CN104812372A - 脂质体药物递送系统 - Google Patents

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V·皮莱
L·C·杜图伊托
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Abstract

本发明涉及药物递送系统，具体地涉及脂质体药物递送系统。最具体地，本发明涉及用于在人体或动物体内在靶位释放至少一种药物化合物的脂质体药物递送系统。本发明延伸至制备所述药物递送系统的方法。

Description

脂质体药物递送系统
发明领域
本发明涉及药物递送系统(DDS)，具体地涉及脂质体药物递送系统(LDDS)。最具体地，本发明涉及用于在人体或动物体内在靶位释放至少一种药物化合物的脂质体药物递送系统(LDDS)，所述脂质体药物递送系统(LDDS)包含由二硬脂酰磷酸胆碱(distearoyl phosphocholine,DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-PEG(DSPE-m-PEG)或胆固醇(CHO)构成的脂质体壳，以及容纳在所述脂质体壳内部的药物化合物。本发明延伸至制备所述药物递送系统的方法。
      发明背景
癌症仍然是最使人虚弱的病症之一以及全世界死亡率的显著起因，其临床模式突出了在发病年龄中的烦扰的退行(Tang et al.,2009)。卵巢癌是所有妇科癌症中最具攻击性的，其具有高的复发率和可怜的五年生存率(five-yearsurvival rate)(Chien et al.,2007；Ferrandina et al.,2006)。卵巢癌的预后不良可归因于明显症状的不存在和早期检测机制的缺失，导致晚期疾病和在诊断时的转移(Rose et al.,1996；Hornung et al.,1999；Ferrandina et al.,2006；Cirstoiu-Hapca et al.,2010；Kim et al.,2011)。
尽管癌症研究是广泛和动态的领域，但是足够安全和有效的治疗模态对医学职业者而言仍然是个难题(Liu et al.,2009)。对卵巢癌而言当前的治疗方案涉及外科清创术以及用紫杉烷/铂化合物组合辅助化疗(Stuart,2003；Cirstoiu-Hapca et al.,2010；Kim et al.,2011)。作为一类的抗肿瘤药物对活跃性分化组织不加区别地发挥作用，导致严重的、通常威胁生命的副作用，包括：免疫抑制、胃肠道紊乱、脱发、心脏并发症和神经病(Vauthier et al.,2003；Choet al.,2007；Cirstoiu-Hapca et al.,2010；Mohanty and Sahoo,2010；Guo et al.,2011；Shapira et al.,2011)。另外，全身给药的化学治疗药物渗透到肿瘤组织并由此产生抗肿瘤功效，这受制于诸如肿瘤脉管系统的异质性和肿瘤内部高的组织间隙压等因素(Park J W,2002)。因此，实现最佳的抗肿瘤治疗同时将副作用减到最小之间的平衡仍然是非常棘手的。
除了非特异性生物扰动和随后的有害副作用外，由于固有的较差的水溶性，抗肿瘤药物还具有重大的制剂挑战(Pathak et al.,2006)。由于生物利用度增强同时将侵害最小化，静脉内(IV)给药途径就抗肿瘤治疗的功效而言提供了重要的益处。抗肿瘤药物的IV制剂通常涉及利用额外的增溶剂和/或载体媒介物，和/或复杂的配制过程，其中的每种都具有它们各自的不足诸如副作用和增加的生产成本。出于上述原因，显著减少了模型药物喜树碱(CPT)的临床使用。尽管CPT对包括卵巢癌在内宽泛围的实体肿瘤都是非常强效的，但是其较差的水溶性与严重的副作用分布结合起来成为CPT的临床有用性的一个重要缺点(Schluep et al.,2006；Liu et al.,2009；Fan et al.,2010)。因此已经开发并临床使用了CPT的水溶性衍生物诸如伊立替康和拓扑替康。然而，这些衍生物的功效显著低于CPT的功效。
纳米结构的巨大的吸引力是由于它们独特的性质，这使得它们区分于从其中获得它们的大块材料(Knopp et al.,2009,Ranjan et al.,2009)。用于生物医学应用的纳米系统是当前深入研究的领域，并已显示巨大的潜力，特别是在诊断、成像和治疗领域(Dominguez and Lustegarten,2010)。纳米系统的众多益处涉及增加的表面积-体积比(Khosravi-Darani et al.,2007；Chen et al.,2011；Vizirianakis,2011)。
脂质体药物递送系统(LDDS)是已知的，且具有许多缺点。这些缺点包括受限的脂质体在体内的受限的生存期和在储存期间药物从脂质体内部的泄露(Madrigal-Carballo et al.,2010；Chun et al.,2013)。已知的LDDS通常是大的，直径超过约200nm，妨碍了在靶位的蓄积。
对可递送抗肿瘤药物化合物至肿瘤位点的药物递送系统存在需求，所述药物递送系统优选为可经由静脉内(IV)给药将亲脂性抗肿瘤药物化合物生物特异性递送至实体肿瘤位点的DDS，从而使得所述药物递送系统有效地靶向肿瘤并集中在肿瘤位点以有效释放药物化合物。对具有上述特性的药物递送系统存在需求，所述药物递送系统可以简单地制备、易于配制成IV制剂，以及是稳定的，从而允许延长的储存。
      发明概述
宽泛的说，本发明涉及用于在人体或动物体内在靶位释放至少一种药物化合物的脂质体药物递送系统(LDDS)，所述脂质体药物递送系统(LDDS)包含由至少一种磷脂构成的脂质体壳，所述壳在其中限定内腔室(innercompartment)。所述LDDS还可包含容纳在由所述脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。所述LDDS还可包含表面活性剂。
根据本发明的第一方面，提供了用于在人体或动物体内在靶位释放至少一种药物化合物的脂质体药物递送系统(LDDS)，所述脂质体药物递送系统(LDDS)包含由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)构成的脂质体壳，所述壳在其中限定内腔室。
所述脂质体药物递送系统(LDDS)还可包含容纳在由所述脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。
二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)可以是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)可以是L-α-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基-聚乙二醇缀合物。
所述脂质体壳还可包含表面活性剂。所述表面活性剂可以是选自、但不限于以下的至少一种表面活性剂：磺基琥珀酸二辛酯(DOS)、吐温80和司盘80，或它们的任何组合，优选地，所述表面活性剂为磺基琥珀酸二辛酯(DOS)。所述表面活性剂在使用中可增加所述脂质体壳的结构稳定性，以及可促进具有纳米化的尺寸的脂质体壳的形成。
可设置所述脂质体壳使得所述二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)的非极性官能团向内朝向所述腔室的内部，以及极性官能团向外朝向所述壳的外表面。在使用中，所述脂质体壳的非极性官能团增加了容纳在所述腔室之内的非极性药物化合物和/或亲脂性药物化合物诸如喜树碱的溶解。
所述药物化合物可以是选自、但不限于以下的至少一种药物化合物：氨基酸，止痛药，消炎药，驱虫剂，抗细菌剂，氨基糖苷类，β-内酰胺类抗生素，糖肽类，青霉素类，喹诺酮类，磺胺类，镇定剂，强心苷，抗帕金森剂(antiparkinson agent)，抗抑郁药，抗肿瘤剂，免疫抑制剂，抗病毒剂，抗生素制剂，抗真菌剂，抗微生物剂，食欲抑制剂，止吐剂，抗组胺剂，抗偏头痛药，冠状、大脑或外周血管扩张药，抗心绞痛药，钙通道阻滞剂，激素药物，避孕药，抗血栓剂，利尿剂，抗高血压药，化学依赖性药物(chemicaldependency drug)，局部麻醉剂，皮质类固醇，皮肤病药，维生素，类固醇，唑类衍生物，硝基化合物，胺化合物，昔康类衍生物，粘多糖，阿片类化合物，吗啡样药物，芬太尼衍生物和类似物，前列腺素，苯甲酰胺类，肽，呫吨类，儿茶酚胺类，二氢吡啶类，噻嗪类，斯德酮亚胺，多糖，降胆固醇剂，植物化学物质和抗氧化剂，或上述物质的任何衍生物。列出上述药物类别是出于说明性目的，不管引入到其中的活性物质和/或物质是怎样的，本发明的脂质体药物递送系统(LDDS)都可包括任何药物制剂。
优选地所述药物为选自、但不限于以下的至少一种抗肿瘤药物：喜树碱、紫杉烷和铂化合物，优选地所述抗肿瘤药物为喜树碱。在所述药物为喜树碱的实施方案中，所述腔室提供了对所容纳的药物的保护，从而防止在生理条件下在使用中通常发生的内酯开环。所述脂质体壳的非极性基团促进容纳非极性药物诸如喜树碱(CPT)，由此防止在使用中在所述脂质体壳到达靶位之前药物从所述脂质体壳泄露。
所述靶位可以是位于人体或动物体中或人体或动物体上的癌细胞，优选地为形成肿瘤的癌细胞，更优选地为作为卵巢肿瘤的肿瘤。
所述脂质体壳可具有小于约200nm、优选地小于约160nm的直径。所述脂质体壳可被依尺寸制造从而形成纳米脂质体(NLS)。在使用中，纳米脂质体提高了高通透性和滞留(EPR)效应，由此促进增多的药物递送至靶位。直径约200nm或更小、优选地小于约160nm的脂质体壳会促进所述脂质体壳成功靶向至肿瘤。
所述纳米脂质体(NLS)还可含有容纳在由所述壳限定的内腔室之内的气体，从而形成纳米脂质气泡(nanolipobubble，NLB)以及由此的纳米脂质气泡脂质体药物递送系统(NLB-LDDS)。
所述气体可以是选自、但不限于以下的至少一种气体：空气，氮气，氧气，二氧化碳，氢气，一氧化二氮，稀有气体或惰性气体诸如氦，氩，氙或氪；放射性气体诸如Xe133或Kr81；超极化稀有气体，低分子量的烃诸如甲烷，乙烷，丙烷，丁烷，异丁烷，戊烷或异戊烷；环烷烃诸如环丁烷或环戊烷；烯烃诸如丙烯，丁烯或异丁烯；或炔烃诸如乙炔；醚；酮；酯；卤化气体，优选地氟化或全氟化的气体，诸如氟代烃；六氟化硫；全氟丙酮；全氟乙醚；全氟烷烃；全氟烯烃；全氟炔烃；全氟环烷烃；和饱和全氟化碳。优选，所述气体是六氟化硫。
在使用中，气体从腔室向外扩散至靶位引起了纳米脂质气泡(NLB)的气穴现象(cavitation)，破坏了其结构完整性，并且又促进了药物化合物从腔室之内释放到靶位。
所述脂质体壳还可包含至少部分覆盖所述壳的聚合物包衣。所述聚合物包衣可以响应于pH，从而在低于生理学pH、更优选地在类似于癌瘤的pH值、典型地为约pH 6的pH值下进行构象变化和破坏所述包衣的结构完整性。所述聚合物包衣可以是选自、但不限于以下的至少一种聚合物包衣：生物相容性聚合物；离子聚合物，优选地为阴离子和/或阳离子聚合物。所述离子聚合物可包括但不限于：明胶，聚乙烯亚胺(PEI)，聚-L-赖氨酸(PLL)，角叉菜胶，果胶，藻酸钠，羧酸聚合物，硫酸盐(sulfate)和胺官能化的聚合物诸如聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺，多糖诸如藻酸、果胶酯酸、羧甲基纤维素、透明质酸、肝素(粘多糖)、脱乙酰壳多糖、羧甲基脱乙酰壳多糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸肝素、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉和它们的盐，聚(氰基丙烯酸丁酯)(PBCA)，聚(乳酸)(PLA)，聚(富马酸丙二醇酯)(PPF)，聚酐。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述聚合物包衣为阳离子聚合物，更优选地为脱乙酰壳多糖。
在本发明的另一个实施方案中，所述脂质体壳用依次涂层的两层或更多层包衣层进行包衣。所述依次涂层的两层或更多层包衣层优选地在阳离子聚合物包衣层和阴离子聚合物包衣层之间交替。所述阳离子聚合物包衣层优选地为脱乙酰壳多糖(CHT)，以及所述阴离子聚合物包衣层优选地为聚丙烯酸(PAA)。
所述脂质体壳还可包含冻干保护剂。优选地，所述冻干保护剂可以是糖。所述糖可以是选自、但不限于以下的至少一种糖：乳糖和果糖。
在本发明的第一方面的一个优选实施方案中，提供了纳米脂质体药物递送系统，其包含：
由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)和表面活性剂构成的纳米脂质体壳，所述壳限定内腔室；以及
容纳在由纳米脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。
所述纳米脂质体壳还可包含容纳在内腔室之内的气体从而形成纳米脂质气泡(NLB)。
所述纳米脂质体壳和/或所述纳米脂质气泡还可包含至少部分覆盖所述壳的聚合物包衣。
根据本发明的第二方面，提供了用于在人体或动物体内在靶位释放至少一种药物化合物的脂质体药物递送系统(LDDS)，所述脂质体药物递送系统包含由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)构成的脂质体壳，所述壳限定内腔室。
所述二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)可以是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
所述脂质体药物递送系统还可包含容纳在由所述脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。
所述脂质体壳还可包含表面活性剂。所述表面活性剂可以是选自、但不限于以下的至少一种表面活性剂：磺基琥珀酸二辛酯(DOS)、吐温80和司盘80，或它们的任何组合，优选地，所述表面活性剂为磺基琥珀酸二辛酯(DOS)。所述表面活性剂在使用中可增加所述脂质体壳的结构稳定性，以及可促进具有纳米化的尺寸的脂质体壳的形成。
可设置所述脂质体壳使得二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)的非极性官能团向内朝向所述腔室，以及极性官能团向外朝向所述壳的外表面。在使用中，所述脂质体壳的非极性官能团增加了容纳在所述腔室之内的非极性药物化合物和/或亲脂性药物化合物诸如喜树碱的溶解。
所述药物化合物可以是选自、但不限于以下的至少一种药物化合物：氨基酸，止痛药，消炎药，驱虫剂，抗细菌剂，氨基糖苷类，β-内酰胺类抗生素，糖肽类，青霉素类，喹诺酮类，磺胺类，镇定剂，强心苷，抗帕金森剂，抗抑郁药，抗肿瘤剂，免疫抑制剂，抗病毒剂，抗生素制剂，抗真菌剂，抗微生物剂，食欲抑制剂，止吐剂，抗组胺剂，抗偏头痛药，冠状、大脑或外周血管扩张药，抗心绞痛药，钙通道阻滞剂，激素药物，避孕药，抗血栓剂，利尿剂，抗高血压药，化学依赖性药物，局部麻醉剂，皮质类固醇，皮肤病药，维生素，类固醇，唑类衍生物，硝基化合物，胺化合物，昔康类衍生物，粘多糖，阿片类化合物，吗啡样药物，芬太尼衍生物和类似物，前列腺素，苯甲酰胺类，肽，呫吨类，儿茶酚胺类，二氢吡啶类，噻嗪类，斯德酮亚胺(sydnonimines)，多糖，降胆固醇剂，植物化学物质和抗氧化剂，或上述物质的任何衍生物。列出上述药物类别是出于说明性目的，不管引入到其中的活性物质和/或物质是怎样的，本发明的脂质体药物递送系统(LDDS)都可包括任何药物制剂。
优选地所述药物为选自、但不限于以下的至少一种抗肿瘤药物：喜树碱、紫杉烷和铂化合物，优选地所述抗肿瘤药物为喜树碱。在所述药物为喜树碱的实施方案中，所述腔室提供了对所容纳的药物的保护，从而防止在生理条件下在使用中通常发生的内酯开环。所述脂质体壳的非极性基团促进容纳非极性药物诸如喜树碱(CPT)，由此防止在使用中在所述脂质体壳到达靶位之前药物从所述脂质体壳泄露。
