PL213926B1 - Wyizolowany ssaczy metapneumowirus o ujemnej pojedynczej nici RNA (MPV), kompozycja immunogenna, wyizolowane kwasy nukleinowe, sposoby wykrywania ssaczego metapneumowirusa, wektor, komórka gospodarza, wyizolowane bialko, przeciwcialo, sposób wirologicznego diagnozowania infekcji MPV, sposób serologicznego diagnozowania infekcji MPV, kompozycja farmaceutyczna, zestaw diagnostyczny oraz zastosowanie kompozycji farmaceutycznej - Google Patents

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny wirusologii. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanego ssaczego metapneumowirusa o ujemnej pojedynczej nici RNA (MPV), kompozycji immunogennej zawierającej takiego wirusa, wyizolowanych kwasów nukleinowych, sposobów wykrywania ssaczego metapneumowirusa w próbce, wektora zawierającego taki kwas nukleinowy, komórki gospodarza zawierającej taki kwas nukleinowy, wyizolowanego białka pochodzącego z takiego wirusa, przeciwciała swoiście wiążącego się z takim wirusem, sposobu wirologicznego diagnozowania infekcji MPV u ssaka, sposobu serologicznego diagnozowania infekcji MPV u ssaka, kompozycji farmaceutycznej zawierającej takiego wirusa, zestawu diagnostycznego oraz zastosowania kompozycji farmaceutycznej do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki infekcji MPV lub choroby oddechowej.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci zidentyfikowano kilka czynników etiologicznych chorób ssaków, w szczególności chorób dróg oddechowych (RTI), zwłaszcza ludzi⁷. Klasycznymi czynnikami etiologicznymi RTI u ssaków są wirusy syncytialne układu oddechowego, należące do rodzaju Pneumovirus, znajdywane u ludzi (hRSV) i przeżuwaczy, takich jak bydło i owce (bRSV i/lub oRSV). U ludzkiego RSV, różnice w testach wzajemnej neutralizacji krzyżowej, reaktywności białek G w testach immunologicznych oraz sekwencje nukleotydowe genu G, wykorzystuje się do określenia 2 antygenowych podgrup hRSV. W tych podgrupach sekwencje aminokwasowe wykazują 94% (podgrupa A) lub 98% (podgrupa B) identyczności, podczas gdy między podgrupami znaleziono tylko 53% identyczności sekwencji aminokwasowych. Obserwuje się dodatkową zmienność w podgrupach na podstawie przeciwciał monoklonalnych, testów RT-PCR i testów zabezpieczania Rnazy. Wirusy z obu podgrup występują na całym świecie i mogą pojawiać się podczas jednej pory roku. Infekcja może nastąpić w obecności wcześniej istniejącej odporności i aby pojawiła się ponowna infekcja, nie jest konieczna odmiana antygenowa. Patrz np. Sullender, W.M. Respiratory Syncytial Virus Genetic and Antigenetic Diversity. Clinical Microbiology Reviews, 2000. 13(1): strony 1-15; Collins, P.L., McIntosh, K. i Chanock, R.M., Respiratory syncytial virus. Field wirology, wydawca B.N. Knipe, Howley, P.M. 1996, Philadelphia: lippencottraven. 1313-1351; Johnson, P.R. i inni, The G glycoprotein of human respiratory syncytial viruses of subgroups A and B: extensive sequence divergence between antigenically related proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987. 84 (16): strony 5625-9; Collins, P.L., The molecular Biology of Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) of the Genus Pneumovirus, w The Paramyxoviruses, D.W. Kingsbury, wydawca. 1991, Plenum Press: Nowy Jork, strona 103-153.

Innym klasycznym Pneumovirusem jest wirus zapalenia płuc myszy (PVM), zazwyczaj znajdowany tylko u myszy laboratoryjnych. Jednak części chorób obserwowanych wśród ssaków wciąż nie można przypisać znanym patogenom.

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany metapneumowirus (MPV) ssaczy o ujemnej pojedynczej nici RNA, w którym sekwencja aminokwasowa białka N tego wyizolowanego ssaczego metapneumowirusa o ujemnej pojedynczej nici RNA jest w ponad 91% identyczna z sekwencją aminokwasową białka N o sekwencji o nr id. Sekw. 1 lub 91, przy czym identyczność oznaczona jest względem całej długości białka N.

Korzystnie ten metapneumowirus o ujemnej pojedynczej nici RNA koduje ponadto:

a) białko P wykazujące ponad 68% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka P o sekwencji o nr id. Sekw.: 8 lub 92; b) białko M wykazujące ponad 87% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M o sekwencji o nr id. Sekw.: 14 lub 93;

c) białko F wykazujące ponad 81% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka F o sekwencji o nr id. Sekw.: 21 lub 94;

d) białko M2-1 wykazujące ponad 84% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M2-1 o sekwencji o nr id. Sekw.: 47 lub 95;

e) białko M2-2 wykazujące ponad 56% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M2-2 o sekwencji o nr id. Sekw.: 55 lub 96;

f) białko L wykazujące ponad 90% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka L o sekwencji o nr id. Sekw.: 99 lub 100;

g) białko SH wykazujące ponad 29% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka SH o sekwencji o nr id. Sekw.: 63 lub 97; albo

h) białko G wykazujące ponad 29% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka G o sekwencji o nr id. Sekw.: 64 lub 98;

PL 213 926 B1 przy czym identyczność sekwencji oznaczona jest względem całej długości odpowiedniego białka.

Korzystnie ten metapneumowirus o ujemnej pojedynczej nici RNA koduje:

a) białko P wykazujące ponad 68% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka P o sekwencji o nr id. Sekw.: 8 lub 92; b) białko M wykazujące ponad 87% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M o sekwencji o nr id. Sekw.: 14 lub 93;

c) białko F wykazujące ponad 81% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka F o sekwencji o nr id. Sekw.: 21 lub 94;

d) białko M2-1 wykazujące ponad 84% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M2-1 o sekwencji o nr id. Sekw.: 47 lub 95;

e) białko M2-2 wykazujące ponad 56% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M2-2 o sekwencji o nr id. Sekw.: 55 lub 96;

f) białko L wykazujące ponad 90% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka L o sekwencji o nr id. Sekw.: 99 lub 100;

g) białko SH wykazujące ponad 29% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka SH o sekwencji o nr id. Sekw.: 63 lub 97; i

h) białko G wykazujące ponad 29% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka G o sekwencji o nr id. Sekw.: 64 lub 98; przy czym identyczność sekwencji oznaczona jest względem całej długości odpowiedniego białka.

Korzystnie genom tego wirusa zawiera sekwencję nukleotydową, która to sekwencja nukleotydowa jest w co najmniej 90% identyczna z sekwencją nukleotydową o nr id. Sekw. 36, 38 lub 40.

Korzystnie wirus ten nie ulega replikacji w gatunkach ptaków.

Korzystnie wirus ten jest wirusem atenuowanym.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja immunogenna, charakteryzująca się tym, że zawiera wirusa jak określono powyżej, w której zakaźnym wirusem rekombinowanym jest w szczególności wirus atenuowany.

Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany kwas nukleinowy, charakteryzujący się tym, że koduje wirusa jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany kwas nukleinowy, charakteryzujący się tym, że hybrydyzuje specyficznie w ostrych warunkach z kwasem nukleinowym jak określono powyżej, przy czym ostre warunki obejmują w szczególności hybrydyzację w buforze składającym się z 6x SSC, mM Tris-HCl (pH=7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA i 100 pg/ml denaturowanego DNA ze spermy łososia, przez 48 godzin w 65°C, płukanie w buforze składającym się z 2x

SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll, 0,02% BSA, przez 45 minut w 37°C i płukanie w buforze składającym się z 0,1x SSC przez 45 minut w 50°C.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wykrywania ssaczego metapneumowirusa w próbce, polegający na tym, że obejmuje kontaktowanie próbki z kwasem nukleinowym jak określono powyżej, przy czym ssaczymi MPV jest w szczególności ludzki MPV.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto wektor, charakteryzujący się tym, że zawiera kwas nukleinowy jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera kwas nukleinowy jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też wyizolowane białko, charakteryzujące się tym, że pochodzi z wirusa jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też przeciwciało, charakteryzujące się tym, że wiąże się specyficznie z wirusem jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wykrywania ssaczego metapneumowirusa w próbce, polegający na tym, że obejmuje kontaktowanie próbki z przeciwciałem jak określono powyżej.

Korzystniej kwas nukleinowy ma co najmniej 18, co najmniej, 20, co najmniej 23 lub co najmniej nukleotydów długości.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wirusologicznego diagnozowania infekcji MPV u ssaka, polegający na tym, że obejmuje wykrywanie w próbce od wymienionego ssaka obecności izolatu wirusa lub jego składnika poprzez kontaktowanie tej próbki z kwasem nukleinowym jak określono powyżej.

PL 213 926 B1

Przedmiotem wynalazku jest także sposób serologicznego diagnozowania infekcji MPV u ssaka, polegający na tym, że obejmuje wykrywanie w próbce od wymienionego ssaka obecności przeciwciała specyficznie skierowanego przeciwko MPV lub jego składnikowi poprzez poddawanie reakcji tej próbki z białkiem jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera (i) wyizolowanego metapneumowirusa ssaczego o ujemnej pojedynczej nici RNA jak określono powyżej oraz (ii) farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Korzystnie kompozycja ta zawiera wirusa, którego genom koduje ponadto sekwencje innych wirusów, albo genom tego wirusa może być pozbawiony części genomu wirusa do generowania replikacyjnie defektywnego wirusa i może zawierać mutacje, delecje lub insercje do generowania wirusów atentowanych.

Korzystniej innym wirusem jest wirus grypy rzekomej typu 3 (PI3).

Korzystnie ta kompozycja farmaceutyczna zawiera ponadto sekwencję nukleotydową RSV.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zestaw diagnostyczny do diagnozowania infekcji MPV, charakteryzujący się tym, że zawiera wirusa jak określono powyżej, kwas nukleinowy jak określono powyżej, białko lub jego fragment jak określono powyżej albo przeciwciało jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kompozycji farmaceutycznej jak określono powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki infekcji MPV lub choroby oddechowej.

W przypadku wirusa określonego powyżej, kompozycji immunogennej określonej powyżej, lub kompozycji farmaceutycznej określonej powyżej wirusem korzystnie jest izolat 00-1 ludzkiego MPV albo izolat 99-1 ludzkiego MPV.

Opisano tu wyizolowanego, zasadniczo ssaczego wirusa RNA o ujemnej, pojedynczej nici (MPV), należącego do podrodziny Pneumovirinae rodziny Paramyxoviridae, i możliwego do identyfikacji jako filogenetycznie odpowiadającego rodzajowi Metapneumovirus. Wymieniony wirus jest możliwy do identyfikacji jako filogenetycznie odpowiadający rodzajowi Metapneumovirus, przez określenie sekwencji kwasu nukleinowego wymienionego wirusa i testowanie go w testach filogenetycznych, w których np. generuje się drzewa maksymalnego prawdopodobieństwa przy użyciu metody „bootstrap” w 100 powtórzeniach i 3 zamianach, oraz ustalenie, że bliżej odpowiada on filogenetycznie izolatowi wirusowemu zdeponowanemu jako I-2614 w CNCM w Paryżu, niż zasadniczo ptasiemu izolatowi wirusowemu ptasiego penumowirusa (APV), znanemu także jako wirus nieżytu nosa i tchawicy indyków (TRTV), czynnikowi etiologicznemu nieżytu nosa i tchawicy ptaków. Dla wymienionych analiz filogenetycznych, najodpowiedniejsze jest uzyskanie sekwencji kwasu nukleinowego nie-MPV jako grupy zewnętrznej dla porównania, przy czym bardzo użyteczny izolat grupy zewnętrznej można uzyskać z ptasiego pneumowirusa serotypu C (APV-C), jak np. przedstawiono tu na fig. 5.

Chociaż analizy filogenetyczne stanowią wygodny sposób identyfikacji wirusa jako MPV, dostarcza się tu również kilka innych prawdopodobnie prostszych aczkolwiek nieco bardziej seryjnych metod identyfikowania wymienionego wirusa lub białek wirusowych albo kwasów nukleinowych z wymienionego wirusa. Praktycznie, MPV można zidentyfikować z użyciem procentów homologii wirusa, białek lub kwasów nukleinowych do zidentyfikowania, w porównaniu z izolatami, białkami wirusowymi lub kwasami nukleinowymi identyfikowanymi tu przez sekwencję lub depozyt. Ogólnie wiadomo, że gatunki wirusów, zwłaszcza gatunki wirusów RNA, często stanowią pseudogatunek, przy czym grupa takich wirusów wykazuje heterogenność wśród jego członków. Tak więc oczekuje się, że każdy izolat może mieć nieco inny procent pokrewieństwa z jednym z różnych izolatów jakie tu opisano.

Gdy chce się porównać ze zdeponowanym wirusem I-2614, niniejszy opis dostarcza wyizolowanego, zasadniczo ssaczego wirusa RNA o ujemnej, pojedynczej nici (MPV), należącego do podrodziny Pneumovirinae z rodziny Paramyxoviridae, i możliwego do identyfikacji jako odpowiadający filogenetycznie rodzajowi Metapneumovirus, przez określenie sekwencji aminokwasowej wymienionego wirusa i określenie, że wymieniona sekwencja aminokwasowa ma procent homologii aminokwasowej z izolatem wirusowym zdeponowanym jako I-2614 w CMCM w Paryżu, który jest zasadniczo wyższy niż udziały procentowe podane tu dla białka L, białka M, białka N, białka P lub białka F, w porównaniu z APV-C lub podobnie, wyizolowany, zasadniczo ssaczy wirus o ujemnej, pojedynczej nici RNA (MPV), należący do podrodziny Pneumowirinae z rodziny Paramyxowiridae, jest tu opisany jako możliwy do identyfikacji jako odpowiadający filogenetycznie rodzajowi Metapneumovirus, przez określenie sekwencji aminokwasowej wymienionego wirusa i określenie, że wymieniona sekwencja aminokwasowa ma procent identyczności aminokwasowej z izolatem wirusowym zdeponowanym jako 1-2614

PL 213 926 B1 w CMCM w Paryżu, który jest zasadniczo wyższy niż udziały procentowe podane tu dla białka L, białka M, białka N, białka P lub białka F, jak identyfikowano tu poniżej, w porównaniu z APV-C.

Znowu praktycznie można uznać MPV jako należący do jednej z dwóch grup serologicznych MPV, jak tu identyfikowano, jeśli izolaty lub białka wirusowe lub kwasy nukleinowe z izolatów, jakie trzeba zidentyfikować, mają procenty homologii, które wchodzą w zakres procentów homologii identyfikowanych tu dla obu oddzielnych grup, biorąc izolaty 00-1 lub 99-1 jako odpowiednie izolaty do porównywania. Jednak, gdy procenty homologii są mniejsze lub istnieje większa potrzeba odróżnienia izolatów wirusowych od np. APV-C, bardziej zalecane jest stosowanie analiz filogenetycznych jakie tu zidentyfikowano.

Ponownie, należy pamiętać, że wymienione procenty mogą się nieco różnić, gdy do określania procentu homologii wybiera się inne izolaty.

Opisując tego MPV, wynalazek dostarcza środki i sposoby diagnostyczne oraz środki i sposoby terapeutyczne, które można wykorzystać przy diagnozie i/lub leczeniu choroby, w szczególności choroby układu oddechowego, zwłaszcza ssaków, szczególniej ludzi. Jednakże, z powodu pokrewieństwa genetycznego, aczkolwiek odległego, zasadniczo ssaczego MPV z zasadniczo ptasim APV, w szczególności APV-C, wynalazek dostarcza także środki i sposoby, które można wykorzystać przy diagnozie i leczeniu choroby ptasiej. W wirusologii, najbardziej zalecane jest aby diagnozę i/lub leczenie konkretnej infekcji wirusowej przeprowadzać z odczynnikami, które są najbardziej swoiste dla wymienionego konkretnego wirusa powodującego wymienioną infekcję. W tym przypadku, zalecane jest aby wymienioną diagnozę i/lub leczenie infekcji MPV przeprowadzać z odczynnikami, które są najbardziej swoiste dla MPV. W żaden sposób nie wyklucza to jednak możliwości stosowania zamiennie odczynników mniej swoistych, lecz wystarczająco reaktywnych krzyżowo, np. ponieważ są łatwiej dostępne i wystarczająco spełniają swe zadanie. Opisuje się tu np. ustalenie diagnozy wirusologicznej i/lub serologicznej infekcji MPV u ssaków za pomocą odczynników pochodzących od APV, w szczególności odczynników pochodzących od APV-C, w szczegółowym opisie, jest tu np. pokazane, że można uzyskać wystarczająco godną zaufania diagnozę serologiczną infekcji MPV u ssaków z użyciem ELISA konkretnie zaprojektowanej do wykrywania przeciwciał APV u ptaków. Szczególnie użytecznym testem do tego celu jest test ELISA opracowany do wykrywania przeciwciał APV (np. w surowicy lub żółtku jaja), z których jedna z wersji dostępnych na rynku jest znana jako APV-Ab SVANOVIR®, produkowana jest przez SVANOMA Biotech AB, Uppsal Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala, Szwecja. Sytuacja odwrotna jest także brana pod uwagę, jest tu np. opisane przeprowadzenie diagnozy wirusologicznej i/lub serologicznej infekcji APV u ssaków z użyciem odczynników pochodzących od MPV, w szczegółowym opisie jest tu np. pokazane, że można uzyskać wystarczająco godną zaufania diagnozę serologiczną infekcji APV u ptaków z użyciem ELISA opracowanej do wykrywania przeciwciał MPV. Biorąc pod uwagę, że antygeny i przeciwciała oddziaływują jak zamek i klucz, wykrywanie różnych antygenów można uzyskać przez wybór odpowiedniego przeciwciała mającego wystarczającą reaktywność krzyżową. Oczywiście, polegając na takiej reaktywności krzyżowej, najlepiej wybrać odczynniki (takie jak antygeny lub przeciwciała) kierując się homologiami aminokwasowymi, jakie istnieją między różnymi (gliko)proteinami różnych wirusów, przez co odczynniki odnoszące się do większości homologicznych białek będą najbardziej użyteczne przy wykorzystywaniu w testach polegających na reaktywności krzyżowej.

Przy wykrywaniu kwasu nukleinowego jest nawet prościej, zamiast projektowania starterów lub sond na bazie heterologicznych sekwencji kwasu nukleinowego różnych wirusów, które wykrywają zatem różnice między zasadniczo ssaczymi albo ptasimi Metapneumowirusami, wystarczy zaprojektować lub wybrać startery albo sondy na podstawie tych odcinków sekwencji kwasu nukleinowego swoistych dla wirusa, które wykazują wysoką homologię. Generalnie, dla sekwencji kwasu nukleinowego, procent homologii wynoszący 90% lub wyższy gwarantuje wystarczającą reaktywność krzyżową, aby polegać na testach diagnostycznych wykorzystujących ostre warunki hybrydyzacji.

Wynalazek dostarcza np. sposób wirusologicznej diagnozy infekcji MPV zwierzęcia, w szczególności ssaka, szczególniej człowieka, obejmujący określanie w próbce od wymienionego zwierzęcia, obecności izolatu wirusowego lub jego składnika, przez poddawanie reakcji wymienionej próbki z kwasem nukleinowym swoistym wobec MPV albo przeciwciałem według wynalazku, oraz sposób serologicznego diagnozowania infekcji MPV u ssaka, obejmujący określanie w próbce od wymienionego ssaka, obecności przeciwciała swoiście skierowanego przeciwko MPV albo jego składnika, przez poddawanie reakcji wymienionej próbki z cząsteczką białkową swoistą wobec MPV lub jej fragmentem, albo antygenem według wynalazku. Wynalazek dostarcza także zestaw diagnostyczny do

PL 213 926 B1 diagnozowania infekcji MPV, zawierający MPV, kwas nukleinowy swoisty wobec MPV, cząsteczkę białkową lub jej fragment, antygen i/lub przeciwciało według wynalazku oraz ewentualnie środki do wykrywania wymienionego MPV, kwasu nukleinowego swoistego wobec MPV, cząsteczki białkowej lub jej fragmentu, antygenu i/lub przeciwciała, przy czym wymienione środki obejmują np. grupę, którą można wzbudzić, taką jak fluorofor lub enzymatyczny system wykrywania stosowany w dziedzinie (przykłady odpowiedniego formatu zestawu diagnostycznego obejmują IF, ELISA, testy zobojętniania, test RT-PCR). Aby określić, czy jeszcze niezidentyfikowany składnik wirusowy lub jego syntetyczny analog, taki jak kwas nukleinowy, cząsteczka białkowa lub jej fragment, można zidentyfikować jako swoisty dla MPV, wystarczy zanalizować sekwencję kwasu nukleinowego albo aminokwasową wymienionego składnika, np. dla odcinka wymienionego kwasu nukleinowego lub łańcucha aminokwasowego, zwłaszcza wynoszącego co najmniej 10, w szczególności co najmniej 25, w szczególności co najmniej 40 nukleotydów albo aminokwasów (odpowiednio), przez porównanie homologii sekwencji ze znanymi sekwencjami MPV oraz ze znanymi sekwencjami niebędącymi MPV (dogodnie wykorzystuje się APV-C), przy użyciu np. analiz filogenetycznych jakie tu podano. W zależności od stopnia pokrewieństwa z wymienionymi sekwencjami MPV lub niebędącymi MPV, można zidentyfikować składnik lub analog syntetyczny może być zidentyfikowany.

Wynalazek dostarcza także sposobu wirusologicznego diagnozowania infekcji MPV u ssaka, obejmujący określanie w próbce od wymienionego ssaka obecności izolatu wirusowego lub jego składnika, przez reakcję wymienionej próbki z reaktywnym krzyżowo kwasem nukleinowym pochodzącym od APV (korzystnie serotypu C) albo reaktywnego krzyżowo przeciwciała reagującego z wymienionym APV, oraz sposób serologicznego diagnozowania infekcji MPV u ssaka, obejmujący określanie w próbce od wymienionego ssaka obecności reaktywnego krzyżowo przeciwciała, które jest także skierowane przeciwko APV lub jego składnikowi, przez reakcję wymienionej próbki z cząsteczką białkową lub jej fragmentem albo antygenem pochodzącym od APV. Ponadto, opisano tu również zastosowanie zestawu diagnostycznego, początkowo zaprojektowanego do wykrywania AVP lub AVP-przeciwciało do diagnozowania infekcji MPV, w szczególności do wykrywania wymienionej infekcji MPV u ludzi.

Opisano tu także sposób wirusologicznego diagnozowania infekcji APV u ptaka, obejmujący określanie w próbce od wymienionego ptaka obecności izolatu wirusowego lub jego składnika, przez reakcję wymienionej próbki z reaktywnym krzyżowo kwasem nukleinowym pochodzącym od MPV albo reaktywnym krzyżowo przeciwciałem reagującym z wymienionym MPV, oraz sposób serologicznego diagnozowania infekcji APV u ptaka, obejmujący określanie w próbce od wymienionego ptaka obecności reaktywnego krzyżowo przeciwciała, które jest także skierowane przeciwko MPV lub jego składnikowi, przez reakcję wymienionej próbki z cząsteczką białkową lub jej fragmentem albo antygenem pochodzącym od MPV. Ponadto, opisano tu także zastosowanie zestawu diagnostycznego, początkowo zaprojektowanego do wykrywania MPV lub MPV-przeciwciało, do diagnozowania infekcji APV, w szczególności do wykrywania wymienionej infekcji APV u drobiu, takiego jak kura, kaczka lub indyk.

Jak powiedziano, w przypadku leczenia można podobnie wykorzystać stwierdzoną reaktywność krzyżową, szczególnie gdy występujące okoliczności czynią stosowanie podejścia bardziej homologicznego trudniejszym. Szczepienia, które nie mogą czekać, takie jak szczepienia ratunkowe przeciwko infekcjom MPV, można przeprowadzić np. z użyciem preparatów szczepionki otrzymanych z izolatów APV (korzystnie typu C), gdy bardziej homologiczna szczepionka MPV nie jest dostępna, i na odwrót, można brać pod uwagę szczepienia przeciwko infekcjom APV z użyciem preparatów szczepionki pochodzących z MPV. Również, techniki genetyki odwrotnej umożliwiają tworzenie chimerowych konstrukcji wirusowych APV-MPV, które są użyteczne jako szczepionka, będąc wystarczająco odmiennym w stosunku do izolatów polowych każdego z odpowiednich szczepów, które mają być atenuowane do pożądanego stopnia. Podobne techniki genetyki odwrotnej umożliwiają także tworzenie chimerowych konstrukcji paramyksowirus-metapneumowirus, takich jak RSV-MPV albo konstrukcji PI3-MPV do zastosowania w preparatach szczepionek. Takie konstrukcje są szczególnie użyteczne jako szczepionka skojarzona do zwalczania chorób układu oddechowego.

Opisano tu zatem nowy czynnik etiologiczny, wyizolowany, zasadniczo ssaczy wirus RNA o ujemnej, pojedynczej nici (zwany tu także MPV), należący do podrodziny Pneumovirinae rodziny Paramyxoviridae, lecz nie identyfikowalny jako klasyczny pneumowirus, i należący do rodzaju Metapneumovirus, oraz składniki swoiste wobec MPV lub ich analogi syntetyczne. Wirusy ssacze przypominające metapneumowirusy, czyli metapneumowirusy możliwe do izolacji od ssaków, które zasadniczo funkcjonują jako naturalny gospodarz dla wymienionego wirusa albo wywołują chorobę u wymiePL 213 926 B1 nionego ssaka, nie zostały dotąd odkryte. Metapneumowirusy, generalnie uważane za ograniczające się zasadniczo do drobiu jako naturalnego gospodarza albo czynnika etiologicznego choroby, są także znane jako pneumowirusy ptasie. Ostatnio opisano izolat APV kaczki (FR 2 801 607), dodatkowo wykazując, że infekcje APV są zasadniczo ograniczone do ptaków jako naturalnych gospodarzy.

Wynalazek dostarcza wyizolowanego pneumowirus ssaczego (zwanego tu także MPV), który obejmuje porządek genowy i sekwencję aminokwasową inne niż w rodzaju Pneumovirus, i który jest ściśle spokrewniony i, biorąc pod uwagę jego pokrewieństwo filogenetyczne, prawdopodobnie należy do rodzaju Metapneumovirus w podrodzinie Pneumovirinae rodziny Paramyxoviridae. Chociaż do dnia dzisiejszego metapneumowirusy zostały wyizolowane jedynie od ptaków, okazuje się, że można zidentyfikować pokrewne, aczkolwiek materialnie różne, wirusy u innych gatunków zwierząt, takich jak ssaki. Wykazano tu powtarzaną izolację MPV od ludzi, podczas gdy nie istnieją tego typu doniesienia dla APV. Ponadto, inaczej niż APV, MPV zasadniczo nie replikuje albo tylko w niewielkim stopniu replikuje u kurcząt i indyków, natomiast łatwo u makaków jawajskich. Nie znaleziono doniesień dotyczących replikacji APV u ssaków. Poza tym, podczas gdy swoiste surowice odpornościowe wzbudzone przeciwko MPV neutralizują MPV, surowice odpornościowe wzbudzone przeciwko APV A, B lub C nie neutralizują MPV w tym samym stopniu, i ten brak pełnej reaktywności krzyżowej stanowi następny dowód, że MPV jest innym metapneumowirusem. Ponadto, choć APV i MPV mają podobny porządek genowy, białka G i SH MPV różnią się w dużym stopniu od tych znanych z APV pod tym względem, że nie wykazują żadnej istotnej homologii sekwencji na poziomie zarówno aminokwasowym jak i kwasu nukleinowego. Można dogodnie opracować testy diagnostyczne do rozróżnienia między izolatami APV i MPV albo przeciwciałami skierowanymi przeciwko tym różnym wirusom, na podstawie jednego lub obu tych białek (przykładami są IF, ELISA, test zobojętniania, test RT-PCR). Jednakże do rozróżnienia między APV i MPV można wykorzystać także informacje o sekwencji i/lub antygenie, uzyskane od bardziej spokrewnionych białek N, P, M, F i L MPV oraz analizy homologii sekwencji z odpowiednimi białkami APV. Przykładowo, filogenetyczne analizy informacji o sekwencji uzyskane od MPV ujawniły, że APV i MPV są dwoma różnymi wirusami. W szczególności, drzewa filogenetyczne pokazują, że APV i MPV stanowią dwa inne rody wirusa. Wykazaliśmy także, że MPV krąży w populacji ludzkiej od co najmniej 50 lat, zatem transmisje wewnątrzgatunkowe miały miejsce prawdopodobnie co najmniej 50 lat temu i nie występują codziennie. Ponieważ CPE MPV był rzeczywiście nie do odróżnienia od tego, który wywoływał hRSV lub hPIV-1 w hodowlach komórkowych tMK lub innych, MPV mógł uchodzić niezauważony aż do dzisiaj. Dogodnie stosuje się tMK (trzeciorzędowe małpie komórki nerki, czyli komórki MK w trzecim pasażu w hodowli komórkowej), z powodu ich niższych kosztów w porównaniu z pierwszorzędowymi czy drugorzędowymi hodowlami. CPE, jak również niektóre klasyczne Paramyxoviridae, charakteryzuje tworzenie syncytiów, po którym komórki wykazywały gwałtowne wewnętrzne rozrywanie, po którym następowało odłączenie komórek od monowarstwy. Komórki zazwyczaj (lecz nie zawsze) wykazywały CPE po trzech pasażach wirusa z materiału oryginalnego, w dniu 10 do 14 po szczepieniu (inokulacji), nieco później niż CPE wywoływany przez inne wirusy, takie jak hRSV czy hPIV-1.

Klasycznie, jako czynniki wyniszczające chorób, paramyksowirusy odpowiadają za śmierć każdego roku wielu zwierząt i ludzi na świecie. Paramyxoviridae tworzą rodzinę w rzędzie Mononegavirales (wirusy RNA o ujemnej, pojedynczej nici), składającą się z podrodzin Paramyxovirinae i Pneumovirinae. Ta ostatnia podrodzina jest obecnie taksonomicznie podzielona na rodzaje Pneumovirus i Me₁ tapneumovirus¹. Ludzki wirus syncytialny układu oddechowego (hRSV), typ gatunku rodzaju Pneumovirus, jest pojedynczym, najważniejszym czynnikiem wywołującym infekcje dolnych dróg oddecho₂ wych niemowląt i małych dzieci na świecie². Inni członkowie rodzaju Pneumovirus to wirusy syncytialne dróg oddechowych bydła i owiec oraz wirus zapalenia płuc myszy (ang. PMV).

Ptasi pneumovirus (APV) znany jako wirus nieżytu nosa i tchawicy indyków (ang. Turkey rhinotracheitis, TRTV), czynnik etiologiczny ptasiego nieżytu nosa i tchawicy, infekcji górnych dróg oddechowych indyków, jest jedynym członkiem ostatnio wydzielonego rodzaju Metapneumovirus, który, jak powiedziano, aż do dzisiaj nie był kojarzony z infekcjami lub co więcej, z chorobą ssaków. Podgrupy serologiczne APV można zróżnicować na podstawie sekwencji nukleotydowej lub aminokwasowej glikoproteiny G oraz testów zobojętniania przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, które rozpoznają także glikoproteinę G. W podgrupach A, B i D białko G wykazuje 98,5 do 99,7% identyczności sekwencji, podczas gdy między podgrupami obserwuje się tylko 31,2-38% identyczności. Patrz np. Collins, M.S., Gough, R.E. i Alexander, D.J., Antigenic differentiation of avian pneumoviruses isolates using polyclonal antisera and mouse monoclonal antibodies. Avian Pathology, 1993. 22: strona 4698

PL 213 926 B1

479; Cook, J.K.A., Jones, B.V., ellis, M.M, Antigenic differentiation of strains of turkey rhinotracheitis virus using monoclonal antibodies. Avian Pathology, 1993.22: strona 257-273; Bayon-Auboyer, M.H., i inni, Nucleotide sequences of the F, L and G protein genes of two non-A/non-B avian pneumoviruses (APV) reveal a novel APV subgroup. J. Gen. Virol, 2000. 81(Pt11): strona 2723-33; Seal, B.S., Matrix protein gene nucleotide and predicted amino acid sequence demonstrate that the first US avian pneumovirus isolate is distinct from European strains. Virus Res., 1998. 58(1-2): strona 45-52; BayonAuboyer, M.H., i inni, Comparison of F-, G- and N-based RT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitis virus. Arch. Virol., 1999. 144(6): strona 1091-109; Juhasz, K. i A.J.Easton, Extensive sequence variation in the attachment (G) protein gene of avian pneumovirus: evidence for two distinct subgroups. J. Gen. Virol, 1994. 75(Pt 11): strona 2873-80.

Dodatkowy serotyp APV jest podany w WO00/20600, który opisuje izolat Colorado APV i porównuje go ze znanymi szczepami APV lub TRTV za pomocą testów neutralizacji surowicy in vitro. Najpierw izolat Colorado testowano przeciwko monoswoistym, poliklonalnym surowicom odpornościowym wobec rozpoznanych izolatów TRT. Izolat Colorado nie był zneutralizowany przez monoswoiste surowice odpornościowe wobec żadnego szczepu TRT. Był on jednak zneutralizowany przez hiperimmunologiczną surowicę odpornościową wzbudzoną przeciwko podgrupie szczepu A. Ta surowica odpornościowa zneutralizowała homologicznego wirusa do miana wynoszącego 1:400, a izolat Colorado do miana wynoszącego 1:80. Stosując powyższą metodę izolat Colorado testowano potem przeciwko przeciwciałom monoklonalnym TRT. W każdym przypadku, wzajemne miano neutralizacji wynosiło <10. Monoswoistą surowicę odpornościową wzbudzoną wobec izolatu Colorado testowano także przeciwko szczepom TRT obu podgrup. Żaden z testowanych szczepów TRT nie został zneutralizowany przez surowicę odpornościową wobec izolatu Colorado.

Szczep Colorado APV nie zabezpiecza kur SPF przed prowokacją podgrupą A albo podgrupą B szczepu wirusa TRT. Wyniki te sugerują, że izolat Colorado może być pierwszym przykładem dodatkowego serotypu ptasiego pneumowirusa, co sugerował także Bayon-Auboyer i inni (J.Gen.Vir. 81: 2723- 2733 (2000).

W zalecanej postaci realizacji opisano tu wyizolowanego MPV taksonomicznie odpowiadającgo (dotąd nieznanemu ssaczemu) metapneumowirusowi obejmującemu porządek genowy inny niż u pneumowirusów podrodziny Pneumovirinae rodziny Paramyxoviridae. Klasyfikacja tych dwóch rodzajów opiera się przede wszystkim na ich układzie genowym; metapneumowirusy generalnie nie posiadają białek niestrukturalnych, takich jak NS1 albo NS2 (patrz także Randhawa i inni, J.Vir. 71:9849-9854 (1997), a porządek genowy jest inny niż u pneumowirusów (RSV:3'-NS1-NS2-N-P-MSH-G-F-M2-L-5', APV:3'- N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')^4,5,6. MPV dostarczony przez wynalazek albo izolat wirusowy taksonomicznie mu odpowiadający, został ujawniony w analizie EM dzięki cząstkom podobnym do paramyksowirusa. Zgodnie z klasyfikacją, MPV lub izolaty wirusowe filogenetycznie mu odpowiadające lub odpowiadające taksonomicznie, są wrażliwe na traktowanie chloroformem; hoduje się je optymalnie na komórkach tMK lub komórkach funkcjonalnie im równoważnym, i są zasadniczo zależne od trypsyny w większości hodowli komórkowych. Ponadto, typowy CPE i brak aktywności hemaglutynującej z większością klasycznie stosowanych krwinek czerwonych, sugerował, że wirus jaki tu opisano, aczkolwiek tylko odlegle, jest spokrewniony z klasycznymi pneumowirusami, takimi jak RSV.

Podczas gdy większość paramyksowirusów wykazuje aktywność hemaglutynującą, to większość 13 pneumowirusów nie wykazuje¹³. MPV według wynalazku zawiera także drugą nakładającą się ORF (M2-2) we fragmencie kwasu nukleinowego kodującym białko M2, tak jak generalnie większość pneumowirusów, tak jak np. pokazano także u Ahmadian i innych J. Gen. Vir. 80:2011-2016 (1999).

Aby znaleźć dalsze izolaty wirusowe jakie dostarczono w wynalazku, wystarczy przetestować próbkę, ewentualnie otrzymaną od chorego zwierzęcia lub człowieka, pod względem obecności wirusa podrodziny Pneumovirinae i przetestować tak otrzymanego wirusa pod względem obecności genów kodujących (funkcjonalne) NS1 lub NS2 albo zasadniczo wykazać porządek genowy, który jest inny niż pneumowirusów, takich jak RSV już omówiony powyżej. Ponadto, izolat wirusowy odpowiadający filogenetycznie, a więc taksonomicznie odpowiadający MPV, można znaleźć przez doświadczenia hybrydyzacji krzyżowej z użyciem kwasu nukleinowego od opisanego tutaj izolatu MPV, albo klasyczne doświadczenia serologii krzyżowej z użyciem przeciwciał monoklonalnych otrzymanych od izolatu MPV.

Nowo wyizolowane wirusy odpowiadają filogenetycznie, a więc odpowiadają taksonomicznie MPV przy porównywaniu porządku genowego i/lub sekwencji aminokwasowej wystarczająco podobnej do naszego prototypowego izolatu (izolatów) MPV, albo odpowiadają im strukturalnie, i wykazują bliPL 213 926 B1 skie pokrewieństwo z rodzajem Metapneumovirus w podrodzinie Pneumovirinae. Najwyższa homologia sekwencji aminokwasowej oraz określenie podobieństwa strukturalnego na poszczególnym poziomie białkowym, między MPV i każdym z innych znanych wirusów tej samej rodziny do dzisiaj (APV podtyp C) ma miejsce dla macierzy 87%, nukleoproteiny 88%, fosfoproteiny 68%, białka fuzyjnego 81% i dla części białka polimerazy 56-64%, jak można wywnioskować porównując sekwencje podane w fig. 6 z sekwencjami innych wirusów, w szczególności APV-C. Poszczególne białka lub całe izolaty wirusowe o odpowiednio wyższej homologii do tych wymienionych wartości maksymalnych uważa się za odpowiadające filogenetycznie, a więc odpowiadające taksonomicznie MPV, i obejmują sekwencję kwasu nukleinowego strukturalnie odpowiadającą sekwencji jaką ukazano w fig. 6. Wraz z tym, wynalazek dostarcza wirusa filogenetycznie odpowiadającego wirusowi zdeponowanemu.

Należy zauważyć, że podobnie jak u innych wirusów, występuje pewien stopień zmienności między różnymi wyizolowanymi, zasadniczo ssaczymi izolatami wirusów RNA o ujemnej, pojedynczej nici, jakie tu dostarczono. W drzewie filogenetycznym zidentyfikowaliśmy co najmniej dwa ugrupowania genetyczne izolatów wirusowych na podstawie porównawczych analiz sekwencji części genów L, M, N i F. Na podstawie różnic nukleotydowych i aminokwasowych w sekwencjach nukleotydowych lub aminokwasowych wirusów (sekwencjach wirusowych), oraz przez analogię do innych pneumowirusów, takich jak RSV, te genotypy MPV reprezentują podtypy MPV. W każdym z ugrupowań genetycznych izolatów MPV, stwierdzono, że procent identyczności na poziomie nukleotydów wynosił 94-100 dla L, 91-100 dla M, 90-100 dla N i 93-100 dla F, a na poziomie aminokwasów, okazało się, że procent identyczności wynosił 91-100 dla L, 98-100 dla M, 96-100 dla N i 98-100 dla F. Dodatkowe porównanie można znaleźć na fig. 18 do 28. Minimalny procent identyczności na poziomie nukleotydowym dla całej grupy wyizolowanego, zasadniczo ssaczego wirusa RNA o ujemnej, pojedynczej nici jakiego tu dostarczono (izolaty MPV), zidentyfikowany jak dotąd, wynosił 81 dla L i M, 83 dla N i 82 dla F. Na poziomie aminokwasowym, procent ten wynosił 91 dla L i N, 94 dla M i 95 dla F. Sekwencja wirusowa izolatu MPV lub wyizolowanego genu F MPV jaki tu dostarczono, wykazuje np. mniej niż 81% identyczności sekwencji nukleotydowej lub mniej niż 82% identyczności sekwencji aminokwasowej z odpowiadającą sekwencją nukleotydową lub aminokwasową genu fuzyjnego APV-C (F) jak np. dostarczono u Seal i innych, Vir. Res. 66:139147 (2000).

