレステロール、および１０％のＰＥＧ−脂質の脂質モル組成を含む、最終重量比が約７．５対１の総脂質対ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ、およびＰＥＧ脂質に対してＣ１４アルキル鎖長、約５０〜６０ｎｍの平均粒径の、最終的な最適化された静注製剤は、肝臓に９０％より高い製剤の分布をもたらし得る（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２−８７９を参照（その全体が本明細書に援用される））。別の例において、Ｃ１２−２００（米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号明細書および公表された国際出願の国際公開第２０１０１２９７０９号パンフレット（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される））リピドイドを使用した静注製剤は、５０／１０／３８．５／１．５のＣ１２−２００／ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比を有し、重量比が７対１の総脂質対ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ、および平均粒径が８０ｎｍであってよく、これはポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを肝細胞に送達するのに有効であり得る（ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）．２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４−１８６９を参照（参照により本明細書に援用される））。別の実施形態では、ＭＤ１リピドイド含有製剤は、インビボでポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを肝細胞に有効に送達するために使用してもよい。筋肉内経路又は皮下経路に最適化されたリピドイド製剤の特性は、標的細胞型および製剤が細胞外マトリックスを通って血流中に拡散する能力に応じて大きく異なり得る。有効な肝細胞送達のためには、内皮窓のサイズに起因して１５０ｎｍ未満の粒度が望ましいこともあるが（参照により本明細書に援用されるアキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２−８７９を参照のこと）、他の細胞型、例えば限定はされないが、内皮細胞、骨髄系細胞、及び筋細胞への製剤の送達に対するリピドイド調合されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの使用は、同様のサイズ制限を受けないこともある。骨髄系細胞及び内皮などの、他の非肝細胞にインビボでｓｉＲＮＡを送達するためのリピドイド製剤の使用が、報告されている（本明細書にその全体が参照により援用されるアキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１−５６９；ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５−１０１０；チョー（Ｃｈｏ）ら著、アドバンスト・ファンクショナル・マテリアルズ（Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．）、２００９年、第１９巻、ｐ．３１１２−３１１８；第８回国際ユダ・フォークマン会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｕｄａｈ Ｆｏｌｋｍａｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、２０１０年１０月８日〜９日を参照）。単球などの骨髄系細胞への有効な送達、リピドイド製剤は同様の成分モル比を有し得る。異なる比のリピドイドおよび他の成分、例えば限定はされないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＭＧは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの製剤を、限定はされないが、肝細胞、骨髄系細胞、筋細胞などを含む種々の細胞型への送達に最適化するために使用してもよい。例えば、成分モル比は、限定はされないが、５０％のＣ１２−２００、１０％のジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、３８．５％のコレステロール、および１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含んでもよい（ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５−１０１０を参照；その全体が参照により本明細書に援用される）。核酸を皮下送達または筋肉内送達のいずれかによって細胞（限定はされないが、脂肪細胞及び筋細胞など）に局所送達するためのリピドイド製剤の使用は、全身送達に望ましいすべての製剤成分を必要としないこともあり、したがってリピドイドおよびポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのみを含んでもよい。
リピドイドはポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる細胞トランスフェクションを増加させることが可能でありうる；および／またはコード化タンパク質の翻訳を増強し得るため、異なるリピドイドの組み合わせを用いることにより、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに誘導されるタンパク質生成の有効性を改善し得る（ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ．１６８８−１６９４を参照、その全体が参照により本明細書に援用される）。
リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して調合してもよい。一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主として脂質二重層で構成され得る人工的に調製された小胞であり、栄養素及び医薬製剤の投与用送達媒体として使用してもよい。リポソームは、限定はされないが、直径が数百ナノメートルであり得るとともに狭い水性の区画によって分離された一連の同心の二重層を含み得る多重膜小胞（ＭＬＶ：ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、直径５０ｎｍ未満であり得る小さい単細胞小胞（ＳＵＶ：ｓｍａｌｌ ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、及び直径５０〜５００ｎｍであり得る大きい単層小胞（ＬＵＶ：ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）など、種々のサイズであってもよい。リポソーム設計は、非健常組織に対するリポソームの付着を向上させ、または限定はされないがエンドサイトーシスなどの事象を活性化するため、限定はされないが、オプソニンまたはリガンドを含んでもよい。リポソームは、医薬製剤の送達を向上させるため、低いまたは高いｐＨを含んでもよい。
リポソームの形成は、限定はされないが、封入される医薬製剤およびリポソーム成分、脂質小胞を分散させる媒体の性質、封入物質の有効濃度およびその潜在的毒性、小胞の適用中および／または送達中に関与する任意のさらなるプロセス、目的の適用に対する小胞の至適サイズ、多分散性及び有効期間、ならびに安全かつ効率的なリポソーム産物のバッチ間再現性及び大量生産の可能性などの、物理化学的特性に依存し得る。
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、限定はされないが、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソームから形成されるリポソーム、マリナ・バイオテック（ＭａｒｉｎａＢｉｏｔｅｃｈ）（ボセル、ワシントン州）のＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、およびＭＣ３（米国特許出願公開第２０１００３２４１２０号明細書；その全体が参照により本明細書に援用される）、および限定はされないが、ヤンセン・バイオテック・インコーポレイテッド（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（ホーシャム、ペンシルベニア州）のＤＯＸＩＬ（登録商標）などの小分子薬物を送達し得るリポソームなどのリポソームを含んでもよい。
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、限定はされないが、過去に記載がある、かつインビトロおよびインビボでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが示されている安定化プラスミド脂質粒子（ＳＰＬＰ：ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ−ｌｉｐｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ：ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｐｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ）の合成から形成されるリポソームなどのリポソームを含んでもよい（ホイーラー（Ｗｈｅｅｌｅｒ）ら著、ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、ｐ．２７１−２８１；チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、ｐ．１４３８−１４４７；ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）ら著、ファーマシューティカル・リサーチ（ＰｈａｒｍＲｅｓ）、２００５年、第２２巻、ｐ．３６２−３７２；モリッシー（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００５年、第２巻、ｐ．１００２−１００７；ツィンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００６年、第４４１巻、ｐ．１１１−１１４；ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ）、２００５年、第１０７巻、ｐ．２７６−２８７；センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ）、２０１０年、第２８巻、ｐ．１７２−１７６；ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、２００９年、第１１９巻、ｐ．６６１−６７３；ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）、ヒューマン・ジーン・セラピー（ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５−１３２を参照；これらはすべて、それら全体が本明細書に援用される）。ホイーラー（Ｗｈｅｅｌｅｒ）らによる元の作製方法はデタージェント透析法であったが、これは後にジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより改良されており、自発的小胞形成法と称される。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに加えて３〜４つの脂質成分から構成される。例として、リポソームは、限定はされないが、ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより記載された通り、５５％のコレステロール、２０％のジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、および１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有してもよい。別の例として、特定のリポソーム製剤は、限定はされないが、ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）らにより記載されたとおり、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、および３０％のカチオン性脂質を含有してもよく、ここでカチオン性脂質は、１，２−ジステアリルオキシ（ｄｉｓｔｅａｒｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、または１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であってもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、機能化
された脂質二重層の間で架橋を有し得る脂質小胞内で調合されてもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、脂質−ポリカチオン複合体中で調合されてもよい。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当該技術分野で既知の方法および／または米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法によって行ってもよい。非限定例として、ポリカチオンは、限定はされないが、ポリリジン、ポリオルニチンおよび／またはポリアルギニンなどのカチオン性ペプチドまたはポリペプチドを含んでもよい。別の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、限定はされないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの中性脂質をさらに含み得る脂質−ポリカチオン複合体中で調合してもよい。
リポソーム製剤は、限定はされないが、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質の飽和度、ペグ化の性質、全成分の比およびサイズなどの生物物理学的パラメータにより影響され得る。センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら（センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２０１０年、第２８巻、ｐ．１７２−１７６）による一例では、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、および１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成された。もう１つの例として、カチオン性脂質の組成を変えると、様々な抗原提示細胞にｓｉＲＮＡをより有効に送達することができた（バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、２０１１年、第１９巻、ｐ．２１８６−２２００；その全体が参照により本明細書に援用される）。
一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤中のＰＥＧの比は増加または減少させ、かつ／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長はＣ１４からＣ１８にかけて修飾し、ＬＮＰ製剤の薬物動態および／または体内分布を変更することができる。非限定例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣおよびコレステロールに対して、脂質モル比が１〜５％のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。別の実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、限定はされないが、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）などのＰＥＧ脂質と置換してもよい。カチオン性脂質は、限定はされないが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡなどの当該技術分野で既知の任意の脂質から選択してもよい。
一実施形態では、カチオン性脂質は、限定はされないが、国際公開番号で、国際公開第２０１２０４０１８４号パンフレット、国際公開第２０１１１５３１２０号パンフレット、国際公開第２０１１１４９７３３号パンフレット、国際公開第２０１１０９０９６５号パンフレット、国際公開第２０１１０４３９１３号パンフレット、国際公開第２０１１０２２４６０号パンフレット、国際公開第２０１２０６１２５９号パンフレット、国際公開第２０１２０５４３６５号パンフレット、国際公開第２０１２０４４６３８号パンフレット、国際公開第２０１００８０７２４号パンフレット、国際公開第２０１０２１８６５号パンフレットおよび国際公開第２００８１０３２７６号パンフレット、米国特許第７，８９３，３０２号明細書および米国特許第７，４０４，９６９号明細書および米国特許出願公開第２０１０００３６１１５号明細書（これら各々はその全体参照により本明細書に援用される）に記載のカチオン性脂質から選択してもよい。別の実施形態では、カチオン性脂質は、限定はされないが、国際公開番号で、国際公開第２０１２０４０１８４号パンフレット、国際公開第２０１１１５３１２０号パンフレット、国際公開第２０１１１４９７３３号パンフレット、国際公開第２０１１０９０９６５号パンフレット、国際公開第２０１１０４３９１３号パンフレット、国際公開第２０１１０２２４６０号パンフレット、国際公開第２０１２０６１２５９号パンフレット、国際公開第２０１２０５４３６５号パン
フレットおよび国際公開第２０１２０４４６３８号パンフレットに記載の式Ａ（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）から選択してもよい。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質は、限定はされないが、国際公開番号で国際公開第２００８１０３２７６号パンフレットの式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号明細書の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号明細書の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩおよび米国特許出願公開第２０１０００３６１１５号明細書の式Ｉ−ＶＩ（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）から選択してもよい。非限定例として、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ〜ジメチルペンタコサ〜１６，１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３Ｊ１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−ＮＪＮ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ（ｄｉｍｅｉｈｙｌｏｃｔａｃｏｓａ）−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ；１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ；Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコス（ｄｉｍｅｔｙｌｈｅｐｔａｃｏｓ）−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサス（ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｃｏｓ）−１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−ＮＪＮ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｃｏｓａｎ）−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０Ｊ２３−ジエン−１０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニリコサ（ｎｏｎｙｌｉｃｏｓａ）−１１，１４−ジエン−１−イル］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコス（ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｃｏｓ）−２０−エン−１０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコス（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｅｐｔａｃｏｓ）−１５−エン−１０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス（ｄｉｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｃｏｓ）−１４−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス（ｄｉｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｃｏｓ）−１７−エン−１０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコント（ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｒｉｔｒｉａｃｏｎｔ）−２４−エン−１０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス（ｄｉｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｃｏｓ）−２０−エン−１０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコント（ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｅｎｔｒｉａｃｏｎｔ）−２２−エン−１０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコス（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｃｏｓ）−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ（ｎｏｎｙｌｈｅｎｉｃｏｓａ）−１２，１５−ジエン−１−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン（ｅｐｔａｄｅｃａｎ）−８−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｄｅｃａｎ）−１０−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン（ｎｏｎａｄｅｃａｎ）−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１〜［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘニコサン−１０−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−
２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル（ｐｅｎｔｙｌｃｙｃＩｏｐｒｏｐｙｌ）］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン（ｎｏｎａｄｅｃａｎ）−１０−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン（ｈｅｘａｄｅｃａｎ）−８−アミン、Ν，Ν−ジメチル（ｄｉｍｅｔｈｙＨ）−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル（ｕｎｄｅｃｙＩｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）］テトラデカン（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎ）−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン（ｄｏｄｅｃａｎ）−１−アミン、１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデカン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｄｅｃａｎ）−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎ）−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン（ｐｅｎｔａｄｅｃａｎ）−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、Ｓ−Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクト−５−エン−１−イルオキシ］プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデク（ｏｃｔａｄｅｃ）−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン（化合物９）；（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコス（ｄｏｃｏｓ）−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコス（ｄｏｃｏｓ）−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデク（ｈｅｘａｄｅｃ）−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈ（１−メトイロクチル（ｍｅｔｏｙｌｏｃｔｙｌ））オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン
、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−｛［８−（２−オクリルシクロプロピル（ｏｃｌｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ））オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン（ｐｒｏｐａｎ）−２−アミン、ならびに（１１Ｅ、２０Ｚ、２３Ｚ）−Ｎ；Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２−トリエン−１０−アミン、あるいはその薬学的に許容可能な塩または立体異性体、から選択してもよい。
一実施形態では、カチオン性脂質は、当該技術分野で既知の方法および／または国際公開番号で国際公開第２０１２０４０１８４号パンフレット、国際公開第２０１１１５３１２０号パンフレット、国際公開第２０１１１４９７３３号パンフレット、国際公開第２０１１０９０９６５号パンフレット、国際公開第２０１１０４３９１３号パンフレット、国際公開第２０１１０２２４６０号パンフレット、国際公開第２０１２０６１２５９号パンフレット、国際公開第２０１２０５４３６５号パンフレット、国際公開第２０１２０４４６３８号パンフレット、国際公開第２０１００８０７２４号パンフレットおよび国際公開第２０１０２１８６５号パンフレット（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法によって合成してもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡのＬＮＰ製剤は、脂質モル比３％のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。別の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡのＬＮＰ製剤は、脂質モル比１．５％のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡの医薬組成物は、国際公開第２０１２０９９７５５号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載のＰＥＧ化脂質のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｐｈｏｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００）を含有してもよい。一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、当該技術分野で既知のカチオン性脂質および少なくとも１つの他の成分を含有してもよい。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、当該技術分野で既知のカチオン性脂質、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含有してもよい。非限定例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含有してもよい。非限定例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣおよびコレステロールを、２：４０：１０：４８のモル比で含有してもよい（ギール（Ｇｅａｌｌ）ら著、「自己増殖性ＲＮＡワクチンの非ウイルス送達（Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ
ｏｆ ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、ピーナス（ＰＮＡＳ）、２０１２年；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４）。
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、国際公開番号で国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレットまたは国際公開第２００８１０３２７６号パンフレット（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法によって調合してもよい。非限定例として、本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレットおよび／または国際公開第２００８１０３２７６号パンフレット（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載のＬＮＰ製剤に被包してもよい。
一実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、ポリカチオン組成物を含んでもよい。非限定例として、ポリカチオン組成物は、米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）の式１〜６０から選択してもよい。別の実施形態では、ポリカチオン組成物を含むＬＮＰ製剤は、本明細書に記載の修飾ＲＮＡをインビボおよび／またはインビトロで送達するために使用してもよい。
一実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、透過促進剤分子をさらに含んでもよい。非限定的な透過促進剤分子は、米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一実施形態では、医薬組成物は、限定はされないが、ＤｉＬａ２リポソーム（マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ボセル、ワシントン州）、スマーティクルズ（ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ）（登録商標）（マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ボセル、ワシントン州）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）ベースのリポソーム（例えば、卵巣がんへのｓｉＲＮＡ送達（ランデン（Ｌａｎｄｅｎ）ら著、キャンサー・バイオロジー・アンド・セラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００６年、第５巻、第１２号、ｐ．１７０８−１７１３））およびヒアルロン酸で被覆されたリポソーム（クワイエット・セラピューティクス（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、イスラエル）などのリポソーム中で調合してもよい。
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、急速に除去される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として知られる生分解性カチオン性脂質と置き換えることにより、改良してもよい。イオン化可能なカチオン性脂質、例えば限定はされないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡは、経時的に血漿および組織の中で蓄積することが示されており、潜在的な毒性源でありうる。急速に除去される脂質の急速な代謝は、脂質ナノ粒子の認容性および治療指数を、ラットでは１ｍｇ／ｋｇ用量〜１０ｍｇ／ｋｇ用量の桁だけ改善し得る。酵素分解されたエステル結合の取り込みは、カチオン成分の分解および代謝特性を改善し得る一方、ｒｅＬＮＰ製剤の活性をさらに維持し得る。エステル結合は、脂質鎖内に内部的に位置し得るかまたは脂質鎖の末端に末端的に位置し得る。内部エステル結合は、脂質鎖内の任意の炭素を置換し得る。
一実施形態では、内部エステル結合は、飽和炭素の両側に位置し得る。ｒｅＬＮＰの非限定例は、以下を含む。
一実施形態では、ナノスピーシーズ（ｎａｎｏｓｐｅｃｉｅｓ）、ポリマーおよび免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することにより、免疫応答が誘発され得る（米国特許出願公開第２０１２０１８９７００号明細書および国際公開第２０１２０９９８０５号パンフレット；これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）。ポリマーは、ナノスピーシーズを被包し得るかまたはナノスピーシーズを部分的に被包し得る。
脂質ナノ粒子は、粒子の表面特性を変更するように操作することで、脂質ナノ粒子は、粘膜関門を透過することが可能である。粘液は、限定はされないが、口腔（例えば、頬および食道粘膜および扁桃組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、鼻、咽頭、気管および気管支粘膜）、性器（例えば、膣、頸部および尿道膜）、などの粘膜組織に位置する。より高い薬物被包効率および多様な薬剤の持続的送達を提供する能力にとって好ましい１０〜２００ｎｍより大きいナノ粒子は、粘膜関門を通って急速に拡散するには大き過ぎると考えられている。粘液は、継続的に分泌され、流され、廃棄または消化され、再循環されることにより、捕捉された粒子の大部分が粘膜（ｍｕｃｏｓｌａ）組織から数秒以内または数時間以内に除去され得る。低分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で高密度に被覆されている大型ポリマーナノ粒子（直径が２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は、粘液を通じて、水中に拡散する同じ粒子よりもわずか４〜６倍遅く拡散した（ライ（Ｌａｉ）ら著、ピーナス（ＰＮＡＳ）、２００７年、第１０４巻、第５号、ｐ．１４８２−４８７；ライ（Ｌａｉ）ら著、アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．）、２００９年、第６１巻、第２号、ｐ．１５８−１７１；これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）。ナノ粒子の輸送は、透過速度および／または蛍光顕微鏡技術、例えば限定はされないが、蛍光退色後回復測定（ＦＲＡＰ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）および高分解能多重粒子追跡（ＭＰＴ： ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ）を用いて測定することができる。
粘液を透過させるように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）および／またはポリマー−ビタミン抱合体および／またはトリブロック共重合体を含んでもよい。ポリマー材料は、限定はされないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーバメート、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｅｎｅｉｍｉｎｅｓ）、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートを含ん
でもよい。ポリマー材料は、生分解性および／または生体適合性であってもよい。特定のポリマーの非限定例として、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＰＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート（ｐｏｌｙａｌｋｙｌ ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン（ポリエチレンおよびポリプロピレンなど）、ポリアルキレングリコール（ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）など）、ポリアルキレンテレフタレート（ポリ（エチレンテレフタレート）など）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル（ポリ（酢酸ビニル）など）、ポリビニルハライド（ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）など）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化されたセルロース（アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースなど）、アクリル酸のポリマー（ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）など）、ならびにこれらの共重合体および混合物、ポリジオキサノンおよびその共重合体、ポリヒドロキシアルカン酸エステル、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、およびトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドン、が挙げられる。脂質ナノ粒子は、限定はされないが、ブロック共重合体、および（ポリ（エチレングリコール））−（ポリ（プロピレンオキシド））−（ポリ（エチレングリコール））トリブロック共重合体などの共重合体を被覆するかまたは会合させてもよい（米国特許出願公開第２０１２０１２１７１８号明細書および米国特許出願公開第２０１００００３３３７号明細書を参照；これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）。共重合体は、一般に安全と見なされるポリマー（ＧＲＡＳ）であってもよく、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学的実体が全く発生しないようになされ得る。例えば、脂質ナノ粒子は、さらにヒト粘液を急速に透過することができる新しい化学的実体を形成することのない、ポロキサマーで被覆したＰＬＧＡナノ粒子を含んでもよい（ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、アンゲヴァント・ケミエ，インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２０１１年、第５０巻、ｐ．２５９７−２６００；その全体が参照により本明細書に援用される）。
ポリマー−ビタミン抱合体のビタミンは、ビタミンＥであってもよい。同抱合体のビタミン部分は、限定はされないが、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、疎水性部分、または他の界面活性剤（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖およびアルキレンオキシド鎖）の疎水性成分などの他の適切な成分と置き換えてもよい。
粘液を透過させるように操作された脂質ナノ粒子は、表面改変剤（ｓｕｒｆａｃｅ ａｌｔｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、例えば限定はされないが、ｍｍＲＮＡ、アニオン性タ
ンパク質（例えばウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、例えばジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドなど）、糖類または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコールおよびポロキサマー）、粘液溶解薬（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クレロデンドルム（ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ）、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）、および遺伝子組換えヒトデオキシリボヌクレアーゼを含む様々なデオキシリボヌクレアーゼ、を含んでもよい。表面改変剤は、粒子の表面内に包埋またはメッシュしてもよく、あるいは脂質ナノ粒子の表面上で（例えば、被覆、吸着、共有結合、または他の方法により）処理してもよい（米国特許出願公開第２０１００２１５５８０号明細書および米国特許出願公開第２００８０１６６４１４号明細書を参照；これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）。
粘液を透過する脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の少なくとも１つのｍｍＲＮＡを含んでもよい。ｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に被包してもよく、および／または粒子の表面上で処理してもよい。ｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に共有結合させてもよい。粘液を透過する脂質ナノ粒子の製剤は、複数のナノ粒子を含んでもよい。さらに、同製剤は、粘液と相互作用し、周囲の粘液の構造特性および／または接着性を変更し、粘膜付着を低下させ得る粒子を含んでもよく、それにより、粘液を透過する脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を増加させることができる。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、限定はされないが、サイレンス・セラピューティクス（Ｓｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（ロンドン、英国）のアトゥプレックス（ＡＴＵＰＬＥＸ）（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム及び他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ステムジェント（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）（登録商標）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）のステムフェクト（ＳＴＥＭＦＥＣＴ）（商標）、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンベースの標的および非標的核酸送達など、リポプレックスとして調合される（アレク（Ａｌｅｋｕ）ら著、キャンサ・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ）、２００８年、第６８巻、ｐ．９７８８−９７９８；ストランバーグ（Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ）ら著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第５０巻、ｐ．７６−７８；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１２２２−１２３４；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１３６０−１３７０；グートビール（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、プルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第２３巻、ｐ．３３４−３４４；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、ミクロバスキュラー・リサーチ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ．２８６−２９３、ワイデ（Ｗｅｉｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ）、２００９年、第３２巻、ｐ．４９８−５０７；ワイデ（Ｗｅｉｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ）、２００８年、第３１巻、ｐ．１８０−１８８；パスコロ（Ｐａｓｃｏｌｏ）著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第４巻、ｐ．１２８５−１２９４；フォティン−ムレチェク（Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ）ら著、２０１１年、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、第３４巻、ｐ．１−１５；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９−
７１７；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２００７年６月；第１０４巻、ｐ．４０９５−４１００；ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）、ヒューマン・ジーン・セラピー（ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５−１３２；これらはすべて、それら全体が参照により本明細書中に援用される）。
一実施形態では、また、限定はされないが、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、および白血球を含め、インビボで種々の細胞型を受動的または能動的に標的とするようにかかる製剤を構築するか、または組成を変更してもよい（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７−１３６４；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９−７１７；ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、２００９年、第１１９巻、ｐ．６６１−６７３；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、ミクロバスキュラー・リサーチ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ．２８６−２９３；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１２２２−１２３４；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１３６０−１３７０；グートビール（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、プルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第２３巻、ｐ．３３４−３４４；バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ．２１８６−２２００；フェンスケ（Ｆｅｎｓｋｅ）およびカリス（Ｃｕｌｌｉｓ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｌｉｖ）、２００８年、第５巻、ｐ．２５−４４；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、ｐ．６２７−６３０；ピア（Ｐｅｅｒ）およびリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）著、ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１１２７−１１３３；これらはすべて、それら全体が参照により本明細書中に援用される）。肝細胞に対する製剤の受動的標的化の一例には、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよびＭＣ３ベースの脂質ナノ粒子製剤が含まれ、これらはアポリポタンパク質Ｅに結合し、インビボでこれらの製剤の肝細胞への結合および取り込みを促進することが示されている（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７−１３６４；その全体が参照により本明細書に援用される）。製剤はまた、限定はされないが、葉酸塩、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、および抗体標的化手法により例示の通りの、その表面上での種々のリガンドの発現を介して選択的に標的化され得る（コルハトカ（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ディスカバリー・テクノロジー（Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１１年、第８巻、ｐ．１９７−２０６；ムサッチオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）およびトーチリン（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ）著、フロンティア・イン・バイオサイエンス（Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ）、２０１１年、第１６巻、ｐ．１３８８−１４１２；ユー（Ｙｕ）ら著、モレキュラー・メンブレン・バイオロジー（Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ）、２０１０年、第２７巻、ｐ．２８６−２９８；パティル（Ｐａｔｉｌ）ら著、クリティカル・レビュー・イン・セラピューティック・ドラッグ・キャリア・システム（Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ）、２００８年、第２５巻、ｐ．１−６１；ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオマクロモレキュルズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８−２７１４、チャオ（Ｚｈａｏ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ）、２００８年、第５巻、ｐ．３０９−３１９；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１８巻