所述靶位可以是癌细胞，优选地为形成肿瘤的癌细胞，更优选地为作为卵巢肿瘤的肿瘤。
所述脂质体壳可具有小于约200nm、优选地小于约160nm的直径。所述脂质体壳可被依尺寸制造从而形成纳米脂质体(NLS)。在使用中，纳米脂质体提高了高通透性和滞留(EPR)效应，由此促进增多的药物递送至靶位。直径约200nm或更小、优选地小于约160nm的脂质体壳会促进所述脂质体壳成功靶向至肿瘤。
所述纳米脂质体(NLS)还可含有容纳在由所述壳限定的内腔室之内的气体，从而形成纳米脂质气泡(NLB)以及由此的纳米脂质气泡脂质体药物递送系统(NLB-LDDS)。
所述气体可以是选自、但不限于以下的至少一种气体：空气，氮气，氧气，二氧化碳，氢气，一氧化二氮，稀有气体或惰性气体诸如氦，氩，氙或氪；放射性气体诸如Xe133或Kr81；超极化稀有气体，低分子量的烃诸如甲烷，乙烷，丙烷，丁烷，异丁烷，戊烷或异戊烷；环烷烃诸如环丁烷或环戊烷；烯烃诸如丙烯，丁烯或异丁烯；或炔烃诸如乙炔；醚；酮；酯；卤化气体，优选地氟化或全氟化的气体，诸如氟代烃；六氟化硫；全氟丙酮；全氟乙醚；全氟烷烃；全氟烯烃；全氟炔烃；全氟环烷烃；和饱和全氟化碳。优选，所述气体是六氟化硫。
在使用中，气体从腔室向外扩散至靶位引起了纳米脂质气泡(NLB)的气穴现象，破坏了其结构完整性，并且又促进了药物化合物从腔室之内释放到靶位。
所述脂质体壳还可包含至少部分覆盖所述壳的聚合物包衣。所述聚合物包衣可以响应于pH，从而在低于生理学pH、更优选地在类似于癌瘤的pH值、典型地为约pH 6的pH值下进行构象变化和破坏所述包衣的结构完整性。所述聚合物包衣可以是选自、但不限于以下的至少一种聚合物包衣：生物相容性聚合物；离子聚合物，优选地为阴离子和/或阳离子聚合物。所述离子聚合物可包括但不限于：明胶，聚乙烯亚胺(PEI)，聚-L-赖氨酸(PLL)，角叉菜胶，果胶，藻酸钠，羧酸聚合物，硫酸盐和胺官能化的聚合物诸如聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺，多糖诸如藻酸、果胶酯酸、羧甲基纤维素、透明质酸、肝素(粘多糖)、脱乙酰壳多糖、羧甲基脱乙酰壳多糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸肝素、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉和它们的盐，聚(氰基丙烯酸丁酯)(PBCA)，聚(乳酸)(PLA)，聚(富马酸丙二醇酯)(PPF)，聚酐。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述聚合物包衣为阳离子聚合物，更优选地为脱乙酰壳多糖。
在本发明的另一个实施方案中，所述脂质体壳用依次涂层的两层或更多层包衣层进行包衣。所述依次涂层的两层或更多层包衣层优选地在阳离子聚合物包衣层和阴离子聚合物包衣层之间交替。所述阳离子聚合物包衣层优选地为脱乙酰壳多糖，以及所述阴离子聚合物包衣层优选地为聚丙烯酸。
所述脂质体壳还可包含冻干保护剂。优选地，所述冻干保护剂可以是糖。所述糖可以是选自、但不限于以下的至少一种糖：乳糖和果糖。
在本发明的第二方面的一个优选的实施方案中，提供了纳米脂质体药物递送系统，其包含：
由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇(CHO)和表面活性剂构成的脂质体壳，所述壳限定内腔室；以及
容纳在由所述脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。
所述纳米脂质体壳还可包含容纳在内腔室之内的气体从而形成纳米脂质气泡(NLB)。
所述纳米脂质体壳和/或所述纳米脂质气泡还可包含至少部分覆盖所述壳的聚合物包衣。
根据本发明的第三方面，提供了脂质体壳用于在诊断和/或治疗疾病中将药物化合物递送至人体或动物体的靶位的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)构成，所述壳限定内腔室。
所述脂质体壳还可包含容纳在内腔室之内的药物化合物。
所述疾病可以是癌症，以及可以是选自、但不限于以下的至少一种癌症：乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌，结肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，脑癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，卵巢癌，和血液恶性肿瘤诸如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。优选地，所述癌症是卵巢癌。
根据本发明的第四方面，提供了脂质体壳在制备用于在治疗疾病中将药物化合物递送至人体或动物体的靶位的药物中的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)构成，所述壳限定内腔室。
所述药物可被配制成静脉内(IV)制剂。
所述脂质体壳还可包含容纳在内腔室之内的药物化合物.
所述疾病可以是癌症，以及可以是选自、但不限于以下的至少一种癌症：乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌，结肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，脑癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，卵巢癌，和血液恶性肿瘤诸如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。优选地，所述癌症是卵巢癌。
根据本发明的第五方面，提供了脂质体壳用于在诊断和/或治疗疾病中将药物化合物递送至人体或动物体的靶位的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)构成。
所述脂质体壳还可包含容纳在内腔室之内的药物化合物。
所述疾病可以是癌症，以及可以是选自、但不限于以下的至少一种癌症：乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌，结肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，脑癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，卵巢癌，和血液恶性肿瘤诸如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。优选地，所述癌症是卵巢癌。
根据本发明的第六方面，提供了脂质体壳在制备用于在治疗疾病中将药物化合物递送至人体或动物体的靶位的药物中的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)构成。
所述药物可被配制成静脉内(IV)制剂。
所述脂质体壳还可包含容纳在内腔室之内的药物化合物。
所述疾病可以是癌症，以及可以是选自、但不限于以下的至少一种癌症：乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌，结肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，脑癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，卵巢癌，和血液恶性肿瘤诸如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。优选地，所述癌症是卵巢癌。
根据本发明的第七方面，提供了通过将根据本发明的第一和/或第二方面的脂质体药物递送系统(LDDS)给予需要治疗癌症的人或动物来治疗癌症、优选为卵巢癌的方法。
根据本发明的第八方面，提供了制备根据本发明的第一方面的脂质体药物递送系统(LDDS)的方法，所述方法包括以下步骤：
将DSPC和DSPE-m-PEG加到有机溶剂、优选地为氯仿和甲醇的混合物中，产生溶液1；
将表面活性剂、优选地为DOS加到溶液1中，形成溶液2；
将药物化合物、优选地为CPT加到溶液2中，形成溶液3；
将磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)加到溶液3中，形成溶液4；以及
真空蒸发溶液4，产生LLDS的水溶液。
根据本发明的第九方面，提供了制备根据本发明的第二方面的脂质体药物递送系统(LDDS)的方法，所述方法包括以下步骤：
将DSPC和胆固醇(CHO)加到有机溶剂、优选地为氯仿和甲醇的混合物中，产生溶液1；
将表面活性剂、优选地为DOS加到溶液1中，形成溶液2；
将药物化合物、优选地为CPT加到溶液2中，形成溶液3；
将磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)加到溶液3中，形成溶液4；以及
真空蒸发溶液4，产生LLDS的水溶液。
附图说明
本发明的实施方案仅通过实施例的方式并参考附图描述，在附图中：
图1显示了根据本发明的第二方面的DSPC:CHO纳米脂质体药物递送系统在T＝0小时(a)和T＝3小时(b)的典型ζ尺寸分布(尺寸vs强度)。图1还显示根据本发明的第一方面的DSPC:DSPE-m-PEG纳米脂质体药物递送系统在T＝0小时(c)和T＝3小时(d)的典型ζ尺寸分布(尺寸vs强度)；
图2a-c显示了根据本发明的第一方面的、具有不同的DSPC:DSPE-m-PEG比例的、纳米脂质体药物递送系统(LDDS)的药物释放分数(fractional drug release)。图2d-f显示了根据本发明的第二方面的、具有不同DSPC:CHO(3:1–1:3)比例的纳米脂质体药物递送系统(LDDS)的药物释放分数；
图3显示了分别在30000x放大率(a)、40000x放大率(b)和50000x放大率(c)的DSPC:CHO纳米脂质体(NLS)的透射电子显微照片；
图4显示了以下的微超声图像：a)引入DSPC:CHO纳米脂质体之前的角叉菜胶水凝胶，b)注射纳米脂质体和c)注射后2分钟纳米脂质体在水凝胶中的分散；
图5显示了a)候选CHO-NLS、b)CHO-NLB、c)候选DSPE-m-PEG-NLS和d)DSPE-m-PEG-NLB的尺寸强度分布。(在所有情况中n＝3以及SD<0.02)；
图6显示了用CHT和PAA包衣的CHO-NLS的冻干后产物的扫描电子显微照片(4800x放大率)；
图7显示了用FITC染料标记的a)CHO-NLB和b)DSPE-m-PEG-NLB的荧光显微照片，证实冻干、重构和SF6气体引入后NLB结构的恢复；
图8显示了对CPT和SB在CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB中改变后的DIE的图解说明；
图9显示了在肿瘤和生理学pH历时24小时CPT从a)候选CHO-NLS和DSPE-m-PEG-NLS以及b)候选CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB中的药物释放分数分布(在所有情况中n＝3以及SD<0.02)；
图10显示了在肿瘤和生理学pH下历时24小时a)CPT和b)SB从含有SB的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB中的药物释放分数(在所有情况中n＝3以及SD<0.02)；
图11显示了在肿瘤和生理学pH下历时24小时a)CPT和b)SB从用CHT和PAA层层(layer-by-layer)包衣的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB中的药物释放分数(在所有情况中n＝3以及SD<0.02)；
图12显示了在非参照模型中，在环境温度重构后至多12小时a)未包衣的CHO-NLB和b)用CHT和PAA聚合物层层包衣的CHO-NLB的背散射分布。背散射的变化作为c)未包衣的CHO-NLB和d)用CHT和PAA聚合物层层包衣的CHO-NLB的时间的函数，参照初始测量；
图13显示了在非参照模型中，在环境温度重构后至多12小时a)未包衣的DSPE-m-PEG-NLB和b)用CHT和PAA聚合物层层包衣的DSPE-m-PEG-NLB的背散射分布。背散射的变化作为c)未包衣的DSPE-m-PEG-NLB和d)用CHT和PAA聚合物层层包衣的DSPE-m-PEG-NLB的时间的函数，参照初始测量；以及
图14显示了用CHT和PAA聚合物层层包衣的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB在环境温度和冷藏温度下储存历时三个月的时间段的a)平均尺寸，b)ζ电位，c)CPT引入和D)SB引入(在所有情况中n＝3以及SD<0.03)。
      本发明的实施方案的详细描述
宽泛地说，本发明涉及用于在人体或动物体内在靶位释放至少一种药物化合物的脂质体药物递送系统(LDDS)，所述脂质体药物递送系统(LDDS)包含由至少一种磷脂构成的脂质体壳，所述壳在其中限定内腔室。所述LDDS还可包含容纳在由所述脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。所述LDDS还可包含表面活性剂。
根据本发明的第一方面，提供了用于在人体或动物体内在靶位释放至少一种药物化合物的脂质体药物递送系统(LDDS)，所述脂质体药物递送系统(LDDS)包含由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)构成的脂质体壳，所述壳限定内腔室。典型地，所述二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，以及所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)是L-α-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基-聚乙二醇缀合物(DSPE-m-PEG)。
所述脂质体药物递送系统(LDDS)通常包含容纳在由所述脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。所述药物化合物可以是选自、但不限于以下的至少一种药物化合物：氨基酸，止痛药，消炎药，驱虫剂，抗细菌剂，氨基糖苷类，β-内酰胺类抗生素，糖肽类，青霉素类，喹诺酮类，磺胺类，镇定剂，强心苷，抗帕金森剂，抗抑郁药，抗肿瘤剂，免疫抑制剂，抗病毒剂，抗生素制剂，抗真菌剂，抗微生物剂，食欲抑制剂，止吐剂，抗组胺剂，抗偏头痛药，冠状、大脑或外周血管扩张药，抗心绞痛药，钙通道阻滞剂，激素药物，避孕药，抗血栓剂，利尿剂，抗高血压药，化学依赖性药物，局部麻醉剂，皮质类固醇，皮肤病药，维生素，类固醇，唑类衍生物，硝基化合物，胺化合物，昔康类衍生物，粘多糖，阿片类化合物，吗啡样药物，芬太尼衍生物和类似物，前列腺素，苯甲酰胺类，肽，呫吨类，儿茶酚胺类，二氢吡啶类，噻嗪类，斯德酮亚胺，多糖，降胆固醇剂，植物化学物质和抗氧化剂，或上述物质的任何衍生物。列出上述药物类别是出于说明性目的，不管引入到其中的活性物质和/或物质是怎样的，本发明的脂质体药物递送系统(LDDS)都可包括任何药物制剂。
优选地所述药物为选自、但不限于以下的至少一种抗肿瘤药物：喜树碱、紫杉烷和铂化合物，优选地所述抗肿瘤药物为喜树碱。在所述药物为喜树碱的实施方案中，所述腔室提供了对所容纳的药物的保护，从而防止在生理条件下在使用中通常发生的内酯开环。所述脂质体壳的非极性基团促进容纳非极性药物诸如喜树碱(CPT)，由此防止在使用中在所述脂质体壳到达靶位之前药物从所述脂质体壳泄露。