Również, sekwencja wirusowa izolatu MPV lub wyizolowanego genu L MPV jaki tu dostarczono wykazuje np. mniej niż 61% identyczności sekwencji nukleotydowej lub mniej niż 63% identyczności sekwencji aminokwasowej z odpowiadającą sekwencją nukleotydową lub aminokwasową genu polimerazy APV-A, jaki np. dostarczono u Randhawa i innych J. Gen. Vir. 77:3047-3051 (1996).

Rozbieżność sekwencji szczepów MPV na świecie może być nieco wyższa, analogicznie jak w przypadku innych wirusów. W konsekwencji, identyfikuje się dwa potencjalne ugrupowania genetyczne przez analizy częściowych sekwencji nukleotydowych w ORF N, M, F i L 9 izolatów wirusowych. W ugrupowaniu obserwowano 90-100% identyczności nukleotydowej, a 81-88% identyczności obserwowano między ugrupowaniami. Informacja o sekwencji otrzymana dla większej liczby izolatów wirusowych potwierdziła istnienie dwóch genotypów. Izolat wirusowy ned/00/01 jako prototyp ugrupowania A oraz izolat wirusowy ned/99/01 jako prototyp ugrupowania B wykorzystano w testach zobojętniania krzyżowego aby przetestować, czy genotypy są spokrewnione z różnymi serotypami lub podgrupami. Z tych danych wnioskujemy, że zasadniczo ssacze izolaty wirusowe wykazujące procent homologii aminokwasowej wyższy niż 64 dla L, 87 dla M, 88 dla N, 68 dla P, 81 dla F, 84 dla M2-1 lub 58 dla M2-2 w stosunku do izolatu I-2614 można klasyfikaować jako izolowany, zasadniczo ssaczy wirus RNA o ujemnej, pojedynczej nici jaki tu dostarczono. W szczególności te izolaty wirusowe, które ogólnie posiadają minimalny procent identyczności na poziomie sekwencji nukleotydowej z prototypowym izolatem MPV jaki tu dostarczono, wynoszący 81 dla M, 83 dla N i/lub 82 dla F są członkami grupy izolatów MPV jaki tu dostarczono. Na poziomie aminokwasowym, te udziały procentowe wynoszą 91 dla L i N, 94 dla M i/lub 95 dla F. Jeśli procent homologii sekwencji aminokwasowej dla danego izolatu wirusowego jest wyższy niż 90 dla L i N, 93 dla M albo 94 dla F, izolat wirusowy jest podobny do grupy izolatów MPV przedstawionych w fig. 5. Jeśli procent homologii sekwencji aminokwasowej dla danego izolatu wirusowego jest wyższy niż 94 dla L, 95 dla N lub 97 dla M i F, izolat wirusowy można identyfikować jako należący do jednego z ugrupowań genotypowych przedstawionych na fig. 5. Należy zauważyć, że te procenty homologii, przez jakie definiuje się ugrupowania genetyczne, są podobne do stopnia homologii występującego wśród ugrupowań genetycznych w odpowiednich genach RSV.

PL 213 926 B1

W skrócie, opisano tu wyizolowanego, zasadniczo ssaczego wirusa RNA o ujemnej, pojedynczej nici (MPV) należącego do podrodziny Pneumovirinae rodziny Paramyxoviridae i możliwego do identyfikacji jako filogenetycznie odpowiadający rodzajowi Metapneumovirus, przez określenie sekwencji kwasu nukleinowego odpowiedniego fragmentu genomu wymienionego wirusa i testowanie go w analizach drzewa filogenetycznego, gdzie generuje się drzewa maksymalnego prawdopodobieństwa przy użyciu metody „bootstrap” w 100 powtórzeniach i 3 zamianach, i ustalenie, że odpowiada on ściślej filogenetycznie izolatowi wirusowemu zdeponowanemu jako I-2614 w CNCM w Paryżu, niż odpowiada on izolatowi wirusowemu ptasiego pneumowirusa (APV) znanego także jako wirus nieżytu nosa i tchawicy indyków (TRTV), czynnikowi etiologicznemu nieżytu nosa i tchawicy ptaków.

Odpowiednimi fragmentami kwasu nukleinowego genomu, z których każdy jest użyteczny w takich analizach drzewa filogenetycznego, są np. jakiekolwiek fragmenty RAP-PCR 1 do 10 jakie tu ujawniono w opisie szczegółowym, prowadząc do różnych analiz drzewa filogenetycznego, jakie tu ujawniono, na fig. 4 lub 5. Analizy drzewa filogenetycznego genów nukleoproteiny (N), fosfoproteiny (P), białka macierzy (M) oraz białka fuzyjnego (F) MPV ujawniły najwyższy stopień homologii sekwencji z serotypem C APV, pneumowirusem ptasim, znajdowanym przede wszystkim u ptaków w Stanach Zjednoczonych.

Opisano tu również wyizolowanego, zasadniczo ssaczego wirusa RNA o ujemnej, pojedynczej nici (MPV) należącego do podrodziny Pneumovirinae rodziny Paramyxoviridae i możliwego do identyfikacji jako filogenetycznie odpowiadający rodzajowi Metapneumovirus, przez określenie sekwencji kwasu nukleinowego odpowiedniego fragmentu genomu wymienionego wirusa i testowanie go w analizach drzewa filogenetycznego, gdzie generuje się drzewa maksymalnego prawdopodobieństwa przy użyciu metody „bootstrap” w 100 powtórzeniach i 3 zamianach, i ustalenie, że odpowiada on ściślej filogenetycznie izolatowi wirusowemu zdeponowanemu jako I-2614 w CNCM w Paryżu, niż odpowiada on izolatowi wirusowemu ptasiego pneumowirusa (APV) znanemu także jako wirus nieżytu nosa i tchawicy indyków (TRTV), czynnikowi etiologicznemu nieżytu nosa i tchawicy ptaków, przy czym wymieniony odpowiedni fragment obejmuje otwartą ramkę odczytu kodującą białko wirusowe wymienionego wirusa.

Odpowiednia otwarta ramka odczytu (ORF) obejmuje ORF kodującą białko N. Jeśli stwierdzona jest całkowita identyczność aminokwasowa wynosząca co najmniej 91%, zwłaszcza co najmniej 95% analizowanego białka N z białkiem N izolatu I-2614, analizowany izolat wirusowy obejmuje korzystny izolat MPV według wynalazku. Jak pokazano, pierwszy gen w mapie genomowej MPV koduje białko o 394 aminokwasach (aa) i wykazuje rozległą homologię z białkiem N innych pneumowirusów. Długość ORF N jest identyczna jak długość ORF N APV-C (tablica 5) i jest mniejsza niż u innych paramyksowirusów (Barr i inni, 1991). Analiza sekwencji aminokwasowej ujawniła najwyższą homologię z APV-C (88%) i tylko 7-11% z innymi paramyksowirusami (tablica 6).

Barr i inni (1991) zidentyfikowali 3 regiony podobieństwa między wirusami należącymi do rzędu Mononegavirales: A, B i C (fig. 8). Chociaż podobieństwa są najwyższe w rodzinie wirusowej, regiony są wysoko zakonserwowane między rodzinami wirusów. We wszystkich trzech regionach MPV wykazano 97% identyczności sekwencji aa z APV-C, 89% z APV-B, 92 z APV-A i 66-73% z RSV i PVM. Region między resztami aa 160 i 340 jak się okazuje jest wysoce zakonserwowany wśród metapneumowirusów, oraz w nieco mniejszym stopniu Pneumovirinae (Miyahara i inni, 1992; Li i inni, 1996; Barr i inni, 1991). Zgodne z tym, że MPV jest metapneumowirusem jest to, że ten poszczególny region wykazuje 99% podobieństwa z APV-C.

Inna odpowiednia otwarta ramka odczytu (ORF) użyteczna w analizach filogenetycznych, obejmuje ORF kodującą białko P. Jeśli stwierdzona jest całkowita identyczność aminokwasowa wynosząca co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 85% analizowanego białka P z białkiem P izolatu I-2614, analizowany izolat wirusowy obejmuje korzystny izolat MPV według wynalazku. Druga ORF w mapie genomowej koduje białko o 294 aa, które dzieli 68% homologii sekwencji z białkiem P APV-C i tylko 22-26% z białkiem P RSV (tablica 6). Gen P MPV zawiera jedną zasadniczą ORF i pod tym względem jest podobny do P wielu innych paramyksowirusów (przegląd Lamb i Kolakofsky, 1996; Sedlmeier i inni, 1998). W przeciwieństwie do APV A i B oraz PVM, a podobnie jak RSV i APV-C, ORF P MPV nie posiada reszt cysteinowych. Ling (1995) sugerował, że region o wysokim podobieństwie między wszystkimi pneumowirusami (aa 185-241) odgrywa rolę albo w procesie syntezy RNA albo w utrzymywaniu integralności strukturalnej kompleksu nukleokapsydu. Ten region o wysokim podobieństwie występuje także w MPV (fig. 9), zwłaszcza jeśli bierze się pod uwagę substytucje konserwatywne,

PL 213 926 B1 wykazując 100% podobieństwa z APV-C, 93% z APV-A i B, oraz około 81% z RSV. Koniec C białka P MPV jest bogaty w reszty glutaminianowe jak opisano dla APV (Ling i inni, 1995).

Inna odpowiednia otwarta ramka odczytu (ORF) użyteczna w analizach filogenetycznych, obejmuje ORF kodującą białko M. Jeśli stwierdza się całkowitą identyczność aminokwasową wynoszącą co najmniej 94%, zwłaszcza co najmniej 97% analizowanego białka M z białkiem M izolatu I-2614, analizowany izolat wirusowy obejmuje korzystny izolat MPV według wynalazku. Trzecia ORF genomu MPV koduje białko o 254 aa, co przypomina ORF M innych pneumowirusów. ORF M MPV ma dokładnie taką samą wielkość jak ORF M innych metapneumowirusów (tablica 5) i wykazuje wysoką homologię sekwencji aa z białkami macierzy APV (76-87%), niższa homologię z RSV i PVM (37-38%) i 10% lub mniejszą homologię z innymi paramyksowirusami (tablica 6). Easton (1997) porównywał sekwencje białek macierzy wszystkich paramyksowirusów i znalazł zakonserwowany heksapeptyd przy reszcie 14 do 19, który jest także zakonserwowany u MPV (fig. 10). Dla RSV, PVM i APV zidentyfikowano małe drugorzędowe ORF w środku albo nakładające się na główną ORF M (52 aa i 51 aa w bRSV, 75 aa w RSV, 46 aa w PVM i 51 aa w APV) (Yu i inni, 1992; Easton i inni, 1997; Samal i inni, 1991; Satake i inni, 1984). Zauważyliśmy dwie małe ORF w ORF M MPV. Jedna mała ORF o 54 resztach aa znajdowała się wewnątrz głównej ORF M, poczynając od nukleotydu 2281 i jedna mała ORF o 33 resztach aa nakładała się na główną ORF M, poczynając od nukleotydu 2893 (dane nieukazane). Podobnie jak drugorzędowe ORF RSV i APV, nie ma istotnej homologii między tymi drugorzędowymi ORF i drugorzędowymi ORF innych pneumowirusów, a sygnały start i stop nie występują. Poza tym, nie udowodniono syntezy białek odpowiadających tym drugorzędowym ORF APV i RSV.

Inna odpowiednia otwarta ramka odczytu (ORF) użyteczna w analizach filogenetycznych obejmuje ORF kodującą białko F. Jeśli stwierdza się całkowitą identyczność aminokwasową wynoszącą co najmniej 95%, zwłaszcza co najmniej 97% analizowanego białka F z białkiem F izolatu I-2614, analizowany izolat wirusowy obejmuje korzystny izolat MPV według wynalazku. ORF F MPV jest położona w sąsiedztwie ORF M, co jest charakterystyczne dla członków rodzaju Metapneumovirus. Gen F MPV koduje białko o 539 aa, które jest dłuższe o dwie reszty aa niż F APV-C (tablica 5). Analiza sekwencji aa ujawniła 81% homologii z APV-C, 67% z APV-A i B, 33-39% z białkami F pneumowirusa i tylko 10-18% z innymi paramyksowirusami (tablica 6). Jedną z zakonserwowanych cech wśród białek F paramyksowirusów, i także widoczną u MPV, jest rozmieszczenie reszt cysteinowych (Morrison, 1988; Yu i inni, 1991). Metapneumowirusy dzielą 12 reszt cysteinowych w F1 (7 jest zakonserwowanych wśród wszystkich paramyksowirusów), i dwie w F2 (1 jest zakonserwowana wśród wszystkich paramyksowirusów). Z 3 potencjalnych miejsc N-glikozylacji występujących w ORF F MPV, żadnej nie ma w RSV, a dwie (pozycja 66 i 389) są w APV. Trzecie, unikatowe, potencjalne miejsce N-glikozylacji dla MPV jest położone w pozycji 206 (fig. 11). Mimo niskiej homologii sekwencji z innymi paramyksowirusami, białko F MPV wykazywało cechy typowego białka fuzyjnego zgodnego z cechami opisanymi dla białek F innych członków rodziny Paramyxoviridae (Morrison, 1988). Białka F członków Paramyxoviridae są sytentyzowane jako inaktywne prekursory (F0), które są rozszczepiane przez proteazy komórki gospodarza, które tworzą aminoterminalne podjednostki F2 i wielką karboksyterminalną podjednostkę F1. Proponowane miejsce rozszczepienia (Collins i inni, 1996) jest zakonserwowane wśród wszystkich członków rodziny Paramyxoviridae. Miejsce rozszczepienia MPV zawiera reszty RQSR. Obie reszty argininowe (R) są takie same w APV i RSV, lecz reszty glutaminowe (Q) i serynowe (S) są dzielone z innymi paramyksowirusami, takimi jak ludzki wirus grypy typu 1, wirus Sendai oraz morbiliwirusy (dane nieukazane). Uważa się, że region hydrofobowy na końcu aminowym F1 działa jako błonowa domena fuzyjna i wykazuje wysokie podobieństwo sekwencji wśród paramyksowirusów i morbiliwirusów, a w mniejszym stopniu wśród pneumowirusów (Morrison, 1988). Te 26 reszt (pozycja 137-163, fig. 11) jest zakonserwowanych między MPV i APV-C, co jest zgodne z tym regionem będącym wysoce zakonserwowanym wśród metapneumowirusów (Naylor i inni, 1998; Seal i inni, 2000).

Jak widać dla podjednostek F2 APV i innych paramyksowirusów, MPV wykazywał delecję 22 reszt aa w porównaniu z RSV (pozycja 107-128, fig. 11). Ponadto, dla RSV i APV, okazało się, że peptyd sygnałowy i domena kotwicząca są zakonserwowane wewnątrz podtypów i wykazywały wysoką zmienność między podtypami (Plows i inni, 1995; Naylor i inni, 1998). Peptyd sygnałowy MPV (aa 10-35, fig. 11) na końcu aminowym F2 wykazuje pewne podobieństwo sekwencji z APV-C (18 z 26 reszt aa jest podobnych) i mniejszy stopień zakonserwowania z innymi APV lub RSV. Znacznie większą zmienność widać w błonowej domenie kotwiczącej na końcu karboksylowym F1, choć wciąż widać pewną homologię z APV-C.

PL 213 926 B1

Inna odpowiednia otwarta ramka odczytu (ORF) użyteczna w analizach filogenetycznych obejmuje ORF kodującą białko M2. Jeśli stwierdza się całkowitą identyczność aminokwasową wynoszącą co najmniej 85%, zwłaszcza co najmniej 90% analizowanego białka M2 z białkiem M2 izolatu I-2614, analizowany izolat wirusowy obejmuje korzystny izolat MPV według wynalazku. Gen M2 jest unikatowy dla Pneumovirinae i u wszystkich pneumowirusów zaobserwowano dwie nakładające się ORF. Pierwsza główna ORF reprezentuje białko M2-1, które wzmacnia zdolność polimerazy wirusowej do działania (Collins i inni, 1995; Collins, 1996) oraz jej odczytywanie przez regiony międzygenowe (Hardy i inni, 1998; Fearns i inni, 1999). Gen M2-1 MPV, położony sąsiadująco w stosunku do genu F, koduje białko o 187 aa (tablica 5) i ujawnia najwyższą (84%) homologię z M2-1 APV-C (tablica 6). Porównanie wszystkich pneumowirusowych białek M2-1 ujawniło najwyższe zakonserwowanie w aminoterminalnej połowie białka (Collins i inni, 1990; Zamora i inni, 1992; Ahmadian i inni, 1999), co jest zgodne z obserwacją, że MPV wykazuje 100% podobieństwa z APV-C w pierwszych 80 resztach aa białka (fig. 12A). Białko M2-1 MPV zawiera 3 reszty cysteinowe położone wewnątrz pierwszych 30 reszt aa, które są zakonserwowane wśród wszystkich pneumowirusów. Taka koncentracja cystein jest często spotykana w białkach wiążących cynk (Ahmadian i inni, 1991; Cuesta i inni, 2000).

Drugorzędowe ORF (M2-2), które nakładają się z M2-1 ORF pneumowirusów, są zakonserwowane pod względem położenia, lecz nie pod względem sekwencji i uważa się, że odgrywają rolę w kontroli przełączania między replikacją i transkrypcją RNA wirusa (Collins i inni, 1985; Elango i inni, 1985; Baybutt i inni, 1987; Collins i inni, 1990; Ling i inni, 1992; Zamora i inni, 1992; Alansari i inni, 1994; Ahmadian i inni, 1999; Bermingham i inni, 1999). Dla MPV, ORF M2-2 zaczyna się przy nukleotydzie 512 w ORF M2-1 (fig. 7), co jest dokładnie taką samą pozycją startową jak dla APV-C. Długość ORF M2-2 jest taka sama dla APV-C i MPV, 71 reszt aa (tablica 5). Porównanie sekwencji ORF M2-2 (fig. 12B) ujawniło 56% homologii sekwencji aa między MPV i APV-C i tylko 26-27% homologii sekwencji aa między MPV i APV-A i B (tablica 6).

Inna otwarta ramka odczytu (ORF) użyteczna w analizach filogenetycznych obejmuje ORF kodującą białko L. Jeśli stwierdza się całkowitą identyczność aminokwasową wynoszącą co najmniej 91%, zwłaszcza co najmniej 95% analizowanego białka L z białkiem L izolatu I-2614, analizowany izolat wirusowy obejmuje korzystny izolat MPV według wynalazku. Przez analogię do innych wirusów o ujemnej nici, ostatnia ORF genomu MPV jest zależnym od RNA składnikiem polimerazy RNA kompleksów replikacji i transkrypcji. Gen L MPV koduje białko o 2005 aa, które jest o 1 resztę dłuższe od białka APV-A (tablica 5). Białko L MPV dzieli 64% homologii z APV- A, 42-44% z RSV i około 13% z innymi paramyksowirusami (tablica 6). Poch i inni, (1989; 1990) zidentyfikował sześć zakonserwowanych domen w białku L niesegmentowanych wirusów o ujemnej nici RNA, z których domena III zawierała cztery rdzeniowe motywy polimerazy, które uważa się za zasadnicze dla czynności polimerazy. Motywy te (A, B, C i D) są dobrze zakonserwowane w białku L MPV: w motywach A, B i C: MPV dzieli 100% podobieństwa ze wszystkimi pneumowirusami, a w motywie D MPV dzieli 100% podobieństwa z APV i 92% z RSV. Dla całej domeny III (aa 625-847 w ORF L), MPV dzieli 83% identyczności z APV, 67-68% z RSV i 26-30% z innymi paramyksowirusami (fig. 15). Oprócz motywów polimerazy, białka L pneumowirusa zawierają sekwencję, która przypomina konsensusowy motyw wiążący ATP K(X)21GEGAGN(X)20K (Stec, 1991). ORF L MPV zawiera podobny motyw jak APV, w którym reszty pośrednie są oddalone o: K(x)22GEGAGN(X)19K.

Bardzo zalecana otwarta ramka odczytu (ORF) użyteczna w analizach filogenetycznych obejmuje ORF kodującą białko SH. Jeśli stwierdza się całkowitą identyczność aminokwasową wynoszącą co najmniej 30%, zwłaszcza co najmniej 50%, w szczególności co najmniej 75% analizowanego białka SH z białkiem SH izolatu I-2614, analizowany izolat wirusowy obejmuje korzystny izolat MPV według wynalazku. Gen położony sąsiadująco w stosunku do M2 MPV koduje białko o 183 aa (fig. 7). Analiza sekwencji nukleotydowej i jej wnioskowanej sekwencji aminokwasowej ujawniła brak dostrzegalnej homologii z innymi genami lub produktami genowymi wirusa RNA. ORF SH MPV jest najdłuższą ORF SH znaną do dzisiaj (tablica 5). Skład reszt aa ORF SH jest względnie podobny do APV, RSV i PVM, z wysokim udziałem procentowym treoniny i seryny (22%, 18%, 19%, 20,0%, 21% i 28% zawartości seryna/treonina odpowiednio dla MPV, APV, RSV A, RSV B, bRSV i PVM). ORF SH MPV zawiera 10 reszt cysteinowych, podczas gdy SH APV zawiera 16 reszt cysteinowych. Wszystkie pneumowirusy mają podobną liczbę potencjalnych miejsc N-glikozylacji (MPV 2, APV 1, RSV 2 bRSV 3, PVM 4).

Profile hydrofobowości dla białka SH MPV oraz SH APV i RSV ujawniły podobne cechy strukturalne (fig. 13B). ORF SH APV i MPV mają hydrofilowy koniec N (aa 1-30), centralną domenę hydryfobową (aa 30-53), która może służyć jako potencjalna domena przekraczająca błonę, drugą domenę

PL 213 926 B1 hydryfobową koło reszty 160 i hydrofilowy koniec C. Dla kontrastu, SH RSV jak się okazuje nie posiada C-terminalnej połowy ORF APV i MPV. U wszystkich pneumowirusowych białek SH domena hydryfobowa jest oflankowana przez aminokwasy zasadowe, które występują także w ORF SH dla MPV (aa 29 i 54).

Inna bardzo zalecana odpowiednia otwarta ramka odczytu (ORF) użyteczna w analizach filogenetycznych obejmuje ORF kodującą białko G. Jeśli stwierdza się całkowitą identyczność aminokwasową wynoszącą co najmniej 30%, zwłaszcza co najmniej 50%, w szczególności co najmniej 75% analizowanego białka G z białkiem G izolatu I-2614, analizowany izolat wirusowy obejmuje korzystny izolat MPV według wynalazku. ORF G MPV leży sąsiadująco w stosunku do genu SH i koduje białko o 236 aminokwasach. Drugorzędowa mała ORF znajduje się zaraz za tą ORF, potencjalnie kodując 68 reszt aa (pozycja 6973-7179), lecz nie posiada kodonu startowego. Trzecia główna ORF, w innej ramce odczytu, o 194 resztach aa (fragment 4, fig. 7) nakłada się na obie te ORF, lecz także nie posiada kodonu startowego (nukleotyd 6416-7000). Za tą główną ORF następuje czwarta ORF w tej samej ramce odczytu (nukleotyd 7001-7198), prawdopodobnie kodująca 65 reszt aa, lecz znowu nie posiadająca kodonu startowego. Wreszcie, potencjalna ORF o 97 resztach aa (lecz bez kodonu startowego) znajduje się w trzeciej ramce odczytu (nukleotydy 6444-6737, fig. 1). Inaczej niż pierwsza ORF, inne ORF nie posiadają widocznych sekwencji początku genu lub końca genu (patrz poniżej). Choć ORF G o 236 resztach aa prawdopodobnie reprezentuje co najmniej część białka przylegania MPV, nie można wykluczyć, że ekspresja dodatkowych sekwencji kodujących zachodzi w postaci oddzielnych białek albo jako część białka przylegania poprzez pewne zdarzenia redagowania RNA. Należy zauważyć, że dla APV i RSV nie zostały zidentyfikowane żadne drugorzędowe ORF po głównej ORF G, ale zarówno APV jak i RSV mają drugorzędowe ORF w obrębie głównej ORF. Jednakże nie ma dowodu na ekspresję tych ORF i nie istnieje homologia między przewidywanymi sekwencjami aa dla różnych wirusów (Ling i inni, 1992). Drugorzędowe ORF w G MPV nie ujawniają cech innych białek G i to, czy zachodzi ekspresja dodatkowych ORF, wymaga dodatkowego badania. Analizy BLAST ze wszystkimi czterema ORF ujawniły brak dostrzegalnej homologii na poziomie sekwencji nukleotydowej lub aa z innymi znanymi wirusowymi genami lub produktami genowymi. Zgadza się to z niskimi homologiami sekwencji znajdowanymi dla innych białek G, takich jak hRSV A i B (53%) (Johnson i inni, 1987) oraz APV A i B (38%) (Juhasz i inni, 1994). Podczas gdy większość ORF MPV przypomina te z APV zarówno pod względem długości jak i sekwencji, ORF G MPV jest znacznie mniejsza niż ORF G APV (tablica 5). Sekwencja aa ujawniła zawartość seryny i treoniny wynoszącą 34%, która jest nawet wyższa niż 32% dla RSV i 24% dla APV. ORF G zawiera także 8,5% reszt prolinowych, co stanowi wyższą zawartość niż 8% dla RSV i 7% dla APV. Niezwykłą obfitość reszt prolinowych w białkach G APV, RSV i MPV obserwowano także w glikoproteinach pochodzenia śluzowego, gdzie jest ona główną determinantą struktury trójwymiarowej białek (Collins i inni, 1983; Wertz i inni, 1985; Jentoft, 1990). Liczba potencjalnych miejsc glikozylacji związanych z N w G MPV jest podobna do innych pneumowirusów; MPV posiada 5, podczas gdy hRSV posiada 7, bRSV posiada 5 i APV posiada 3 do 5.

Przewidywany profil hydryfobowości G MPV ujawnił cechy podobne do innych pneumowirusów. Koniec aminowy zawiera region hydrofilowy, po czym krótki obszar hydrofobowy (aa 33-53) i głównie hydrofilowy koniec karboksylowy (fig. 14B). Ta całkowita organizacja jest zgodna z organizacją białka transbłonowego kotwiczącego typu II i odpowiada dobrze tym regionom w białku G APV i RSV. ORF G MPV zawiera tylko 1 resztę cysteinową w przeciwieństwie do RSV i APV (odpowiednio 5 i 20).

Zgodnie z klasycznymi analizami serologicznymi znanymi np. z Francki, R.I.B, Fauquet, C.M., Knudson, D.L i Brown, F, Classification and nomenclature of viruses, Fifth report of the international Committee on Taxonomy of Viruses, Arch Virol, 1991, Suplement 2: strona 140-144, izolat MPV można także zidentyfikować jako należący do serotypu jaki tu dostarczono, definiując go na podstawie jego odmienności immunologicznej jak określono przez ilościową neutralizację ze zwierzęcymi surowicami odpornościowymi (otrzymanymi np. od fretek lub świnek morskich jak dostarczono w szczegółowym opisie). Taki serotyp albo nie wykazuje reakcji krzyżowej z innymi albo wykazuje stosunek miana homologicznego do heterologicznego >16 w obu kierunkach. Jeśli nautralizacja wykazuje pewien stopień reakcji krzyżowej między dwoma wirusami w każdym lub obu kierunkach (stosunek mian homologiczny do heterologicznego wynoszący osiem lub 16), zakłada się odmienność serotypu, jeśli istnieją zasadnicze różnice biofizyczne/biochemiczne DNA. Jeśli nautralizacja wykazuje inny stopień reakcji krzyżowej między dwoma wirusami w każdym lub obu kierunkach (stosunek mian homologiczny do heterologicznego jest mniejszy niż osiem), zakłada się identyczność serotypu izolatów w badaniu. Jak

PL 213 926 B1 powiedziano, użyteczne izolaty prototypowe, takie jak I-2614, znane tu także jako izolat MPV 00-1, są tu dostarczone.

Dodatkowej klasyfikacji wirusa jako wyizolowanego, zasadniczo ssaczego wirusa RNA o ujemnej, pojedynczej nici jaki tu dostarczono można dokonać na podstawie homologii z białkami G i/lub SH. Jeśli ogólnie całkowita identyczność sekwencji między ORF N, P, M, F, M2 i L APV (wyizolowanym od ptaków) i MPV (wyizolowanym od ludzi) wynosiła 64 do 88 procent, i znaleziono także homologię sekwencji nukleotydowej między regionami niekodującymi genomów APV i MPV, nie występuje zasadniczo żadna dostrzegalna homologia sekwencji aminokwasowej między dwiema ORF izolatu ludzkiego (MPV) i jakiejkolwiek z ORF innych paramyksowirusów. Zawartość aminokwasowa, profile hydrofobowości i położenie tych ORF w genomie wirusowym pokazują, że reprezentują one analogi białek G i SH. Homologia sekwencji między APV i MPV, podobna organizacja ich genomu (3'-N-P-MF-M2-SH-G-L-5'), jak również analizy filogenetyczne dowodzą dodatkowo proponowanej klasyfikacji MPV jako pierwszego ssaczego metapneumowirusa. Nowe izolaty MPV są więc identyfikowane jako takie przez izolację i charakteryzację wirusa na komórkach tMK lub innych, przez RT-PCR i/lub analizę sekwencji, a następnie analizy drzewa filogenetycznego, oraz technikami serologicznymi, takimi jak testy zobojętniania wirusa, pośrednie testy immunofluorescencyjne, bezpośrednie testy immunofluorescencyjne, analizy FACs lub inne techniki immunologiczne. Dogodnie techniki te są skierowane na analogi białka SH i/lub G.

Przykładowo, opisano tu sposób identyfikacji dodatkowych izolatów MPV jakie tu dostarczono, przy czym sposób ten obejmuje szczepienie świnki morskiej lub fretki zasadniczo niezakażonej MPV lub wolnej swoistego patogenu (w opisie szczegółowym zwierzę szczepi się (inokuluje) donosowo, lecz możliwe są również inne drogi szczepienia, takie jak szczepienie domięśniowe lub śródskórne oraz z użyciem innego zwierzęcia doświadczalnego) prototypowym izolatem I-2614 lub izolatami pokrewnymi. Surowice zbiera się od zwierzęcia w dniu zerowym, dwa tygodnie i trzy tygodnie po szczepieniu. Zwierzę o specyficznej serokonwersji jak zmierzono w teście neutralizacji wirusa (VN) i pośredniej IFA przeciwko odpowiedniemu izolatowi I-2614 oraz surowice od zwierzęcia z serokonwersją wykorzystuje się do wykrywania immunologicznego wymienionych dodatkowych izolatów.

Przykładowo, wynalazek dostarcza charakterystyki nowego członka rodziny Paramyxoviridae, ludzkiego metapneumowirusa lub wirusa podobnego do metapneumowirusa (ponieważ jego ostateczna taksonomia oczekuje na omówienie przez komitet taksonomii wirusów, MPV jest tu opisywany np. jako taksonomicznie odpowiadający APV) (MPV), który może wywoływać ciężkie RTI u ludzi. Oznaki kliniczne choroby wywoływanej przez MPV są zasadniczo podobne do wywoływanych przez hRSV, tak jak kaszel, bóle mięśniowe, wymioty, gorączka, zapalenie oskrzelików lub zapalenie płuc, możliwe zapalenie spojówek, albo ich kombinacje. Jak widać u dzieci zakażonych hRSV, zwłaszcza bardzo małe dzieci mogą wymagać hospitalizacji. Przykładowo dostarczony jest tu MPV, jaki zdeponowano 19 stycznia 2001 jako I-2614 w CNCM, Institute Pasteur, Paryż, albo izolat wirusowy filogenetycznie odpowiadający powyższemu. W związku z tym, wynalazek dostarcza wirusa obejmującego sekwencję kwasu nukleinowego lub fragment funkcjonalny filogenetycznie odpowiadający sekwencji kwasu nukleinowego pokazanej na fig. 6a, 6b, 6c lub strukturalnie jej odpowiadający. W szczególności, wynalazek dostarcza wirusa charakteryzującego się tym, że po przetestowaniu go za pomocą analiz drzewa filogenetycznego, w których tworzy się drzewa maksymalnego prawdopodobieństwa, stosując metodę „bootstrap” w 100 powtórzeniach i 3 zamianach, filogenetycznie odpowiada on ściślej izolatowi wirusowemu zdeponowanemu jako I-2614 w CNCM, Paryż, niż jest spokrewniony z izolatem wirusowym ptasiego pneumowirusa (APV) znanego także jako wirus nieżytu nosa i tchawicy indyków (TRTV), czynnik etiologiczny nieżytu nosa i tchawicy ptaków. Szczególnie użyteczne jest stosowanie izolatu wirusa APV-C jako grupy zewnętrznej przy wymienionych analizach drzewa filogenetycznego, gdyż jest on najbardziej spokrewniony aczkolwiek jest on wirusem zasadniczo niessaczym.

Proponujemy, aby nowy ludzki wirus został nazwany ludzkim metapneumowirusem albo wirusem podobnym do metapneumowirusa (MPV) na podstawie kilku obserwacji. Analiza EM ujawniła cząstki podobne do paramyksowirusa. Zgodnie z klasyfikacją, MPV okazał się wrażliwy na traktowanie chloroformem. Optymalnie MPV hoduje się na komórkach tMK i jest on zależny od trypsyny. Objawy kliniczne wywoływane przez MPV, jak również typowy CPE oraz brak aktywności hemaglutynującej sugerował, że wirus ten jest blisko spokrewniony z hRSV. Chociaż większość paramyksowirusów wykazuje aktywność hemaglutynującą, większość pneumowirusów nie wykazuje¹⁸.

Przykładowo, wynalazek dostarcza niezidentyfikowanego wcześniej paramyksowirusa z próbek aspiratu nosowo-gardłowego pobranego od 28 dzieci cierpiących z powodu ciężkiego RTI. Objawy

PL 213 926 B1 kliniczne u tych dzieci były w większości podobne do tych wywoływanych przez hRSV. Dwadzieścia siedmioro pacjentów było dziećmi poniżej piątego roku życia, a połowa z nich była w wieku między 1 a 12 miesięcy. Inny pacjent miał osiemnaście lat. Wszyscy osobnicy cierpieli z powodu choroby górnych dróg oddechowych (RTI), przy czym zakres objawów był od kaszlu, bóli mięśniowych, wymiotów i gorączki, do zapalenia oskrzelików i ciężkiego zapalenia płuc. Większość tych pacjentów było hospitalizowanych przez jeden do dwóch tygodni.

Izolaty wirusowe od tych pacjentów miały morfologię paramyksowirusów w badaniu pod mikroskopem elektronowym z negatywnym kontrastem, lecz nie reagowały ze swoistymi antysurowicami przeciwko znanym ludzkim i zwierzęcym paramyksowirusom. Wszystkie one były blisko spokrewnione między sobą, co określono przez pośrednie testy immunofluorescencyjne (IFA) z surowicami wzbudzonymi przeciwko tym dwóm izolatami. Analizy sekwencji dziewięciu z tych izolatów ujawniły, że wirus jest nieco spokrewniony z APV. Na podstawie danych wirusologicznych, homologii sekwencji, jak również organizacji genomu, uważamy, że wirus ten jest członkiem rodzaju Metapneumovirus. Badania serologiczne wykazały, że wirus ten jest względnie rozpowszechnionym patogenem, ponieważ ilość osobników z przeciwciałami w Holandii jest bliska 100% ludzi w wieku do pięciu lat. Ponadto, ilość osobników z przeciwciałami okazała się równie wysoka jeśli chodzi o surowice zebrane od ludzi w 1958 roku, wskazując, że wirus ten krąży w populacji ludzkiej od ponad 40 lat. Identyfikacja tego proponowanego, nowego członka rodzaju Metapneumovirus, zapewnia obecnie także rozwój środków i metod dla testów diagnostycznych lub zestawów testowych oraz szczepionek lub surowic albo kompozycji przeciwciał na wirusowe infekcje dróg oddechowych, oraz metod testowania lub przesiewania pod względem czynników antywirusowych użytecznych przy leczeniu infekcji MPV.

W tym zakresie, wynalazek dostarcza, między innymi, wyizolowanego lub rekombinowanego kwasu nukleinowego albo jego swoistego wobec wirusa funkcjonalnego fragmentu, możliwego do otrzymania z wirusa według wynalazku. W szczególności, wynalazek dostarcza startery i/lub sondy odpowiednie do identyfikacji kwasu nukleinowego MPV.

Ponadto, wynalazek dostarcza wektor obejmujący kwas nukleinowy według wynalazku. Rozpoczynając, opisano wektory, takie jak wektory plazmidowe zawierające (części) genomu MPV, wektory wirusowe zawierające (części) genomu MPV (np. lecz bez ograniczania, innych paramyksowirusów, wirusa krowianki, retrowirusów, bakulowirusa), albo MPV zawierającego (części) genomu innego wirusa albo innych patogenów. Ponadto, opisano liczne techniki genetyki odwrotnej do tworzenia rekombinowanych wirusów o ujemnej nici, na podstawie dwóch krytycznych parametrów. Po pierwsze, produkcja takiego wirusa polega na replikacji częściowej albo pełnej długości kopii antysensownego RNA (ang. negative sense Vidal RNA, vRNA) genomu wirusa lub jego komplementarnej kopii (cRNA). Ten vRNA lub cRNA można wyizolować z zakaźnego wirusa, wytworzyć przez transkrypcję in vitro albo wytworzyć w komórkach przez transfekcję kwasu nukleinowego. Po drugie, wytwarzanie rekombinowanego wirusa o ujemnej nici polega na kompleksie funkcjonalnej polimerazy. Zwykle kompleks polimerazy pneumowirusów składa się z białek N, P, L i może M2, lecz nie koniecznie ogranicza się do nich. Kompleksy polimerazy lub ich składniki można wyizolować z cząstek wirusa, wyizolować z komórek wykazujących ekspresję jednego lub więcej składników, albo wytworzyć przez transfekcję specyficznych wektorów ekspresyjnych.

Zakaźne kopie MPV można otrzymać podczas replikacji wyżej wymienionego vRNA, cRNA lub wektorów wykazujących ekspresję tych RNA, przez wyżej wymieniony kompleks polimera1 fi 17 1 fi 1Q 9Π 91 99 zy^{16,17,18,19,20,21,22}. Dla wytworzenia minireplikonów albo układu genetyki odwrotnej do tworzenia pełnej długości kopii obejmującej większość lub całość genomu MPV, wystarczy użyć sekwencje kwasu nukleinowego końca 3' i/lub końca 5' możliwe do otrzymania np. z APV (Randhawa i inni, 1997) albo samego MPV.

Również, wynalazek dostarcza komórkę gospodarza obejmującą kwas nukleinowy albo wektor według wynalazku. Wektory plazmidowe lub wirusowe zawierające składniki polimerazy MPV (przypuszczalnie N, P, L i M2 lecz niekoniecznie ograniczone do nich) tworzy się w komórkach prokariotycznych dla ekspresji składników w odpowiednich rodzajach komórek (bakterie, komórki owadów, komórki eukariotyczne). Wektory plazmidowe lub wirusowe zawierające pełnej długości lub częściowe kopie genomu MPV będą wytworzone w komórkach prokariotycznych dla ekspresji wirusowych kwasów nukleinowych in vitro albo in vivo. Te ostatnie wektory mogą zawierać inne sekwencje wirusowe do tworzenia wirusów chimerowych lub chimerowych białek wirusowych, mogą nie posiadać części genomu wirusowego do tworzenia wirusa defektywnego pod względem replikacji, i mogą zawierać mutacje, delecje lub insercje do tworzenia wirusów atenuowanych.

PL 213 926 B1

Zakaźne kopie MPV (dzikiego typu, atenuowane, defektywne pod względem replikacji lub chimerowe) można wytworzyć w wyniku wspólnej ekspresji składników polimerazy według opisanych powyżej technologii ze stanu techniki.