、ｐ．１３５７−１３６４；スリニバサン（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ）ら著、メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ）、２０１２年、第８２０巻、ｐ．１０５−１１６；ベン−アリー（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ）ら著、メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ）、２０１２年、第７５７巻、ｐ．４９７−５０７；ピア（Ｐｅｅｒ）、２０１０年、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ）、第２０巻、ｐ．６３−６８；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．４０９５−４１００；キム（Ｋｉｍ）ら著、メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ）、２０１１年、第７２１巻、ｐ．３３９−３５３；スブラマニヤ（Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１８巻、ｐ．２０２８−２０３７；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９−７１７；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、ｐ．６２７−６３０；ピア（Ｐｅｅｒ）およびリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）著、ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１１２７−１１３３；これらはすべて、それら全体が参照により本明細書中に援用される）。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、固体脂質ナノ粒子として調合されてもよい。固体脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ：ＳＬＮ）は、平均直径が１０〜１０００ｎｍの球形であってもよい。ＳＬＮは、脂溶性分子を可溶化することのできる固体脂質コアマトリックスを有し、界面活性剤および／または乳化剤で安定化し得る。さらなる実施形態において、脂質ナノ粒子は、自己組織化脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ Ｎａｎｏ）、２００８年、第２巻、第８号、ｐ．１６９６−１７０２を参照；その全体が参照により本明細書に援用される）。
リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる細胞トランスフェクションを高め、および／またはコード化タンパク質の翻訳を高めることができ得ることから、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに誘導されるタンパク質生成の有効性を向上させるように使用してもよい。１つのかかる例には、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身送達を可能にする脂質封入の使用が含まれる（ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、２００７年、第１５巻、ｐ．７１３−７２０；その全体が参照により本明細書に援用される）。また、リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を高めるために使用してもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、徐放および／または標的化送達のために調合してもよい。本明細書で使用される「徐放」は、治療成績をもたらす特定の放出パターンに適合する医薬組成物または化合物の放出特性を示す。一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、徐放および／または標的化送達のため、本明細書に記載および／または当該技術分野で既知の送達剤に被包してもよい。本明細書で使用される用語「被包する」は、封入、包囲または内包することを意味する。本発明の化合物の製剤に関しては、被包は、実質的で、完全でまたは部分的であってもよい。用語「実質的に（ｓｕｂｓｔｉｔａｎｔｉａｌｌｙ）被包された」は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９％を超えるか、または９９．９９９％を超える本発明の医薬組成物または化合物を、送達剤の中に封入、包囲または内包してもよいことを意味する。「部分的に被包された（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）」は
、１０％未満、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または５０％未満の本発明の医薬組成物または化合物を、送達剤の中に封入、包囲または内包してもよいことを意味する。有利なことに、被包は、本発明の医薬組成物または化合物のエスケープまたは活性を、蛍光および／または電子顕微鏡写真を用いて測定することにより、判定してもよい。例えば、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または９９．９９％を超える本発明の医薬組成物または化合物が、送達剤の中に被包される。
別の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子または急速に除去される脂質ナノ粒子中に被包してもよく、次いで脂質ナノ粒子または急速に除去される脂質ナノ粒子は、本明細書に記載および／または当該技術分野で既知のポリマー、ハイドロゲルおよび／または外科用シーラント（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｓｅａｌａｎｔ）に被包してもよい。非限定例として、ポリマー、ハイドロゲルまたは外科用シーラントは、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ジェルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）（ナノセラピューティクス・インコーポレイテッド（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、アラチュア、フロリダ州）、ハイレネックス（ＨＹＬＥＮＥＸ）（登録商標）（ハロザイム・セラピューティクス（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）、外科用シーラント、例えばフィブリノーゲンポリマー（エチコン・インコーポレイテッド（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．）、コーネリア、ジョージア州）、ティッセル（ＴＩＳＳＥＬＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、ディアフィールド、イリノイ州）、ＰＥＧベースのシーラント、およびコシール（ＣＯＳＥＡＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、ディアフィールド、イリノイ州）、であってもよい。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象に投与される場合にゲルを形成し得る、当該技術分野で既知の任意のポリマーまたはハイドロゲルに被包してもよい。別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックスに被包してもよい。
一実施形態では、徐放および／または標的化送達を意図したポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ製剤はまた、少なくとも１つの徐放コーティング剤を含んでもよい。徐放コーティング剤として、限定はされないが、オパドリ（ＯＰＡＤＲＹ）（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ユードラギット（ＥＵＤＲＡＧＩＴ）ＲＬ（登録商標）、ユードラギット（ＥＵＤＲＡＧＩＴ）ＲＳ（登録商標）ならびにエチルセルロース水分散液（アクアコート（ＡＱＵＡＣＯＡＴ）（登録商標）およびスリリース（ＳＵＲＥＬＥＡＳＥ）（登録商標））などのセルロース誘導体、が挙げられる。
一実施形態では、徐放および／または標的化送達製剤は、ポリカチオン側鎖を有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性（ｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）ポリエステルとして、限定はされないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組み合わせ、が挙げられる。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するＰＥＧ抱合を含んでもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、ナノ粒子治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）に被包して
もよい。ナノ粒子治療薬は、限定はされないが、本明細書に記載の方法や、国際公開第２０１０００５７４０号パンフレット、国際公開第２０１００３０７６３号パンフレット、国際公開第２０１０００５７２１号パンフレット、国際公開第２０１０００５７２３号パンフレット、国際公開第２０１２０５４９２３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号明細書、米国特許出願公開第２０１００１０４６４５号明細書、米国特許出願公開第２０１０００８７３３７号明細書、米国特許出願公開第２０１０００６８２８５号明細書、米国特許出願公開第２０１１０２７４７５９号明細書、米国特許出願公開第２０１０００６８２８６号明細書、および米国特許第８，２０６，７４７号明細書（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）などの当該技術分野で既知の方法によって調合してもよい。別の実施形態では、ポリマーナノ粒子治療薬は、米国特許出願公開第２０１２０１４０７９０号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により同定してもよい。
一実施形態では、ナノ粒子治療薬は、徐放を意図して調合してもよい。本明細書で使用される「徐放」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物を示す。同期間は、限定はされないが、数時間、数日、数週、数か月および数年を含んでもよい。非限定例として、徐放性ナノ粒子は、ポリマーおよび治療薬、例えば限定はされないが、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを含んでもよい（国際公開第２０１００７５０７２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１００２１６８０４号明細書および米国特許出願公開第２０１１０２１７３７７号明細書を参照；これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）。
一実施形態では、ナノ粒子治療薬は、標的特異的であるように調合してもよい。非限定例として、ナノ粒子治療薬（ｔｈｅｒｅａｐｅｕｔｉｃ）は、副腎皮質ステロイドを含んでもよい（国際公開第２０１１０８４５１８号パンフレットを参照）。一実施形態では、ナノ粒子治療薬は、がん特異的であるように調合してもよい。非限定例として、ナノ粒子治療薬は、国際公開第２００８１２１９４９、国際公開第２０１０００５７２６号パンフレット、国際公開第２０１０００５７２５号パンフレット、国際公開第２０１１０８４５２１号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１０００６９４２６号明細書、米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書および米国特許出願公開第２０１００１０４６５５号明細書（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載のナノ粒子として調合してもよい。
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含んでもよい。非限定例として、ナノ粒子は、２つ以上のポリマー、例えば限定はされないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄｓ）、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅｓ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリル酸、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、またはそれらの組み合わせ、を含んでもよい。
一実施形態では、ジブロック共重合体は、ポリマー、例えば限定はされないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリル酸、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セ
リンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、またはその組み合わせ、と併用させたＰＥＧを含んでもよい。
一実施形態では、ナノ粒子治療薬は、ジブロック共重合体を含む。非限定例として、ナノ粒子治療薬は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロック共重合体を含む（米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書および米国特許第８，２３６，３３０号明細書、それら全体が参照により本明細書に援用される）。別の非限定例では、ナノ粒子治療薬は、ＰＥＧおよびＰＬＡまたはＰＥＧおよびＰＬＧＡのジブロック共重合体を含むステルスナノ粒子である（米国特許第８，２４６，９６８号明細書を参照；その各々はその全体が参照により本明細書に援用される）。
一実施形態では、ナノ粒子治療薬は、少なくとも１つのアクリルポリマーを含んでもよい。アクリルポリマーは、限定はされないが、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体、メチルメタクリレート共重合体、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレート共重合体、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレートおよびこれらの組み合わせ、を含む。
一実施形態では、ナノ粒子治療薬は、本明細書に記載および／または当該技術分野で既知の少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含んでもよい。
一実施形態では、ナノ粒子治療薬は、少なくとも１つのアミン含有ポリマー、例えば限定はされないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、およびそれらの組み合わせ、を含んでもよい。
一実施形態では、ナノ粒子治療薬は、ポリカチオン側鎖を有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性（ｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）ポリエステルは、限定はされないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組み合わせ、を含む。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するＰＥＧ抱合を含んでもよい。
別の実施形態では、ナノ粒子治療薬は、少なくとも１つの標的リガンドの抱合を含む。
一実施形態では、ナノ粒子治療薬は、がんを標的にするのに使用可能な水溶液中で調合してもよい（国際公開第２０１１０８４５１３号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０２９４７１７号明細書を参照；これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、合成ナノ担体に被包、連結、および／または会合され得る。合成ナノ担体は、当該技術分野で既知および／または本明細書に記載の方法を用いて調合してもよい。非限定例として、合成ナノ担体は、国際公開第２０１０００５７４０号パンフレット、国際公開第２０１００３０７６３号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号明細書、米国特許出願公開第２０１００１０４６４５号明細書および米国特許出願公開第２０１０００８７３３７号明細書（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法によって調合してもよい。別の実施形態では、合成ナノ担体製剤は、国際公開第２０１１０７２２１８号パンフレットおよび米国特許第８，２１１，４７３号明細書（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により、凍結乾燥してもよい。
一実施形態では、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物お
よび／またはｍｍＲＮＡを放出するための反応基を有してもよい（国際公開第２０１２０９５２５５２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１２０１７１２２９号明細書を参照；これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）。
一実施形態では、合成ナノ担体は、合成ナノ担体の送達から免疫応答を増強するため、免疫刺激剤を有してもよい。非限定例として、合成ナノ担体は、免疫系のＴｈｌに基づく応答を増強し得るＴｈ１免疫刺激剤を含んでもよい（国際公開第２０１０１２３５６９号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０２２３２０１号明細書を参照；これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）。
一実施形態では、合成ナノ担体は、標的化放出を意図して調合してもよい。一実施形態では、合成ナノ担体は、特定のｐＨで、かつ／または所望される時間間隔後、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡを放出するように調合される。非限定例として、合成ナノ粒子は、２４時間後および／または４．５のｐＨで、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡを放出するように調合してもよい（国際公開第２０１０１３８１９３号パンフレットおよび国際公開第２０１０１３８１９４号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１００２０３８８号明細書および米国特許出願公開第２０１１００２７２１７号明細書を参照；これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）。
一実施形態では、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡの制御放出および／または徐放を意図して調合してもよい。非限定例として、徐放を意図した合成ナノ担体は、当該技術分野で既知、本明細書に記載および／または、国際公開第２０１０１３８１９２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１００３０３８５０号明細書（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法によって調合してもよい。
ポリマー、生分解性ナノ粒子、およびコア−シェルナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、天然および／または合成ポリマーを使用して調合してもよい。送達に使用可能なポリマーの非限定例としては、限定はされないが、ミラス（ＭＩＲＵＳ）（登録商標）バイオ（Ｂｉｏ）（マディソン、ウィスコンシン州）およびロシュ・マディソン（Ｒｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ）（マディソン、ウィスコンシン州）のダイナミックポリコンジュゲート（Ｄｙｎａｍｉｃ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ）（商標）製剤、フェーズＲＸ（ＰＨＡＳＥＲＸ）（商標）ポリマー製剤、例えば、限定はされないが、スマルト・ポリマー・テクノロジー（ＳＭＡＲＴＴ
ＰＯＬＹＭＥＲＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）（商標）（シアトル、ワシントン州）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、バイカル（Ｖｉｃａｌ）（サンディエゴ、カリフォルニア州）製バクスフェクチン（ＶＡＸＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）アジュバント、キトサン、カランド・ファーマシューティカルズ（Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（パサディナ、カリフォルニア州）製シクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマーが挙げられる。ロンデル（ＲＯＮＤＥＬ）（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（アロウヘッド・リサーチ・コーポレーション（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、パサディナ、カリフォルニア州）およびｐＨ応答性コブロックポリマー、例えば限定はされないが、フェイズアールエックス（ＰＨＡＳＥＲＸ）（商標）（シアトル、ワシントン州）。
ＰＬＧＡ製剤の非限定例として、限定はされないが、ＰＬＧＡ注射用デポーが挙げられる（例えば、ＰＬＧＡを６６％のＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中に溶解することによって形成されるエリガード（ＥＬＩＧＡＲＤ）（登録商標）と、残りが水性溶媒お
よびリュープロリドである。一旦注射されると、ＰＬＧＡおよびリュープロリドペプチドは皮下空間に沈降する）。
これらのポリマー手法の多くは、インビボでのオリゴヌクレオチドの細胞質への送達における有効性が実証されている（ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５−１３２にレビューされている；その全体が参照により本明細書に援用される）。核酸のロバストなインビボ送達を生じた（この場合低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を伴う）２つのポリマー手法は、ダイナミックポリコンジュゲートおよびシクロデキストリンベースのナノ粒子である。これらの送達手法のうちの一番目は、ダイナミックポリコンジュゲートを使用するもので、マウスにおいてインビボでｓｉＲＮＡを有効に送達し、肝細胞における内因性標的ｍＲＮＡをサイレンシングすることが示されている（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２−１２８８７）。この特定の手法は、多成分ポリマー系であり、その重要な特徴としては、核酸、この場合ｓｉＲＮＡがジスルフィド結合を介して共有結合的に共役される膜活性ポリマーが挙げられ、そこにＰＥＧ基（電荷遮蔽用）およびＮ−アセチルガラクトサミン基（肝細胞標的化用）の双方がｐＨ感受性結合を介して連結される（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２−１２８８７）。ポリマー複合体は、肝細胞に結合してエンドソームに侵入すると、低ｐＨ環境下で分解し、ポリマーがその正電荷を露出すると、ポリマーからのエンドソームエスケープおよびｓｉＲＮＡの細胞質放出が生じる。Ｎ−アセチルガラクトサミン基をマンノース基に置換する場合、アシアロ糖タンパク質受容体発現肝細胞から類洞内皮細胞およびクッパー細胞に標的を変更可能であることが示されている。別のポリマー手法には、トランスフェリン標的シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子の使用が含まれる。これらナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現ユーイング肉腫腫瘍細胞におけるＥＷＳ−ＦＬＩ１遺伝子産物の標的サイレンシングを実証しており（フー−リースコバン（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ）ら著、キャンサ・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ）、２００５年、第６５巻、ｐ．８９８４−８９８２）、これらナノ粒子に調合されたｓｉＲＮＡは、非ヒト霊長類において十分に許容された（ハイデル（Ｈｅｉｄｅｌ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．５７１５−２１）。これらの送達戦略の双方とも、標的化送達及びエンドソームエスケープ機構の双方を用いた合理的な手法を組み入れている。
ポリマー製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの徐放または遅延放出（例えば、筋肉内または皮下注射後）を可能にし得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの放出特性を変更することにより、例えば、長期間にわたるコード化タンパク質の翻訳をもたらすことができる。ポリマー製剤はまた、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を高めるために使用してもよい。生分解性ポリマーは、これまで、ｍｍＲＮＡ以外の核酸を分解から保護するために使用されており、インビボでペイロードの徐放をもたらすことが示されている（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２−１２８８７；サリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ）、２０１０年、第７巻、ｐ．１４３３−１４４６；コンバーチン（Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ）ら著、バイオマクロモレキュルズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１０年１０月１日；チュー（Ｃｈｕ）ら著、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ）、２０１２年１月１３日；マンガニエロ（Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１２年、第３３巻、ｐ．２３０１−２３０９；ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオマクロ
モレキュルズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８−２７１４；シンハ（Ｓｉｎｇｈａ）ら著、ヌクレイック・アシッド・セラピューティクス（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ）、２０１１年、第２巻、ｐ．１３３−１４７；ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５−１３２；シャファート（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ）およびワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００８年、第１６巻、ｐ．１１３１−１１３８；チャツルベディ（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ）、２０１１年、第８巻、ｐ．１４５５−１４６８；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、モレキュラー・ファーマシューティクス（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ）、２００９年、第６巻、ｐ．６５９−６６８；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、ｐ．１０６７−１０７０；これら各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
一実施形態では、医薬組成物は、徐放性製剤であってもよい。さらなら実施形態では、徐放性製剤は、皮下送達を意図してもよい。徐放性製剤は、限定はされないが、ＰＬＧＡマイクロスフェア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ジェルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）（ナノセラピューティクス・インコーポレイテッド（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、アラチュア、フロリダ州）、ハイレネックス（ＨＹＬＥＮＥＸ）（登録商標）（ハロザイム・セラピューティクス（Ｈａｌｏｚｙｍｅ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）、外科用シーラント、例えばフィブリノーゲンポリマー（エチコン・インコーポレイテッド（Ｅｔｈｉｃｏｎ
Ｉｎｃ．）、コーネリア、ジョージア州）、ティッセル（ＴＩＳＳＥＬＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、ディアフィールド、イリノイ州）、ＰＥＧベースのシーラント、およびコシール（ＣＯＳＥＡＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、ディアフィールド、イリノイ州）、を含んでもよい。
非限定例として、修飾ｍＲＮＡは、ＰＬＧＡマイクロスフェアを調節可能な放出速度（例えば、数日および数週）で調製し、修飾ｍＲＮＡをＰＬＧＡマイクロスフェアで被包する一方、被包プロセス中の修飾ｍＲＮＡの完全性を維持することにより、ＰＬＧＡマイクロスフェア中で調合してもよい。ＥＶＡｃは、前臨床の徐放性インプラント用途（例えば、緑内障用の持続放出製品であるオキュサート（Ｏｃｕｓｅｒｔ）のピロカルピン眼インサートまたはプロゲスタサート（ｐｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ）の徐放性プロゲステロン子宮内装置；経皮送達システムであるテストダーム（Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ）、デュラジェシック（Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ）およびセレギリン（Ｓｅｌｅｇｉｌｉｎｅ）；カテーテル）において広範に使用される、非生分解性の生体適合性ポリマーである。ポロキサマーＦ−４０７ ＮＦは、５℃未満の温度で低粘度を有するポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの親水性の非イオン界面活性剤トリブロック共重合体であり、１５℃より高い温度で固体ゲルを形成する。ＰＥＧベースの外科用シーラントは、１分以内に調製でき、３分以内にシールし、３０日以内に再吸収される、送達装置内で混合される２つの合成ＰＥＧ成分を含む。ジェルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）および天然ポリマーは、投与部位でのインサイチュのゲル化能を有する。それらは、イオン相互作用（ｉｎｅｒａｃｔｉｏｎ）を介してタンパク質およびペプチドの治療薬候補と相互作用し、安定化効果をもたらすことが示されている。
ポリマー製剤はまた、限定はされないが、葉酸塩、トランスフェリン、およびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）により例示されるような種々のリガンドの発現を通じて、選択的に標的化され得る（ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオマクロモレキュル
ズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８−２７１４；ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２−１２８８７；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、モレキュラー・ファーマシューティクス（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ）、２００９年、第６巻、ｐ．６５９−６６８；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、ｐ．１０６７−１０７０；これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、ポリマー化合物とまたはその中で調合してもよい。ポリマーは、少なくとも１つのポリマー、例えば限定はされないが、ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｎｅｓ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（１−リジン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧ、カチオンリポポリマー、生分解性カチオンリポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分岐型ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、生分解性ポリマー、生分解性ブロック共重合体、生分解性ランダム共重合体、生分解性ポリエステル共重合体、生分解性ポリエステルブロック共重合体、生分解性ポリエステルブロックランダム共重合体、直鎖状生分解性共重合体、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性マルチブロック共重合体、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリル酸、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、アクリルポリマー、アミン含有ポリマーまたはその組み合わせ、を含んでもよい。
非限定例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、米国特許第６，１７７，２７４号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のように、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧのポリマー化合物と調合してもよい。製剤は、インビトロでの細胞への遺伝子導入、またはポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡのインビボ送達において使用してもよい。別の例では、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、米国特許出願公開第２００９００４２８２９号明細書および米国特許出願公開第２００９００４２８２５号明細書（これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載のように、カチオン性ポリマーを有する溶液または培地、乾燥医薬組成物あるいは乾燥され得る溶液に懸濁してもよい。
別の非限定例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロック共重合体と調合してもよい（米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書および米国特許第８，２３６，３３０号明細書を参照、これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）。非限定例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＰＥＧおよびＰＬＡまたはＰＥＧおよびＰＬＧＡのジブロック共重合体と調合してもよい（米国特許第８，２４６，９６８号明細書を参照、その全体が参照により本明細書に援用される）。
ポリアミン誘導体は、核酸を送達するか、あるいは疾患を治療および／または予防するか、あるいは移植可能または注射可能デバイス内に含めるため、使用してもよい（米国特許出願公開第２０１００２６０８１７号明細書、その全体が参照により本明細書に援用される）。非限定例として、医薬組成物は、修飾核酸およびｍｍＲＮＡおよび米国特許出願公開第２０１００２６０８１７号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書中に
援用される）に記載のポリアミン誘導体を含んでもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのアクリルポリマーと調合してもよい。アクリルポリマーは、限定はされないが、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸共重合体、メチルメタクリレート共重合体、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレート共重合体、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート、ならびにこれらの組み合わせ、を含む。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、国際公開第２０１１１１５８６２号パンフレット、国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレットおよび国際公開第２０１２０６８１８７号パンフレット（これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載の少なくとも１つのポリマーと調合してもよい。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、国際公開第２０１１１１５８６２号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の式Ｚのポリマーと調合してもよい。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレットまたは国際公開第２０１２０６８１８７号パンフレット（これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載の式Ｚ、Ｚ’またはＺ’’のポリマーと調合してもよい。本発明の修飾ＲＮＡと調合されるポリマーは、国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレットまたは国際公開第２０１２０６８１８７号パンフレット（これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により合成してもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの製剤は、少なくとも１つのアミン含有ポリマー、例えば限定はされないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマーまたはその組み合わせ、を含んでもよい。
例えば、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、ポリ（アルキレンイミン）、生分解性カチオンリポポリマー、生分解性ブロック共重合体、生分解性ポリマー、または生分解性ランダム共重合体、生分解性ポリエステルブロック共重合体、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダム共重合体、直鎖状生分解性共重合体、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロック共重合体またはその組み合わせ、を含む医薬化合物中で調合してもよい。生分解性カチオンリポポリマーは、当該技術分野で既知の、および／または、米国特許第６，６９６，０３８号明細書、米国特許出願公開第２００３００７３６１９号明細書および米国特許出願公開第２００４０１４２４７４号明細書（これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により作製してもよい。ポリ（アルキレンイミン）は、当該技術分野で既知のおよび／または米国特許出願公開第２０１００００４３１５号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法を用いて作製してもよい。生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂａｌｅ）ポリマー、生分解性ブロック共重合体、生分解性ランダム共重合体、生分解性ポリエステルブロック共重合体、生分解性ポリエステルポリマー、または生分解性ポリエステルランダム共重合体は、当該技術分野で既知の、および／または、米国特許第６，５１７，８６９号明細書および米国特許第６，２６７，９８７号明細書（その内容は各々、その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載の方法を用いて作製してもよい。直鎖状生分解性共重合体は、当該技術分野で既知のおよび／または米国特許第６，６５２，８８６号明細書に記載の方法を用いて作製してもよい。ＰＡＧＡポリマーは、当該技術分野で既知のおよび／または米国特許第６，２１７，９１２号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法を用いて作製してもよい。ＰＡＧＡポリマーは、限定はされないが、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン（ｐｏｌｙａｒｇｉｎｅ）、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリ乳酸およびポリ（ラ
クチド−コ−グリコリド）などのポリマーと共重合し、共重合体またはブロック共重合体を形成してもよい。生分解性架橋カチオン性マルチブロック共重合体は、当該技術分野で既知の、および／または米国特許第８，０５７，８２１号明細書または米国特許出願公開第２０１２００９１４５号明細書（これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により作製してもよい。例えば、マルチブロック共重合体は、分岐ポリエチレンイミンに対して異なるパターンを有する直鎖状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）ブロックを用いて合成してもよい。さらに、組成物または医薬組成物は、当該技術分野で既知の、本明細書に記載の、または米国特許出願公開第２０１００００４３１５号明細書または米国特許第６，２６７，９８７号明細書および米国特許第６，２１７，９１２号明細書（これら各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により作製してもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ポリカチオン側鎖を有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルと調合してもよい。分解性（Ｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）ポリエステルは、限定はされないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するＰＥＧ抱合体を含んでもよい。
一実施形態では、本明細書に記載のポリマーは、脂質終端化ＰＥＧ（ｌｉｐｉｄ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ＰＥＧ）に抱合させてもよい。非限定例として、ＰＬＧＡは、ＰＬＧＡ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧを形成する脂質終端化ＰＥＧに抱合させてもよい。別の非限定例として、本発明で使用されるＰＥＧ複合体は、国際公開第２００８１０３２７６号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、別の化合物と抱合させてもよい。抱合体の非限定例として、米国特許第７，９６４，５７８号明細書および米国特許第７，８３３，９９２号明細書（これら各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、米国特許第７，９６４，５７８号明細書および米国特許第７，８３３，９９２号明細書（これら各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載の式１〜１２２の抱合体と抱合させてもよい。
米国特許出願公開第２０１００００４３１３号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のように、遺伝子送達組成物は、ヌクレオチド配列およびポロキサマーを含んでもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１００００４３１３号明細書に記載のポロキサマーを有する遺伝子送達組成物中で使用してもよい。
一実施形態では、本発明のポリマー製剤は、カチオン性担体を含み得るポリマー製剤を、コレステロールおよびポリエチレングリコール基に共有結合され得るカチオンリポポリマーと接触させることにより、安定化させてもよい。ポリマー製剤は、米国特許出願公開第２００９００４２８２９号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法を用いて、カチオンリポポリマーと接触させてもよい。カチオン性担体は、限定はされないが、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチル
アンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ−［Ｎ-（Ν’，Ν’−ジメチルアミノエタノール）−カルバ
モイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドＤＯＤＡＣ）、およびこれらの組み合わせ、を含んでもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡはまた、ポリマー、脂質、および／または他の生分解性剤、例えば限定はされないが、リン酸カルシウムの組み合わせを使用して、ナノ粒子として調合してもよい。成分は、コア−シェル、ハイブリッド、および／または多層構造（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）に組み入れてもよく、それによりナノ粒子の微調整が可能となり、ひいてはポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの送達が増強することができる（ワン（Ｗａｎｇ）ら著、ネイチャー・マテリアルズ（Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ）、２００６年、第５巻、ｐ．７９１−７９６；フラー（Ｆｕｌｌｅｒ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２００８年、第２９巻、ｐ．１５２６−１５３２；デコカー（ＤｅＫｏｋｅｒ）ら著、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ）、２０１１年、第６３巻、ｐ．７４８−７６１；エンドレス（Ｅｎｄｒｅｓ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１１年、第３２巻、ｐ．７７２１−７７３１；スー（Ｓｕ）ら著、モレキュラー・ファーマシューティクス（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ）、２０１１年６月６日、第８巻、第３号、ｐ．７７４−８７；その全体が参照により本明細書に援用される）。
脂質および／またはポリマーと組み合わせた生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、インビボでポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを送達することが示されている。一実施形態では、脂質で被覆されたリン酸カルシウムナノ粒子（これはアニスアミドなどの標的リガンドも含有してもよい）は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを送達するために使用してもよい。例えば、マウス転移性肺モデルにおいてｓｉＲＮＡを有効に送達するために、脂質で被覆されたリン酸カルシウムナノ粒子が使用された（リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ）、２０１０年、第１４２巻、ｐ．４１６−４２１；リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ）、２０１２年、第１５８巻、ｐ．１０８−１１４；ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第２０巻、ｐ．６０９−６１５）。この送達系では、ｓｉＲＮＡの送達を改善するため、標的化されたナノ粒子とエンドソームエスケープを増強する成分であるリン酸カルシウムとの双方を組み合わせられる。
一実施形態では、ＰＥＧ−ポリアニオンブロック共重合体を有するリン酸カルシウムは、ポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの送達に使用してもよい（カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ）、２００４年、第９７巻、ｐ．３４５−３５６；カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ）、２００６年、第１１１巻、ｐ．３６８−３７０）。
一実施形態では、ＰＥＧ−電荷変換型ポリマー（ピテラ（Ｐｉｔｅｌｌａ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１１年、第３２巻、ｐ．３１０６−３１１４）は、ナノ粒子を形成し、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを送達するために使用してもよい。ＰＥＧ−電荷変換型ポリマーは、酸性ｐＨでポリカチオンに切断され、ひいてはエンドソームエスケープを増強することにより、ＰＥＧ−ポリアニオンブロック共重合体に対する改良が可能である。
コア−シェルナノ粒子の使用では、カチオン性架橋ナノゲルコアおよび様々なシェルを合成するハイスループット手法がさらに重視されている（ジークバルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２９９６−１３００１）。ポリマーナノ粒子の複合体化、送達、および内部移行は、ナノ粒子のコアおよびシェルの双方の成分における化学組成を変更することによって正確に制御することができる。例えば、コア−シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後、ｓｉＲＮＡをマウス肝細胞に効率的に送達することができる。
一実施形態では、中間のＰＬＧＡ層とＰＥＧを有する（ｃｏｎｔａｉｎｇ）外側の中性脂質層とを含む中空脂質コアは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを送達するために使用してもよい。非限定例として、ルシフェラーゼ発現腫瘍を有するマウスでは、従来のリポプレックスと比較した場合、脂質−ポリマー−脂質ハイブリッドナノ粒子がルシフェラーゼ発現を有意に抑制することが決定された（シャイ（Ｓｈｉ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ）、２０１１年、第５０巻、ｐ．７０２７−７０３１）。
ペプチドおよびタンパク質
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる細胞の遺伝子導入を高めるため、ペプチドおよび／またはタンパク質と調合してもよい。一実施形態では、ペプチド、例えば限定はされないが、細胞透過性ペプチドならびに細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチドは、医薬製剤を送達するため、使用してもよい。本発明の医薬製剤と併用可能な細胞透過性ペプチドの非限定例として、細胞内空間への送達を促進するポリカチオンに結合した細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポルタン、又はｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドが挙げられる（例えば、キャロン（Ｃａｒｏｎ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）第３巻、第３号、ｐ．３１０−８、２００１年；ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ）、「細胞透過性ペプチド：プロセスおよび応用（Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、ボーカラトーン、フロリダ州、２００２年）；エル−アンダルッシ（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ）ら著、カレント・ファーマシューティカル・デザイン（Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．）、第１１巻、第２８号、ｐ．３５９７−６１１、２００３年；およびデエー（Ｄｅｓｈａｙｅｓ）ら著、セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンス（Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．）、第６２巻、第１６号、ｐ．１８３９−４９、２００５年を参照、これらはすべて、参照により本明細書中に援用される）。組成物はまた、細胞透過剤、例えばリポソーム（組成物の細胞内空間への送達を増強する）を含むように調合してもよい。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、細胞内送達を可能にするため、限定はされないが、アイレロン・セラピューティクス（Ａｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）製およびパーメオン・バイオロジクス（Ｐｅｒｍｅｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）製のペプチドおよび／またはタンパク質などのペプチドおよび／またはタンパク質と複合してもよい（クロニカン（Ｃｒｏｎｉｃａｎ）ら著、エーシーエス・ケミカルバイオ