所述脂质体壳还可包含表面活性剂。所述表面活性剂可以是选自、但不限于以下的至少一种表面活性剂：磺基琥珀酸二辛酯(DOS)、吐温80和司盘80，或它们的任何组合，优选地，所述表面活性剂为磺基琥珀酸二辛酯(DOS)。所述表面活性剂在使用中可增加所述脂质体壳的稳定性。所述表面活性剂典型地吸附到所述脂质体壳中或吸附到所述脂质体壳上。脂质体壳中表面活性剂浓度越高，稳定作用越好，并且所形成的脂质体壳越小。所述表面活性剂促进具有纳米化的尺寸的脂质体壳的制备。
所述脂质体壳被典型地设置使得二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)的非极性官能团向内朝向所述腔室，以及极性官能团向外朝向所述壳的外表面。在使用中，所述脂质体壳的非极性官能团增加了容纳在所述腔室之内的非极性药物化合物和/或亲脂性药物化合物诸如喜树碱的溶解。
所述靶位典型地是位于人体或动物体中或人体或动物体上的癌细胞，优选地为形成肿瘤的癌细胞，更优选地为作为卵巢肿瘤的肿瘤。
所述脂质体壳可具有小于约200nm、优选地小于约160nm的直径。所述脂质体壳可被依尺寸制造从而形成纳米脂质体(NLS)。在使用中，纳米脂质体提高了高通透性和滞留(EPR)效应，由此促进增多的药物递送至靶位。直径约200nm、优选地小于约160nm的脂质体壳会促进所述脂质体壳成功靶向至肿瘤。
所述纳米脂质体(NLS)典型地还含有容纳在由所述壳限定的内腔室之内的气体，从而形成纳米脂质气泡(NLB)以及由此的纳米脂质气泡脂质体药物递送系统(NLB-LDDS)。所述气体可以是选自、但不限于以下的至少一种气体：空气，氮气，氧气，二氧化碳，氢气，一氧化二氮，稀有气体或惰性气体诸如氦，氩，氙或氪；放射性气体诸如Xe133或Kr81；超极化稀有气体，低分子量的烃诸如甲烷，乙烷，丙烷，丁烷，异丁烷，戊烷或异戊烷；环烷烃诸如环丁烷或环戊烷；烯烃诸如丙烯，丁烯或异丁烯；或炔烃诸如乙炔；醚；酮；酯；卤化气体，优选地氟化或全氟化的气体，诸如氟代烃；六氟化硫；全氟丙酮；全氟乙醚；全氟烷烃；全氟烯烃；全氟炔烃；全氟环烷烃；和饱和全氟化碳。优选，所述气体是六氟化硫。
在使用中，气体从腔室向外扩散至靶位引起了纳米脂质气泡(NLB)的气穴现象，破坏了其结构完整性，并且又促进了药物化合物从腔室之内释放到靶位。
所述脂质体壳还通常包含至少部分覆盖所述壳、但通常完全覆盖所述壳的聚合物包衣。所述聚合物包衣通常响应于pH，从而在低于生理学pH、更优选地在类似于癌瘤的pH值、典型地为约pH 6的pH值下进行构象变化和破坏所述包衣的结构完整性。已知的是，癌瘤具有低于正常健康组织的pH。所述聚合物包衣可以是选自、但不限于以下的至少一种聚合物包衣：生物相容性聚合物；离子聚合物，优选地为阴离子和/或阳离子聚合物。所述离子聚合物可包括但不限于：明胶，聚乙烯亚胺(PEI)，聚-L-赖氨酸(PLL)，角叉菜胶，果胶，藻酸钠，羧酸聚合物，硫酸盐和胺官能化的聚合物诸如聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺，多糖诸如藻酸、果胶酯酸、羧甲基纤维素、透明质酸、肝素(粘多糖)、脱乙酰壳多糖、羧甲基脱乙酰壳多糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸肝素、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉和它们的盐，聚(氰基丙烯酸丁酯)(PBCA)，聚(乳酸)(PLA)，聚(富马酸丙二醇酯)(PPF)，聚酐。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述聚合物包衣为阳离子聚合物，更优选地为脱乙酰壳多糖。
在本发明的另一个实施方案中，所述脂质体壳用依次涂层的两层或更多层包衣层进行包衣。所述依次涂层的两层或更多层包衣层优选地在阳离子聚合物包衣层和阴离子聚合物包衣层之间交替。所述阳离子聚合物包衣层优选地为脱乙酰壳多糖，以及所述阴离子聚合物包衣层优选地为聚丙烯酸。
所述脂质体壳还可包含冻干保护剂。优选地，所述冻干保护剂可以是糖。所述糖可以是选自、但不限于以下的至少一种糖：乳糖和果糖。
在本发明的第一个方面的一个优选实施方案中，提供了纳米脂质体药物递送系统，其包含：由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)和表面活性剂构成的纳米脂质体壳，所述壳限定内腔室；以及容纳在由纳米脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。所述纳米脂质体壳典型地还包含容纳在内腔室之内的气体从而形成纳米脂质气泡(NLB)。所述纳米脂质体壳和/或所述纳米脂质气泡典型地还包含至少部分覆盖所述壳的、但通常完全覆盖所述壳的聚合物包衣。
根据本发明的第二方面，提供了用于在人体或动物体内在靶位释放至少一种药物化合物的脂质体药物递送系统(LDDS)，所述脂质体药物递送系统包含由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)构成的脂质体壳，所述壳限定内腔室。所述二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)典型地为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
所述脂质体药物递送系统典型地还包含容纳在由所述脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。所述药物化合物可以是选自、但不限于以下的至少一种药物化合物：氨基酸，止痛药，消炎药，驱虫剂，抗细菌剂，氨基糖苷类，β-内酰胺类抗生素，糖肽类，青霉素类，喹诺酮类，磺胺类，镇定剂，强心苷，抗帕金森剂，抗抑郁药，抗肿瘤剂，免疫抑制剂，抗病毒剂，抗生素制剂，抗真菌剂，抗微生物剂，食欲抑制剂，止吐剂，抗组胺剂，抗偏头痛药，冠状、大脑或外周血管扩张药，抗心绞痛药，钙通道阻滞剂，激素药物，避孕药，抗血栓剂，利尿剂，抗高血压药，化学依赖性药物，局部麻醉剂，皮质类固醇，皮肤病药，维生素，类固醇，唑类衍生物，硝基化合物，胺化合物，昔康类衍生物，粘多糖，阿片类化合物，吗啡样药物，芬太尼衍生物和类似物，前列腺素，苯甲酰胺类，肽，呫吨类，儿茶酚胺类，二氢吡啶类，噻嗪类，斯德酮亚胺，多糖，降胆固醇剂，植物化学物质和抗氧化剂。列出上述药物类别是出于说明性目的，不管引入到其中的活性物质和/或物质是怎样的，本发明的脂质体药物递送系统(LDDS)都可包括任何药物制剂。
优选地所述药物为选自、但不限于以下的至少一种抗肿瘤药物：喜树碱、紫杉烷和铂化合物，优选地所述抗肿瘤药物为喜树碱。在所述药物为喜树碱的实施方案中，所述腔室提供了对所容纳的药物的保护，从而防止在生理条件下在使用中通常发生的内酯开环。所述脂质体壳的非极性基团促进容纳非极性药物诸如喜树碱(CPT)，由此防止在使用中在所述脂质体壳到达靶位之前药物从所述脂质体壳泄露。
所述脂质体壳典型地还包含表面活性剂。所述表面活性剂可以是选自、但不限于以下的至少一种表面活性剂：磺基琥珀酸二辛酯(DOS)、吐温80和司盘80，或它们的任何组合，优选地，所述表面活性剂为磺基琥珀酸二辛酯(DOS)。所述表面活性剂在使用中可增加所述脂质体壳的稳定性。所述表面活性剂典型地吸附到所述脂质体壳中或吸附到所述脂质体壳上。脂质体壳中表面活性剂浓度越高，稳定作用越好，并且所形成的脂质体壳越小。所述表面活性剂促进具有纳米尺寸的脂质体壳的制备。
所述脂质体壳通常被设置使得二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)的非极性官能团向内朝向所述腔室，以及极性官能团向外朝向所述壳的外表面。在使用中，所述脂质体壳的非极性官能团增加了容纳在所述腔室之内的非极性药物化合物和/或亲脂性药物化合物诸如喜树碱(CPT)的溶解作用。
所述靶位典型地是位于人体或动物体中或人体或动物体上的癌细胞，优选地为形成肿瘤的癌细胞，更优选地为作为卵巢肿瘤的肿瘤。
所述脂质体壳可具有小于约200nm、优选地小于约160nm的直径。所述脂质体壳可被依尺寸制造从而形成纳米脂质体(NLS)。在使用中，纳米脂质体提高了高通透性和滞留(EPR)效应，由此促进增多的药物递送至靶位。直径约200nm、优选地小于约160nm的脂质体壳会促进所述脂质体壳成功靶向至肿瘤。
所述纳米脂质体(NLS)典型地还含有容纳在由所述壳限定的内腔室之内的气体，从而形成纳米脂质气泡(NLB)以及由此的纳米脂质气泡脂质体药物递送系统(NLB-LDDS)。所述气体可以是选自、但不限于以下的至少一种气体：空气，氮气，氧气，二氧化碳，氢气，一氧化二氮，稀有气体或惰性气体诸如氦，氩，氙或氪；放射性气体诸如Xe133或Kr81；超极化稀有气体，低分子量的烃诸如甲烷，乙烷，丙烷，丁烷，异丁烷，戊烷或异戊烷；环烷烃诸如环丁烷或环戊烷；烯烃诸如丙烯，丁烯或异丁烯；或炔烃诸如乙炔；醚；酮；酯；卤化气体，优选地氟化或全氟化的气体，诸如氟代烃；六氟化硫；全氟丙酮；全氟乙醚；全氟烷烃；全氟烯烃；全氟炔烃；全氟环烷烃；和饱和全氟化碳。优选，所述气体是六氟化硫。
在使用中，气体从腔室向外扩散至靶位引起了纳米脂质气泡(NLB)的气穴现象，破坏了其结构完整性，并且本身促进了药物化合物从腔室之内释放到靶位。
所述脂质体壳还通常包含至少部分覆盖所述壳的聚合物包衣。所述聚合物包衣可响应于pH，从而在低于生理学pH、更优选地在类似于癌瘤的pH值、典型地为约pH 6的pH值下进行构象变化和破坏所述包衣的结构完整性。所述聚合物包衣可以是选自、但不限于以下的至少一种聚合物包衣：生物相容性聚合物；离子聚合物，优选地为阴离子和/或阳离子聚合物。所述离子聚合物可包括但不限于：明胶，聚乙烯亚胺(PEI)，聚-L-赖氨酸(PLL)，角叉菜胶，果胶，藻酸钠，羧酸聚合物，硫酸盐和胺官能化的聚合物诸如聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺，多糖诸如藻酸、果胶酯酸、羧甲基纤维素、透明质酸、肝素(粘多糖)、脱乙酰壳多糖、羧甲基脱乙酰壳多糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸肝素、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉和它们的盐，聚(氰基丙烯酸丁酯)(PBCA)，聚(乳酸)(PLA)，聚(富马酸丙二醇酯)(PPF)，聚酐。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述聚合物包衣为阳离子聚合物，更优选地为脱乙酰壳多糖。
在本发明的另一个实施方案中，所述脂质体壳用依次涂层的两层或更多层包衣层进行包衣。所述依次涂层的两层或更多层包衣层优选地在阳离子聚合物包衣层和阴离子聚合物包衣层之间交替。所述阳离子聚合物包衣层优选地为脱乙酰壳多糖(CHT)，以及所述阴离子聚合物包衣层优选地为聚丙烯酸(PAA)。
所述脂质体壳还可包含冻干保护剂。优选地，所述冻干保护剂可以是糖。所述糖可以是选自、但不限于以下的至少一种糖：乳糖和果糖。
在本发明的第二方面的一个优选的实施方案中，提供了纳米脂质体药物递送系统，其包含：由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇(CHO)和表面活性剂构成的脂质体壳，所述壳限定内腔室；以及容纳在由所述脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。所述纳米脂质体壳典型地还包含容纳在内腔室之内的气体从而形成纳米脂质气泡(NLB)。所述纳米脂质体壳和/或所述纳米脂质气泡典型地还包含至少部分覆盖所述壳、但通常完全覆盖所述壳的聚合物包衣。
根据本发明的第三方面，提供了脂质体壳用于在诊断和/或治疗疾病中将药物化合物递送至人体或动物体的靶位的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)构成，所述壳限定内腔室。所述脂质体壳典型地还包含容纳在内腔室之内的药物化合物，通常为喜树碱(CPT)。所述疾病可以是癌症，以及可以是选自、但不限于以下的至少一种癌症：乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌，结肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，脑癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，卵巢癌，和血液恶性肿瘤诸如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。优选地，所述癌症是卵巢癌。
根据本发明的第四方面，提供了脂质体壳在制备用于在治疗疾病中将药物化合物递送至人体或动物体的靶位的药物中的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)构成，所述壳限定内腔室。所述药物通常被配制成静脉内(IV)制剂。所述脂质体壳典型地还包含容纳在内腔室之内的药物化合物。所述疾病可以是癌症，以及可以是选自、但不限于以下的至少一种癌症：乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌，结肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，脑癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，卵巢癌，和血液恶性肿瘤诸如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。优选地，所述癌症是卵巢癌。
根据本发明的第五方面，提供了脂质体壳用于在诊断和/或治疗疾病中将药物化合物递送至人体或动物体的靶位的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)构成。所述脂质体壳典型地还包含容纳在内腔室之内的药物化合物，典型地为喜树碱(CPT)。所述疾病可以是癌症，以及可以是选自、但不限于以下的至少一种癌症：乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌，结肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，脑癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，卵巢癌，和血液恶性肿瘤诸如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。优选地，所述癌症是卵巢癌。
根据本发明的第六方面，提供了脂质体壳在制备用于在治疗疾病中将药物化合物递送至人体或动物体的靶位的药物中的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)构成。所述药物通常被配制成静脉内(IV)制剂。所述脂质体壳典型地还包含容纳在内腔室之内的药物化合物。所述疾病可以是癌症，以及可以是选自、但不限于以下的至少一种癌症：乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌，结肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，脑癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，卵巢癌，和血液恶性肿瘤诸如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。优选地，所述癌症是卵巢癌。
根据本发明的第七方面，提供了通过将根据本发明的第一和/或第二方面的脂质体药物递送系统(LDDS)给予需要治疗癌症的人或动物来治疗癌症、优选为卵巢癌的方法。
根据本发明的第八方面，提供了制备根据本发明的第一方面的脂质体药物递送系统(LDDS)的方法，所述方法包括以下步骤：
将DSPC和DSPE-m-PEG加到有机溶剂、优选地为氯仿和甲醇的混合物中，产生溶液1；
将表面活性剂、优选地为DOS加到溶液1中，形成溶液2；