Poza tym można wykorzystywać komórki eukariotyczne, wykazujące tymczasową lub stabilną ekspresję jednego lub więcej pełnej długości lub częściowych białek MPV. Takie komórki można wytwarzać przez transfekcję (wektory białkowe lub wektory kwasu nukleinowego), infekcję (wektory wirusowe) lub transdukcję (wektory wirusowe) i mogą być użyteczne do komplementacji wymienionych wirusów dzikiego typu, atenuowanych, defektywnych pod względem replikacji lub chimerowych.

Wirus chimerowy może być szczególnie użyteczny do tworzenia rekombinowanych szczepionek zabezpieczających przed dwoma lub więcej wirusami^23,24,26. Przykładowo, można przewidzieć, że wektor wirusa MPV z ekspresję jednego lub więcej białek RSV lub wektor RSV z ekspresją jednego lub więcej białek MPV będzie zabezpieczał osobniki szczepione takim wektorem przed obiema infekcjami wirusowymi. Podobne podejście można przewidzieć dla PI3 lub innych paramyksowirusów. Wirusy atenuowane i defektywne pod względem replikacji mogą być użyteczne w celu szczepienia żywymi szczepionkami, jak sugerowano dla innych wirusów^25,26.

W korzystnej postaci realizacji, wynalazek dostarcza cząsteczkę białkową lub białko wirusowe swoiste dla metapneumowirusa albo jego funkcjonalny fragment kodowany przez kwas nukleinowy według wynalazku. Użyteczne cząsteczki białkowe pochodzą np. z jakiegokolwiek genu lub fragmentu genowego możliwego do otrzymania z wirusa według wynalazku. Takie cząsteczki, albo ich fragmenty antygenowe, jakie tu dostarczono, są np. użyteczne w metodach diagnostycznych lub zestawach oraz w kompozycjach farmaceutycznych, takich jak szczepionki podjednostkowe. Szczególnie użyteczne jest białko F, SH i/lub G lub ich fragmenty antygenowe do włączenia jako antygen albo immunogen podjednostkowy, lecz można także zastosować całego inaktywowanego wirusa. Szczególnie użyteczne są także te substancje białkowe, które są kodowane przez fragmenty rekombinowanego kwasu nukleinowego, które identyfikuje się dla analiz filogenetycznych, oczywiście zalecane są te, które występują w granicach ORF użytecznych w analizach filogenetycznych, w szczególności do wzbudzania przeciwciał swoistych wobec MPV, czy to in vivo (np. w celach zabezpieczających lub do dostarczenia przeciwciał diagnostycznych) czy in vitro (np. za pomocą technologii prezentacji na fagu lub innej techniki użytecznej przy tworzeniu syntetycznych przeciwciał).

Wynalazek dostarcza także przeciwciała, są to przeciwciała naturalne poliklonalne albo monoklonalne, albo syntetyczne (np. cząsteczki wiążące pochodzące z biblioteki (fagowej)), które reagują swoiście z antygenem obejmującym cząsteczkę białkową albo jej funkcjonalny fragment swoisty wobec MPV według wynalazku. Takie przeciwciała są użyteczne w sposobie identyfikowania izolatu wirusowego jako MPV, obejmującym poddawanie reakcji wymienionego izolatu wirusowego lub jego składnika z przeciwciałem jakie tu dostarczono. Można to uzyskać np. przy użyciu oczyszczonego albo nieoczyszczonego MPV lub jego części (białek, peptydów) stosując ELISA, RIA, FACS lub podobne formaty testów wykrywających antygen (Current Protocols in Immunology). Alternatywnie, zainfekowane komórki lub hodowle komórkowe można wykorzystać do identyfikacji antygenów wirusowych przy użyciu klasycznych technik immunofluorescencji albo immunohistochemicznych.

Inne metody identyfikacji izolatu wirusowego jako MPV, obejmują reakcję wymienionego izolatu wirusowego lub jego składnika z kwasem nukleinowym swoistym wobec wirusa według wynalazku, w szczególności jeśli wymieniony wirus ssaczy obejmuje wirusa ludzkiego.

W ten sposób wynalazek dostarcza izolat wirusowy możliwy do identyfikacji sposobem według wynalazku jako wirus ssaczy, taksonomicznie odpowiadający wirusowi RNA o ujemnej, pojedynczej nici, możliwy do identyfikacji jako prawdopodobnie należący do rodzaju Metapneumovirus podrodziny Pneumovirinae rodziny Paramyxoviridae.

Sposób ten jest użyteczny jako sposób wirusologicznego diagnozowania infekcji MPV u ssaka, przy czym wymieniony sposób obejmuje np. określanie w próbce od wymienionego ssaka obecności izolatu wirusowego lub jego składnika, przez reakcję wymienionej próbki z kwasem nukleinowym albo przeciwciałem według wynalazku. Przykłady są podane dalej w opisie szczegółowym, takie jak zastosowanie PCR (lub innych technik amplifikacji lub hybrydyzacji dobrze znanych w dziedzinie) albo zastosowanie wykrywania immunofluorescencyjnego (albo innych technik immunologicznych znanych w dziedzinie).

Wynalazek opisuje także sposób serologicznego diagnozowania infekcji MPV u ssaka, obejmujący określenie w próbce od wymienionego ssaka, obecności przeciwciała swoiście skierowanego

PL 213 926 B1 przeciwko MPV lub jego składnikowi, przez reakcję wymienionej próbki z cząsteczką białkową lub jej fragmentem albo antygenem według wynalazku.

Sposoby i środki tu dostarczone są szczególnie użyteczne w zestawie diagnostycznym do diagnozowania infekcji MPV, przy czym jest to diagnoza wirusologiczna lub serologiczna. Takie zestawy lub testy mogą np. zawierać wirusa, kwas nukleinowy, cząsteczkę białkową lub jej fragment, antygen i/lub przeciwciało według wynalazku. Dostarczone jest także zastosowanie wirusa, kwasu nukleinowego, cząsteczki białkowej lub jej fragmentu, antygenu i/lub przeciwciała według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej np. do leczenia lub profilaktyki infekcji MPV i/lub do leczenia lub profilaktyki chorób układu oddechowego, w szczególności u ludzi. Atenuację wirusa można uzyskać ustalonymi metodami opracowanymi w tym celu, włączając, lecz bez ograniczenia, zastosowanie pokrewnych wirusów innego gatunku, serie pasaży przez zwierzęta laboratoryjne i/lub hodowle tkankowe, komórkowe, mutagenezę ukierunkowaną klonów cząsteczkowych i wymianę genów lub fragmentów genowych między pokrewnymi wirusami.

Kompozycja farmaceutyczna obejmująca wirusa, kwas nukleinowy, cząsteczkę białkową lub jej fragment, antygen i/lub przeciwciała według wynalazku, może być np. stosowana w sposobie leczenia lub profilaktyki infekcji MPV i/lub choroby układu oddechowego, obejmującym dostarczenie osobnikowi kompozycji farmaceutycznej według wynalazku. Najbardziej użyteczne jest kiedy wymieniony osobnik obejmuje człowieka, zwłaszcza jeśli wymieniony człowiek jest w wieku poniżej 5 lat, ponieważ takie niemowlęta i małe dzieci ulegają najprawdopodobniej infekcji ludzkim MPV jaki tu dostarczono. Generalnie, pacjenci w fazie ostrej będą cierpieć z powodu objawów górnych dróg oddechowych predysponujących do innych chorób układu oddechowego i innych chorób. Mogą również wystąpić choroby dolnych dróg oddechowych, predysponujące do większego natężenia i innych poważnych stanów chorobowych.

Opisano tu także sposób otrzymywania czynnika antywirusowego użytecznego przy leczeniu choroby układu oddechowego, obejmujący wyprowadzenie hodowli komórkowej lub zwierzęcia doświadczalnego zawierającego wirusa według wynalazku, traktowanie wymienionej hodowli lub zwierzęcia doświadczalnego kandydującym czynnikiem antywirusowym i określenie wpływu wymienionego czynnika na wymienionego wirusa lub infekcję wymienionej hodowli lub zwierzęcia. Przykładem takiego czynnika antywirusowego jest przeciwciało neutralizujące MPV, albo jego składnik funkcjonalny, jaki tu dostarczono, lecz można także otrzymywać czynniki antywirusowe o innym charakterze. Wynalazek opisuje także zastosowanie czynnika antywirusowego według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, w szczególności do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby układu oddechowego, zwłaszcza jeśli wywoływana jest przez infekcję MPV, i dostarcza kompozycję farmaceutyczną obejmującą czynnik antywirusowy według wynalazku, użyteczną w sposobie leczenia lub profilaktyki infekcji MPV lub choroby układu oddechowego, przy czym wymieniony sposób obejmuje dostarczenie osobnikowi takiej kompozycji farmaceutycznej.

Wynalazek jest dodatkowo wyjaśniony w szczegółowym opisie, bez ograniczania się do niego.

Opisy rysunków

Fig. 1A obejmuje tablicę 1: Procent homologii znaleziony między sekwencją aminokwasową izolatu 00-1 i innych członków Pneumovirinae. Udziały procentowe (x100) są podane dla sekwencji aminokwasowych N, P, M, F i dwóch fragmentów RAP-PCR w L (8 i 9/10). Numery dostępu wykorzystane do analiz są opisane w sekcji materiałów i metod.

Fig. 1B obejmuje tablicę 2: Ilość osobników z przeciwciałami MPV u ludzi podzielonych na kategorie wiekowe przy użyciu testów immunofluorescencji i zobojętniania wirusa.

Fig. 2: Schematyczne przedstawienie genomu APV z położeniem i wielkością fragmentów otrzymanych za pomocą RAP-PCR i RT-PCR na izolacie wirusowym 00-1. Fragmenty 1 do 10 otrzymano za pomocą RAP-PCR. Fragment A otrzymano za pomocą startera we fragmencie RAP-PCR 1 i 2, i starter zaprojektowano na podstawie dopasowania sekwencji literowej i trailerowej APV i RSV6. Fragment B otrzymano przy użyciu starterów zaprojektowanych we fragmencie RAP-PCR 1 i 2 oraz fragmencie RAP-PCR 3. Fragment 3 otrzymano za pomocą starterów zaprojektowanych we fragmencie RAP-PCR 3 i fragmencie RAP-PCR 4, 5, 6 i 7.

Dla wszystkich drzew filogenetycznych (fig. 3-5) sekwencje DNA dopasowano przy użyciu pakietu oprogramowania ClustalW, a drzewa maksymalnego prawdopodobieństwa wytworzono przy użyciu pakietu oprogramowania DNA-ML z 5 programu Phylip 3,5, za pomocą metody „bootstrap” 15 w 100 powtórzeniach i 3 zamianach¹⁵. Wcześniej opublikowane sekwencje, które wykorzystano do tworzenia drzew filogenetycznych są dostępne w Genbank pod numerami dostępu: dla wszystkich

PL 213 926 B1

ORF: hRSV: NC001781; bRSV:NC001989; dla ORF F: PVM, D11128; APV-A, D00850; APV-B, Y14292; APV-C, AF187152; dla ORF N: PVM, D10331; APV-A, U39295; APV-B, U39296; APV-C, AF176590; dla ORF M: PVM, U66893; APV-A, X58639; APV-B, U37586; APV-C, AF262571; dla ORF P: PVM, 09649; APV-A, U22110, APV-C, AF176591. Analizy filogenetyczne dla dziewięciu różnych izolatów wirusowych MPV przeprowadzono z użyciem APV szczepu C jako grupy zewnętrznej.

Skróty stosowane w ilustracjach: hRSV: ludzki RSV; bRSV: bydlęcy RSV; PVM: wirus zapalenia płuc myszy; APV-A, B i C: ptasi pneumowirus typu A, B i C.

Fig. 3. Porównanie ORF N, P, M i F członków podrodziny Pneumovirinae oraz izolatu wirusowego 00-1. Dopasowanie pokazuje sekwencję aminokwasową pełnych białek N, P, M i F oraz częściowego białka L izolatu wirusowego 00-1. Pokazane są aminokwasy, które różnią się między izolatem 00-1 i innymi wirusami, aminokwasy identyczne są reprezentowane przez kropki, przerwy są reprezentowane jako kreski. Liczby odpowiadają pozycjom aminokwasów w białkach. Numery dostępu wykorzystane w analizach są opisane w sekcji materiałów i metod. APV-A, B lub C: ptasi pneumowirus typu A, B lub C, b- lub hRSV: bydlęcy lub ludzki syncytialny wirus oddechowy, PVM: wirus zapalenia płuc myszy. L8: fragment 8 otrzymany za pomocą RAP-PCR położony w L, L9/10: konsensusowy fragment 9 i 10 otrzymany za pomocą RAP-PCR, położony w L. Dla dopasowania P, sekwencja APV-B była niedostępna z Genebank. Dla dopasowania L, dostępne były jedynie sekwencje bRSV, hRSV i APV-A.

Fig. 4: Analizy filogenetyczne ORF N, P, M i F członków rodzaju Pneumoviridae oraz izolatu wirusowego 00-1. Analizę filogenetyczną przeprowadzono na sekwencjach wirusowych następujących genów: F (panel A), N (panel B), M (panel C) i P (panel D). Drzewa filogenetyczne opierają się na analizach maksymalnego prawdopodobieństwa z użyciem metody „bootstrap” w 100 powtórzeniach i 3 zamianach. Dla każdego drzewa jest ukazana skala reprezentująca liczbę zmian nukleotydowych.

Fig. 5: Pokrewieństwo filogenetyczne dla części ORF F (panel A), N (panel B), M (panel C) i L (panel D) dziewięciu pierwszorzędowych izolatów MPV z APV-C, jest to genetycznie najbliższy krewniak. Drzewa filogenetyczne opierają się na analizach maksymalnego prawdopodobieństwa. Dla każdego drzewa jest ukazana skala reprezentująca liczbę zmian nukleotydowych. Numery dostępu dla APV-C: panel A: D00850; panel B: U39295; panel C: X58639; i panel D: U65312.

Fig. 6A: Informacja o sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej od końca 3' genomu izolatu 00-1 MPV. Podane są ORF N: ORF dla nukleoproteiny; P: ORF dla fosfoproteiny; M: ORF dla białka macierzy; F: ORF dla białka fuzyjnego; GE: koniec genu; GS: początek genu.

Fig. 6B i C: Informacje o sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej z otrzymanych fragmentów w genie polimerazy (L) izolatów 00-1 MPV. Pozycje fragmentów w L opierają się na homologii białka z APV-C (numer dostępu U65312). Fragment po translacji 8 (fig. 6B) zlokalizowany jest od numeru aminokwasu 8 do 243, a konsensus fragmentów 9 i 10 (fig. 6C) zlokalizowany jest od numeru aminokwasu 1358 do 1464 ORF APV-C.

Fig. 7:

Mapa genomowa izolatu 00-1 MPV. Pozycje nukleotydowe kodonu startowego i przestankowego są zaznaczone pod każdą ORF. Linie podwójne, które przekraczają ORF L wskazują skrócony obraz genu L. Trzy ramki odczytu pod mapą wskazują pierwszorzędową ORF G (nukleotyd 62626972) i nakładające potencjalne drugorzędowe ORF.

Fig. 8:

Dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej nukleoproteiny MPV z innymi pneumowirusami. Regiony zakonserwowane zidentyfikowane przez Barr (1991) są reprezentowane przez kwadraty i oznakowane A, B i C. Region zakonserwowany wśród wirusów (Li, 1996) jest ukazany jako zacieniowana na szaro. Przerwy są reprezentowane przez kreski, kropki wskazują pozycje identycznych reszt aminokwasowych w porównaniu z MPV.

Fig. 9:

Porównanie sekwencji aminokwasowej fosfoproteiny MPV z innymi pneumowirusami. Region wysokiego podobieństwa (Ling, 1995) jest obramowany, a region bogaty w glutaminian jest zacieniowany na szaro. Przerwy są reprezentowane przez kreski, a kropki wskazują pozycję identycznych reszt aminokwasowych w porównaniu z MPV.

Fig. 10:

Porównanie wnioskowanej sekwencji aminokwasowej białka macierzy MPV z innymi pneumowirusami. Zakonserwowana sekwencja heksapeptydu (Easton, 1997) jest zacieniowana na szaro. PrzePL 213 926 B1 rwy są reprezentowane przez kreski, a kropki wskazują pozycję identycznych reszt aminokwasowych w stosunku do MPV.

Fig. 11:

Dopasowanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej białka fuzyjnego MPV z innymi pneumowirusami. Zakonserwowane reszty cysteinowe są obramowane, miejsca glikozylacji powiązane z N są podkreślone, miejsce rozszczepienia F0 jest podkreślone podwójnie, peptyd fuzyjny, peptyd sygnałowy i błonowa domena kotwicząca są ukazane jako zacieniowane na szaro. Przerwy są reprezentowane przez kreski, a kropki wskazują pozycję identycznych reszt aminokwasowych w stosunku do MPV.

Fig. 12:

Porównanie sekwencji aminokwasowej ORF M2 MPV z innymi pneumowirusami. Dopasowanie ORF M2-1 jest ukazane w panelu A, a zakonserwowany koniec aminowy (Collins, 1990; Zamora, 1999) ukazany przez zacieniowanie na szaro. Trzy zakonserwowane reszty cysteinowe są wydrukowane czcionką pogrubioną i zaznaczone przez #. Dopasowanie ORF M2-2 jest ukazane w panelu B. Przerwy są reprezentowane przez kreski, a kropki wskazują pozycję identycznych reszt aminokwasowych w stosunku do MPV.

Fig. 13:

Analizy sekwencji aminokwasowej ORF SH MPV. (A) Sekwencja aminokwasowa ORF SH MPV z resztami serynowymi i treoninowymi zacieniowanymi na szaro, resztami cysteinowymi pogrubionymi i regionem hydrofobowym podwójnie podkreślonym. Potencjalne miejsca glikozylacji powiązane z N są podkreślone pojedynczo. Liczby wskazują pozycje zasadowych aminokwasów flankujących domenę hydrofobową. (B) Dopasowanie wykresów hydrofobowości białek SH MPV, APV-A i hRSV-B. Wykorzystano procedurę Kyte i Doolittle (1982) z okienkiem 17 aminokwasów. Strzałki wskazują domenę silnie hydrofobową. Pozycje w ORF są podane na osi X.

Fig. 14:

Analizy sekwencji aminokwasowej ORF G MPV. (A) Sekwencja aminokwasowa ORF G MPV z resztami serynowymi, treoninowymi i prolinowymi zacieniowanymi na szaro, resztami cysteinowymi pogrubionymi i regionem hydrofobowym podwójnie podkreślonym. Potencjalne miejsca N- glikozylacji są podkreślone pojedynczo. Liczby wskazują pozycje zasadowych aminokwasów flankujących domenę hydrofobową. (B) Dopasowanie wykresów hydrofobowości białek G MPV, APV-A i hRSV-B. Wykorzystano procedurę Kyte i Doolittle (1982) z okienkiem 17 aminokwasów. Strzałki wskazują region hydrofobowy. Pozycje w ORF są podane na osi X.

Fig. 15:

Porównanie sekwencji aminokwasowych domeny zakonserwowanej genu polimerazy MPV i innych paramyksowirusów. Domena III jest ukazana z czterema zakonserwowanymi motywami polimerazy (A, B, C, D) w domenie III (Poch 1998, 1999), obramowana. Przerwy są reprezentowane przez kreski, a kropki wskazują pozycję identycznych reszt aminokwasowych w stosunku do MPV. hPIV-3: ludzki wirus grypy rzekomej typu 3; SV wirus sendai; hPIV-2: ludzki wirus grypy rzekomej typu 2; NDV: wirus choroby Newcastle; MV wirus odry; nipah: wirus Nipah.

Fig. 16:

Analizy filogenetyczne ORF M2-1 i L oraz wybranych paramyksowirusów. ORF M2-1 dopasowano z IRF M2-1 innych członków rodzaju Pneumovirinae (A), a ORF L dopasowano z ORF L członków rodzaju Pneumovirinae oraz wybranych innych paramyksowirusów jak opisano w opisie fig. 15(B). Utworzono drzewa filogenetyczne za pomocą analiz maksymalnego prawdopodobieństwa przy użyciu metody „bootstrap” w 100 powtórzeniach i 3 zamianach. Dla każdego drzewa jest ukazana skala reprezentująca liczbę zmian nukleotydowych. Liczby w drzewie reprezentują wartości samoładujące na podstawie drzew konsensusowych.

Fig. 17:

Sekwencje niekodujące izolatu 00-1 hMPV. (A) Sekwencje niekodujące między ORF i na końcu genomowym, są ukazane w kierunku sensownym. Od lewej do prawej, ukazane są kodony przestankowe zaznaczonych ORF, następnie sekwencje niekodujące, sygnały początku genu i kodony startowe zaznaczonych kolejnych ORF. Liczby wskazują pierwszą pozycję kodonu startowego i przestankowego w mapie hMPV. Sekwencje, które obrazują podobieństwo do sygnałów końca opublikowanego genu są podkreślone, a sekwencje, które obrazują podobieństwo do UAAAAAU/A/C są oznaczone linią nad sekwencją. (B) Sekwencje nukleotydowe końców genomowych hMPV. Końce genomowe hMPV dopasowuje się między sobą i z tymi z APV. Regiony podkreślone przedstawiają sekwencje starterowe wykorzystane w testach RT-PCR, które są oparte na sekwencji końca 3' i 5' APV i RSV

PL 213 926 B1 (Randhawa i inni, 1997; Mink i inni, 1991). Nukleotydy wydrukowane pogrubioną kursywą, oznaczają część genowego sygnału startowego genu N. Le: lider, Tr: trailer.

Fig. 18:

Porównanie dwóch prototypowych izolatów hMPV z APV-A i APV-C; Matryce podobieństwa DNA dla kwasów nukleinowych kodujących różne białka wirusowe.

Fig. 19:

Porównanie dwóch prototypowych izolatów hMPV z APV-A i APV-C; Matryce podobieństwa białka dla różnych białek wirusowych.

Fig. 20:

Dopasowanie aminokwasowe nukleoproteiny dwóch prototypowych izolatów hMPV.

Fig. 21:

Dopasowanie aminokwasowe prototypowych izolatów hMPV.

Fig. 22:

Dopasowanie aminokwasowe białka prototypowych izolatów hMPV.

Fig. 23:

Dopasowanie aminokwasowe białka fuzyjnego dwóch prototypowych izolatów hMPV.

Fig. 24:

Dopasowanie aminokwasowe białka M2-1 dwóch prototypowych izolatów hMPV.

Fig. 25:

Dopasowanie aminokwasowe białka M2-2 dwóch prototypowych izolatów hMPV.

Fig. 26:

Dopasowanie aminokwasowe krótkiego białka hydrofobowego dwóch prototypowych izolatów hMPV.

Fig. 27:

Dopasowanie aminokwasowe glikoproteiny przylegania dwóch prototypowych izolatów hMPV.

Fig. 28:

Dopasowanie aminokwasowe końca N białka polimerazy dwóch prototypowych izolatów hMPV.

Fig. 29:

Wyniki testów RT-PCR na wymazach z gardła i nosa 12 świnek morskich szczepionych ned/00/01 i/lub ned/99/01.

Fig. 30A: Odpowiedź IgG przeciwko ned/00/01 i ned/99/01 dla świnek morskich zakażonych ned/00/01 i ponownie zakażonych ned/00/01 (GP 4, 5 i 6) lub ned/99/01 (GP 1 i 3).

Fig. 30B: Odpowiedź IgG przeciwko ned/00/01 i ned/99/01 dla świnek morskich zakażonych ned/99/01 i ponownie zakażonych albo ned/00/01 (GP 8 i 9) albo ned/99/01 (GP 10, 11, 12).

Fig. 31: ELISA swoistości ned/00/01 i ned/99/01 wobec surowic pobranych od świnek morskich zakażonych albo ned/00/01 albo ned/99/01.

Fig. 32: ELISA średniej odpowiedzi IgG przeciwko ned/00/01 i ned/99/01 3 homologicznych (00-1/00-1), 2 homologicznych (99-1/99-1), 2 heterologicznych (99-1/00-1) i 2 heterologicznych (00-1/99-1) zakażonych świnek morskich.

Fig. 33: Średni procent inhibicji APV świnek morskich zakażonych hMPV.

Fig. 34: Miana zobojętnienia wirusa świnek morskich zakażonych ned/00/01 i ned/99/01 przeciwko ned/00/01, ned/99/01 i APV-C.

Fig. 35: Wyniki testów RT-PCR na wymazach z gardła makaków jawajskich szczepionych (dwukrotnie) ned/00/01.

Fig. 36: A (górne dwa panele):

Odpowiedź IgA, IgM i IgG przeciwko ned/00/01 2 makaków jawajskich (ponownie) zakażonych ned/00/01.

Fig. 36B (panele dolne):

Odpowiedź IgG przeciwko APV 2 makaków jawajskich zakażonych ned/00/01.

Fig. 37: Porównanie zastosowania ELISA hMPV i ELISA inhibicji APV do wykrywania przeciwciał IgG w ludzkich surowicach.

Szczegółowy opis

Izolacja i charakteryzowanie wirusa

Od 1980 do 2000 znaleźliśmy 28 niezidentyfikowanych izolatów wirusowych od pacjentów z ciężką chorobą układu oddechowego. Tych 28 niezidentyfikowanych izolatów wirusowych rosło powoli na komórkach tMK, słabo w komórkach VERO i komórkach A549 i nie mogły lub tylko w niewielkim stopniu namnażały się w komórkach MDCK lub fibroblastach kurzych zarodków. Większość z tych

PL 213 926 B1 izolatów wirusowych indukowała CPE po trzech pasażach na komórkach tMK, między dniem dziesiątym i czternastym. CPE nie był wyraźnie odróżnialny od CPE wywoływanych przez hRSV lub hPIV w komórkach tMK lub innych hodowlach komórkowych, charakteryzujących się tworzeniem syncytiów, po którym komórki wykazywały gwałtowny rozpad wewnętrzny, następnie oddzielenie komórek od monowarstwy. Komórki zwykle (czasem później) wykazywały CPE po trzech pasażach wirusa z materiału wyjściowego, w dniu 10 do 14 po posianiu, nieco później niż CPE wywoływany przez inne wirusy, takie jak hRSV lub hPIV.

Wykorzystaliśmy supernatanty z zakażonych komórek tMK do analizy EM, która ujawniła obecność cząstek wirusowych podobnych do paramyksowirusów, wielkości w zakresie od 150 do 600 nanometrów, z krótkimi wypustkami otoczki w zakresie od 13 do 17 nanometrów. Zgodnie z własnościami biochemicznymi wirusów otoczkowych, takich jak Paramyxoviridae, standardowe traktowanie chloroformem lub eterem⁸ skutkowało redukcją zakaźności wynoszącą >10⁴ TCID50 dla komórek tMK. Supernatanty hodowli komórkowej tMK zakażone wirusem nie wykazywały aktywności hemaglutynującej z erytrocytami indyków, kur i świnek morskich. Podczas hodowli, replikacja wirusa okazała się być zależną od trypsyny na testowanych komórkach. Te połączone dane wirusologiczne pozwoliły na ustalenie, że nowo zidentyfikowany wirus był klasyfikowany taksonomicznie jako członek rodziny Paramyxoviridae.

Wyizolowaliśmy RNA z komórek tMK zakażonych 15 z niezidentyfikowanych izolatów do analiz odwrotnej transkrypcji i łańcuchowej reakcji polimerazy (RT-PCR), stosując zbiór starterów swoistych dla Paramyxoviridae⁹, hPIV 1-4, wirusa sendai, wirusa małpiego typu 5, wirusa choroby Newcastle, wirusów hRSV, odry, świnki, Nipah, Hendra, Tupaia i Mapuera. Testy RT-PCR były przeprowadzane przy niskiej ostrości w celu wykrycia potencjalnie spokrewnionych wirusów, a RNA wyizolowany z homologicznych partii wirusa wykorzystano jako kontrolę. Podczas gdy dostępne kontrole reagowały pozytywnie z odpowiednimi starterami swoistymi wobec wirusa, nowo zidentyfikowane izolaty wirusowe nie reagowały z żadnym zbiorem starterów, wskazując, że wirus nie był blisko spokrewniony z testowanymi wirusami.

Do szczepienia donosowego świnek morskich i fretek wykorzystaliśmy dwa supernatanty hodowli komórkowej tMK zakażone wirusem. Surowice od tych zwierząt zebrano w dniu zerowym, dwa tygodnie i trzy tygodnie po szczepieniu. Zwierzęta nie wykazywały klinicznych objawów, lecz wszystkie przeszły serokonwersję, co zmierzono w teście zobojętniania wirusa (VN) i pośredniej IFA przeciwko wirusom homologicznym. Surowice nie reagowały w pośredniej IFA z żadnym ze znanych paramyksowirusów opisanych powyżej oraz z PVM. Następnie, przesialiśmy jak dotąd zidentyfikowane izolaty wirusowe wykorzystując surowice poinfekcyjne świnek morskich i fretek, z których 28 było wyraźnie pozytywnych w teście pośredniej IFA z surowicami poinfekcyjnymi, sugerując, że były one serologicznie blisko spokrewnione lub identyczne.

RAP PCR

Aby otrzymać informacje o sekwencji nieznanych izolatów wirusowych, wykorzystaliśmy strate10 gię losowej amplifikacji PCR, znaną jako RAP-PCR¹⁰. W tym celu, komórki tMK zostały zakażone jednym z izolatów wirusowych (izolat 00-1), jak również hPIV-1, który służył jako kontrola. Gdy obie hodowle wykazały podobny poziom CPE, wirus w supernatantach hodowlanych oczyszczono na ciągłych gradientach 20-60% sacharozy. Frakcje gradientu badano pod względem obecności cząstek podobnych do wirusa za pomocą EM, a RNA wyizolowano z frakcji zawierającej około 50% sacharozy, w której zaobserwowano nukleokapsydy. Równe ilości RNA wyizolowanego z obu frakcji wirusowych, wykorzystano do RAP-PCR, po których próbki uruchomiono jedna obok drugiej na 3% żelu agarozowym NuSieve. Dwadzieścia rozmaicie zobrazowanych prążków swoistych dla niezidentyfikowanego wirusa oczyszczono następnie z żelu, klonowano w plazmidzie pCR2.1 (Invitrogen) i sekwencjonowano z użyciem starterów swoistych dla wektora. Gdy użyliśmy tych sekwencji do przeszukania pod względem homologii sekwencji w bazie danych Genbank stosując oprogramowanie BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 10 z 20 fragmentów wykazało podobieństwo do sekwencji APV/TRTV.

Te 10 fragmentów zlokalizowano w genach kodujących nukleoproteinę (N; fragment 1 i 2), białko macierzy (M; fragment 3), białko fuzyjne (F; fragment 4, 5, 6, 7) i białko polimerazy (L; fragment 8, 9, 10) (fig. 2). Następnie zaprojektowaliśmy startery PCR do skompletowania informacji o sekwencji dla końca 3' genomu wirusa, na podstawie naszych fragmentów RAP PCR, jak również opublikowanych sekwencji liderowych i trailerowych dla Pneumovirinae⁶. Trzy fragmenty amplifikowano, z których fragment A obejmował najdalszy koniec 3' otwartej ramki odczytu (ORF) N, fragment B obejmował ORF fosfoproteiny (P), a fragment C zamykał przerwę między ORF M i F (fig. 2). Analizy sekwencji

PL 213 926 B1 tych trzech fragmentów ujawniły brak ORF NS1 i NS2 na najdalszym końcu 3' genomu wirusowego i położenie ORF F tuż przy ORF M. Ta organizacja genomu przypomina metapneumowirusa APV, co jest także zgodne z homologią sekwencji. Całość sekwencji po translacji dla ORF Ν, Ρ, Μ i F wykazywała średnio 30-33% homologii z członkami rodzaju Pneumovirus i 66-68% z członkami rodzaju Metapneumovirus. Dla ORF SH i G nie znaleziono dostrzegalnej homologii z członkami obu rodzajów. Homologia aminokwasowa znaleziona dla N wykazywała około 40% homologii z hRSV i 88% z APV-C, jego najbliższym genetycznie krewnym, co np. można wywnioskować przez porównanie sekwencji aminokwasowej z fig. 3 z sekwencją aminokwasową odpowiednich białek N innych wirusów. Sekwencja aminokwasowa dla P wykazywała około 25% homologii z hRSV i około 66-68% z APV-C, M wykazało około 36-39% z hRSV i około 87-89% z APV-C, F wykazywało około 40% homologii z hRSV i około 81% z APV-C, M2-1 wykazywało około 34-36% homologii z pneumowirusami i 84-86% z APV-C, M2-2 wykazywało około 15-17% homologii z pneumowirusami i 56% z APV-C a fragmenty otrzymane w L wykazywały średnio 44% z pneumowirusami i 64% z APV-C.

Filogeneza

Choć poszukiwania z użyciem oprogramowania BLAST przy użyciu sekwencji nukleotydowych otrzymanych z niezidentyfikowanego izolatu wirusowego ujawniły homologie przede wszystkim z członkami Pneumovirinae, homologie na podstawie sekwencji białkowych ujawniły również pewne podobieństwo z innymi paramyksowirusami (dane nieukazane). Jako wskaźnik pokrewieństwa między nowo zidentyfikowanym izolatem wirusowym i członkami Pneumovirinae, skonstruowano drzewa filogenetyczne na podstawie ORF Ν, Ρ, Μ i F tych wirusów. We wszystkich czterech drzewach filogenetycznych, nowo zidentyfikowany izolat wirusowy był najbardziej spokrewniony z APV (fig. 4). Z czterech serotypów APV, które zostały opisane¹¹, APV serotypu C, metapneumowirus występujący przede wszystkim u ptaków w USA, wykazywał największe podobieństwo do nowo zidentyfikowanego wirusa. Należy jednak zauważyć, że dostępna jest jedynie częściowa informacja o sekwencji dla APV serotypu D.

Aby określić pokrewieństwo naszych nowo zidentyfikowanych izolatów wirusowych, skonstruowaliśmy drzewa filogenetyczne na podstawie informacji o sekwencji otrzymanych z ośmiu do dziewięciu izolatów (8 dla F, 9 dla N, M i L). W tym celu wykorzystaliśmy RT-PCR ze starterami zaprojektowanymi do amplifikacji krótkich fragmentów w ORF N, M, F i L, które następnie bezpośrednio sekwencjonowano. Dziewięć izolatów wirusowych, które wcześniej okazały się spokrewnione w kategoriach serologicznych (patrz powyżej) okazały się również blisko spokrewnione genetycznie. W rzeczywistości wszystkie dziewięć izolatów było bliżej spokrewnionych między sobą niż z APV. Choć informacje o sekwencji wykorzystane do tych drzew filogenetycznych były ograniczone, okazuje się, że dziewięć izolatów można podzielić na dwie grupy, grupując izolat 94-1, 99-1 i 99-2 w jedną grupę, a pozostałe sześć izolatów (94-2; 93-1; 93-2; 93-3; 93-4; 00-1) w drugą (fig. 5).

Występowanie osobników z przeciwciałami

Aby zbadać ilość osobników z przeciwciałami wobec tego wirusa w populacji ludzkiej, przetestowaliśmy surowice od ludzi w różnym wieku, za pomocą pośredniej IFA z użyciem komórek tMK zakażonych jednym z niezidentyfikowanych izolatów wirusowych. Analiza ta ujawniła, że 25% dzieci w wieku między sześć a dwanaście miesięcy miała przeciwciała wobec wirusa, a w wieku do pięciu lat blisko 100% dzieci było seropozytywnych. Wszystkie 56 próbek surowicy testowanych za pomocą pośredniej IFA przetestowano za pomocą testu VN. Dla 51 (91%) próbek wyniki testu VN zgadzały się z wynikami otrzymanymi dla pośredniej IFA (miano >32). Cztery próbki, które były pozytywne w IFA, okazały się negatywne w teście VN (miano <8), podczas gdy jedna surowica reagowała negatywnie w IFA (miano<32) i pozytywnie w teście VN (miano 16) (tablica 2).

IFA przeprowadzona z użyciem 72 surowic pobranych od ludzi w 1958 roku (w wieku od 8-99

12,27 lat)^12,27 ujawniła 100% liczby osobników z przeciwciałami, wskazując, że wirus krąży w populacji ludzkiej od ponad 40 lat. Poza tym liczne z tych surowic wykorzystano w testach VN do potwierdzenia danych IFA (tablica 2).

Analizy genetyczne genów N, M, P i F ujawniły, że MPV ma wyższą homologię sekwencji w stosunku do ostatnio proponowanego rodzaju Metapneumovirus (średnio 63%) w porównaniu z rodzajem Pneumovirinae (średnio 30%), a więc przedstawia organizację genomu podobną i przypominającą APV/TRTV. W przeciwieństwie do organizacji genomu RSV (3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5'), metapneumowirusy nie posiadają genów NS1 i NS2 i mają inne położenie genów między M i L (3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5'). Brak ORF między genami M i F w naszych izolatach wirusowych oraz brak NS1 i NS2 w sąsiedztwie N, oraz wysoka homologia sekwencji aminokwasowych z APV są poPL 213 926 B1 wodami aby zaproponować klasyfikację MPV wyizolowanego od ludzi jako pierwszego członka rodzaju Metapneumovirus pochodzenia ssaczego, w szczególności ludzkiego.

Analizy filogenetyczne ujawniły, że dziewięć izolatów MPV, z których otrzymano informacje o sekwencji, było blisko spokrewnionych. Chociaż informacja o sekwencji była ograniczona, były one w rzeczywistości bardziej spokrewnione między sobą niż z jakimkolwiek ptasim metapneumowirusem. Z czterech serotypów APV, które zostały opisane, serotyp C był najbardziej spokrewniony z MPV na podstawie genów N, P, M i F. Należy jednak zauważyć, że dla serotypu D z Genbank dostępne były tylko częściowe sekwencje dla genu F, a dla serotypu B dostępne były tylko sekwencje M, N i F. Nasze izolaty MPV tworzyły dwa ugrupowania w drzewie filogenetycznym. Zarówno dla hRSV jak i APV opisano różne podtypy genetyczne i serologiczne. Czy dwa ugrupowania genetyczne izolatów MPV reprezentują podgrupy serologiczne, które są także różne pod względem funkcjonalnym, pozostaje obecnie niewiadome. Nasze badania serologiczne pokazały, że MPV jest częstym patogenem ludzkim. Powtarzana izolacja tego wirusa z próbek klinicznych od dzieci z ciężką RTI wskazuje, że wydźwięk kliniczny i ekonomiczny MPV może być duży. Nowe testy diagnostyczne na podstawie wykrywania i serologii wirusa pozwolą na bardziej szczegółowe analizy występowania oraz wydźwięku klinicznego i ekonomicznego tego patogenu wirusowego.

Delikatne różnice między wynikami IFA i VN (5 próbek) mogą być spowodowane faktem, że w IFA wykrywano tylko przeciwciała IgG w surowicy, podczas gdy test VN wykrywa obie klasy i podklasy przeciwciał, albo różnice mogą wynikać z różnic czułości obu testów. Dla IFA wykorzystuje się wartość odcięcia 16, podczas gdy dla VN wykorzystuje się wartość odcięcia 8.

Z drugiej strony, różnice między testem IFA i VN mogą także wskazywać możliwe różnice między różnymi serotypami tego nowo zidentyfikowanego wirusa. Ponieważ MPV wydaje się najbardziej spokrewniony z APV, spekulujemy, że wirus ludzi mógł pochodzić od ptaków. Analiza próbek surowicy pobranych od ludzi w roku 1958 ujawniła, że MPV był szeroko rozprzestrzeniony w ludzkiej populacji przez ponad 40 lat, wskazując, że musiała mieć miejsce wstępna zoonoza na długo przed rokiem 1958.