ロジー（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）、２０１０年、第５巻、ｐ．７４７−７５２；マクノートン（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、２００９年、第１０６巻、ｐ．６１１１−６１１６；ソーヤー（Ｓａｗｙｅｒ）著、ケミカル・バイオロジー・アンド・ドラッグ・デザイン（Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．）、２００９年、第７３巻、ｐ．３−６；バーダイン（Ｖｅｒｄｉｎｅ）およびヒリンスキー（Ｈｉｌｉｎｓｋｉ）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、２０１２年、第５０３巻、ｐ．３−３３；これらはすべて、その全体が参照により本明細書に援用される）。
一実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、第１のドメインと第２のドメインとを含んでもよい。第１のドメインは、過剰荷電ポリペプチドを含んでもよい。第２のドメインは、タンパク質結合パートナーを含んでもよい。本明細書で使用される「タンパク質結合パートナー」は、限定はされないが、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドを含む。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーに対する細胞内結合パートナーをさらに含んでもよい。細胞透過性ポリペプチドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが導入され得る細胞から分泌可能な場合がある。
含有ペプチドまたはタンパク質の製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる細胞トランスフェクションを増加させ、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの体内分布を（例えば、特定の組織または細胞型を標的化することにより）変化させ、および／またはコード化タンパク質の翻訳を増強させるため、使用してもよい。
細胞
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、エクスビボで細胞に遺伝子導入することが可能であり、その細胞は続いて対象に移植される。非限定例として、医薬組成物は、修飾ＲＮＡを肝臓及び骨髄系細胞に送達するための赤血球、修飾ＲＮＡをウイルス様粒子（ＶＬＰ）で送達するためのビロソーム、ならびに修飾ＲＮＡを送達するための、限定はされないがマックスサイト（ＭＡＸＣＹＴＥ）（登録商標）（ゲイサーズバーグ、メリーランド州）製およびエリテック（ＥＲＹＴＥＣＨ）（登録商標）（リヨン、仏国）製などの電気穿孔細胞を含んでもよい。ｍｍＲＮＡ以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子および電気穿孔細胞の使用例は、文書化されている（ゴッドフリン（Ｇｏｄｆｒｉｎ）ら著、エキスパート・オピニオン・オンバイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第１２巻、ｐ．１２７−１３３；ファング（Ｆａｎｇ）ら著、エキスパート・オピニオン・オンバイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第１２巻、ｐ．３８５−３８９；フー（Ｈｕ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１０９８０−１０９８５；ルンド（Ｌｕｎｄ）ら著、ファーマシューティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ）、２０１０年、第２７巻、ｐ．４００−４２０；ハックリーデ（Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・リポソーム・リサーチ（Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ）、２００７年、第１７巻、ｐ．３９−４７；クシ（Ｃｕｓｉ）著、ヒューマン・ワクチン（Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ）、２００６年、第２巻、ｐ．１−７；ド・ジョンジュ（ｄｅ Ｊｏｎｇｅ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．４００−４１１；これらはすべて、それら全体が参照により本明細書に援用される）。
ポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡは、国際公開第２０１１０８５２３１号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０１７１２４８号明細書（これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法によって合成された合成ＶＬＰ中で送達してもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの細胞ベースの製剤は、細胞トランスフェクション（例えば、細胞担体における）を確実にし、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの体内分布を（例えば、細胞担体を特定の組織または細胞型に標的化することにより）変更し、および／またはコード化タンパク質の翻訳を増強するために使用してもよい。
細胞への核酸の導入については、ウイルス媒介性および非ウイルス媒介性の技術を含め、様々な方法が当該技術分野において既知であり、かつ好適である。例示的な非ウイルス媒介性技術の例としては、限定はされないが、電気穿孔、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介性移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介性移入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）または細胞融合が挙げられる。
ソノポレーション、すなわち細胞超音波処理技術は、細胞原形質膜の透過性を改良するための音波（例えば、超音波周波数）の使用である。ソノポレーション法は当業者に既知であり、インビボで核酸を送達するのに用いられる（ユン（Ｙｏｏｎ）およびパク（Ｐａｒｋ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ）、２０１０年、第７巻、ｐ．３２１−３３０；ポステマ（Ｐｏｓｔｅｍａ）およびギリヤ（Ｇｉｌｊａ）、カレント・ファーマシューティカル・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００７年、第８巻、ｐ．３５５−３６１；ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）およびベッティンガー（Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ）、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００７年、第１４巻、ｐ．４６５−４７５；すべてはその全体が参照により本明細書に援用される）。ソノポレーション法は、当該技術分野において既知であり、また例えば、細菌に関連するものとして米国特許出願公開第２０１００１９６９８３号明細書に、また他の細胞型に関連するものとして、例えば米国特許出願公開第２０１００００９４２４号明細書に教示され、これらの各々はその全体が参照により本明細書に援用される。
電気穿孔技術もまた、当該技術分野において周知であり、インビボで、および臨床的に、核酸を送達するのに用いられる（アンドレ（Ａｎｄｒｅ）ら著、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１０巻、ｐ．２６７−２８０；キアレッラ（Ｃｈｉａｒｅｌｌａ）ら著、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１０巻、ｐ．２８１−２８６；ホフマン（Ｈｏｊｍａｎ）著、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１０巻、ｐ．１２８−１３８；すべてはその全体が参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、実施例２６に記載のように、電気穿孔によって送達してもよい。
ヒアルロニダーゼ
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの筋肉内または皮下局所注射は、ヒアルロナンの加水分解を触媒するヒアルロニダーゼを含んでもよい。ヒアルロニダーゼは、間質バリアの構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それにより組織透過性を高める（フロスト（Ｆｒｏｓｔ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ）、２００７年、第４巻、ｐ．４２７−４４０；その全体が参照により本明細書に援用される）。それは、トランスフェクト細胞によって生成されるコード化タンパク質の分散および全身分布を速めるのに有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼは、筋肉内または皮下に投与された本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、また
はｍｍＲＮＡに曝露される細胞の数を増加させるために使用してもよい。
ナノ粒子模倣物
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ナノ粒子模倣物の内部に被包し、および／またはそれに吸収させてもよい。ナノ粒子模倣物は、生物または粒子、例えば限定はされないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオンおよび細胞の送達機能を模倣し得る。非限定例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ウイルスの送達機能を模倣し得る非バイロン粒子中に被包してもよい（国際公開第２０１２００６３７６号パンフレットを参照、その全体が参照により本明細書に援用される）。
ナノチューブ
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのナノチューブ、例えば限定はされないが、ロゼットナノチューブ、リンカーとともにツイン塩基（ｔｗｉｎ ｂａｓｅｓ）を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブおよび／または単層カーボンナノチューブに付着させるか、あるいはその他として結合させてもよい。ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、限定はされないが、立体力、イオン力、共有結合力および／または他の力などの力を介して、ナノチューブに結合させてもよい。
一実施形態では、ナノチューブは、１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを細胞に放出し得る。少なくとも１つのナノチューブのサイズおよび／または表面構造は、体内でのナノチューブの相互作用を支配し、および／あるいは、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡに付着または結合するように、変更してもよい。一実施形態では、少なくとも１つのナノチューブの、構成要素および／または構成要素に付着される官能基は、ナノチューブの寸法および／または特性を調節するように変更してもよい。非限定例として、ナノチューブの長さは、ナノチューブが正常な血管壁内の孔を通過するのを阻止するように変更してもよいが、腫瘍組織の血管内のより大きい孔を通過するのに十分に小さい。
一実施形態では、少なくとも１つのナノチューブはまた、限定はされないがポリエチレングリコールなどのポリマーを含む、送達増強化合物（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）で被覆してもよい。別の実施形態では、少なくとも１つのナノチューブおよび／あるいはポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、薬学的に許容可能な賦形剤および／または送達媒体と混合してもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのロゼットナノチューブに付着され、および／またはその他として、結合される。ロゼットナノチューブは、当該技術分野で既知の方法により、および／または国際公開第２０１２０９４３０４号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により形成してもよい。少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、ロゼットナノチューブまたはロゼットナノチューブを形成するモジュールが、水性培地中で、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのロゼットナノチューブへの付着あるいはその他として結合を誘発し得る条件下で、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡと混合される場合、国際公開第２０１２０９４３０４号パンフレット（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により、少なくとも１つのロゼットナノチューブに付着させ、および／またはその他として結合させてもよい。
抱合体
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、抱合体、例えば、担体または標的基に共有結合的に連結した、または一緒に融合タンパク質（例えば標的基と治療用タンパク質またはペプチドとを有するもの）を生成する２つのコード領域を含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含む。
本発明の抱合体としては、天然物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質、が挙げられる。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド重合体、またはポリホスファジンといったポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはαヘリックスペプチド、が挙げられる。
特にＲＮＡとの、ポリヌクレオチド抱合体の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５
，５９９，９２８号明細書および米国特許第５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書（これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
一実施形態では、本発明の抱合体は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡにおける担体として機能し得る。抱合体は、カチオン性ポリマー、限定はされないが、ポリ（エチレングリコール）にグラフトされ得る、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、およびポリエチレンイミンを含んでもよい。非限定例として、抱合体は、ポリマー抱合体に類似してもよく、ポリマー抱合体を合成する方法は、米国特許第６，５８６，５２４号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載され得る。
抱合体はまた、標的基、例えば細胞または組織標的剤、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば抗体を含んでもよい。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体またはアプタマーであってもよい。
標的基は、タンパク質、例えば糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに対して特異的な親和性を有する分子、または抗体、例えば、がん細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であってもよい。標的基はまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。標的基はまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーなどの非ペプチド種を含んでもよい。リガンドは、例えば、リポ多糖、又はｐ３８ＭＡＰキナーゼのアクチベーターであってもよい。
標的基は、特定の受容体を標的化することが可能な任意のリガンドであってよい。例として、限定はされないが、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー（ａｐａｔａｍｅｒ）、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、およびＨＤＬリガンド、が挙げられる。詳細な実施形態では、標的基はアプタマーである。アプタマーは未修飾であってもよく、または本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有してもよい。
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、限定はされないが、ロックド核酸と同様の修飾などの化学修飾を含んでもよい。
サンタリス（Ｓａｎｔａｒｉｓ）によるものなどの、ロックド核酸（ＬＮＡ）の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、以下のもの、すなわち米国特許第６，２６８，４９０号明細書；米国特許第６，６７０，４６１号明細書；米国特許第６，７９４，４９９号明細書；米国特許第６，９９８，４８４号明細書；米国特許第７，０５３，２０７号明細書；米国特許第７，０８４，１２５号明細書；および米国特許第７，３９９，８４５号明細書（これらの各々はその全体が参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
ＰＮＡ化合物の調製について教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらの各々は参照により本明細書に援用される。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、例えば、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１年、第２５４巻、ｐ．１４９７−１５００に見出すことができる。
本発明で取り上げる一部の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ、ならびに、他の修飾骨格、特に上記で参照される米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここで天然のリン酸ジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および上記で参照される米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシド、を含む。一部の実施形態では、本明細書で取り上げるポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｔｏｔｉｄｅｓ）は、上記で参照される米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。
２’位の修飾もまた、送達に役立ち得る。好ましくは、２’位の修飾はポリペプチドコード配列に位置せず、すなわち翻訳可能領域に位置しない。２’位の修飾は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび／またはテーリング領域に位置してもよい。２’位の修飾は、以下、すなわち、Ｈ（すなわち２’−デオキシ）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい）のうちの１つを２’位に含んでもよい。好適な例示的修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられる（式中、ｎおよびｍは１〜約１０である）。他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、以下、すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、挿入剤、薬物動態学的特性を改善する基、または薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを２’位に含む。一部の実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら著、ヘルベチカ・キミカ・アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第７８巻、ｐ．４８６−５０４）、すなわちアルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の以下の例に記載されるとおりの、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、同様に本明細書の以下の例に記載されるとおりの、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。他の修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾がまた、他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位または２’−５’連結ｄｓＲＮ
Ａおよび５’末端ヌクレオチドの５’位に作製してもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。かかる修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらの各々は参照により本明細書に援用される。
さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、細胞透過性ポリペプチドに共有結合的に抱合される。細胞透過性ペプチドはまた、シグナル配列を含んでもよい。本発明の抱合体は、安定性が高まり、細胞トランスフェクションが増加し、および／または体内分布が変化する（例えば、特定の組織または細胞型に標的化される）ように設計してもよい。
自己組織化核酸ナノ粒子
自己組織化ナノ粒子は、核酸鎖が容易に再プログラム可能であり得るように正確に制御可能な、明確に定義されたサイズを有する。例えば、がん標的のナノ送達担体における最適な粒径は、２０ｎｍを超える直径が腎クリアランスを回避し、増強された透過性および保持効果を介して特定の腫瘍への送達を促進するように、２０〜１００ｎｍである。自己組織化核酸ナノ粒子を用いると、サイズおよび形状が均一な単一の集団は、がん標的リガンドの正確に制御された空間的配向性および密度を有することで、送達が増強される。非限定例として、オリゴヌクレオチドナノ粒子は、短いＤＮＡ断片および治療用ｓｉＲＮＡのプログラム可能な自己組織化を用いて調製される。これらのナノ粒子は、制御可能な粒径ならびに標的リガンドの位置および密度の場合、分子的に同一である。ＤＮＡ断片およびｓｉＲＮＡは、標的化されたインビボ送達用にＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ四面体ナノ粒子を作製する１ステップ反応に自己組織化される（リー（Ｌｅｅ）ら著、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１２年、第７巻、ｐ．３８９−３９３）。
賦形剤
医薬製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよく、賦形剤は、本明細書で使用される場合、特定の望ましい剤形に適するとおりの、あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などを含む。レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）（リッピンコット、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ボルティモア、メリーランド州、２００６年；参照により本明細書に援用される）に、医薬組成物の調合に使用される様々な賦形剤およびその既知の調製技術が開示される。任意の望ましくない生物学的効果をもたらしたり、またはその他として、医薬組成物の任意の他の１つもしくは複数の成分と有害な様式で相互作用したりするなど、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と適合しない場合を除き、その使用は本発明の範囲内に含まれると考えられる。
一部の実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒトでの使用及び獣医学用途が承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は医薬品グレードである。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ：Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、欧州薬局方（ＥＰ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準に適合する。
医薬組成物の作製に使用される薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定はされないが、不活性希釈剤、分散剤および／または造粒剤、表面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、滑沢剤、および／または油、が挙げられる。かかる賦形剤は、任意選択的に医薬組成物中に含めてもよい。
例示的な希釈剤としては、限定はされないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖など、および／またはそれらの組み合わせ、が挙げられる。
例示的な造粒剤および／または分散剤としては、限定はされないが、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーゴム、柑橘パルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木材産物、海綿、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルスターチナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（スターチ１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミウニムマグネシウム（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第４級アンモニウム化合物など、および／またはそれらの組み合わせ、が挙げられる。
例示的な表面活性剤および／または乳化剤としては、限定はされないが、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックスおよびレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリンおよびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０］、ソルビタンモノパルミテート［スパン（Ｓｐａｎ）（登録商標）４０］、ソ
ルビタンモノステアレート［スパン（Ｓｐａｎ）（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［スパン（Ｓｐａｎ）（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［スパン（Ｓｐａｎ）（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［エム・ワイ・アール・ジェイ（ＭＹＲＪ）（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート，およびソルトル（ＳＯＬＵＴＯＬ）（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、クレモフォア（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ビー・アール・アイ・ジェイ（ＢＲＩＪ）（登録商標）３０］）、ポリ（ビニルピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、プルロニック（ＰＬＵＯＲＩＮＣ）（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー（ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ）（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウムなど、および／またはそれらの組み合わせ、が挙げられる。
例示的な結合剤としては、限定はされないが、デンプン（例えば、コーンスターチおよびデンプン糊）；ゼラチン；糖類（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然および合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンウォーゴム（ｐａｎｗａｒ ｇｕｍ）、ガッチゴム（ｇｈａｔｔｉｇｕｍ）、イサポール（ｉｓａｐｏｌ）外皮の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、およびカラマツアラボガラクタン（ｌａｒｃｈ ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクレート；ワックス；水；アルコールなど、およびそれらの組み合わせ、が挙げられる。
例示的な防腐剤は、限定はされないが、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤および／または他の防腐剤を含んでもよい。例示的な酸化防止剤は、限定はされないが、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル（ａｃｏｒｂｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または亜硫酸ナトリウム、を含む。例示的なキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウム、を含む。例示的な抗菌性防腐剤は、限定はされないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサール、を含む。例示的な抗真菌性防腐剤は、限定はされないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸、を含む。例示的なアルコール防腐剤は、限定はされないが、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノ
ール、ヒドロキシベンゾエート、および／またはフェニルエチルアルコール、を含む。例示的な酸性防腐剤は、限定はされないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロチン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸、を含む。他の防腐剤は、限定はされないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ナトリウムラウリルエーテルサルフェート（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、グリダント・プラス（ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ）（登録商標）、フェノニップ（ＰＨＥＮＯＮＩＰ）（登録商標）、メチルパラベン、ジャーモール（ＧＥＲＭＡＬＬ）（登録商標）１１５、ジャーマベン（ＧＥＲＭＡＢＥＮ）（登録商標）ＩＩ、ネオロン（ＮＥＯＬＯＮＥ）（商標）、カトン（ＫＡＴＨＯＮ）（商標）、および／またはユーキシル（ＥＵＸＹＬ）（登録商標）、を含む。
例示的な緩衝剤は、限定はされないが、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化カルシウムリン酸塩、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張食塩水、リンガー溶液、エチルアルコールなど、および／またはそれらの組み合わせ、を含む。
例示的な滑沢剤は、限定はされないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、モルト、ベヘン酸グリセリル（ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｂｅｈａｎａｔｅ）、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびそれらの組み合わせ、を含む。
例示的な天然油は、限定はされないが、アーモンド、杏仁、アボカド、ババス、ベルガモット、ブラックカラント種（ｂｌａｃｋ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｅｅｄ）、ルリヂサ、カデ、カモミール、キャノーラ、キャラウェー、カルナバ、キャスター、シナモン、ココアバター、ココナツ、タラの肝臓、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、マツヨイグサ、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ゴード、ブドウの種、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイの実、ラバンジン、ラベンダー、レモン、リツェアクベバ、マカダミアナッツ（ｍａｃａｄｅｍｉａ ｎｕｔ）、ゼニアオイ（ｍａｌｌｏｗ）、マンゴーの種、メドウフォームの種、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジ・ラフィー、パーム、パーム核、桃仁（ｐｅａｃｈ ｋｅｒｎｅｌ）、ピーナッツ、ケシの実、カボチャの種、菜種、米ぬか、ローズマリー、サフラワー、ビャクダン、サスクアナ（ｓａｓｑｕａｎａ）、サボイ、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチベルソウ、クルミおよび小麦胚芽の油、を含む。例示的な油は、限定はされないが、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコーン、セバシン酸ジエチル、ジメチコーン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油および／またはそれらの組み合わせ、を含む。
カカオバターおよび坐剤ワックス（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｙ ｗａｘ）、着色料、コー
ティング剤、甘味料、調味料、および／または香料（ｐｅｒｆｕｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などの賦形剤は、フォーミュレータ（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒ）の判断によると、組成物中に存在し得る。
送達
本開示は、薬物送達の科学における期待される進歩を考慮して、任意の適切な経路による、治療、製薬、診断またはイメージングのいずれかを意図した、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの送達を包含する。送達は、ネイキッドであってもまたは調合されてもよい。
ネイキッド送達（Ｎａｋｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ネイキッドで細胞に送達してもよい。本明細書で使用される「ネイキッド」は、遺伝子導入を促進する作用物質を含まないポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを送達することを示す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、修飾を全く含有しなくてもよい。ネイキッドなポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、当該技術分野で既知でありかつ本明細書に記載の投与経路を用いて細胞に送達してもよい。
送達のための調合（Ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の方法を用いて調合してもよい。製剤は、修飾および／または未修飾であり得るポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含有してもよい。製剤は、さらに限定はされないが、細胞透過剤（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ）、薬学的に許容可能な担体、送達剤、生体内分解性または生体適合性ポリマー、溶媒、および徐放性送達製剤（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｄｅｐｏｔ）を含んでもよい。調合されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、当該技術分野で既知でありかつ本明細書に記載の投与経路を用いて細胞に送達してもよい。
組成物はまた、限定はされないが、カテーテルを介する、ゲル剤、散剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、および／またはドロップ剤による、組成物が被覆または含浸された織物または生分解性材料などの基材の使用によるなど、直接浸漬または入浴（ｂａｔｈｉｎｇ）を含む、当該技術分野におけるいくつかの方法のいずれかで、器官または組織への直接送達のため、調合してもよい。
投与
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、治療的に有効な転帰（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｏｕｔｃｏｍｅ）をもたらす任意の経路により投与してもよい。これらは、限定はされないが、経腸、経胃腸（ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒａｌ）、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）（硬膜外（ｐｅｒｉｄｕｒａｌ））、脳内（大脳内部に）、脳室内（脳室内部に）、皮膚上（皮膚上への適用）、皮内、（皮膚自体の内部に）、皮下（皮膚の下に）、経鼻投与（鼻を通して）、静脈内（静脈内部に）、動脈内（動脈内部に）、筋肉内（筋肉内部に）、心臓内（心臓内部に）、骨内注入（骨髄内部に）、髄腔内（脊柱管内部に）、腹腔内、（腹膜内部に注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内、（眼を通して）、空洞内注射、（陰茎の底部内部に）、腟内投与、子宮内、過剰羊水（ｅｘｔｒａ−ａｍｎｉｏｔｉｃ）投与、経皮（全身分布のための無傷皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、空気注入（強く息を吸う）、舌下、唇下、浣腸、点眼（結膜上へ）、または耳滴、を含む。特定の実施形態では、組成物は、血液脳関門、血管バリア、または他の上皮バリアを通過することを可能にする方法で投与してもよい。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡにおける投与の非限定的経路は、以下に記載される。
非経口および注射投与
経口および非経口投与のための液体剤形は、限定はされないが、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤、および／またはエリキシル剤を含む。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、キャスターおよびゴマの油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、調味料、および／または香料などの補助剤を含んでもよい。非経口投与のための特定の実施形態では、組成物は、クレモフォア（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。
注射用製剤、例えば滅菌した注射可能な水性もしくは油性の懸濁剤は、適切な分散剤、浸潤剤、および／または懸濁剤を用いて既知の技術によって調合してもよい。滅菌注射用製剤は、非経口的に許容可能な非毒性希釈剤および／または溶媒中の注射可能な滅菌溶液、懸濁液、および／または乳液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。使用可能な許容可能な媒体および溶媒の中には、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐおよび等張食塩水がある。滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として慣用的に使用される。このため、合成のモノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性（ｂｌａｎｄ）不揮発性油を使用してもよい。注射剤の調製においては、オレイン酸などの脂肪酸を使用してもよい。
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルタによるろ過により、および／あるいは使用前に滅菌水または滅菌した他の注射媒体中に溶解または分散させることが可能な滅菌固体組成物の形態での滅菌剤を混入することにより、滅菌してもよい。
活性成分の効果を延長させるため、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延させることが望ましい場合が多い。これは、水難溶性の結晶性または非結晶性材料の懸濁液を使用することにより実現され得る。そこでは、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、ひいては結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油媒体に溶解または懸濁させることによって行われる。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製される。薬物に対するポリマーの比および使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物の放出速度は、制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、薬物を体組織に適合できるリポソームまたはマイクロエマルションに封入することによって調製される。
経直腸および経膣投与
経直腸または経膣投与用の組成物は、典型的には、組成物を、周囲温度で固体であるが体温では液体であり、したがって直腸または膣腔内で溶融して活性成分を放出するココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスなどの適切な非刺激性賦形剤と混合することによって調製可能な坐剤である。
経口投与
経口投与用の固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤を含む。かかる
固体剤形では、活性成分は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容可能な賦形剤、例えばクエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムおよび／またはフィラーもしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシア）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、四級アンモニウム化合物）、浸潤剤（例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）、および滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、ならびにそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は緩衝剤を含んでもよい。
局所または経皮投与
本明細書に記載の、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含有する組成物は、局所投与のために調合してもよい。皮膚は、容易に接近可能であることから、送達における理想的な標的部位であり得る。遺伝子発現は、皮膚（潜在的には非特異的毒性を回避する）だけでなく、皮膚内部の特定の層および細胞型に制限され得る。
送達された組成物の皮膚の発現部位は、核酸送達の経路に依存することになる。３つの経路、すなわち、（ｉ）局所適用（例えば、局所／領域の治療および／または美容用途に）；（ｉｉ）皮内注射（例えば、局所／領域の治療および／または美容用途に）；ならびに（ｉｉｉ）全身性送達（例えば、皮膚および真皮外領域の双方を冒す皮膚疾患の治療に）が、一般的に、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを皮膚に送達すると考えられる。ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、当該技術分野で既知のいくつかの異なる手法により、皮膚に送達することができる。大部分の局所送達手法は、限定はされないが、非カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体、粒子媒介性（遺伝子銃）、穿刺を介した遺伝子導入、およびウイルス送達手法の局所適用などのＤＮＡの送達において機能することが示されている。核酸の送達後、遺伝子産物は、限定はされないが、基底ケラチノサイト、皮脂腺細胞、皮膚線維芽細胞および真皮マクロファージを含む、多数の異なる皮膚細胞型において検出されている。
一実施形態では、本発明は、本発明の方法を便宜的および／または効果的に実施するための種々のドレッシング材（例えば、創傷被覆材）または包帯（例えば、弾力包帯）を提供する。典型的にはドレッシング材または包帯は、本明細書に記載の医薬組成物および／あるいはポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを、ユーザが対象に対して複数の治療を行うことを可能にする程度の十分な量、含んでもよい。
一実施形態では、本発明は、２回以上の注射で送達されるべき、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの組成物を提供する。
一実施形態では、局所および／または経皮投与の前、組織の少なくとも１つの領域、例えば皮膚には、透過性を亢進し得るデバイスおよび／または溶液を施してもよい。一実施形態では、組織には、皮膚の透過性を亢進するため、研磨デバイス（ａｂｒａｓｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）を施してもよい（米国特許出願公開第２００８０２７５４６８号明細書を参照、その全体が参照により本明細書に援用される）。別の実施形態では、組織には、超音波増強装置（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｄｅｖｉｃｅ）を施してもよい。超音波増強装置は、限定はされないが、米国特許出願公開第２００４０２３６２６８号明細書および米国特許第６，４９１，６５７号明細書および米国特許第６，２３４，９９０号明細書（これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載のデバイスを含んでもよい。組織の透過性を亢進させる方法は、米国特許出願公開第
２００４０１７１９８０号明細書および米国特許出願公開第２００４０２３６２６８号明細書および米国特許第６，１９０，３１５号明細書（これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの製剤を送達する前、あるデバイスを使用し、組織の透過性を亢進させてもよい。皮膚の透過性は、当該技術分野で既知の、および／または米国特許第６，１９０，３１５号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により、測定してもよい。非限定例として、修飾ｍＲＮＡ製剤は、米国特許第６，１９０，３１５号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の薬物送達方法により、送達してもよい。
別の非限定例では、組織は、組織に透過性を亢進し得るデバイスを施し得る前、間および／または後に、局所麻酔薬（エムラ（ＥＭＬＡ））クリームの共融混合物で処置してもよい。カッツ（Ｋａｔｚ）ら著（アネスシージア・アンド・アナルジージア（Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ）（２００４年）；第９８巻、ｐ．３７１−７６；その全体が参照により本明細書に援用される）は、低エネルギーと組み合わせたエムラ（ＥＭＬＡ）クリームを用いると、表在性皮膚の痛覚消失（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｎａｌｇｅｓｉａ）の発症が低エネルギー超音波による前処置からわずか５分程度で認められることを示した。
一実施形態では、促進剤は、組織が透過性を亢進するように治療される前、間、および／または後に、組織に適用してもよい。促進剤は、限定はされないが、輸送促進剤、物理的促進剤（ｐｈｙｓｉｃａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）、およびキャビテーション促進剤（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）を含む。促進剤の非限定例が、米国特許第６，１９０，３１５号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一実施形態では、免疫応答を誘発する物質をさらに含有し得る、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡの製剤を送達する前に、あるデバイスを使用して、組織の透過性を亢進させてもよい。別の非限定例では、免疫応答を誘発する物質を含有する製剤は、米国特許出願公開第２００４０１７１９８０号明細書および米国特許出願公開第２００４０２３６２６８号明細書（これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により、送達してもよい。
組成物の局所および／または経皮投与のための剤形は、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、溶液、噴霧剤、吸入剤および／またはパッチを含んでもよい。一般に、活性成分は、滅菌条件下で、要求され得る薬学的に許容可能な賦形剤および／または任意の必要とされる防腐剤および／もしくは緩衝剤と混合される。
さらに、本発明では、化合物の身体への制御された送達を提供するというさらなる利点を有することが多い、経皮吸収型貼付剤の使用が検討される。かかる剤形は、例えば、化合物を適切な培地に溶解し、および／または懸濁することにより、調製することができる。代わりにまたは加えて、速度は、１つには速度制御膜を提供することにより、ならびに／あるいは化合物をポリマーマトリックスおよび／またはゲルに分散させることにより、制御することができる。
局所投与に適した製剤は、限定はされないが、液体および／または半液体製剤、例えば、塗布剤、ローション剤、水中油および／もしくは油中水型乳剤、例えば、クリーム剤、軟膏剤および／もしくはペースト剤、および／または溶液および／または懸濁剤、を含む。局所的に投与可能な製剤は、例えば約０．１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含ん
でもよいが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解度制限と同程度に高い可能性がある。局所投与のための製剤は、本明細書に記載の追加的成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