将药物化合物、优选地为CPT加到溶液2中，形成溶液3；
将磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)加到溶液3中，形成溶液4；以及
真空蒸发溶液4，产生LLDS的水溶液。
根据本发明的第九方面，提供了制备根据本发明的第二方面的脂质体药物递送系统(LDDS)的方法，所述方法包括以下步骤：
将DSPC和胆固醇(CHO)加到有机溶剂、优选地为氯仿和甲醇的混合物中，产生溶液1；
将表面活性剂、优选地为DOS加到溶液1中，形成溶液2；
将药物化合物、优选地为CPT加到溶液2中，形成溶液3；
将磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)加到溶液3中，形成溶液4；以及
真空蒸发溶液4，产生LLDS的水溶液。
在本发明的一个优选的实施方案中，提供了纳米脂质气泡脂质体药物递送系统(NLB-LDDS)，其包含生物响应性和/或生物相容性和/或生物可降解聚合物、磷脂和气体，用于在静脉内给药后靶向治疗卵巢癌。抗肿瘤药物模型喜树碱(CPT)以及可能地辅助性治疗和/或植物化学物质将被引入到NLB-LDDS中，并且作为静脉内给药后被动靶向作用的结果会在肿瘤位点释放。一种所述的植物化学物质为水飞蓟宾(silibinin，SB)，其是从水飞蓟植物的粗种子提取物中提取的天然存在的多酚类抗氧化剂。
根据本发明的第一和第二方面的NLB-LDDS的纳米级尺寸、由于它们独特的化学组成赋予的它们的特异性化学-物理性质，以及由肿瘤组织显示出的微生理学现象(称为高通透性和滞留(EPR)效应)结合在一起，是抗肿瘤纳米脂质气泡在肿瘤位点蓄积、由此导致药物在肿瘤组织中集中释放并蓄积的原因，增强了抗肿瘤功效。这些NLB-LDDS还显著降低在现有的剂型中观察到的CPT的常见副作用。药物化合物(CPT和SB)通过气体核(gaseouscore)的扩散得到释放，所述气体核会导致NLB的气穴现象和CPT在肿瘤处的最终释放。另外，肿瘤组织的微环境生理条件(例如相对健康组织较低的pH)对NLB的生物响应性聚合物包衣层的影响增强了在肿瘤组织中蓄积之后的药物释放。
由于药物被包封在NLB-LDDS中，在到达肿瘤位点之前药物在体循环中的释放是迟滞的，妨碍了不利的、通常普遍的生物扰动，所述生物扰动会引起与抗肿瘤治疗相关的破坏性副作用。NLB-LDDS允许CPT和SB在人体或动物体内在癌瘤位点的集中释放。NLB-LDDS大大改善卵巢癌治疗的治疗结果，缩短治疗持续时间，改善患者在治疗期间的健康相关的生活质量并增加总体的五年生存率。另外，通过NLB-LDDS促进的靶向的药物释放降低了达到最大功效所需的药物总量，以及相关的副作用所需的住院和治疗，最终降低与癌症化学疗法相关的总体的高成本。
NLB-DDS将亲脂性药物化合物(例如CPT和SB)容纳在其腔室内部，增加了CPT和SB的溶解性，以及所述纳米-尺寸(通常由表面活性剂引起)增加了EPR效应，确保NLB-DDS到达CPT和/或SB可容易地与肿瘤接触的靶位。NLB-LDDS的纳米级尺寸范围允许NLB-DDS包围网状内皮系统，降低其从体内的清除。由NLB-LDDS的尺寸和结构提供的高的表面积:体积比和NLB的脂质组分改善了CPT和SB的溶解，并增强了CPT和SB(以及潜在地其他抗肿瘤药物)的吸收和生物利用度。
增强的EPR效应、增强的溶解、增强的吸收、增强的生物利用度和降低的体内清除的组合效应都增加了肿瘤组织中的药物的浓度，因此改善了抗肿瘤药物的抗肿瘤功效。
已显示，CPT由于其抗肿瘤活性在癌症治疗中是有前景的，然而，其使用伴随着差的溶解性和不利的副作用。NLB-LDDS改善了CPT的溶解性，而CPT通常在水和大多数有机溶剂中展示非常差的溶解性，关于CPT的药物制剂和给药而言这形成了最初的挑战(Hatefi and Amsden,2002；Lui et al.,2009)。CPT表现出有害的副作用分布，这严重削弱了其临床有用性(Fan etal.,2010)。构效关系(SAR)研究已经强调了活性的内酯基团，该内酯基团导致了CPT的溶解性和生理学依赖的特性，然而对其抗肿瘤活性是决定性的(Hatefi and Amsden,2002；Fan et al.,2010)。在生理学pH以及高于生理学pH，发生该内酯基团的开环，导致向无活性羧酸盐形式(carboxylate form)的可逆转化(Hatefi and Amsden.2002)。这损害了活性的内酯形式的生物利用度。此外，人血清白蛋白(HSA)对CPT的羧酸盐形式具有特有的亲和性。与HAS结合不利地影响内酯-羧酸盐平衡，还损害CPT的活性的内酯形式的生物利用度(Lui et al.,2009)。将CPT容纳在NLB-DDS的腔室之内有助于克服通常于CPT有关的严重副作用。
如上文所解释的那样，根据本发明的NLB-LDDS对CPT以及SB的溶解会具有相当有利的影响，同时能够维持IV给药途径。另外，NLB-LDDS会起到防止CPT与水性环境接触、并且因此防止转化为无活性的羧酸盐形式的作用。NLB-LDDS的被动靶向功能性将有利地改变CPT的生物扰动，由此有力降低损害该强力的抗肿瘤药物的临床有用性的副作用。根据本发明的的NLB-LDDS目的是在癌症、特别是卵巢癌的治疗中恢复CPT的用途，这通过利用纳米技术的优点以改善CPT的功效并降低CPT的副作用来实现。
通过以下的本发明的非限制性实施方案进一步描述、说明和/或例示本发明。
1.根据本发明的第一和第二方面的纳米脂质体(NLS)
1.1材料
喜树碱(CPT)(≥90％纯度；Mw＝348.35)，即所述抗肿瘤药物模型，采用的磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)(≥99％纯度；Mw＝790.15)，且L-α-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基-聚乙二醇缀合物(DSPE-m-PEG)(≥98％；Mw＝＝2748.1)以及胆固醇(CHO)(≥99％纯度,Mw＝386.65)获自Sigma Chemical Company(St Louis,MO,USA)。磺基琥珀酸二辛酯钠盐(DOS)(≥99％纯度；MW＝444.56)用作表面活性剂，六氟化硫(SF6)作为脂质体药物递送系统(LDDS)的气相引入。上述物质购自Sigma ChemicalCompany。氯仿、甲醇、缓冲盐以及所有其他试剂为分析级的并且不经进一步修饰就使用。此外，所有A-级玻璃器皿和双重去离子水(double de-ionizedwater)在制备制剂时采用。
1.2方法
最初制备纳米脂质体(NLS)，用于通过二因素、三水平、面向中心的中心复合设计数学模型(Two-Factor,Three-Level,Face-Centered CentralComposite Design mathematical model)产生可行的制剂的设计。该设计的纳米脂质体的特征被进行优化。
1.2.1喜树碱-负载的纳米脂质体(NLS)的制剂
纳米脂质体制剂通过对反相溶剂蒸发法进行适应性改变来配制，以便制备根据本发明的第一和第二方面的脂质体药物递送系统(LDDS)。
简而言之，在借助磁力搅拌器(400rpm，5分钟)在搅动下将总量为40mg的DSPC(10-30mg)与(1)DSPE-m-PEG(10-30mg)或(2)CHO(10-30mg)溶于氯仿:甲醇(9:1；10mL)中，得到DSPC:DSPE-m-PEG或DSPC:CHO的重量比范围为1:3–3:1的溶液。随后将DOS和CPT溶于所述有机溶液中。随后将磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH 7.4,25℃；10mL)在冰浴上、采用Vibracell探针式超声发生器(Sonics&Materials Inc,Newtown,Connecticut,USA)在超声处理下加到所述有机溶液(振幅＝80％；90秒)中。这致使了均质、单相乳液的充分形成。随后使乳液在圆底烧瓶中真空蒸发(65-75℃)2-4小时，采用MultivaporTM(Buchi Labortechnik AG,Switzerland)。在蒸发过程中将PBS(pH7.4,25℃；10mL)周期性加入，并在每次加入后如前所述对制剂进行超声处理30秒。溶剂蒸发结束后，产生了根据本发明的第一或第二方面的纳米脂质体药物递送系统的水性悬浮液。因此，制备了根据本发明的第一方面(DSPE-m-PEG-NLS)的纳米脂质体(NLS)和根据本发明的第二方面(CHO-NLS)的纳米脂质体。
1.2.2纳米脂质体尺寸和ζ电位的确定
采用Zetasizer NanoZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)分析水性纳米脂质体悬浮液的尺寸和尺寸分布数据。将样品通过0.22μm滤器过滤到合适的试管中并通过用非侵害性背散射技术(non-invasive backscatter technology)增强了的动态光散射进行分析，以基于粒子经布朗运动在样品中的扩散得到尺寸和尺寸分布。测量值得自2个角，增加了测量的准确度。所有的尺寸测量在25℃一式三份进行，历时三小时的一段时间，同时在定轨振荡器浴(20rpm)中维持在37℃。
简而言之，所述Zetasizer NanoZS系统采用激光多普勒微量电泳技术来确定样品中离子响应于所应用的电场的速度。这能够阐明样品的电泳泳动度以及由此的ζ电位。如上所述，所有ζ电位测量在25℃一式三份进行，历时三小时的一段时间，同时在定轨振荡器浴(20rpm)中维持在37℃。
1.2.3药物引入效率(Drug Incorporation Efficiency，DIE)的说明
药物引入到LDDS的腔室中的效率通过衍生自该LDDS的新颖的方法确定。使用的模型药物(CPT)水溶性非常差。将纳米脂质体(NLS)最终悬浮在水相中。因此假设所述纳米脂质体(NLS)是这样定向的：磷脂的非极性基团朝向纳米脂质体的核，以及极性基团向外朝向水性悬浮介质。因此CPT会引入到纳米脂质体内部，或者沉淀出来。未引入的药物，由于其在悬浮介质中的非溶解性，会主要以沉淀物存在。因此，理论上讲所述未引入的沉淀出的药物可通过双重过滤法经0.22μm滤器移除。
旋转蒸发得到水性纳米脂质体悬浮液后，将悬浮液经0.22μm滤器双重过滤以除去游离药物。滤液随后进行超声处理(振幅＝80％,10分钟)，此后，溶于DMSO(1:1)中。药物引入效率使用UV-光谱学在366λ(Cecil CE 3021,Cecil Instruments Ltd.,Milton,Cambridge,UK)一式三份评价，参考已经构建的标准曲线。以下方程用于计算药物引入效率，其作为在配制过程中最初加入的药物的百分数：
药物引入效率(DIE)(％)＝引入的药物量/加入的总药物量×100
方程1
1.2.4体外药物释放分析
从纳米脂质体悬浮液除去游离药物后，将10mL样品封装在经处理的透析管(截止值＝12000kDA)中并悬浮在PBS(pH 7.4,25℃；200mL)中。将该容器在定轨振摇器浴中在20rpm维持在37℃。以预定的间隔，从外部PBS相移除5mL等份液并加到DMSO(5mL)中，产生1:1的比例，以阻止药物沉淀。新鲜缓冲液(5mL)替换到外相中以维持下沉(sink)状态。经涡旋的样品通过UV-光谱学在366λ分析，相对于已构建的CPT在PBS:DMSO(1:1)中的标准曲线。
1.2.5纳米脂质体的形态学特征
纳米脂质体(NLS)的形态学通过两种成像模式评价。纳米脂质体(NLS)的形状和尺寸最初经透射电子显微术(TEM)确认。简而言之，使用微量加液器用纳米脂质体悬浮液涂覆铜载网并使其干燥约1小时。然后将所述网插入到透射电子显微镜(TEM)的负载室中。TEM采用高能电子束以非常高的放大率产生高分辨图像。以不同的放大率获得显微照片以阐明单个的纳米脂质体的结构。
除了上述成像技术外，采用了利用2100(Visualsonics,Toronto,Ontario,Canada)的微超声成像来确认纳米脂质体的总体外观。该技术进一步突出了行为特征诸如纳米脂质体的聚集，所述特征是稳定性的重要指示。制备10％w/v角叉菜胶水凝胶，在其上涂布超声凝胶。将纳米脂质体悬浮液注入到所述凝胶中并应用超声束，当纳米脂质体分散在水凝胶中时产生纳米脂质体的图像。
2.关于纳米脂质体药物递送系统(NLS-DDS)的结果和讨论
2.1纳米脂质体的ζ-尺寸分析
如前所述，LDDS所呈现的益处部分依赖于纳米脂质体(NLS)的纳米级尺寸。所述纳米尺寸的级别将部分致成LDDS的靶向性质。另外，纳米尺寸分级赋予了水溶性差的抗肿瘤药物增溶作用。因此，评价纳米脂质体尺寸从根本上讲是重要的。建立了约200nm、优选地约160nm的基准尺寸。所有制剂都落入该尺寸范围中。各种制剂之间尺寸变化的最重要的贡献者是DOS的浓度。较高浓度的DOS导致纳米脂质体尺寸的降低以及较窄的尺寸分布，这通过较低的多分散性指数(PdI)来指示。一般而言，表面活性剂被吸附到脂质体表面中或脂质体表面上，形成脂质体结构的一部分。表面活性剂浓度越高，更多的表面活性剂可用于吸附到脂质体表面中或脂质体表面上，总体LDDS的稳定化作用越好并且总体LDDS越小。此外，含有CHO的纳米脂质体制剂通常具有比含有DSPE-m-PEG的纳米脂质体制剂更大的尺寸，如图1所示。这归因于CHO分子的松散性。
图1显示了根据本发明的第二方面(CHO-NLS)的DSPC:CHO纳米脂质体药物递送系统在T＝0小时(a)和T＝3小时(b)的典型的ζ尺寸分布(尺寸vs强度)。图1还显示根据本发明的第一方面(DSPE-m-PEG-NLS)的DSPC:DSPE-m-PEG纳米脂质体药物递送系统在T＝0(c)和T＝3(d)的典型的ζ尺寸分布(尺寸vs强度)。
2.2纳米脂质体的表面电荷表征
ζ电位指示了所配制的纳米脂质体的表面电荷，以及由此的这些纳米脂质体(NLS)聚集的倾向。ζ电位由此被视为制剂的稳定性的合适指标。所有纳米脂质体制剂展示了负的ζ电位，这归因于表面活性剂(DOS)的阴离子性质。然而，注意到在含有DSPE-m-PEG的制剂和含有CHO的制剂(即分别为本发明的第一和第二方面)之间存在显著差异。根据本发明的第二方面的包含DSPC和CHO的组合的纳米脂质体药物递送系统(CHO-NLS)，与根据本发明的第一方面的包含DSPC:DSPE-m-PEG的组合的纳米脂质体药物递送系统(DSPE-m-PEG-NLS)相比，展示出显著更负性的ζ电位(分别为约-45mV和约7mV).另外，根据本发明的第二方面的药物递送系统显示的强的表面电荷(即高的ζ电位)增加了用阳离子聚合物包衣的可能性。
2.3药物引入效率(DIE)的评价
实现足够高水平的药物引入到纳米脂质体药物递送系统中是特别具有挑战性的，这是由于这些LDDS的纳米级尺寸范围。DSPC:CHO纳米脂质体(根据本发明的第二方面)即CHO-NLS展示出有利地、高的DIE，除了两种制剂外所有的制剂显示DIE>60％。所实现的最大可重现DIE为81.47％。
表1
      
2.4体外药物释放分析
根据本发明的第一和第二方面的LDDS在少于24小时内释放所有引入的药物。药物释放分布突出了在足够的CPT得到释放之前LDDS在肿瘤组织中蓄积的足够时间。这对药物的抗肿瘤功效、维持CPT的内酯环的稳定性以及限制该药物的临床用途的有害副作用都具有实质上的影响。另外，一旦LDDS在肿瘤组织中蓄积，快速药物释放在克服抗药性的饱和机制方面可证实是有利的。DOS浓度表现出对药物释放动力学具有最显著的影响。假设的是，由ζ电位与DOS浓度的直接关系所证实的表面活性剂的稳定效应在一定程度上延迟了药物释放，导致较大的MDT。
LDDS包含在其中限定了腔室的脂质体壳。将低扩散性的气体诸如六氟化硫(SF6)引入到腔室中，以及聚合物包衣进一步延迟了CPT从LDDS中的释放。
因为CPT作用于细胞周期的S-相，延长的释放可证实对LDDS的抗肿瘤功效是相当有益的。此外，进一步限制在LDDS在肿瘤组织中蓄积之前释放的CPT的量将导致降低的副作用和在肿瘤组织中发挥抗肿瘤作用的增强的载药量。