Materiały i metody

Kolekcja próbek

Przez ostatnie dekady nasze laboratorium zgromadziło aspiraty nosowo-gardłowe od dzieci cierpiących z powodu RTI, które rutynowo testuje się na obecność wirusów. Wszystkie aspiraty nosowo-gardłowe testowano przez bezpośrednie testy immunofluorescencyjne (DIF). Przy użyciu przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie przeciwko wirusowi grypy typu A i B, hRSV i ludzkiemu wirusowi grypy rzekomej (hPIV) typu 1 do 3. Aspiraty nosowo-gardłowe poddano także procesom izolacji wirusa 14 z użyciem technik probówkowych zwanych „rapid shell vial”¹⁴ na różnych liniach komórkowych łącznie z komórkami VERO, trzeciorzędowymi komórkami nerki makaków jawajskich (ang. cynomolgus monkey) (tMK), komórkami ludzkiego nabłonka płuc (HEL) i komórkami nerki morbin dock (MDCK). Próbki wykazujące efekt cytopatyczny (CPE) po dwóch do trzech pasażach i te które były negatywne w teście DIF, przetestowano za pomocą pośrednich testów immunofluorescencyjnych (IFA) przy użyciu przeciwciał swoistych wobec wirusa grypy typu A, B i C, hRSV typów A i B, wirusa odry, wirusa świnki, ludzkiego wirusa grypy rzekomej (hPIV) typów 1 do 4, wirusa sendai, małpiego wirusa typu 5 oraz wirusa choroby Newcastle. Chociaż w wielu przypadkach można było zidentyfikować czynnik etiologiczny, niektóre próbki były negatywne pod względem wszystkich testowanych wirusów.

Test immunofluorescencji bezpośredniej (DIF)

Próbki aspiratów nosowo-gardłowych od pacjentów cierpiących z powodu RTI wykorzystano do DIF i izolacji wirusa jak opisano^14,15. Próbki przechowywano w temperaturze -70°C. W skrócie, aspiraty nosowo-gardłowe rozcieńczono 5 ml Dulbecco MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) i dokładnie mieszano przez jedną minutę. Zawiesinę wirowano w ten sposób przez dziesięć minut z prędkością 840 x g. Osad rozprowadzono na szkiełku o wielu zagłębieniach (Nutacon, Leimuiden, Holandia), supernatant wykorzystano do izolacji wirusa. Po przemyciu, komórki utrwalono w acetonie przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Po przemyciu, szkiełka inkubowano przez 15 minut w temperaturze 37°C z dostępnymi na rynku surowicami odpornościowymi swoistymi wobec wirusa, znakowanymi FITC, takimi jak grypy A i B, hRSV i hPIV 1 do 3 (Dako, Glostrup, Dania). Po trzech przemyciach w PBS i jednym wodą z kranu, szkiełka włożono do roztworu glicerol/PBS (Citifluor, UKC, Canterbury, UK) i przykryto. Szkiełka analizowano z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego Axioscop (Carl Zeiss B.V, Weesp, Holandia).

PL 213 926 B1

Izolacja wirusa

Do izolacji wirusa, komórki tMK (RIVM, Bilthoven, Holandia) hodowano w 24 studzienkowych płytkach zawierających szkiełka szklane (Costar, Cambridge, UK) z pożywką opisaną poniżej, uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (BioWhittaker, Vervier, Belgia). Przed posianiem płytki przemyto PBS i nałożono MEM Eagle'a, z solą Hank'a (ICN, Costa Mesa, CA) z czego pół litra uzupełniono 0,26 grama HaHCO3, 0,025 M Hepes (Biowhittaker), 2 mM L-glutaminy (Biowhittaker), 100 jednostkami penicyliny, 100 mg streptomycyny (Biowhittaker), 0,5 grama laktoalbuminy (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Holandia), 1,0 gramem D-glukozy (Merck, Amsterdam, Holandia), 5,0 gramami peptonu (Oxoid, Haarlem, Holandia) i 0,02% trypsyną (Life Technologies, Bethesda, MD). Płytki posiano (inokulowano) supernatantem próbek aspiratu nosowo-gardłowego, 0,2 ml na studzienkę, w trzech powtórzeniach, następnie wirowano z prędkością 840 x g przez jedną godzinę. Po posianiu płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez maksimum 14 dni, zmieniając pożywkę raz w tygodniu i hodowle sprawdzano codziennie pod względem CPE. Po 14 dniach komórki zeskrobano z drugiego pasażu i inkubowano 14 dni. Etap ten powtórzono do trzeciego pasażu. Szkiełka szklane wykorzystano do zademonstrowania obecności wirusa przez pośrednią IFA jak opisano poniżej.

Immunizacja zwierzęcia

Wytworzono surowice odpornościowe swoiste dla nowo odkrytego wirusa, od fretki i świnki morskiej, przez doświadczalne donosowe zakażenie dwóch fretek wolnych od swoistych patogenów i dwóch świnek morskich, utrzymywanych w oddzielnych ciśnieniowych komorach rękawicowych. Dwa do trzech tygodni potem wszystkie zwierzęta skrwawiano przez nakłucie sercowe, a ich surowice wykorzystano jako surowice odniesienia. Surowice testowano pod względem wszystkich wcześniej opisanych wirusów za pomocą pośredniej IFA jak opisano poniżej.

Wykrywanie antygenu przez pośrednią IFA

Przeprowadziliśmy pośrednią IFA na szkiełkach zawierających zakażone komórki tMK. Po przemyciu PBS szkiełka inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C z surowicami odpornościowymi swoistymi dla wirusa. Wykorzystaliśmy przeciwciała monoklonalne w DIF przeciwko grupie A, B i C, hPIV typu 1 do 3 i hRSV jak opisano powyżej. Dla hPIV typu 4, wirusa świnki, wirusa odry wirusa sendai, wirusa małpiego typu 5, wirusa choroby Newcastle wykorzystano przeciwciała poliklonalne wobec wirusa (RIVM) oraz surowice odniesienia fretki i świnki morskiej. Po trzech przemyciach PBS i jednym przemyciu wodą z kranu, szkiełka zabarwiono wtórnymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko surowicom użytym w pierwszej inkubacji. Przeciwciałami wtórnymi dla surowic odpornościowych poliklonalnych były kozie anty-fretkowe (KPL, Guilford, UK, rozcieńczenie 40-krotne), mysie antykrólicze (Dako Glostrup, Dania, rozcieńczenie 20-krotne), królicze anty-kurze (KPL, rozcieńczenie 20-krotne) i mysie anty-świnka morska (Dako, rozcieńczenie 20-krotne). Szkiełka opracowywano tak jak opisano dla DIF.

Wykrywanie przeciwciał u ludzi przez pośrednią IFA

Dla wykrycia przeciwciała swoistych wobec wirusa, zakażone komórki tMK utrwalono zimnym acetonem na szkiełkach nakrywkowych, przemyto PBS i wybarwiono znakowanymi FITC króliczymi, anty-ludzkimi przeciwciałami, rozcieńczonymi 80 razy w PBS (Dako). Szkiełka obrabiano tak jak opisano powyżej.

Hodowla wirusa MPV

Subkonfluentne jednowarstwowe komórki tMK w pożywkach jakie opisano powyżej, zaszczepiono supernatantami próbek, które wykazywały CPE po dwóch lub trzech pasażach w 24-studzienkowych płytkach. Hodowle sprawdzano pod względem CPE codziennie, a pożywki wymieniano raz w tygodniu. Ponieważ CPE był inny dla każdego izolatu, wszystkie hodowle testowano w dniu 12 do 14 za pomocą pośredniej IFA przy użyciu przeciwciał fretki przeciwko nowemu izolatowi wirusowemu. Hodowle pozytywne liofilizowano i rozpuszczano trzy razy, po czym supernatanty sklarowano przez wirowanie z niską prędkością, odmierzono równe ilości i przechowywano w stanie zamrożonym w temperaturze -70°C. 50% zakaźnych dawek hodowli tkankowej (TCID50) wirusa w supernatantach hodowlanych określono tak jak opisano¹⁶.

Test neutralizacji wirusa

Testy VN przeprowadzono z użyciem serii dwukrotnych rozcieńczeń ludzkich i zwierzęcych surowic, poczynając od rozcieńczenia ośmiokrotnego. Rozcieńczone surowice inkubowano przez jedną godzinę z 100 TCID50 wirusa przed posianiem komórek tMK hodowanych w 96-studzienkowych płytkach, po czym płytki wirowano z prędkością 840 x g. Pożywki wymieniono po trzech i sześciu dniach i prowadzono IFA z użyciem przeciwciał fretki przeciwko MPV 8 dni po posianiu. Miano VN określono

PL 213 926 B1 jako najniższe rozcieńczenie próbki surowicy dające negatywny wynik IFA i inhibicję CPE w hodowlach komórkowych.

Charakteryzacja wirusa

Przeprowadzono testy hemaglutynacji i wrażliwości na chloroform jak opisano^8,14. Dla analiz EM, wirusa zatężono z zakażonych supernatantów hodowli komórkowych w mikrowirówce w temperaturze 4°C przy prędkości 17000 x g, po czym osad ponownie zawieszono w PBS i sprawdzano za pomocą EM z negatywnym kontrastem. Do RAP-PCR wirusa zatężono z zakażonych supernatantów komórek tMK za pomocą ultrawirowania na poduszce z 60% sacharozy (2 godziny z prędkością 150000 x g, 4°C). Interfazę 60% sacharozy rozcieńczono następnie PBS i nalano na wierzch 20-60% ciągłego gradientu sacharozy, który wirowano przez 16 godzin z prędkością 275000 x g w temperaturze 4°C. Frakcje gradientu sacharozy badano na obecność cząstek podobnych do wirusa za pomocą EM i elektroforezy w żelu poIiakrylamidowym, następnie barwiono srebrem. Około 50% frakcji sacharozy, które jak się wydawało zawierały nukleokapsydy, wykorzystano do izolacji RNA i RAP-PCR.

Izolacja RNA

RNA wyizolowano z supernatantu zakażonych hodowli komórkowych lub frakcji gradientu sacharozy przy użyciu zestawu High Pure Isolation, zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Diagnostic, Almere, Holandia).

RT-PCR

Testy RT-PCR sekwencji nukleotydowych swoistych dla wirusa na znanych paramyksowirusach są opisane w dodatku 1. Przeprowadzono jednoetapową RT-PCR w 50 μΐ reakcjach zawierających mM Tris.HCl pH 8,5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 2 mM ditiotreitol, 20 μΜ każdego dNTP, 10 jednostek rekombinowanej RNAsin (Promega, Leiden, Holandia), 10 jednostek AMV RT (Promega, Leiden, Holandia), 5 jednostek polimerazy Amplitaq Gold DNA (PE Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel,

Holandia) i 5 μΐ RNA. Warunki cykli były następujące: 45 minut w temperaturze 42°C i 7 minut w temperaturze 95°C raz, 1 minuta w temperaturze 95°C, 2 minuty w temperaturze 42°C i 3 minuty w temperaturze 72°C powtórzone 40 razy i 10 minut w temperaturze 72°C raz.

RAP-PCR

RAP-PCR przeprowadzono zasadniczo jak opisano¹⁰. Sekwencje nukleotydowe są opisane w dodatku 2. Do reakcji RT wykorzystano 2 μl RNA w 10 μl środowiska reakcji zawierającego 10 ng^l oligonukleotydu, 10 mM ditiotreitol, 500 μl każdego dNTP, 25 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KCl i 3 mM MgCl2. Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 5 minut w temperaturze 70°C i 5 minut w temperaturze 37°C, po których dodano 200 jednostek enzymu Superscript RT (LifeTechnologies). Inkubację w temperaturze 37°C kontynuowano przez 55 minut i reakcję zakończono przez 5 minutową inkubację w temperaturze 72°C. Mieszaninę RT rozcieńczono uzyskując 50 μl mieszanin reakcyjnych PCR zawierających 8 ng^l oligonukleotydu, 300 μm każdego dNTP, 15 mM Tris-HCl pH 8,3, 65 mM KCl, 3,0 mM MgCl2 i 5 jednostek polimerazy Taq DNA (PE Biosystems). Warunki cykli były następujące: 5 minut w temperaturze 94°C, 5 minut w temperaturze 40°C i 1 minuta w temperaturze 72°C raz, po czym 1 minuta w temperaturze 94°C, 2 minuty w temperaturze 56°C i 1 minuta w temperaturze 72°C powtórzone 40 razy oraz 5 minut w temperaturze 72°C raz. Po RAP-PCR, 15 ml produktów RT-PCR uruchomiono obok siebie na żelu agarozowym NuSieve (FMC BioProdukcts, Heerhugowaard, Holandia) i klonowano w wektorze pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, Holandia) zgodnie z instrukcjami producenta.

Analiza sekwencji

Produkty RAP-PCR klonowane w wektorze pCR2.1 (Invitrogen) sekwencjonowano za pomocą oligonukleotydów swoistych dla M13. Fragmenty DNA otrzymane przez RT-PCR oczyszczono z żeli agarozowych przy użyciu zestawu Qiaquick Gel Extraction (Qiagen, Leusden, Holandia), i sekwencjonowano bezpośrednio z tymi samymi oligonukleotydami stosowanymi przy PCR. Analizy sekwencji przeprowadzono przy użyciu zestawu do terminacji sekwencjonowania Dyenamic ET (Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, Holandia) oraz automatycznego sekwenatora DNA ABI 373 (PE Biosystem). Wszystkie techniki przeprowadzano zgodnie z instrukcjami producenta.

Tworzenie fragmentów genomowych MPV za pomocą RT-PCR

Aby wytworzyć fragmenty PCR obejmujące przerwy A, B i C między fragmentami RAP-PCR (fig. 2) wykorzystaliśmy testy RT-PCR jak opisano przedtem, na RNA wyizolowanym z izolatu wirusowego 00-1. Stosowano następujące startery:

PL 213 926 B1

Dla fragmentu A: TR1 zaprojektowany w liderze: (5'-AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3' i N1 zaprojektowany na końcu 3' fragmentów RAP-PCR otrzymanych w N (5'-CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3').

Dla fragmentu B: N2 zaprojektowano na końcu 5' fragmentów RAP-PCR otrzymanych w N: (5'-CATGCAAGCTTATGGGGC-3') i M1 zaprojektowano na końcu 3' fragmentów RAP-PCR otrzymanych w M: (5'-CAGAGTGGTTATTGTCAGGGT-3').

Dla fragmentu C: M2 zaprojektowano na końcu 5' fragmentu RAP-PCR otrzymanego w M: (5'-GTAGAACTAGGAGCATATG-3' i F1 zaplanowano na końcu 3' fragmentów RAP-PCR otrzymanych w F: (5'-TCCCCAATGTAGATACTGCTTC-3').

Fragmenty oczyszczono z żelu, klonowano i sekwencjonowano jak opisano poprzednio.

RT-PCR do diagnozowania MPV

Do amplifikacji i sekwencjonowania części ORF N, M, F i L dziewięciu izolatów MPV, wykorzystaliśmy startery N3 (5'-GCACTCAAGAGATACCCTAG-3') i N4 (5'-AGACTTTCTGCTTTGCTGCCTG-3'), amplifikujące fragmenty o 151 nukleotydach, M3 (5'-CCCTGACAATAACCACTCTG-3') i M4 (5'-GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC-3') amplifikujące fragmenty o 252 nukleotydach, F7 (5'-TGCACTATCTCCTCTTGGGGCTTTG-3') oraz F8 (5'-TCAAAGCTGCTTGACACTGGCC-3') amplifikujący fragment o 221 nukleotydach, oraz L6 (5'-CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3') i 17 (5'-CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3') amplifikujący fragment o 173 nukleotydach, odpowiednio. RT-PCR, oczyszczanie żelu i bezpośrednie sekwencjonowanie przeprowadzono jak opisano powyżej. Ponadto, wykorzystano następujące sondy:

Sonda stosowana dla M: 5'-TGC TTG TAC TTC CCA AAG-3'

Sonda stosowana dla N: 5'-TAT TTG AAC AAA AAG TGT-3'

Sonda stosowana dla L: 5'-TGGTGTGGGATATTAACAG-3'

Analizy filogenetyczne

Dla wszystkich drzew filogenetycznych, sekwencje DNA dopasowano przy użyciu programu komputerowego ClustalW i wytworzono drzewa maksymalnego prawdopodobieństwa przy użyciu pakietu oprogramowania DNA-ML programu Phylip 3.5, stosując metodę „bootstrap” w 100 powtórze15 niach i 3 zamianach¹⁵. Wcześniej opublikowane sekwencje, które wykorzystano do tworzenia drzew filogenetycznych są dostępne w Genbank pod numerami dostępu: dla wszystkich ORF: hRSV: NC001781; bRSV: NC001989; dla ORF F: PVM, D11128; APV-A, D00850; APV-B, Y14292; APV-C, AF187152; dla ORF N: PVM, D10331; APV-A, U39295; APV-B, U39296; APV-C, AF176590; dla ORF M: PVM, U66893; APV-A, X58639; APV-B, U37586; APV-C, AF262571; dla ORF P: PVM, 09649; APV-A, U22110, APV-C, AF176591. Analizy filogenetyczne dla dziewięciu różnych izolatów wirusowych MPV przeprowadzono z użyciem APV szczepu C jako grupy zewnętrznej.

Skróty stosowane w ilustracjach: hRSV: ludzki RSV; bRSV: bydlęcy RSV; PVM: wirus zapalenia płuc myszy; APV-A, B i C: ptasi pneumowirus typu A, B i C.

Przykłady i metody identyfikacji MPV

Kolekcjonowanie próbek

Aby znaleźć izolaty wirusowe, powinno się przebadać aspiraty nosowo-gardłowe, wymazy gardłowe i nosowe, płukania oskrzelowo-pęcherzykowe dogodnie od ssaków, takich jak ludzie, ssaki mięsożerne (psy, koty, łasicowate, foki itd.), konie, przeżuwacze (bydło, owce, kozy itd.), świnie, króliki, ptaki (drób, strusie, itd.). Od ptaków można również zbadać wymazy i płukanki kloaki. Należy zebrać surowice do testów immunologicznych, takich jak ELISA i testy neutralizacji wirusa.

Zebrane próbki wirusa rozcieńczono 5 ml pożywki Dulbecco MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) i dokładnie wymieszano w mieszalniku typu vortex przez jedną minutę. Zawiesinę wirowano następnie przez dziesięć minut z prędkością 840 x g. Osad rozprowadzono na szkiełku z wieloma zagłębieniami (Nutacon, Leimuiden, Holandia) do testów immunofluorescencyjnych, a supernatant wykorzystano do izolacji wirusa.

Izolacja wirusa

Do izolacji wirusa komórki tMK (RIVM, Bilthoven, Holandia) hodowano w 24-studzienkowych płytkach, zawierających szklane szkiełka (Costar, Cambridge, UK), z pożywką opisaną poniżej, uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (BioWhittaker, Vervier, Belgia). Przed posianiem, płytki przemyto PBS i zaopatrzono w MEM Eagle'a z solą Hank'a (ICN, Costa Mesa, CA) uzupełnionych 0,52 g/litr NaHCO3, 0,025 M Hepes (Biowhittaker), 2 mM L-glutaminy (Biowhittaker), 200 jednostkami/litr penicyliny, 200 mg/litr streptomycyny (Biowhittaker), 1 gramem/litr laktoalbuminy (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Holandia), 2,0 gramami/litr D-glukozy (Merck, Amsterdam, Holandia), 10 gramami/litr

PL 213 926 B1 peptonu (Oxoid, Haarlem, Holandia) i 0,02% trypsyną (Life Technologies, Bethesda, MD). Płytki posiano supernatantem z próbek aspiratu nosowo-gardłowego, 0,2 ml na studzienkę, w trzech powtórzeniach, następnie wirowano z prędkością 840 x g przez jedną godzinę. Po posianiu płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez maksimum 14 dni, zmieniając pożywkę raz w tygodniu i hodowle sprawdzano codziennie pod względem CPE. Po 14 dniach komórki zeskrobano z drugiego pasażu i inkubowano 14 dni. Etap ten powtórzono do trzeciego pasażu. Szkiełka szklane wykorzystano do zademonstrowania obecności wirusa przez pośrednią IFA, jak opisano poniżej.

CPE obserwowano generalnie po trzecim pasażu, w dniu 8 do 14 w zależności od izolatu. CPE był rzeczywiście nie do odróżnienia od wywoływanego przez hRSV i hPIV w komórkach tMK lub innych hodowlach komórkowych. Jednakże hRSV indukuje CPE poczynając od około 4 dnia. CPE charakteryzował się tworzeniem syncytiów, po którym komórki wykazały gwałtowne rozbicie wewnętrzne, po czym oderwanie od komórek z monowarstwy. Dla niektórych izolatów CPE był trudny do zauważenia i korzystano z IFA aby potwierdzić obecność wirusa w tych hodowlach.

Hodowla wirusa MPV

Subkonfluentne komórki tMK w monowarstwie w pożywkach jakie opisano powyżej, zaszczepiono supernatantami próbek, które wykazywały CPE po dwóch lub trzech pasażach w 24-studzienkowych płytkach. Hodowle codziennie sprawdzano pod względem CPE, a pożywki wymieniano raz w tygodniu. Ponieważ CPE był inny dla każdego izolatu, wszystkie hodowle testowano w dniu 12 do 14 za pomocą pośredniej IFA przy użyciu przeciwciał fretki przeciwko nowemu izolatowi wirusowemu. Hodowle pozytywne liofilizowano i rozpuszczano trzy razy, po których supernatanty klarowano przez wirowanie z niską prędkością, odmierzono równe ilości i przechowywano w stanie zamrożonym w temperaturze -70°C. 50% zakaźnych dawek hodowli tkankowej (TCID50) wirusa w supernatantach hodowlanych określono tak jak opisano¹⁶.

Charakterystyka wirusa

Przeprowadzono testy hemaglutynacji i wrażliwości na chloroform postępując zgodnie z dobrze 14 ustalonymi i opisanymi technikami stosowanymi w dziedzinie¹⁴. Do analiz EM wirus zatężono z supernatantów zakażonych hodowli komórkowych w mikrowirówce w temperaturze 4°C przy prędkości 17000 x g, po czym osad ponownie zawieszono w PBS i badano za pomocą EM z negatywnym kontrastem.

Wykrywanie antygenu za pomocą pośredniej IFA

Zebrane próbki opracowywano tak jak opisano, a osad próbek rozprowadzono na szkiełku z wieloma zagłębieniami. Po wysuszeniu, komórki utrwalono w acetonie przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.

Alternatywnie, wirusa hodowano na komórkach tMK w 24-studzienkowych płytkach zawierających szklane szkiełka. Te szklane szkiełka przemyto PBS i utrwalono w acetonie przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.

Po przemyciu PBS szkiełka inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C z przeciwciałami poliklonalnymi w rozcieńczeniu 1:50 do 1:100 w PBS. Wykorzystaliśmy immunizowane fretki i świnki morskie do otrzymania przeciwciał poliklonalnych, lecz te przeciwciała można wzbudzić u różnych zwierząt, a rozcieńczenie robocze przeciwciała poliklonalnego może się zmieniać dla każdej immunizacji. Po trzech przemyciach PBS i jednym przemyciu wodą z kranu, szkiełka inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut ze znakowanymi FITC, kozimi przeciwciałami anty-fretkowymi (KPL, Guilford, UK, rozcieńczenie 40-krotne). Po trzech przemyciach w PBS i jednym w wodzie z kranu, szkiełka włożono do roztworu glicerol/PBS (Citifluor, UKC, Canterbury, UK) i przykryto. Szkiełka analizowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Axioscop (Carl Zeiss B.V., Weesp, Holandia).

Wykrywanie przeciwciał u ludzi, ssaków, przeżuwaczy i innych zwierząt za pomocą pośredniej IFA

Do wykrywania przeciwciał swoistych dla wirusa, komórki tMK zakażone MPV utrwalono acetonem na szkiełkach przykrywkowych (jak opisano powyżej), przemyto PBS i inkubowano 30 minut w temperaturze 37°C z próbkami surowicy w rozcieńczeniu 1 do 16. Po dwóch przemyciach PBS i jednym wodą z kranu, szkiełka inkubowano 30 minut w temperaturze 37°C ze znakowanymi FITC, wtórnymi przeciwciałami przeciwko użytemu gatunkowi (Dako). Szkiełka poddawano obróbce tak jak opisano powyżej.

Przeciwciała można wyznakować bezpośrednio barwnikiem fluorescencyjnym, co da w efekcie bezpośredni test immunofluorescencyjny. FITC można zastąpić jakimkolwiek barwnikiem fluorescencyjnym.

Immunizacja zwierzęcia

U fretki i świnki morskiej wytworzono surowice odpornościowe swoiste dla nowo odkrytego wirusa, przez doświadczalne donosowe zakażenie dwóch fretek wolnych od swoistych patogenów

PL 213 926 B1 i dwóch świnek morskich, utrzymywanych w oddzielnych ciśnieniowych komorach rękawicowych. Dwa do trzech tygodni potem wszystkie zwierzęta skrwawiano przez nakłucie sercowe, a ich surowice wykorzystano jako surowice odniesienia. Surowice testowano pod względem wszystkich wcześniej opisanych wirusów za pomocą pośredniej IFA jak opisano poniżej. Inne gatunki zwierząt są także odpowiednie do tworzenia preparatów swoistego przeciwciała i można wykorzystać inne preparaty antygenowe.

Test neutralizacji wirusa (test VN)

Testy VN przeprowadzono z użyciem serii dwukrotnych rozcieńczeń ludzkich i zwierzęcych surowic, poczynając od rozcieńczenia ośmiokrotnego. Rozcieńczone surowice inkubowano przez jedną godzinę z 100 TCID50 wirusa przed posianiem komórek tMK hodowanych w 96-studzienkowych płytkach, po czym płytki wirowano z prędkością 840 x g. Pożywki wymieniono po trzech i sześciu dniach i prowadzono IFA (patrz powyżej). Miano VN określono jako najniższe rozcieńczenie próbki surowicy dające negatywną IFA i inhibicję CPE w hodowlach komórkowych.

Izolacja RNA

RNA wyizolowano z supernatantów zakażonych hodowli komórkowych lub frakcji gradientu sacharozy, przy użyciu zestawu High Pure RNA Isolation, zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Diagnostic, Almere, Holandia). RNA można także wyizolować postępując zgodnie z innymi procedurami znanymi w technice (Current Protocols in Molecular Biology).

RT-PCR

Przeprowadzono jednoetapową RT-PCR w 50 pl reakcjach zawierających 50 mM Tris.HCl pH 8,5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 2 mM ditiotreitol, 200 μΜ każdego dNTP, 10 jednostek rekombinowanej RNAsin (Promega, Leiden, Holandia), 10 jednostek AMV RT (Promega, Leiden, Holandia), 5 jednostek polimerazy Amplitaq Gold DNA (PE Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel, Holandia) i 5 pl RNA. Warunki cykli były następujące: 45 minut w temperaturze 42°C i 7 minut w temperaturze 95°C raz, 1 minuta w temperaturze 95°C, 2 minuty w temperaturze 42°C i 3 minuty w temperaturze 72°C powtórzone 40 razy i 10 minut w temperaturze 72°C raz.

Startery użyte do diagnostycznej PCR:

Dla nukleoproteiny: N3 (5'-GCACTCAAGAGATACCCTAG-3') i N4 (5'-AGACTTTCTGCTTTGCTGCCTG-3'), amplifikujące fragmenty o 151 nukleotydach.

Dla białka macierzy: M3 (5'-CCCTGACAATAACCACTCTG-3') i M4 (5'-GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC-3') amplifikujące fragmenty o 252 nukleotydach.

Dla białka polimerazy: L6 (5'-CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3') i L7 (5'-CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3') amplifikujący fragment o 173 nukleotydach.

Można zaprojektować inne startery na podstawie sekwencji MPV, i do konkretnych celów można użyć innych buforów i warunków testu.

Analiza sekwencji

Analizy sekwencji przeprowadzono przy użyciu zestawu do terminacji sekwencjonowania Dyenamic ET (Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, Holandia oraz automatycznego sekwenatora

DNA ABI 373 (Pe Biosystem). Wszystkie techniki przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta.

Fragmenty PCR sekwencjonowano bezpośrednio z użyciem tych samych oligonukleotydów, które wykorzystano do PCR albo fragmenty oczyszczono z żelu za pomocą zestawu Qiaquick Gel Extraction (Qiagen, Leusden, Holandia) i klonowano w wektorze pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, Holandia) zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie sekwencjonowano za pomocą oligonukleotydów swoistych dla M13.

Oligonukleotydy stosowane do analizowania końca 3' genomu (brak NS1/NS2)

Zaprojektowano starter TR1 (5'-AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3') na podstawie opublikowanych sekwencji trailera i lidera dla hRSV i APV, opublikowanych przez Randhawa (1997) oraz starter N1 (5'-CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3') zaprojektowano na podstawie sekwencji w białku N. Test RT-PCR i sekwencjonowanie przeprowadzono tak jak opisano powyżej.

W wyniku RT-PCR otrzymano produkt długości około 500 par zasad, który jest zbyt mały aby zawierał informacje dla dwóch ORF, a translacja tych sekwencji nie ujawniła żadnych ORF.

Wykrywanie przeciwciała u ludzi, ssaków, przeżuwaczy i innych zwierząt za pomocą ELISA

U Paramyxoviridae, białko N jest najpowszechniej występującym białkiem, a odpowiedź odpornościowa na to białko pojawia się we wczesnej fazie infekcji. Z tych powodów, do opracowania testu ELISA do wykrywania przeciwciał wobec MPV wykorzystuje się korzystnie rekombinowane źródło białek N. Antygeny odpowiednie do wykrywania przeciwciał obejmuje każde białko MPV, które łączy się z każdym przeciwciałem swoistym wobec MPV, od pacjenta, który zetknął się lub jest zakażony

PL 213 926 B1 wirusem MPV. Zalecane antygeny według wynalazku obejmują te, które przede wszystkim wywołują odpowiedź odpornościową u pacjentów, którzy zetknęli się z MPV, które zatem, zwykle są najłatwiej rozpoznawane przez przeciwciała pacjenta. Szczególnie zalecane antygeny obejmują białka N, F i G MPV. Antygeny stosowane w technikach immunologicznych mogą być antygenami natywnymi albo mogą być ich wersjami zmodyfikowanymi. Do zmiany sekwencji aminokwasowej antygenu MPV można stosować dobrze znane techniki biologii molekularnej, aby wytworzyć zmodyfikowane wersje antygenu, jaki można wykorzystać w technikach immunologicznych. Metody klonowania genów, do manipulacji genami do i z wektorów ekspresji, oraz do ekspresji białka kodowanego przez gen w heterologicznym gospodarzu, są dobrze znane i te techniki można wykorzystać do dostarczenia wektorów ekspresyjnych, komórek gospodarza, oraz do ekspresji klonowanych genów kodujących antygeny w gospodarzu, aby wytworzyć rekombinowane antygeny do zastosowania w testach diagnostycznych. Patrz np.: Molecular clining, A laboratory manual oraz Current Protocols in Molecular Biology. Do wytworzenia antygenów MPV można stosować rozmaite układy ekspresji. Przykładowo, opisano rozmaite wektory ekspresyjne odpowiednie do wytwarzania białek w E.coli, B.subtilis, drożdżach, komórkach owadów i komórkach ssaczych, z których każdy można użyć do wytworzenia antygenu odpowiedniego do wykrywania przeciwciała anty-MPV u eksponowanych pacjentów.

Układ ekspresji bakulowirusa ma tę zaletę, że zapewnia konieczną obróbkę białek, i z tego powodu jest zalecany. Układ wykorzystuje promotor polihedrynowy do kierowania ekspresją antygenów MPV. (Matsuura i inni, 1987, J. Gen. Virol. 68: 1233-1250).

Antygeny wytworzone przez rekombinowane bakulowirusy można wykorzystać w rozmaitych testach immunologicznych do wykrywania przeciwciał anty-MPV u pacjenta. Wiadomo, że antygeny rekombinowane można stosować zamiast naturalnego wirusa w praktycznie każdym teście immunologicznym do wykrywania przeciwciał swoistych dla wirusa. Testy obejmują testy bezpośrednie i pośrednie, testy kapankowe, testy w fazie stałej, takie jak te, które wykorzystują między innymi płytki lub paciorki, oraz testy w fazie ciekłej. Odpowiednie testy obejmują te, które wykorzystują przeciwciała pierwotne i wtórne oraz te, które wykorzystują odczynniki wiążące przeciwciało, takie jak białko A. Ponadto, w wynalazku można stosować rozmaite metody wykrywania, łącznie z metodami kolorymetrycznymi, fluorescencyjnymi, fosforescencyjnymi, chemiluminescencyjnymi, luminescencyjnymi i radioaktywnymi.

P r z y k ł a d 1 pośredniej EIA IgG anty-MPV przy użyciu rekombinowanego białka N

Przeprowadzić można pośrednią EIA IgG przy użyciu rekombinowanego białka N (wytworzonego za pomocą rekombinowanego bakulowirusa w komórkach owadzich (Sf9)) jako antygenu. Aby wytworzyć antygen, komórki Sf9 zakażono rekombinowanym bakulowirusem i zebrano 3-7 dni po infekcji. Zawiesinę komórkową przemyto dwukrotnie w PBS, pH 7,2, wyregulowaną do gęstości komórek wynoszącej 5,0 x 10⁶ komórek/ml oraz zamrażano i rozmrażano trzy razy. Wielki osad resztek komórkowych osadzono przez wirowanie z niską prędkością (500 x g przez 15 minut) i supernatant zebrano i przechowywano w temperaturze -70°C do użycia. Komórki niezakażone poddaje się podobnym procesom aby uzyskać antygen kontroli negatywnej.

100 μΐ rozmrożonego lizatu stosuje się do powleczenia płytek do mikromiareczkowania, w rozcieńczeniach w zakresie od 1:50 do 1:1000. Lizat komórek niezakażonych prowadzi się w studzienkach w dwóch powtórzeniach i służy on jako kontrola negatywna. Po całonocnej inkubacji płytki przemywa się dwukrotnie mieszaniną PBS/0,05% Tween. Testowane surowice rozcieńcza się 1:50 do 1:200 w buforze ELISA (PBS uzupełniony 2% normalną surowicą kozią oraz 0,5% albuminą surowicy bydlęcej i 0,1% mlekiem), po czym inkubuje studzienki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.

Płytki przemywa się dwa razy mieszaniną PBS/0,05% Tween. Do studzienek dodaje się, rozcieńczoną 1:3000 do 1:5000 w buforze ELISA, kozią anty-ludzką (albo przeciwko innemu gatunkowi) IgG wyznakowaną peroksydazą chrzanową, i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Następnie płytki przemywa się dwa razy mieszaniną PBS/0,05% Tween i raz wodą z kranu, inkubuje przez 15 minut w temperaturze pokojowej z substratem enzymu TMB, 3,3'5,5'-tetrametylobenzydyną, taką jak otrzymaną od Sigma, i reakcję zatrzymuje się za pomocą 100 μΐ 2 M kwasu fosforowego. Odczyty kolorymetryczne mierzy się przy 450 nm z użyciem automatycznego czytnika płytek do mikromiareczkowania.

P r z y k ł a d 2: Wychwytująca EIA IgM anty-MPV przy użyciu rekombinowanej nukleoproteiny

Można przeprowadzić EIA z wychwytem IgM przy użyciu rekombinowanej nukleoproteiny lub jakiegokolwiek innego rekombinowanego białka jako antygenu, przez modyfikację testów opisanych wcześniej przez Erdman i innych (1990) J. Clin. Microb. 29: 1466-1471.

PL 213 926 B1

Oczyszczone przez powinowactwo wychwytujące przeciwciało, anty-ludzka IgM (albo przeciwko innemu gatunkowi), takie jak otrzymane od Dako, dodaje się do studzienek płytki do mikromiareczkowania, w stężeniu wynoszącym 250 ng na studzienkę, w 0,1 M buforze węglanowym, pH 9,6. Po całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej, płytki przemywa się dwa razy w mieszaninie PBS/0,05% Tween. 100 pl testowej surowicy rozcieńczonej 1:200 do 1:1000 w buforze ELISA, dodaje się do studzienek w trzech powtórzeniach i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Następnie płytki przemywa się następnie dwukrotnie mieszaniną PBS/0,05% Tween.

Rozmrożony (zakażony rekombinowanym wirusem) lizat komórkowy Sf9 rozcieńcza się 1:100 do 1:500 w buforze ELISA, dodaje do studzienek i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Niezakażony lizat komórkowy służy jako kontrola negatywna i prowadzi się go w studzienkach dwóch powtórzeniach. Następnie płytki przemywa się trzy razy mieszaniną PBS/0,05% Tween i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze 37°C z 100 pl poliklonalnego przeciwciała przeciwko MPV w optymalnym rozcieńczeniu w buforze ELISA. Po 2 płukaniach mieszaniną PBS/0,05% Tween, płytki inkubuje się z wyznakowanym peroksydazą chrzanową wtórnym przeciwciałem (takim jak królicze antyfretkowe) i płytki inkubuje 20 minut w temperaturze 37°C.

Następnie płytki przemywa się pięć razy w mieszaninie PBS/0,05% Tween, inkubuje przez 15 minut w temperaturze pokojowej z substratem enzymowym TMB, 3,3'5,5'-tetrametylobenzydyną, jaką np. otrzymano od Sigma, i reakcję zatrzymuje się za pomocą 100 pl 2 M kwasu fosforowego. Odczyty kolorymetryczne mierzy się w 450 nm przy użyciu automatycznego czytnika płytek do mikromiareczkowania.

Wrażliwości EIA z wychwytem IgM przy użyciu rekombinowanej nukleoproteiny (albo innego rekombinowanego białka) i całego wirusa MPV porównuje się przy użyciu par surowic fazy ostrej i ozdrowieńczej od osób z kliniczną infekcją wirusem MPV. Swoistość EIA z wychwytem rekombinowanej nukleoproteiny określa się przez testowanie próbek surowicy od zdrowych osób i osób z innymi infekcjami paramyksowirusowymi.

Możliwości EIA do zastosowania rekombinowanych białek fuzyjnych i glikoprotein MPV wytworzonych przez ekspresję w bakulowirusie

Glikoproteiny G i F są dwoma transbłonowymi glikoproteinami otoczkowymi wirionu MPV i reprezentują główne antygeny neutralizujące i zabezpieczające. Ekspresja tych glikoprotein w układzie wektora wirusowego, takim jak układ bakulowirusa, zapewnia źródło rekombinowanych antygenów do zastosowania w testach do wykrywania przeciwciała swoistych wobec MPV. Ponadto, ich stosowanie w połączeniu np. z nukleoproteiną dodatkowo wzmacnia wrażliwość enzymatycznych testów immunologicznych przy wykrywaniu przeciwciała przeciwko MPV.

Jako alternatywne metody wobec tych tu opisanych wykorzystać można rozmaite testy immunologiczne (Current Protocols in Immunology).

Aby znaleźć izolaty wirusa, należy zbadać aspiraty nosowo-gardłowe, wymazy gardłowe i nosowe, płukania oskrzelowo-pęcherzykowe od, między innymi, ssaków, takich jak ludzie, ssaków mięsożernych (psy, koty, łasicowate, foki itd.), koni, przeżuwaczy (bydło, owce, kozy itd.), świń, królików, ptaków (drób, strusie, itd.). Od ptaków można również zbadać wymazy i płukanki kloaki. W przypadku wszystkich próbek, w celu wykrywania wirusa można przeprowadzić techniki serologiczne (wykrywanie przeciwciała i antygenu itd.), izolacji wirusa i wykrywanie kwasu nukleinowego).

Przeciwciała monoklonalne można wytworzyć przez immunizację myszy (lub innych zwierząt) oczyszczonym MPV lub jego częściami (białkami, peptydami) i następnie stosowanie ustalonej technologii hybrydomy (Current protocols in Immunology). Alternatywnie, do tego celu można wykorzystać technologię prezentacji na fagu (Current protocols in Immunology). Podobnie można otrzymać przeciwciała poliklonalne, od zakażonych ludzi lub zwierząt, albo od immunizowanych ludzi lub zwierząt (Current protocols in Immunology).

Wykrywanie obecności lub braku obecności białek NS1 i NS2 można przeprowadzić przy użyciu western-blotting, IFA, technik immunoprecypitacji, stosując rozmaite preparaty przeciwciał. Wykrywanie obecności lub braku obecności genów NS1 i NS2 lub ich homologów w izolatach wirusowych można przeprowadzić przy użyciu PCR ze zbiorami starterów zaprojektowanych na podstawie znanych genów NS1 i/lub NS2, jak również rozmaitymi technikami hybrydyzacji kwasów nukleinowych.