デポー投与
本明細書に記載のように、一部の実施形態では、組成物は、持続放出のためのデポー中に調合される。一般に、特定の器官または組織（「標的組織」）は、投与の標的にされる。
本発明の一部の態様では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、標的組織の内部または近位に空間的に保持される。提供されるのは、組成物、特に組成物の１つ以上の核酸成分が標的組織内で実質的に保持される（組成物の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または９９．９９％より多くが標的組織内で保持されることを意味する）ような条件下で、（１つ以上の標的細胞を有する）標的組織を組成物に接触させることにより、組成物を哺乳類対象の標的組織に提供する方法である。有利なことに、保持は、１つ以上の標的細胞に侵入する組成物中に存在する核酸の量を測定することにより、判定される。例えば、対象に投与される核酸の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または９９．９９％より多くは、投与後のある時点で細胞内に存在する。例えば、哺乳類対象への筋肉内注射は、リボ核酸およびトランスフェクション試薬を含有する水性組成物を用いて実施され、組成物の保持は、筋肉細胞内に存在するリボ核酸の量を測定することによって判定される。
本発明の態様は、組成物を、哺乳類対象の標的組織に、組成物が標的組織内で実質的に保持されるような条件下で（１つ以上の標的細胞を有する）標的組織を組成物と接触させることにより、提供する方法を対象とする。組成物は、目的のポリペプチドが少なくとも１つの標的細胞内で生成されるような、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの有効量を含有する。組成物は、一般に、細胞透過剤（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）を含有するが、「ネイキッド」核酸（細胞透過剤または他の作用物質を伴わない核酸など）や、薬学的に許容可能な担体もまた、検討される。
一部の環境では、組織内の細胞によって生成されるタンパク質の量は、望ましくは増加する。好ましくは、タンパク質生成におけるこの増加は、標的組織内の細胞に、空間的に限定される。したがって、提供されるのは、哺乳類対象の組織内での目的のタンパク質の生成を増加させる方法である。組成物の単位量が、所定量の標的組織内に含まれるかなりの百分率の細胞内で目的のポリペプチドを生成することが判定されていることを特徴とする、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含有する組成物が、提供される。
一部の実施形態では、組成物は、複数の異なるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの１つまたは２つ以上が目的のポリペプチドをコードする場合に含む。任意選択的には、組成物はまた、組成物の細胞内送達を補助するための細胞透過剤を含有する。判定は、所定の量の標的組織内に含有される実質的百分率の細胞内で、目的のポリペプチドを生成するのに必要とされる組成物の用量からなされる（一般に、標的組織に隣接する組織内または標的組織に対して遠位の組織内で、所定量の目的のポリペプチドの有意な生成を誘発することはない）。この判定後、判定された用量は、哺乳類対象の組織内に直接的に導入される。
一実施形態では、本発明は、２回以上の注射においてまたは分割用量（ｓｐｌｉｔ ｄ
ｏｓｅ）注射によって送達されるべきポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを提供する。
一実施形態では、本発明は、小型の使い捨て薬剤リザーバーまたはパッチポンプを用いて標的組織近傍で保持してもよい。パッチポンプの非限定例として、作製されたもの、および／またはビーディ（ＢＤ）（登録商標）（フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）、インスレット・コーポレーション（Ｉｎｓｕｌｅｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ベッドフォード、マサチューセッツ州）、ステディメド・セラピューティクス（ＳｔｅａｄｙＭｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（サンフランシスコ、カリフォルニア州）、メドトロニック（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）（ミネアポリス、ミネソタ州）、ユニライフ（ＵｎｉＬｉｆｅ）（ヨーク、ペンシルベニア州）、ヴァレリタス（Ｖａｌｅｒｉｔａｓ）（ブリッジウォーター、ニュージャージー州）、およびスプリングリーフ・セラピューティクス（ＳｐｒｉｎｇＬｅａｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（ボストン、マサチューセッツ州）によって販売されたものが挙げられる。
経肺投与
医薬組成物は、頬側口腔を介する経肺投与に適した製剤として、調製、包装、および／または販売してもよい。かかる製剤は、活性成分を含みかつ約０．５ｎｍ〜約７ｎｍまたは約１ｎｍ〜約６ｎｍの範囲内の直径を有する乾燥粒子を含んでもよい。かかる組成物は、好適には、噴霧剤の流れが散剤を分散させることに特化し得る乾燥粉末貯蔵器を含むデバイスを使用して、かつ／あるいは、密封容器中の低沸点の噴霧剤に溶解した活性成分および／または懸濁した活性成分を含むデバイスなどの自己推進性の溶媒／散剤分注容器を使用して投与することを意図して乾燥粉末の形態である。かかる散剤は粒子を含み、重量で少なくとも９８％の粒子が０．５ｎｍを超える直径を有し、かつ数で少なくとも９５％の粒子が７ｎｍ未満の直径を有する。あるいは、重量で少なくとも９５％の粒子が、１ｎｍを超える直径を有し、かつ数で少なくとも９０％の粒子が６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖などの固体の微細な粉末希釈剤を含んでよく、便宜的に単位用量の形態で提供される。
低沸点の噴霧剤は、一般に、気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴霧剤を含む。一般に、噴霧剤は、組成物の５０％〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成してもよく、活性成分は、組成物の０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）を構成してもよい。噴霧剤は、液体の非イオン性界面活性剤および／または固体のアニオン性界面活性剤および／または固体の希釈剤（活性成分を含む粒子と同程度の粒径を有してよい）などの追加的な成分をさらに含んでもよい。
経肺送達するために調合した医薬組成物は、溶液および／または懸濁剤の液滴の形態で活性成分をもたらし得る。かかる製剤は、任意選択的に滅菌された、活性成分を含む水溶液および／または希アルコール溶液および／または懸濁液として、調製、包装、および／または販売してもよく、任意の噴霧および／または微粒化デバイスを使用して、便意的に投与してもよい。かかる製剤は、限定はされないが、サッカリンナトリウムなどの調味料、揮発油、緩衝剤、表面活性剤、および／またはオキシ安息香酸メチル（ｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ）などの防腐剤を含む、１つ以上の追加的な成分をさらに含んでもよい。この投与経路によって提供される液滴は、約０．１〜約２００ｎｍの範囲内の平均直径を有してもよい。
鼻腔内、経鼻および頬側投与
経肺送達にとって有用である本明細書に記載の製剤は、医薬組成物を鼻腔内送達するために有用である。鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分を含み、かつ約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗い散剤である。かかる製剤は、嗅剤が摂取されるように
、すなわち鼻孔近くに保持された散剤の容器からの鼻道を介した急速な吸入により、投与される。
経鼻投与に適した製剤は、例えば少なくとも約０．１％（ｗ／ｗ）から多くとも１００％（ｗ／ｗ）までの活性成分を含んでよく、また、本明細書に記載の追加的な成分の１つ以上を含んでもよい。医薬組成物は、頬側投与に適した製剤として、調製、包装、および／または販売してもよい。かかる製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製された錠剤および／またはロゼンジの形態であってもよく、例えば０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）の活性成分であり、残部は、経口的に溶解可能なかつ／または分解可能な組成物であり、また任意選択的には、本明細書に記載の追加的な成分のうちの１つ以上であってもよい。あるいは、頬側投与に適した製剤は、活性成分を含む、粉末および／またはエアロゾル化溶液および／もしくは微粒化溶液および／または懸濁剤を含んでもよい。かかる粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散させた場合、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲内の平均粒子および／または液滴サイズを有してよく、また、本明細書に記載の任意の追加的な成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
点眼投与
医薬組成物は、点眼投与に適した製剤として、調製、包装、および／または販売してもよい。かかる製剤は、例えば、水性または油性の液体賦形剤中、０．１／１．０％（ｗ／ｗ）の活性成分の溶液および／または懸濁剤を含む、点眼剤の形態であってもよい。かかる滴剤は、緩衝剤、塩、および／または１つ以上の他の本明細書に記載の任意の追加的な成分をさらに含んでもよい。有用な他の点眼的に投与可能な製剤としては、微結晶性の形態でおよび／またはリポソーム調製物中に、活性成分を含むものが挙げられる。点耳剤および／または点眼剤は、本発明の範囲内に含まれるものと考えられる。
ペイロード投与：検出可能な作用物質および治療薬
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、物質（「ペイロード」）の生物学的標的への送達、例えば標的の検出のための検出可能な物質の送達、または治療薬の送達が所望される場合のいくつかの異なるシナリオにおいて使用してもよい。検出方法は、ラボアッセイ、またはタギング／染色／イメージングが必要とされる任意の状況で、限定はされないが、インビトロおよびインビボ双方のイメージング法によるイメージング、例えば、免疫組織化学、生物発光イメージング（ＢＬＩ：ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ：Ｍａｇｎｅｔｉｃ
Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ）、陽電子放出形コンピュータ断層撮影（ＰＥＴｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、電子顕微鏡、Ｘ線コンピュータ断層撮影、ラマンイメージング、光干渉断層撮影、吸収イメージング、赤外線画像、蛍光反射イメージング、蛍光顕微鏡、蛍光分子断層イメージング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ）、核磁気共鳴イメージング、Ｘ線イメージング、超音波イメージング、光音響イメージング、を含んでもよい。
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、任意の有用な配向性においてリンカーおよびペイロードの双方を含むように設計してもよい。例えば、２つの末端を有するリンカーは、一方の末端をペイロードにかつもう一方の末端を核酸塩基に、例えばデアザ−アデノシンもしくはデアザ−グアノシンのＣ−７もしくはＣ−８位で、またはシトシンもしくはウラシルのＮ−３もしくはＣ−５位に付着されるように使用される。本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上のペイロード（例えば、標識および転写阻害剤）、および切断可能なリンカーを含んでもよい。一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸であり、この場合、切断可能なリンカーの一方の末端は７−デアザ−アデニンのＣ７位に付着され、リンカーのもう一方の末端は阻害剤に（例えば、シチ
ジン上の核酸塩基のＣ５位に）付着され、また標識（例えば、Ｃｙ５）はリンカーの中央に付着される（例えば、米国特許第７，９９４，３０４号明細書の図５ならびにカラム９および１０の中のＡ＊ｐＣｐ Ｃ５ Ｐａｒｇ Ｃａｐｌｅｓｓの化合物１を参照、参照により本明細書中に援用される）。修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸のコード領域への組み入れ時、得られるポリヌクレオチドは、標識および阻害剤（例えば、ポリメラーゼ阻害剤）に付着された切断可能なリンカーを有することになる。（例えば、切断可能なジスルフィド部分を有するリンカーを還元するための還元的条件下での）リンカーの切断時、標識および阻害剤は放出される。追加的なリンカーおよびペイロード（例えば、治療薬、検出可能な標識、および細胞透過性ペイロード）は、本明細書に記載されている。
例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、クラスター中の全細胞に対して、遺伝子導入された細胞を直接的に追跡可能な人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）において使用することができる。別の例では、リンカーを介してポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡに付着させかつ蛍光標識することが可能な薬物は、薬物をインビボで、例えば細胞内部で追跡するため、使用することができる。他の例として、限定はされないが、細胞への可逆的な薬物送達におけるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの使用が挙げられる。
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ペイロード、例えば検出可能な作用物質または治療薬の特定のオルガネラに対する細胞内標的化において使用することできる。例示的な細胞内標的は、限定はされないが、高度なｍＲＮＡプロセシングにおける核局在化、または阻害剤を有するｍＲＮＡに連結された核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、を含んでもよい。
さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、治療薬を、例えば生存動物における細胞または組織に送達するため、使用することできる。例えば、リンカーを介して治療薬に付着されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、治療薬が細胞内へ移動し、細胞内標的に到達することを可能にする、メンバーの浸透を促進することができる。
一部の実施形態では、ペイロードは、治療薬、例えば細胞毒、放射性イオン、化学療法薬、または他の治療薬であってもよい。細胞毒または細胞毒性薬は、細胞に対して有害であり得る任意の作用物質を含む。例として、限定はされないが、タクソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｉｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール（米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照、その全体が本明細書に援用される）、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５、米国特許第５，４７５，０９２号明細書、米国特許第５，５８５，４９９号明細書、および米国特許第５，８４６，５４５号明細書を参照、これらのすべては参照により本明細書中に援用される）、およびそれらの類似体または相同体、が挙げられる。放射性イオンは、限定はされないが、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、亜リン酸、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、およびプラセオジムを含む。他の治療薬は、限定はされないが、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル
、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タクソールおよびマイタンシノイド）、を含む。
一部の実施形態では、ペイロードは、検出可能な作用物質、例えば様々な有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素または酵素基質、蛍光材料、発光材料（例えば、ルミノール）、生物発光材料（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン）、化学発光材料、放射性材料（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、または９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸（テクネチウム酸（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４ −）として））、および造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、および極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ））、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨウ素化造影剤（イオヘキソール）、微小気泡、またはパーフルオロカーボン）、であってもよい。かかる光学的に検出可能な標識は、例えば限定はされないが、４−アセトアミド−４’−イソチオシアン酸スチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体（例えば、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート）；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）；ブリリアントイエロー（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ）；クマリンおよび誘導体（例えば、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、および７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１））；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール（ｄｉｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）−スルホナフタレイン（ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ））；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン６酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアン酸スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］−ナフタレン−１−スルホニル塩化物（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体（例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート）；エリトロシンおよび誘導体（例えば、エリトロシンＢおよびエリトロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体（例えば、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、Ｘ−ローダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣまたはＸＲＩＴＣ）、およびフルオレサミン）；２−［２−［３−［［１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル）−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ｂｅｎｚ［ｅ］ｉｎｄｏｌ）−２−イリデン］エチリデン］−２−［４−（エトキシカルボニル）−１−ピペラジニル］−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル（ｅｔｈｅｎｙｌ）］−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウムヒドロキシド（ｂｅｎｚ［ｅ］ｉｎｄｏｌｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、分子内塩、ｎ，ｎ−ジエチルエタンアミンとの化合物（１：１）（ＩＲ１４４
）；５−クロロ−２−［２−［３−［（５−クロロ−３−エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾール−イリデン）エチリデン］−２−（ジフェニルアミノ）−１−シクロペンテン（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｅｎ）−１−イル］エテニル］−３−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩（ＩＲ１４０）；マラカイトグリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルソクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド（Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ）；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体（例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンミニジル１−ピレン）；ブチレート定量ドット（ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）；リアクティブレッド（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ）４（シバクロン（ＣＩＢＡＣＲＯＮ）（商標）ブリリアントレッド（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ）３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体（例えば、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リスアミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ））、Ν，Ν，Ν’，Ν’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ））；リボフラビン；ロソリック酸（ｒｏｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ）；テルビウムキレート誘導体；シアニン−３（Ｃｙ３）；シアニン−５（Ｃｙ５）；シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン−７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；アレクサ（Ａｌｅｘａ）６４７；ラホーヤブルー（Ｌａ Ｊｏｌｔａ Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニン、を含む。
一部の実施形態では、検出可能な作用物質は、活性化時に検出可能になる検出不能な前駆物質であってもよい（例えば、蛍光発生テトラジン−フルオロフォア作成物（例えば、テトラジン−ボディピーＦＬ（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）、テトラジン−オレゴングリーン４８８（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８）、またはテトラジン−ボディピーＴＭＲ−Ｘ（ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ））または酵素活性化可能な蛍光発生剤（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ）（例えば、プロセンス（ＰＲＯＳＥＮＳＥ）（登録商標）ＶｉｓＥｎメディカル（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ）））。酵素標識された組成物を使用可能なインビトロアッセイは、限定はされないが、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光検査、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、およびウエスタンブロット解析を含む。
組み合わせ
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の他の治療薬、予防薬、診断薬、またはイメージング剤と併用してもよい。「〜を組み合わせた」は、これらの送達方法が本開示の範囲内に含まれるとはいえ、作用物質が、同時に投与される、かつ／または共送達用に調合される必要があることを意味することは意図されていない。組成物は、１つ以上の他の所望される治療薬または医療処置と同時にか、それらの前か、またはそれらの後に投与してもよい。一般に、各作用物質は、その作用物質用に決定された用量および／または工程で投与されることになる。一部の実施形態では、本開示は、バイオアベイラビリティを改善し、代謝を低下させ、かつ／または変更し、排出を阻害し、ならびに／あるいは体内での分布を変更し得る作用物質を組み合わせた、医薬、予防、診断、またはイメージング組成物の送達を包含する。非限定例として、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、がんを治療するため、または過剰増殖性細胞（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ）を制御するための医薬品と併用してもよい。米国特許第７，９６４，５７１号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）では、リポポリマーとともにインターロイキン１２をコードするＤＮＡプラスミドを含む医薬組成物を使用するとともに、少なくとも１つの抗がん剤または化学療法薬を投与す
る、固形の一次または転移腫瘍を治療するための併用療法について記載がある。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学療法薬または抗がん剤とともに投与可能な、リポポリマーを有する医薬組成物中に含めてもよい（例えば、抗増殖性分子およびリポポリマーをコードするＤＮＡプラスミドを含む医薬組成物を主張する、米国特許出願公開第２０１１０２１８２３１号明細書を参照、その全体が参照により本明細書に援用される）。
投薬
本発明は、本発明に従うポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡおよびそのコードされるタンパク質または複合体を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。核酸、タンパク質または複合体、あるいはその医薬、イメージング、診断、または予防組成物は、疾患、障害、および／または状態（例えば、ワーキングメモリ欠乏に関連する疾患、障害、および／または状態）に対する予防、治療、診断、またはイメージングに有効な任意の量およに任意の投与経路を用いて、対象に投与してもよい。必要とされる正確な量は、種、年齢、および対象の全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性機序などに応じて、対象間で変動することになる。本発明に従う組成物は、投与の容易性および用量の均一性を意図して、典型的には用量単位形態で調合される。しかし、本発明の組成物の日々の全使用量が、主治医により、正しい医学的判断の範囲内で決定可能であることは理解されるだろう。任意の特定の患者における特定の治療的に有効な、予防的に有効な、または適切なイメージング用量レベルは、治療されている障害および障害の重症度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般健康、性別および食事；使用される特定の化合物の投与時間、投与経路、および排出速度；治療期間；使用される特定の化合物と併用されるまたは同時使用される薬剤；ならびに医療技術において周知の要素など、を含む種々の要素に依存することになる。
特定の実施形態では、本発明に従う組成物は、１日に１回以上、１日当たり、対象体重に対して、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの、送達に十分な用量レベルで投与することで、所望される治療、診断、予防、またはイメージングの効果を得ることができる。所望される用量は、１日に３回、１日に２回、１日に１回、１日おき、３日ごと、毎週、２週ごと、３週ごと、または４週ごとに送達してもよい。特定の実施形態では、所望される用量は、複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはより多数回の投与）を用いて送達してもよい。
本発明によると、分割用量レジメンでのｍｍＲＮＡの投与により、哺乳類対象において、より高レベルのタンパク質が生成されることが発見されている。本明細書で使用される「分割用量」は、単回単位用量または全一日用量の２回以上の用量へ、例えば単回単位用量の２回以上の投与への分割である。本明細書で使用される「単回単位用量」は、１回用量で／同時に／単一経路で／単一の接触点で、すなわち単一の投与事象で投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｄ）任意の治療薬の用量である。本明細書で使用される「全一日用量」は、２４時間以内に投与または処方される量である。全一日用量は、単回単位用量として投与してもよい。一実施形態では、本発明のｍｍＲＮＡは、分割用量で対象に投与される。ｍｍＲＮＡは、単独の緩衝液中または本明細書に記載の製剤中で調合してもよい。
剤形
本明細書に記載の医薬組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下）などの本明細書に記載の剤形に調合してもよい。
液体剤形
非経口投与用の液体剤形としては、限定はされないが、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルション、溶液、懸濁剤、シロップ剤、および／またはエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば限定はされないが、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（詳細には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含んでもよい。非経口投与のための特定の実施形態では、組成物は、可溶化剤、例えば、クレモフォア（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはそれらの組み合わせと混合してもよい。
注射剤
注射用製剤、例えば、滅菌された注射可能な水性または油性の懸濁剤は、既知の技術に従って調合してもよく、適切な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤を含んでもよい。滅菌注射用調合剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤および／または溶媒中の滅菌された注射可能な溶液、懸濁剤、および／または乳剤、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液、であってもよい。使用可能な許容可能な媒体および溶媒の中には、限定はされないが、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張食塩水が含まれる。滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として慣習的に使用される。この目的のために、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油は、使用することができる。オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製において使用してもよい。
注射用製剤は、使用前に、例えば、細菌保持フィルタを通して濾過することにより、および／または、滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散可能な滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより、滅菌することができる。
活性成分の効果を延長させるため、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延させることが望ましい場合がある。これは、水難溶性の結晶性または非結晶性材料の液体懸濁液を使用することにより実現され得る。そこでは、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの吸収速度は、その溶解速度に依存し、ひいては結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口投与されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの遅延吸収は、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを油媒体に溶解または懸濁させることによって実現され得る。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中にポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製される。ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡに対するポリマーの比および使用される特定のポリマーの性質に応じて、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの放出速度は、制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、限定はされないが、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを、体組織に適合できるリポソームまたはマイクロエマルションに封入することによって調製してもよい。
経肺
経肺送達にとって有用である本明細書に記載の製剤はまた、医薬組成物の鼻腔内送達にとって有用であり（ｕｓｅ）得る。鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分を含み、かつ約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗い散剤であってもよい。かかる製剤は、嗅剤が摂取されるように、すなわち鼻の近くに保持された散剤の容器からの鼻道を介した急速な吸入により、投与してもよい。
経鼻投与に適した製剤は、例えば最低で約０．１％（ｗ／ｗ）から最高で１００％（ｗ／ｗ）までの活性成分を含んでよく、また、本明細書に記載の追加的な成分の１つ以上を含んでもよい。医薬組成物は、頬側投与に適した製剤として、調製、包装、および／または販売してもよい。かかる製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製された錠剤および／またはロゼンジの形態であってもよく、また例えば、０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含有してもよく、残部は、経口的に溶解可能なかつ／または分解可能な組成物、また任意選択的には、本明細書に記載の追加的な成分のうちの１つ以上を含有してもよい。あるいは、頬側投与に適した製剤は、活性成分を含む、粉末および／またはエアロゾル化溶液および／もしくは微粒化溶液および／または懸濁剤を含んでもよい。かかる粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散させた場合、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲内の平均粒子および／または液滴サイズを有してよく、また、本明細書に記載の任意の追加的な成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
医薬品の製剤および／または作製における一般的検討事項は、例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、リッピンコット、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（参照により本明細書中に援用される）において見出され得る。
コーティング剤またはシェル剤
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶性のコーティング剤および製剤の技術分野で周知の他のコーティングなどのコーティング剤およびシェルを用いて調製することができる。それらは、任意選択的に乳白剤を含んでもよく、（１つ以上の）活性成分が、腸管の特定の一部分にのみかまたは優先的に、任意選択的には遅延する方法で放出される組成物であってもよい。使用可能な包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同種の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤ならびに高分子量のポリエチレングリコールなどを使用する、ソフト充填ゼラチンカプセル剤およびハード充填ゼラチンカプセル剤中のフィラーとして使用することができる。
医薬組成物の特性
本明細書に記載の医薬組成物は、バイオアベイラビリティ、治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）および／または分布容積のうちの１つ以上によって特徴づけることができる。
バイオアベイラビリティ
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤を有する組成物に調合される場合、本明細書に記載の送達剤が欠如した組成物に対して、バイオアベイラビリティの上昇を示し得る。本明細書で使用される用語「バイオアベイラビリティ」は、哺乳動物に投与された所定量のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの全身利用率を示す。バイオアベイラビリティは、哺乳動物への化合物の投与後の、不変の化合物形態の曲線下面積（ＡＵＣ）、または最大血清もしくは血漿濃度（Ｃｍａｘ）を測
定することによって評価することができる。ＡＵＣは、縦座標（Ｙ軸）沿いに化合物の血清もしくは血漿濃度、それに対して横座標（Ｘ軸）沿いに時間をプロットして、曲線下面積を判定したものである。一般に、特定の化合物に対するＡＵＣは、当業者に既知の方法を用いて、また、Ｇ．Ｓ．バンカー（Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ），「現代の薬剤学、薬物および薬学（Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，第７２巻，マルセル・デッカー・ニューヨーク社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．），１９９６年（参照により本明細書に援用される）に記載のようにして、計算することができる。
Ｃｍａｘ値は、化合物の哺乳動物への投与後に、哺乳動物の血清または血漿中で得られる化合物の最大濃度である。特定の化合物のＣｍａｘ値は、当業者に既知の方法を用いて測定することができる。本明細書で使用される語句「上昇する生物学的利用率」または「薬物動態を改善する」は、哺乳動物における第１のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの全身利用率（ＡＵＣ、Ｃｍａｘ、またはＣｍｉｎとして測定される）が、本明細書に記載の送達剤と同時投与される場合、かかる同時投与がなされない場合より大きいことを意味する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのバイオアベイラビリティは、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％、上昇し得る。
治療域
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤を有する組成物に調合される場合、本明細書に記載の送達剤が欠如した投与されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ組成物の治療域に対して、投与されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ組成物の治療域の上昇を示し得る。本明細書で使用される「治療域」は、治療効果を誘発する確率が高い、血漿濃度の範囲、または作用部位での治療活性物質の濃度の範囲を示す。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの、本明細書に記載の送達剤と同時投与される場合の治療域は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％、上昇し得る。
分布容積
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤を有する組成物に調合される場合、本明細書に記載の送達剤が欠如した組成物に対して、分布容積（Ｖｄｉｓｔ）の改善、例えば低下または標的化を示し得る。分布容積（Ｖｄｉｓｔ）は、血液または血漿中の薬物濃度に対する体内の薬物量に関する。本明細書で使用される用語「分布容積」は、血液または血漿中の場合と同一の濃度で、体内の薬物の総量を含有することが必要になる流体容積を示す、すなわち、Ｖｄｉｓｔは、体内の薬物量／血液または血漿中の薬物濃度に相当する。例えば、１０ｍｇ用量でかつ１０ｍｇ／Ｌの血漿濃度であれば、分布容積は、１リットルになる。分布容積は、薬物が血管外組織内に存在する範囲を示す。大きい分布容積は、化合物が組織成分に結合する、血漿タンパク質の結合と比較した場合の傾向を示す。臨床の場では、Ｖｄｉｓｔを用いて負荷用量を決定し、定常状
態の濃度を得ることができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの分布容積は、本明細書に記載の送達剤と同時投与される場合、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、低下し得る。
生物学的効果
一実施形態では、動物に送達される修飾ｍＲＮＡの生物学的効果は、動物におけるタンパク質の発現を分析することにより、分類することができる。再プログラム化されたタンパク質の発現は、本発明の修飾ｍＲＮＡを投与した哺乳動物から採取された生物学的試料を分析することから判定することができる。一実施形態では、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌの、哺乳動物に投与された修飾ｍＲＮＡによってコードされる発現タンパク質が好ましい場合がある。例えば、哺乳動物に送達された修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質における５０〜２００ｐｇ／ｍｌのタンパク質の発現は、哺乳動物における治療有効量のタンパク質として認めてもよい。
質量分析による修飾核酸の検出
質量分析（ＭＳ：ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）は、分子に関する、そのイオンへの変換後の構造的情報および分子質量／濃度の情報を提供し得る分析技術である。分子は、まずイオン化されることで正または負の電荷が得られ、次いで分子は、質量分析計を通って移動し、その質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って検出器の様々な領域に到達する。
質量分析は、さらなる分析のため、分画された試料をイオン化し、荷電分子を発生させるイオン供給源を含む質量分析計を用いて実施される。例えば、試料のイオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ：ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、光イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃（ＦＡＢ：ｆａｓｔ ａｔｏｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）／液体二次イオン化（ＬＳＩＭＳ：ｌｉｑｕｉｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ：ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、フィールドイオン化、電界脱離、熱スプレー／プラズマスプレーイオン化、および粒子ビームイオン化によって実施してもよい。当業者は、イオン化法の選択が測定されるべき分析物、試料のタイプ、検出器のタイプ、正対負モードの選択などに基づいて判定可能であることを理解するであろう。
試料がイオン化された後、それによって生成された正荷電または負荷電イオンを分析し、質量対電荷比（すなわち、ｍ／ｚ）を決定することができる。質量対電荷比を決定するための好適な分析計は、四重極型（ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ）分析計、イオントラップ型（ｉｏｎ ｔｒａｐｓ）分析計、および飛行時間型分析計を含む。イオンは、いくつかの検出モードを用いて検出することができる。例えば、選択されたイオンは、検出することができ（すなわち、選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｍｏｄｅ）を用いて）、または代わりに、イオンは、走査モード、例えば多重反応モニタリング（ＭＲＭ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ：ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を用いて検出することができる。
安定同位体で標識された希釈ペプチド標準と共役される液体クロマトグラフィー−多重反応モニタリング（ＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭ）は、タンパク質を検証するための有効な方法であることが示されている（例えば、ケシシアン（Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎ）ら著、モレキュ
ラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、２００９年、第８巻、ｐ．２３３９−２３４９；カーン（Ｋｕｈｎ）ら著、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ）、２００９年、第５５巻、ｐ．１１０８−１１１７；ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら著、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ）、２０１０年、第５６巻、ｐ．２８１−２９０）。バイオマーカー発見試験において使用されることが多い非標的質量分析と異なり、標的ＭＳ法は、複雑な混合物中の選択された数１０〜数１００のペプチドに対する機器の完全な分析能力に注目した、ＭＳのペプチド配列に基づくモードである。目的のタンパク質由来のペプチドに限って検出および断片化を制限することにより、感受性および再現性が、発見モードのＭＳ法に対して劇的に改善される。タンパク質のこの質量分析に基づく多重反応モニタリング（ＭＲＭ）定量方法は、臨床試料の迅速な標的化された多重のタンパク質発現プロファイリングを介した、バイオマーカーの発見および定量に多大な影響を与え得る。
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡによってコードされる少なくとも１つのタンパク質を含有し得る生物学的試料は、ＭＲＭ−ＭＳの方法によって分析してもよい。生物学的試料の定量はさらに、限定はされないが、内部標準として、同位体標識したペプチドまたはタンパク質を含んでもよい。
本発明によると、生物学的試料は、一旦対象から得られると、酵素消化を施してもよい。本明細書で使用される用語「消化する」は、より短いペプチドに分解することを意味する。本明細書で使用される語句「試料を処理してタンパク質を消化する」は、試料中のタンパク質を分解するような方法で試料を操作すること意味する。これらの酵素は、限定はされないが、トリプシン、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃおよびキモトリプシンを含む。一実施形態では、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡによってコードされる少なくとも１つのタンパク質を含有し得る生物学的試料は、酵素を用いて消化してもよい。
一実施形態では、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生物学的試料は、タンパク質について、エレクトロスプレーイオン化を用いて分析してもよい。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析（ＥＳＩＭＳ）では、質量分析による分析前の、イオンの溶液から気相への移行に役立つ電気エネルギーが用いられる。試料は、当該技術分野で既知の方法（例えば、ホー（Ｈｏ）ら、クリニカル・バイオケミストリー・レビュー（Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｒｅｖ．）、２００３年、第２４巻、第１号、ｐ．３−１２）を用いて分析してもよい。溶液中に含有されるイオン種は、帯電液滴の微細な噴霧剤を分散させ、溶媒を蒸発させ、またイオンを帯電液滴から駆出させ、霧状の高帯電液滴を生成することにより、気相に移行され得る。霧状の高帯電液滴は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの質量分析計、例えば限定はされないが、四重極型（ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ）質量分析計を用いて分析してもよい。さらに、質量分析方法は、精製ステップを含んでもよい。非限定例として、最初の四重極型は、単一のｍ／ｚ比を選択するように設定してもよく、それにより、異なるｍ／ｚ比を有する他の分子イオンを濾過して除去することができ、ＭＳ分析の前に複雑で時間のかかる試料精製手順を排除することができる。
一実施形態では、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生物学的試料は、タンパク質について、タンデム型ＥＳＩＭＳシステム（例えば、ＭＳ／ＭＳ）において分析してもよい。非限定例として、液滴は、プロダクトスキャン（または娘スキャン）、前駆体スキャン（親スキャン）、ニュートラルロスまたは多重反応モニタリングを用いて分析してもよい。
一実施形態では、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生物学的試料は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析（Ｍ
ＡＬＤＩＭＳ）を用いて分析してもよい。ＭＡＬＤＩは、大分子および小分子の双方、例えばタンパク質の非破壊性気化およびイオン化を提供する。ＭＡＬＤＩ分析においては、分析物は、まず、限定はされないが、紫外線吸収性弱有機酸も含み得る、高モルの過剰なマトリックス化合物と共結晶化される。ＭＡＬＤＩにおいて使用されるマトリックスの非限定例として、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸および２，５−ジヒドロキシ安息香酸が挙げられる。分析物−マトリックス混合物のレーザー放射により、マトリックスおよび分析物の気化が生じ得る。レーザー誘導性脱離は、無傷分析物の高いイオン収量をもたらし、高精度での化合物の測定を可能にする。試料は、当該技術分野で既知の方法を用いて分析してもよい（例えば、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）、ウェイ（Ｗｅｉ）およびシウズダク（Ｓｉｕｚｄａｋ）、「分析化学の百科事典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２０００年、ｐ．５８８０−５８９４）。非限定例として、ＭＡＬＤＩ分析において用いられる質量分析計は、線形飛行時間型（ＴＯＦ）、ＴＯＦリフレクトロンまたはフーリエ変換質量分析計を含んでもよい。