图2a-c显示了根据本发明的第一方面的、具有不同的DSPC:DSPE-m-PEG比例(DSPE一直是DSPE-m-PEG)的纳米脂质体药物递送系统(LDDS)的药物释放分数。图2d-f显示了根据本发明的第二方面的、具有不同DSPC:CHO(3:1–1:3)比例的纳米脂质体药物递送系统(LDDS)的药物释放分数。
2.5纳米脂质体的形态学表征
透射电子显微照片确认了有规则的、充分限定的、接近球形的DSPC:CHO纳米脂质体(CHO-NLS)的存在，如图3a-c所示。图3显示了分别在30000x放大率(a)、40000x放大率(b)和50000x放大率(c)的纳米脂质体的透射电子显微照片。
微超声成像在突出所配制的纳米脂质体的分散特性方面是尤其有利的。图4示出DSPC:CHO纳米脂质体(根据本发明的第二方面)即CHO-NLS在注射到角叉菜胶水凝胶中时的外观以及纳米脂质体在所述粘性水凝胶介质中的有利的分散。纳米脂质体聚集的缺乏被清楚地显现出来，并且指示了可察觉的制剂稳定性。图4显示了以下的微超声图像：a)引入纳米脂质体之前的角叉菜胶水凝胶，b)注射纳米脂质体和c)注射后2分钟纳米脂质体在水凝胶中的分散。
3.将气体引入到NLS中，形成纳米脂质气泡脂质体药物递送系统(NLB-LDDS)
3.1制备含有CHO的NLS以及含有DSPE-m-PEG的NLS用于引入气体
采用磁力搅拌器(400rpm，5分钟)在连续搅拌下将DSPC、DOS与CHO或DSPE-m-PEG(浓度按照表2所示)同时溶于氯仿:甲醇(9:1；10mL)溶剂系统中。在连续搅动下将喜树碱(CPT)(0.05％w/v)加到所述有机溶液中。随后将磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(pH 7.4,25℃；10mL)在冰浴上、采用Vibracell探针式超声发生器(Sonics&Materials Inc,Newtown,Connecticut,USA)在超声处理下加到所述有机溶液(振幅＝80％；90秒)中。这致使了均质、单相乳液的形成。随后使该乳液真空蒸发(65-75℃)2-3小时，采用MultivaporTM(BuchiLabortechnik AG,Switzerland)。在蒸发过程中将PBS(pH 7.4,25℃；10mL)周期性加入，并在每次加入后如前所述对制剂进行超声处理30秒。溶剂蒸发结束后，产生了水性NLS悬浮液。使得到的NLS悬浮液进行在约70℃的冷冻以及在约37℃的融化的三个循环，以便在每次冷冻-融化循环后通过经0.22μm微孔滤器过滤将多层NLS转化为单层NLS。对这些单层NLS的所有接着发生的变更和分析一式三份进行(n＝3)。
表2通过统计学优化获得的NLS系统的配方组成
      
3.2经气体引入将所配制的NLS转化为NLB:超声处理持续时间的影响
对10mL CHO-NLS(根据本发明的第二方面)和10mL DSPE-m-PEG-NLS(根据本发明的第一方面)进行过滤并各自注入20mL小瓶中。将SF6气体引入到小瓶的顶空中，随后将小瓶密封。小瓶的超声处理在槽式超声发生器中进行，引起SF6气体穿透到CHO-NLS和DSPE-m-PEG-NLS的脂质膜中，并形成气体核，由此形成根据本发明的第一方面(DSPE-m-PEG-NLB)的纳米脂质气泡(NLBs)和根据本发明的第二方面的(CHO-NLB)纳米脂质气泡(NLBs)。
超声处理进行2、3和5分钟以确定超声处理持续时间对NLB的最终尺寸和稳定性的影响。超声处理2和3分钟后，尺寸和ζ电位的变化是不显著的。然而，超声处理5分钟后，由于低于25nm的小比例的(<5％)NLB的形成，PdI不利地变高。超声处理5分钟的NLB的ζ电位展示出不利的缺失(deficit)：CHO-NLB，约10mV；以及DSPE-m-PEG-NLB，约4mV。因此，对所有另外的制剂而言，描述了3分钟的超声处理持续时间。
3.3研究冻干对NLB尺寸和稳定性的影响
为了确定冻干对所配制的NLB的稳定性的影响，确定了冻干前后使用和不使用冻干保护剂配制的NLB的平均尺寸、尺寸分布和ζ电位。制备CHO-NLS和DSPE-m-PEG-NLS并如上所述转化为NLB。所配制的NLB在于25rpm旋转的定轨振摇器浴中历时3小时的一段时间、维持在37℃进行尺寸、尺寸分布和ζ电位分析，一式三份。
同时，将未修饰的NLS悬浮液(15mL)以及含有乳糖或果糖(约0.05％w/v)作为冻干保护剂的NLS悬浮液在-70℃冷冻48小时。将样品随后冻干(Labconco,Kansas City,MO,USA)，并将产物再悬浮于PBS(pH 7.4；25℃；10mL)中，至浓度为0.5％w/v。使得到的NLS悬浮液进行三个冷冻-融化循环，在每次循环后进行经0.22μm微孔滤器过滤。根据上述方法进行NLS至NLB的转化。平均尺寸、尺寸分布和ζ电位分析历时3小时的一段时间进行，同时将NLB悬浮液在于25rpm旋转的定轨振摇器浴中维持在37℃。
3.4经水含量测定评价冻干保护剂的功效
通过测定体积的卡尔-费歇尔(KF)滴定对单纯的(plain)、含有果糖和含有乳糖的制剂的冻干粉末(10mg)进行水含量的测定，采用卡尔-费歇尔滴定计(Mettler Toledo,Columbus,Ohio,USA)。
3.5经层层(LBL)自沉积评估聚合物包衣
层层(LBL)聚合物包衣是基于这样的原则：带有相反电荷的分子之间的静电吸引，导致聚合物交替沉积到带电荷的表面上。候选NLS显示出总体阴离子的表面电荷，而CHO-NLS相对于DSPE-m-PEG-NLS具有更强的负ζ电位，这促进聚阳离子主要聚合物层的建立，以及随后聚阴离子和聚阳离子聚合物层的交替沉积。
表3所研究的阳离子和阴离子聚合物经LBL自沉积方法在NLS包衣层中的应用
      
概括地说，采用磁力搅拌器将单层NLS悬浮液在不断搅动下滴加到离子聚合物溶液中。允许在环境条件下进行包衣，历时3-12小时的一段时间，以有规律的间隔进行ζ电位分析以确定成功的聚合物包衣。随后在不断搅拌下将阳离子NLS悬浮液滴加到阴离子聚合物溶液中，并允许聚合物在环境条件吸附6-18小时的一段时间，并进行周期性ζ电位分析。涂覆两层或四层聚合物层。将乳糖即冻干保护剂加到聚合物包衣的-NLS悬浮液中，并将该悬浮液在-70℃冷冻48小时，随后冻干。将冻干的粉末再悬浮于PBS(pH7.4；25℃)中，形成聚合物包衣的NLS，并如上所述转化为聚合物包衣的NLB。表3概括了作为合适的NLS包衣物质研究的聚合物及其浓度。
3.6评价所配制的NLS和NLB的尺寸特征
纳米级尺寸范围对于本发明的LDDS的临床关联性和可行性是重要的。平均尺寸和尺寸分布的变化也作为制剂的稳定性的关键指示物被强调。因此，所研究的所有修饰最初基于所述修饰对得到的制剂的尺寸分布的影响的立场进行评价。在评价每种修饰对制剂的尺寸分布的影响的最初研究期间，历时3小时的一段时间进行分析，同时将NLB在于25rpm旋转的定轨振摇器浴中维持在生理学温度。表4简洁概括了所研究的修饰对NLS和NLB的平均尺寸和尺寸分布特征的影响。
表4对候选NLS和NLB制剂进行的平均尺寸和尺寸分布评价和所进行的修饰的概括
      
3.7所配制的NLS和NLB的表面电荷表征
由于所配制的LDDS的静脉内(IV)性质和NLB在体内聚集的严重关联，对本发明而言尺寸特征和表面电荷特征是同等重要的。此外，抗肿瘤药物的高成本确保了对具有延长的贮存期限的稳定制剂的需要。因此，ζ电位确定结合所述的尺寸分析进行。此外，ζ电位的变化是含有带有相反电荷的聚合物的成功的聚合物包衣的一个独特的指示物。
3.8所配制的NLB的形态学表征
在聚合物包衣后，采用PhenomTM扫描电子显微镜(FEI Company,Hillsboro,OR,USA)对冻干的产物(CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB)进行扫描电子显微术(SEM)，以定性评价所得到的冻干的产物的形态学结构。将样品作为单层固定在采样棒(sampling stub)上，并在获得显微照片前用金-钯涂覆30秒。
另外，所配制的NLS的冻干的粉末在异硫氰酸荧光素(FITC)染料存在下用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(pH 7.4；25℃)重构，并随后如上所述转化为NLB。使NLB悬浮液在载玻片上干燥1小时，接着在100mS暴露后采用倒置免疫荧光显微镜成像(Olympus IX71,Olympus,Tokyo,Japan)。
3.9研究CPT和SB的引入效率
在候选NLS上(与预期值比较)、在所配制的NLB(引入水飞蓟宾(SB)并将聚合物包衣层涂覆到NLB上之后)上确定CPT引入效率。CPT的药物引入效率(DIE)如上所述进行。
3.10产生CPT的感光分光(Photospectroscopic)定量的标准曲线
除了生理学pH之外，还在近似的肿瘤pH(6.0；37℃)进行药物释放以确定较低的pH对CPT释放特征的影响。在近似的肿瘤pH(6.0)分析CPT的释放特征需要构建CPT在PBS(pH 6.0；37℃)中的标准曲线，从而能够对CPT进行感光分光定量。制备CPT于DMSO中的储备溶液并随后进行连续稀释。波长扫描后，描述在pH 6.0进行CPT测定的最佳波长，在345nm分析上述连续稀释的溶液。
3.11CPT和SB释放特征的说明
如上所说明的那样，在重构冻干的粉末并转化为NLB之后，在近似的肿瘤和生理学pH进行药物释放研究。参照CPT和SB的有关标准曲线进行药物释放的定量。调节NLB悬浮液的浓度和体积，以便适应于包含SB并维持两种化合物的下沉状态。
3.12评估制剂的稳定性
制剂的临床可行性和有用性大部分受在不同条件下的制剂的稳定性的影响。当表面电荷表示为制剂的稳定性的最初指示物时，需要进一步考虑可能影响制剂的稳定性或受制剂的稳定性影响的其他条件。因此，通过暴露于血清、重构后的行为变化和长期储存稳定性来确定制剂的稳定性。
3.13在血清存在下的稳定性
针对静脉内给药的制剂，建立在血清存在下的所述制剂的特征是一项重要的测定。将包衣的和未包衣的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB(10mL)用FBS(50％v/v)在37℃孵育1小时，所述浓度被视为足以模拟生理学条件的适当浓度。以15分钟间隔将100μL NLB-FBS的组合用10mL PBS(pH 7.4,37℃)稀释，然后采用Zetasizer NanoZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)确定平均尺寸、尺寸分布和表面电荷表征。
3.14评价重构后制剂的稳定性
对于描述给药前储存条件以及制剂的重构和给予患者之间的准备时间(provision period)而言，评价重构后NLB悬浮液的稳定性是关键的。采用TurbiscanTM LAB(Formulaction,L’Union,France)定性分析所配制的NLB悬浮液的行为特征。将有关的NLB悬浮液(20mL)引入到专门的小瓶中，然后在25℃历时12小时的一段时间以预定的间隔进行分析。
3.15确定长期储存对NLB的物理化学特征的影响
确定所配制的NLB的长期稳定性，作为平均尺寸、ζ电位、CPT含量和SB含量随3个月的分析时间的变化的函数。将冻干的NLS密封在透明小瓶中，将SF6气体填充到顶空，然后在4℃和25℃储存。以每周一次的间隔将PBS引入到所述小瓶中，并如上所述在槽式超声发生器进行超声处理，形成NLB。确定药物含量、ζ大小和ζ电位。
4结果和讨论(CHO-NLB-LDDS和DSPE-m-PEG-NLB-LDDS)
4.1候选制剂的尺寸和表面电荷表征
CHO-NLS的平均尺寸较由统计学优化预测的尺寸大2.41％，考虑到所述制剂的纳米级，这是非常令人满意的。此外，所获得的平均尺寸仍然充分低于约200nm、优选地约160nm的基准尺寸，这在最初被描述为利于被动靶向至肿瘤组织，如图5a所示。PDI(结果未显示)为0.151，表明所述制剂中NLS的窄的尺寸分布。NLS向NLB的转化导致平均尺寸的稍微降低，这在图5b的尺寸分布中得到阐述。这可能是归因于用占据较小体积的气体核替换水性核(aqueous core)。此外，在形成气体核时采用的超声处理可引起CHO-NLB的平均尺寸的降低。
以实验获得的候选CHO-NLS制剂的ζ电位较由统计学优化预测的该制剂的ζ电位小9.26％的负性电位。CHO-NLS转化为CHO-NLB之后还存在表面电荷的不利的减少。这可能是归因于在转化过程中脂质膜的稍微脱稳定化。然而，所配制的CHO-NLB的ζ电位仍然是高度有利的，这表明是一种不倾向于聚集的稳定的制剂。
候选NLS的平均尺寸和ζ电位，以及将这些NLS转化为NLB之后的平均尺寸和ζ电位概述于表5中。此外，通过偏差百分数的值突出了针对每种候选NLS所测量的响应(由统计学优化预测)的比较。
表5.以实验确定的候选CHO-NLS和DSPE-m-PEG-NLS和NLB的平均尺寸和ζ电位，以及与由计算模型预测的NLS的值相比的偏差百分数
      
如图5c所阐明的那样，候选DSPE-m-PEG-NLS的平均尺寸较由统计学优化预测的该制剂的平均尺寸小2.18％。转化为DSPE-m-PEG-NLB展示出所述制剂的平均尺寸的显著增加，如图5d所描述的那样。DSPE-m-PEG-NLB的例外的尺寸特征非常利于LDDS通过高通透性和滞留(EPR)效应向肿瘤组织的被动靶向，以及因此，可显著改善经该LDDS体内递送的CPT的安全性和有效性。
以实验取得的候选DSPE-m-PEG-NLS的ζ电位与由统计学优化预测的该LDDS的ζ电位非常相关，偏离仅1.19％。将DSPE-m-PEG-NLS转化为DSPE-m-PEG-NLB导致表面电荷的轻微减少，与针对CHO-NLB所观察到的情况类似。
4.2确定冻干对所配制的NLB的影响
关于长期储存稳定性已经提出了持续的挑战，引起人们对脂质体储存的稳定化机制的日益增加的兴趣(Chaudhury et al.,2012)。这一考虑因素也与本申请有关，设想在SF6(一旦转化为NLB则形成气体核)存在下LDDS的储存形式为NLS。因此，研究了冻干作为形成展示出长期储存可行性的制剂的手段。
确定冻干对分别根据本发明的第二和第一方面配制的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB的影响，作为制剂冻干前后以及不存在和存在冻干保护剂时平均尺寸、ζ电位和DIE的变化的函数。在所有条件下，冻干表现出对所配制的CHO-NLB具有脱稳定化效应。这在冻干后得到的制剂的ζ电位中显著更明显，这是显著不太有利的，如表6所突出的那样。表面电荷的减少允许NLB聚集和聚结，这在历时一段分析时间的波动性平均尺寸中是明显的。此外，在冻干后的CHO-NLB中观察到DIE降低约9％，证实了所述制剂的不稳定性。脂质膜的结构完整性在冷冻和冻干过程中被损害，导致引入到NLB-LDDS中的亲脂性药物分子减少。加入合适的冻干保护剂对冻干后确定的CHO-NLB的平均尺寸具有非常有利的影响。经冻干和重构的产物的ζ电位与冻干前的制剂的ζ电位是相当的。乳糖的存在提高了CHO-NLB的DIE，证实相对于冻干前达到的DIE的不显著(<2％)的降低。
表6.CHO-NLB和DSPE-NLB制剂的物理特征的列表，突出了冻干与掺入冻干保护剂对得到的NLB性质的影响
      
相反，冻干对DSPE-m-PEG-NLB的影响相对于对CHO-NLB的影响显然具有较小的不利性，即便在不存在冻干保护剂的情况下。与DSPE缀合的PEG分子的存在保证了该制剂冻干的稳定性。PEG展示出冷冻保护剂以及冻干保护剂性质，这利于制剂在冷冻和冻干条件下的稳定性。冻干保护剂的加入证明了DSPE-m-PEG-制剂的相当的尺寸和在得到的表面电荷特征中的轻微的改善。
水置换假说提出，糖的冻干保护机制涉及糖和磷脂首基之间的相互作用，导致磷脂首基的间距的维持(Chen et al.,2010)。此外，所述糖还起到降低磷脂的酰基链之间的范德华力的作用，共同维持脂质双层膜的结构完整性。
4.3确定冻干保护剂对所配制的NLS和NLB的功效