Aby określić, czy geny NS1 i NS2 są obecne na końcu 3' genomu wirusowego, można przeprowadzić PCR ze starterami swoistymi wobec tego końca 3' genomu. W naszym przypadku, wykorzystaliśmy starter swoisty dla regionu 3' niepoddawanego translacji genomu wirusowego i starter w ORF N. W tym samym celu można zaprojektować inne startery. Brak obecności genów NS1/NS2 ujawnia się przez długość i/lub sekwencję nukleotydową produktu PCR. Startery swoiste dla genów NS1 i/lub NS2

PL 213 926 B1 można stosować w kombinacji ze starterami swoistymi dla innych części końca 3' genomu wirusa (tak jak region niepoddawany translacji albo ORF N, M lub F) pozwalającymi na pozytywną identyfikację obecności genów NS1 lub NS2. Oprócz PCR do tego celu można wykorzystać rozmaite techniki, takie jak klonowanie molekularne, hybrydyzacja kwasu nukleinowego.

P r z y k ł a d 3: Różne serotypy/podgrupy MPV

Przez analizy częściowych sekwencji nukleotydowych w ORF N, M, F i L 9 izolatów wirusowych identyfikuje się dwa potencjalne ugrupowania genetyczne. Wewnątrz ugrupowania obserwowano 90-100% identyczności, a 81-88% identyczności obserwowano między ugrupowaniami. Informacje o sekwencji otrzymane na większej ilości izolatów potwierdziły istnienie dwóch genotypów. Aby przetestować czy genotypy są spokrewnione z innymi serotypami lub podgrupami w testach neutralizacji krzyżowej wykorzystano izolat wirusowy ned/00/01 jako prototyp ugrupowania A i izolat wirusowy ned/99/01 jako prototyp ugrupowania B.

Wyniki

Wykorzystując testy RT-PCR ze starterami położonymi w genie polimerazy, zidentyfikowaliśmy 30 dodatkowych izolatów wirusowych z próbek aspiratów nosowo-gardłowych. Informacje o sekwencji części genów macierzy i polimerazy tych nowych izolatów, razem z tymi od wcześniejszych 9 izolatów, wykorzystaliśmy do skonstruowania drzew filogenetycznych (fig. 16). Analizy tych drzew potwierdziły obecność dwóch ugrupowań genetycznych, z izolatem wirusowym ned/00/01 jako prototypem ugrupowania A i izolatem wirusowym ned/99/01 jako prototypem ugrupowania B. Identyczność sekwencji nukleotydowej wewnątrz grupy wynosiła ponad 92%, podczas gdy między ugrupowaniami identyczność wynosiła 81-85%.

Izolaty wirusowe ned/00/01 i ned/99/01 zostały wykorzystane do szczepienia fretek aby wzbudzić surowice odpornościowe swoiste wobec wirusa. Te surowice odpornościowe wykorzystano w testach neutralizacji wirusa dla obu wirusów.

T a b l i c a 3: Miana neutralizacji wirusa

	Izolat 00-1	Izolat 99-1
Surowica wstępna Fretka A (00-1)	2	2
Fretka A 22 dpi (00-1)	64	2
Surowica wstępna Fretka B (99-1)	2	2
Fretka B 22 dpi (99-1)	4	64

Dla izolatu 00-1 miano różni się 32 (64/2) razy Dla izolatu 99-1 miano różni się 16 (64/4) razy

Oprócz tego, zaszczepiono 6 świnek morskich każdym jednym z wirusów (ned/00/01 ned/99/01). Testy RT-PCR próbek aspiratów nosowo-gardłowych wykazały replikację wirusa od dnia do dnia 10 po zakażeniu. W dniu 70 po zakażeniu świnki morskie zostały poddane prowokacji homologicznym albo heterologicznym wirusem i dla wszystkich czterech przypadków zanotowano replikację wirusa.

T a b l i c a 4

	Pierwotna infekcja	Replikacja wirusa	Wtórna infekcja	Replikacja wirusa
Świnka morska 1-3	00-1	2 z 3	99-1	1 z 2
Świnka morska 4-6	00-1	3 z 3	00-1	1 z 3
Świnka morska 7-9	99-1	3 z 3	00-1	2 z 2
Świnka morska 10-12	99-1	3 z 3	99-1	1 z 3

uwaga: dla wtórnej infekcji nie było już świnki morskiej 2 i 9.

PL 213 926 B1

Testy neutralizacji wirusa z surowicami odpornościowymi po pierwszej prowokacji wykazały zasadniczo takie same wyniki jak w testach VN przeprowadzonych z fretkami (>16-krotna różnica miana VN).

Wyniki przedstawione w tym przykładzie potwierdzają istnienie dwóch genotypów, które odpowiadają dwóm serotypom MPV, i pokazują możliwość powtórnej infekcji heretologicznym i homologicznym wirusem.

P r z y k ł a d 4: Dalsze określenie sekwencji

Przykład ten opisuje dodatkową analizę sekwencji otwartych ramek odczytu (ORF) i sekwencji międzygenowych, jak również częściowych sekwencji końców genomu.

Analizy sekwencji genów nukleoproteiny (N), fosfoproteiny (F), białka macierzy (M) i białka fuzyjnego (F) MPV ujawniły najwyższy stopień homologii sekwencji z APV serotypu C, ptasim pneumowirusem występującym przede wszystkim u ptaków w Stanach Zjednoczonych. Analizy te ujawniły także brak obecności nie-strukturalnych białek NS1 i NS2 na końcu 3' genomu wirusa i umiejscowienie białka fuzyjnego tuż obok białka macierzy. Tutaj prezentujemy sekwencje genów białka o 22K (M2), małego hydrofobowego białka (SH), białka przylegania (G) i białka polimerazy (L), regiony międzygenowe i sekwencję trailerową. W połączeniu z sekwencjami opisanymi wcześniej, sekwencje prezentowane tutaj dopełniają sekwencji genomowej MPV z wyjątkiem najdalszych 12-15 nukleotydów końca genomu i ustalają organizację genomu MPV. Wraz z porównaniami sekwencji genomu MPV z tymi z APV podtypu A, B i C, RSV podtypu A i B, PVM i innych paramyksowirusów, dostarcza się silnego dowodu na klasyfikację MPV w rodzaju Metapneumovirus.

Wyniki

Strategia sekwencji

Izolat MPV 00-1 (van den Hoogen i inni, 2001) namnożono w trzeciorzędowych małpich komórkach nerki (tMK), a RNA wyizolowany z supernatantów 3 tygodnie po posianiu wykorzystano jako matryce do analiz RT-PCR. Startery zaprojektowano na podstawie częściowej informacji o sekwencji dostępnej dla MPV 00-1 (van den Hoogen i inni, 2001), jak również sekwencji liderowych i trailerowych APV i RSV (Randhawa i inni, 1997; Mink i inni, 1991). Początkowo wytworzono fragmenty między wcześniej otrzymanymi produktami, o wielkości w zakresie od 500 p.z. do 4 Kb długości, za pomocą amplifikacji RT-PCR i bezpośrednio sekwencjonowano. Sekwencję genomową potwierdzono następnie przez utworzenie serii nakładających się fragmentów RT-PCR o wielkości w zakresie od 500 do 800 p.z., które reprezentowały cały genom MPV. Dla wszystkich fragmentów PCR, obie nici sekwencjonowano bezpośrednio aby zminimalizować błędy amplifikacji i sekwencjonowania. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe wykorzystano do przeszukiwania pod względem homologii z sekwencjami w bazie danych Genbank, przy użyciu programu BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Nazwy białek przypisano otwartym ramkom odczytu (ORF) na podstawie homologii ze znanymi genami wirusowymi, jak również ich położenia w genomie. Na podstawie tej informacji skonstruowano mapę genomową MPV (fig. 7). Genom MPV ma długość 13378 nukleotydów i jego organizacja jest podobna do organizacji genomu APV. Poniżej przedstawiamy porównanie między ORFami i sekwencjami niekodującymi MPV i innych paramyksowirusów oraz omawiamy istotne podobieństwa i różnice.

Gen nukleoproteiny (N)

Jak pokazano, pierwszy gen w mapie genomu MPV koduje białko o 394 aminokwasach (aa) i wykazuje dużą homologię z białkiem N innych pneumowirusów. Długość ORF N jest identyczna jak długość ORF N APV-C (tablica 5) i jest mniejsza niż u innych paramyksowirusów (Barr i inni, 1991). Analiza sekwencji aminokwasowej ujawniła najwyższą homologię z APV-C (88%) i tylko 7-11% z innymi paramyksowirusami (tablica 6).

Barr i inni, zidentyfikował 3 regiony podobieństwa między wirusami należącymi do rzędu Mononegavirales: A, B i C (fig. 8). Chociaż podobieństwa są najwyższe w rodzinie wirusa, regiony te są wysoce zakonserwowane między rodzinami wirusów. We wszystkich trzech regionach MPV ujawnia 97% identyczności sekwencji aa z APV-C, 89% z APV-B, 92% z APV-A i 66-73% z RSB i PVM. Region między resztami aa 160 i 340 jak okazuje się wysoce zakonserwowany wśród metapneumowirusów i w nieco mniejszym stopniu Pneumovirinae (Miyahara i inni, 1992; Li i inni, 1996; Barr i inni, 1991). Zgadza się to z przynależnością MPV do metapneumowirusów, wykazując 100% podobieństwa z APV C.

Gen fosfoproteiny (P)

Druga ORF w mapie genomu koduje białko o 294 aa, które dzieli 68% homologii sekwencji aa z białkiem P APV-C i tylko 22-26% z białkiem P RSV (tablica 6). Gen P MPV zawiera jedną podstaPL 213 926 B1 wową ORF i z tego względu jest podobny do P wielu innych paramyksowirusów (przegląd Lamb i Kolakofsky, 1996; Sedlmeier i inni, 1998).

W przeciwieństwie do APV A i V oraz PVM, a podobnie jak RSV i APV-C, ORF P MPV nie posiada reszt cysteinowych. Ling (1995) sugerował, że region o wysokim podobieństwie między wszystkimi pneumowirusami (aa 185-241) odgrywa rolę albo w syntezie RNA albo w utrzymywaniu integralności strukturalnego kompleksu nukleokapsydu. Ten region o wysokim podobieństwie występuje także u MPV (fig. 9) zwłaszcza jeśli bierze się pod uwagę substytucje konserwatywne, wykazując 100% podobieństwa z APV-C, 93% z APV-A i B, oraz około 81% z RSV. Koniec C białka P MPV jest bogaty w reszty glutaminianowe jak opisano dla APV (Ling i inni, 1995).

Gen białka macierzy (M)

Trzecia ORF genomu MPV koduje białko o 254 aa, co przypomina ORF M innych pneumowirusów. ORF M MPV ma dokładnie taką samą wielkość jak ORF M innych metapneumowirusów (tablica 5) i wykazuje wysoką homologię sekwencji aa z białkami macierzy APV (78-87%), niższą homologię z RSV i PVM (37-38%) i 10% lub mniejszą homologię z innymi paramyksowirusami (tablica 6).

Easton (1997) porównał sekwencje białek macierzy wszystkich pneumowirusów i znalazł zakonserwowany heptapeptyd przy reszcie 14 do 19, który jest także zakonserwowany u MPV (fig. 10). Dla RSV, PVM i APV zidentyfikowano małe, drugorzędowe ORF wewnątrz albo nakładające się na główną ORF M (52 aa i 51 aa u bRSV, 75 aa u RSV, 46 aa u PVM i 51 aa u APV) (Yu i inni, 1992; Easton i inni, 1997; Samal i inni, 1991; Satake i inni, 1984). Zauważyliśmy dwie małe ORF w ORF M MPV. Jedna mała ORF o 54 resztach aa znajdowała się wewnątrz głównej ORF M (fragment 1, fig. 7), zaczynając od nukleotydu 2281 i jedna mała ORF o 33 resztach aa nakładała się na główną ORF M, zaczynając od nukleotydu 2893 (fragment 2, fig. 7). Podobnie do drugorzędowe ORF RSV i APV, nie ma istotnej homologii między tymi drugorzędowymi ORF i drugorzędowymi ORF innych pneumowirusów, a widoczne sygnały start i stop nie występują. Oprócz tego, nie opisano dowodu na syntezę białek odpowiadających tym drugorzędową ORF APV i RSV.

Gen białka fuzyjnego (F)

ORF F MPV zlokalizowana jest w sąsiedztwie ORF M, co jest charakterystyczne dla członków rodzaju Metapneumovirus. Gen F MPV koduje białko o 539 aa, które jest dłuższe o dwa aa od F APV-C (tablica 5). Analiza sekwencji aa ujawniła 81% homologii z APV-C, 67% z APV-A i B, 33-39% z białkami F pneumowirusów i tylko 10-18% z innymi paramyksowirusami (tablica 6). Jedną z zakonserwowanych cech wśród białek F paramyksowirusów, i widoczną także u MPV, jest rozmieszczenie reszt cysteinowych (Morrison, 1988; Yu i inni, 1991). Metapneumowirusy dzielą 12 reszt cysteinowych w F1 (7 jest zakonserwowanych wśród wszystkich paramyksowirusów) i dwa w F2 (1 jest zakonserwowany wśród wszystkich paramyksowirusów). Z 3 potencjalnych miejsc N-glikozylacji występujących w ORF F MPV żadna nie występuje u RSV, a dwie (pozycja 74 i 389) dzieli z APV. Trzecie, unikatowe, potencjalne miejsce N-glikozylacji dla MPV leży w pozycji 206 (fig. 11).

Mimo niskiej homologii sekwencji z innymi paramyksowirusami, białko F MPV ujawniło typowe cechy białka fuzyjnego zgodne z tymi opisanymi dla białek F innych członków rodziny Paramyxoviridae (Morrison, 1988). Białka F członków rodziny Paramyxoviridae są syntetyzowane jako inaktywne prekursory (F0), które ulegają rozszczepieniu przez proteazy komórki gospodarza, co tworzy aminoterminalne podjednostki F2 i dużą karboksyterminalną podjednostkę F1. Proponowane miejsce rozszczepienia (Collins i inni, 1996) jest zakonserwowane wśród wszystkich członków rodziny Paramyxoviridae. Miejsce rozszczepienia MPV zawiera reszty RQSR. Obie reszty argininowe (R) występują też u innych paramyksowirusów, takich jak wirus grypy rzekomej typu 1, wirus sendai i morbiliwirusy (dane nieukazane).

Jak się uważa, region hydryfobowy na końcu aminowym F1 działa jako błonowa domena fuzyjna i wykazuje wysokie podobieństwo sekwencji wśród paramyksowirusów i morbiliwirusów oraz w mniejszym stopniu z pneumowirusami (Morrison, 1988). Te 26 reszt (pozycja 137-163, fig. 11) jest zakonserwowanych między MPV i APV-C, co zgadza się tym, że region ten jest wysoce zakonserwowany wśród metapneumowirusów (Naylor i inni, 1998; Seal i inni, 2000).

Jak widać dla podjednostek F2 APV i innych paramyksowirusów, MPV ujawnił delecję 22 aa w porównaniu z RSV (pozycja 107-128, fig. 11). Ponadto, dla RSV i APV, peptyd sygnałowy i domena kotwicząca są zakonserwowane, jak się okazało, wewnątrz podtypów i wykazywały wysoką zmienność między podtypami (Plows i inni, 1995; Naylor i inni, 1998). Peptyd sygnałowy MPV (aa 10-35, fig. 11) na końcu aminowym F2 wykazuje pewne podobieństwo sekwencji z APV-C (18 z 26 reszt aa jest podobnych) i mniejszy stopień zakonserwowania z innymi APV lub RSV. Znacznie większą zmienność widać

PL 213 926 B1 w błonowej domenie kotwiczącej na końcu karboksylowym F1, choć wciąż widać pewną homologię z APV-C.

Białko 22K (M2)

Gen M2 jest unikatowy dla Pneumovirinae i zaobserwowano dwie nakładające się ORF u wszystkich pneumowirusów. Pierwsza, główna ORF reprezentuje białko M2-1, które wzmacnia zdolność do działania polimerazy wirusowej (Collins i inni, 1995; Collins, 1996) oraz jej odczyt regionów wewnątrzgenowych (Hardy i inni, 1998; Fearns i inni, 1999). Gen M2-1 dla MPV, leżący sąsiadująco w stosunku do genu F, koduje białko o 187 aa (tablica 5) i wykazuje najwyższą (84%) homologię z M2-1 APV-C (tablica 6). Porównanie białek M2-1 wszystkich pneumowirusów wykazało najwyższy stopień zakonserwowania w aminoterminalnej połowie białka (Collins i inni, 1990; Zamora i inni, 1992; Ahmadian i inni, 1999), co jest w zgodzie z obserwacją, że MPV obrazuje 100% podobieństwa z APV-C w pierwszych 80 resztach białka (fig. 12A). Białko M2-1 MPV zawiera 3 reszty cysteinowe położone wewnątrz pierwszych 30 reszt aa, które są zakonserwowane wśród wszystkich pneumowirusów. Taka koncentracja cystein występuje często w białkach wiążących cynk (Ahmadian i inni, 1991; Cuesta i inni, 2000).

Drugorzędowe ORF (M2-2), które nakładają się z M2-1 ORF pneumowirusów, są zakonserwowane pod względem położenia, lecz nie pod względem sekwencji, i są uważane za związane z kontrolą przełączania między replikacją i transkrypcją RNA wirusa (Collins i inni, 1985; Elango i inni, 1985;

Baybutt i inni, 1987; Collins i inni, 1990; Ling i inni, 1992; Zamora i inni, 1992; Alansari i inni, 1994; Ahmadian i inni, 1999; Bermingham i inni, 1999). Dla MPV, ORF M2-2 zaczyna się przy nukleotydzie 512 w ORF M2-1 (fig. 7), co jest dokładnie taką samą pozycją startową jak dla APV-C. Długość ORF M2-2 jest taka sama dla APV-C i MPV, 71 reszt aa (tablica 5). Porównanie sekwencji ORF M2-2 (fig. 12B) ujawniło 64% homologii sekwencji między MPV i APV-C i tylko 44-48% homologii sekwencji aa między MPV i APV-A i B (tablica 6).

ORF małego białka hydrofobowego (SH)

Gen leżący sąsiadująco w stosunku do M2 hMPV prawdopodobnie koduje białko SH o 183 aa (fig. 1 i 7). Brak jest dostrzegalnej identyczności sekwencji między tą ORF i innymi genami lub produktami genowymi wirusa RNA. Nie jest to zaskakujące, ponieważ podobieństwo sekwencji między białkami SH pneumowirusa jest generalnie niskie (tablica 1). Przypuszczalna ORF SH hMPV jest najdłuższą ORF SH znaną do dzisiaj (tablica 1). Skład reszt aa ORF SH jest względnie podobny do APV, RSV i PVM, z wysokim udziałem procentowym reszt treoniny i seryny (22%, 18%, 19%, 20,0%, 21% i 28% odpowiednio dla MPV, APV, RSV A, RSV B, bRSV i PVM). ORF SH hMPV zawiera 10 reszt cysteinowych, podczas gdy SH APV zawiera 16 reszt cysteinowych. ORF SH hMPV zawiera dwa potencjalne miejsca N-glikozylacji (aa 76 i 121), podczas gdy APV ma jedno, RSV ma dwa lub trzy, PVM ma cztery.

Profile hydrofobowości dla przypuszczalnego białka SH hMPV oraz SH APV i RSV ujawniły podobne cechy strukturalne (fig. 7B). ORF SH APV i hMPV mają hydrofilowy koniec N, centralną domenę hydryfobową, która może służyć jako potencjalna domena przekraczająca błonę (aa 30-53 dla hMPV), drugą domenę hydryfobową (aa 155-170) i hydrofiIowy koniec C. Dla kontrastu, SH RSV jak się okazuje, nie posiada C-terminalnej części ORF APV i hMPV. We wszystkich pneumowirusowych białkach SH, domena hydryfobowa jest oflankowana przez reszty aminokwasów zasadowych, które występują także w ORF SH dla hMPV (aa 29 i 54).

ORF glikoproteiny przylegania (G)

Przypuszczalna ORF G hMPV leży sąsiadująco w stosunku do przypuszczalnego genu SH i koduje białko o 236 aminokwasach (nukleotyd 6262-6972, fig. 1). Drugorzędowa mała ORF znajduje się zaraz za tą ORF, potencjalnie kodując 68 reszt aa (nukleotyd 6973-7179), lecz nie posiada kodonu startowego. Trzecia potencjalna ORF, w drugiej ramce odczytu, o 194 resztach, nakłada się na obie te ORF, lecz także nie posiada kodonu startowego (nukleotyd 6416-7000). Za tą główną ORF następuje czwarta ORF o 65 resztach aa w tej samej ramce odczytu (nukleotyd 7001-7198), znowu nie posiadająca kodonu startowego. Wreszcie, potencjalna ORF o 97 resztach aa (lecz bez kodonu startowego) znajduje się w trzeciej ramce odczytu (nukleotydy 6444-6737, fig. 1). Inaczej niż pierwsza ORF, inne ORF nie posiadają widocznych sekwencji startowej genu lub kończącej genu (patrz poniżej). Choć ORF G o 236 resztach aa prawdopodobnie reprezentuje co najmniej część białka przylegania MPV, nie można wykluczyć, że ekspresja dodatkowych sekwencji kodujących zachodzi w postaci oddzielnych białek albo jako część białka przylegania poprzez pewne zdarzenia redagowania RNA. Należy zauważyć, że dla APV i RSV nie zostały zidentyfikowane żadne drugorzędowe ORF za pierwszorzęPL 213 926 B1 dową ORF G, lecz że zarówno APV jak i RSV posiadają drugorzędowe ORF w głównej ORF G. Jednakże nie ma dowodu na ekspresję tych ORF i nie istnieje homologia między przewidywanymi sekwencjami aa dla różnych wirusów (Ling i inni, 1992). Drugorzędowe ORF w G hMPV nie ujawniają cech innych białek G i to, czy zachodzi ekspresja dodatkowych ORF, wymaga dodatkowego badania.

Analizy BLAST ze wszystkimi czterema ORF ujawniły brak dostrzegalnej identyczności na poziomie sekwencji nukleotydowej lub aa z innymi znanymi wirusowymi genami lub produktami genowymi. Pozostaje to w zgodzie z niskim procentem identyczności sekwencji dla innych białek G, takich jak hRSV A i B (53%) (Johnson i inni, 1987) oraz APV A i B (38%) (Juhasz i Easton, 1994).

Podczas gdy większość ORF hMPV przypomina te z APV zarówno pod względem długości jak i sekwencji, przypuszczalna ORF G MPV o 236 resztach aa jest znacznie mniejsza niż ORF G APV (tablica 1). Sekwencja aa ujawniła zawartość seryny i treoniny wynoszącą 34%, która jest nawet wyższa niż 32% dla RSV i 24% dla APV. Przypuszczalna ORF G zawiera także 8,5% reszt prolinowych, co stanowi wyższą zawartość niż 8% dla RSV i 7% dla APV. Niezwykłą obfitość reszt prolinowych w białkach G APV, RSV i hMPV obserwowano także w glikoproteinach pochodzenia śluzowego, gdzie jest ona główną determinantą struktury trójwymiarowej białek (Collins i Wertz, 1983; Wertz i inni, 1985; Jentoft, 1990). ORF G hMPV zawiera pięć potencjalnych miejsc N-glikozylacji, podczas gdy hRSV posiada siedem, bRSV posiada pięć i APV posiada trzy do pięciu.

Przewidywany profil hydryfobowości G hMPV ujawnił cechy podobne do innych pneumowirusów. Koniec N zawiera region hydrofilowy, po czym krótki obszar hydrofobowy (aa 33-53 dla hMPV) i głównie hydrofilowy koniec C (fig. 8B). Ta całkowita organizacja jest zgodna z organizacją białka transbłonowego kotwiczącego typu II i odpowiada dobrze tym regionom w białku G APV i RSV. Przypuszczalna ORF G hMPV zawiera tylko 1 resztę cysteinową w przeciwieństwie do RSV i APV (odpowiednio 5 i 20). Co godne zapamiętania, tylko dwie z czterech drugorzędowych ORF w genie G zawierały jedną dodatkową resztę cysteinową i te cztery potencjalne ORF ujawniły 12-20% reszt serynowych i treoninowych oraz 6-11% reszt prolinowych.

Gen polimerazy (L)

Przez analogię do innych wirusów o ujemnej nici, ostatnia ORF genomu MPV jest zależnym od RNA składnikiem polimerazy RNA kompleksów replikacji i transkrypcji. Gen L MPV koduje białko o 2005 aa, które jest o 1 resztę dłuższe od białka APV-A (tablica 5). Białko L MPV dzieli 64% homologii z APV-A, 42-44% z RSV i około 13% z innymi paramyksowirusami (tablica 6). Poch i inni, (1989; 1990) zidentyfikował sześć zakonserwowanych domen w białku L niesegmentowanych wirusów o ujemnej nici RNA, z których domena III zawierała cztery rdzeniowe motywy polimerazy, które uważa się za zasadnicze dla czynności polimerazy. Motywy te (A, B, C i D) są dobrze zakonserwowane w białku L MPV: w motywach A, B i C: MPV dzieli 100% podobieństwa ze wszystkimi pneumowirusami, a w ugrupowaniu D MPV dzieli 100% podobieństwa z APV i 92% z RSV. Dla całej domeny III (aa 627-903 w ORF L), MPV dzieli 77% identyczności z APV, 61-62% z RSV i 23-27% z innymi paramyksowirusami (fig. 15). Oprócz motywów polimerazy, białka L pneumowirusa zawierają sekwencję, która przypomina konsensusowy motyw wiążący ATP K(X)21GEGAGN(X)20K (Stec, 1991). ORF L MPV zawiera podobny motyw jak APV, w którym reszty pośrednie są oddalone o: K(x)22GEGAGN(X)19K.

Analizy filogenetyczne

Jako wskaźnik dla pokrewieństwa między MPV i członkami Pneumovirinae, wcześniej skonstruowano drzewa filogenetyczne na ORF N, P, M i F (van den Hoogen i inni, 2001) i ujawniono bliskie pokrewieństwo między MPV i APV-C. Z powodu niskiej homologi i genów SH i G MPV z tym z innych paramyksowirusów, nie można skonstruować godnych zaufania drzew filogenetycznych dla tych genów. Poza tym, odmienne organizacje genowe między członkami rodzajów Pneumovirus i Metapneumovirus uniemożliwiają tworzenie drzew filogenetycznych na podstawie całej sekwencji genomowej. Skonstruowaliśmy zatem jedynie drzewa filogenetyczne dla genów M2 i L oprócz tych opublikowanych wcześniej. Oba te drzewa potwierdziły bliskie pokrewieństwo między APV i MPV wewnątrz podrodziny Pneumovirinae (fig. 16).

Niekodujące sekwencje MPV

Łączenia genów w genomach paramyksowirusów zawierają krótkie i wysoce zakonserwowane sekwencje nukleotydowe na początku i końcu każdego genu (sygnały początku genu i końca genu), prawdopodobnie pełniące rolę w inicjacji i terminacji transkrypcji (Currant i inni, 1999). Porównanie sekwencji międzygenowych między wszystkimi genami MPV ujawniło sekwencję konsensusową dla sygnału początku genu N, P, M, F, M2 i G: GGGACAAGU (fig. 17A), która jest identyczna jak konsensusowy sygnał początku genu metapneumowirusów (Ling i inni, 1992; Yu i inni, 1992; Li i inni, 1996;

PL 213 926 B1

Bayon-Auboyer i inni, 2000). Wykryto, że sygnały początku genu dla genów SH i L MPV są nieco inne niż ten konsensus (SH: GGGAUAAAU, L: GAGACAAAU). Dla APV sygnał początku genu L także okazał się inny niż konsensus: AGGACCAAT (APV-A) (Randhawa i inni, 1996) i GGGACCAGT (APV-D) (Bayon-Auboyer i inni, 2000).

W przeciwieństwie do podobnych sekwencji początku genu MPV i APV, konsensusowa sekwencja końca genu APV, UAGUUAAUU (Randhawa i inni, 1996) nie występowała w sekwencjach międzygenowych MPV. Powtarzaną sekwencją znalezioną w większości genów z wyjątkiem regionu międzygenowego G-L była U AAAAA U/A/C, która mogła prawdopodobnie działać jak sygnał końca genu. Jednakże, ponieważ sekwencjonowaliśmy raczej RNA wirusa, a nie mRNA, nie można było przypisać definitywnych sygnałów końca genu, a więc wymaga to dalszego badania. Regiony międzygenowe pneumowirusów zmieniają się pod względem wielkości i sekwencji (Curran i inni, 1999; Blumberg i inni, 1991; Collins i inni, 1983). Regiony międzygenowe MPV nie ujawniły homologii z regionami z APV i RSV i miały wielkość w zakresie od 10 do 228 nukleotydów (fig. 17B). Region międzygenowy pomiędzy ORF M i F zawiera część drugorzędowej ORF, która zaczyna się w pierwszorzędowej ORF M (patrz powyżej). Region międzygenowy między SH i G zawiera 192 nukleotydy i nie wydaje się posiadać potencjału kodującego, na podstawie obecności licznych kodonów przestankowych we wszystkich trzech ramkach odczytu. Region międzygenowy między G i L zawiera 241 nukleotydów, które mogą obejmować dodatkowe ORF (patrz powyżej). Co interesujące, początek ORF L jest umiejscowiony w tych drugorzędowych ORF. Podczas gdy gen L APV nie zaczyna się w poprzedzającej ORF G, ORF L RSV zaczyna się także w poprzedzającym genie M2. Na końcach 3' i 5' genomu paramyksowirusów, krótkie pozagenowe regiony są przytaczane jako sekwencje liderowe i trailerowe, i około 12 pierwszych nukleotydów lidera i ostatnie 12 nukleotydów trailera jest komplementarne, prawdopodobnie dlatego, że każdy zawiera podstawowe elementy promotora wirusowego (Curran i inni, 1999; Blumberg i inni, 1991; Mink i inni, 1986). Lider 3' zarówno MPV jak i APV mają długość 41 nukleotydów i widoczna jest pewna homologia między nukleotydem 16 i 41 obu wirusów (18 z 26 nukleotydów) (fig. 17B). Jak wspomniano wcześniej, pierwsze 15 nukleotydów mapy genomu MPV opartych jest na sekwencji startera na podstawie genomu APV. Długość trailera 5' MPV (188 nukleotydów) przypomina wielkością trailer 5' RSV (155 nukleotydów), który jest znacznie dłuższy od APV (40 nukleotydów). Dopasowanie końcowych 40 nukleotydów trailera MPV i trailera APV ujawniło homologię 21 z 32 nukleotydów, oprócz końcowych 12 nukleotydów, które reprezentują sekwencje starterowe na podstawie sekwencji genomowej APV. Nasze analizy sekwencji ujawniły brak obecności genów NS1 i NS2 na końcu 3' genomu i organizacje genomową przypominającą organizację metapneumowirusów (3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5'). Wysoka homologia sekwencji występująca między genami MPV i APV dodatkowo podkreśla bliskie pokrewieństwo między tymi dwoma wirusami. Dla genów N, P, M, F, M2-1 i M2-2 MPV występuje całkowita homologia aminokwasowa z APV-C wynosząca 79%. Rzeczywiście, dla tych genów APV-C i MPV wykazały homologię sekwencji, która jest w takim samym zakresie jak homologia sekwencji występująca między podgrupami innych rodzajów, takich jak RSV-A i B lub APVA i B. To bliskie pokrewieństwo między APV-C i MPV jest także widoczny w analizach filogenetycznych, które ujawniły MPV i APV-C zawsze w tej samej gałęzi, oddzielnie od gałęzi zawierającej APV-A i B. Identyczna organizacja genomu, homologia sekwencji i analizy filogenetyczne faworyzują klasyfikację MPV jako pierwszego członka rodzaju Metapneumovirus, którego można wyizolować od ssaków. Należy zauważyć, że wykryta zmienność sekwencji między różnymi izolatami wirusowymi MPV w genach N, M, F i L, wykazał możliwość istnienia różnych genotypów (van den Hoogen i inni, 2001). Bliskie pokrewieństwo między MPV i APV-C nie jest odzwierciedlone w zakresie gospodarza, ponieważ APV zakaża ptaki w przeciwieństwie do MPV (van den Hoogen i inni, 2001). Ta różnica w zakresie gospodarza może być określona przez różnice między białkami SH i G obu wirusów, które są wysoce rozbieżne. Białka SH i G MPV nie wykazują istotnej homologii sekwencji aa z białkami SH i G jakiegokolwiek innego wirusa. Chociaż zawartość aminokwasów i wykresy hydrofobowości przemawiają za określeniem tych ORF jako SH i G, konieczne są dane doświadczalne do oszacowania ich funkcji. Takie analizy będą także rzucać światło na rolę dodatkowych nakładających się ORF w tych genach SH i G. Oprócz tego, analizy sekwencji genów SH i G APV-C mogą zapewnić lepszy wgląd w funkcjonowanie białek SH i G MPV i ich pokrewieństwo z tymi z APV-C. Niekodujące regiony MPV okazały się całkiem podobne do tych z APV. Sekwencje lidera 3' i trailera 5' APV i MPV wykazują wysoki stopień homologii. Chociaż długości regionów międzygenowych nie były zawsze takie same w przypadku APV i MPV konsensusowe sygnały początku genu większości ORF okazały się identyczne. W przeciwieństwie do tego, nie stwierdzono sygnałów końca genu w MPV. Chociaż znaleźliśmy

PL 213 926 B1 powtarzającą się sekwencję (U AAAAA U/A/C) w większości regionów międzygenowych, konieczna jest analiza sekwencji mRNA wirusa do formalnego naszkicowania tych sekwencji końca genu. Należy zauważyć, że informację o sekwencji dla 15 nukleotydów na końcu 3' i 12 nukleotydów na końcu 5' otrzymuje się przez użycie procedur szybkiej amplifikacji końców cDNA (RACE). Technika ta okazała się pomyślna dla innych, w przypadku pokrewnych wirusów (Randhawa, J.S. i inni, Rescue of synthetic minireplicons estabilishes the absence of the NS1 and NS2 genes from avian genomic RNA. J.Virol, 71, 9849-9854 (1997); Mink, M.A. i inni, Nucleotide sequence of the 3' leader and 5' trailer regions of human respiratory syncytial wirus genomic RNA. Virology 185, 615-24 (1991)). Aby określić sekwencję sekwencji liderowej 3' vRNA, do oczyszczonego vRNA dodaje się ogon homopolimeru A z użyciem poli-A-polimerazy i sekwencję liderową następnie amplifikuje się za pomocą PCR z użyciem startera poli-T i startera w genie N. Aby określić sekwencję sekwencji trailerowej 5' vRNA, wykonuje się kopię cDNA sekwencji trailerowej z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy i startera w genie L, po czym doczepianie do cDNA homopolimeru dG z użyciem terminalnej transferazy. Następnie, region trailerowy amplifikuje się przy użyciu startera poli-C oraz startera w genie L. Jako strategię alternatywną, vRNA łączy się z sobą samym lub łącznikami syntetycznymi, po czym regiony liderowy i trailerowy amplifikuje się przy użyciu starterów w genach L i N oraz starterów swoistych dla łącznika. Dla sekwencji trailerowej 5' możliwe jest także bezpośrednie sekwencjonowanie oczyszczonego vRNA za pomocą dideoksynukleotydów (Randhawa, 1997). Wykorzystując te podejścia, możemy zanalizować dokładną sekwencję końców genomu hMPV. Informacja o sekwencji tu dostarczona jest istotna do tworzenia testów diagnostycznych, szczepionek i środków antywirusowych na MPV i infekcje MPV.

Materiały i metody

Analiza sekwencji

Izolat wirusowy 00-1 namnożono do wysokiego miana (w przybliżeniu 10 000 TCID50/ml) na trzeciorzędowych małpich komórkach nerki jak opisano poprzednio (van den Hoogen i inni, 2001). RNA wirusa wyizolowano z supernatantów zakażonych komórek stosując zestaw High Pure RNA Isolating Kit zgodnie z instrukcjami producenta (Roch Diagnostics, Almere, Holandia). Startery zaprojektowano na podstawie sekwencji opublikowanych poprzednio (van den Hoogen i inni, 2001) oprócz sekwencji opublikowanych dla lidera i trailera APV/RSV (Randhawa i inni, 1997; Mink i inni, 1991) i są one dostępne na życzenie. Testy RT-PCR prowadzono z wirusowym RNA, przy użyciu jednoprobówkowego testu, w całkowitej objętości wynoszącej 50 pl, z użyciem 50 mM Tris pH 8,5, 50 mM NaCl, 4,5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 1 μΜ startera zgodnego, 1 μΜ startera odwrotnego, 0,6 mM dNTP, 20 jednostek RNAsin (Promega, Leiden, Holandia) i 5 jednostek Taq Polymerase (PE Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel, Holandia). Odwrotną transkrypcję prowadzono w temperaturze 42°C przez 30 minut, po czym 8 minut inaktywacji w temperaturze 95°C. cDNA amplifikowano podczas 40 cykli w temperaturze 95°C, 1 minuta; w temperaturze 42°C, 2 minuty; w temperaturze 72°C, 3 minuty, z końcowym wydłużaniem w temperaturze 72°C przez 10 minut. Po badaniu na 1% żelu agarozowym, produkty RT-PCR oczyszczono z żelu przy użyciu zestawu Qiaquick Gel Extraction (Qiagen, Leusden, Holandia) i sekwencjonowano bezpośrednio przy użyciu zestawu do terminacji sekwencjonowania Dyenamicy ET (Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, Holandia) oraz automatycznego sekwenatora DNA ABI 373 (PE Applied Biosystem, Nieuwerkerk aan de Ijssel, Holandia), zgodnie z instrukcjami producenta.

Dopasowania sekwencji dokonano przy użyciu pakietu oprogramowania Clustal, dostępnego w pakiecie oprogramowania BioEdit wersja 5.0.6 (http://jwbrown.mbio.nscu.edu/Bioedit//bioedit.html; Hall, 1999).

Analiza filogenetyczna

Aby skonstruować drzewa filogenetyczne, sekwencje DNA dopasowano przy użyciu pakietu oprogramowania ClustalW i stworzono drzewa maksymalnego prawdopodobieństwa przy użyciu pakietu oprogramowania DNA-ML programu Phylip 3.5, wykorzystując metody bootstrap w 100 powtórzeniach i 3 zamianach. Wartości bootstrap obliczono dla drzew konsensusowych utworzonych za pomocą pakietu konsensusowego (Felsenstein, 1989).

Sekwencja genomu MPV jest dostępna z GenBank pod numerem dostępu AF371337. Wszystkie inne sekwencje tu wykorzystywane, są dostępne z Genbank pod numerami dostępu AB046218 (wirus odry, wszystkie ORF), NC-001796 (wirus ludzkiej grypy rzekomej typu 3, wszystkie ORF), NC-001552 (wirus Sendai, wszystkie ORF), X57559 (wirus ludzkiej grypy rzekomej typu 2, wszystkie ORF), NC-002617 (wirus choroby Newcastle, wszystkie ORF), NC-002728 (wirus Nipah, wszystkie ORF), NC-001989 (bRSV, wszystkie ORF), M11486 (hRSV A, wszystkie ORF z wyjątkiem L),

PL 213 926 B1

NC-001803 (hRSV, ORF L), NC-001781 (hRSV B, wszystkie ORF), D10331 (PVM, ORF N), U09649 (PVM, ORF P), U66893 (PVM, ORF M), U66893 (PVM, ORF SH), D11130 (PVM, ORF G), D11128 (ORF F). ORF M2 PVM otrzymano od Ahmadian (1999), AF176590 (APV-C, ORF N), U39295 (APV-A ORF N), U39296 (APV-B, ORF N), AP262571 (APV-C, ORF M), U37586 (APV-B, ORF Μ), X58639 (APV-A, ORF M), AF176591 (APV-C, ORF P), AF325443 (APV-B, ORF P), U22110 (APV-A, ORF P), AF187152 (APV-C, ORF F), Y14292 (APV-B, ORF F), D00850 (APV-A, ORF F), AF176592 (APV-C, ORF M2), AF35650 (APV-B, ORF M2), X63408 (APV-A, ORF M2), U65312 (APV-A, ORF L), S40186 (APV-A, ORF SH).