一実施形態では、分析物−マトリックス混合物は、乾燥液滴法を用いて形成してもよい。生物学的試料をマトリックスと混合することで、マトリックス対試料比が約５０００：１の場合の飽和マトリックス溶液が生成される。次いで、一定分量（約０．５〜２．０ｕＬ）の飽和マトリックス溶液を乾燥させておくことで、分析物−マトリックス混合物が形成される。
一実施形態では、分析物−マトリックス混合物は、薄層法を用いて形成してもよい。マトリックスの均一膜がまず形成され、次いで試料が適用され、マトリックスにより吸収され、分析物−マトリックス混合物が形成され得る。
一実施形態では、分析物−マトリックス混合物は、厚層法を用いて形成してもよい。マトリックスの均一膜が、ニトロセルロースマトリックス添加剤を用いて形成される。一旦均一なニトロセルロースマトリックス層が得られると、試料が適用され、マトリックスに吸収され、分析物−マトリックス混合物が形成される。
一実施形態では、分析物−マトリックス混合物は、サンドイッチ法を用いて形成してもよい。マトリックス結晶の薄層は、薄層法などで調製され、その後、水性トリフルオロ酢酸、試料およびマトリックスの液滴が添加される。次いで、試料は、マトリックスに吸収され、分析物−マトリックス混合物が形成される。
Ｖ．本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの使用
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡは、細胞の表現型を変更するために使用してもよい。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡは、ペプチド、ポリペプチドまたは複数のタンパク質をコードし、目的のポリペプチドを生成可能である。目的のポリペプチドは、治療薬および／または臨床や研究の場において使用してもよい。非限定例として、目的のポリペプチドは、再プログラム化因子、分化因子および脱分化因子を含んでもよい。
治療薬
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ、例えば修飾核酸および修飾ＲＮＡ、ならびに本明細書に記載のそれらから翻訳されるタンパク質は、治療薬または予防薬として使用してもよい。それらは、医薬、治療および予防的治療における用途に提供される。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは対象に投与してもよく、ここでポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、インビボで翻訳され、対象において治療用または予防用ポリペプチドを生成する。提供されるの
は、ヒトおよび他の哺乳類における疾患または状態の診断、治療または予防を目的とする組成物、方法、キット、および試薬である。本発明の活性治療薬は、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡか、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含有する細胞か、あるいはポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチド、を含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、１つ以上のタンパク質をコードする翻訳可能領域を有する１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含有する併用治療薬（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）である。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、細胞集団内の組換えポリペプチドの翻訳を誘発する方法である。かかる翻訳は、インビボ、エクスビボ、培養物中、またはインビトロであってもよい。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する有効量の組成物と接触される。同集団は、核酸が細胞集団の１つ以上の細胞内に局在化される、組換えポリペプチドが核酸から細胞内で翻訳されるような条件下で接触される。
「有効量」の組成物は、少なくとも一部には、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特性（例えば、サイズ、および修飾ヌクレオシドの範囲）、および他の決定因子に基づいて提供される。一般に、有効量の組成物は、細胞内での、効率的な、好ましくは対応する未修飾核酸を含有する組成物よりも効率的なタンパク質生成を提供する。効率の向上は、細胞への遺伝子導入（すなわち、核酸が遺伝子導入された細胞の百分率）の増加、核酸からのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の低下（例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳の期間の拡大によって実証される）、または宿主細胞の自然免疫応答の低下、によって実証され得る。
本発明の態様は、組換えポリペプチドのインビボでの翻訳を、それを必要とする哺乳類対象において誘発する方法に関する。その場合、少なくとも１つの構造または化学修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する有効量の組成物が、本明細書に記載の送達方法を用いて対象に投与される。核酸は、核酸が対象の細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが核酸から細胞内で翻訳されるような量および他の条件下で提供される。核酸が局在化される場合の細胞、または細胞が存在する組織は、１回または２回以上の核酸投与の場合に標的化され得る。
特定の実施形態では、投与されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳されるような細胞、組織または生物において実質的に不在である機能的活性を提供する１つ以上の組換えポリペプチドの生成を誘導する。例えば、欠損している機能的活性は、酵素的性質、構造的性質、または遺伝子制御性であってもよい。関連の実施形態では、投与されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳されるような細胞内で存在するが実質的に欠損している機能的活性を（例えば相乗的に）増強する、１つ以上の組換えポリペプチドの生成を誘導する。
他の実施形態では、投与されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳されるような細胞内で実質的に不在である１つのポリペプチド（または複数のポリペプチド）を置換する１つ以上の組換えポリペプチドの生成を誘導する。かかる不在は、コーディング遺伝子またはその調節経路の遺伝子突然変異に起因し得る。一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、細胞内の内因性タンパク質のレベルを望ましいレベルに増加させ、かかる増加は、内因性タンパク質のレベルを、亜正常レベルから正常レベルまたは正常レベルから超常的レベルへ到達させ得る。
あるいは、組換えポリペプチドは、細胞内に存在するか、細胞表面上に存在するか、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗するように機能する。通常、内因性タンパク質の活性は、例えば活性または局在化の変更をもたらす内因性タンパク質の突然変異に起因して、対象に対して有害である。加えて、組換えポリペプチドは、直接的または間接的に、細胞内に存在するか、細胞表面上に存在するか、または細胞から分泌される生物学的部分の活性に拮抗する。拮抗される生物学的部分の例として、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、志賀および破傷風毒素などのタンパク質毒素、またはボツリヌス、コレラ、およびジフテリア毒素などの小分子毒素、が挙げられる。加えて、拮抗される生体分子は、望ましくない活性、例えば細胞毒性または細胞分裂停止活性を示す内因性タンパク質であってもよい。
本明細書に記載の組換えタンパク質は、細胞内、潜在的には核などの特定の区画内での局在化を意図して操作することができ、あるいは細胞からの分泌または細胞の原形質膜への転座を意図して操作される。
本開示の他の態様は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを有する細胞の哺乳類対象への移植に関する。細胞の哺乳類対象への投与は、当業者にとって既知であり、また限定はされないが、局所的移植（例えば、局所または皮下投与）、器官送達または全身注射（例えば、静脈注射または吸入）、および薬学的に許容可能な担体中の細胞製剤、を含む。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有するかかる組成物は、筋肉内、経動脈、腹腔内、静脈内、鼻腔内、皮下、内視鏡的、経皮的、またはくも膜下腔内投与を意図して調合してもよい。一部の実施形態では、組成物は、持続放出を意図して調合してもよい。治療薬を投与可能な対象は、疾患、障害、または有害な状態（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を患うか、またはそれを発生させるリスクがあってもよい。提供されるのは、これらのベースに基づき、対象の同定、診断、および分類を行う方法であり、同方法は、臨床診断、バイオマーカーレベル、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）、および当該技術分野で既知の他の方法を含んでもよい。
疾患または障害
家族性高コレステロール血症
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）を治療するために使用してもよい。本明細書で使用される用語「家族性高コレステロール血症」または「ＦＨ」は、血漿中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）関連コレステロールレベルの上昇によって特徴づけられる常染色体優性遺伝性障害を示す。正常な患者におけるＬＤＬコレステロールレベル（例えば、＜１３０ｍｇ／ｄＬ）に対して、ヘテロ接合性およびホモ接合性ＦＨ患者におけるレベルは各々、３５０〜５５０ｍｇ／ｄＬおよび＞６００ｍｇ／ｄＬに上昇することが多い。ＦＨを有する患者または対象におけるこれらのレベルへのＬＤＬコレステロールの上昇は、組織内でのコレステロール沈着をもたらし、若年での心血管疾患リスクの増大を有し得る。一部の実施形態では、これらの個体の血液中の高レベルのＬＤＬは、ＬＤＬ受容体をコードする遺伝子における突然変異に起因し得る。ＬＤＬは、トリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｅｒｉｄｅ）リッチ超低密度リポタンパク質すなわちＶＬＤＬの脂肪分解異化（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ）により、循環血液中で生成される。限定するつもりはないが、脂質輸送およびエステル化反応の後、ＬＤＬ受容体が循環血液中でＬＤＬに結合し、受容体が発現される肝細胞表面へのＬＤＬのエンドサイトーシスを促進すると考えられる。この受容体が機能障害性を示す場合、ＬＤＬレベルは、その長期の血中滞留中に循環血液中で上昇したままであり、アテローム動脈硬化症の発症を促進する。ＬＤＬＲ遺伝子における不活性化突然変異は、ヘテロ接合性およびホモ接合性患者におけるＬＤＬＲ発現（各々
、一般に正常な患者の約５０％および約１０〜１５％）を有する大半のＦＨ症例に関与する。ＦＨを有する個体は、ＦＨに関連した遺伝子突然変異についてはヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。ヘテロ接合性ＦＨは、一般集団における有病率（ｐｒｅｖｅｌａｎｃｅ）が約１／５００であり、最も一般的な遺伝性障害のうちの１つである一方、同疾患のホモ接合体は、有病率（ｐｒｅｖｅｌａｎｃｅ）が約１／１，０００，０００であり、より希少である。ホモ接合性個体における症状は、より重篤であり得る。診断は、限定はされないが、黄色腫（脂肪皮膚の成長（ｆａｔｔｙ ｓｋｉｎ ｇｒｏｗｔｈｓ））を明らかにする診断を含む、当該技術分野で既知の方法により、小児期または青年期の間に可能である。ＦＨの早期診断は、家族歴および遺伝の分析を通じて行うことができる（ショウク Ｂ．（Ｓｊｏｕｋｅ，Ｂ．）ら著、家族性高コレステロール血症：現在および将来の管理（Ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ：ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．）」、カレント・カーディオロジー・レポーツ（Ｃｕｒｒ Ｃａｒｄｉｏｌ Ｒｅｐ．）、２０１１年、１２月；第１３巻、第６号、ｐ．５２７−３６；アヴィス Ｈ．Ｊ．（Ａｖｉｓ，Ｈ．Ｊ．）ら著、「家族性高コレステロール血症を有する小児におけるスタチン療法のシステマティックレビューおよびメタ解析（Ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔａｔｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ．）」、アルテリオスクルシス・スロムボーシス・アンド・ヴァスキュラー・バイオロジー（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｅ Ｂｉｏｌ．）、２００７年、８月；第２７巻、第８号、ｐ．１８０３−１０；これらの各々はそれら全体が参照により本明細書に援用される）。
現在の治療薬、例えばスタチン、ナイアシンおよび樹脂は、肝臓におけるＬＤＬＲ発現の誘導を介して、直接的または間接的に血清コレステロールレベルを低下させ得る。これらの手法は、多数のヘテロ接合性ＦＨ患者にとって有効である一方、問題となり得る。これらの薬剤を服用する少なくとも２５〜３０％の患者は、それらの所望されるＬＤＬコレステロール目標を達成することができない。これらの作用物質は、ホモ接合性ＦＨを治療する場合、主にこれらの患者の肝臓における機能的ＬＤＬＲの残留レベルが低いことから、有効性が低下する可能性さえある。これらの患者の大部分は、スタチンに対して、また疾患の重症形態において非応答性であり、治療はＬＤＬアフェレーシスおよび肝移植に限定される。現在の治療は、標的となるＬＤＬコレステロールレベルを低下させることに常に奏功するとは限らず、したがって、新しい治療が早急に必要とされる。
一実施形態では、ＦＨを有する患者には、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含む組成物を投与してもよい。ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ペプチド、タンパク質またはその断片、例えば限定はされないが、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、アポリポタンパク質Ｂ（アポＢ（ＡＰＯＢ））、およびプロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、をコードし得る。
一実施形態では、ＦＨは、ＬＤＬＲのペプチド、タンパク質またはその断片をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含む本発明の組成物を投与することによって治療してもよい。別の実施形態では、ＦＨは、ペプチド、タンパク質またはその断片をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含む本発明の組成物を投与することによって治療してもよい。
一実施形態では、ＦＨは、アポＢ（ＡＰＯＢ）のペプチド、タンパク質またはその断片をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含む本発明の組成物を投与することによって治療してもよい。別の実施形態では、ＦＨは、ペ
プチド、タンパク質またはその断片をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含む本発明の組成物を投与することによって治療してもよい。一実施形態では、ＦＨは、ＰＣＳＫ９のペプチド、タンパク質またはその断片をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含む本発明の組成物を投与することによって治療してもよい。別の実施形態では、ＦＨは、ペプチド、タンパク質またはその断片をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含む本発明の組成物を投与することによって治療してもよい。
別の実施形態では、有望な目的の細胞株または細胞株の収集物、特に、既知の活性を有する参照タンパク質のタンパク質変異体などの目的のポリペプチドにおいて、特定のポリペプチドの発現を最適化することは有用であり得る。一実施形態では、提供されるのは、複数の標的細胞型を提供し、またポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを複数の標的細胞型の各々と独立に接触させることにより、標的細胞内の目的のポリペプチドの発現を最適化する方法である。加えて、培養条件は、タンパク質生成効率を高めるように変更してもよい。その後、複数の標的細胞型における目的のポリペプチドの存在および／またはレベルは、検出および／または定量化することで、それに関する効率的な標的細胞および細胞培養条件の選択により、目的のポリペプチドの発現の最適化が可能になる。かかる方法は、目的のポリペプチドが、効率的なタンパク質生成を複雑化することが多い、１つ以上の翻訳後修飾を有するかまたは実質的な三次構造を有する場合、有用であり得る。
本明細書に記載の方法および組成物は、内因性アゴニストへの生物学的応答を減弱させるかまたは遮断する能力および／または哺乳類対象における受容体またはシグナル伝達分子に拮抗する能力があるタンパク質を生成することを意図して使用してもよい。例えば、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３受容体シグナル伝達は、多発性硬化症などの慢性自己免疫障害ならびに関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、強直性脊椎炎およびクローン病（Ｃｈｒｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）などの炎症性疾患において増強され得る（キクリー Ｋ．（Ｋｉｋｌｙ Ｋ．）、リウ Ｌ．（Ｌｉｕ Ｌ．）、ナ Ｓ．（Ｎａ Ｓ．）、セジウィッチ ＪＤ（Ｓｅｄｇｗｉｃｈ ＪＤ）、２００６年、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１８巻、第６号、ｐ．６７０−５）。別の実施形態では、核酸は、ケモカイン受容体に対するアンタゴニストをコードする。ケモカイン受容体ＣＸＣＲ−４およびＣＣＲ−５は、ＨＩＶの宿主細胞への侵入に対して必要とされる（アレンザナ・セイスデドスＦ．（Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ Ｆ．）ら著、１９９６年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１０月３日；第３８３巻、第６５９９号、ｐ．４００）。
細胞表面上でのリガンドまたは受容体の発現
本明細書に記載の一部の態様および態様の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、細胞表面上でリガンドまたはリガンド受容体（例えばホーミング部分）を発現することを意図して使用してもよい。細胞表面に付着されるリガンドまたはリガンド受容体部分は、細胞がインビボで組織または作用物質との所望される生物学的相互作用を有することを可能にし得る。リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマー、ペプチド、ビタミン、炭水化物、タンパク質またはポリペプチド、受容体、例えば、細胞表面受容体、接着分子、糖タンパク質、糖残基、治療薬、薬物、グリコサミノグリカン、またはそれらの任意の組み合わせ、であってもよい。例えば、リガンドは、がん細胞特異抗原を認識する抗体であってもよく、細胞に腫瘍細胞と優先的に相互作用する能力を与えることで、修飾細胞の腫瘍特異的局在化を可能にする。好ましいリガンドが、処置されるべき組織の外面上の標的分子と相互作用する能力を有し得ることから、リガンドは、細胞組成物の、処置されるべき組織内に蓄積する能力を与え得る。他の組織との限られた交差反応性を有するリガンドは、一般に好ましい。
いくつかの場合、リガンドは、細胞が、特定の組織を標的にするかまたは特定のリガンドと相互作用することを可能にするホーミング部分として作用し得る。かかるホーミング部分は、限定はされないが、特定の結合対、抗体、モノクローナル抗体、またはその誘導体もしくは類似体、例えば限定はされないが、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一のドメイン抗体、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）および抗体断片、ヒト化抗体および抗体断片、ならびに前記の多価バージョン；多価結合試薬（ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）、例えば限定はされないが、単一特異性または二重特異性抗体、例えばジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ＳＣＦＶ）２断片）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重特異性抗体（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）または四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、典型的には共有結合されたまたはその代わりとして安定化された（すなわち、安定化されたロイシンジッパーまたはヘリックス）ｓｃＦｖ断片、のうちの任意のメンバーを含んでもよく、また、他のホーミング部分は、例えば、アプタマー、受容体、および融合タンパク質を含む。
一部の実施形態では、ホーミング部分は、細胞標的化特異性の調整を可能にし得る表面結合抗体であってもよい。これは、高度に特異的な抗体が、所望される標的化部位における目的のエピトープに対して産生され得ることから、特に有用である。一実施形態では、複数の抗体は、細胞の表面上で発現され、また各抗体は、所望される標的に対して異なる特異性を有し得る。かかる手法は、ホーミング相互作用の結合活性および特異性を増強し得る。
当業者は、細胞の所望される局在化または機能に基づいて、任意のホーミング部分を選択することができ、例えば、エストロゲン受容体リガンド、例えばタモキシフェンは、細胞表面上に数が増加したエストロゲン受容体を有するエストロゲン依存性乳がん細胞に対して細胞を標的化し得る。リガンド／受容体相互作用の他の非限定例として、ＣＣＲＩ（例えば、関節リウマチおよび／または多発性硬化症における炎症関節組織または脳を処置するため）、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８（例えば、リンパ節組織を標的化する）、ＣＣＲ６、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０（例えば、腸管組織を標的化するため）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０（例えば、皮膚を標的化するため）、ＣＸＣＲ４（例えば、一般的な増強された遊出のため）、ＨＣＥＬＬ（例えば、炎症および炎症性障害、骨髄を処置するため）、アルファ４ベータ７（Ａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７）（例えば、腸管粘膜を標的化するため）、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１（例えば、内皮を標的化する）、が挙げられる。一般に、標的化（例えばがん転移）に関与する任意の受容体は、本明細書に記載の方法および組成物における用途として、利用してもよい。
ＶＩ．キットおよびデバイス
本発明は、本発明の方法を便宜的および／または効率的に実施するための種々のキットを提供する。典型的には、キットは、ユーザが、１以上の対象の複数の処置を実施し、かつ／または複数の実験を実施し、また細胞および／または細胞集団と少なくとも１回接触させることを可能にするのに十分な量および／または数の要素を含むことになる。
一態様では、本発明は、本発明の分子（ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ）を含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、１つ以上の機能的抗体またはその機能断片を含む。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡとの併用が有用であるキットおよびデバイスは、２０１２年１２月１４日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）に開示されたものを含む。
ＶＩＩ．定義
本明細書中の様々な箇所で、本開示の化合物の置換基は、グループまたは範囲として開示される。詳細には、本開示は、かかるグループおよび範囲のメンバー間のあらゆる個々の小結合を含むことが意図されている。例えば、用語「Ｃ１〜６アルキル」は、詳細には、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、およびＣ６アルキルを個別に開示することが意図されている。
約（ａｂｏｕｔ）：本明細書で使用される用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、列挙される値の＋／−１０％を意味する。
組み合わせて投与される：本明細書で使用される用語「組み合わせて投与される」または「組み合わせ投与」は、２つ以上の作用物質が対象に、同時にまたは各作用物質の患者に対する効果が重複し得るようなある間隔以内に投与されることを意味する。一部の実施形態では、それらは、互いの間隔が約６０分、３０分、１５分、１０分、５分、または１分以内に投与される。一部の実施形態では、作用物質の投与は、組み合わされた（例えば相乗）効果が得られるように、互いに十分密な間隔で行われる。
動物：本明細書で使用される用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを示す。一部の実施形態では、「動物」は、発生の任意のステージでのヒトを示す。一部の実施形態では、「動物」は、発生の任意のステージでの非ヒト動物を示す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。一部の実施形態では、動物は、限定はされないが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および昆虫類を含む。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子改変動物、またはクローンである。
約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）：本明細書で使用される用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、目的の１つ以上の値に適用される場合、記述された参照値に類似する値を示す。特定の実施形態では、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、（かかる数が考えられる値の１００％を超えることになる場合を除き）特に指定のない限り、またはその代わり、文脈から明らかである場合、記述される参照値の（より大きいまたは小さい）いずれかの方向で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満に該当する値の範囲を示す。
〜に会合される：本明細書で使用される用語「〜に会合される」、「抱合される」、「連結される」、「付着される」および「繋ぎ止められた」は、２つ以上の部分との関連で使用される場合、同部分が、直接的にまたは連結剤として役立つ１つ以上の追加的部分を介して、互いに物理的に会合または結合され、同部分が、物理的に会合した状態を保つような十分に安定した構造を、構造が使用される条件下、例えば生理学的条件下で形成することを意味する。「会合」は、厳密に、直接的な化学的共有結合によるものである必要はない。それはまた、「会合された」実体が物理的に会合された状態を保つように十分に安定した、イオンもしくは水素結合またはハイブリダイゼーションに基づく結合性を示唆し得る。
二機能性：本明細書で使用される用語「二機能性」は、少なくとも２つの機能を発揮する能力があるかまたは維持する、任意の物質、分子または部分を示す。同機能は、同一の結果または異なる結果をもたらす場合がある。同機能をもたらす構造は、同じであるかまたは異なる場合がある。例えば、本発明の二機能性修飾ＲＮＡは、細胞毒性ペプチド（第１の機能）をコードし得る一方、コーディングＲＮＡを含むヌクレオシドは、ヌクレオシ
ド自体で細胞毒性（第２の機能）を示す。この例において、二機能性修飾ＲＮＡのがん細胞への送達であれば、がんを寛解させるかまたは治療し得るペプチドまたはタンパク質分子を生成するだけでなく、ヌクレオシドの細胞毒性ペイロードを細胞へ送達することになるが、この場合には修飾ＲＮＡの翻訳ではなく分解が生じるはずである。
生体適合性：本明細書で使用される用語「生体適合性」は、生体細胞、組織、器官または系に適合でき、損傷、毒性または免疫系による拒絶のリスクをほとんどもしくは全く示さないことを意味する。
生分解性：本明細書で使用される用語「生分解性」は、生体の作用によって無害な産物に分解され得ることを意味する。
生物活性がある：本明細書で使用される語句「生物活性がある」は、生体系および／または生物において活性を有する任意の物質の特性を示す。例えば、生物に投与される場合にその生物に対して生物学的効果を有する物質は、生物活性があると考えられる。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、たとえポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの一部でも、生物活性があるかまたは生物学的に関連のあると考えられる活性を模倣する場合、生物活性があると考えてもよい。
がん幹細胞：本明細書で使用される「がん幹細胞」は、自己再生ならびに／または異常な増殖および分化を経て、腫瘍を形成することが可能な細胞である。
化学用語：本明細書中に特別に定義されない化学用語は、２０１２年１２月１４日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に援用される）中に提供された化学用語の定義に従うことになる。
用語「ジアステレオマー」は、本明細書で使用される場合、相互の鏡像ではなくかつ相互に対して重ねることができない立体異性体を意味する。
作用物質の「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、有利な結果または所望される結果、例えば臨床結果をもたらすのに十分な量であり、またそういうことから、「有効量」は適用されている文脈に左右される。例えば、がんを治療する作用物質を投与するという文脈の中では、作用物質の有効量は、例えば、本明細書中に定義されるように、作用物質を投与しない場合に得られる応答と比べて、がんの治療を行うのに十分な量である。
用語「光学異性体」は、本明細書で使用される場合、（当該技術分野で標準的な方法による測定によると）少なくとも８０％（すなわち、一方の光学異性体が少なくとも９０％および他方の光学異性体が最大で１０％）、好ましくは少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９８％の光学純度または鏡像体過剰率を有する、本発明の各個別の光学活性型の化合物を意味する。
用語「異性体」は、本明細書で使用される場合、本発明の任意の化合物の、任意の互変異性体、立体異性体、光学異性体、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物が、１つ以上のキラル中心および／または二重結合を有することができ、それ故、立体異性体、例えば二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、鏡像異性体（すなわち（＋）または（−））またはシス／トランス異性体）として存在することは理解されている。本発明によると、本明細書に示される化学構造、ひいては本発明の化合物は、対応する立体異性体の全部、すなわち、立体異性体的に（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ）純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋な、鏡像異性的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な形態）および鏡像異性および立体異性混合物、例えば、ラセミ化合物の双方を包含する。本発明の化合物の鏡像異性および立体異性混合物
は、典型的には、それらの成分の鏡像異性体または立体異性体に、周知の方法、例えばキラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高性能液体クロマトグラフィー、化合物のキラル塩複合体としての結晶化、または化合物のキラル溶媒中での結晶化により、溶解され得る。鏡像異性体および立体異性体はまた、周知の不斉合成方法により、立体異性体的（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ）または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、および触媒から得ることができる。
用語「立体異性体」は、本明細書で使用される場合、基本的な分子構造の、化合物（例えば、本明細書に記載の任意の式の化合物）が有し得る、あらゆる考えられる異なる異性体および立体構造的形態、特にあらゆる考えられる立体化学および立体構造異性体形態、あらゆるジアステレオマー、鏡像異性体および／または配座異性体、を示す。本発明の一部の化合物は、異なる互変異性形態中に存在し得る（後者のすべては本発明の範囲内に含まれている）。
化合物：本明細書で使用される用語「化合物」は、示される構造のすべての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、および同位体を含むことを意味する。
本明細書に記載の化合物は、不斉性であってもよい（例えば、１つ以上の立体中心を有する）。意図されるのは、別段の指示がない限り、すべての立体異性体、例えば鏡像異性体およびジアステレオマーである。非対称的に置換された炭素原子を有する本開示の化合物は、光学活性型またはラセミ型で単離してもよい。いかにして光学活性型を光学活性出発物質から調製するかについての方法は、例えばラセミ混合物の分割によるかまたは立体選択的合成によるものであり、当該技術分野で既知である。多数のオレフィンの幾何異性体、Ｃ＝Ｎ二重結合などはまた、本明細書に記載の化合物中に存在し得、あらゆるかかる安定な異性体は、本開示中で検討される。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体は、記載があり、異性体の混合物として、または分離された異性体形態として単離してもよい。
本開示の化合物はまた、互変異性形態を含む。互変異性形態は、単結合と隣接する二重結合との交換およびそれに付随するプロトンの遊走に起因する。互変異性形態は、同一の実験式および全電荷を有する異性体のプロトン化状態であるプロトトロピック（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ）互変異性体を含む。プロトトロピック互変異性体の例として、ケトン−エノール対、アミド−イミド酸対、ラクタム−ラクチム対、アミド−イミド酸対、エナミン−イミン対、およびプロトンが複素環系の２つ以上の位置を占め得る場合の環状形態、例えば、１Ｈ−および３Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−、２Ｈ−および４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１Ｈ−および２Ｈ−イソインドール、および１Ｈ−および２Ｈ−ピラゾール、が挙げられる。互変異性形態は、平衡状態であるか、または適切な置換により１つの形態に立体的に固定化され得る。
本開示の化合物はまた、中間体または最終化合物の中に生じる原子の同位体の全部を含む。「同位体」は、同一の原子数であるが、原子核内の異なる数の中性子に起因して異なる質量数を有する原子を示す。例えば、水素の同位体は、三重水素および重水素を含む。
本開示の化合物および塩は、ルーチン的な方法により、溶媒または水分子を組み合わせて調製し、溶媒和物および水和物を形成してもよい。
委任された：本明細書で使用される用語「委任された」は、細胞に言及する場合、通常の環境下で、細胞が分化経路に入るには遠すぎる場合、細胞が、異なる細胞型に分化するかまたはより少数の分化細胞型に戻るのではなく、特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続けることになることを意味する。
保存されている：本明細書で使用される用語「保存されている」は、ポリヌクレオチド
配列またはポリペプチド配列の各々のヌクレオチドまたはアミノ酸残基において、比較されている２つ以上の配列の同一位置において改変されずに存在するものを示す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列内の他所に見られるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連のある配列の中で保存されているものである。
一部の実施形態では、２つ以上の配列は、互いに１００％同一である場合、「完全に保存されている」と言われる。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、少なくとも７０％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも９０％同一である、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、約７０％同一である、約８０％同一である、約９０％同一である、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、少なくとも３０％同一である、少なくとも４０％同一である、少なくとも５０％同一である、少なくとも６０％同一である、少なくとも７０％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも９０％同一である、または少なくとも９５％同一である場合、「保存されている」と言われる。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、約３０％同一である、約４０％同一である、約５０％同一である、約６０％同一である、約７０％同一である、約８０％同一である、約９０％同一である、約９５％同一である、約９８％同一である、または約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用してもよく、あるいはその一部、領域または特徴に適用してもよい。
徐放：本明細書で使用される用語「徐放」は、治療成績に効果をもたらす特定の放出パターンに適合する医薬組成物または化合物の放出特性を示す。
環状または環化：本明細書で使用される用語「環状」は、連続したループの存在を示す。環状分子は、環状である必要はなく、単にサブユニットの壊れていない鎖を形成するように連結されたものである。本発明の操作されたＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの環状分子は、単一の単位または多量体であってもよく、あるいは複合体または高次構造の１つ以上の成分を含んでもよい。
細胞分裂停止：本明細書で使用される「細胞分裂停止」は、細胞（例えば、哺乳類細胞｛例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはそれらの組み合わせ、の成長、分裂、または増殖を阻害し、低下させ、抑制することを示す。
細胞毒性：本明細書で使用される「細胞毒性」は、細胞（例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはそれらの組み合わせに対して、殺滅するか、あるいは傷害性、毒性または致死的効果を引き起こすことを示す。
送達：本明細書で使用される「送達」は、化合物、物質、実体、部分、カーゴまたはペイロードを送達する作用または方法を示す。
送達剤：本明細書で使用される「送達剤」は、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの標的化細胞へのインビボ送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を示す。
不安定化される：本明細書で使用される用語「デステイブル（ｄｅｓｔａｂｌｅ）」、「不安定化する（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅ）」または「不安定化する（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）領域」は、同一領域または分子の開始形態、野生型または天然型より安定性が低下した領域または分子を意味する。
検出可能な標識：本明細書で使用される「検出可能な標識」は、ラジオグラフィー、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む、当該技術分野で既知の方法によって容易に検出されるもう１つの実体に付着され、取り込まれ、または会合される、１つ以上のマーカー、シグナル、または部分を示す。検出可能な標識は、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオンや、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテンなどのリガンド、量子ドットなどを含む。検出可能な標識は、本明細書中に開示されるペプチドまたはタンパク質における任意の位置に位置してもよい。それらは、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質の内部に存在するか、あるいはＮ末端またはＣ末端に位置してもよい。
発生能：本明細書で使用される「発生能（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）」または「発生能（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｏｔｅｎｃｙ）」は、分化時に細胞によって得られうる、あらゆる細胞発生運命または細胞型を示す。
発生能変更因子：本明細書で使用される「発生能変更因子」は、細胞の発生能を変更し得るタンパク質またはＲＮＡを示す。
消化：本明細書で使用される用語「消化」は、より小さい切片または成分に分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に関しては、消化は、ペプチドの生成をもたらす。
分化細胞：本明細書で使用される用語「分化細胞」は、天然形態では多能性を示さない任意の体細胞を示す。分化細胞はまた、部分的に分化された細胞を包含する。
分化：本明細書で使用される用語「分化因子」は、細胞の所望される細胞型への分化を誘発し得る、タンパク質、ＲＮＡまたは小分子などの発生能変更因子を示す。
分化する：本明細書で使用される「分化する」は、非委任（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）またはレスコミッティッド細胞（ｌｅｓｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｃｅｌｌ）が委任細胞の特徴を得る場合のプロセスを示す。
遠位：本明細書で使用される用語「遠位」は、中心から離れてあるいは目的のポイントまたは領域から離れて位置することを意味する。
用量分割因子（ＤＳＦ：Ｄｏｓｅ ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）：全一日用量または単回単位用量のＰＵＤによって除される用量分割治療（ｄｏｓｅ ｓｐｌｉｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のＰＵＤの比。同値は、投与計画群の比較から得られる。
ＥＳ細胞：本明細書で使用される用語「ＥＳ細胞」は、胚性の胚盤胞の内部細胞塊の天然多能性幹細胞を示す。
被包する：本明細書で使用される用語「被包する」は、封入するか、包囲するかまたは包むことを意味する。
コード化タンパク質切断シグナル：本明細書で使用される「コード化タンパク質切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を示す。
操作された：本明細書で使用される場合、本発明の実施形態は、構造的または化学的のいずれにしても、開始点、野生型または天然分子から変化する特徴または特性を有するように設計される場合、「操作された」である。
エキソソーム：本明細書で使用される「エキソソーム」は、哺乳類細胞またはＲＮＡ分解に関与する複合体によって分泌される小胞である。
発現：本明細書で使用される核酸配列の「発現」は、以下の事象、すなわち、（１）Ｄ
ＮＡ配列からの（例えば転写による）ＲＮＡ鋳型の生成；（２）（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）ＲＮＡ転写物のプロセシング；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾、のうちの１つ以上を示す。
特徴：本明細書で使用される「特徴」は、特徴、特性、または特徴的要素を示す。
製剤：本明細書で使用される「製剤」は、少なくともポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡおよび送達剤を含む。
断片：本明細書で使用される「断片」は、一部分を示す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含んでもよい。
機能的：本明細書で使用される「機能的」生体分子は、それが特徴づけられる特性および／または活性を示す形態の生体分子である。
相同性：本明細書で使用される用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的関連性を示す。一部の実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一かまたは類似する場合、相互に「相同性」があると考えられる。用語「相同性」は、必然的に少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を示す。本発明によると、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０のアミノ酸の少なくとも１つのストレッチに対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらに９９％に相当する場合、相同性があると考えられる。一部の実施形態では、相同性ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５個のユニークに特定されたアミノ酸のストレッチをコードする能力によって特徴づけられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列については、相同性は、少なくとも４〜５個のユニークに特定されたアミノ酸のストレッチをコードする能力によって判定される。本発明によると、２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも約２０のアミノ酸の少なくとも１つのストレッチに対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合、相同性があると考えられる。
同一性：本明細書で使用される用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えばオリゴヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的関連性を示す。２つのポリヌクレオチド配列のパーセント同一性の計算は、例えば、最適な比較を目的として２つの配列を整列することによって実施することができる（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために第１および第２核酸配列の一方または両方に導入することができ、また非同一配列は、比較目的のために無視することができる）。特定の実施形態では、比較目的のために整列された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１配列内のある位置が第２配列内の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められる場合、それら分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一位置の数の関数であり、そこでは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数、および各ギャップの長さが考慮される。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の判定は、数学アルゴリズムを用いて行うことができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、例えば、「コンピュータによる分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスク Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８年；「バイオコンピューティング：インフォマティクスおよびゲノム計画（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミス Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３年；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、フォン・ハインヘ Ｇ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列データのコンピュータ分析、パートＩ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ）」、グリフィン Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン
Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー、１９９４年；ならびに「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリブスコフ Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデヴリュー Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、エム・ストックトン・プレス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１年（これら各々は、参照により本明細書中に援用される）に記載される方法を用いて判定することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（ｇａｐ
ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を使用する、アライン（ＡＬＩＧＮ）プログラム（バージョン２．０）中に組み込まれている、メイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（カビオス（ＣＡＢＩＯＳ）、１９８９年、第４巻、ｐ．１１−１７）を用いて判定してもよい。あるいは、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ中のギャップ（ＧＡＰ）プログラムを用いて判定することができる。配列間のパーセント同一性を判定するために一般的に使用される方法は、限定はされないが、カリージョ Ｈ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．）およびリプマン Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）、サイアム・ジャーナル・オン・アプライド・マセマティクス（ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、第４８巻：ｐ．１０７３（１９８８年）（参照により本明細書中に援用される）中に開示されたものを含む。同一性を判定するための技術は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて成文化されている。２つの配列間の相同性を判定するための例示的なコンピュータソフトウェアとして、限定はされないが、ジーシーシー（ＧＣＧ）プログラムパッケージ（デヴリュー Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻、第１号、ｐ．３８７（１９８４年））、ブラストピー（ＢＬＡＳＴＰ）、ブラストエヌ（ＢＬＡＳＴＮ）、およびファスタ（ＦＡＳＴＡ）（アルツシュール Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ）、第２１５巻、ｐ．４０３（１９９０年））が挙げられる。