如上文所说明的那样，进行冻干的过程以增强制剂的储存稳定性，特别是与NLS有关的稳定性。通过从制剂除去水分降低了水解降解和与水的存在相关的其他化学反应的倾向。认为可接受的冻干的产物的最大含水量为3％w/w(Chaudhury et al.,2012)。
在不存在冻干保护剂时，CHO-NLS的冻干的产物倾向于聚集，需要稍微搅拌以松动。此外，制剂似乎是更吸湿的，表示经过48小时之后更大的吸湿性，通过肉眼观察到的冻干的粉末的结块所证实。研究了两种糖即果糖和乳糖在制剂中作为冻干保护剂的功效。果糖在制剂中的存在导致冻干后的产物倾向于聚集并具有某种程度的海绵状的外观和质地，尤其是在CHO-NLS中。果糖浓度的改变对的冻干的产物的质地没有显著的影响。然而，将作为冻干保护剂的乳糖加到CHO-NLS中导致冻干后更为自由流动的粉末。DSPE-M-PEG-NLS表明冻干的粉末仅非常轻微的聚集，这是由于PEG分子的冷冻保护剂和冻干保护剂的性质。含有果糖或乳糖作为冻干保护剂的冻干的DSPE-m-PEG-NLS的肉眼观察结果揭示了类似于对CHO-NLS所观察到的影响，尽管不太显著。KF滴定确证了这些肉眼检查的发现，其中含有果糖的制剂在10mg样品大小显示约2-4％更高的含水量。含有乳糖的NLS样品显示可接受的含水量(<3％w/w)，因此在所有随后制备的制剂中采用乳糖作为冻干保护剂。
4.4 SB引入和SB对所配制的NLB的物理特征的影响
将水飞蓟宾(SB)额外引入到所配制的NLB-LDDS中以增强所述制剂的细胞毒素活性并提供该溶解性差的植物化学物质的有效递送方式。然而，维持所述制剂的纳米级是重要的并且不能被加入的第二种抗肿瘤化合物的损害。此外，这一修饰在NLB的聚合物包衣之前进行。因此，仅达20nm的尺寸增量可适应于CHO-NLB，并且约50nm的尺寸增量可允许用于DSPE-m-PEG-NLB。
最初引入100-200mg的SB导致CHO-NLB较大的平均尺寸和随时间不稳定的尺寸变化。尺寸分布也是非常宽的，其中PdI>0.6。加入15-50mg SB后获得的CHO-NLB的尺寸分布显著更有利。加入15mg和30mg SB后CHO-NLB的物理特征和DIE的差异是轻微的(marginal)。将SB的量增加至50mg导致CHO-NLB平均增加约22nm，这使得不能够实现维持低于约200nm基准尺寸时的足够的聚合物包衣。另外，表面电荷和SB引入效率的同时降低证实是不利的。获得的DSPE-m-PEG-NLB的极其有利的尺寸分布允许在加入15-200mg SB后所述LDDS保持在合适的尺寸范围中。然而，进一步减少了已经不利的表面电荷，因为SB的量在限定的范围内增加，且SB引入效率增加。仅加入15mg和30mg SB后鉴定了超过50％的SB的DIE。向其中加入了15mg和30mg SB的DSPE-m-PEG-NLB的平均尺寸的差异是不显著的，而在加入30mg SB后该制剂的ζ电位是轻微更有利的。因此，就引入到CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB中而言，描述了30mg SB。表7概述了加入一系列SB量得到的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB的平均尺寸和ζ电位，以及各自的SB引入效率。
表7与加入到制剂中的SB的量相关的所配制的NLB-DDS的物理特征和SB引入效率
      
4.5研究NLB的聚合物包衣的可行性:宏观和微观评估
在引入带相反电荷的聚合物之后，通过ζ电位的正和负值的反转评价成功的聚合物包衣的应用。用脱乙酰壳多糖(CHT)和聚丙烯酸(PAA)依次涂层CHO-NLS和DSPE-m-PEG-NLS证实是非常有益的，在每层吸附后展示出充分反转的ζ电位。在CHO-NLS中ζ电位的这一变化历时更短的一段时间显示出来。这归因于所配制的NLS最初更高的带电荷性质，这导致带相反电荷的聚合物层更迅速和更完全的吸附。PAA的浓度从0.5％w/v增加到2％w/v引起总体上强的阴离子表面，在悬浮液中无显著聚合物沉淀。类似地，CHT的浓度从0.5％w/v降低到0.1％w/v促进所期望的总体阴离子性ζ电位的建立。成功涂覆四层聚合物层后，在乳糖存在下冻干NLS，致成了稍微絮状的粉末，其在环境条件下可快速且容易地再分散。此外，重构并引入气体核后得到的聚合物包衣的-NLB的平均尺寸仍然远低于约200nm(CHO-NLB＝189.81nm；DSPE-m-PEG-NLB＝141.62nm)，这是针对稳定的纳米系统描述的基准尺寸。涂覆四层聚合物层后得到的聚合物包衣的CHO-NLB的表面电荷为-32.47mV，DSPE-m-PEG-NLB的表面电荷为-24.27mV。形成聚合物包衣对DSPE-m-PEG-NLB的表面电荷较对CHO-NLB具有更显著有利的影响。针对这两种制剂达到的强的阴离子性表面对NLB制剂的稳定性具有有利的影响。此外，已报道，阴离子性表面与血液相容性和细胞内化具有有益的关联。
采用扫描电子显微术定性评估冻干的、用CHT和PAA聚合物层层包衣的CHO-NLS和DSPE-m-PEG-NLS的形态学特征，提供了对所述制剂的宏观外观和行为的更深的理解。图6中用CHT和PAA依次包衣的DSPE-m-PEG-NLS显微照片揭示了在不存在显著基质的情况下充分限定的NLS。这证明样品重构的容易性。用相同的聚合物组合包衣的CHO-NLS的微观外观展示出与所包衣的DSPE-m-PEG-NLS观察到的相当的特征。
4.6荧光显微术
采用荧光显微术确认重构冻干的粉末后NLS结构的恢复和随后向NLB的转化。CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB的荧光显微照片分别显示在图7a和b中，突出了双层脂质膜结构的弹性和球状NLB结构的恢复。此外，明显不存在NLB的聚集。
4.7确立CPT引入的效率
针对候选CHO-NLS和DSPE-m-PEG-NLS的CPT引入的效率例外地表明与由统计学优化所预测的那些效率非常相关，如表8所概述的那样。NLS转化为NLB未引起DIE的显著变化。然而，冻干、之后重构引起CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB的DIE降低约2％。
表8.针对CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB以实验得到的和统计学预测CPT的DIE
      
将SB引入到NLB制剂中具有影响所述制剂的所有物理和物理化学特征的潜力，尤其是影响CPT的引入。进行这一修饰后，与药物引入有关的考虑因素是两重的。首先，分析了SB引入效率，因为这直接影响从引入该植物化学物质所希望的协同性抗肿瘤效应。其次，SB引入对CPT引入的效率的影响与该修饰的可行性相关。CPT和SB都是亲脂性化合物，因此预期它们竞争性引入到NLB-LDDS中。确定的引入到CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB中最可行的SB的量(30mg)展示出>65％引入到CHO-NLS中，伴随着CPT引入的不显著的降低。加入30mg SB后DSPE-m-PEG-NLB展示出令人满意的SB的引入效率(约53％)。然而，该制剂重复性地展示出CPT引入同时增加约2.5％。
对所配制的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB进行的最终修饰是涂覆聚合物包衣的连续层。完成聚合物包衣的吸附所需的延长的小时数表现出与药物从NLB-LDDS的泄露有关。通过有规律的分析ζ电位最小化包衣时间，以确定在最短的时间用分别的聚合物成功包衣。在涂覆聚合物包衣前后评估CPT和SB含量。
含有CHO的双层NLB膜的稳健性再次通过完成聚合物包衣后CPT和SB含量的轻微降低来证实。此外，CHO-NLB的高的表面电荷也许促成了聚合物较迅速地吸附到所述表面上，由此进一步妨碍药物从NLB中泄露出来。然而，DSPE-m-PEG-NLB在聚合物包衣过程中经受更高的药物泄露。初步研究显示，药物从DSPE-m-PEG-NLS中更快速释放，与在CHO-NLS中相反，因此该观察结果不是完全意料不到的。然而，聚合物包衣后DSPE-m-PEG-NLB的CPT含量较开始聚合物包衣之前达到的含量仅低约4.5％，以及SB含量低约约2.7％。图8概述了在乳糖存在下在聚合物包衣、冻干和重构后CPT和SB的最终DIE。
4.8确立药物释放特征和修饰对候选制剂的影响
观察到的CPT从候选NLS释放的模式类似于在每种实验设计中观察到的制剂的一般倾向。候选NLS和NLB显示出稍微双相性的CPT释放模式，这对于CHO-NLS而言是最突出的，如图9a和b所示。CPT从CHO-NLS释放和从DSPE-m-PEG-NLS释放之间的差异也是针对候选NLS注意到的关键特征。CPT释放的差异可能直接归因于每种候选NLS的平均尺寸和表面电荷特征。更低的DSPE-m-PEG-NLS的平均尺寸提供了更大的表面积-体积比，由此增加了CPT从LDDS扩散出来的扩散性的面积。此外，CHO-NLS的基本上更为负性的表面电荷减小了NLS结块的倾向，由此增强了所述制剂的稳定性。CHO-NLS历时分析的第一个6小时展现出较DSPE-m-PEG-NLS稍微更快速的CPT释放。此后，CPT释放速率表现出降低。在分析时间的大约第一个12小时中，DSPE-m-PEG-NLS的双相性模式展示出较快的CPT释放，接着CPT释放稍微降低。因此，从10小时以后，CPT从DSPE-m-PEG-NLS中的释放分数超过从CHO-NLS的的释放分数。在20小时确定CPT从DSPE-m-PEG-NLS中的完全释放。在历时24小时的分析期间，CHO-NLS显示出引入的CPT的仅约75％的累积释放。代表肿瘤环境所采用的更为酸性的pH表现出对CPT释放仅具有轻微的影响，这在所述分析时间内在每种候选NLS之间都存在变化。
在候选NLS转化为NLB中气体核的引入导致CPT在所有制剂中显著更快速的释放。在分析的第一个6小时展现出CPT在生理学pH和肿瘤pH从所有制剂中非常类似的释放，例外的是在生理学pH从DSPE-m-PEG-NLB的释放。超过8小时之后，CPT展示出从CHO-NLB中稍微慢的释放模式，历时24小时的分析时间在这两种pH条件下达到90-92％之间的累积CPT释放。CHO-NLS转化为冻干的和重构的CHO-NLB之后表面电荷的显著降低(-37.9mV降低到-27.9mV)归因于CPT从候选CHO-NLB中释放增加。带电荷的表面的强度的降低导致较不稳定的制剂，其具有更大的NLB聚集倾向。虽然CHO-NLB的表面电荷降低，但是转化为NLB之后达到的ζ电位是非常令人满意的，这解释了不存在从NLB制剂中显著爆发性释放以及受控的CPT释放模式。此外，在较低的pH的分析突出了对CPT从CHO-NLB的释放无显著影响。
CPT从DSPE-m-PEG-NLB的释放显著高于从DSPE-m-PEG-NLS的释放，特别是在较低的pH，此时，观察到完全的CPT释放达16小时。CPT从DSPE-m-PEG-NLB中更迅速的释放一定程度上可归因于所述制剂的低的表面电荷。然而，假定的是，所述制剂的平均尺寸以及脂质膜的渗透性可进一步归因于CPT释放模式，因为冻干后DSPE-m-PEG-NLB的ζ电位较DSPE-m-PEG-NLS的ζ电位稍微更有利。在pH 6.0CPT从DSPE-m-PEG-NLB的更快的释放可能暗示了在较低的pH在NLB核中脂质膜对SF6气体的更高的渗透性，导致了所引入的药物更迅速的释放。
加入第二种活性化合物SB，构成了评估SB的释放特征以及确定SB释放对CPT的释放分布的影响的需要。在第一个10小时，CPT从含有SB的CHO-NLB(CHO-NLB+SB)中的释放模式未展现出与SB天然制剂的显著差异，除了在第一小时CPT明显的爆发性释放(如图10a所阐述的那样)。在此时间段观察到SB的类似的爆发性释放，显示在图10b中，表明这两种化合物一定程度上与NLB表面结合。另外，额外化合物的存在可能改变了所配制的CHO-NLB的表面张力，导致从CPT和SB两者的最初爆发性释放。从10小时开始，CPT从CHO-NLB+SB的释放较从不含SB的CHO-NLB中所观察到的释放高约7-9％。在分析期间所采用的释放介质的不同pH(7.4和6.0)的影响只有在10小时后才变得明显，而CPT在pH 6.0的释放表现出稍微高于在pH 7.4的释放。然而，根据该研究，仍然认为肿瘤pH对CPT从CHO-NLB+SB中的释放特征的影响是可忽略的。历时24小时的研究达到了CPT从CHO-NLB+SB的82-86％的累积CPT释放。
在第一个10小时，CPT从含有SB的DSPE-m-PEG-NLB(DSPE-m-PEG-NLB+SB)的释放模式相对于从CHO-NLB+SB的释放是较慢的，之后超过了从CHO-NLB+SB的释放。CPT和SB的显著爆发性释放的缺失表明，CPT和SB与NLB表面的结合是不存在的或者达到远低于针对CHO-NLB+SB所猜想的程度。在研究中在整个时间段，CPT从DSPE-m-PEG-NLB+SB的释放低于从SB天然的DSPE-m-PEG-NLB的释放。释放介质中pH的差异对CPT从DSPE-NLS+SB的释放行为不具有可证明的影响。CPT从DSPE-m-PEG-NLS+SB的完全释放通过完成24小时的评估时间来确定。在分析的第一个小时中SB从所配制的CHO-NLB的前述爆发性释放后，图10b展示的接着发生的模式突出了相当恒定的释放模式，这与观察到的CPT的释放相比是相当快的。SB较CPT水溶性更大，这可能促使了CPT在NLB的脂质环境中的保留较SB的保留达到更高的程度。SB表现出历时24小时的一段时间在较低的pH较在生理学pH释放快3-8％。在生理学pH和肿瘤pH在20小时后都显示了SB从CHO-NLB的完全释放。从DSPE-m-PEG-NLS建立的SB释放的模式是显著恒定的，非常类似于一级释放。释放分布的较陡的梯度证实在16小时内达到了SB从DSPE-m-PEG-NLB+SB中完全释放。释放介质的pH对SB的释放特征具有轻微的影响。在第一小时后SB从DSPE-m-PEG-NLB+SB的释放比CPT从同一制剂的释放显著更快。
递送经历着广泛代谢的水溶性差的化合物的挑战损害了SB的临床潜能的全面利用。然而，该植物化学物质展示了体内高的渗透性。引入到NLB-LDDS中提供了递送到肿瘤组织中的机制，在肿瘤组织中，SB可进入肿瘤细胞并有效发挥其抗肿瘤活性。
强调了延迟CPT和SB释放的开始并降低CPT和SB释放速率，这是根据降低这些化合物不加区别的全身活性的需要以及增加CPT和SB在肿瘤位点的浓度而建立的。为了实现这一目的，需要足够的时间以允许在释放显著比例的被引入的化合物之前所配制的LDDS在肿瘤位点的被动蓄积。此外，CPT的延迟释放将是特别有利的，因为该药物主要作用于细胞周期的S-期。因此，延迟的释放促进更大量的肿瘤细胞在S-期暴露于CPT，由此增强CPT的功效。分层的聚合物包衣在所配制的NLB上的设置证实在减慢CPT和SB从各候选NLB-LDDS中的释放的方面是格外有益的。
涂覆聚合物包衣(在这种情况中为层层CHT和PAA聚合物包衣)显著减缓了在生理学pH和肿瘤pH下CPT从CHO-NLB的释放，而释放特征的差异在pH 7.4是更为显著的。显然不存在在未包衣的NLB中观察到的双相性释放模式，而释放分布呈现出更恒定的线性形状，如图11a所示。在24小时达到的CPT的累积释放<50％。这是CPT在水性介质中半衰期≤1小时的相当可观的延伸，如文献中报道的那样(Yang et al.,1999；Kang et al.,2002)。此外，在分析的第一小时小于7％的CPT从NLB-LDDS中释放，突出了爆发性释放的缺失以及表明了足够低浓度的CPT释放到体循环中。CPT从所配制的用CHT和PAA聚合物层层包衣的CHO-NLB中的上述释放特征的实现具有解决CPT的毒性分布的潜力，所述毒性分布是限制这一光谱抗肿瘤剂的临床应用的一个主要缺点。