T a b l i c a 5:

Długość ORF MPV i innych paramyksowirusów

	N1	P	M	F	M2-1	M2-2	SH	G	L
MPV	394	294	254	539	187	71	183	236	2005
APV A	391	278	254	538	186	73	174	391	2004
APV B	391	279	254	538	186	73	2	414	2
APV C	394	294	254	537	184	71	2	2	2
APV D	2	2	2	2	2	2	2	389	2
hRSV A	391	241	256	574	194	90	64	298	2165
hRSV B	391	241	249	574	195	93	65	299	2166
bRSV	391	241	256	569	186	93	81	257	2162
PVM	393	295	257	537	176	77	92	396	2
inne3	418-	225-	335-	539-	4	4	4	4	2183-
	542	709	393	565					2262

Uwagi:

1. Długość wyrażona w resztach aminokwasowych.

2. Sekwencje niedostępne.

3. Inne; wirus ludzkiej grypy rzekomej typu 2 i 3, wirus Sendai, wirus odry, wirus nipah, wirus zarazy fok oraz wirus choroby

New Castle.
4. ORF niewystępujące w genomie wirusowym. T a b l i c a 6: Identyczność sekwencji aminokwasowej między ORF MPV i u innych paramyksowirusów1.
	N	P	M	F	M2-1	M2-2	L
APV A	69	55	78	67	72	26	64
APV B	69	51	76	67	71	27	2
APV C	88	68	87	81	84	56	2
hRSV A	42	24	38	34	36	18	42
hRSV B	41	23	37	33	35	19	44
bRSV	42	22	38	34	35	13	44
PVM	45	26	37	39	33	12	2
inne3	7-11	4-9	7-10	10-18	4	4	13-14

Inne 7-11 4-9 7-10 ID-18 -4 -4 13-1

Uwagi:

1. Brak homologi sekwencji ze znanymi białkami G i SH a więc zostały wyłączone.

2. Sekwencje niedostępne.

3. Patrz lista w tablicy 5, uwaga 3.

4. ORF nie występująca w genomie wirusowym.

PL 213 926 B1

Odniesienia

Current Protocols in Molecular Biology, tom 1-3 (1994-1998). Wydane przez Ausubel, F.M., Brent, R., Einston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. i Struhl, K. Opublikowane przez John Wiley and sons, Inc., USA.

Current Protocols in Immunology, tom 1-3. Wydane przez Coligan, J.E., Kruisbeek, A.M., Margulies, D.H., Shevach, E.M. i Strobe, W. Opublikowane przez John Wiley and sons, Inc., USA.

Sambrook i inni Molecular cloning, a laboratory manual, drugie wydanie, tom 1-3. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Fields, Virology. 1996. Tom 1-2 3-cie wydanie, wydane przez: Fields, B.N., Knipe, D.M. i Howley, P.M. Lippincott-Raven, Philadelpia, USA.

1. Pringle, C.R. Virus taxonomy at the Xith international congress of virology, Sydney, Australia 1999. Arch. Virol. 144/2, 2065.2070 (1999).

2. Domachowske, J.B. & Rosenberg, H.F. Respiratory syncytial virus infection: immune response, immunopathogenesis, and treatment. Clin. Microbio. Rev. 12(2), 298-309 (1999). Przegląd.

3. Giraud, P., Bennejean, G., Guittet, M. & Toquin, D. Turkey rhinotracheitis in France: preliminary investigations on a ciliostatic virus. Vet. Rec. 119, 606-607 (1986).

4. Ling, R., Easton, A.J. & Pringle, C.R. Sequence analysis of the 22K, SH and G genes of turkey rhinotracheitis virus and their intergenic regions reveals a gene order different from that of other pneumovirusee. J. Gen.Virol. 78, 1709-1715 (1992).

5. Yu, Q., Davis, P.J., Li, J. & Cavanagh, D. Cloning and sequencing of the matrix protein (M) gene of turkey rhinotracheitis virus reveal a gene order different from that of respiratory syncytial virus. Virology 186, 426-434 (1992).

6. Randhawa, J.S., Marriott, A.C., Pringle, C.R. & Easton, A.J. Rescue of synthetic minireplicons establishes the absence of the NS1 and NS2 genes from avian pneumovirus. J.Virol. 71, 9849-9864 (1997).

7. Evans, A.S. w: Viral Infections of Humans. Epidemiology and control. 3-cie wydanie, (wydawca Evans, A.S) 22-28 (Plenum Publishing Corporation, New York, 1989).

8. Osterhaus, A.D.M.E., Yang, H., Spijkers, H.E.M., Groen, J., Teppema, J.S. & van Steenis,

G. The isolation and partial characterization of a highly pathogenic herpesvirus from the Harbor Seal (Phoca vitulina). Arch.of Virol. 86, 239-251 (1985).

9. K.B. Chua i inni Nipah virus: a recently emergent deadly paramyxovirus. Science 288, 1432.1435 (2000).

10. Welsh, J., Chada, K., Dalal, S.S., Cheng, R., Ealph, D. & McClelland, M. Arbitrarily primed PGR fingerprinting of RNA. NAR. 20, 4965-4970 (1992).

11. Bayon-Auboyer, M., Arnauld, C., Toquin, D. & Eterradossi, N. Nucleotide sequences of the F, L and G protein genes of two non-A/non-B avian pneumoviruses (APV) reveal a novel APV subgroup. J. of Gen. Virol. 81, 2723-2733 (2000).

12. Mulder, J. & Masurel, N. Pre-epidemic antibody against 1957 strain of asiatic influenza in serum of older people living in The Netherlands. The Lancet, kwiecień 19, 810-814 (1958).

13. Pringle, C.R. w: The Paramyxoviruses. 1-sze wydanie. (Wydawca. D.W. Kingsbury) 1-39 (Plenum Press, New York, 1991).

14. Rothbarth, P.H., Groen, J., Bohnen, AM., Groot, de R., & Osterhaus, A.D.M.E. Influenza virus serology-a comparative study. J.of Virol. Methods 78,163-169 (1999).

15. Brandenburg, A.H., Groen, J., van Steensel-Moll, H.A, Claas, E.J.C., Rothbarth, P.H., Neijens, H.J. & Osterhaus, A.D.M.E. Respiratory syncytial virus specific serum antibodies in infants under six months of age: limited serological response upon infection. J.Med.Virol. 62, 97-104 (1997).

16. Lennette, D.A. i inni In; Diagnostic procedures for viral, rickettsial, and chlamydial infections. 7-me wydanie. (Wydawcy Lennette, E.H., Lennette, D.A. & Lennette, E.T.) 3-25; 37-138; 431-463; 481-494; 539-563 (American public health association, Washington, 1995).

15. Felsenstein, J. Department of Genetics, Universtity of Washington. Http ://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html

16. Schnell i inni EMBO J 13, 4195-4203, 1994

17. Colins, P.L., Hill, M.G., Camargo, E., Grosfeld, H., Chanock, R.M. & Murphy, B.R. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an esential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development. PNAS 92, 11563-11567 (1995).

PL 213 926 B1

18. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawakao, Y., Hobom, G. & Webster, R.G. A DNA transfection system for generation of influenza virus from eight plasmids. PNAS 97, 6108-6113 (2000).

19. Bridgen, A., Elliot, E.M. Rescue of a segmented negative-strand virus entirely from cloned complementary DNAs. PNAS 98, 15400-15404 (1996).

20. Palese, P., Zheng, H., Engelhardt, O.G., Pleschica, S. & Garcia-Sastre, A. Negative-strand RNA viruses: genetic engineering and applications. PNAS 98, 11354-11368 (1996).

21. Peeters, B.P., de Leeuw, O.S., Koch, G. & Gielkens, A.L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J.Virol. 78, 5001-5009 (1999).

22. Durbin, A.P., Hall S.L., Siew, J.W., Whitehead, S.S., Collins, P.L. & Murphy, B.R. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology 286, 323-332 (1997).

23. Tao, T., Durbin, A.P., Whitehead, S.S., Davoodi, P., Collis, P.L. & Murphy, B.R. Recovery of a fully viable chimeric human parainfluenza virus (PIV) type 3 in which the hemagglutininneuraminidase and fusion glycoproteins have been replaced by those of PIV type 1. J. Virol. 72, 29552961 (1998).

24. Durbin, A.P., Sidadopoulos, M.H., McAuliffe, J.M., Riggs, J.M., Surman, S.R., Collins, P.L. & Murphy, B.R. Human parainfluenza virus type 3 (PIV3) expressing the hemagglutinin protein of measles virus provides a potential method for immunization against measles virus and PIV3 in early infancy. J. Virol. 74, 6821-6831 (2000).

25. Skiadopoulos, M.H., Durbin, A.P., Tatem, J.M., Wu, S.L., Paschalis, M., Tao, T., Collins, P.L. & Murphy, B.R. Three amino acid substitutions in the L protein of the human parainfluenza virus type 3 cp45 live attenuated vaccine candidate contribute to its temperature-sensitive and attenuation phenotypes. J. Virol. 72, 1762-1768 (1998).

26. Teng. N., Whitehead, S.S., Bermingham, A., St. Claire, M., Elkins, W.R., Murphy, B.R. & Collins, P.L. J.Virol. 74, 9317-9321 (2000).

27. Masurel, N. Relation between Hong Kong virus and former human A2 isolates and the A/EQU12 virus in human sera collected before 1957. The Lancet 3 maj, 907-910 (1969).

Dodatkowe odniesienia wykorzystywane w przykładzie 4.

AHMADIAN, G., CHAMBERS, P., i EASTON, A. J. (1999). Detection and characterisation of proteins encoded by the second ORF of the M2 gene of pneumoviruses. J Gen Virol 80, 2011-6.

ALANSABI, H., i POTGIETER, L.N. (1994). Molecular cloning and sequence analysis of the phosphoprotein, nucleocapsid protein, matrix protein and 22K (M2) protein of the ovine respiratory syncytial virus. J Gen Viral 75, 3597-601.

BARR, J., CHAMBERS, P., PEINGLE, C.R., i EASTON, A.J. (1991). Sequence of the major nucleocapsid protein gene of pneumonia virus of mice: sequence comparisons suggest structural homology between nudeocapsid proteins of pneumoviruses, paramyxoviruses, rhabdoviruses and filoviruses. J Gen Viral 72, 677-86.

BAYBUTT, H.N., i PRINGLE, C.R. (1987). Molecular cloning and sequencing of the F and 22K membrane protein genes of the RSS-2 strain of respiratory syncytial virus. J Gen Virol 68, 2789-96,

BAYON-AUBOYER, M.H., aenauld, C., TOQUIN, D., i ETERRADOSSI, N. (2000). Nucleotide sequences of the F, L and G protein genes of two non-A/non-B avian pneumoviruses (APV) reveal a novel APV subgroup. J Gen Virol 81, 2723-33.

BERMINGHAM, A, i COLLINS, P.L. (1999). The M2-2 protein of human respiratory syncytial virus is a regulatory factor involved in the balance between RNA replication and transcription. Proc Natl Acad Sci USA 96, 11259-64.

BLUMBERG, B.M., CHAN, J., i UDEM, S.A (1991). Function of Paramyxovirus 3' and 5' end sequences: In therory and practice. In „the Paramyxoviruses” (D. Kingsbury, Ed.), str. 235-247. Plenum, New York.

COLLINS, P.L., I WERTZ. G.W. (1983). cDNA doning and transcriptional mapping of nine polyadenylylated RNAs encoded by the genome of human respiratory syncytial virus. Proc Natl Acad Sci USA 80, 3208-12.

COLLINS, P.L., i WERTZ, G.W. (1985). The envelopeassociated 22K protein of human respiratory syncytial virus: nudeotide sequence of the mRNA and a related polytranscript. J Virol 64, 65-71.

COLLINS, P.L., DICKENS, L.E., BUCKLER-WHITE, A., OLMSTED, R.A., SPRIGGS, M.K.,

CAMARGO, E., i COELINGH, K.V.W. (1986). Nudeotide sequences for the gene junctions of human

PL 213 926 B1 respiratory syncytial virus reveal distinctive features of intergenic structure and gene order. Proc Natl Acad Sci USA 88, 4594-98.

COLLINS, P.L., HILL, M.G., i JOHNSON, P.R. (1990). The two open reading frames of the 22K mRNA of human respiratory syncytial virus: sequence comparison of antigenic subgroups A and B and expression in vitro. J Gen Virol 71, 3015-20.

COLLINS, P.L., HILL, M.G., CAMARGO, E., GROSFELD, H., CHANOCK, R.M., i MURPHY, B.R. (1995). Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development. Proc Natl Acad Sci USA 92, 11563-7.

COLLINS, P.L., McNTOSH, K. i CHANCOK, R.M. (1996). „Respiratory syncytial virus.” W: Fields virology (B.N. Knipe, Howley, P.M., wydawca.) Lippencott-Raven, Philadelphia.

COOK, J.K. (2000). Avian rhinotracheitis. Rev Sci Tech 19, 602-13.

CUESTA, I., GENG, X., ASENJO, A, i VILLANEUVA, N. (2000). Structural phosphoprotein M2-1 of the human respiratory syncytial virus is an RNA binding protein. J. Gen. Virol 74, 9858-67.

CURRAN, J., i KOLAKOFSKY, D. (1999). Replication of paramyxoviruses. Adv. Virus Res. 50, 403-422.

EASTON, A.J., i CHAMBERS, P. (1997). Nucleotide sequence of the genes encoding the matrix and small hydrophobic proteins of pneumonia virus of mice. Virus Res 48, 27-33.

ELANGO, N., SATAKE, M.,I VENKATESAN, S. (1985). mRNA sequence of three respiratory syncytial virus genes encoding two nonstructural proteins and a 22K structural protein. J Virol 55, 101-10.

FEARNS, R., i COLLINS, P.L. (1999). Role of the M2-1 transcription antitermination protein of respiratory syncytial virus in sequential transcription. J Virol 73, 6862-64.

FELSBNSTEIN, J. (1989). „PHYLIP-Phylogeny Inference Package (Version 3.2. Cladistics 5).”.

GIRAUD, P., BENNEJEAN, G., GUITET, M., i TOQUIN, D. (1986). Turkey rhinotracheitis in France: preliminary investigations on a ciliostatic virus. Vet Rec 119, 606-7.

Hall, T.A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41, 95-98.

HARDY, B.W., i WERTZ, G.W. (1998). The product of the respiratory syncytial virus M2 gene OKF1 enhances readthrough of intergenic junctions during viral transcription. J Virol 72, 520-6.

HORVATH, C.M., i LAMB. B.A. (1992). Studies on the fusion peptide of a paramyxovirus fusion glycoprotein: roles of conserved residues in cell fusion. J Virol 66, 2448-55.

JENTOFT, N. (1990). Why are proteins 0-glycosylated? Trends Biochem Sci 15, 291-4.

JOHNSON, P.R., JR., OLMSTBD, R.A., PRINCE, G.A., MURPHY, B.R., ALLING, D.W., WALSH, E.E., i COLLINS, P.L. (1987). Antigenic relatedness between glycoproteins of human respiratory syncytial virus subgroups A and B: evaluation of the contributions of F and G glycoproteins to immunity. J Virol 61, 3163-6.

JUHASZ, K, i EASTON, A.J. (1994). Extensive sequence variation in the attachment (G) protein gene of avian pneumovirus: evidence for two distinct subgroups. J Gen Virol 75, 2873-80.

Kyte, J. i Doolittle, R.F. (1982). A Simple Method for Displaying the Hydrophobic Character of a Protein. J. Mol. Biol. 157, 105-142.

LAMB, R.A., i KOLAKOFSKY, D. (1996). „Paramyxoviridae: the viruses and their replication”. W: Fields virology (B.N. Knipe, Howley, P.M., wydawcy.) Lippencott-Raven, Philadelphia.

LI, J., LING, R., RANDHAWA, J.S., SHAW, K., DAVIS, P.J., JUHASZ, K., PRINGLE, C.R., EASTON, A.J., i CAVANAGH, D. (1996). Sequence of the nucleocapsid protein gene of subgroup A and B avian pneumoviruses. Virus Res 41, 185-91.

LING, R., EASTON, A.J., i PRINGLE, C.R. (1992). Sequence analysis of the 22K, SH and G genes of turkey rhinotracheitis virus and their intergenic regions reveals a gene order different from that of other pneumoviruses. J Gen, Virol 73,1709-15.

LING, R., DAVIS, P.J., YU, Q., WOOD, C.M., PRINGLE, C.R., CAVANAGH, D., i EASTON, A.J. (1995). Sequence and in vitro expression of the phosphoprotein gene of avian pneumovirus. Virus Res 36, 247-57.

MARRIOT, A.C., SMITH, J.M., i EASTON, A. (2001). Fidelity of leader and trailer sequence usage by the respiratory syncytial virus and avian pneumovirus replication complexes. J. Virol. 75, 6266-72.

PL 213 926 B1

MINK, M.A., STEC, D.S., i COLLINS, P.L. (1991). Nucleotide sequences of the 3' leader and 5' trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA. Virology 185, 616-24.

MIYAHARA, K., KITADA, S., YOSHIMOTO, M., MATSUMURA, H., KAWANO, M., KOMADA,

H., TSURUDOME, M., KUSAGAWA, S., NISHIO, M., i ITO, Y. (1992). Molecular evolution of human paramyxoviruses. Nudeotide sequence analyses of the human parainfluenza type 1 virus NP and M protein genes and construction of phylogenetic trees for all the human paramyxoviruses. Arch Virol 124, 266-68.

MORRISON, T.G. (1988). Structure, function, and intracellular processing of paramyxovirus membrane proteins. Virus Res 10, 113-35.

NAYLOR, C.J., BBITTOM, P., i CAVANAGH, D. (1998). The ectodomains but not the transmembrane domains of the fusion proteins of subtypes A and B avian pneumovirus are conserved to a similar extent as those of human respiratory syncytial virus. J Gen Virol 79,1393.8.

PLOWS, D.J., i PRINGLE, C.R. (1995). Variation in the fusion glycoprotein gene of human respiratory syncytial virus subgroup A. Virus Genes 11, 37-46.

POCH, O., BLUMBERG, B.M., BOUGUELERET, L., i TORDO, N. (1990). Sequence comparison of five polymerases (L proteins) of unsegmented negative-strand RNA viruses: theoretical assignment of functional domains. J Gen Virol 71, 1153-62.

POCH, O., SAUVAGET, I., DELARUE, M., i TORDO, N. (1989). Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements. EmboJ 8, 3867-74.

RANDHAWA, J.S., MARRIOTT, A.C., PRINGLE, C.R., i EASTON, A.J. (1997). Rescue of synthetic minireplicons establishes the absence of the NS1 and NS2 genes from avian pneumovirus. J Virol 71, 9849-54.

RANDHAWA, J.S., WILSON, S.D., TOLLEY, K.P., CAVANAGH, D., PRINGLE, C.R., i EASTON, A.J. (1996). Nucleotide sequence of the gene encoding the viral polymerase of avian pneumovirus. J Gen Virol 77, 3047-51.

SAMAL, S.K., i ZAMORA, M. (1991). Nucleotide sequence analysis of a matrix and small hydrophobic protein didstronic mRNA of bovine respiratory syncytial virus demonstrates extensive sequence divergence of the small hydrophobia protein from that of human respiratory syncytial virus. J Gen Virol 72, 1715-20.

SATAKE, M., i VENKATE SAN, S. (1984). Nucleotide sequence of the gene encoding respiratory syncytial virus matrix protein. J Virol 60, 92-9.

SEAL, B.S., SELLERS, H.S., i MEINERSMANN, R.J. (2000). Fusion protein predicted amino acid sequence of the first US avian pneumovirus isolate and lack of heterogeneity among other US isolates. Virus Res 66, 139-47.

SEDLMEIER, R., i NEUBERT, W.J. (1998). The replicative complex of paramyxoviruses: structure and function. Adv Virus Res 50, 101-39.

STEC, D.S., HILL, M.G., 3RD, i COLLINS, P.L. (1991). Sequence analysis of the polymerase L gene of human respiratory syncytial virus and predicted phylogeny of nonsegmented negative-strand viruses. Virology 188, 273-87

VAN DEN HOOGEN, B.G., DE JONG, J.C., GROEN, J., KUEKEN, T., DE GROOT, R., FOUCHIER, R.A., i OSTERHAUS, A.D. (2001). A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease. Nat Med 7(6). 719-24.

VIRUS TAXONOMY (2000). Siódmy raport międzynarodowego komitetu taksonomii wirusów.

WERTZ, G.W., COLLINS, P.L., HUANG, Y,. GRUBER, O., LEVINE. S., i BALL, L.A. (1985). Nudeotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral membrane protein. Proc Ncal Acad Sci USA 82, 4075-9.

YU, Q., DAVIS, P.J., BARRET, T., BINNS, M.M., BOURSNELL, M.E., i CAVANAGH, D. (1991). Deduced amino acid sequence of the fusion glycoprotein of turkey rhinotracheitis virus has greater identity with that of human respiratory syncytial virus, a pneumovirus, than that of paramyxoviruses and morbilliviruses. J Gen Virol 72, 75-81.

YU, Q., DAVIS, P.J., LI, J., i CAVANAGH, D. (1992). Cloning and sequencing of the matrix protein (M) gene of turkey rhinotracheitis virus reveal a gene order different from that of respiratory syncytial virus. Virology 186, 426-34.

ZAMORA, M., i SAMAL, S.K. (1992). Sequence analysis of M2 mRNA of bovine respiratory syncytial virus obtained from an F-M2 dicistronic mRNA suggests structural homology with that of human respiratory syncytial virus. J Gen Virol 78, 737-41.

PL 213 926 B1

Startery wykorzystane do wykrywania RT-PCR znanych paramyksowirusów. Startery dla hPIV-1 do 4, świnki, odry, Tupaia, Mapuera i Hendra są opracowywane w miejscowym laboratorium i na podstawie dopasowania dostępnych sekwencji. Startery dla wirusa choroby New Castle otrzymano od Seal, J., J. i innych; Clin. Microb., 2624-2630, 1995. Startery dla PCR Nipah i ogólnie paramyksowirusów otrzymano od: Chua, K.B., i inni; Science, 288 26 maj 2000.

Wirus Startery Położenie

Wirus	Startery Położenie w białku
HPIV-1	fwd Rev	5'-TGTTGTCGAGACTATTCCAA-3’ 5’-TGTTG(T/A)ACCAGTTGCAGTCT-3’	HN
HPrV-2	Fwd Rev	5’-TGCTGCTTCTATTGAGAAACGCC-3’ n δ’-GGTGAC/T TC(T/C)AATAGGGCCA-3’
HPIV-3	Fwd Rev	5’-CTCGAGGTTGTCAGGATATAG-3' 5'-CTITGGGAGTTGAACACAGTT-3’	HN
HPIV-4	Fwd Rev	5’-TTC(A/G)GTTTTAGCTGCTTACG-3’ n 5’-AGGCAAATCTCTGGATAATGC-3’
świnki	Fwd Rev	5’-TCGTAACGTCTCGTGACC-3’ SH 5’-GGAGATCTTTCTAGAGTGAG-3’
NDV	Fwd Rev	5’-CCTTGGTGAiTCTATCCGIAG-3’ 5’-CTGCCACTGCTAGTTGiGATAATCC-3’	F
Tupaia	Fwd Rev	5’-GGGCTTCTAAGCGACCCAGATCTTG-3’ 5’-GAATTTCCTTATGGACAAGCTCTGTGC-3’	N
Mapuera	Fwd Rev:	5’-GGAGCAGGAACTCCAAGACCTGGAG-3’ 5’-GCTCAACCTCATCACATACTAACCC-3’	N
Hendra	Fwd Rev	5’-GAGATGGGCGGGCAAGTGCGGCAACAG-3’N 5’-GCCrHTGCAATCAGGATCCAAATTTGGG-3’
Nipah	Fwd Rev	5’-ctgctgcagttcaggaaacatcag-3’ 5’ACCGGATGTGCTCACAGAACTG-3’	N
HRSV	Fwd Rev	5’-TTTGTTATAGGCATATCATTG-3’ 5’-TTAACCAGCAAAGTGTTA-3'	F
różyczki	Fwd Rev	5’-TTAGGGCAAGAGATGGTAAGG-3’ 5’-TTATAACAATGATGGAGGG-3’	N

Fwd - zgodny

Rev - odwrotny

Ogólnie Paramyxoviridae:

Fwd 5'-CATTAAAAAGGGCACAGACGC-3' P

Rev 5'-TGGACATTCTCCGCAGT-3'

PL 213 926 B1

Startery do RAP-PCR:

ZF1: 5’-CCCACCACCAGAGAGAAA-3’ ZF4: 5’-ACCACCAGAGAGAAACCC-3’ ZF7: 5’-ACCAGAGAGAAACCCACC-3’ ZF10: 5’-AGAGAGAAACCCACCACC-3’ ZF13: 5’-GAGAAACCCACCACCAGA-3’ ZF16: 5’-AAACCCACCACCAGAGAG-3’

CS1: 5’-GGAGGCAAGCGAACGCAA-3’

CS4: 5’-GGCAAGCGAACGCAAGGA-3’

CS7: 5’-AAGCGAACGCAAGGAGGC-3’

CS10:5’-CGAACGCAAGGAGGCAAG-3’

CS13:5’-ACGCAAGGAGGCAAGCGA-3’

CS 16:5’-CAAGGAGGCAAGCGAACG-3’ fragmentów z powodzeniem oczyszczono i sekwencjonowano: znaleziono 10 fragmentów z homologią sekwencji u APV

Fragment 1	ZF 7, 335 p.z.	gen N
Fragment 2	ZF 10, 235 p.z.	gen N
Fragment 3	ZF 10, 800 p.z.	gen M
Fragment 4	CS 1, 1250 p.z.	gen F
Fragment 5	CS 10, 400 p.z.	gen F
Fragment 6	CS 13, 1450 p.z.	gen F
Fragment 7	CS 13, 760 p.z.	gen F
Fragment 8	ZF 4, 780 p.z.	gen L (poziom białka)
Fragment 9	ZF 10, 330 p.z.	gen L (poziom białka)
Fragment 10	ZF10, 260 p.z.	gen L (poziom białka)

Startery stosowano do amplifikacji RAP-PCR kwasów nukleinowych z izolatu prototypowego.

P r z y k ł a d 5

Dodatkowe badania dwóch podtypów hMPV

Na podstawie analizy filogenetycznej różnych izolatów hMPV otrzymanych dotychczas, zidentyfikowano dwa genotypy, przy czym izolat 00-1 jest prototypem genotypu A, a izolat 99-1 prototypem genotypu B.

Naszą hipotezą jest, że te genotypy są spokrewnione z podtypami oraz że ponowne zakażenie wirusami z obu podgrup nastąpi w obecności wcześniej istniejącej odporności i zmienność antygenowa nie musi być koniecznie potrzebna do wystąpienia ponownego zakażenia.

Ponadto, okazuje się, że hMPV jest blisko spokrewniony z ptasim pneumowirusem, wirusem występującym przede wszystkim u drobiu. Sekwencje nukleotydowe obu wirusów wykazują wysoki procent homologii, z wyjątkiem białek SH i G. Wykazujemy tu, że wirusy reagują krzyżowo w testach, które opierają się głównie na nukleoproteinie i białku macierzy, ale odpowiadały one różnie w testach, które oparte są na białkach przylegania. Różnice mian neutralizacji dostarczają dodatkowego dowodu,

PL 213 926 B1 że dwa genotypy hMPV są dwoma różnymi serotypami jednego wirusa, przy czym APV jest innym wirusem.

Reakcja krzyżowa między dwoma serotypami i reakcja krzyżowa między APV i hMPV

Metody

Protokół do wykrywania przeciwciał IgG, IgA i IgM dla hMPV:

Przeprowadzono pośrednią EIA IgG dla hMPV w płytkach do mikromiareczkowania zasadniczo jak opisano wcześniej (Rothbarth, P.H., 1999; Influenza virus serology-a comparative study. J. of Vir. Methods 78 (1999) 163-169). W skrócie, zatężony hMPV solubilizowano przez traktowanie 1% Triton X-100 i powleczono na 16 godzin w temperaturze pokojowej na płytki do mikromiareczkowania w PBS, po określeniu optymalnego rozcieńczenia roboczego przez miareczkowanie szachownicowe. Następnie, do studzienek dodano 100 pl objętości próbek ludzkiej surowicy rozcieńczonej 1:100 w buforze EIA i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Wiązanie ludzkiej IgG wykrywano przez dodanie koziej anty-ludzkiej IgG sprzężonej z peroksydazą (Biosource, USA). Dodanie TMB jako substratu wywoływało płytki i mierzono OD w 450 nm. Wyniki wyrażono jako stosunek S(ygnał)/N(egatywny) OD. Surowicę uznawano za pozytywną dla IgG jeśli stosunek S/N był poza kontrolą negatywną plus trzy razy standard.

Przeciwciała hMPV klasy IgM i IgA wykrywano w surowicach przez wychwytującą EIA zasadniczo jak opisano wcześniej (Rothbarth, P.H., 1999; Influenza virus serology-a comparative study. J. of Vir. Methods 78 (1999) 163-169). Do wykrywania IgA i IgM wykorzystano dostępne na rynku płytki do mikromiareczkowania powleczone anty-ludzką IgM lub przeciwciałami monoklonalnymi IgA-swoistymi. Surowice rozcieńczono 1:100 po inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, do każdej studzienki dodano optymalne stężenie robocze hMPV (100 pl). Inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po przemyciu, dodano poliklonalne anty-hMPV wyznakowane peroksydazą, płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Dodanie TMB jako substratu wywoływało płytki i mierzono OD w 450 nm. Wyniki wyrażono jako stosunek S(ygnał)/N(egatywny) OD. Surowicę uznawano za pozytywną dla IgG jeśli stosunek S/N był poza kontrolą negatywną plus trzy razy standard.

Przeciwciała APV wykrywano w teście inhibicji APV. Protokół dla testu inhibicji APV obejmował enzymatyczny test immunologiczny APV-Ab SVANOVIR®, produkowany przez SVANOVA Biotech AB, Uppsal Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala, Szwecja. Wyniki wyrażono jako stosunek S(ygnał)/N(egatywny) OD. Surowicę uznawano za pozytywną dla IgG jeśli stosunek S/N był poza kontrolą negatywną plus trzy razy standard.

1. Świnki morskie

A. (Ponowna) infekcja świnek morskich oboma podtypami hMPV

Do szczepienia 6 świnek morskich na podtyp użyto izolatów wirusowych ned/00/01 (podtyp A) i ned/99/01 (podtyp B), (dotchawiczo, donosowo i doocznie).

świnek zakażono hMPV 00-1 (10e6,5 TCID50) świnek zakażono hMPV 99-1 (10e4,1 TCID50) dni po pierwotnym zakażeniu (infekcji), świnki morskie szczepiono homologicznym i heterologicznym podtypem (10e4 TCID50/ml):

świnki morskie: 1-sza infekcja 00-1; 2-ga 99-1 (heterologiczna)

1-sza infekcja 00-1; 2-ga 00-1 (homologiczna)

1-sza infekcja 99-1; 2-ga 00-1 (heterologiczna)

1-sza infekcja 99-1; 2-ga 99-1 (homologiczna)

Zbierano wymazy z gardła i nosa przez 12 dni (1-sza infekcja) lub 8 dni (2-ga infekcja) po zakażeniu i testowano na obecność wirusa za pomocą testów RT-PCR.

Wyniki testu RT-PCR: fig. 29

Omówienie wyników: świnki morskie szczepione izolatem wirusowym ned/00/01 wykazują infekcję górnych dróg oddechowych w dniu 1 do 10 po zakażeniu. Świnki morskie szczepione ned/99/01 wykazują infekcję górnych dróg oddechowych w dniu 1 do 5 po zakażeniu. Zakażenie ned/99/01 okazuje się trochę lżejsze niż zakażenie ned/00/01. Drugie szczepienie świnek morskich heterologicznym wirusem dało ponowną infekcję u 3 z 4 świnek morskich, a homologicznym wirusem i 2 z 6 świnek morskich. Zanotowano brak lub jedynie niewielkie objawy kliniczne u tych zwierząt, które uległy ponownemu zakażeniu i nie zauważono żadnych objawów klinicznych u tych zwierząt, które były zabezpieczone przed ponowną infekcją, pokazując, że nawet dla wirusa dzikiego typu efekt zabezpieczający jest ewidentny, ukazując możliwe zastosowanie heterologicznego (oraz oczywiście homologów) izolatu jako szczepionki, nawet w postaci nieatenuowanej.

świnki morskie:

świnki morskie:

świnki morskie:

PL 213 926 B1

Oba podtypy hMPV są zdolne do zakażania świnek morskich, choć infekcja podtypem B (ned/99/01) wydaje się lżejsza (krótszy okres obecności wirusa w nosie i gardle) niż infekcja podtypem A (ned/00/01). Może to być spowodowane wyższą podaną dawką dla podtypu A, albo niższą wirulencją podtypu B.

Chociaż obecność wcześniej istniejącej odporności nie zabezpiecza w sposób pełny przed ponowną infekcją wirusem, zarówno homologicznym jak i heterologicznym, infekcja okazuje się mniej wyraźna jako, że zanotowano krótszy okres występowania wirusa oraz nie wszystkie zwierzęta stały się pozytywne pod względem obecności wirusa.

B. Serologia świnek morskich zakażonych oboma serotypami hMPV

W dniu 0, 52, 70, 80, 90, 110, 126 i 160 od świnek morskich pobrano surowice i testowano w rozcieńczeniu 1:100 za pomocą ELISA całego wirusa przeciwko antygenowi ned/00/01 i ned/99/01.

Fig. 30A i B: Odpowiedź IgG przeciwko ned/00/01 i ned/99/01 dla każdej poszczególnej świnki morskiej.

Fig. 31: Swoistość ELISA ned/00/01 i ned/99/01. Wykorzystano tylko dane od świnek morskich ponownie zakażonych homologicznie.

Fig. 32: Średnia odpowiedź IgG przeciwko ned/00/01 i ned/99/01 w ELISA u 3 homologicznie (00-1/00-1), 2 homologicznie (99-1/99-1), 2 heterologicznie (99-1/00-1) i 2 heterologicznie (00-1/99-1) zakażonych świnek morskich.

Omówienie wyników:

Zaobserwowano jedynie pomniejsze różnice w odpowiedzi na dwie różne ELISA. ELISA całego wirusa przeciwko 00-1 lub 99-1 nie może być stosowana do odróżniania tych dwóch podtypów.

C. Reaktywność surowic wzbudzonych przeciwko hMPV u świnek morskich z antygenem APV

Surowice pobrane od zakażonych świnek morskich testowano za pomocą ELISA inhibicji APV.

Fig. 33; Średni procent inhibicji APV u świnek morskich zakażonych hMPV.

Omówienie wyników:

Surowice wzbudzone przeciwko hMPV u świnek morskich, reagują w teście inhibicji APV w taki sam sposób jak reagują w ELISA IgG hMPV.

Surowice wzbudzone przeciwko ned/99/01 wykazują niższy procent inhibicji w ELISA inhibicji APV niż surowice wzbudzone przeciwko ned/00/01. Świnki morskie zakażone z ned/99/01 mogły mieć niższe miano (jak widać przy ELISA hMPV) lub reakcja krzyżowa ned/99/01 z APV jest mniejsza niż ned/00/01. Niemniej jednak ELISA inhibicji APV-Ab można stosować do wykrywania przeciwciał hMPV u świnek morskich.

D. Testy neutralizacji wirusa z surowicami wzbudzonymi przeciwko hMPV u świnek morskich.

Surowice pobrane w dniu 0, dniu 52, 70 i 80 po zakażeniu wykorzystano w teście neutralizacji (krzyżowej) wirusa z użyciem ned/00/01, ned/99/01 i APV-C. Wyjściowym rozcieńczeniem było 1 do 10 i stosowano 100 TCID50 wirusa na studzienkę. Po neutralizacji wirusa przeniesiono na komórki tMK, wirowano przez 15 minut przy 3500 obrotach na minutę, po czym pożywkę wymieniono na świeżą.

Testy APV hodowano przez 4 dni, a testy hMPV hodowano przez 7 dni. Komórki utrwalono 80% acetonem i przeprowadzono IFA z małpimi, anty-hMPV znakowanymi fitc. Studzienki, które były negatywne w barwieniu, uznawano za miano neutralizujące. Dla każdego wirusa włączono miano 10 log roztworu macierzystego wirusa i 2-krotne miano roztworu roboczego.

Fig. 34: Miana neutralizacji wirusa świnek morskich zakażonych ned/00/01 i ned/99/01 przeciwko ned/00/01, ned/99/01 i APV-C.

2. Makaki jawajskie

A. (Ponowna) infekcja makaków jawajskich oboma podtypami hMPV

Do szczepienia 2 makaków jawajskich na podtyp użyto izolatów wirusowych ned/00/01 (podtyp A) i ned/99/01 (podtyp B) (1e5TCID50) (dotchawiczo, donosowo i doocznie). Sześć miesięcy po pierwszym zakażeniu, makaki szczepiono drugi raz ned/00/01. Pobierano wymazy z gardła przez 14 dni (1-sza infekcja) lub 8 dni (2-ga infekcja) po zakażeniu i testowano na obecność wirusa za pomocą testów RT-PCR.

Fig. 35: Wyniki testów RT-PCR wymazów z gardła makaków jawajskich szczepionych (dwukrotnie) ned/00/01.

Podsumowanie wyników:

Krótkie omówienie wyników: makaki jawajskie szczepione izolatem wirusowym ned/00/01 wykazują infekcję górnych dróg oddechowych w dniu 1 do 10 po zakażeniu. Objawy kliniczne obejmowaPL 213 926 B1 ły ropny nieżyt nosa. Drugie szczepienie makaków homologicznym wirusem spowodowało ponowną infekcję, co wykazała PCR, jednak nie zauważono żadnych objawów klinicznych.

B. Serologia na surowicach pobranych od makaków jawajskich zakażonych hMPV

Od makaków, które otrzymały ned/00/01 pobierano surowice przez 6 miesięcy po pierwszym zakażeniu (ponowne zakażenie wystąpiło w dniu 240 dla małpy 3 i w dniu 239 dla małpy 6).

Surowice użyto do testu na obecność przeciwciał IgG przeciwko albo ned/00/01 albo APV, oraz na obecność przeciwciał IgA i IgM przeciwko ned/00/01.

Wyniki: fig. 36A

Odpowiedź IgA, IgM i IgG przeciwko ned/00/01 u 2 makaków jawajskich (ponownie) zakażonych ned/00/01.

Fig. 36B

Odpowiedź IgG przeciwko APV z 2 makaków jawajskich zakażonych ned/00/01.

Krótkie omówienie wyników:

Dwa makaki zakażono z powodzeniem ned/00/01 i w obecności przeciwciał przeciwko ned/00/01 zakażono ponownie homologicznym wirusem. Odpowiedź na przeciwciała IgA i IgM wykazuje wzrost przeciwciał IgM po pierwszym zakażeniu oraz jego brak po ponownym zakażeniu. Przeciwciała IgA wykrywa się jedynie po ponownym zakażeniu, co wykazuje natychmiastowość odpowiedzi odpornościowej po pierwszym zakażeniu. Surowice przeciwko hMPV u makaków, które były testowane w ELISA inhibicji APV wykazują podobną odpowiedź jak w ELISA IgG hMPV.

Omówienie/wnioski

Przeciwciała hMPV u makaków jawajskich wykrywa się za pomocą ELISA inhibicji APV z podobną czułością jak dla ELISA hMPV, a zatem EIA inhibicji APV jest odpowiednia do testowania próbek ludzkich na obecność przeciwciała hMPV.

C. Testy (krzyżowej) neutralizacji wirusa z surowicami pobranymi od makaków jawajskich zakażonych hMPV.

Krótkie omówienie wyników: Surowice pobierane od dnia 0 do dnia 229 po pierwszym zakażeniu wykazują jedynie niskie miana neutralizacji wirusa przeciwko ned/00/01 (0-80), surowice pobierane po powtórnym zakażeniu wykazują wysokie miana neutralizacji przeciwko ned/00/01:>1280. Tylko surowice pobrane po powtórnym zakażeniu wykazują miana neutralizacji przeciwko ned/99/01 (80640) i żadna z surowic nie neutralizuje wirusa APV-C.

Nie występuje reakcja krzyżowa między APV-C i hMPV w testach (krzyżowej) neutralizacji wirusa, przy czym istnieje reakcja krzyżowa między ned/00/01 i ned/99/01 po wzmocnieniu odpowiedzi przeciwciał.

3. Ludzie

Surowice od pacjentów w wieku <6 miesięcy do >20 lat testowano uprzednio za pomocą testów IFA i neutralizacji wirusa przeciwko ned/00/01 (patrz tablica 1 opisu).