遺伝子の発現を阻害する：本明細書で使用される語句「遺伝子の発現を阻害する」は、遺伝子の発現産物量の低下を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的には、ｍＲＮＡレベルの低下は、それから翻訳されるポリペプチドレベルの低下をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的技術を用いて判定してもよい。
インビトロ：本明細書で使用される用語「インビトロ」は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）の中ではなく、人工的環境下、例えば、試験管内または反応容器内、細胞培養液中、ペトリ皿内などで発生する事象を示す。
インビボ：本明細書で使用される用語「インビボ」は、生物（例えば、動物、植物、または微生物あるいはその細胞または組織）の中で発生する事象を示す。
単離された：本明細書で使用される用語「単離された」は、（天然または実験設定のいずれかにおいて）会合した相手の成分の少なくとも一部から分離されている物質または実体を示す。単離された物質は、会合している物質との関連で、様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質および／または実体は、他方の成分（最初に会合した相手）の少なくとも約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超または９０％超から分離され得る。一部の実施形態では、単離された作用物質は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超、純粋である。物質は、本明細書で使用される場合、他の成分から実質的に遊離している場合、「純粋」である。
実質的に単離された：「実質的に単離された」は、化合物が、それが形成または検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的分離は、例えば、本開示の化合物中に豊富に存在する組成物を含んでもよい。実質的分離は、本開示の化合物またはその塩の、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％を含有する組成物を含んでもよい。化合物およびその塩を単離するための方法は、当該技術分野ではルーチン的なものである。
リンカー：本明細書で使用されるリンカーは、原子の集団、例えば１０〜１，０００個の原子を示し、原子または集団、例えば限定はされないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、およびイミンから構成してもよい。リンカーは、第１の末端で核酸塩基または糖部分上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドと、第２の末端でペイロード、例えば検出可能な作用物質または治療薬に付着してもよい。リンカーは、核酸配列への組み込みに干渉しないように十分な長さがあってもよい。リンカーは、任意の有用な目的のため、例えば、本明細書に記載のように、（例えば、２つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子の結合を介して）ｍｍＲＮＡ多量体またはｍｍＲＮＡ複合体を形成するため、ならびにペイロードを投与するため、使用してもよい。リンカー中に組み込んでもよい化学基の例として、本明細書に記載のように、限定はされないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）（これらの各々は任意選択的に置換してもよい）が挙げられる。リンカーの例として、限定はされないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコール単量体単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラプロピレングリコール）、およびデキストランポリマー、が挙げられる。他の例として、限定はされないが、リンカー内部の切断可能な部分、例えばジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）またはアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）など（還元剤または光分解を用いて切断可能）が挙げられる。選択的に切断可能な結合の非限定例として、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または他の還元剤、および／または光分解の使用により切断可能なアミド結合、ならびに、例えば酸性または塩基性加水分解により切断可能なエステル結合、が挙げられる。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位：本明細書で使用されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位は、少なくともｍｉＲＮＡの「シード」領域が結合する対象の核酸転写物のヌクレオチド位置または領域を示す。
修飾された：本明細書で使用される「修飾された」は、本発明の分子の改変された状態または構造を示す。分子は、化学的、構造的、および機能的方法を含む、多数の方法で修飾してもよい。一実施形態では、本発明のｍＲＮＡ分子は、例えば天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣに関する場合、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入により修飾される。キャップ構造などの非標準ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造と異なるが、「修飾された」とは考えられない。
粘液：本明細書で使用される「粘液」は、粘稠性がありかつムチン糖タンパク質を含む天然物質を示す。
多能性：本明細書で使用される「多能性」または「部分分化細胞」は、細胞を示す場合、３つすべての胚葉ではないが、１つ以上の胚葉の細胞に分化する発生能を有する細胞を示す。
天然の：本明細書で使用される「天然の」は、人工的補助なしに自然の中に存在することを意味する。
非ヒト脊椎動物：本明細書で使用される「非ヒト脊椎動物」は、野生および家畜種を含む、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）以外のすべての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例として、限定はされないが、哺乳類、例えばアルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ミュール、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、およびヤクが挙げられる。
オフターゲット：本明細書で使用される「オフターゲット」は、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する意図されない任意の効果を示す。
オリゴポテント（Ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）：本明細書で使用される「オリゴポテント」は、細胞について言う場合、多能性幹細胞よりも制限された細胞系譜のサブセットを生じさせる手段を意味する。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用される「オープンリーディングフレーム」すなわち「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレーム中に終止コドンを有しない配列を示す。
作動可能に連結された：本明細書で使用される語句「作動可能に連結された」は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能的結合を示す。
任意選択的に置換された：本明細書中の「任意選択的に置換されたＸ」形式の語句（例えば、任意選択的に置換されたアルキル）は、「Ｘ、ここでＸは任意選択的に置換された」（例えば、「アルキル、ここでアルキルは任意選択的に置換された」）に対応することが意図されている。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）が本質的に任意選択的であることを意味することは意図されていない。
ペプチド：本明細書で使用される「ペプチド」は、５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長より短いかまたはそれと均等である。
パラトープ：本明細書で使用される「パラトープ」は、抗体の抗原結合部位を示す。
患者：本明細書で使用される「患者」は、治療を求め得るかまたはそれを必要とし得る対象、治療を必要とする対象、治療を受診中の対象、治療を受診することになる対象、あるいは特定の疾患または状態に対して訓練された専門家によって治療されている対象を示す。
薬学的に許容可能な：語句「薬学的に許容可能な」は、正常な医学的判断の範囲内で、適切なリスク・ベネフィット比に見合う、過剰な毒性、炎症、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を有しないヒトおよび動物の組織との接触状態での使用に適した、化合物、材料、組成物、および／または剤形を示すように本明細書で使用される。
薬学的に許容可能な賦形剤：語句「薬学的に許容可能な賦形剤」は、本明細書で使用される場合、患者において実質的に無毒性でかつ非炎症性の特性を有する、本明細書に記載の化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解することが可能な媒体）を示す。賦形剤は、例えば、抗接着剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔｓ）、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｉｄｓ）、崩壊剤、色素（顔料）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルムフォーマー（ｆｉｌｍ ｆｏｒｍｅｒ）またはコーティング剤、香料、芳香、流動促進剤（流れ促進剤（ｆｌｏｗ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ））、滑沢剤、保存剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、および水和水（ｗａｔｅｒｓ ｏｆ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）、を含んでもよい。例示的な賦形剤は、限定はされないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、セラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、滑石、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトール、を含む。
薬学的に許容可能な塩：本開示はまた、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な塩」は、開示される化合物の誘導体を示し、ここで親化合物は、（例えば、遊離塩基基を適切な有機酸と反応させることにより）既存の酸部分または塩基部分をその塩形態に変換することによって修飾される。薬学的に許容可能な塩の例として、限定はされないが、アミンなどの塩基性残基の無機質または有機酸塩；カルボキシル酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩など、が挙げられる。代表的な酸付加塩として、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩（ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ）、樟脳スルホン酸塩（ｃａｍｐｈｏｒｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオナート（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ジグルコン酸塩（ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩（ｇｌｕｃｏｈｅｐｔｏｎａｔｅ）、グリセロリン酸塩（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩（ｈｅｐｔｏｎａｔｅ）、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホネート、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチネート（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩など、が挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩として、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに、無毒なアンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオン、例えば限定はされないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、
トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなど、が挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、例えば無毒性の無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の無毒塩（ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ ｓａｌｔｓ）を含む。本開示の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的方法により、塩基性または酸性部分を有する親化合物から合成することができる。一般に、かかる塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中もしくは有機溶媒中またはその２つの混合物中の化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水系媒体は、好ましい。適切な塩のリストは、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ペンシルベニア州、１９８５年、ｐ．１４１８、「製薬塩：特性、選択、および使用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ）」、Ｐ．Ｈ．スタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）およびＣ．Ｇ．ウェルムス（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）（編）、ワイリー・ヴイシーエイチ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年、およびベルゲ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６６巻、ｐ．１−１９（１９７７年）（これらの各々はその全体が参照により本明細書中に援用される）の中に見出される。
薬物動態：本明細書で使用される「薬物動態」は、分子または化合物の、それが生体に投与された物質の運命の決定に関するような任意の１つ以上の特性を示す。薬物動態は、吸収、分布、代謝および排泄の範囲および速度を含む、いくつかの領域に分かれる。これは、一般にＡＤＭＥと称され、ここで、（Ａ）吸収は、血液循環に入る物質の過程であり、；（Ｄ）分布は、身体の体液および組織の全体にわたる物質の分散または散在であり；（Ｍ）代謝（または生体内分解）は、親化合物の娘代謝産物への不可逆性形質転換であり；また（Ｅ）排泄（または除去）は、体からの物質の除去を示す。希少症例では、一部の薬物は、体組織内に不可逆的に蓄積する。
薬学的に許容可能な溶媒和物：用語「薬学的に許容可能な溶媒和物」は、本明細書で使用される場合、適切な溶媒の分子が結晶格子中に取り込まれた、本発明の化合物を意味する。適切な溶媒は、投与される用量で生理学的に許容できる。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製してもよい。適切な溶媒の例として、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、および三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジルなど、が挙げられる。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と称される。
物理化学的：本明細書で使用される「物理化学的」は、物理および／または化学特性を意味するかまたはそれに関する。
多能性の：本明細書で使用される「多能性の」は、様々な条件下で、３つすべての胚葉に特徴的な細胞型に分化する発生能を有する細胞を示す。
多能性：本明細書で使用される「多能性」または「多能性状態」は、細胞が３つすべての胎児胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）に分化する能力を有する場合の細胞の発生能を示す。
予防する：本明細書で使用される用語「予防する」は、感染、疾患、障害および／または状態の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状、特徴、または臨床症状の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状、特徴、または徴候の発症を部分的または完全に遅延させること；感染、特定の疾患、障害および／または状態からの進行を部分的または完全に遅延させること；ならびに／あるいは感染、疾患、障害、および／または状態に関連した病理を発生させるリスクを低下させること、を示す。
プロドラッグ：本開示はまた、本明細書に記載の化合物のプロドラッグを含む。本明細書で使用される「プロドラッグ」は、化学的または物理的変化時に治療薬として作用する物質、分子または実体を示唆する形態である、任意の物質、分子または実体を示す。プロドラッグは、何らかの方法で共有結合または隔離させることができ、哺乳類対象への投与前、投与時または投与後、活性薬剤部分を放出するかまたはそれに変換される。プロドラッグは、化合物中に存在する官能基を、修飾基がルーチン的な操作またはインビボのいずれかで切断されて親化合物になるような方法で修飾することにより、調製することができる。プロドラッグは、ヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、またはカルボキシル基が、哺乳類対象に投与される場合、切断により、各々、遊離したヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、またはカルボキシル基を形成する任意の基に結合される場合の化合物を含む。プロドラッグの調製および使用については、Ｔ．ヒグチ（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびＶ．ステラ（Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ）、Ａ．Ｃ．Ｓ．シンポジウム・シリーズ（Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）の「新規送達システムとしてのプロドラッグ（Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、第１４巻、および「薬物設計におけるバイオリバーシブルな担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）」、エドワード Ｂ．ロシェ（Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ）、米国薬学会およびペルガモンプレス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）」、１９８７年（これらの双方は全体として参照により本明細書に援用される）の中で考察されている。
増殖する：本明細書で使用される用語「増殖する」は、成長するか、拡大するかまたは増加するかあるいは迅速な成長、拡大または増加を引き起こすことを意味する。「増殖性」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性に抗するかまたは適さない特性を有することを意味する。
前駆細胞：本明細書で使用される用語「前駆細胞」は、分化によって発生可能な細胞よりも高い発生能を有する細胞を示す。
タンパク質切断部位：本明細書で使用される「タンパク質切断部位」は、アミノ酸鎖の制御された切断が、化学的、酵素的または光化学的手段によって行うことができる場合の部位を示す。
タンパク質切断シグナル：本明細書で使用される「タンパク質切断シグナル」は、切断用にポリペプチドにフラッグを付ける（ｆｌａｇｓ）かまたはマークする（ｍａｒｋｓ）少なくとも１つのアミノ酸を示す。
目的のタンパク質：本明細書で使用される用語「目的のタンパク質」または「所望されるタンパク質」は、本明細書に提供されるもの、ならびにその断片、突然変異体、変異体、および改変物（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）を含む。
近位：本明細書で使用される用語「近位」は、中心あるいは目的のポイントまたは領域により近く位置されることを意味する。
精製された：本明細書で使用される「精製する」、「精製された」、「精製」は、望まれない成分、材料汚染、混合物または不完全さから実質的に純化または清澄化することを意味する。
反復遺伝子導入：本明細書で使用される用語「反復遺伝子導入」は、同じ細胞培養液へのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの複数回にわたる遺伝子導入を示す。細胞培養液には、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回またはそれより多い回数、遺伝子導入を行うことができる。
再プログラム化：本明細書で使用される「再プログラム化」は、細胞または細胞集団の発生能を元に戻す過程を示す。
再プログラム化因子：本明細書で使用される用語「再プログラム化因子」は、タンパク質、ＲＮＡまたは小分子などの発生能変更因子を示し、その発現は細胞の分化度が低い状態または未分化状態への再プログラム化に寄与する。
試料：本明細書で使用される用語「試料」または「生物学的試料」は、その組織、細胞または構成部分のサブセット（例えば、体液、限定はされないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血液、尿、膣液および精液を含む）を示す。試料は、生物全体から調製されるホモジネート、可溶化液または抽出物、あるいはその組織、細胞または構成部分、またはその画分もしくは部分のサブセット（限定はされないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液や、皮膚、呼吸器、腸管、および泌尿生殖路の外部切片、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、器官を含む）をさらに含んでもよい。さらに、試料は、媒体、例えば普通ブイヨンまたはゲルを示し、それは細胞成分、例えばタンパク質または核酸分子を含有してもよい。
シグナル配列：本明細書で使用される語句「シグナル配列」は、タンパク質の輸送または局在化を誘導可能な配列を示す。
単回単位用量：本明細書で使用される「単回単位用量」は、一回用量／一回／単一経路／単一接触点、すなわち単一の投与事象で投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｄ）任意の治療薬の用量である。
類似性：本明細書で使用される用語「類似性」は、ポリマー分子間、例えばポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的関連性を示す。ポリマー分子相互間のパーセント類似性の計算は、当該技術分野で理解されているように、パーセント類似性の計算では保存的置換が考慮される点を除けば、パーセント同一性の計算と同様にして行うことができる。
体細胞：本明細書で使用される「体細胞」は、胚細胞、着床前胚中に存在するかまたはそれから得られる細胞、またはかかる細胞のインビトロ増殖から得られる細胞と異なる任意の細胞を示す。
体性幹細胞：本明細書で使用される「体性幹細胞」は、胎児、若年性および成体組織を含む非胚性組織に由来する任意の多能性または複能性幹細胞を示す。
体性多能性細胞：本明細書で使用される「体性多能性細胞」は、その発生能が多能性状態の場合に変更されていた体細胞を示す。
分割用量：本明細書で使用される「分割用量」は、単回単位用量または全一日用量の２回以上の用量への分割である。
安定な：本明細書で使用される「安定な」は、反応混合物から有用な純度になるまで単離状態で生存する程度に十分に強固であり、また好ましくは有効な治療薬へ調合することが可能な化合物を示す。
安定化された：本明細書で使用される用語「安定化する」、「安定化された」、「安定化領域」は、安定化させるかまたは安定になることを意味する。
幹細胞：本明細書で使用される用語「幹細胞」は、自己再生の特性を有し、かつ、特異的な発生能を伴わずに複数の細胞型に分化する発生能を有する（ａｈｓ）、未分化状態または部分的に分化された状態にある細胞を示す。幹細胞は、増殖能があり得、より多くのかかる幹細胞を発生させる一方、その発生能を維持する能力があり得る。
対象：本明細書で使用される用語「対象」または「患者」は、例えば、実験、診断、予防、および／または治療を目的とした、本発明に記載の組成物が投与可能な任意の生体を示す。典型的な対象は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトなどの哺乳類）および／または植物を含む。
実質的に：本明細書で使用される用語「実質的に」は、目的の特徴または特性のすべてまたはほぼすべての範囲または程度を示す定性的条件を示す。生物学的技術の当業者は、生物学的および化学的現象が、もし存在すれば、完了に至る、および／または完成へと進む、あるいは絶対的な結果を得るかまたはそれを回避することがまれであることを理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、多数の生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的欠如をとらえるために本明細書で使用される。
実質的に等しい：本明細書で使用される場合、それが投与間に時間差があることに関係することから、同用語は±２％を意味する。
実質的に同時に：本明細書で使用される場合、それが投与が複数回であることに関係することから、同用語は２秒以内を意味する。
〜を患う：疾患、障害、および／または状態「を患う」個体は、疾患、障害、および／または状態のうちの１つ以上の症状であると診断されているか、またはそれらを示している。
〜に罹りやすい：疾患、障害、および／または状態「に罹りやすい」個体は、疾患、障害、および／または状態の症状であると診断されておらず、および／またはそれらを示していない場合があるが、疾患またはその症状を発生する傾向を抱える。一部の実施形態では、疾患、障害、および／または状態（例えばがん）に罹りやすい個体は、以下のもの、すなわち、（１）疾患、障害、および／または状態の発生に関連した遺伝子突然変異；（２）疾患、障害、および／または状態の発生に関連した遺伝子多型；（３）疾患、障害、および／または状態に関連したタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増強および／または低下；（４）疾患、障害、および／または状態の発生に関連した習慣および／または生活様式；（５）疾患、障害、および／または状態の家族歴；ならびに（６）疾患、障害、および／または状態の発生に関連した微生物への暴露および／または感染、のうちの１つ以上によって特徴づけられる場合がある。一部の実施形態では、疾患、障害、および／または状態に罹りやすい個体は、疾患、障害、および／または状態を発生することになる。一部の実施形態では、疾患、障害、および／または状態に罹りやすい
個体は、疾患、障害、および／または状態を発生しないことになる。
徐放：本明細書で使用される用語「徐放」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物の放出特性を示す。
合成：用語「合成」は、人手により生成され、調製され、および／または作製されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であってもよい。
標的化細胞：本明細書で使用される「標的化細胞」は、目的の任意の１つ以上の細胞を示す。細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュであるいは生物の組織または器官において見出すことができる。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトおよび最も好ましくは患者であってもよい。
治療薬：用語「治療薬」は、対象に投与される場合、治療、診断、および／または予防効果を有し、かつ／あるいは所望される生物学的および／または薬理学的効果を誘発する任意の作用物質を示す。
治療有効量：本明細書で使用される用語「治療有効量」は、感染、疾患、障害、および／または状態の症状に対して、治療し、改善し、発症を診断し、予防し、かつ／あるいは遅延させるための、感染、疾患、障害、および／または状態を患っているかまたはそれに罹りやすい対象に投与される場合に十分な、送達されるべき作用物質（例えば、核酸、薬剤、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
治療的に有効な転帰：本明細書で使用される用語「治療的に有効な転帰」は、感染、疾患、障害、および／または状態の症状に対して、治療し、改善し、発症を診断し、予防し、かつ／あるいは遅延させるための、感染、疾患、障害、および／または状態を患っているかまたはそれに罹りやすい対象において十分な転帰を意味する。
全一日用量：本明細書で使用される「全一日用量」は、２４時間の期間内に与えられる量または処方される量である。それは、単回単位用量として投与してもよい。
全能性：本明細書で使用される「全能性」は、成人の体ならびに胎盤を含む胚外組織の中に見出される細胞のすべてを作るような発生能を有する細胞を示す。
転写因子：本明細書で使用される用語「転写因子」は、例えば転写の活性化または抑制によってＤＮＡのＲＮＡへの転写を調節する、ＤＮＡ結合タンパク質を示す。一部の転写因子が転写単独の調節をもたらす一方、それら以外は他のタンパク質と連携して作用する。一部の転写因子は、特定の条件下で転写の活性化および抑制の双方を行うことができる。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域内の特定の共通配列に酷似した１つ以上の特定の標的配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を、単独でまたは他の分子と複合体を形成して調節し得る。
転写：本明細書で使用される用語「転写」は、外因性核酸を細胞に導入するための方法を示す。遺伝子導入の方法は、限定はされないが、化学的方法、物理的処理およびカチオン性脂質または混合物を含む。
分化転換本明細書で使用される「分化転換」は、一種の分化細胞の、特性を同定することなく、かつそれらの表現型を他の完全に分化した細胞の表現型に変化させる能力を示す。
治療する：本明細書で使用される用語「治療する」は、特定の感染、疾患、障害、およ
び／または状態の１つ以上の症状または特徴に対して、部分的または完全に軽減し、寛解し、改善し、緩和し、発症を遅延させ、進行を阻害し、重症度を低下させ、および／または発生率を低下させることを示す。例えば、がんを「治療すること（処置すること）」は、腫瘍の生存、成長、および／または伝播を阻害することを示してもよい。治療としては、疾患、障害、および／または状態に関連した病理を発生させるリスクを低下させることを目的として、疾患、障害、および／または状態の徴候を呈さない対象、ならびに／あるいは、疾患、障害、および／または状態の初期徴候のみを呈する対象に投与してもよい。
未修飾：本明細書で使用される「未修飾」は、何らかの方法で変更を受ける前の任意の物質、化合物または分子を示す。未修飾は、常にではないが、生体分子の野生型または天然型を示し得る。分子は一連の修飾を受ける場合があり、それにより、各修飾分子はその後の修飾における「未修飾」開始分子として機能し得る。
均等物および範囲
当業者は、単なるルーチン的な実験を用いて、本明細書に記載の本発明に従う特定の実施形態に対する多数の均等物を理解するか、または確認できることになる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることが意図されていないとはいえ、特許請求の範囲の中で示される通りである。
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、文脈から違った意味で指示されない限り、またはそれ以外として文脈から明白でない限り、１つまたは複数を意味し得る。あるグループの１つ以上のメンバー間で「または」を含む特許請求の範囲または特許明細書は、グループメンバーの１つ、複数、または全部が、所与の生成物または方法において存在する、使用される、またはそれに違った意味で関連する場合、文脈から違った意味で指示されない限り、またはそれ以外として文脈から明白でない限り、充足されると考えられる。本発明は、まさにグループの１つのメンバーが、所与の生成物または方法において存在する、使用される、またはそれに違った意味で関連する場合の実施形態を含む。本発明は、グループメンバーの複数または全部が、所与の生成物または方法において存在する、使用される、またはそれに違った意味で関連する場合の実施形態を含む。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が、オープンであることが意図され、追加的な要素またはステップの包含を許容するが必要としないことも注目される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書で使用される場合、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」もまた、このように包含され、開示される。
範囲が与えられる場合、終了点は含まれる。さらに、範囲として表される値は、別段の指示がない限りまたは代わりとして文脈および当業者の理解から明白である場合、本発明の異なる実施形態における記述された範囲内の任意の特定の値または部分範囲、文脈において明確に別段の指示がない限りでは範囲の下限値の単位の１０分の１まで、と見なすことができることは理解されるべきである。
さらに、先行技術の範囲内に該当する本発明の任意の特定の実施形態が、任意の１つ以上の特許請求の範囲から明示的に除外され得ることは理解されるべきである。かかる実施形態が当業者に既知であると見なされることから、それらは、たとえ除外が本明細書中に明示されなくても除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の核酸またはそれによってコードされるタンパク質；任意の生成方法；任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関わるか否か、何らかの理由において、任意の１つ以上の特許請求の範囲から除外され得る。
あらゆる引用されるソース、例えば、参考文献、出版物、データベース、データベース
エントリ、および本明細書に引用される技術は、たとえ引用中に明示的に記述されなくても、参照により本願中に援用される。引用されるソースおよび本願の記述に対する紛争が生じる場合、本願中の記述によって調整されるものとする。
セクションおよび表の見出しは、限定することが意図されていない。
（実施例）
実施例１．修飾ｍＲＮＡの作製
本発明に記載の修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）は、標準的な実験方法および材料を用いて作製してもよい。目的の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、強力なコザック（Ｋｏｚａｋ）翻訳開始シグナルを有し得る５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／またはポリＡテールの鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含みうるα−グロビン３’ＵＴＲによって隣接させてもよい。修飾ｍＲＮＡは、修飾により、細胞の自然免疫応答を低下することができる。細胞応答を低下させるための修飾は、プソイドウリジン（Ψ）および５−メチル−シチジン（５ｍｅＣ、５ｍｃまたはｍ５Ｃ）を含んでもよい（カリコ Ｋ．（Ｋａｒｉｋｏ Ｋ．）ら著、イミュニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、第２３巻、ｐ．１６５−７５（２００５年）、カリコ Ｋ．（Ｋａｒｉｋｏ Ｋ．）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、第１６巻、ｐ．１８３３−４０（２００８年）、アンダーソン Ｂ．Ｒ．（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＢＲ）ら著、ＮＡＲ（２０１０年）（これらの各々はその全体が参照により本明細書に援用される）を参照）。
ＯＲＦはまた、様々な上流または下流への付加（限定はされないが、β−グロビン、タグなど）を含んでもよく、限定はされないが、ＤＮＡ２．０（メンローパーク、カルフォルニア州）などの最適化サービスから注文することができ、またＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローニング部位を含んでもよい。構築物を受け取る際、それは化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）に再構成し、形質転換することができる。
本発明においては、エヌイービー（ＮＥＢ）のＤＨ５−αコンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）を使用する。形質転換は、１００ｎｇのプラスミドを使用し、エヌイービー（ＮＥＢ）の使用説明書に従って実施する。プロトコルは、以下のとおりである。
１．氷上のエヌイービー（ＮＥＢ）の５−αコンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞のチューブを１０分間解凍する。
２．プラスミドＤＮＡを１ｐｇ〜１００ｎｇ含有する１〜５μｌを細胞混合物に添加する。慎重にチューブを４〜５回フリックし、細胞とＤＮＡを混合する。ボルテックスしない。
３．混合物を氷上に３０分間置く。混合しない。
４．４２℃で正確に３０秒間熱ショックを与える。混合しない。
５．氷上に５分間置く。混合しない。
６．室温ＳＯＣの９５０μｌをピペットし、混合物に入れる。
７．３７℃で６０分間置く。激しく振盪するか（２５０ｒｐｍ）または回転する。
８．選択プレートを３７℃に温める。
９．チューブをフリックし、反転させることにより、細胞を完全に混合する。
あるいは、３０℃で２４〜３６時間または２５℃で４８時間インキュベートする。
次いで、単一のコロニーを使用し、適切な抗生物質を用いて５ｍｌのＬＢ成長培地に接種し、次いで５時間成長させておく（２５０ＲＰＭ、３７℃）。次いで、これを使用し、２００ｍｌの培地に接種し、同一条件下で一晩成長させておく。
プラスミド（最大８５０μｇ）を単離するため、マキシプレップ（ｍａｘｉ ｐｒｅｐ）は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ハイピュア・マキシプレップ・キット（ＨｉＰｕｒｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア州）を使用し、製造業者の使用説明書に従って実施する。
インビトロ転写（ＩＶＴ）用のｃＤＮＡを作製するため、まずプラスミドを、ＸｂａＩなどの制限酵素を使用して直線化する。ＸｂａＩを用いる典型的な制限消化は、次のもの、すなわち、プラスミド１．０μｇ；１０×緩衝液１．０μｌ；ＸｂａＩ１．５μｌ；ｄＨ２Ｏ最大１０μｌ；３７℃で１時間インキュベート、を含むことになる。５μｇ未満の実験室規模で実施する場合、反応物は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア州）を使用し、製造業者の使用説明書に従って精製する。より大規模な精製は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製の標準的なピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲキット（ＰＣＲ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア州）など、より大きな負荷能力を有する製品を用いて行う必要がありうる。精製後、直線化されたベクターは、ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動を用いて分析し、直線化を確認する。
非限定例として、Ｇ−ＣＳＦは、目的のポリペプチドを示し得る。実施例１〜５において概説されるステップの中で用いられる配列は表３に示す。開始コドン（ＡＴＧ）が表３の各配列中に下線で示されていることは注目すべきである。
表３．Ｇ−ＣＳＦ配列

実施例２：ｃＤＮＡ作製のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡを調製するためのＰＣＲ法は、カパ・バイオシステムズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（ウーバン、マサチューセッツ州）製の２×カパ（ＫＡＰＡ）ハイファイ（ＨＩＦＩ）（商標）ホットスタート・レディーミックス（ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ）を使用して実施した。このシステムは、２×カパ（ＫＡＰＡ）レディーミック
ス（ＲｅａｄｙＭｉｘ）１２．５μｌ；フォワードプライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；リバースプライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇ；および２５．０μｌに希釈したｄＨ２Ｏ、を含む。反応条件は、９５℃で５分間および９８℃、２５サイクルで２０秒間、次いで５８℃で１５秒間、次いで７２℃で４５秒間、次いで７２℃で５分間、次いで４℃で終了まで、である。
本発明のリバースプライマーは、ｍＲＮＡにおいて、ポリＡ１２０の代わりにポリＴ１２０を組み込んでいる。より長いまたはより短いポリ（Ｔ）トラクトを有する他のリバースプライマーを用いて、ｍＲＮＡにおけるポリ（Ａ）テールの長さを調節してもよい。
反応物は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア州）を使用し、製造業者の使用説明書に従って精製する（最大５μｇ）。より大規模な反応には、より大規模な能力を有する製品を用いた精製が必要となる。精製後、ｃＤＮＡは、ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動により分析し、ｃＤＮＡが予想されたサイズであることを確認する。次いで、インビトロ転写反応に進む前に、ｃＤＮＡに対して配列決定分析を実施する。
実施例３．インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロ転写反応では、修飾ヌクレオチドまたは修飾ＲＮＡを有するｍＲＮＡを作製する。組み入れる（ｉｎｐｕｔ）ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスは、天然および非天然ＮＴＰを用いて内製する。
典型的なインビトロ転写反応は、次のものを含む。
鋳型ｃＤＮＡ １．０μｇ
１０×転写緩衝液（４００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１９０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン） ２．０μｌ
カスタムＮＴＰ（各々２５ｍＭ） ７．２μｌ
リボヌクレアーゼ阻害剤 ２０Ｕ
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ３０００Ｕ
ｄＨ２Ｏ 最大２０．０μｌ
３７℃で３時間〜５時間のインキュベーション
粗製ＩＶＴミックスは、翌日の精製用に４℃で一晩貯蔵してもよい。次いで、１Ｕのリボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼを使用し、元の鋳型を消化する。３７℃でのインキュベーションの１５分後、ｍＲＮＡは、アムビオン（Ａｍｂｉｏｎ）製メガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（オースティン、テキサス州）を用いて、製造業者の使用説明書に従って精製する。このキットは、最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。精製後、ＲＮＡは、ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動により分析し、ＲＮＡが適切なサイズでありかつＲＮＡの分解が全く生じていないことを確認する。
実施例４．ｍＲＮＡの酵素によるキャッピング
混合物がＩＶＴ ＲＮＡを６０μｇ〜１８０μｇおよびｄＨ２Ｏを最大で７２μｌ含む場合、ｍＲＮＡのキャッピングは次のように実施する。混合物は、６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、次いで直ちに氷に移す。
次いで、プロトコルは、１０×キャッピング緩衝液（０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍＭ ＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭ Ｓ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；リボヌクレアーゼ阻害剤（１００Ｕ）；２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワク
シニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ（最大２８μｌ）の混合および６０μｇのＲＮＡに対して３０分間または１８０μｇのＲＮＡに対して最大２時間の３７℃でのインキュベーションを含む。
次いで、ｍＲＮＡは、アムビオン（Ａｍｂｉｏｎ）製メガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（オースティン、テキサス州）を用いて、製造業者の使用説明書に従って精製する。精製後、ＲＮＡは、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（商標）（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動により分析し、ＲＮＡが適切なサイズでありかつＲＮＡの分解が全く生じていないことを確認する。ＲＮＡ産物はまた、配列決定のために逆転写ＰＣＲを走らせてｃＤＮＡを生成することにより、配列決定してもよい。
実施例５．ポリＡテーリング反応
ｃＤＮＡ中にポリＴが存在しない場合、ポリＡテーリング反応は、最終産物を精製する前に実施する必要がある。これは、キャッピングされたＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）；リボヌクレアーゼ阻害剤（２０Ｕ）；１０×テーリング緩衝液（０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭ ＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ（最大１２３．５μｌ）を混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることによって行う。ポリＡテールが既に転写物中に存在する場合、テーリング反応はスキップし、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）製メガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（オースティン、テキサス州）（最大５００μｇ）を用いた精製に直接進んでもよい。ポリＡポリメラーゼは、好ましくは、酵母中で発現される組換え酵素である。
本明細書中に記載の実施した試験においては、ポリＡテールは、ＩＶＴ鋳型中にコードされ、１６０ヌクレオチド長を含む。しかし、ポリＡテーリング反応の処理能力または完全性が、正確に１６０ヌクレオチドを常にもたらすとは限らない場合があることは理解されるべきである。したがって、約１６０ヌクレオチド、例えば、約１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４または１６５のポリＡテールは、本発明の範囲内に含まれる。
実施例６．天然５’キャップおよび５’キャップ類似体
修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、製造業者のプロトコルに従い、以下の化学ＲＮＡキャップ類似体、すなわち、３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）を用いたインビトロ転写反応の間に同時に完了し、５’−グアノシンキャップ構造を作製してもよい。修飾ＲＮＡの５’−キャッピングは、転写後にワクシニアウイルスキャッピング酵素：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）を用いて完了し、「Ｃａｐ０」構造を作製してもよい。Ｃａｐ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼの双方を用いて作製し、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルを作製してもよい。Ｃａｐ２構造は、Ｃａｐ１構造から作製し、次いで２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いて５’−末端から３番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化を行ってもよい。Ｃａｐ３構造は、Ｃａｐ２構造から作製し、次いで２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いて５’−末端から４番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化を行ってもよい。酵素は、好ましくは、組換え供給源に由来する。
哺乳類細胞に遺伝子導入する際、修飾ｍＲＮＡｓは、１２〜１８時間または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間または７２時間超の間にかけて安定性を有する。
実施例７．キャッピング
Ａ．タンパク質発現アッセイ
ＡＲＣＡ（３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）キャップ類似体またはＣａｐ１構造を有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（配列番号３０で示され、配列内に示されない約１６０ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｔｏｄｉｅｓ）長のポリＡテールを有するｍＲＮＡ配列）は、等しい濃度でヒト一次ケラチノサイトに遺伝子導入することができる。遺伝子導入の６、１２、２４および３６時間後、培地に分泌されたＧ−ＣＳＦの量は、ＥＬＩＳＡによりアッセイしてもよい。より高レベルのＧ−ＣＳＦを培地に分泌する合成ｍＲＮＡｓであれば、より高度な翻訳的に適格な（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）キャップ構造を有する合成ｍＲＮＡに対応することになる。
Ｂ．純度分析と合成
ＡＲＣＡキャップ類似体またはＣａｐ１構造の粗合成産物を有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（配列番号３０で示され、配列内に示されていない約１６０ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｔｏｄｉｅｓ）長のポリＡテールを有するｍＲＮＡ配列）は、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を用いて、純度について比較してもよい。電気泳動による、単一の明確なバンドを有する合成ｍＲＮＡは、複数のバンドまたはストリーキング（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）バンドを有する合成ｍＲＮＡと比較して、より高い純度の産物に対応する。単一のＨＰＬＣピークを有する合成ｍＲＮＡのであっても、より高い純度の産物に対応することになる。より高い効率を有するキャッピング反応であれば、より純粋なｍＲＮＡ集団をもたらすことになる。
Ｃ．サイトカイン分析
ＡＲＣＡキャップ類似体またはＣａｐ１構造を有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（配列番号３０で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチド長のポリＡテールを伴う）は、複数の濃度でヒト一次ケラチノサイトに遺伝子導入することができる。遺伝子導入の６、１２、２４および３６時間後、培地に分泌されたＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βなどの炎症促進性サイトカインの量は、ＥＬＩＳＡによりアッセイしてもよい。より高レベルの炎症促進性サイトカインを培地に分泌する合成ｍＲＮＡであれば、免疫活性化キャップ構造を有する合成ｍＲＮＡに対応することになる。