如图11a所示，对CPT在较低的肿瘤pH(6.0)的释放的评价也揭示了在研究的时间段CPT释放的有利降低。在pH 6.0，CPT在分析的第一小时的释放低于针对未包衣的CHO-NLB所观察到的释放，以及在生理学pH，低于针对用CHT和PAA聚合物层层包衣的CHO-NLB所观察到的释放。此外，CPT从包衣的CHO-NLB的释放分布较未包衣的CHO-NLB具有显著更线性的外观，表明更受控的释放方式。然而，在第一小时之后，CPT从聚合物包衣的NLB-LDDS的释放较在生理学pH观察到的更快。历时24小时的一段时间实现CPT约63％的累积释放，这比历时相同时间段从包衣的CHO-NLB实现的CPT释放高14％。这归因于作为层层包衣的一部分采用的CHT的pH响应性特性。CHT是直链多糖，其在高达pH 6.2时展示了水溶性，这是由于在该较低的pH下葡糖胺单元的质子化(Pujana et al.,2012；Chatrabhuti andChirachanchai,2013)。CHT在较低的pH的特征的改变促进了该聚合物在pH响应性涂覆中的用途。所配制的NLB-LDDS不能严格意义上视为pH响应性的，而CPT在较低的肿瘤pH的释放的增加导致该抗肿瘤药物在肿瘤组织中的浓度增加，这具有显著增强CPT的治疗功效的潜力。
对在生理学pH和肿瘤pH释放介质中CPT从层层CHT和PAA包衣的DSPE-m-PEG-NLB的释放特征的评价具有与从层层CHT和PAA包衣的CHO-NLB获得的特征相比强烈的相似性。相对于未包衣的CHO-NLB，在未包衣的DSPE-m-PEG-NLB中观察到的一般倾向是活性化合物更快速的释放。这一观察结果归因于DSPE-NLB的较低的稳定性，这是由于更低的阴离子性表面电荷，以及DSPE-NLB脂质膜的更高的渗透性。层层CHT和PAA聚合物包衣之后，DSPE-m-PEG-NLB的ζ电位展现出表面电荷的阴离子强度的非常有利的增强，达到较在包衣的CHO-NLB中观察到的更大的程度。此外，层层CHT和PAA聚合物包衣相当大程度地降低了LDDS对SF6气体核的渗透性。包衣的DSPE-m-PEG-NLB在pH 6.0保留了一些双相释放特征，这区别于未包衣的制剂。在评价的第一个8小时CPT从DSPE-m-PEG-NLB的释放是更快的。在生理学pH和肿瘤pH，CPT从DSPE-m-PEG-NLB的累积释放分别展现出约为50％和58％。这种有利的释放模式与包衣的DSPE-m-PEG-NLB的较小尺寸结合在一起，相对于包衣的CHO-NLB，可证实对于该LDDS的被动靶向能力是极其有利的。
如就CPT所述的那样，由于层层CHT和PAA聚合物包衣的结果，SB从CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB的释放显著降低，如图11b中所描绘的那样。SB从未包衣的CHO-NLB的爆发性释放有着特别的影响。在这两种pH环境下在第一个小时层层CHT和PAA聚合物包衣将SB从CHO-NLB的释放成功地降低了约19％。pH的影响是明确的，特别是在2小时分析后。SB从CHO-NLB的释放稍微快于针对CPT得出的释放。在pH 7.4和6.0达到的SB从CHO-NLB的累积释放分别为57％和约72％。对DSPE-m-PEG-NLB的研究也突出了对LDDS层层CHT和PAA聚合物包衣之后SB慢得多的释放。pH对SB从包衣的DSPE-m-PEG-NLB的释放存在显著的影响，其中在生理学pH的累积释放较在肿瘤pH确定的释放低约10％。SB在生理学pH的降低的释放提示，在到达肿瘤组织之前，更低浓度的SB将会在体循环中进行代谢和清除。在肿瘤pH SB从包衣的DSPE-m-PEG-NLB的更快释放将促进SB在靶位达到更高的浓度，引起优良的SB功效以及与CPT结合的增强的协同性抗肿瘤作用。
4.9限定NLB-LDDS的稳定性特征
从成本、生产和临床使用的立场来看，药物制剂的稳定性可显著地影响所述制剂的活性。不能被储存可接受的时间段的制剂需要在使用前即刻生产，这可导致生产和运输成本增加，由于无法预料的情况延迟治疗，并最终使临床使用变麻烦。此外，重构后冻干的产物的时间依赖性稳定性、合适的储存条件，以及给药后稳定性对评价制剂的总体可行性而言是关键的。
4.9.1确定NLB在血清中的稳定性
预期的NLB制剂的静脉内递送要求建立严格的稳定性参数，特别是关于所给药的制剂的尺寸特征。血清蛋白的吸收，或者在血清蛋白存在下NLB的聚集可显著地影响制剂的可行性。在血清蛋白存在下未包衣的CHO-NLB历时分析的时间段展示出<10nm的尺寸增加，以及表面电荷的轻微降低。这归因于在血清蛋白存在下CHO-NLB的稍微脱稳定化，血清蛋白引起了NLB的聚集。CHO-NLB的层层CHT和PAA聚合物包衣后表面电荷的增加赋予制剂更大的稳定性。因此，血清蛋白的存在对所述制剂的稳定性仅具有轻微的影响。<2nm的尺寸增加不是归因于血清蛋白的存在，而是纳米系统随时间的正常尺寸变化。ζ电位的维持进一步指示CHO-NLB的聚集是不存在的。
表9在FBS存在下未包衣的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB以及CHT和PAA聚合物层层包衣的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB的物理特征
      
      
就在血清蛋白存在下未包衣的DSPE-m-PEG-NLB和层层CHT和PAA聚合物包衣的DSPE-m-PEG-NLB而言，显著不存在膜的脱稳定化，如同在所述分析时间段制剂的尺寸和ζ电位的分钟变化所证实的那样。在所配制的DSPE-m-PEG-NLB的膜中与DSPE缀合的PEG的存在赋予制剂对抗血清蛋白的作用的优良的稳定性。所述制剂对抗聚集以及与血清蛋白的相互作用的稳定性归因于聚合物包衣的DSPE-m-PEG-NLB的强的阴离子电荷。
4.9.2表征重构的NLB的稳定性
将冻干的粉末或颗粒制剂重构到悬浮液中伴随着制剂的稳定性的改变。一些细胞毒性制品的制造商给出的制备和给药指示限定了在细胞毒性制品的产品重构和完全静脉内输注之间仅4-6小时的时间段。在环境温度采用TurbiscanTM LAB(Formulaction,L’Union,France)评估所配制的NLB-LDDS的稳定性。测定由层层CHT和PAA包衣的和未包衣的NLB制剂所背散射的光，采用所述测定限定所述制剂的稳定性特征。较肉眼观察，TurbiscanTM LAB能够更早地检测出悬浮物质行为的微小变更。
未包衣的CHO-NLB(描绘于图12a中)的背散射图突出了颗粒物质行为的不集中的变化，这将指示悬浮的NLB沉降或乳油化。然而，背散射在整个光谱中的变化表明了NLB尺寸的变化。在重构后第一个6小时中观察到尺寸减小，这可能是气体核从NLB中逐渐蒸发出来的结果。此后观察到CHO-NLB的尺寸轻微增加(<2％)。与重构后的时间相关的制剂稳定性的降低导致CHO-NLB的聚集以及可能的聚结，由此引起尺寸增加(通过背散射的增加来检测)。重构后历时12小时的时间段确定的背散射的最大变异为约4％。定量背散射随分析时间的变化并描绘于图12c中。如同最陡的梯度所指示的那样，在0.5-4.5小时观察到背散射的最明显变化，其中背散射每小时变化0.94％。
CHT和PAA聚合物层层包衣的CHO-NLB的背散射分布描绘于图12b中，代表了制剂稳定性的示例性表现。类似于未包衣的CHO-NLB，没有乳油化或沉降的迹象。历时12小时的时间段观察到CHO-NLB的尺寸的轻微(<2％)变异。然而，不同于未包衣的CHO-NLB，仅观察到单向的尺寸变异。层层CHT和PAA包衣的CHO-NLB的尺寸的稍微降低归因于SF6气体逐渐渗透出NLB。所配制的层层CHT和PAA包衣的CHO-NLB的增强的稳定性成为不存在聚集的基础，而在重构6小时后在未包衣的CHO-NLB观察到了聚集。图12d定量了背散射(参照最初测量)随着分析时间的变化。所述图的梯度突出了聚合物包衣的CHO-NLB制剂的例外的稳定性，其中每小时背散射的变化为0.01％。
确定不存在未包衣的DSPE-m-PEG-NLB和层层CHT和PAA包衣的DSPE-m-PEG-NLB的迁移行为，证实所述制剂对抗沉降或乳油化的稳定性。在图13a中以非参照模式呈现的未包衣的DSPE-m-PEG-NLB的背散射图，突出了与未包衣的CHO-NLS的关于如下方面的相当的特征：在分析期间的前半段观察到NLB尺寸的减少，接着是悬浮的NLB的尺寸的增加。该现象再次归因于气体核从DSPE-m-PEG-NLB的蒸发，导致LDDS尺寸减少，接着在分析的后一阶段稳定性更低的DSPE-m-PEG-NLB的聚集。在历时12小时的时间段观察到的背散射的最大变化为约2.5％。如由每种制剂显示出的ζ电位所断定的那样，DSPE-m-PEG-NLB较CHO-NLB更不稳定，而背散射的变化小于针对CHO-NLB观察到的4％的变异。较小的最初尺寸的未包衣的DSPE-m-PEG-NLB在所述制剂的核中含有较小体积的SF6气体。因此，气体核从所配制的DSPE-m-PEG-NLB中蒸发出来引起较针对更大的CHO-NLB所观察到的更轻微的尺寸变异。背散射的变化通过DeltaBS(t)图表的方式定量，描绘于图13c中。该图表突出了历时0.5-4.5小时背散射的最大降低，接着是背散射的交替增加和降低，这提示由于悬浮的NLB在布朗运动中可逆的聚集导致的不显著尺寸变异。该图表在0.5-4.5小时的斜率指明每小时背散射的变化为0.3％。
聚合物包衣的DSPE-m-PEG-NLB的背散射图表关于LDDS的稳定性特征呈现出显著更有利的模式。图13b中以非参照模式呈现的该图表，突出了历时12小时分析时间段几乎不可想象的背散射变化。通过参照在评估开始的最初测量对背散射变化进行定量证实了这一例外的稳定性，呈现于图13d中。该图表实际上的水平梯度断定了历时全部12小时的时间段每小时背散射变化为0％。因此，DSPE-m-PEG-NLB重构后的稳定性分布提示了允许在重构和给予患者之间有足够时间的高度稳定的制剂。
4.9.3评价NLB-LDDS的储存稳定性
在环境和冷冻温度历时3个月的时间段评价作为冻干的产物配制的CHT和PAA聚合物层层包衣的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB的稳定性。以每周一次的间隔重构制剂，转化为NLB并确定制剂的平均尺寸、ζ电位以及CPT和SB的DIE。历时第一个8周CHO-NLB的尺寸的变化是最小的，之后冷冻的制剂较在室温储存的制剂更好地维持其尺寸，如图14a所突出的那样。然而，在第三个月期间，冷冻的和非冷冻的制剂间的差异<2nm。在为期12周研究结束时，CHO-NLB制剂保持低于200nm。DSPE-m-PEG-NLB显示出历时整个研究在两种温度储存的制剂平均尺寸的不显著变异。此外，所述制剂到研究末期展示出仅2-3nm的尺寸增加。长期储存以及储存温度表现出对制剂的表面电荷具有更大的影响，如图14b中所图示的那样。在环境温度储存的CHO-NLB历时评价时间段展现出ζ电位的不利的7.24mV的增加，而冷冻样品具有ζ电位的4.17mV的增加。冷冻的和非冷冻的样品间的ζ电位的差异随着研究进行而增加。
引入的药物从在悬浮液中储存的所配制的脂质体和纳米气泡中的泄露出来是与这些LDDS的可行性相关的主要的稳定性挑战之一。先前已探究了冻干并报道为增强前述LDDS的储存稳定性的方式之一。因此，在该研究中配制的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB的最终呈现形式为冻干的产物。历时所述分析时间段关于CPT的DIE的这两种制剂的储存稳定性，呈现于图14c中，是卓越的。经所述分析论断，CHO-NLB显示出CPT的DIE的<3％降低，而针对DSPE-m-PEG-NLB的所述降低为<4％。在这两种DDS中储存温度对引入CPT的影响是不显著的。如图14d所描绘的那样，储存温度表现出对SB在DSPE-m-PEG-NLB中的引入效率具有可忽略的影响。然而，储存时间导致SB引入的梯度降低，最后在所述3个月研究的末期达到SB的DIE低<3％。关于SB引入的CHO-NLB储存稳定性较针对DSPE-m-PEG-NLB所观察到的是稍微不利的，其中图14d表示出历时研究时间段SB的DIE降低约4％降低。在第3-8周之间，冷冻对SB引入的影响是明显的。然而，就CHO-NLB而言，总体上，储存温度对SB的引入稳定性的影响是可忽略的。
4.10本发明的NLB-LDDS的优点
将NLS转化为NLB制剂突出了CHO-NLB的优良的稳定性、药物引入和药物释放特征，而DSPE-m-PEG-NLB的尺寸分布是特别有利的。作为实际考虑研究了冻干的可行性，以改善所述制剂的长期稳定性，由此增强所述新的LDDS的工业和临床生存力。荧光显微术进一步证实冻干后NLB形态学结构的恢复。
对所配制的NLB-LDDS进行的进一步修饰包括引入具有抗肿瘤特性的植物化学物质。维持有利的尺寸分布以促进LDDS的被动靶向性质是确定引入到LDDS中的SB的最佳浓度时的重要考量。有趣的是，将SB引入到CHO-NLB中对CPT的共存的DIE具有轻微的影响，而引入到DSPE-m-PEG-NLB中的CPT稍微增加。将SB包含到DDS中导致了在第一小时CPT和SB从CHO-NLB的爆发性释放，以及历时所述24小时的评价时间段CPT的更快速的释放。相反，将SB引入到DSPE-m-PEG-NLB中导致CPT更慢的释放。与CPT相关的SB的更高的水溶性是SB更快速释放的原因，而就CHO-NLB而言SB的完全释放在20小时内达到，就DSPE-m-PEG-NLB而言为16小时。
在聚合物分层这一方面，CHT和PAA的组合证实是非常有利的，而冻干产生的絮状粉末容易重构。此外，CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB的平均尺寸都保持在低于最初描述的基准的200nm尺寸。具有聚合物包衣对DSPE-m-PEG-NLB的表面电荷具有特别有益的影响，实现ζ电位的有利的约16mV的降低。CHO-NLB显示出CPT和SB的引入效率分别为77.17％和64.38％。DSPE-m-PEG-NLB显示出CPT和SB的引入效率分别为55.17％和50.10％。此外，涂覆聚合物包衣显著地增强了这两种药物化合物的释放特征且引入了在生理学pH和肿瘤pH的差别性释放特征，由此改善了LDDS的被动靶向能力。
制剂的稳定性是药物制剂的关键考虑因素。对所配制的NLB-LDDS的稳定性的评价进一步突出了聚合物包衣(特别是层层CHT和PAA聚合物包衣)对CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB的稳定性特征的影响。对聚合物包衣的CHO-NLB和DSPE-m-PEG-NLB的重构后评价显示了在整个12小时的评价时间段显著的稳定性特征，特别是对于DSPE-m-PEG-NLB。对NLB-LDDS在环境温度和冷冻温度历时3个月时间段的长期储存稳定性的评价突出了就引入CPT和SB而言极好的稳定性，其中储存温度的影响不显著。在8周后CHO-NLB的尺寸的增加才是明显的，而非冷冻的制剂经受了ζ电位的不利的>7mV的增加。DSPE-m-PEG-NLB历时所述3个月评价时间段的尺寸和ζ电位分布展现出优良的稳定性。
本发明的CHO-NLS、CHO-NLB、DSPE-m-PEG-NLS和DSPE-m-PEG都提供了这样的药物递送系统：其至少具有针对被动肿瘤靶向的有利尺寸，出于储存的目的是稳定的，易于配制成供静脉内化学疗法施用的制剂，显示了有利的药物引入效率，以及显示了有利的药物释放分布。本申请呈现的LDDS的每种至少缓解了本领域当前工艺水平的已知问题。
就本发明的实施方案和/或实例而言已经详细描述了本发明，而应该理解的是，本领域技术人员一旦理解了前述内容，可容易地想到对这些实施方案的变更、改变和等同形式。因此，本发明的范围应评价为所附权利要求及其任何等同形式的范围。
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Claims (49)

1.用于在人体或动物体内释放至少一种药物化合物至靶位的脂质体药物递送系统(LDDS)，所述脂质体药物递送系统(LDDS)包含由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)构成的脂质体壳，所述壳限定内腔室。
2.根据权利要求1的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述脂质体壳还包含表面活性剂。