Przetestowaliśmy tutaj wiele z tych surowic na obecność przeciwciał IgG, IgM i IgA w ELISA przeciwko ned/00/01 i testowaliśmy próbki w ELISA inhibicji APV.

Wyniki: Fig. 37. Porównanie wykorzystania ELISA hMPV i ELISA inhibicji APV do wykrywania przeciwciał IgG w ludzkich surowicach, istnieje silna korelacja między testem IgG hMPV oraz testem APV-Ab, zatem test APV Ab jest zasadniczo zdolny do wykrywania przeciwciała IgG wobec hMPV u ludzi.

4. Drób kur przetestowano zarówno testem ELISA inhibicji APV jak i ELISA ned/00/01 na obecność przeciwciała IgG przeciwko APV.

Krótkie omówienie wyników: zarówno ELISA hMPV jak i ELISA inhibicji APV wykrywają przeciwciała przeciwko APV (dane nieukazane).

Krótkie omówienie wyników:

Znaleźliśmy dwa genotypy hMPV, przy czym ned/00/01 jest prototypem podgrupy A, a ned//00/01 jest prototypem podgrupy B.

„Zgodnie z klasycznymi analizami serologicznymi (jak np. Francki, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L. i Brown, F., Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the international Committee on Taxonomy of Viruses. Arch Virol., 1991. Suplement 2: str. 140-144), można określić dwa podtypy na podstawie ich różnic immunologicznych, co określono przez ilościowe testy neutralizacji z użyciem zwierzęcych surowic odpornościowych. Dwa różne serotypy wykazują albo brak reaktywności krzyżowej między sobą, albo wykazują stosunek mian homologiczny do heterologicznego

PL 213 926 B1 >16 w obu kierunkach. Jeśli neutralizacja wykazuje pewien stopień reakcji krzyżowej między dwoma wirusami w każdym lub obu kierunkach (stosunek miana homologicznego do heterologicznego wynoszący osiem lub 16), zakłada się odmienność serotypu, jeśli istnieją zasadnicze różnice biofizyczne/biochemiczne DNA. Jeśli neutralizacja wykazuje różny stopień reakcji krzyżowej między dwoma wirusami w każdym lub obu kierunkach (stosunek miana homologicznego do heterologicznego jest mniejszy niż osiem), zakłada się identyczność serotypu badanych izolatów.”

W przypadku RSV wiadomo, że ponowna infekcja występuje w obecności wcześniej istniejącej odporności (zarówno homologicznej jak i heterologicznej). Zakażenie świnek morskich oraz makaków jawajskich zarówno homologicznym jak i heterologicznym serotypem hMPV pokazało, że jest to także prawdą dla hMPV. Poza tym ELISA IgA i IgM przeciwko hMPV ujawniła, że reakcja przeciwciał IgA występuje jedynie po ponownej infekcji. Surowice wzbudzone przeciwko hMPV lub APB odpowiadają w równy sposób w ELISA APV i hMPV. Z porównania sekwencji nukleotydowych wiadomo, że wirusy wykazują około 80% homologii aminokwasowej dla genów N, P, M i F. W ELISA, białka N i M są głównymi reagującymi antygenami. Testy neutralizacji wirusa (o którym wiadomo, że reaguje przeciwko glikoproteinom powierzchniowym G, SH i F) pokazują różnicę między dwiema surowicami. Chociaż APV i hMPV reagują krzyżowo w ELISA, analizy filogenetyczne sekwencji nukleotydowych hMPV i APV, różnice mian neutralizacji wirusa surowic wzbudzonych przeciwko dwóm różnym wirusom oraz różnice w wykorzystaniu przez gospodarza, ponownie wykazują, że APV-C i hMPV są dwoma innymi wirusami. Na podstawie tych wyników spekulujemy, że infekcja hMPV u ssaków jest prawdopodobnie wynikiem zoonozy, która przeszła z ptaków na ssaki. Lecz wirus dostosował się w taki sposób (czyli białka G i SH), że powrotna zoonoza (ze ssaków na ptaki) wydaje się nieprawdopodobna, zważywszy na obecność APV u ptaków.

Dodatek

Podstawowe wiadomości o Pneumovirinae

Rodzina Paramyxoviridae obejmuje dwie podrodziny: Paramyxovirinae i Pneumovirinae. Podrodzina Pneumovirinae składa się z dwóch rodzajów: Pneumovirus i Metapneumovirus. Rodzaj Pneumovirus zawiera wirusy syncytialne dróg oddechowych ludzi, bydła, owiec i kóz oraz wirus zapalenia płuc myszy (PVM). Rodzaj Metapneumowvirus zawiera pneumowirusy ptasie (APV, przytaczane także jako TRTV).

Klasyfikacja rodzaju w podrodzinie Pneumovirinae opiera się na klasycznych cechach wirusa, porządku genowym i konstelacji genów. Wirusy rodzaju Pneumovirus są unikatowe w rodzinie Paramyxoviridae dlatego, że zawierają dwa białka niestrukturalne na końcu 3' genomu (3'-NS1-NS2-N-PM-SH-G-F-M2-L-5'). W przeciwieństwie do tego, wirusy z rodzaju Metapneumovirus nie posiadają genów NS1 i NS2, a organizacja genów między regionami kodującymi M i L jest inna: 3'-N-P-M-F-M2SH-G-L-5'.

Wszyscy członkowie podrodziny Paramyxovirinae mają aktywność hemaglutynacji, lecz funkcja ta nie jest cechą definiującą dla podrodziny Pneumovirinae, gdyż nie występuje u RSV i APV, lecz występuje u PMV. Aktywność neuraminidazy występuje u członków rodzaju Paramyxovirus i Rubulavirus (podrodzina Paramyxovirinae), lecz nie występuje w rodzaju Morbillivirus (podrodzina Paramyxovirinae) i rodzaju Pneumovirus oraz Metapneumovirus (podrodzina Pneumovirinae).

Drugą cechą odróżniającą podrodzinę Pneumovirinae jest widocznie ograniczone wykorzystanie alternatywnych ORF w mRNA przez RSV. W przeciwieństwie do tego, kilku członków podrodziny Paramyxovirinae, takich jak wirusy Sendai i odry, mają dostęp do alternatywnych ORF w mRNA, kodując fosfoproteinę (P) kierującą syntezą nowego białka.

Białko G Pneumovirinae nie wykazuje pokrewieństwa sekwencji lub podobieństwa strukturalnego z białkami HN lub H Paramyxovirinae i ma tylko połowę wielkości ich długości łańcucha. Poza tym, białka N i P są mniejsze niż ich odpowiednik i w Paramyxovirinae i nie posiadają wyraźnej homologii sekwencji. Większość niesegmentowanych wirusów RNA o ujemnej nici posiada pojedyncze białko macierzy (M). Członkowie podrodziny Pneumovirinae są wyjątkiem, ponieważ posiadają dwa takie białka, M i M2. Białko M jest mniejsze niż jego odpowiednik z Paramyxovirinae i nie ma pokrewieństwa sekwencji z Paramyxovirinae.

W hodowli komórkowej członkowie podrodziny wykazują typowy efekt cytopatyczny; indukują charakterystyczne tworzenie syncytiów komórkowych. (Collins, 1996).

Podrodzina Pneumovirinae, rodzaj Pneumovirus hRSV jest typowym gatunkiem rodzaju Pneumovirus i jest główną i szeroko rozprzestrzenioną przyczyną chorób dolnych dróg oddechowych niemowląt i małych dzieci (Selwyn, 1990). Poza tym,

PL 213 926 B1 hRSV jest coraz częściej rozpoznawany jako istotny patogen w innych grupach pacjentów, łącznie z osobnikami o upośledzonej odporności oraz u osób starszych. RSV jest także istotną przyczyną zapalenia płuc nabytego w grupie hospitalizowanych dorosłych w każdym wieku (Englund, 1991; Falsey, 2000; Dowell, 1996). Zidentyfikowano dwa główne typy antygenowe RSV (A i B) na podstawie różnic ich reaktywności z przeciwciałami monoklonalnymi i poliklonalnymi oraz za pomocą analiz sekwencji kwasu nukleinowego (Anderson, 1985; Johnson, 1987; Sullender, 2000). Do odróżniania tych dwóch podtypów wykorzystuje się w szczególności białko G. RSV-A i B dzielą jedynie 53% homologii sekwencji aminokwasowej w G, podczas gdy inne białka wykazują wyższą homologię między podtypami (tablica 1) (Collins, 1996).

Opisano wykrywanie infekcji RSV przy użyciu przeciwciał monoklinalnych i poliklonalnych w technikach immunofluorescencyjnych (DIF, IFA), testach neutralizacji wirusa i ELISA albo testach RT-PCR (Rothbarth, 1988; Van Milaan, 1994; Coggins, 1998). Blisko spokrewnione z hRSV są RSV bydła (bRSV), owiec (oRSV) i kóz (oRSV), z czego bRSV zbadano najdokładniej. Na podstawie homologii sekwencji z hRSV, RSV przeżuwaczy klasyfikuje się w obrębie rodzaju Pneumovirus, podrodzinie Pneumovirinae (Collins, 1996). Diagnoza infekcji RSV przeżuwaczy i podtypowanie opiera się na łącznym wykorzystaniu serologii, wykrywania antygenu, izolacji wirusa i testach RT-PCR (Uttenthal, 1996; Valarcher, 1999; Oberst, 1993; Vilcek, 1994).

Przeprowadzono kilka analiz organizacji molekularnej bRSV, przy użyciu ludzkich i bydlęcych surowic odpornościowych, przeciwciał monoklonalnych i sond cDNA. Te analizy pokazały, że składy białkowe hRSV i bRSV są bardzo podobne, a organizacja genomu bRSV przypomina tę z hRSV. Zarówno dla bRSV jak i hRSV białka G i F stanowią główne antygeny neutralizacyjne i zabezpieczające. Białko G jest bardzo zmienne między podtypami hRSV oraz między hRSV i bRSV (odpowiednio 53 i 28%) (Prozzi, 1997; Lerch, 1990). Białka F szczepów hRSV i bRSV prezentują porównywalne cechy strukturalne i pokrewieństwo antygenowe. Białko F bRSV wykazuje 80-81% homologii z hRSV, podczas gdy dwa podtypy hRSV dzielą 90% homologii w F (Walravens, K, 1990).

Badania na podstawie stosowania przeciwciał swoistych wobec hRSV i bRSV sugerowały istnienie różnych podtypów antygenowych bRSV. Podtypy A, B i AB wyróżnia się na podstawie wzorów reakcji przeciwciał monoklonalnych swoistych dla białka G (Furze, 1994; Prozzi, 1997; Elvander, 1998). Epidemiologia bRSV jest bardzo podobna do hRSV. Spontaniczne infekcje u młodego bydła towarzyszą często ciężkim oznakom ze strony układu oddechowego, podczas gdy infekcja doświadczalna generalnie wywołuje łagodniejszą chorobę z delikatnymi zmianami patologicznymi (Elvander, 1996).

RSV wyizolowano także od naturalnie zakażonych owiec (oRSV) (LeaMaster, 1983) i kóz (cRSV) (Lehmkuhl, 1980). Oba szczepy dzielą 96% sekwencji nukleotydowej z bydlęcym RSV i antygenicznie reagują krzyżowo. Zatem, wirusy te klasyfikuje się także w obrębie rodzaju Pneumovirus.

Innym członkiem podrodziny Pneumovirinae, rodzaj Pneumovirus, jest wirus zapalenia płuc myszy (PVM).

PVM jest powszechnym patogenem w koloniach zwierząt laboratoryjnych, szczególnie tych, które zawierają myszy bezgrasicze. Naturalnie nabyta infekcja jest uważana za asymptomatyczną, choć pasaż wirusa w płucach myszy skutkował jawnymi objawami choroby, od infekcji górnych dróg oddechowych do śmiertelnego zapalenia płuc (Richter, 1988; Weir, 1988).

Opisano ograniczoną serologiczną reaktywność krzyżową między białkiem nukleokapsydu (N) i fosfoproteiną (P) PVM i hRSV, lecz żadne z białek zewnętrznych nie wykazuje reaktywności krzyżowej, a wirusy można odróżnić od siebie za pomocą testów neutralizacji wirusa (Chambers, 1990a; Gimenez, 1984; Ling, 1989a).

Glikoproteiny PVM jak się okazuje, różnią się od innych paramyksowirusów i przypominają RSV pod względem wzoru glikozylacji. Różnią się jednak pod względem obróbki. Inaczej niż RSV, lecz podobnie do innych paramoksowirusów, PVM ma aktywność hemaglutującą z erytrocytami gryzoni, za którą, jak się wydaje, odpowiada białko G, ponieważ przeciwciało monoklonalne wobec tego białka hamuje hemaglutynację (Ling, 1989b).

Genom PVM przypomina hRSV, łącznie z dwoma białkami niestrukturalnymi na końcu 3' i podobną organizacją genomu (Chambers, 1990a; Chambers, 1990b). Sekwencje nukleotydowe genów NS1/NS2 PVM nie są w sposób wykrywalny homologiczne z hRSV (Chambers, 1991). Niektóre białka PVM wykazują silną homologię z hRSV (N: 60% i F: 38 do 40%), choć G jest zupełnie różne (sekwencja aminokwasowa jest 31% dłuższa) (Barr, 1991; Barr, 1994; Chambers, 1992). Opisano, że gen P PVM, lecz nie ten z RSV czy APV, koduje drugą ORF reprezentującą unikatowe białko PVM (Collins,

PL 213 926 B1

1996). Nowe izolaty PVM identyfikuje się przez izolacje wirusa, testy hemaglutynacji, test neutralizacji wirusa i różne techniki immunofluorescencyjne.

Tablica w dodatku: Homologia aminokwasowa między różnymi wirusami w obrębie rodzaju Pneumovirus podrodziny Pneumovirinae.

Gen	hRSV	bRSV	oRSV względem hRSV	bRSV względem hRSV	bRSV względem oRSV	PVM względem hRSV
NS1	87			68-69	89	*
NS2	92			83-84	87	*
N	96		93			60
P	-		81
M	-		89
F	89			80-81		38-40
G	53	88-100	21-29	38-41	60-62	*
M2	92		94			41
SH	76		45-50		56
L	-

* Brak wykrywalnej homologii sekwencji

Rodzaj Metapneumovirus

Ptasie pneumowirusy (APV) zidentyfikowano jako czynnik etiologiczny nieżytu nosa i tchawicy indyków (McDougall, 1986; Collins, 1988) i są zatem często przytaczane jako wirusy nieżytu nosa i tchawicy indyków (TRTV). Chorobą tą jest infekcja górnych dróg oddechowych indyków, wywołująca wysoką chorobowość i zmienną, lecz często wysoką, śmiertelność. U indyczek, wirus może także indukować znaczną redukcję nieśności. Ten sam wirus może także zakażać kur, lecz u tego gatunku rola wirusa jako patogenu pierwotnego jest mniej jasno określona, choć zwykle tworzyszy jej zespół obrzęku głowy (SHS) u kurcząt rozpłodowych (Cook, 2000). Wiriony są pleomorficzne, choć głównie sferyczne, o wielkości od 70 do 600 mn, a nukleokapsyd, zawierający liniowy, niesegmentowany, o ujemnej nici genom RNA, wykazuje symetrię helikalną (Collins, 1986; Giraud, 1986). Ta morfologia przypomina członków rodziny Paramyxoviridae. Analizy białek kodowanych przez APV oraz RNA sugerowały, że z dwóch podrodzin tej rodziny (Paramyxovirinae i Pneumovirinae) APV nabliżej przypominał Pneumovirinae (Collins, 1988; Ling, 1988; Cavanagh, 1988).

APV nie posiada białek niestrukturalnych (NS1 i NS2), a porządek genowy (3'-N-P-M-F-M2-SHG-L-5') jest innym niż u pneumowirusów ssaczych, takich jak RSV. APV został więc ostatnio sklasyfikowany jako typowy gatunek dla nowego rodzaju Metapneumovirus (Pringle, 1999).

Różnice wzorów neutralizacji, ELISA i reaktywność z przeciwciałami monoklonalnymi ujawniły istnienie różnych typów antygenowych APV. Sekwencjonowanie nukleotydowe genu G doprowadziło do określenia dwóch podtypów (A i B), które dzielą tylko 38% homologii aminokwasowej (Collins, 1993; Juhasz, 1994). APV wyizolowany z Colorado, USA (Cook, 1999) słabo neutralizował krzyżowo podtyp A i B wirusów i na podstawie informacji o sekwencji przypisano go do nowego podtypu, C (Seal, 1998; Seal, 2000). Dwa nie-A/nie-B APV wyizolowano we Francji i okazały się one antygenowo inne niż podtypy A, B i C. Na podstawie sekwencji aminokwasowych genów F, L i G, wirusy te sklasyfikowano ponownie jako nowy podtyp D (Bayon-Auboyer, 2000).

Rozpoznanie infekcji APV można uzyskać przez izolację wirusa na hodowlach narządów tchawicznych kur lub indyków (TOC) lub w hodowlach komórek Vero. Efekt cytopatyczny (CPE) obserwuje się generalnie po jednym lub dwóch dodatkowych pasażach. Ten CPE charakteryzujące się rozsianym ogniskowym obszarem okrągłych komórek, prowadzącym do tworzenia syncytiów (Buys, 1989). Opracowano liczne testy serologiczne włączając IF i testy neutralizacji wirusa. Wykrywanie przeciwciał

PL 213 926 B1 wobec APV przez ELISA jest najpowszechniej stosowaną metodą (O'Loan, 1989; Gulati, 2000). Ostatnio, do diagnozowania infekcji APV wykorzystuje się łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Jako materiał wyjściowy można wykorzystać wymazy pobrane z przełyku (Bayon-Auboyer, 1999; Shin, 2000).

Alansari, H. i Potgieter, L.N.D. 1994. Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of the ovine respiratory syncytial virus non-structural 1C and 1B genes and the small hydrophobic protein gene. J.Gen.Virol. 75: 401-404.

Alansari, H., Duncan B.B., Baker, J.C. i Potgieter, L.N. 1999. Analysis of ruminant respiratory syncytial virus isolates by RNAse protection of the G glycoprotein transcripts. J. Vet.Diagn. Invest. 11: 215-20.

Anderson, L.J., Hierholzer, J.C., Tsou, C., Hendry, R.M., Fernic, B.F., Stone, Y. i McIntosh, K. 1985. Antigenic characterisation of respiratory syncytial virus strains with monoclonal antibodies. J. Inf. Dis. 151: 626-633.

Barr, J., Chambers, Pringle, C.R., Easton, A.J. 1991. Sequence of the major nucleocapsid protein gene of pneumonia virus of mice: sequence comparisons suggest structural homology between nucleocapsid proteins of pneumoviruses, paramyxoviruses, rhabdoviruses and filoviruses. J.Gen.Virol. 72: 677-685.

Barr, J., Chambers, P., Harriott, P., Pringle, C.R. i Easton, A.J. 1994. Sequence of the phosphoprotein gene of pneumonia virus of mice: expression of multiple proteins from two overlapping rading frames. J. Virol. 68: 5330-5334.

Bayon-Auboyer, M.H., Jestin, V., Toquin, D., Cherbonnel, M. i Eterradosi, N. 1999. Comparison of F-, G- and N-based RT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitis virus. Arch.Vir. 144: 1091-1109.

Bayon-Auboyer, M.H., Arnauld, C., Toquin, D., i Eterradossi, N. 2000. Nucleotide sequences of the F, L and G protein genes of two non-A/non-B avian pneumoviruees (APV) reveal a novel APV subgroup. J.Gen.Virol. 81: 2723-2733.

Buys, S.B., Du Preez, J.H. i Els, H.J. 1989. The isolation and attenuation of a virus causing rhinotracheitis in turkeys in South Africa. Onderstepoort J.Vet.Res. 56; 87-98.

Cavanagh, D. i Barrett, T. 1988. Pneumovirus-Iike characteristics of the mRNA and proteins of turkey rhinotracheitis virus. Virus Res. 11: 241-256.

Chambers, P., Pringle, C.R. i Easton, A.J. 1990a. Molecular cloning of pneumonia virus of mice. J. Virol. 64: 1869-1872.

Chambers, P., Matthews, D.A, Pringle, C.R. i Easton, A.J. 1990b. The nucleotide sequences ofintergenic regions between nine genes of pneumonia virus of mice establish the physical order of these genes in the viral genome. Virus Res. 18: 263-270.

Chambers, P., Pringle, C.R., i Easton, A.J. 1991. Genes 1 and 2 of pneumonia virus of mice encode proteins which have little homology with the 1C and 1B proteins of human respiratory syncytial virus. J.Gen.Vir. 72: 2545-2549.

Chambers, P. Pringle CR, Easton AJ. 1992. Sequence analysis of the gene encoding the fusion glycoprotein of pneumonia virus of mice suggests possible conserved secondary structure elements in pramyxovirus fusion glycoproteins. J. Gen. Virol. 73: 1717-1724.

Coggins, W.B., Lefkowitz, E.J. i Sullender, W.M. 1998. Genetic variability among group A and group B respiratory syncytial viruses in a children's hospital, J. Clin. Microbiol. 36: 3552-3557.

Collins, M.S. i Gough, R.E., Lister, S.A., Chettle, N. i Eddy, R. 1986. Further characterisation of a virus associated with turkey rhiotracheitis. Vet. Rec. 119: 606.

Collins, M.S. i Gough, R.E. 1988. Characterisation of a virus associated with turkey rhinotracheitis. J. Gen.Virol. 69: 909-916.

Collins, M.S., Gough, R.E., i Alexander, D.J. 1993. Antigenic differentiation of avian pneumovirus isolates using polyclonal antisera and mouse monoclonal antibodies. Avian Pathology 22: 469-479.

Collins, P.L., McIntosh, K., Chanock, R.M. 1996. Eespiratory syncytial virus. P. 1313-1351. w: B.N. Fields, D.M. Knipe, i P.M. Howley (wydawcy). Fields virology, 3-cie wydanie, tom 1 LippincottRaven, Philadelphia, Pa, USA.

Cook, J.K.A., Huggins, M.B., Orbell, S.J. i Senne, D.A. 1999. Preliminiary antigenic characterization of an avian pneumovirus isolated from commercial turkeys in Colorado, USA. Avian pathol. 28: 607-617.

PL 213 926 B1

Cook, J.K.A. 2000. Avian rhinotracheitis. Rev. Scitech. off int. Epiz. 19: 602-613.

Dowell, S.F., Anderson, L.J., Gary, H.E., Erdman, D.D., Plouffe, J.P., File, T.M., Marston, B.J. i Breiman, R.F. 1996. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174: 456-462.

Elvander, M. 1996. Severe respiratory disease in dairy cows caused by infection with bovine respiratory syncytial virus. Vet. Rec. 138: 101-105.

Elvander, M., Vilcek, S., Baule, C., Uttenthal, A., Ballagi-Pordany, A. i Belak, S.1998. Genetic and antigenic analysis of the G attachment protein of bovine respiratory syncytial virus strains. J. Gen. Virol. 79: 2939-2946.

Englund, J.A., Anderson, L.J., i Rhame, F.S. 1991. Nosocomial transmission of respiratory syncytial virus in immunocompromised adults. J. Clin. Microbiol. 29: 115-119.

Falsey, A.R. i Walsh, E.E. 2000. Respiratory syncytial virus infection in adults. Clin. Microb. Rev. 13: 371-84.

Furze, J., Wertz, G., Lerch, R. i Taylor, G. 1994. Antigenic heterogeneity of the attachment protein of bovine respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 75: 363-370.

Gimenez, H.B., Cash, P. i Melvin, W.T. 1984. Monoclonal antibodies to human respiratory syncytial virus and their use in comparison of different virus isolates. J. Gen. Virol. 65: 963-971.

Gulati, B.R., Cameron, K.T., Seal, B.S, Goyal, S.M., Halvorson, DA. i Njenga, M.K. 2000. Development of a highly sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant matrix protein for detection of avian pneumovirus antibodies. J. Clin. Microbiol. 38: 4010-4.

Johnson, P.R., Spriggs M.K., Olmsted, E.A. i Coiling, P.L. 1987. The G glycoprotein of human respiratory syncytial virus subgroups A and B: extensive sequence divergence between antigenically related proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5625-5629.

Juhasz, K. i Easton, A.J. 1994. Extensive sequence variation in the attachment (G) protein gene of avian pneumovirus: evidence for two distinct subgroups. J. Gen. Virol. 75: 2873-2880.

LeaMaster, B.R., Evermann, J.F., Mueller, M.K., Prieur, M.K. i Schlie, J.V. 1983. Serologic studies on naturally occurring respiratory syncytial virus and Haemophilus sommus infections in sheep. American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians 26: 265-276.

Lehmkuhl, H.D., Smith, M.H., Cutlip, R.C. 1980. Morphogenesis and structure of caprine respiratory syncytial virus. Arch.Vir. 65: 269-76.

Lerch, R.A., Anderson, K. i Wertz, G.W. 1990. Nucleotide sequence analysis and expression from recombinant vectors demonstrate that the attachment protein G of bovine respiratory syncytial virus is distinct from that of human respiratory syncytial virus. J. Virol. 64: 5559-5569.

Ling, E. i Pringle, C.R. 1988. Turkey rhinotracheitis virus: in vivo and in vitro polypeptide synthesis. J. Gen. Virol. 69: 917-923.

Ling, R. i Pringle, C.R. 1989a. Polypeptides of pneumonia virus of mice. I. Immunological crossreactions and post-translational modifications. J. Gen. Virol. 70: 1427-1440.

Ling, R. i Pringle, C.R. 1989b. Polypeptides of pneumonia virus of mice. II. Characterization of the glycoproteins. J. Gen. Virol. 70: 1441-1452.

McDougall, J.S. i Cook, J.K.A. 1986. Turkey rhinotracheitis: preliminary investigations. Vet. Rec. 118: 206-207.

Oberst, R.D., M.P. Hays, K.J. Hennessy, L.C. Stine, J.F. Evermann, i Kelling, C.L. 1993. Characteristic differences in reverse transcription polymerase chain reaction products of ovine, bovine and human respiratory syncytial viruses. J. Vet. Diagn. Investig. 5: 322-328.

O'Loan, C.J., Allan, G., Baxter-Jones, C. i McNulty, M.S. 1989. An improved ELISA and serum neutralisation test for the detection of turkey rhinotracheitis virus antibodies- J. Virol. Meth. 25: 271-282.

Paccaud, M.F. i Jacquier, C., 1970. A respiratory syncytial virus of bovine origin. Arch. Ges.Virusforsch. 30: 327-342.

Pringle, C.R. 1999 Virus taxonomy at the Xith international congress of virology, Sydney, Australia 1999. Arch. Virol. 144/2: 2065-2070.

Prozzi, D., Walravens, K., Langedijk, J.P.M, Daus, F., Kramps, J.A. i Letesson, J.J. 1997. Antigenic and molecular analysis of the variability of bovine respiratory syncytial virus G glycoprotein. J. Gen. Virol. 78: 359-366.

Randhawa, J.S., Marriott, A.C., Pringle, C.R., i A.J. Easton 1997. Rescue of synthetic minireplicons establish the absence of the NS1 and NS2 genes from avian pneumoviruses. J. Virol. 71:

9849-9854.

PL 213 926 B1

Richter, C.B., Thigpen, J.E., Richter, C.S. i Mackenzie, J.M. 1988. Fatal pneumonia with terminal emaciation in nude mice caused by pneumonia vrius of mice. Lab. Anim. Sci. 38: 255-261.

Rothbarth, P.H., Habova, J.J. i Masurel, N. 1988. Rapid diagnosis of infections caused by respiratory syncytial virus. Infection 16: 252.

Seal, B.S. 1998. Matrix protein gene nucleotide and predicted amino acid sequence demonstrate that the first US avian pneumovirus isolate is distinct form European strans. Virus Res. 58, 45-52.

Seal, B.S., Sellers, H.S., Meinersmann, R.J. 2000. Fusion protein predicted amino acid sequence of the first US avian pneumovirus isolate and lack of heterogeneity among other US isolates. Virus Res. 66: 139-147.

Selwyn, B.J. 1990. The epidemiology of acute respiratory tract infection in young children: comparison findings from several developing countries. Rev. Infect. Dis. 12: S870-S888.

Shin, H.J., Rajashekara, G., Jirjis, F.F., Shaw, D.P., Goyal, S.M., Halvorson, D.A. i Nagaraja, K.V 2000. Specific detection of avian pneumovirus (APV) US isolates by RT-PCR. Arch. Virol. 145: 1239-1246.

Sullender, W.M. 2000. Respiratory syncytial virus genetic and antigenic diversity. Clin. Microb. Rev. 13: 1-15.

Trudel, M., Nadon, F., Sinnard, C., Belanger, F., Alain, R., Seguin, C. i Lussier, G. 1989. Comparison of caprine, human and bovine strains of respiratory syncytial virus. Arch. Vir. 107: 141-149.

Uttenthal, A., Jensen, N.P.B. i Blom, J.Y. 1996. Viral aetiology of enzootic pneumonia in Danish dairy herds, diagnostic tools and epidemiology. Vet. Rec. 139, 114-117.

Valarcher, J., Bourhy, H., Gelfi, J. i Schelcher, F. 1999. Evaluation of a nested reverse transcription-PCR assay based on the nucleoprotein gene for diagnosis of spontaneous and experimental bovine respiratory syncytial virus infections. J. Clin. Microb. 37: 1868-1862.

Van Milaan, A.J., Sprenger, J.J., Rothbarth, P.H., Brandenburg, A.H., Masurel, N. i Claas, E.G. 1994. Detection of respiratory syncytial virus by RNA-polymerase chain reaction and differentiation of subgroups with ohgonucleotide probes. J.Med.Virol. 44: 80-87.

Vilcek, S, Elvander, M., Ballagi-Pordany, A., i Belak, S. 1994. Development of nested PCR assays for detection of bovine respiratory syncytial virus in clinical samples. J. Clin. Microb. 32: 2225-2231.

Walravens, K., Kettmann, R., Collard, A., Coppe, P. i Burny, A., 1990. Sequence comparison between the fusion protein of human and bovine respiratory syncytial viruses. J. Gen. Virol. 71: 3009-3014.

Weir, E.G., Brownstein, D.G., Smith, A.L. i Johnson, E.A. 1988. Respiratory disease and wasting in athymic mice infected with pneumonia virus of mice. Lab. Anim. Sci. 34: 35-37.

PL 213 926 B1

Lista sekwencji <110> MEDIMMUNE VACCINES, INC.

DeJong, Jan Fouchier, Ronaldus Van Den Hoogen, Bernadetta Osterhaus, Albertus Groen, Jan <120> Wirus powodujący chorbę oddechową u podatnych ssaków <130>

<140>

<141>

<150> P 367 826 <151> 2002-01-18 <150> PCT/NL02/00040 <151> 2002-01-18 ' <150> EP01200213.5 <151> 2001-01-19 <150> EP01203985.5 <151> 2001-10-18 .

<160> 172 <170> Patentln wersja 3.2 <210> 1 <211> 394 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 1

Met Ser Leu Gin Gly Ile His Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 15 10 15

Ile Leu Lys Glu Ser Gin Tyr Thr Ile Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30

Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gin Gin Glu Ile Thr Leu Leu Cys 35 40 45

Gly Glu Ile Leu Tyr Ala Lys His Ala Asp Tyr Lys Tyr Ala Ala Glu 50 55 60

Ile Gly Ile Gin Tyr Ile Ser Thr Ala Leu Gly Ser Glu Arg Val Gin 65 70 75 80

Gin Ile Leu Arg Asn Ser Gly Ser Glu Val Gin Val Val Leu Thr Arg 85 90 95

PL 213 926 B1

Thr Tyr Ser Leu Gly Lys Ile Lys Asn Asn Lys Gly Glu Asp Leu Gin 100 105 110

Met Leu Asp Ile His Gly Val Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Ile Asp 115 120 125

Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Ala Thr Leu Leu Lys Glu Ser Ser Gly 130 135 140

Asn Ile Pro Gin Asn Gin Arg Pro Ser Ala Pro Asp Thr Pro Ile Ile 145 150 155 160

Leu Leu Cys Val Gly Ala Leu Ile Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr Ile 165 170 175

Glu Val Gly Leu Glu Thr Thr Val Arg Arg Ala Asn Arg Val Leu Ser 180 185 190

Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Arg Met Asp Ile Pro Lys Ile Ala Arg 195 200 205

Ser Phe Tyr Asp Leu Phe Glu Gin Lys Val Tyr His Arg Ser Leu Phe 210 215 220

Ile Glu Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala 225 230 235 240

Glu Ser Leu Phe Val Asn Ile Phe Met Gin Ala Tyr Gly Ala Gly Gin 245 250 255

Thr Met Leu Arg Trp Gly Val Ile Ala Arg Ser Ser Asn Asn Ile Met 260 265 270

Leu Gly His Val Ser Val Gin Ala Glu Leu Lys Gin Val Thr Glu Val 275 280 285

Tyr Asp Leu Val Arg Glu Met Gly Pro Glu Ser Gly Leu Leu His Leu

290 295 300

Arg Gin Ser Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu Ala Asn Cys Pro Asn

305 310 315 320

Phe Ala Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly Ile Ile Gly

325 330 335

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

210 215 220

Gly 225

Lys

Ala

Leu

Gly

Ser 230

Thr

Ser

Ser

Gly

Ser 235

Arg

Met

Glu

Ser

Leu 240

Phe

Val

Asn

Ile

Phe

Met

Gin

Ala

Tyr

Gly

Ala

Gly

Gin

Thr

Met

Leu

245

250

255

Arg

Arg

Gly

Val

Val

Ala

Arg

Ser

Ser

Asn

Asn

Ile

Met

Leu

Gly

His

250

265

270

Val

Ser

Val

Gin

Ala

Glu

Leu

Arg

Gin

Val

Ser

Glu

Val

Tyr

Asp

Leu

275

280

285

Val

Arg

Lys

Met

Gly

Pro

Glu

Ser

Gly

Leu

Leu

His

Leu

Arg

Gin

Ser

290

295

300

Pro

Lys

Ala

Gly

Leu

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Cys

Pro

Asn

Phe

Ala

Ser

305

310

315

320

Val

Val

Leu

Gly

Asn

Ala

Ala

Gly

Leu

Gly

Ile

Ile

Gly

Met

Tyr

Lys

325

330

335

Gly

Arg

Ala

Pro

Asn

Leu

Glu

Leu

Phe

Ser

Ala

Ala

Glu

Ser

Tyr

Ala

340

345

350

Arg

Ser

Leu

Lys

Glu

Ser

Asn

Lys

Ile

Asn

Leu

Ala

Ala

Leu

Gly

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Asp

Glu

Arg

Glu

Ala

Ala

Thr

Ser

Tyr

Leu

Gly

Gly

Asp

Glu

370

375

380

Asp

Lys

Ser

Gin

Lys

Phe

Glu

385

390

<210>

4

<211>

394

<212>

PRT

<213>

Ptasi pneumowirus C

<400>

4

Met

Ser

Leu

Gin

Gly

Ile

Gin

Leu

Ser

Asp

Leu

Ser

Tyr

Lys

His

Ala

1

5

10

15

Ile

Leu

Lys

Glu

Ser

Gin

Tyr

Thr

Ile

Lys

Arg

Asp

Val

Gly

Thr

Thr

20

25

30

PL 213 926 B1

Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gin Arg Glu Val Ser Leu Leu Cys 35 40 45

Gly Glu Ile Leu Tyr Ala Lys His Thr Asp Tyr Ser His Ala Ala Glu 50 55 60

Val Gly Met Gin Tyr Val Ser Thr Thr Leu Gly Ala Glu Arg Thr Gin 65 70 75 80

Gin Ile Leu Lys Asn Ser Gly Ser Glu Val Gin Ala Val Leu Thr Lys 85 90 95

Thr Tyr Ser Leu Gly Lys Gly Lys Asn Ser Lys Gly Glu Glu Leu Gin 100 105 110

Met Leu Asp Ile His Gly Val Glu Arg Ser Trp Ile Glu Glu Val Asp 115 120 125

Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Ala Ser Ala Thr Lys Asp Asn Ser Gly 130 135 140

Pro Ile Pro Gin Asn Gin Arg Pro Ser Ser Pro Asp Ala Pro Ile Ile 145 150 155 160

Leu Leu Cys Ile Gly Ala Leu Ile Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr Ile 165 170 175

Glu Val Gly Leu Glu Thr Ala Val Arg Arg Ala Asn Arg Val Leu Asn 180 185 190

Asp Ala Leu Lys Arg Phe Pro Arg Ile Asp Ile Pro Lys Ile Ala Arg 195 200 205

Ser Phe Tyr Asp Leu Phe Glu Gin Lys Val Tyr Tyr Arg Ser Leu Phe 210 215 220

Ile Glu Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala 225 230 235 240

Glu Ser Leu Phe Val Asn Ile Phe Met Gin Ala Tyr Gly Ala Gly Gin 245 250 255

Thr Met Leu Arg Trp Gly Val Ile Ala Arg Ser Ser Asn Asn Ile Met 260 265 270

PL 213 926 B1

Leu Gly His Val Ser Val Gin Ala Glu Leu Lys Gin Val Thr Glu Val 275 280 285

Tyr Asp Leu Val Arg Glu Met Gly Pro Glu Ser Gly Leu Leu His Leu 290 295 300

Arg Gin Asn Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu Ala Asn Cys Pro Asn 305 310 315 320

Phe Ala Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly Ile Leu Gly 325 330 335

Met Tyr Arg Gly Arg Val Pro Asn Thr Glu Leu Phe Ala Ala Ala Glu 340 345 350

Ser Tyr Ala Arg Ser Leu Lys Glu Ser Asn Lys'Ile Asn Phe Ser Ser 355 360 365

Leu Gly Leu Thr Glu Glu Glu Lys Glu Ala Ala Glu Asn Phe Leu Asn 370 375 380

Ile Asn Glu Glu Gly Gin Asn Asp Tyr Glu 385 390 <210> 5 <211> 391 <212> PRT <213> Bydlęcy syncytialny wirus oddechowy <400> 5

Met Ala Leu Ser Lys Val Lys Leu Asn Asp Thr Phe Asn Lys Asp Gin 15 10 15

Leu Leu Ser Thr Ser Lys Tyr Thr Ile Gin Arg Ser Thr Gly Asp Asn 20 25 30

Ile Asp Ile Pro Asn Tyr Asp Val Gin Lys His Leu Asn Lys Leu Cys 35 40 45

Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu

55 60

Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Leu

70 75 80

Lys Ile Leu Lys Asp Ala Gly Tyr Gin Val Arg Ala Asn Gly Val Asp

90 95

PL 213 926 B1

Val Ile Thr His Arg Gin Asp Val Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu 100 105 110

Val Leu Thr Leu Val Ser Leu Thr Ser Glu Val Gin Gly Asn Ile Glu 115 120 125

Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu 130 135 140

Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Val 145 150 155 160

Leu Cys Val Ala Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg 165 170 175

Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Arg Asn 180 185 190

Glu Met Lys Arg Tyr Lys Gly Leu Ile Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser 195 200 205

Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys Tyr Pro His Tyr Ile Asp Val Phe Val 210 215 220

His Phe Gly Ile Ala Gin Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu 225 230 235 240

Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gin Val 245 250 255

Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu 260 265 270

Gly His Ala Ser Val Gin Ala Glu Met Glu Gin Val Val Glu Val Tyr 275 280 285

Glu Tyr Ala Gin Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu 290 295 300

Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gin Phe Pro Asn Phe 305 310 315 320

Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu 325 330 335

PL 213 926 B1

Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gin Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala 340 345 350

Tyr Ala Glu Gin Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu 355 360 365

Asp Leu Thr Thr Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys Asn Gin Leu Asn Pro 370 375 380

Lys Asp Asn Asp Val Glu Leu

385 390 <210> 6 <211> 391 <212> PRT <213> Ludzki syncytialny wirus oddechowy <400> 6

Met Ala Leu Ser Lys Val Lys Leu Asn Asp Thr Leu Asn Lys Asp Gin 15 10 15

Leu Leu Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Ile Gin Arg Ser Thr Gly Asp Asn 20 25 30

Ile Asp Thr Pro Asn Tyr Asp Val Gin Lys His Leu Asn Lys Leu Cys 35 40 45

Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu 50 55 60

Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile 65 70 75 80

Lys Ile Leu Lys Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp 85 90 95

Ile Thr Thr Tyr Arg Gin Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu 100 105 110