Ｄ．キャッピング反応効率
ＡＲＣＡキャップ類似体またはＣａｐ１構造を有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（配列内に示されない約１６０ヌクレオチド長のポリＡテールを伴う、配列番号３０で示されるｍＲＮＡ配列）は、キャップされたｍＲＮＡヌクレアーゼの処理後、キャッピング反応効率について、ＬＣ−ＭＳにより分析することができる。キャップされたｍＲＮＡのヌクレアーゼ処理であれば、遊離ヌクレオチドとＬＣ−ＭＳによって検出可能なキャップされた５’−５−三リン酸キャップ構造との混合物が得られることになる。キャップされた産物のＬＣ−ＭＳスペクトルに対する量は、反応物からの全ｍＲＮＡのパーセントとして表現可能であり、その場合、キャッピング反応効率に対応することになる。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造であれば、ＬＣ−ＭＳにより、より多量のキャップされた産物を有することになる。
実施例８．修飾ＲＮＡまたは逆転写ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々の修飾ＲＮＡ（２０μｌの量中、２００〜４００ｎｇ）または逆転写ＰＣＲ産物（
２００〜４００ｎｇ）は、非変性の１．２％アガロースイーゲル（Ａｇａｒｏｓｅ Ｅ−Ｇｅｌ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア州）上のウェルに負荷し、製造業者のプロトコルに従って１２〜１５分間実行する。
実施例９．ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）での修飾ＲＮＡの定量およびＵＶスペクトルデータ
ＴＥ緩衝液（１μｌ）中の修飾ＲＮＡは、ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）でのＵＶ吸光度読み取りに使用し、インビトロ転写反応から得られた各修飾ＲＮＡの収量を定量化する。
実施例１０．タンパク質発現のためのスクリーニング方法
Ａ．エレクトロスプレーイオン化
対象に投与した修飾ＲＮＡによってコードされたタンパク質を含有し得る生物学的試料は、調製し、１、２、３または４つの質量分析計を用い、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）についての製造業者のプロトコルに従って分析する。生物学的試料はまた、タンデム型ＥＳＩ質量分析システムを用いて分析することができる。
タンパク質断片、または全タンパク質のパターンは、所与のタンパク質における既知の対照と比較し、同一性を比較により判定する。
Ｂ．マトリックス支援レーザー脱離／イオン化
対象に投与した修飾ＲＮＡによってコードされたタンパク質を含有し得る生物学的試料は、調製し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）についての製造業者のプロトコルに従って分析する。
タンパク質断片、または全タンパク質のパターンは、所与のタンパク質における既知の対照と比較し、同一性を比較により判定する。
Ｃ．液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析
修飾ＲＮＡによってコードされたタンパク質を含有し得る生物学的試料は、トリプシン酵素で処理し、内部に含有されるタンパク質を消化することができる。得られたペプチドは、液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって分析する。ペプチドは、質量分析計において断片化し、コンピュータアルゴリズムにより、タンパク質配列データベースにマッチし得る診断パターンが得られる。消化された試料は、希釈することで、所与のタンパク質において１ｎｇ以下の出発物質を得ることができる。単純な緩衝液バックグラウンド（例えば、水または揮発性塩）を有する生物学的試料は、溶液中（ｉｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ）消化を誘導するのに適する一方、より複雑なバックグラウンド（例えば、洗剤、不揮発性塩、グリセロール）では、試料分析を容易にするための追加的な精製ステップが必要である。
タンパク質断片、または全タンパク質のパターンは、所与のタンパク質における既知の対照と比較し、同一性を比較により判定する。
実施例１１．ＬＤＬ−Ｒ１突然変異ｍＲＮＡ配列
ＰＣＳＫ９への結合が欠損した１つ以上のＬＤＬ−Ｒタンパク質をコードする配列は、表４に示す。ＲＮＡの開始部位は、下線が引かれた「ＡＵＧ」であり、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは太字部である。
表４．ＬＤＬ−Ｒ配列

実施例１２．ＬＤＬＲ１タンパク質配列
１つ以上の突然変異（ｍｕｔａｎ）ＬＤＬ−Ｒ１タンパク質の配列は、表５に示す。
表５．タンパク質配列

実施例１３．Ｃｙｐ７ａｌ配列
ＣＹＰ７Ａ１タンパク質のオープンリーディングフレームをコードする配列、ならびに５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、表６に示す。コード化タンパク質の配列もまた示す。
表６．ＣＹＰ７ａ１配列
実施例１４．ＮＡＳＨ ＨＣＣ動物モデル
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを含む化合物は、非アルコール性（ｎｏｎ−ａｌｃｏｌｏｌｉｃ）脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に対する動物モデルにおいて試験することができる。１つのモデルは、スタム（ＳＴＡＭ）（商標）マウス（ステリック・インスティチュート・アンド・カンパニー（Ｓｔｅｌｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ａｎｄ Ｃｏ）、東京、日本）の使用を含む。
実施例１５〜２０における材料
ＬＤＬＲタンパク質のオープンリーディングフレーム、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のオープンリーディングフレーム、およびルシフェラーゼタンパク質のオープンリーディングフレームをコードする配列ならびに５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、表７に示す。ＲＮＡの開始部位は、下線が引かれた「ＡＵＧ」であり、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは太字部である。
表７．ＬＤＬＲ、ｍＣｈｅｒｒｙおよびルシフェラーゼ配列

実施例１５．哺乳類におけるＬＤＬＲインビボ試験
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体（ＬＤＬＲ）ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ配列；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾；５’キャップ、Ｃａｐ１；同配列で示されない１６０ヌクレオチドのポリＡテール）は、８．０μｇのｍＲＮＡをダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）と最終容量が０．２ｍＬになるまで混合することにより、リポフェクタミン２０００（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）と複合させた。
リポフェクタミン２０００（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）は、ＤＭＥＭで１２．５倍希釈し、等容量の希釈したＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ溶液と混合させた。試料は、室温で５分間インキュベートし、容量０．１ｍＬの複合させたｍＲＮＡ混合物を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス３匹の各尾静脈に注射した。各動物は、総用量２．０μｇのＬＤＬ受容体ｍＲＮＡを受けた。６時間後、動物は、屠殺し、脾臓を除去した。脾細胞は、標準的手順に従って（予め赤血球を溶解させずに）単離し、等量の、ヒトＬＤＬ受容体に特異的なＩｇＧかまたは対照としての非免疫ＩｇＧのいずれかで染色した。
ＬＤＬ受容体の発現は、ＣＤ１１ｂ＋脾細胞集団に対するゲーティングを伴うフローサイトメトリーにより評価した。図４に示されるように、インビボでのＣＤ１１ｂ＋脾細胞集団におけるＬＤＬ受容体の発現は、ＬＤＬ受容体ＩｇＧ（ＬＤＬＲ ＩｇＧ）で染色した３つの異なるマウスの各々において、非免疫ＩｇＧ（非免疫ＩｇＧ）で染色した細胞と比較して、右方にシフトしたピークの存在により、明白であった。
リポフェクタミン単独で処理したマウスにおいては、ＬＤＬ受容体に特異的なピークは全く認められず、染色は非免疫ＩｇＧの場合に認められたものと同様であった。
実施例１６．マウスにおけるインビボでのＬＤＬＲの発現
ＬＤＬＲ−／−マウスを使用し、インビボでのＬＤＬＲ ｍｍＲＮＡの発現について試験する。ＬＤＬＲ ｍｍＲＮＡは、注射によりＬＤＬＲ−／−マウスに投与する。マウス由来の組織は、ＬＤＬＲ発現について試験する。マウス組織のウエスタンブロット解析を行い、ＬＤＬＲ ｍｍＲＮＡ投与の結果としてのＬＤＬＲタンパク質発現を探索する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲをマウス組織に対して実施し、ＬＤＬＲの遺伝子発現を探索する。
実施例１７．ペプチド同一性の確認
タンパク質は、ペプチドの同一性を確認するため、定量的ＬＣ−多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を伴う質量分析を備えた液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて評価することができる。
本明細書に記載の任意のタンパク質標的の同一性は、定量的ＬＣ−多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイを伴う質量分析を備えた液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）（バイオグノーシスＡＧ（Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ ＡＧ）、シュリーレン、スイス）を用いて評価することができる。修飾ｍＲＮＡから発現されたタンパク質を含有するヒーラ細胞可溶化物は、細胞可溶化物中のペプチドの同一性を確認するため、定量的ＬＣ−ＭＲＭアッセイを伴うＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（バイオグノーシスＡＧ（Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ ＡＧ）、シュリーレン、スイス）を用いて評価する。同定されたペプチド断片は、当該技術分野で既知および／または記載の方法を用いて、アイソフォームを含む既知のタンパク質に対して比較する。
Ａ．試料調製
溶解用緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）中の各試料中のタンパク質は、５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）とともに３７℃で１時間インキュベーショントすることにより低下する。アルキル化は、室温、暗所で３０分間、１０ｍＭヨードアセトアミドを用いて行う。タンパク質は、１：５０のプロテアーゼ：タンパク質比で、トリプシン（配列グレード、プロメガコーポレーション（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マディソン、ウィスコンシン州）を用いてペプチドに消化する。消化は、３７℃で一晩行う（総消化時間は１２時間である）。ペプチドは、質量分析による分析で、Ｃ１８スピンカラム（ザ・ネスト・グループ（Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ）、サウスボロー、マサチューセッツ州）を用い、製造業者の使用説明書に従って浄化する。ペプチドは、完全乾燥になるまで乾燥させ、ＬＣ溶媒Ａ（１％アセトニトリル、０．１％ギ酸（ＦＡ））に再懸濁する。すべての溶媒は、シグマ・アルドリッジ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）（登録商標）（セントルイス、ミズーリ州）からのＨＰＬＣ−グレードであり、すべての化学物質は、特に指定のない限り、シグマ・アルドリッジ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）（登録商標）（セントルイス、ミズーリ州）から得られる。
Ｂ．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびＬＣ−ＭＲＭ
ペプチドは、あらゆる質量分析による分析において、プロキセオン（Ｐｒｏｘｅｏｎ）製イージーｎＬＣ（Ｅａｓｙ ｎＬＣ）ナノ液体クロマトグラフィーシステム上の充填したＣ１８カラム（マジック・エーキュー（Ｍａｇｉｃ ＡＱ）、３ｕｍの粒径、２００Åの孔径、ミクロム・バイオリソーシーズ・インコーポレイテッド（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ）（オーバーン、カリフォルニア州）；１１ｃｍのカラム長、７５ｕｍの内径、ニュー・オブジェクティブ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）（ウーバン、マサチューセッツ州））に注入する。ＬＣ溶媒は、Ａ：０．１％ＦＡとともに、水中、１％アセトニトリル；Ｂ：０．１％ＦＡとともに、アセトニトリル中、３％の水、である。ショットガン分析におけるＬＣ勾配は、１２０分で５〜３５％の溶媒Ｂ、次いで、２分で３５〜１００％の溶媒Ｂおよび８分で１００％の溶媒Ｂ、である（総勾配長さは１３０分である）。ペプチド発見にかけてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳショットガンは、標準的なナノ−エレクトロスプレー源を備えた、サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））（ビレリカ、マサチューセッツ州）製キュー・イグザクティブ（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ）質量分析計上で実行した。ＬＣ−ＭＲＭにおけるＬＣ勾配は、３０分で５〜３５％の溶媒Ｂ、次いで２分で３５〜１００％の溶媒Ｂおよび８分で１００％溶媒Ｂ、である（総勾配長さは４０分である）。サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（サーモフィッシャーサイエンティフィッ
ク（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））（ビレリカ、マサチューセッツ州）製ティーエスキュー・バンテージ（ＴＳＱ Ｖａｎｔａｇｅ）三連四重極型質量分析計は、標準的なナノ−エレクトロスプレー源を備えている。再校正用の不定期ＭＲＭモードでは、それは２０ｍｓの滞留時間／トランジションで操作する。試料全体におけるペプチドの相対定量については、ティーエスキュー・バンテージ（ＴＳＱ Ｖａｎｔａｇｅ）は、４分の取得ウィンドウの長さ（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ ｌｅｎｇｔｈ）での定期ＭＲＭモードで操作する。ＬＣ溶離剤は１．９ｋＶでエレクトロスプレーし、ＭＲＭ分析は０．７ＤａのＱ１ピーク幅を用いて実施する。衝突エネルギーは、ティーエスキュー・バンテージ（ＴＳＱ Ｖａｎｔａｇｅ）について、ベンダーの仕様に従い、直線回帰により計算する。
Ｃ．アッセイ設計、データ処理および分析
ＬＣ−ＭＲＭアッセイの作製については、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析から得られた１２の最も強力な断片イオンを、定期ＬＣ−ＭＲＭモードで測定し、データは、エムプロフェット（ｍＰｒｏｐｈｅｔ）のスコアリング部分であるエムクエスト（ＭＱＵＥＳＴ）（登録商標）（クルーテック（Ｃｌｕｅｔｅｃ）、カールスルーエ、ドイツ）を用いて処理した（ライター（Ｒｅｉｔｅｒ）ら著、「ｍＰｒｏｐｈｅｔ：大規模ＳＲＭ実験における自動化データ処理および統計的検証（ｍＰｒｏｐｈｅｔ：Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄａｔａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ＳＲＭ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）」、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２０１１年、第８号、ｐ．４３０−４３５；その内容は参照により本明細書に援用される）。アッセイは手作業で検証し、正確な断片強度を測定し、ｉＲＴ（保持時間の指標）はバイオグノーシス（Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ）のｉＲＴ−ペプチドに対して指定する（エッシャー（Ｅｓｃｈｅｒ）ら著、「ｉＲＴ使用による、ペプチド測定値をより標的化するための保持時間の正規化（Ｕｓｉｎｇ ｉＲＴ，ａ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｍｏｒｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、２０１２年、第１２号、ｐ．１１１１−１１２１；その内容は参照により本明細書に援用される）。
一連の試料全体におけるペプチドの相対定量については、各アッセイの８つの最も強力なトランジションは、一連の試料全体に対して測定する。データ分析は、スペクトロダイブ（ＳｐｅｃｔｒｏＤｉｖｅ）（商標）（バイオグノーシス（Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ）、シュリーレン、スイス）を用いて実施する。総ピーク領域は、選択されたペプチドに対して比較し、０．０５の偽発見率（ｄｉｓｃｏｖｅｒ ｒａｔｅ）を適用する。０．０５未満のＱ値を有するペプチドは、除外し、各試料中で検出されることはないと考えられる。
実施例１８．化学修飾を有する修飾ｍＲＮＡからのペプチド同一性の確認
低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）修飾ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１４０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾）から生成されたタンパク質を含有する細胞可溶化物は、実施例１７に記載のように、定量ＬＣ−ＭＲＭを伴うＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて評価した。評価したタンパク質において同定されたペプチド断片を表８に示す。全部のペプチドは、親タンパク質に特異的であり、ＬＤＬＲおよびＨＦＥ２は、親タンパク質およびそのアイソフォームに特異的であった。表８中の「ユニプロットＩＤ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ）」は、ペプチド断片配列がデータベース内のすべてのレビュー（ｒｅｖｉｅｗ）タンパク質に対してブラストした場合でのユニプロット（ＵｎｉＰｒｏｔ）データベースからのタンパク質識別子を示す。細胞可溶化物中のタンパク質を評価するのに使用したハウスキーピングタンパク質は、表９に示す。
表８．タンパク質およびペプチド断片配列
表９．ハウスキーピングタンパク質
実施例１９．細胞培養液中での低密度リポタンパク質受容体発現の検出
Ａ．ヒーラ細胞への遺伝子導入
ヒーラ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グランドアイランド、ニューヨーク州）および１×グルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）試薬（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グランドアイランド、ニューヨーク州）を添加した、ＭＥＭイーグルの培地（Ｅａｇｌｅｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＭＥＭ、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グランドアイランド、ニューヨーク州）中、２４ウェルディッシュ（コーニングライフサイエンス（Ｃｏｒｎｉｎｇ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、トゥックズベリー、マサチューセッツ州）に蒔き（７．５×１０４個の細胞／ウェル）、標準的な細胞培養条件下で一晩培養した。遺伝子導入溶液は、各ウェルに対して、第１のチューブ内の５０μｌのオプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）試薬（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グランドアイランド、ニューヨーク州）および第２のチューブ内、５０μｌのオプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）中の１μｌのＬ２０００トランスフェクション試薬（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グランドアイランド、ニューヨーク州）を用いて、５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾した２５０ｎｇの低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）修飾ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１４０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）、ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡ（配列番号４３で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾）またはルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（配列番号４４で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾）を結合させることによって処理されるように調製した。調製後、第１および第２のチューブは、各々の内容物を結合させる前、室温で５分間インキュベートした。結合させたトランスフェクション溶液は、室温で１５分間インキュベートした。次いで、１００μｌのトランスフェクション溶液を各ウェルに添加した。細胞は、後続する分析の前、さらに１６時間培養した。
Ｂ．フローサイトメトリーによるＬＤＬＲの検出
遺伝子導入後、培地は、細胞から除去し、６０μｌの０．２５％トリプシン（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グランドアイランド、ニューヨーク州）を各ウェルに添加した。細胞は、２４０μｌ／ウェルのトリプシンインヒビター（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グランドアイランド、ニューヨーク州）の添加前、２分間トリプシン処理した。得られた細胞溶液は、９６ウェルプレート（コーニングライフサイエンス（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、トゥックズベリー、マサチューセッツ州）に移し、細胞は、遠心分離（８００×ｇで５分間）によりペレット化し、上清を廃棄した。細胞ペレットは、ＰＢＳで洗浄し、フォックスピースリー（Ｆｏｘｐ３）固定／透過処理用溶液（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）に４５分間再懸濁した。細胞は、遠心分離（８００×ｇで５分間）により再びペレット化し、透過処理用緩衝液（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）に１０分間再懸濁した。細胞は、遠心分離（８００×ｇで５分間）により再びペレット化し、透過処理用緩衝液で洗浄した。次いで、細胞は、ＬＤＬＲに特異的な一次抗体、その後フィコエリトリン標識二次抗体で処理した。次いで、標識した細胞は、ファックス（ＦＡＣＳ）緩衝液（１％ウシ血清アルブミンおよび０．１％アジ化ナトリウムを有するＰＢＳ）と結合し、クラスターチューブに移した。図５に示すように、標識した細胞は、次いでビーディー・アキュリ（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ）（ビーディー・バイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いてフローサイト
メトリーにより分析した。
Ｃ．免疫蛍光によるＬＤＬＲ検出
遺伝子導入した細胞は、ＰＢＳで洗浄し、室温で２０分間、固定液（４％ホルムアルデヒドを有するＰＢＳ）で処理した。次いで、細胞は、ＰＢＳで洗浄し、透過処理／ブロッキング溶液（０．１％ツイーン２０とともに５％ウシ血清アルブミンを有するトリス緩衝生理食塩水）で処理した。細胞は、０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳで３回洗浄する前、穏やかに撹拌しながら、室温で２時間インキュベートした。次いで、細胞は、一次抗体（ヤギ抗−ＬＤＬＲ、アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州）または通常のＩｇＧ対照の存在下または不在下で、室温で２時間処理し、０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、蛍光標識とともに１：２００に希釈したロバ抗−ヤギＩｇＧを含有する二次抗体溶液で処理した（アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州）。細胞は、０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳで再び洗浄し、蛍光顕微鏡イメージングにより試験した。ルシフェラーゼまたはｍＣｈｅｒｒｙを一過性に発現する細胞は、蛍光免疫染色の不在下で、蛍光顕微鏡により試験した。
実施例２０．低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の発現
Ａ．インビトロでのＬＤＬＲ発現
ヒト胚性腎上皮（ＨＥＫ２９３）細胞（エルジーシー・スタンダーズ・ゲーエムベーハー（ＬＧＣ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍｂＨ）、ヴェセル、ドイツ）は、６つのウェルプレート（ビーディー・バイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンノゼ、米国）上に播種した。ＨＥＫ２９３は、３ｍＬの細胞培地中に約５００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏｍｉｎｅ）単独またはＬＤＬＲ ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾；５’キャップ、Ｃａｐ１、約１６０ヌクレオチドのポリＡテール（配列内に示さず））を有するリポフェクタミンまたは対照としてＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号３０で示されるｍＲＮＡ；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾；５’キャップ、Ｃａｐ１；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール）を有するリポフェクタミンは、１ウェルあたり４０００、８００、４００、４０、および４ｎｇの量のＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡを細胞に播種後、直接添加し、インキュベートした。３７℃で１８時間のインキュベーション後、細胞は、洗浄し、固定し、染色した。Ｇ−ＣＳＦ ｍＲＮＡのトランスフェクト細胞は、抗−ＬＤＬＲ抗体で処理し、１セットのＬＤＬＲトランスフェクト細胞を、対照として通常のヤギＩｇＧで処理した。結合された一次抗体は、フィコエリトリン（ＰＥ）標識二次抗体で処理後、ＦＡＣＳ分析により検出した。
図６Ａに示されるように、ＦＡＣＳ分析の結果は、すべてのゲートされた生細胞の７４．８％が、ＬＤＬＲを８００ｎｇの用量のＬＤＬＲ ｍＲＮＡで発現することが検出されたことを示す。すべてのゲートされた生細胞の１１．６％が、ＬＤＬＲを４０ｎｇの用量のＬＤＬＲ ｍＲＮＡで発現することが検出された。染色は、対照の非免疫ＩｇＧで染色した、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡで処理した細胞では全く認められなかった。ＬＤＬＲ陽性細胞は、Ｇ−ＣＳＦ ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞内で全く検出されなかった。
Ｂ．タンパク質蓄積
ヒト胚性腎上皮（ＨＥＫ２９３）細胞（エルジーシー・スタンダーズ・ゲーエムベーハー（ＬＧＣ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍｂＨ）、ヴェセル、ドイツ）は、６つのウェルプレート（ビーディー・バイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンノゼ、米国）上に播種した。ＨＥＫ２９３は、３ｍＬの細胞培地中に約５００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。リポフェクタミンまたはＬＤＬＲ ｍＲＮＡ（配列番号４２
で示されるｍＲＮＡ；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾；５’キャップ、Ｃａｐ１、約１６０ヌクレオチドのポリＡテール（配列内に示さず））を有するリポフェクタミンまたは対照としてＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号３０で示されるｍＲＮＡ；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾；５’キャップ、Ｃａｐ１；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール）を有するリポフェクタミンは、ウェルごとの細胞に播種後、直接添加し、インキュベートした。１５時間後、遺伝子導入培地は、完全培地と交換した。トランスフェクト細胞は、培地交換の０、２、４、８、２４、４８、および７２時間後に収集した。トランスフェクト細胞は、フィコエリトリン（ＰＥ）に抱合した抗−ＬＤＬＲ抗体で処理し、１セットのＬＤＬＲトランスフェクト細胞を、対照としてＰＥに抱合した通常のヤギＩｇＧで処理した。結合された一次抗体は、上記のようにＦＡＣＳ分析により検出した。
図６Ｂに示されるように、ＦＡＣＳ分析は、すべてのゲートされた生細胞の約６５％が、遺伝子導入培地を洗浄、除去して０．０時間後（遺伝子導入の１５．０時間後）、ＬＤＬＲを発現することが検出されたことを示す。パーセント陽性細胞は、３７℃で経時的に低下し、それにより、遺伝子導入培地除去から２４時間経過するまで、ＬＤＬＲは検出されなかった。
Ｃ．ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）（登録商標）標識ＬＤＬＲ
発現されたＬＤＬＲが機能的であるか否かを評価するため、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）（登録商標）で標識したＬＤＬ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウーバン、マサチューセッツ州）を使用した。ＨＥＫ２９３細胞には、ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾；５’キャップ、Ｃａｐ１、約１６ヌクレオチドのポリＡテール（配列内に示さず））またはＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号３０で示されるｍＲＮＡ；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾；５’キャップ、Ｃａｐ１；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール）のいずれかを一晩かけて遺伝子導入し、細胞は洗浄し、漸増量のボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬとともにインキュベートした。３７℃で１時間インキュベーション後、細胞は洗浄し、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬの結合をＦＡＣＳにより評価した。ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬのＬＤＬＲ ｍＲＮＡトランスフェクト細胞への結合は、図６Ｃに示すように、高親和性（Ｋｄが約６０ｎｇ／ｍＬ）および飽和性を示した。それに対して、Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞への結合は全く認められなかった。
ＬＤＬ結合の特異性を評価するため、ＬＤＬ−ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）結合シグナルが非標識ＬＤＬとの競合により低下され得たか否かについて検討した。ＨＥＫ２９３細胞には、ＬＤＬＲおよび対照としてＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡを一晩かけて遺伝子導入した。０．５ｕｇ／ｍＬのＬＤＬ−ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）は、０．０１、０．１、０．５、１．０、１０、１００または５００ｕｇ／ｍＬの非標識ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）と同時に、トランスフェクト細胞に添加した。標識ＬＤＬについてのフローサイトメトリーを通じて陽性として検出された、生きたゲートされたトランスフェクト細胞のパーセントを、表１０に示す。ＬＤＬ−ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）シグナルは、非標識ＬＤＬをさらに添加するにつれて次第に低下した。
表１０．標識ＬＤＬ染色の百分率
競合試験において、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬの結合であれば、非標識ＬＤＬにより用量依存的に低下し得る（図６Ｄ）。これらのデータは、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬのＬＤＬＲ ｍＲＮＡを発現する細胞への結合が、飽和性、特異性、および高親和性を示すことを示す。
インビボでのＬＤＬＲ ｍＲＮＡの発現により、血漿コレステロールのレベルが低下し得たか否かを評価するため、ＬＤＬＲノックアウトマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーハーバー、マイン）は、リポフェクタミン２０００中、２．０μｇのＬＤＬＲ ｍＲＮＡの０．１ｍＬの単回静脈注射により処置したかまたはリポフェクタミン２０００単独を注射した（図６Ｅでは「陰性」と示す）。２４．０時間後、血清は、各マウスから単離し、サイズ排除クロマトグラフィーによる高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって分画した。正の対照として、活性タンパク質のヒト成長ホルモン（アブカム（Ａｂｃａｍ）カタログ番号ａｂ１１６１６２）も使用した（図６Ｅでは「成長ホルモン」として示す）。各画分の総コレステロール含量は図６Ｅに示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると、リポタンパク質（ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬ）を有するアポリポタンパク質Ｂは、画分３〜５に限定されることが示された。画分３〜６の平均総コレステロールは、負の対照において４１６．１ｕｇ、正の対照（成長ホルモン）において４０９．０ｕｇ、またＬＤＬＲをコードするｍＲＮＡを投与したマウスにおいて３２１．３ｕｇであった。媒体の注射に対して、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡの単回注射によるＬＤＬＲノックアウトマウスの処置により、ＶＬＤＬ＋ＩＤＬ＋ＬＤＬ画分中のコレステロール含量が約２０％低下した。これらのデータは、ＬＤＬＲノックアウトマウスにおけるＬＤＬＲ ｍＲＮＡの発現が、コレステロールリッチリポタンパク質の血清レベルを低下させ得ることを示す。
実施例２１．化学修飾を有する修飾ｍＲＮＡからのペプチド同一性の確認
５−メチルシトシンおよびプソイドウリジン（５ｍＣおよびｐＵで完全に修飾されるか、５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジン（５ｍＣおよび１ｍｐＵ）で完全に修飾されるか、プソイドウリジン（ｐＵ）で完全に修飾されるか、１−メチルシュードウリジン（１ｍｐＵ）で完全に修飾されるか、またはウリジン残基の２５％が２−チオウリジンで修飾されかつシトシン残基の２５％が５−メチルシトシンで修飾された場合（ｓ２Ｕおよび５ｍＣ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）修飾ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１４０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）およびＬＤＬＲ−ＰＣＳＫ９−４Ａ修飾ｍＲＮＡ（配列番号１２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１４０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）から生成されたタンパク質を含有する細胞可溶化物は、実施例１７に記載のように、定量ＬＣ−ＭＲＭを伴うＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて評価した。評価したタンパク質において同定されたペプチド断片は、表１１に示す。
表１１．タンパク質およびペプチド断片配列
実施例２２．野生型ＬＤＬＲおよびＰＣＳＫ９への結合が欠損したＬＤＬＲの修飾ｍＲＮＡの設計および合成
Ａ．ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡ
ＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示さない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；１−メチルシュードウリジンおよび５−メチルシュードウリジンで完全に修飾）は、前述のように合成した。修飾ｍＲＮＡ産物は、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００）バイオアナライザーを用いて分析し、図７に示すように、約２．８Ｋｂの予想されたサイズで１本のバンドが認められた。
Ｂ．ＰＣＳＫ９への結合が欠損したＬＤＬＲの修飾ｍＲＮＡ
ヒトＰＣＳＫ９への結合が欠損したＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡは、前述のように合成する。修飾ｍＲＮＡは、Ｙ３３６Ａ（配列番号３７）、Ｅ３１７Ａ（配列番号３６）、Ｎ３１６Ａ（配列番号３５）、Ｌ３３９Ｄ（配列番号３４）、またはＤ３３１Ｅ（配列番号３３）などの単一のアミノ酸置換基を有するＰＣＳＫ９への結合が欠損した突然変異ＬＤＬＲあるいはアミノ酸置換基：Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｙ３３６ＡおよびＤ３３１Ａ（配列番号３８）を有する四重突然変異体をコードし、ここで例えば、「Ｎ３１６Ａ」は、３１６位でのアミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｉｃｄ）アスパラギンを意味し、アミノ酸のアラニンと置換される。突然変異ＬＤＬＲ ｍＲＮＡは、本明細書に記載の化学修飾をさらに含む。修飾ｍＲＮＡ産物の確認は、バイオアナライザーおよびペプチド消化などの当該技術分野で既知の方法によって行う。
実施例２３．ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡのインビトロ発現
ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞には、リポフェクタミン単独、ＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡを含有するリポフェクタミン（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示さない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；１−メチルシュードウリジンおよび５−メチルシトシンで完全に修飾）または対照としてのＧ−ＣＳＦをコードする修飾ＲＮＡ（配列番号３０で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；１−メチルシュードウリジンおよび５−メチルシトシンで完全に修飾）を含有するリポフェクタミンを遺伝子導入した。３７℃で１８時間のインキュベーション後、細胞は、洗浄し、固定し
、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｔｈｒｉｎ）（ＰＥ）標識抗−ヒトＬＤＬＲ抗体（アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州；ヒトＬＤＬＲ親和性精製ポリクローナルＡｂＡＦ２１４８）またはＰＥ標識ヤギ非免疫ＩｇＧ（アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州；アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）精製ヤギＩｇＧ、アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）カタログ番号ＡＣ−１０８−Ｃ）のいずれかで染色した。ＰＥへの抱合は、イノバ・バイオサイエンス（Ｉｎｎｏｖａ
ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のライトニング・リンク（ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−ｌｉｎｋ）抱合キット（ライトニング・リンク（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ）Ｒ−ＰＥ抗体標識キット、ノバス・バイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）カタログ番号：７０３−００１０）を用いて完了した。
ヒトＬＤＬＲの発現は、フローサイトメトリーによって監視した。漸増量（４〜４０００ｎｇ）のＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡの遺伝子導入により、ＰＥ標識抗−ＬＤＬＲ ＩｇＧで染色した細胞のパーセントが増加したが、Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡの対照を遺伝子導入した細胞においては増加しなかった。８００ｎｇの、ＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡの遺伝子導入を、図８に示す。ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞内でのＰＥ標識非免疫ＩｇＧの場合、陽性染色は全く検出されなかった。
ＬＤＬＲの発現は、遺伝子導入から８〜２４時間後にピークに達し、その後低下した。
実施例２４．ＬＤＬＲの検出
ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞には、ＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ、配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡ；５’キャップ、Ｃａｐ１；１−メチルシュードウリジンおよび５−メチルシトシンで完全に修飾）を含有するリポフェクタミンまたは対照としてＧ−ＣＳＦをコードする修飾ｍＲＮＡ（配列番号３０で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；１−メチルシュードウリジンおよび５−メチルシトシンで完全に修飾）を含有するリポフェクタミンを遺伝子導入した。３７℃で１６時間のインキュベーション後、細胞は、洗浄し、完全成長培地と交換した。細胞は、遺伝子導入の０、２、４および８時間後、収集し、ＬＤＬＲに対して染色した。図９に示すように、ＬＤＬＲは、遺伝子導入後、生細胞の６８．１％において検出され、遺伝子導入用培地の不在下で、８時間後、２７．６％に減少した。図９において、カラム１および２には、ＬＤＬＲをコードするｍＲＮＡを遺伝子導入し、カラム３には、Ｇ−ＣＳＦをコードする対照ｍＲＮＡを遺伝子導入した。カラム１および３は、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｔｈｒｉｎ）（ＰＥ）標識抗−ヒトＬＤＬＲ抗体（アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州；ヒトＬＤＬＲ親和性精製ポリクローナルＡｂＡＦ２１４８）で染色し、カラム２は、対照としてＰＥに抱合したヤギＩｇＧ（アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州；アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）精製ヤギＩｇＧ、アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）カタログ番号ＡＣ−１０８−Ｃ）で染色した。ＰＥへの抱合は、イノバ・バイオサイエンス（Ｉｎｎｏｖａ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のライトニング・リンク（ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−ｌｉｎｋ）抱合キット（ライトニング・リンク（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ）Ｒ−ＰＥ抗体標識キット、ノバス・バイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）カタログ番号：７０３−００１０）を用いて完了した。
実施例２５．ＰＣＳＫ９への結合が欠損したＬＤＬＲの修飾ｍＲＮＡのインビトロ発現
ヒトおよびマウス野生型ＬＤＬＲならびにヒトＰＣＳＫ９への結合が欠損したＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡは、本明細書に記載のように合成する。修飾ｍＲＮＡは、当該技術分野で既知の方法により、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入する。野生型ＬＤＬＲおよ
びＰＣＳＫ９への結合が欠損したＬＤＬＲ突然変異体の発現は、遺伝子導入後にスクリーニングし、最も高度に発現する修飾ｍＲＮＡを判定する。
実施例２６．Ｈｅｐ−Ｇ２細胞内でのＬＤＬＲのＰＣＳＫ９下方制御
ヒト肝細胞がん（Ｈｅｐ−Ｇ２）細胞は、完全培地（１０％リポタンパク質欠損血清を有するＤＭＥＭ培地（イントラセル・リソーシズ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）、フレデリック、メリーランド州））中で培養することで、内因性ＬＤＬＲを下方制御する。ＰＣＳＫ９によるＬＤＬＲ発現の下方制御は、既知の方法（例えば、リパリ（Ｌｉｐａｒｉ）ら著、「フリンで切断されたプロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケシン９型（ＰＣＳＫ９）は活性型であり、低密度リポタンパク質受容体および血清コレステロールレベルを調節する（Ｆｕｒｉｎ−ｃｌｅａｖｅｄ Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／Ｋｅｘｉｎ Ｔｙｐｅ９（ＰＣＳＫ９）Ｉｓ Ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ Ｓｅｒｕｍ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｌｅｖｅｌｓ．）」、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．）、２０１２年、第２８７巻、第５２号、ｐ．４３４８２−４３４９１；マクナット（ＭｃＮｕｔｔ）ら著、「分泌されたＰＣＳＫ９の拮抗作用はＨｅｐＧ２細胞内で低密度リポタンパク質受容体の発現を増強する（Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＰＣＳＫ９ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＨｅｐＧ２ Ｃｅｌｌｓ．）」、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．）、２００９年、第２８４巻、第１６号、ｐ．１０５６１−１０５７０を参照；これら各々はその全体が参照により本明細書に援用される）により評価されることになる。
ＬＤＬＲ発現の下方制御を評価するための一方法は、本明細書に記載のように、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞に野生型ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡまたはＰＣＳＫ９への結合が欠損したＬＤＬＲの修飾ｍＲＮＡを遺伝子導入することである。Ｈｅｐ−Ｇ２細胞は、ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡの遺伝子導入前、完全培地中で培養することで、内因性ＬＤＬＲを下方制御する。３７℃で２４時間のインキュベーション後、野生型ＬＤＬＲまたはＰＣＳＫ９への結合が欠損したＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡの遺伝子導入からのＬＤＬＲの代謝回転は、細胞可溶化物のウエスタンブロット解析（プロテイン・シンプル（ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＩＭＰＬＥ）（商標）、サンタクララ、カリフォルニア州）およびフローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳソーティング）により、外因性ＰＣＳＫ９の存在下および不在下で評価する（アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州）。最もＰＣＳＫ９に非感受性のＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡについて判定する。
実施例２７．肝細胞に形質導入する製剤
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、当該技術分野で既知、本明細書に記載、および／または、「修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸組成物（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という表題のＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法を用いて調合する。本明細書で使用されるＬＮＰは、イオン化可能な脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはカチオン性脂質Ｃ１２−２００を含んでもよい。
ルシフェラーゼをコードする修飾ｍＲＮＡ（例えば、配列番号４４；配列内に示されない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；本明細書に記載の少なくとも１つの化学修飾で修飾）は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＣ１２−２００を含むＬＮＰ中で調合する。調合したルシフェラーゼは、野生型マウスおよびＬＤ
ＬＲ欠損マウスに投与する。野生型およびＬＤＬＲ欠損マウスの肝細胞内でのルシフェラーゼの発現は、修飾ｍＲＮＡの投与後、所定の間隔で、当該技術分野で既知または本明細書に記載の方法を用いて測定する。イメージングの２０分前、マウスの腹腔内に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇ注射する。動物は麻酔し、画像はＩＶＩＳルミナ（ｌｕｍｉｎａ）ＩＩイメージングシステム（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて得る。生物発光（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｅｓ）は、全フラックス（光子／秒）として測定する。
実施例２８．マウスにおけるＬＤＬＲのインビボ発現