3.根据权利要求2的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述表面活性剂是选自以下的至少一种表面活性剂：磺基琥珀酸二辛酯(DOS)、吐温80和司盘80，或它们的任何组合。
4.根据权利要求1至3中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，还包含至少部分覆盖所述壳的聚合物包衣。
5.根据权利要求4的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述聚合物包衣是选自以下的至少一种聚合物包衣：生物相容性聚合物、离子聚合物、阴离子聚合物、阳离子聚合物、明胶、聚乙烯亚胺(PEI)、聚-L-赖氨酸(PLL)、角叉菜胶、果胶、藻酸钠、羧酸聚合物、硫酸盐、和胺官能化的聚合物诸如聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、多糖诸如藻酸、果胶酯酸、羧甲基纤维素、透明质酸、肝素(粘多糖)、脱乙酰壳多糖(CHT)、羧甲基脱乙酰壳多糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸肝素、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉和它们的盐、聚(氰基丙烯酸丁酯)(PBCA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(富马酸丙二醇酯)(PPF)、聚酐。
6.根据权利要求5的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述聚合物包衣包含至少两层，优选地为阴离子层和阳离子层，还优选地为聚丙烯酸(PAA)和脱乙酰壳多糖(CHT)。
7.根据权利要求1至6中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述脂质体壳还包含冻干保护剂，优选地为糖，还优选地为乳糖和/或果糖。
8.根据权利要求1至7中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，还包含容纳在由所述壳限定的内腔室之内的气体，从而形成纳米脂质气泡(NLB)。
9.根据权利要求8的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述气体是选自以下的至少一种气体：空气、氮气、氧气、二氧化碳、氢气、一氧化二氮、稀有气体或惰性气体诸如氦、氩、氙或氪；放射性气体诸如Xe133或Kr81；超极化稀有气体、低分子量的烃诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷或异戊烷；环烷烃诸如环丁烷或环戊烷；烯烃诸如丙烯、丁烯或异丁烯；或炔烃诸如乙炔；醚；酮；酯；卤化气体，优选地氟化或全氟化的气体，诸如氟代烃；六氟化硫；全氟丙酮；全氟乙醚；全氟烷烃；全氟烯烃；全氟炔烃；全氟环烷烃；和饱和全氟化碳，优选地，所述气体是六氟化硫。
10.根据权利要求1至9中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，还包含容纳在由所述脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。
11.根据权利要求10的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述药物化合物是选自以下的至少一种药物：氨基酸，止痛药，消炎药，驱虫剂，抗细菌剂，氨基糖苷类，β-内酰胺类抗生素，糖肽类，青霉素类，喹诺酮类，磺胺类，镇定剂，强心苷，抗帕金森剂，抗抑郁药，抗肿瘤剂，免疫抑制剂，抗病毒剂，抗生素药物，抗真菌剂，抗微生物剂，食欲抑制剂，止吐剂，抗组胺剂，抗偏头痛药，冠状、大脑或外周血管扩张药，抗心绞痛药，钙通道阻滞剂，激素药物，避孕药，抗血栓剂，利尿剂，抗高血压药，化学依赖性药物，局部麻醉剂，皮质类固醇，皮肤病药，维生素，类固醇，唑类衍生物，硝基化合物，胺化合物，昔康类衍生物，粘多糖，阿片类化合物，吗啡样药物，芬太尼衍生物和类似物，前列腺素，苯甲酰胺类，肽，呫吨类，儿茶酚胺类，二氢吡啶类，噻嗪类，斯德酮亚胺，多糖，降胆固醇剂，植物化学物质和抗氧化剂，或上述物质的任何衍生物。
12.根据权利要求11的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述抗肿瘤药物是选自以下的至少一种抗肿瘤药物：喜树碱、紫杉烷和铂化合物。
13.根据权利要求1至12中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
14.根据权利要求1至12中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)是L-α-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基-聚乙二醇缀合物(DSPE-m-PEG)。
15.根据权利要求1至14中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述脂质体壳被配置成使得二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)的非极性官能团向内朝向所述内腔室，以及极性官能团向外朝向所述壳的外表面，在使用中，所述脂质体壳的非极性官能团增加了容纳在所述腔室之内的非极性药物化合物和/或亲脂性药物化合物的溶解。
16.用于在人体或动物体内释放至少一种药物化合物至靶位的脂质体药物递送系统(LDDS)，所述脂质体药物递送系统(LDDS)包含：
由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)和表面活性剂构成的纳米脂质体壳，所述壳限定内腔室；以及
容纳在由所述纳米脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。
17.根据权利要求16的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述表面活性剂是磺基琥珀酸二辛酯(DOS)。
18.根据权利要求16或17的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述纳米脂质体壳还包含至少部分覆盖所述壳的聚合物包衣，优选地所述聚合物包衣包含至少两层，优选地为阴离子层和阳离子层，还优选地为聚丙烯酸(PAA)和脱乙酰壳多糖(CHT)。
19.根据权利要求16至18中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述纳米脂质体壳还包含冻干保护剂，优选地为糖，还优选地为乳糖和/或果糖。
20.根据权利要求16至19中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，还包含容纳在内腔室之内的气体，从而形成纳米脂质气泡(NLB)。
21.用于在人体或动物体内释放至少一种药物化合物至靶位的脂质体药物递送系统(LDDS)，所述脂质体药物递送系统(LDDS)包含由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)构成的脂质体壳，所述壳限定内腔室。
22.根据权利要求21的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述脂质体壳还包含表面活性剂。
23.根据权利要求22的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述表面活性剂为选自以下的至少一种表面活性剂：磺基琥珀酸二辛酯(DOS)、吐温80和司盘80，或它们的任何组合。
24.根据权利要求20至23中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，还包含至少部分覆盖所述壳的聚合物包衣。
25.根据权利要求24的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述聚合物包衣为选自以下的至少一种聚合物包衣：生物相容性聚合物；离子聚合物、阴离子聚合物、阳离子聚合物、明胶、聚乙烯亚胺(PEI)、聚-L-赖氨酸(PLL)、角叉菜胶、果胶、藻酸钠、羧酸聚合物、硫酸盐、和胺官能化的聚合物诸如聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、多糖诸如藻酸、果胶酯酸、羧甲基纤维素、透明质酸、肝素(粘多糖)、脱乙酰壳多糖、羧甲基脱乙酰壳多糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸肝素、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉和它们的盐、聚(氰基丙烯酸丁酯)(PBCA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(富马酸丙二醇酯)(PPF)、聚酐。
26.根据权利要求25的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述聚合物包衣包含至少两层，优选地为阴离子层和阳离子层，还优选地为聚丙烯酸(PAA)和脱乙酰壳多糖(CHT)。
27.根据权利要求21至26中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述纳米脂质体壳还包含冻干保护剂，优选地为糖，还优选地为乳糖和/或果糖。
28.根据权利要求21至27中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，还包含容纳在由所述壳限定的内腔室之内的气体，从而形成纳米脂质气泡(NLB)。
29.根据权利要求28的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述气体是选自以下的至少一种气体：空气、氮气、氧气、二氧化碳、氢气、一氧化二氮、稀有气体或惰性气体诸如氦、氩、氙或氪；放射性气体诸如Xe133或Kr81；超极化稀有气体、低分子量的烃诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷或异戊烷；环烷烃诸如环丁烷或环戊烷；烯烃诸如丙烯、丁烯或异丁烯；或炔烃诸如乙炔；醚；酮；酯；卤化气体，优选地氟化或全氟化的气体，诸如氟代烃；六氟化硫；全氟丙酮；全氟乙醚；全氟烷烃；全氟烯烃；全氟炔烃；全氟环烷烃；和饱和全氟化碳，优选地，所述气体是六氟化硫。
30.根据权利要求21至29中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，还包含容纳在由所述脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。
31.根据权利要求30的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述药物化合物是选自以下的至少一种药物：氨基酸，止痛药，消炎药，驱虫剂，抗细菌剂，氨基糖苷类，β-内酰胺类抗生素，糖肽类，青霉素类，喹诺酮类，磺胺类，镇定剂，强心苷，抗帕金森剂，抗抑郁药，抗肿瘤剂，免疫抑制剂，抗病毒剂，抗生素药物，抗真菌剂，抗微生物剂，食欲抑制剂，止吐剂，抗组胺剂，抗偏头痛药，冠状、大脑或外周血管扩张药，抗心绞痛药，钙通道阻滞剂，激素药物，避孕药，抗血栓剂，利尿剂，抗高血压药，化学依赖性药物，局部麻醉剂，皮质类固醇，皮肤病药，维生素，类固醇，唑类衍生物，硝基化合物，胺化合物，昔康类衍生物，粘多糖，阿片类化合物，吗啡样药物，芬太尼衍生物和类似物，前列腺素，苯甲酰胺类，肽，呫吨类，儿茶酚胺类，二氢吡啶类，噻嗪类，斯德酮亚胺，多糖，降胆固醇剂，植物化学物质和抗氧化剂，或上述物质的任何衍生物。
32.根据权利要求31的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述抗肿瘤药物是选自以下的至少一种抗肿瘤药物：喜树碱、紫杉烷和铂化合物。
33.根据权利要求21至32中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
34.根据权利要求21至33中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述脂质体壳被配置成使得二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)的非极性官能团向内朝向所述内腔室，以及极性官能团向外朝向所述壳的外表面，在使用中，所述脂质体壳的非极性官能团增加了容纳在所述腔室之内的非极性药物化合物和/或亲脂性药物化合物的溶解。
35.用于在人体或动物体内释放至少一种药物化合物至靶位的脂质体药物递送系统(LDDS)，所述脂质体药物递送系统(LDDS)包含：
由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇(CHO)和表面活性剂构成的纳米脂质体壳，所述壳限定内腔室；以及
容纳在由所述纳米脂质体壳限定的内腔室之内的药物化合物。
36.根据权利要求35的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述表面活性剂是磺基琥珀酸二辛酯(DOS)。
37.根据权利要求35或36的脂质体药物递送系统(LDDS)，还包含至少部分覆盖所述壳的聚合物包衣，优选地所述聚合物包衣包含至少两层，优选地为阴离子层和阳离子层，还优选地为聚丙烯酸(PAA)和脱乙酰壳多糖(CHT)。
38.根据权利要求35至37中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，其中所述纳米脂质体壳还包含冻干保护剂,优选地为糖，还优选地为乳糖和/或果糖。
39.根据权利要求35至38中任一项的脂质体药物递送系统(LDDS)，还包含容纳在内腔室之内的气体，从而形成纳米脂质气泡(NLB)。
40.脂质体壳用于在治疗疾病中递送药物化合物至人体或动物体的靶位的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)构成，所述壳限定内腔室。
41.根据权利要求40的用途，其中所述脂质体壳还包含容纳在内腔室之内的药物化合物。
42.脂质体壳在制备用于在治疗疾病中递送药物化合物至人体或动物体的靶位的药物中的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-m-聚乙二醇(DSPE-m-PEG)构成，所述壳限定内腔室。
43.根据权利要求42的用途，其中所述脂质体壳还包含容纳在内腔室之内的药物化合物。
44.根据权利要求42或43的用途，其中所述药物被配制成静脉内(IV)制剂。
45.脂质体壳用于在治疗疾病中递送药物化合物至人体或动物体的靶位的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)构成。
46.根据权利要求45的用途，其中所述脂质体壳还包含容纳在内腔室之内的药物化合物。
47.脂质体壳在制备用于在治疗疾病中递送药物化合物至人体或动物体的靶位的药物中的用途，所述脂质体壳由二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇(CHO)构成。
48.根据权利要求47的用途，其中所述脂质体壳还包含容纳在内腔室之内的药物化合物。
49.根据权利要求47或48的用途，其中所述药物被配制成静脉内(IV)制剂。
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