ＬＤＬＲ−／−マウスを使用し、野生型ヒトまたはマウスのＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡ、あるいはＰＣＳＫ９への結合が欠損したヒトまたはマウスＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡ（集合的に「ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡ」）のインビボ発現について試験する。脂質ナノ粒子中で調合したＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡは、漸増用量の０．００５〜０．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２０ｍｇ／ｋｇ、０．０３０ｍｇ／ｋｇ、０．０４０ｍｇ／ｋｇ、０．０５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）のＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡを含有する０．１ｍｌの静脈注射により、ＬＤＬＲ−／−マウスに投与する。マウスは、注射後の様々な時点、例えば２時間〜９６時間（例えば、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間）後に屠殺する。肝臓は切除し、細胞可溶化物および肝臓は分析のために調製する。ＬＤＬＲタンパク質の発現およびｍＲＮＡ転写物における薬物濃度変化は、抗−ＬＤＬＲ抗体を用いたウエスタンブロット解析によって測定し、マウス組織内での修飾ＬＤＬＲ ｍＲＮＡの発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析する。血清は、修飾ｍＲＮＡの注射後の様々な時点で収集し、サイトカインパネルについて、マウスルミネックス（ＬＵＭＩＮＥＸ）（登録商標）パネルを用いて分析する。血清の残りは、ＶＬＤＬ＋ＩＤＬ＋ＬＤＬコレステロールのアッセイにおけるＦＰＬＣにより、分画されることになる（ガーバー（Ｇａｒｂｅｒ）ら著、「個別のマウス血漿試料のリポタンパク質特性分析のための高感度で便利な方法（Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｍｏｕｓｅ ｐｌａｓｍａ ｓａｍｐｌｅｓ．）」、ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０００年、第１４巻、ｐ．１０２０−１０２６に記載の方法を参照；その全体が参照により本明細書に援用される）。
さらなる試験では、ＬＤＬＲ−／−マウスには、野生型ヒトまたはマウスのＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡあるいはＰＣＳＫ９への結合が欠損したヒトまたはマウスのＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡを２回以上投与する。血清は、修飾ｍＲＮＡの注射後の様々な時点で収集し、サイトカインパネルについて、マウスルミネックス（ＬＵＭＩＮＥＸ）（登録商標）パネルを用いて分析し、ＶＬＤＬ＋ＩＤＬ＋ＬＤＬコレステロールについてアッセイする。マウスはまた屠殺し、肝臓は切除し、細胞可溶化物は分析のために調製する。
実施例２９．ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）（ＷＨＨＬ）ウサギにおけるＬＤＬＲのインビボ発現
ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）（ＷＨＨＬ）ウサギを使用し、野生型ヒトＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡまたはＰＣＳＫ９への結合が欠損したヒトＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡ（「ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡ」）のインビボ発現について試験する。脂質ナノ粒子中で調合したＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡは、０．００５〜０．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２０ｍｇ／ｋ
ｇ、０．０３０ｍｇ／ｋｇ、０．０４０ｍｇ／ｋｇ、０．０５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）のＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡを含有する注射により、ウサギに投与する。ＷＨＨＬウサギは、注射から２時間〜９６時間（例えば、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間）後、屠殺し、肝臓は切除し、細胞可溶化物は分析のために調製する。ＬＤＬＲタンパク質発現およびｍＲＮＡ転写物における変化は、細胞可溶化物中で、抗−ＬＤＬＲ抗体を用いたウエスタンブロット解析により測定し、ウサギ組織内でのＬＤＬＲの発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析する。血清は、修飾ｍＲＮＡの注射後の様々な時点で収集し、サイトカインパネルについて分析し、ＶＬＤＬ＋ＩＤＬ＋ＬＤＬコレステロールについてアッセイする。
実施例３０．ＬＤＬＲ欠損ブタにおけるＬＤＬＲのインビボ発現
ＬＤＬＲ欠損ブタ（イグゼンプラー・ジェネティクス（Ｅｘｅｍｐｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、スーセンター、アイオワ州）を使用し、野生型ヒトＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡまたはＰＣＳＫ９への結合が欠損したヒトＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡ（「ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡ」）のインビボ発現について試験する。脂質ナノ粒子中で調合したＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡは、０．００５〜０．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２０ｍｇ／ｋｇ、０．０３０ｍｇ／ｋｇ、０．０４０ｍｇ／ｋｇ、０．０５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）のＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡを含有する注射により、ＬＤＬＲ欠損ブタに投与する。ブタは、注射から２時間〜９６時間（例えば、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間）後、屠殺し、肝臓は切除し、細胞可溶化物は分析のために調製する。ＬＤＬＲタンパク質発現およびｍＲＮＡ転写物における変化は、細胞可溶化物中で、抗−ＬＤＬＲ抗体を用いたウエスタンブロット解析により測定し、ブタ組織内でのＬＤＬＲの発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析する。血清は、修飾ｍＲＮＡの注射後の様々な時点で収集し、サイトカインパネルについて分析し、ＶＬＤＬ＋ＩＤＬ＋ＬＤＬコレステロールについてアッセイする。
実施例３１．ＬＤＬＲ欠損アカゲザルにおけるＬＤＬＲのインビボ発現
ＬＤＬＲ欠損アカゲザル（サウスウェスト国立霊長類研究センター（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）、サンアントニオ、テキサス州）を使用し、野生型ヒトＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡまたはＰＣＳＫ９への結合が欠損したヒトＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡ（「ＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡ」）のインビボ発現について試験する。脂質ナノ粒子中で調合したＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡは、０．００５〜０．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２０ｍｇ／ｋｇ、０．０３０ｍｇ／ｋｇ、０．０４０ｍｇ／ｋｇ、０．０５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）のＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡを含有する注射により、ＬＤＬＲ欠損サルに投与する。サルは、注射から２時間〜９６時間（例えば、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間）後、屠殺し、肝臓は切除し、細胞可溶化物は分析のために調製する。ＬＤＬＲタンパク質発現およびｍＲＮＡ転写物における変化は、細胞可溶化物中で、抗−ＬＤＬＲ抗体を用いたウエスタンブロット解析により測定し、サル組織内でのＬＤＬＲの発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析する。血清は、修飾ｍＲＮＡの注射後の様々な時点で収集し、サイトカインパネルについて分析し、ＶＬＤＬ＋ＩＤＬ＋ＬＤＬコレステロールについてアッセイする。
実施例３２．複数回投与試験
複数回投与を用いる試験は、ＬＤＬＲ−／−マウスを用いて設計し、実施する。マウスの静脈内に、２８日間にわたって８回（週に２回）、脂質ナノ粒子中で調合した、ヒトまたはマウス野生型ＬＤＬＲをコードする修飾ＬＤＬＲ ｍＲＮＡあるいはＰＣＳＫ９への結合が欠損したヒトＬＤＬＲをコードする修飾ＬＤＬＲ ｍＲＮＡを、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇまたは０．０００５ｍｇ／ｋｇ、投与する。ＬＤＬＲタンパク質発現およびｍＲＮＡ転写物における変化は、細胞可溶化物中で、抗−ＬＤＬＲ抗体を用いたウエスタンブロット解析により測定し、組織内でのＬＤＬＲの発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析する。本明細書に記載のように、血清は、所定の時間間隔の間に収集し、サイトカインパネルについて分析し、ＶＬＤＬ＋ＩＤＬ＋ＬＤＬコレステロールについてアッセイする。
実施例３３．野生型およびＬＤＬＲノックアウトマウスにおける総コレステロール
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）３匹およびＬＤＬＲノックアウトマウス（Ｂ６．１２９Ｓ７−ｌｄｌｒｔｍｌＨｅｒ／Ｊ、ジャクソン・ラボラトリーズ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーハーバー、マイン）３匹に由来する血清は、採取し、ＦＰＬＣにより断片化した。野生型およびＬＤＬＲノックアウトマウスに由来する溶出された血清画分の吸光度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで測定した。各画分は、ワコ（Ｗａｋｏ）のコレステロールＥ酵素比色分析（ｃｏｌｏｍｅｔｒｉｃ）法（ワコ（Ｗａｋｏ）、リッチモンド、バージニア州）により、総コレステロールについて分析した。図１０Ａに示すように、吸光度特性は、両方のマウス株において、３つの明確なタンパク質ピークを示した（図１０Ａ）。図１０Ｂにおける画分３〜６にわたる第１のピークでは、ＬＤＬＲノックアウトマウスにおいてコレステロールが最高であることが試験された。図１０Ｂにおける画分７〜１２にわたる第２のピークでは、野生型マウスにおいて総コレステロールが最高であることが試験された。図１０Ｂにおける画分１４〜１８にわたる第３のピークでは、両方のマウス株においてコレステロールが低値または陰性であることが試験された。
実施例３４．野生型ＬＤＬＲおよびＰＣＳＫ９への結合が欠損した変異体の発現
ヒト胚性腎上皮（ＨＥＫ２９３）細胞（エルジーシー・スタンダーズ・ゲーエムベーハー（ＬＧＣ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍｂＨ）、ヴェセル、ドイツ）は、４８ウェルプレート（ビーディー・バイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンノゼ、米国）上に播種する。ＨＥＫ２９３は、０．２ｍＬの細胞培地中に約６０，０００細胞／ウェルの密度で播種する。１ｕＬのリポフェクタミンおよび１５０ｎｇの野生型（ＷＴ）ＬＤＬＲ ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）または１５０ｎｇのＬＤＬＲ配列変異ｍＲＮＡまたは対照としてＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号３０で示されるｍＲＮＡ；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾；５’キャップ、Ｃａｐ１；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール）を含有する製剤は、１ウェルあたり６０，０００の量で細胞を播種後、直接添加し、インキュベートする。
調製して試験したＬＤＬＲ ｍＲＮＡ配列変異体は、４つのアミノ酸置換変異体（４Ａ：Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ）（配列番号１２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、あるいは、以下の単一のアミノ酸置換変異体として、Ｙ３３６Ａ（配列番号１１で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｅ
３１７Ａ（配列番号１０で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｎ３１６Ａ（配列番号９で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｌ３３９Ｄ（配列番号８で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｄ３３１Ｅ（配列番号７で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、を含む。
対照としてのＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡトランスフェクト細胞は、抗−ＬＤＬＲ抗体（アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州；ヒトＬＤＬＲ親和性精製ポリクローナルＡｂＡＦ２１４８）で処理し、ＬＤＬＲトランスフェクト細胞の１セットは、通常のヤギＩｇＧ（アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州；精製ヤギＩｇＧ、アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）カタログ番号ＡＣ−１０８−Ｃ）で処理した。結合された一次抗体は、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗体（アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州）で処理後、ＦＡＣＳ分析により検出した。ＰＥへの抱合は、イノバ・バイオサイエンス（Ｉｎｎｏｖａ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のライトニング・リンク（ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−ｌｉｎｋ）抱合キット（ライトニング・リンク（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ）Ｒ−ＰＥ抗体標識キット、ノバス・バイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）カタログ番号：７０３−００１０）を用いて完了した。
図１１に示されるように、ＦＡＣＳ分析は、すべてのゲートされた生細胞の３２％が、１５０ｎｇの用量の野生型ＬＤＬＲ ｍＲＮＡ（図１１中のＷＴ）でＬＤＬＲを発現することが検出されたことを示す。同様に、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡ変異体を遺伝子導入した細胞においては、すべてのゲートされた生細胞の１２〜３３％が、１５０ｎｇの用量でＬＤＬＲを発現することが検出された。染色は、対照の非免疫ＩｇＧで染色したＬＤＬＲ ｍＲＮＡ処理細胞（ＬＤＬＲ ＷＴ遺伝子導入アイソタイプ染色）では全く認められず、ＬＤＬＲ陽性細胞は、Ｇ−ＣＳＦ ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞（ＧＣＳＦ遺伝子導入ＬＤＬＲ染色）において全く検出されなかった。
実施例３５．外因性ＰＣＳＫ９によるＬＤＬＲの下方制御
ヒト胚性腎上皮（ＨＥＫ２９３）細胞（エルジーシー・スタンダーズ・ゲーエムベーハー（ＬＧＣ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍｂＨ）、ヴェセル、ドイツ）は、４８ウェルプレート（ビーディー・バイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンノゼ、米国）上に播種する。ＨＥＫ２９３は、０．２ｍＬの細胞培地中に約６０，０００細胞／ウェルの密度で播種する。１ｕＬのリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃａｔｍｉｎｅ）および１５０ｎｇの野生型（ＷＴ）ＬＤＬＲ ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）または１５０ｎｇのＬＤＬＲ配列変異ｍＲＮＡまたは対照として１５０ｎｇのＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号３０で示されるｍＲＮＡ；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾；５’キャップ、Ｃａｐ１；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール）を含有する製剤は、１ウェルあたり８００ｎｇの量で細胞を播種後、直接添加し、６０μｇ／ｍＬの外因性ヒトＰＣＳＫ９の存在下および不在下でインキュベートする。
調製して試験したＬＤＬＲ ｍＲＮＡ配列変異体は、４つのアミノ酸置換変異体（４Ａ
：Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ）（配列番号１２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、あるいは、以下の単一のアミノ酸置換変異体として、Ｙ３３６Ａ（配列番号１１で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｅ３１７Ａ（配列番号１０で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｎ３１６Ａ（配列番号９で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｌ３３９Ｄ（配列番号８で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｄ３３１Ｅ（配列番号７で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、を含む。
３７℃で１５時間後、遺伝子導入用培地は、除去し、細胞は洗浄し、上記のように、フィコエリトリン（ＰＥ）に抱合された抗−ＬＤＬＲ抗体（アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州；ヒトＬＤＬＲ親和性精製ポリクローナルＡｂＡＦ２１４８）で処理した。ＬＤＬＲトランスフェクト細胞の１セットは、ＰＥに抱合した通常のヤギＩｇＧ（アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州；精製ヤギＩｇＧ、アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）カタログ番号ＡＣ−１０８−Ｃ）で処理し、非トランスフェクト細胞のもう１つのセットは、対照として使用した。Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞は、追加的な負の対照として使用した。ＰＥへの抱合は、イノバ・バイオサイエンス（Ｉｎｎｏｖａ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のライトニング・リンク（ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−ｌｉｎｋ）抱合キット（ライトニング・リンク（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ）Ｒ−ＰＥ抗体標識キット、ノバス・バイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）カタログ番号：７０３−００１０）を用いて完了した。結合された一次抗体は、上記のようにフローサイトメトリーにより検出した。
図１２に示すように、ＦＡＣＳ分析によると、野生型ＬＤＬＲ ｍＲＮＡが遺伝子導入された細胞内での細胞表面のＬＤＬＲ発現が、ゲートされた生細胞の５１．６％であることが示された。この値は、細胞トランスフェクション中、外因性ＰＣＳＫ９が培地に添加されたとき、ゲートされた生細胞の２１．５％に減少した。それに対し、ＰＣＳＫ９結合ドメイン内に置換を有するＬＤＬＲ ｍＲＮＡ変異体の各々は、外因性ＰＣＳＫ９による下方制御に対して感受性の低下を示し（表１２）、パーセント低下の値は、（野生型ＬＤＬＲの場合に認められた５８％の低下に対して）−８．１％〜２９％の範囲であった。
表１２．外因性ＰＣＳＫ９による細胞表面ＬＤＬＲ発現の下方制御
実施例３６．変異ＬＤＬＲ ｍＲＮＡによって発現されたＬＤＬＲの機能性
発現されたＬＤＬＲが機能的であるか否かを評価するため、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）標識ＬＤＬを使用した。６０、０００個のＨＥＫ２９３細胞／ウェルは、１ｕＬのリポフェクタミン２０００および１５０ｎｇのコード化野生型（ＷＴ）ＬＤＬＲ ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）または１５０ｎｇのＬＤＬＲ変異ｍＲＮＡまたは対照として１５０ｎｇのＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号３０で示されるｍＲＮＡ；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾；５’キャップ、Ｃａｐ１；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール）を含有する製剤を、一晩かけて遺伝子導入した。
調製し、試験したＬＤＬＲ変異ｍＲＮＡ配列は、４つのアミノ酸置換変異体（４Ａ：Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ）（配列番号１２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、または以下の単一のアミノ酸置換変異体、すなわちＹ３３６Ａ（配列番号１１で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｅ３１７Ａ（配列番号１０で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｎ３１６Ａ（配列番号９で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｌ３３９Ｄ（配列番号８で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｄ３３１Ｅ（配列番号７で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、を含む。
細胞は、洗浄し、漸増量（０ｕｇ／ｍｌ、０．１ｕｇ／ｍｌ、１．０ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌまたは５０ｕｇ／ｍｌ）のボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬとともにインキュベートした。３７℃で１時間のインキュベーション後、細胞は洗浄し、細胞と会合させたボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬはフローサイトメトリーによって評価した。曲線プロットは図１３Ａに示す。野生型（ＷＴ）およびＬＤＬＲ ＰＣＳＫ９結合変異体に
ついては、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬのＬＤＬＲ ｍＲＮＡトランスフェクト細胞への結合は、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬ濃度とともに増加するゲートされた細胞集団における右方向への変化として明白であった。ＬＤＬＲ ｍＲＮＡ構築物の各々を遺伝子導入した細胞において、ゲートされた細胞集団における同様の右方向への変化が認められた。図１３Ｂに示されるように、最大半量の細胞の結合は、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬの、野生型またはＰＣＳＫ９結合欠損ＬＤＬＲ ｍＲＮＡのいずれかを遺伝子導入した細胞への結合の場合と同様であった。各構築物においては、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬ結合は、高親和性（０．６〜０．７ｎｇ／ｍＬの間の最大半量の結合）および飽和性を示した。Ｎｏボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬ結合は、Ｇ−ＣＳＦ ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞については全く認められなかった。
実施例３７．細胞表面ＬＤＬＲに対する半減期の評価（Ｅｖａｌｕａｔｅ）
外因性ＰＣＳＫ９が、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞内の細胞表面ＬＤＬ受容体の見かけ上の半減期を調節し得るか否かを評価するため、ＨＥＫ２９３細胞を、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡを遺伝子導入した２４ウェルプレート上に１３０，０００細胞／ウェルで蒔き、上記のように１４時間インキュベートした。細胞単層は洗浄し、ＰＣＳＫ９（６０μｇ／ｍＬ）を含むまたはＰＣＳＫ９を含まない新しい培地を添加した。３７℃でのインキュベーションから様々な時間後、細胞表面でのＬＤＬＲ発現は、上記のように抗−ＬＤＬＲ抗体を用いてフローサイトメトリーにより監視した。図１４Ａに示すように、３００ｎｇの野生型ＬＤＬＲ ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）を遺伝子導入した細胞内の細胞表面ＬＤＬＲは、時間依存性に減少し、見かけ上の半減期は約１３時間であった。ＰＣＳＫ９の、野生型ＬＤＬＲ ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞の培地への添加により、細胞表面ＬＤＬＲの見かけ上の半減期は約４時間に減少した。図１４Ａにおける「＊」は、統計学的検定による有意な差異を表す。
それに対し、ＰＣＳＫ９の、３００ｎｇのＰＣＳＫ９結合欠損ＬＤＬＲ ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞の培地への添加により、細胞表面ＬＤＬＲの見かけ上の半減期における変化はほとんどまたは全く生じなかった（図１３Ｂ〜１３Ｇ）。調製して試験したＰＣＳＫ９結合欠損ＬＤＬＲ ｍＲＮＡ配列は、４つのアミノ酸置換変異体（４Ａ：Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ）（配列番号１２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、または以下の単一のアミノ酸置換変異体、すなわち、Ｙ３３６Ａ（配列番号１１で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｅ３１７Ａ（配列番号１０で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｎ３１６Ａ（配列番号９で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｌ３３９Ｄ（配列番号８で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｄ３３１Ｅ（配列番号７で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、を含む。
図１４Ｂ〜１４Ｇ中のこれらのデータは、ＰＣＳＫ９結合部位に突然変異を有するＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞が外因性ＰＣＳＫ９に応答し
ないことを示し、これは、これらの結合変異体がインビボで野生型ＬＤＬＲよりも長い半減期を有し、高コレステロール血症を有する患者を治療する場合に有用であり得ることを示唆している。
実施例３８．増加するＰＣＳＫ９量の細胞表面ＬＤＬＲに対する効果
漸増量のＰＣＳＫ９による細胞表面でのＬＤＬＲ発現の下方制御を評価するため、完全細胞培地、すなわち１０％ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ（グルタマックス（ＧｌｕｔａＭＡＸ）、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）カタログ番号４１０９０−０３６）に添加した。ＨＥＫ２９３細胞を、３００，０００細胞／ウェルで蒔き、６時間インキュベートし、野生型ＬＤＬＲ ｍＲＮＡ（配列番号４２で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）またはＰＣＳＫ９結合変異体をコードするＬＤＬＲ ｍＲＮＡのいずれかを３００ｎｇ、１５時間遺伝子導入した。調製して試験したＰＣＳＫ９結合変異ｍＲＮＡ配列は、単一のアミノ酸置換変異体であるＮ３１６Ａ（配列番号９で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、およびＤ３３１Ｅ（配列番号７で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）を含む。対照のＵＧＴｌＡ１をコードするｍＲＮＡ（配列番号６１で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）もまた使用した。
インキュベーションの１５時間後、細胞単層を洗浄し、緩衝液単独または漸増量のＰＣＳＫ９を含有する緩衝液のいずれかを添加した。細胞は５時間インキュベートし、細胞表面でのＬＤＬＲ発現は、上記のようにフローサイトメトリーによって測定した。図１５に示すように、野生型ＬＤＬＲ ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞内の細胞表面ＬＤＬ受容体は、ＰＣＳＫ９により用量依存性に減少した。ＬＤＬＲの最大低下は、外因性ＰＣＳＫ９が２０μｇ／ｍＬの時に得られた。それに対し、ＰＣＳＫ９は、ＰＣＳＫ９結合欠損変異体Ｎ３１６ＡまたはＤ３３１ＥをコードするＬＤＬＲ ｍＲＮＡを遺伝子導入した細胞内の細胞表面ＬＤＬＲに対して全く効果を有しなかった。細胞表面ＬＤＬＲは、ＵＧＴｌＡ１をコードするｍＲＮＡを遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞内で全く検出されなかった。これらのデータは、ＰＣＳＫ９に対する結合部位における突然変異をコードするＬＤＬＲ
ｍＲＮＡから発現されたＬＤＬＲが外因性ＰＣＳＫ９に対して非感受性であることを示す。
実施例３９．肝細胞に形質導入するＬＤＬＲの製剤
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、当該技術分野で既知、本明細書に記載および／または「修飾されたヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸組成物（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という表題のＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法を用いて調合する。本明細書で使用するＬＮＰは、イオン化可能な脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはカチオン性脂質Ｃ１２−２００を含み得る。
ＬＤＬＲまたはＬＤＬＲ突然変異体をコードする修飾ｍＲＮＡ（例えば、配列番号７〜１２；配列内に示されない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１；本明細書に記載の少なくとも１つの化学修飾で修飾）は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＣ１２−２００を含むＬＮＰ中で調合する。調合したＬＤＬＲまたはＬＤＬＲ突然変異体は、野生型マウスおよびＬＤＬＲ欠損マウスに投与する。野生型およびＬ
ＤＬＲ欠損マウスの肝細胞内でのＬＤＬＲの発現は、修飾ｍＲＮＡの投与後、所定の間隔で、当該技術分野で既知または本明細書に記載の方法を用いて測定する。
実施例４０．ＬＮＰと調合した修飾ｍＲＮＡの送達
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号４４で示されるｍＲＮＡ配列；配列内に示されない少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）は、５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンのいすれかで完全に修飾し、５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾し、プソイドウリジンで完全に修飾し、１−メチルシュードウリジンで完全に修飾し、またはウリジン残基の２５％は、２−チオウリジンで修飾し、またシトシン残基の２５％は、５−メチルシトシンで修飾する。次いで、ルシフェラーゼｍＲＮＡは、カチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＫＣ２）またはＣ１２−２００を含む脂質ナノ粒子中で調合する。ＰＢＳ中の調合したＬＮＰまたはＰＢＳ単独の対照は、表１３に概説のように、ＬＤＬＲ−／−または正常マウスに静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｅｏｕｓｌｙ）投与する。マウスは、注射の２時間、８時間、２４時間および４８時間経過後に画像化する。イメージングの１０分前、マウスの腹腔内にＤ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇ注射する。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳルミナ（Ｌｕｍｉｎａ）ＩＩイメージングシステム（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を用いて画像を得る。
表１３．投与計画
実施例４１．ＵＧＴ１Ａ１修飾ｍＲＮＡが投与された哺乳類の試験
Ａ．齧歯類
複数用量を用いる試験は、ラットおよび／またはマウス（例えば、ＬＤＬＲ−／−マウス）を用いて設計し、実施する。齧歯類は、本明細書に記載の、ヒト、マウスまたはラットＬＤＬＲまたはそのアイソフォームまたは変異体をコードする修飾ＬＤＬＲ ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇまたは０．０００５ｍｇ／ｋｇ、７日間にわたり、筋肉内または静脈内に２回以上注射する。ＬＤＬＲ ｍＲＮＡは、５％スクロース、生理食塩水または脂質ナノ粒子のいずれかの中で調合する。ＬＤＬＲタンパク質の発現およびｍＲＮＡ転写物における変化は、抗−ＬＤＬＲ抗体を用いるウエスタンブロット解析により、細胞可溶化物中で測定し、組織内の薬物濃度およびＬＤＬＲの転写物は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析する。本明細書に記載のように、ラット由来の血清は、所定の時間間隔の間に採取し、サイトカインパネルについて分析し、コレステロールレベルについてアッセイする（ａｓｓａｙ）。
Ｂ．非ヒト霊長類（ＮＨＰ：Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ）
５％スクロース、生理食塩水または脂質ナノ粒子中で調合したＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡは、非ヒト霊長類の筋肉内または静脈内に投与する。注射は、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡの用量として、０．００５〜０．５ｍｇ／ｋｇの間（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２０ｍｇ／ｋｇ、０．０３０ｍｇ／ｋｇ、０．０４０ｍｇ／ｋｇ、０．０５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）を含有する。ＬＤＬＲタンパク質の発現およびｍＲＮＡ転写物における薬物濃度変化は、抗−ＬＤＬＲ抗体を用いるウエスタンブロット解析により測定し、筋肉組織内の修飾ＬＤＬＲ ｍＲＮＡのレベルは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析する。本明細書に記載のように、非ヒト霊長類由来の血清は、注射後の所定の間隔で採取し、サイトカインパネルについて分析し、コレステロールレベルについてアッセイする（ａｓｓａｙ）。
実施例４２．哺乳類におけるＵＧＴ１Ａ１修飾ｍＲＮＡの反復投与試験
Ａ．齧歯類
複数用量を用いる試験は、ラットおよび／またはマウス（例えば、ＬＤＬＲ−／−マウス）を用いて設計し、実施する。齧歯類には、ヒトまたはラットＬＤＬＲをコードする修飾ＬＤＬＲ ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇまたは０．０００５ｍｇ／ｋｇ、４週間にわたり、筋肉内または静脈内に２回以上（例えば、毎日、週に２回、５日ごと、毎週、１０日ごと、隔週）注射する。ＬＤＬＲ ｍＲＮＡは、５％スクロース、生理食塩水または脂質ナノ粒子のいずれかの中で調合する。
ＬＤＬＲタンパク質の発現およびｍＲＮＡ転写物における変化は、抗−ＬＤＬＲ抗体を用いるウエスタンブロット解析により、細胞可溶化物中で測定し、組織内の薬物濃度およびＬＤＬＲの転写物は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析する。本明細書に記載のように、ラット由来の血清は、所定の時間間隔の間に採取し、サイトカインパネルについて分析し、サイトカインパネルについて分析し、コレステロールレベルについてアッセイする（ａｓｓａｙ）。
Ｂ．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）
５％スクロース、生理食塩水または脂質ナノ粒子中で調合したＬＤＬＲ修飾ｍＲＮＡは、４週間にわたり、非ヒト霊長類の筋肉内または静脈内に、２回以上（例えば、毎日、週に２回、５日ごと、毎週、１０日ごと、隔週）投与する。注射は、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡの用量として、０．００５〜０．５ｍｇ／ｋｇの間（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２０ｍｇ／ｋｇ、０．０３０ｍｇ／ｋｇ、０．０４０ｍｇ／ｋｇ、０．０５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）を含有する。
非ヒト霊長類は、試験の開始前に秤量し、また試験の８日目、１５日目および終了時に秤量する。ＬＤＬＲタンパク質の発現およびｍＲＮＡ転写物における薬物濃度変化は、抗−ＬＤＬＲ抗体を用いるウエスタンブロット解析により測定し、筋肉組織内の修飾ＬＤＬＲ ｍＲＮＡのレベルは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析する。本明細書に記載のように、非ヒト霊長類由来の血清は、注射後の所定の間隔で採取し、サイトカインパネルについて分析し、コレステロールレベルについてアッセイする（ａｓｓａｙ）。
実施例４３．微小生理システム
本明細書に記載のＬＤＬＲおよびその変異体をコードする修飾ｍＲＮＡは、本明細書に記載の方法のうちの１つを用いて、例えば緩衝液、脂質ナノ粒子およびＰＬＧＡの中で調合する。次いで、これらの製剤は、国際公開第２０１３０８６５０２号パンフレット、国
際公開第２０１３０８６４８６号パンフレットおよび国際公開第２０１３０８６５０５号パンフレット（これらの各々の内容はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載の器官チップから作製される微小生理システムに投与するかまたはそれに接触させる。
実施例４４．ＬＤＬＲ突然変異
一実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９への結合が欠損した少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定例として、ＬＤＬＲタンパク質は、本明細書に記載のように、ＰＣＳＫ９への結合が欠損するような少なくとも１つの突然変異を含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ディスエーブルド・ホモログ（ｄｉｓａｂｌｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇ）２のマイトジェン応答性リン酸化タンパク質（ｍｉｔｏｇｅｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＤＡＢ２）への結合が欠損し得る。理論に拘束されたくないが、ＤＡＢ２結合が欠損したＬＤＬＲは、ＬＤＬＲの内部移行をＤＡＢ２経路を介して制限し、ひいてはＬＤＬＲの取り込みを低下させ得る。
一実施形態では、ＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフを修飾し、ＬＤＬＲの被覆ピット（ｃｏａｔｅｄ ｐｉｔｓ）を介する速やかなエンドサイトーシスのためのシグナルを変更することができる。ＮＰＸＹモチーフは、少なくとも１つの突然変異、少なくとも２つの突然変異、少なくとも３つの突然変異、少なくとも４つの突然変異または５つ以上の突然変異を含み得る。非限定例として、ＮＰＸＹモチーフは、ＬＤＬＲ配列のアミノ酸８２２からアミノ酸８２９を含み得る。別の非限定例として、ＮＰＸＹモチーフは、配列ＮＦＤＮＰＶＹＱ（配列番号６２）を含み得る。
一実施形態では、ＬＤＬＲ配列は、ＮＰＸＹモチーフ内に突然変異を含まない。別の実施形態では、ＬＤＬＲ配列は、突然変異を含み得るが、突然変異は、ＬＤＬＲのアミノ酸８２２からアミノ酸８２９が（配列番号６２）で示される場合、ＬＤＬＲの位置８２２、８２６、８２７または８２８でない場合がある。
別の実施形態では、ＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフは、ソーティング・ネキシン（Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｎｅｘｉｎ）１７（ＳＮＸ１７）の、ＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフへの結合を低下させるように修飾され得る。ＳＮＸ１７の、ＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフへの結合の低下は、受容体のエンドソームリサイクリングを調節するため、用いることができる。
一実施形態では、ＳＮＸ１７のＰＸドメイン（ＰＩ３Ｐ結合）は、少なくとも１つの突然変異を含み得る。少なくとも１つの突然変異は、ＳＮＸ１７がＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフに結合し、それにより受容体のエンドソームリサイクリングを調節する能力を変更し得る。
一実施形態では、ＳＮＸ１７のＦＥＲＭ様ドメインは、少なくとも１つの突然変異を含み得る。少なくとも１つの突然変異は、ＳＮＸ１７がＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフに結合し、それにより受容体のエンドソームリサイクリングを調節する能力を変更し得る。
一実施形態では、ＳＮＸ１７のＲａｓ会合ドメインは、少なくとも１つの突然変異を含み得る。少なくとも１つの突然変異は、ＳＮＸ１７がＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフに結合し、それにより受容体のエンドソームリサイクリングを調節する能力を変更し得る。
一実施形態では、本明細書に記載のＬＤＬＲ配列は、リン酸化されている少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。非限定例として、配列ＮＱＤＧＹＳＹＰＳＲ（配列番号６３）
内の少なくとも１つのアミノ酸がリン酸化され得る。非限定例として、ＬＤＬＲの配列番号６３内の２つのチロシン（Ｙ）がリン酸化され得る。別の非制限例として、本明細書に記載のＬＤＬＲ配列内の少なくとも１つのチロシン（Ｙ）がリン酸化され得る。さらに別の非限定例として、本明細書に記載のＬＤＬＲの、８４５位のチロシンおよび８４７位のチロシンがリン酸化される。
一実施形態では、本明細書に記載のＬＤＬＲ配列は、リン酸化されている少なくとも１つのアミノ酸を含み得るが、８２８位のチロシンはリン酸化されない。
別の実施形態では、本明細書に記載のＬＤＬＲ配列は、リン酸化されている少なくとも１つのアミノ酸を含んでもよく、ここでアミノ酸の少なくとも１つは８２８位のチロシンである。
一実施形態では、本明細書に記載のＬＤＬＲ配列は、Ｃ末端配列ＬＥＤＤＶＡ（配列番号６４）内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み得る。非限定例として、配列番号６４は、ＬＤＬＲ配列のアミノ酸８５５からアミノ酸８６０であり得る。
一実施形態では、ＬＤＬＲ配列は、ＬＤＬＲ配列のＮ連結糖鎖付加部位に少なくとも１つの突然変異を含み得る。非限定例として、少なくとも１つの突然変異は、アミノ酸９７、１５６、２７２、５１５および／または６５７に位置し得る。
別の実施形態では、ＬＤＬＲ配列は、ＬＤＬＲ配列のＯ連結糖鎖付加部位に少なくとも１つの突然変異を含み得る。非限定例として、少なくとも１つの突然変異は、アミノ酸７２１〜７６８に位置し得る。
さらに別の実施形態では、ＬＤＬＲ配列は、Ｎ連結糖鎖付加部位に少なくとも１つの突然変異および（ａｎｔ）Ｏ連結糖鎖付加部位に少なくとも１つの突然変異を含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ１）に対する結合が欠損し得る。理論に拘束されたくないが、ＬＤＬＲＡＰ１への結合が欠損したＬＤＬＲは、ＬＤＬＲの結合および内部移行を制限し、ひいてはＬＤＬＲの取り込みを低下させ得る。
一実施形態では、本明細書に記載のＬＤＬＲ配列および構築物のエクトドメインは、細胞質ドメインと融合され得る。非限定例として、ＬＤＬＲエクトドメインは、葉酸塩受容体ＴＭ−細胞質ドメインと融合され得る。別の非限定例として、ＬＤＬＲエクトドメインは、ＧＰＩ連結受容体ＴＭ−細胞質ドメインと融合され得る。
他の実施形態
使用されている用語が限定でなく説明の用語であり、かつ、添付の特許請求の範囲の範囲内で、そのより広範な態様においては本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく、変更がなされる場合があることは理解されるべきである。
本発明は、いくつかの記載の実施形態と関連して、いくらかの長さで、またいくつかの特殊性とともに説明されている一方、任意のかかる詳細または実施形態あるいは任意の特定の実施形態に限定されることは意図されていないが、先行技術を考慮してかかる特許請求の範囲の考えられる最も広い解釈を提供し、ひいては本発明の意図される範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
本明細書に記載のすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により援用される。紛争の場合、定義を含む本明細書によって調整されることになる。さらに、セクション見出し、材料、方法、および実施例は、あくまで例示的なもので
あり、限定することは意図されていない。

Claims (19)

  1. （ａ）ＰＣＳＫ９陰性ＬＤＬＲをコードする合成ポリヌクレオチド、および
    （ｂ）ＣＹＰ７Ａ１をコードする合成ポリヌクレオチド
    を、許容可能な希釈剤または担体中に含む組成物。
  2. （ｃ）アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるスタチン
    をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記合成ポリヌクレオチドが、
    （ａ）少なくとも１つのコレステロールを調節するポリペプチドをコードする、連結ヌクレオシドの第１領域；
    （ｂ）（ｉ）天然５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、配列番号１およびその機能的変異体からなる群から選択される連結ヌクレオシドの配列；
    を含む、前記第１領域の５’末端に位置する第１隣接領域；ならびに
    （ｃ）（ｉ’）天然３’ＵＴＲ、１つ以上のマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ結合部位またはマイクロＲＮＡシードを含む前記のいずれか、およびその機能的変異体または組み合わせ、からなる群から選択される連結ヌクレオシドの配列；および
    （ｉｉ’）連結ヌクレオシドの３’テーリング配列；
    を含む、前記第１領域の３’末端に位置する第２隣接領域；
    を含み、連結ヌクレオシドの前記第１領域は、少なくとも第１の修飾ヌクレオシドを含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記第２隣接領域は、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位をコードする、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記ｍｉＲ結合部位が、ｍｉＲ−１２２ａおよびｍｉＲ−４２２ａからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記合成ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 対象における肝細胞を、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物と接触させるステップを含む、方法。
  8. 前記対象の血漿中のコレステロールレベルを測定するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記肝細胞をスタチンと接触させるステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  10. 前記対象が、ヒトである、請求項７に記載の方法。
  11. 前記ヒトが、ＣＹＰ７Ａ１中に多型を有する、請求項１０に記載の方法。
  12. その治療を必要とする対象における疾患または障害を治療する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  13. 前記疾患または障害が、脂肪肝疾患、肝細胞がん、ＮＡＳＨ、脂肪過多症、家族性高コ
    レステロール血症（ＦＨ）、高コレステロール血症、および異常なリポタンパク質プロファイルからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記疾患または障害が、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）である、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記組成物が、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記組成物が、脂質を含み、かつ前記脂質が、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ｒｅＬＮＰ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＡおよびＰＥＧ化脂質ならびにそれらの混合物から選択される、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記合成ポリヌクレオチドが、１ｕｇ〜１５０ｕｇの間の全一日用量で投与される、請求項１２に記載の方法。
  18. 対象の血漿中のコレステロールレベルを調節する方法であって、前記対象を請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物と接触させるステップを含む、方法。
  19. 調節が、レベルの低下である、請求項１８に記載の方法。
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