Val Leu Thr Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Ile Gin Val Asn Ile Glu

115 120 125

Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu

130 135 140

Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile

145 150 155 160

PL 213 926 B1

Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg 165 170 175

Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn 180 185 190

Glu Ile Lys Arg Tyr Lys Gly Leu Ile Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser 195 200 205

Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys His Pro His Leu Ile Asp Val Phe Val 210 215 220

His Phe Gly Ile Ala Gin Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu 225 230 235 240

Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ser Gly Gin Val 245 250 255

Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu 260 265 270

Gly His Ala Ser Val Gin Ala Glu Met Glu Gin Val Val Glu Val Tyr 275 280 285

Glu Tyr Ala Gin Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu 290 295 300

Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gin Phe Pro Asn Phe 305 310 315 320

Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu 325 330 335

Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gin Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala 340 345 350

Tyr Ala Glu Gin Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu 355 360 365

Asp Leu Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys Asn Gin Leu Asn Pro 370 375 380

Lys Glu Asp Asp Val Glu Leu 385 390

PL 213 926 B1

<210>	7
<211>	393
<212>	PRT
<213>	Wirus zapalenia płuc	myszy
<400>	7
Met Ser Leu Asp Arg Leu Lys	Leu Asn Asp Val Ser Asn Lys Asp Ser

10 15

Leu Leu Ser Asn Cys Lys Tyr Ser Val Thr Arg Ser Thr Gly Asp Val 20 25 30

Thr Ser Val Ser Gly His Ala Met Gin Lys Ala Leu Ala Arg Thr Leu 35 40 45

Gly Met Phe Leu Leu Thr Ala Phe Asn Arg Cys Glu Glu Val Ala Glu 50 55 ' 60

Ile Gly Leu Gin Tyr Ala Met Ser Leu Leu Gly Arg Asp Asp Ser Ile 65 70 75 80

Lys Ile Leu Arg Glu Ala Gly Tyr Asn Val Lys Cys Val Asp Thr Gin 85 90 95

Leu Lys Asp Phe Thr Ile Lys Leu Gin Gly Lys Glu Tyr Lys Ile Gin 100 105 110

Val Leu Asp Ile Val Gly Ile Asp Ala Ala Asn Leu Ala Asp Leu Glu 115 120 125

Ile Gin Ala Arg Gly Val Val Ala Lys Glu Leu Lys Thr Gly Ala Arg 130 135 140

Leu Pro Asp Asn Arg Arg His Asp Ala Pro Asp Cys Gly Val Ile Val 145 150 155 160

Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Val Ser Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg 165 170 175

Gly Gly Leu Asp Ala Val Glu Arg Arg Ala Leu Asn Val Leu Lys Ala

180 185 190

Glu Lys Ala Arg Tyr Pro Asn Met Glu Val Lys Gin Ile Ala Glu Ser

195 200 205

Phe Tyr Asp Leu Phe Glu Arg Lys Pro Tyr Tyr Ile Asp Val Phe Ile

210 215 220

PL 213 926 B1

Thr 225

Phe

Gly

Leu Ala Gin 230

Ser

Ser Val

Arg

Gly 235

Gly

Ser

Lys

Val

Glu 240

Gly

Leu

Phe

Ser Gly Leu

Phe

Met Asn

Ala

Tyr

Gly

Ala

Gly

Gin

Val

245

250

255

Met

Leu

Arg

Trp Gly Leu

Leu

Ala Lys

Ser

Val

Lys

Asn

Ile

Met

Leu

260

265

270

Gly

His

Ala

Ser Val Gin

Ala

Glu Met

Glu

Gin

Val

Val

Glu

Val

Tyr

275

280

285

Glu

Tyr

Ala

Gin Lys Gin

Gly

Gly Glu

Ala

Gly

Phe

Tyr

His

Ile

Arg

290

295

300

Asn

Asn

Pro

Lys Ala Ser

Leu

Leu Ser

Leu

Thr

Asn

Cys

Pro

Asn

Phe

305

310

315

320

Thr

Ser

Val

Val Leu Gly

Asn

Ala Ala

Gly

Leu

Gly

Ile

Ile

Gly

Ser

325

330

335

Tyr

Lys

Gly

Ala Pro Arg

Asn

Arg Glu

Leu

Phe

Asp

Ala

Ala

Lys

Asp

340

345

350

Tyr

Ala

Glu

Arg Leu Lys

Asp

Asn Asn

Val

Ile

Asn

Tyr

Ser

Ala

Leu

355

360

365

Asn

Leu

Thr

Ala Glu Glu

Arg

Glu Leu

Ile

Ser

Gin

Gin

Leu

Asn

Ile

370

375

380

Val

Asp

Asp

Thr Pro Asp

Asp

Asp Ile

385

390

<210>

8

<211>

294

<212>

PRT

<213>

Ludzki metapneumowirus 00-1

<400>

8

Met

Ser

Phe

Pro Glu Gly

Lys

Asp Ile

Leu

Phe

Met

Gly

Asn

Glu

Ala

1

5

10

15

Ala

Lys

Leu

Ala Glu Ala

Phe

Gin Lys

Ser

Leu

Arg

Lys

Pro

Gly

His

20

25

30

Lys

Arg

Ser

Gin Ser Ile

Ile

Gly Glu

Lys

Val

Asn

Thr

Val

Ser

Glu

35

40

45

PL 213 926 B1

Thr Leu Glu Leu Pro Thr Ile Ser 50 55

Arg Pro Ala Lys Pro Thr Ile Pro 60

Ser Glu Pro Lys Leu Ala Trp Thr 65 70

Asp Lys Gly Gly Ala Thr Lys Thr 75 80

Glu Ile Lys Gin Ala Ile Lys Val 85

Met Asp Pro Ile Glu Glu Glu Glu 90 95

Ser Thr Glu Lys Lys Val Leu Pro 100

Ser Ser Asp Gly Lys Thr Pro Ala 105 110

Glu Lys Lys Leu Lys Pro Ser Thr 115 120

Asn Thr Lys Lys Lys Val Ser Phe 125

Thr Pro Asn Glu Pro Gly Lys Tyr 130 135

Thr Lys Leu Glu Lys Asp Ala Leu 140

Asp Leu Leu Ser Asp Asn Glu Glu 145 150

Glu Asp Ala Glu Ser Ser Ile Leu 155 160

Thr Phe Glu Glu Arg Asp Thr Ser 165

Ser Leu Ser Ile Glu Ala Arg Leu 170 175

Glu Ser Ile Glu Glu Lys Leu Ser 180

Met Ile Leu Gly Leu Leu Arg Thr 185 190

Leu Asn Ile Ala Thr Ala Gly Pro 195 200

Thr Ala Ala Arg Asp Gly Ile Arg 205

Asp Ala Met Ile Gly Val Arg Glu 210 215

Glu Leu Ile Ala Asp Ile Ile Lys 220

Glu Ala Lys Gly Lys Ala Ala Glu 225 230

Met Met Glu Glu Glu Met Ser Gin 235 240

Arg Ser Lys Ile Gly Asn Gly Ser 245

Val Lys Leu Thr Glu Lys Ala Lys 250 255

Glu Leu Asn Lys Ile Val Glu Asp 260

Glu Ser Thr Ser Gly Glu Ser Glu 265 270

Glu Glu Glu Glu Pro Lys Asp Thr 275 280

Gin Asp Asn Ser Gin Glu Asp Asp 285

PL 213 926 B1

Ile Tyr Gin Leu Ile Met 290 <210> 9 <211> 278 <212> PRT <213> Ptasi pneumowirus A <400> 9

Met Ser Phe Pro Glu Gly Lys Asp Ile Leu Met Met Gly Ser Glu Ala 15 10 15

Ala Lys Met Ala Asp Ala Tyr Gin Arg Ser Leu Arg Asn Thr Ser Ala 20 25 30

Gly Gly Arg Ser Ile Ser Gly Glu Pro Ile Asn Thr Ile Ala Glu Lys 35 40 ' 45

Val Pro Leu Pro Pro Leu Cys Asn Pro Thr Thr Pro Lys Gly Ser Cys 50 55 60

Ile Lys Pro Asn Lys Ala Pro Val Pro Lys Val Lys Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80

Ile Tyr Pro Lys Leu Pro Thr Ala Pro Val Ala Thr Asp Thr Tyr Thr 85 90 95

Ser Thr Ser Thr Glu Ser Ala Lys Lys Ser Lys Lys Val Lys Phe Asp 100 105 110

Asn Pro Lys Val Gly Lys Tyr Thr Lys Leu Glu Glu Glu Gly Leu Glu 115 120 125

Leu Leu Ser Asp Pro Glu Glu Asp Asn Asp Glu Lys Ser Ser Ile Leu 130 135 140

Thr Phe Glu Glu Lys Asp Thr Ala Ser Thr Ser Ile Glu Ala Arg Leu 145 150 155 160

Glu Ala Ile Glu Glu Lys Leu Ser Met Ile Leu Gly Met Leu Lys Thr 165 170 175

Leu Asn Ile Ala Thr Ala Gly Pro Thr Ala Ala Arg Asp Gly Ile Arg 180 185 190

Asp Ala Met Ile Gly Met Arg Glu Glu Leu Ile Asn Ser Ile Met Thr 195 200 205

PL 213 926 B1

Glu Ala Lys Asp Lys Ile Ala Glu Met Met Lys Glu Glu Asp Thr Gin 210 215 220

Arg Ala Lys Ile Gly Asp Gly Ser Val Lys Leu Thr Glu Lys Ala Lys 225 230 235 240

Glu Leu Asn Lys Ile Leu Glu Asp Gin Ser Ser Ser Gly Glu Ser Glu 245 250 255

Ser Glu Glu Glu Ser Gly Glu Ser Glu Ser Asp Glu Glu Glu Ser Asp 260 265 270

Ile Tyr Asn Leu Asp Leu 275 <210> 10 ' <211> 294 <212> PRT <213> Ptasi pneumowirus szczep C <400> 10

Met Ser Phe Pro Glu Gly Lys Asp Ile Leu Leu Met Gly Asn Glu Ala 15 10 15

Ala Lys Ala Ala Glu Ala Phe Gin Arg Ser Leu Lys Lys Ile Gly His 20 25 30

Arg Arg Thr Gin Ser Ile Val Gly Asp Lys Ile Ile Thr Val Ser Glu 35 40 45

Thr Val Glu Lys Pro Thr Ile Ser Lys Ser Thr Lys Val Thr Thr Pro 50 55 60

Pro Glu Arg Lys Asn Ala Trp Gly Glu Lys Pro Asp Thr Thr Arg Ser 65 70 75 80

Gin Thr Glu Glu Ala Arg Asn Glu Ala Thr Pro Glu Asp Ala Ser Arg 85 90 95

Leu Tyr Glu Glu Val Phe Ala Pro Thr Ser Asp Gly Lys Thr Pro Ala

100 105 110

Glu Lys Gly Lys Glu Thr Pro Glu Lys Pro Lys Lys Lys Val Thr Phe

115 120 125

Lys Asn Asp Glu Ser Gly Arg Tyr Thr Lys Leu Glu Met Glu Ala Leu

130 135 140

PL 213 926 B1

Glu Leu Leu Ser Asp Asn Glu Asp Asp Asp Ala Glu Ser Ser Val Leu 145 150 155 160

Thr Phe Glu Glu Lys Asp Thr Ser Ala Leu Ser Leu Glu Ala Arg Leu 165 170 175

Glu Ser Ile Asp Glu Lys Leu Ser Met Ile Leu Gly Leu Leu Arg Thr 180 185 190

Leu Asn Val Ala Thr Ala Gly Pro Thr Ala Ala Arg Asp Gly Ile Arg 195 200 205

Asp Ala Met Val Gly Leu Arg Glu Glu Leu Ile Ala Asp Ile Ile Lys 210 215 220

Glu Ala Lys Gly Lys Ala Ala Glu Met Met Lyś Glu Glu Ala Lys Gin 225 230 235 240

Lys Ser Lys Ile Gly Asn Gly Ser Val Gly Leu Thr Glu Lys Ala Lys 245 250 255

Glu Leu Asn Lys Ile Val Giu Asp Glu Ser Thr Ser Gly Glu Ser Glu 260 265 270

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Ser Asn Pro Asp Asp Asp 275 280 285

Leu Tyr Ser Leu Thr Met 290

<210>	11
<211>	241
<212>	PRT
<213>	Bydlęcy	syncytialny wirus	oddechowy
<400>	11
Met Glu	i Lys Phe	Ala Pro Glu Phe	His Gly Glu Asp Ala Asn Thr Lys

Ala Thr Lys Phe Leu Glu Ser Leu Lys Gly Lys Phe Thr Ser Ser Lys 20 25 30

Asp Ser Arg Lys Lys Asp Ser Ile Ile Ser Val Asn Ser Val Asp Ile 35 40 45

Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Ile Thr Ser Thr Asn Gin Asn Ile Asn 50 55 60

PL 213 926 B1

Gin 65

Pro

Ser

Glu

Ile

Asn Asp 70

Thr

Ile

Ala

Thr Asn Gin Val 75

His

Ile 80

Arg

Lys

Pro

Leu

Val

Ser

Phe

Lys

Glu

Glu

Leu

Pro

Ser

Ser

Glu

Asn

85

90

95

Pro

Phe

Thr

Arg

Leu

Tyr

Lys

Glu

Thr

Ile

Glu

Thr

Phe

Asp

Asn

Asn

100

105

110

Glu

Glu

Glu

Ser

Ser

Tyr

Ser

Tyr

Asp

Glu

Ile

Asn

Asp

Gin

Thr

Asn

115

120

125

Asp

Asn

Ile

Thr

Ala

Arg

Leu

Asp

Arg

Ile

Asp

Glu

Lys

Leu

Ser

Glu

130

135

140

Ile

Ile

Gly

Met

Leu

His

Thr

Leu

Val

Val

Ala'

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

145

150

155

160

Ala

Ala

Arg

Asp

Gly

Ile

Arg

Asp

Ala

Met

Val

Gly

Leu

Arg

Glu

Glu

165

170

175

Met

Ile

Glu

Lys

Ile

Arg

Ser

Glu

Ala

Leu

Met

Thr

Asn

Asp

Arg

Leu

180

185

190

Glu

Ala

Met

Ala

Arg

Leu

Arg

Asp

Glu

Glu

Ser

Glu

Lys

Met

Thr

Lys

195

200

205

Asp

Thr

Ser

Asp

Glu

Val

Lys

Leu

Thr

Pro

Thr

Ser

Glu

Lys

Leu

Asn

210

215

220

Met

Val

Leu

Glu

Asp

Glu

Ser

Ser

Asp

Asn

Asp

Leu

Ser

Leu

Glu

Asp

225

230

235

240

Phe

<210>

12

<211>

241

<212>

PRT

<213>

Ludzki syncytialny wirus

oddechowy

<400>

12

Met

Glu

Lys

Phe

Ala

Pro

Glu

Phe

His

Gly

Glu

Asp

Ala

Asn

Asn

Lys

1

5

10

15

Ala

Thr

Lys

Phe

Leu

Glu

Ser

Ile

Lys

Gly

Lys

Phe

Ala

Ser

Ser

Lys

20

25

30

PL 213 926 B1

Asp

Pro

Lys 35

Lys

Lys

Asp

Ser

Ile 40

Ile

Ser

Val

Asn

Ser 45

Ile

Asp

Ile

Glu

Val

Thr

Lys

Glu

Ser

Pro

Ile

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Ile

Ile

Asn

50

55

60

Pro

Thr

Ser

Glu

Ala

Asp

Ser

Thr

Pro

Glu

Thr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Pro

65

70

75

80

Arg

Lys

Pro

Leu

Val

Ser

Phe

Lys

Glu

Asp

Leu

Thr

Pro

Ser

Asp

Asn

85

90

95

Pro

Phe

Ser

Lys

Leu

Tyr

Lys

Glu

Thr

Ile

Glu

Thr

Phe

Asp

Asn

Asn

100

105

110

Glu

Glu

Glu

Ser

Ser

Tyr

Ser

Tyr

Glu

Glu

Ile

Asn

Asp

Gin

Thr

Asn

115

120

125

Asp

Asn

Ile

Thr

Ala

Arg

Leu

Asp

Arg

Ile

Asp

Glu

Lys

Leu

Ser

Glu

130

135

140

Ile

Leu

Gly

Met

Leu

His

Thr

Leu

Val

Val

Ala

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

145

150

155

160

Ser

Ala

Arg

Asp

Gly

Ile

Arg

Asp

Ala

Met

Val

Gly

Leu

Arg

Glu

Glu

165

170

175

Met

Ile

Glu

Lys

Ile

Arg

Ala

Glu

Ala

Leu

Met

Thr

Asn

Asp

Arg

Leu

180

185

190

Glu

Ala

Met

Ala

Arg

Leu

Arg

Asn

Glu

Glu

Ser

Glu

Lys

Met

Ala

Lys

195

200

205

Asp

Thr

Ser

Asp

Glu

Val

Pro

Leu

Asn

Pro

Thr

Ser

Lys

Lys

Leu

Ser

210

215

220

Asp

Leu

Leu

Glu

Asp

Asn

Asp

Ser

Asp

Asn

Asp

Leu

Ser

Leu

Asp

Asp

225

230

235

240

Phe

<210>

13

<211>

295

<212>

PRT

<213> ’

Wirus zapalenia płuc

myszy

PL 213 926 B1 <400> 13

Met Glu Lys Phe Ala Pro Glu Phe Val Gly Glu Asp Ala Asn Lys Lys 1 5 10 15

Ala Glu Glu Phe Leu Lys His Arg Ser Phe Pro Ser Glu Lys Pro Leu 20 25 30

Ala Gly Ile Pro Asn Thr Ala Thr His Val Thr Lys Tyr Asn Met Pro 35 40 45

Pro Ile Leu Arg Ser Ser Phe Lys Leu Pro Ser Pro Arg Val Ala Ala 50 55 60

Asn Leu Thr Glu Pro Ser Ala Pro Pro Thr Thr Pro Pro Pro Thr Pro 65 70 75 80

Pro Gin Asn Lys Glu Glu Gin Pro Lys Glu Ser Asp Val Asp Ile Glu 85 90 95

Thr Met His Val Cys Lys Val Pro Asp Asn Pro Glu His Ser Lys Lys 100 105 110

Pro Cys Cys Ser Asp Asp Thr Asp Thr Lys Lys Thr Arg Lys Pro Met 115 120 125

Val Thr Phe Val Glu Pro Glu Glu Lys Phe Val Gly Leu Gly Ala Ser 130 135 140

Leu Tyr Arg Glu Thr Met Gin Thr Phe Ala Ala Asp Gly Tyr Asp Glu 145 150 155 160

Glu Ser Asn Leu Ser Phe Glu Glu Thr Asn Gin Glu Pro Gly Ser Ser 165 170 175

Ser Val Glu Gin Arg Leu Asp Arg Ile Glu Glu Lys Leu Ser Tyr Ile 180 185 190

Ile Gly Leu Leu Asn Thr Ile Met Val Ala Thr Ala Gly Pro Thr Thr

195 200 205

Ala Arg Asp Glu Ile Arg Asp Ala Leu Ile Gly Thr Arg Glu Glu Leu

210 215 220

Ile Glu Met Ile Lys Ser Asp Ile Leu Thr Val Asn Asp Arg Ile Val

225 230 235 240

PL 213 926 B1

Ala

Met

Glu

Lys

Leu

Arg

Asp

Glu

Glu

Cys

Ser

Arg

Ala

Asp

Thr

Asp

245

250

255

Asp

Gly

Ser

Ala

Cys

Tyr

Leu

Thr

Asp

Arg

Ala

Arg

Ile

Leu

Asp

Lys

260

265

270

Ile

Val

Ser

Ser

Asn

Ala

Glu

Glu

Ala

Lys

Glu

Asp

Leu

Asp

Val

Asp

275

280

285

Asp

Ile

Met

Gly

Ile

Asn

Phe

290 295 <210> 14 <211> 254 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 14

Met 1

Glu

Ser

Tyr

Leu 5

Val

Asp

Thr

Tyr

Gin 10

Gly

Ile

Pro

Tyr

Thr 15

Ala

Ala

Val

Gin

Val

Asp

Leu

Ile

Glu

Lys

Asp

Leu

Leu

Pro

Ala

Ser

Leu

20

25

30

Thr

Ile

Trp

Phe

Pro

Leu

Phe

Gin

Ala

Asn

Thr

Pro

Pro

Ala

Val

Leu

35

40

45

Leu

Asp

Gin

Leu

Lys

Thr

Leu

Thr

Ile

Thr

Thr

Leu

Tyr

Ala

Ala

Ser

50

55

60

Gin

Asn

Gly

Pro

Ile

Leu

Lys

Val

Asn

Ala

Ser

Ala

Gin

Gly

Ala

Ala

65

70

75

80

Met

Ser

Val

Leu

Pro

Lys

Lys

Phe

Glu

Val

Asn

Ala

Thr

Val

Ala

Leu

85

90

95

Asp

Glu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Glu

Phe

Asp

Lys

Leu

Thr

Val

Cys

Glu

Val

100

105

110

Lys

Thr

Val

Tyr

Leu

Thr

Thr

Met

Lys

Pro

Tyr

Gly

Met

Val

Ser

Lys

115

120

125

Phe

Val

Ser

Ser

Ala

Lys

Ser

Val

Gly

Lys

Lys

Thr

His

Asp

Leu

Ile

130

135

140

Ala

Leu

Cys

Asp

Phe

Met

Asp

Leu

Glu

Lys

Asn

Thr

Pro

Val

Thr

Ile

145

150

155

160

PL 213 926 B1

Pro Ala Phe Ile Lys Ser Val Ser Ile Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr 165 170 175

Val Glu Ala Ala Ile Ser Ser Glu Ala Asp Gin Ala Leu Thr Gin Ala 180 185 190

Lys Ile Ala Pro Tyr Ala Gly Leu Ile Met Ile Met Thr Met Asn Asn 195 200 205

Pro Lys Gly Ile Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Thr Gin Val Ile Val 210 215 220

Glu Leu Gly Ala Tyr Val Gin Ala Glu Ser Ile Ser Lys Ile Cys Lys 225 230 235 240

Thr Trp Ser His Gin Gly Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ser Arg 245 250 <210> 15 <211> 254 <212> PRT <213> Wirus zapalenia krtani i tchawicy indyków B <400> 15

Met Glu Ser Tyr Ile Ile Asp Thr Tyr Gin Gly Val Pro Tyr Thr Ala 15 10 15

Ala Val Gin Val Asp Leu Val Glu Lys Asp Asn Asn Pro Ala Lys Leu 20 25 30

Thr Val Trp Phe Pro Leu Phe Gin Ser Ser Thr Pro Ala Pro Val Leu 35 40 45

Leu Asp Gin Leu Lys Thr Leu Ser Ile Thr Thr Gin Tyr Thr Val Ser 50 55 60

Pro Glu Gly Pro Val Leu Gin Val Asn Ala Thr Ala Gin Gly Ala Ala 65 70 75 80

Met Ser Ala Leu Pro Lys Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Ala Ala Leu

90 95

Asp Glu Tyr Ser Lys Leu Asp Phe Gly Val Leu Thr Val Cys Asp Val

100 105 110

Arg Ala Val Tyr Leu Thr Thr Leu Lys Pro Tyr Gly Met Val Ser Lys

115 120 125

PL 213 926 B1

Ile Val 130

Thr

Asn

Met

Asn Thr 135

Val

Gly

Arg

Lys

Thr 140

His

Asp

Leu

Ile

Ala Leu

Cys

Asp

Phe

Ile Asp

Met

Glu

Arg

Gly

Ile

Pro

Val

Thr

Ile

145

150

155

160

Pro Ala

Tyr

Ile

Lys

Ala Val

Ser

Ile

Lys

Asp

Ser

Glu

Ser

Ala

Thr

165

170

175

Val Glu

Ala

Ala

Ile

Ser Gly

Glu

Ala

Asp

Gin

Ala

Ile

Thr

Gin

Ala

180

185

190

Arg Ile

Ala

Pro

Tyr

Ala Gly

Leu

Ile

Leu

Leu

Met

Ala

Met

Asn

Asn

195

200

205

Pro Lys

Gly

Ile

Phe

Arg Lys

Leu

Gly

Ala

Gly

Thr

Gin

Val

Ile

Val

210

215

220

Glu Leu

Gly

Pro

Tyr

Val Gin

Ala

Glu

Ser

Leu

Gly

Lys

Ile

Cys

Lys

225

230

235

240

Thr Trp

Asn

His

Gin

Arg Thr

Arg

Tyr

Ile

Leu

Lys

Ser

Arg

245

250

<210>

16

<2ii> :

254

<212> :

PRT

<213> Wirus zapalenia krtani i

tchawicy indyków A

<400>

16

Met Glu

Ser

Tyr

Ile

Ile Asp

Thr

Tyr

Gin

Gly

Val

Pro

Tyr

Thr

Ala

1

5

10

15

Ala Val

Gin

Val

Asp

Leu Ile

Glu

Lys

Asp

Ser

Asn

Pro

Ala

Thr

Leu

20

25

30

Thr Val

Trp

Phe

Pro

Leu Phe

Gin

Ser

Ser

Thr

Pro

Ala

Pro

Val

Leu

35

40

45

Leu Asp

Gin

Leu

Lys

Thr Leu

Ser

Ile

Thr

Thr

Gin

Tyr

Thr

Ala

Ser

50

55

60

Pro Glu

Gly

Pro

Val

Leu Gin

Val

Asn

Ala

Ala

Ala

Gin

Gly

Ala

Ala

65

70

75

80

Met Ser

Ala

Leu

Pro

Lys Lys

Phe

Ala

Val

Ser

Ala

Ala

Val

Ala

Leu

85

90

95

PL 213 926 B1

Asp

Glu Tyr

Ser Arg Leu Glu 100

Phe

Gly 105

Thr

Leu

Thr

Val

Cys 110

Asp

Val

Arg

Ser

Ile

Tyr

Leu

Thr

Thr

Leu

Lys

Pro

Tyr

Gly

Met

Val

Ser

Lys

115

120

125

Ile

Met

Thr

Asp

Val

Arg

Ser

Val

Gly

Arg

Lys

Thr

His

Asp

Leu

Ile

130

135

140

Ala

Leu

Cys

Asp

Phe

Ile

Asp

Ile

Glu

Lys

Gly

Val

Pro

Ile

Thr

Ile

145

150

155

160

Pro

Ala

Tyr

Ile

Lys

Ala

Val

Ser

Ile

Lys

Asp

Ser

Glu

Ser

Ala

Thr

165

170

175

Val

Glu

Ala

Ala

Ile

Ser

Gly

Glu

Ala

Asp

Gin

Ala

Ile

Thr

Gin

Ala

180

185

190

Arg

Ile

Ala

Pro

Tyr

Ala

Gly

Leu

Ile

Leu

Ile

Met

Thr

Met

Asn

Asn

195

200

205

Pro

Lys

Gly

Ile

Phe

Lys

Lys

Leu

Gly

Ala

Gly

Met

Gin

Val

Ile

Val

210

215

220

Glu

Leu

Gly

Pro

Tyr

Val

Gin

Ala

Glu

Ser

Leu

Gly

Lys

Ile

Cys

Lys

225

230

235

240

Thr

Trp

Asn

His

Gin

Arg

Thr

Arg

Tyr

Val

Leu

Arg

Ser

Arg

245 250 <210> 17 <211> 254 <212> PRT <213> Ptasi pneumowirus C <400> 17

Met 1

Glu

Ser

Tyr

Leu 5

Val

Asp

Thr

Tyr

Gin 10

Gly

Val

Pro

Tyr

Thr 15

Ala

Ala

Val

Gin

Thr 20

Asp

Leu

Val

Glu

Lys 25

Asp

Gin

Leu

Pro

Ala 30

Arg

Leu

Thr

Val

Trp 35

Val

Pro

Leu

Phe

Gin 40

Thr

Asn

Thr

Pro

Pro 45

Thr

Val

Leu

Leu

Glu 50

Gin

Leu

Lys

Thr

Leu 55

Thr

Ile

Thr

Thr

Leu 60

Tyr

Thr

Ala

Ser

PL 213 926 B1

Gin Asn Gly Pro Ile Leu Lys Val Asn Ala Ser Ala Gin Gly Ala Ala 65 70 75 80

Met Ser Ala Leu Pro Lys Ser Phe Asp Val Ser Ala Ser Val Ala Leu 85 90 95

Asp Asp Tyr Ser Lys Leu Glu Phe Asp Lys Leu Thr Val Cys Glu Leu 100 105 110

Lys Ala Val Tyr Leu Thr Thr Met Lys Pro Tyr Gly Met Val Ser Lys 115 120 125

Phe Val Asn Ser Ala Lys Ala Val Gly Lys Lys Thr His Asp Leu Ile 130 135 140

Ala Leu Cys Asp Phe Leu Asp Leu Glu Lys Gly Val Pro Val Thr Ile 145 150 155 160

Pro Ala Tyr Ile Lys Ser Val Ser Ile Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr 165 170 175

Val Glu Ala Ala Ile Ser Gly Glu Ala Asp Gin Ala Ile Thr Gin Ala 180 185 190

Arg Ile Ala Pro Tyr Ala Gly Leu Ile Met Ile Met Thr Met Asn Asn 195 200 205

Pro Lys Gly Ile Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Val Gin Val Ile Val 210 215 220

Glu Leu Gly Ala Tyr Val Gin Ala Glu Ser Ile Ser Arg Ile Cys Arg 225 230 235 240

Asn Trp Ser His Gin Gly Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ser Arg 245 250 <210> 18 <211> 256 <212> PRT <213> Bydlęcy syncytialny wirus oddechowy <400> 18

Met Glu Thr Tyr Val Asn Lys Leu His Glu Gly Ser Thr Tyr Thr Ala 15 10 15

Ala Val Gin Tyr Asn Val Ile Glu Lys Asp Asp Asp Pro Ala Ser Leu 20 25 30

PL 213 926 B1

Thr Ile Trp Val Pro Met Phe Gin Ser Ser Ile Ser Ala Asp Leu Leu 35 40 45

Ile Lys Glu Leu Ile Asn Val Asn Ile Leu Val Arg Gin Ile Ser Thr 50 55 60

Leu Lys Gly Pro Ser Leu Lys Ile Met Ile Asn Ser Arg Ser Ala Val 65 70 75 80

Leu Ala Gin Met Pro Ser Lys Phe Thr Ile Ser Ala Asn Val Ser Leu 85 90 95

Asp Glu Arg Ser Lys Leu Ala Tyr Asp Ile Thr Thr Pro Cys Glu Ile 100 105 110

Lys Ala Cys Ser Leu Thr Cys Leu Lys Val Lys Asn Met Leu Thr Thr 115 120 125

Val Lys Asp Leu Thr Met Lys Thr Phe Asn Pro Thr His Glu Ile Ile 130 135 140

Ala Leu Cys Glu Phe Glu Asn Ile Met Thr Ser Lys Arg Val Val Ile 145 150 155 160

Pro Thr Phe Leu Arg Ser Ile Asn Val Lys Ala Lys Asp Leu Asp Ser 165 170 175

Leu Glu Asn Ile Ala Thr Thr Glu Phe Lys Asn Ala Ile Thr Asn Ala 180 185 190

Lys Ile Ile Pro Tyr Ala Gly Leu Val Leu Val Ile Thr Val Thr Asp 195 200 205

Asn Lys Gly Ala Phe Lys Tyr Ile Lys Pro Gin Ser Gin Phe Ile Val 210 215 220

Asp Leu Gly Ala Tyr Leu Glu Lys Glu Ser Ile Tyr Tyr Val Thr Thr 225 230 235 240

Asn Trp Lys His Thr Ala Thr Lys Phe Ser Ile Lys Pro Ile Glu Asp

245 250 255 <210> 19 <211> 256 <212> PRT <213> Ludzki syncytialny wirus oddechowy

PL 213 926 B1 <400> 19

Met Glu Thr Tyr Val Asn Lys Leu His Glu Gly Ser Thr Tyr Thr Ala 15 10 15

Ala Val Gin Tyr Asn Val Leu Glu Lys Asp Asp Asp Pro Ala Ser Leu 20 25 30

Thr Ile Trp Val Pro Met Phe Gin Ser Ser Val Pro Ala Asp Leu Leu 35 40 45

Ile Lys Glu Leu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Val Lys Gin Ile Ser Thr 50 55 60

Pro Lys Gly Pro Ser Leu Arg Val Thr Ile Asn Ser Arg Ser Ala Val 65 70 75 80

Leu Ala Gin Met Pro Ser Asn Phe Ile Ile Ser Ala Asn Val Ser Leu 85 90 95

Asp Glu Arg Ser Lys Leu Ala Tyr Asp Val Thr Thr Pro Cys Glu Ile 100 105 110

Lys Ala Cys Ser Leu Thr Cys Leu Lys Val Lys Ser Met Leu Thr Thr 115 120 125

Val Lys Asp Leu Thr Met Lys Thr Phe Asn Pro Thr His Glu Ile Ile 130 135 140

Ala Leu Cys Glu Phe Glu Asn Ile Met Thr Ser Lys Arg Val Ile Ile 145 150 155 160

Pro Thr Tyr Leu Arg Pro Ile Ser Val Lys Asn Lys Asp Leu Asn Ser 165 170 175

Leu Glu Asn Ile Ala Thr Thr Glu Phe Lys Asn Ala Ile Thr Asn Ala 180 185 190

Lys Ile Ile Pro Tyr Ala Gly Leu Val Leu Val Ile Thr Val Thr Asp 195 200 205

Asn Lys Gly Ala Phe Lys Tyr Ile Lys Pro Gin Ser Gin Phe Ile Val 210 215 220

Asp Leu Gly Ala Tyr Leu Glu Lys Glu Ser Ile Tyr Tyr Val Thr Thr 225 230 235 240

PL 213 926 B1

Asn Trp Lys His Thr Ala Thr Arg Phe Ser Ile Lys Pro Leu Glu Asp 245 250 255

<210>	20
<211>	257
<212>	PRT
<213>	Wirus	zapalenia	płuc
<400>	20
Met Glu Ala	Tyr Leu Val	Glu

Ala Val Gin Leu Asn Leu Val Glu Lys His Ser Ala Asn Ile Ser Leu 20 25 30

Thr Val Trp Ile Pro Met Phe Gin Thr Ser Leu Pro Lys Asn Ser Val 35 40 ' 45

Met Asp Leu Leu His Asp Val Thr Val Ile Cys Thr Gin Ile Ser Thr 50 55 60

Val His Gly Pro Met Ile Lys Val Asp Leu Ser Ser Ser Asn Ala Gly 65 70 75 80

Leu Ala Thr Met Pro Arg Gin Phe Leu Ile Asn Ala Ile Ile Ala Leu 85 90 95

Asp Asp Trp Gly Asn Met Asp Tyr Glu Val Pro Val Ala Phe Asp Lys 100 105 110

Lys Ser Phe Cys Val Thr Ile Leu Lys Pro Lys Asn Met Leu Tyr Thr 115 120 125

Val Pro Ser Ile Thr Pro Thr Asn Arg Pro Thr His Glu Leu Ile Ala 130 135 140

Val Cys Ser Phe His Asn Arg Val Thr Leu Lys Ser Phe Asn Ile Pro 145 150 155 160

Val Phe Ile Arg Ala Leu Tyr Ile Arg Gin Gin Gly Leu Asp Ser Val

165 170 175

Glu Gin Ala Ile Ser Ser Asp Val Asp His Ala Ile Thr Thr Ala Arg

180 185 190

Val Ala Pro Tyr Ala Gly Leu Thr Leu Val Ile Asn Ile Thr Ser Thr

195 200 205

PL 213 926 B1

Lys Leu 225 Trp Gly

Gly Ala 210 Gly Pro

Phe Lys Tyr Leu

Leu Thr 230 Thr

Leu Lys 215

Ala Gly Ser Ser Leu His 235

Gin 220 Asp Ser

Ile Leu Ala Glu

Gin Ser

Val Tyr

Val Ser

Ile Met

Asn 240 Ser

Lys

His

Thr

Gly 245

Ile Leu 250

Lys

Ser

Thr 255

<210>

21

<211>

539

<212>

PRT

<213> I

Ludzki metapneuinowirus 00-1

<400> :

21

Met

Ser

Trp

Lys

Val

Val

Ile

Ile

Phe

Ser

Leu

Leu

Ile

Thr

Pro

Gin

1

5

10

15

His

Gly

Leu

Lys

Glu

Ser

Tyr

Leu

Glu

Glu

Ser

Cys

Ser

Thr

Ile

Thr

20

25

30

Glu

Gly

Tyr

Leu

Ser

Val

Leu

Arg

Thr

Gly

Trp

Tyr

Thr

Asn

Val

Phe

35

40

45

Thr

Leu

Glu

Val

Gly

Asp

Val

Glu

Asn

Leu

Thr

Cys

Ala

Asp

Gly

Pro

50

5S

60

Ser

Leu

Ile

Lys

Thr

Glu

Leu

Asp

Leu

Thr

Lys

Ser

Ala

Leu

Arg

Glu

65

70

75

80

Leu

Arg

Thr

Val

Ser

Ala

Asp

Gin

Leu

Ala

Arg

Glu

Glu

Gin

Ile

Glu

85

90

95

Asn

Pro

Arg

Gin

Ser

Arg

Phe

Val

Leu

Gly

Ala

Ile

Ala

Leu

Gly

Val

100

105

110

Ala

Thr

Ala

Ala

Ala

Val

Thr

Ala

Gly

Val

Ala

Ile

Ala

Lys

Thr

Ile

115

12 0

125

Arg

Leu

Glu

Ser

Glu

Val

Thr

Ala

Ile

Lys

Asn

Ala

Leu

Lys

Lys

Thr

130

135

140

Asn

Glu

Ala

Val

Ser

Thr

Leu

Gly

Asn

Gly

Val

Arg

Val

Leu

Ala

Thr

145

150

155

160

PL 213 926 B1

Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe 165

Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 170 175

Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile 180

Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 185 190

Phe Ser Gin Phe Asn Arg Arg Phe 195 200

Leu Asn Val Val Arg Gin Phe Ser 205

Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala 210 215

Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 220

Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser 225 230

Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gin 235 240

Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg 245

Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 250 255

Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly 260

Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gin 265 270

Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp 275 280

Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala 285

Ala Pro Ser Cys Ser Gly Lys Lys 290 295

Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 300

Glu Asp Gin Gly Trp Tyr Cys Gin 305 310

Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 315 320

Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr 325

Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 330 335

Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala 340

Glu Gin Ser Lys Glu Cys Asn Ile 345 350

Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro 355 360

Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 365

Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser 370 375

Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 380

Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile 385 390

Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile 395 400

PL 213 926 B1

Lys

Gin Leu Asn

Lys 405

Gly Cys

Ser

Tyr

Ile 410

Thr

Asn

Gin Asp Ala 415

Asp

Thr

Val

Thr

Ile

Asp

Asn

Thr

Val

Tyr

Gin

Leu

Ser

Lys

Val

Glu

Gly

420

425

430

Glu

Gin

His

Val

Ile

Lys

Gly

Arg

Pro

Val

Ser

Ser

Ser

Phe

Asp

Pro

435

440

445

Val

Lys

Phe

Pro

Glu

Asp

Gin

Phe

Asn

Val

Ala

Leu

Asp

Gin

Val

Phe

450

455

460

Glu

Ser

Ile

Glu

Asn

Ser

Gin

Ala

Leu

Val

Asp

Gin

Ser

Asn

Arg

Ile

465

470

475

480

Leu

Ser

Ser

Ala

Glu

Lys

Gly

Asn

Thr

Gly

Phe'

Ile

Ile

Val

Ile

Ile

485

490

495

Leu

Ile

Ala

Val

Leu

Gly

Ser

Thr

Met

Ile

Leu

Val

Ser

Val

Phe

Ile

500

505

510

Ile

Ile

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Pro

Thr

Gly

Ala

Pro

Pro

Glu

Leu

Ser

515

520

525

Gly

Val

Thr

Asn

Asn

Gly

Phe

Ile

Pro

His

Asn

530

535

<210> :

22

<211> 1

538

<212> :

PRT

<213> Wirus zapalenia krtani i

tchawicy indyków A

<400> :

22

Met

Asp

Val

Arg

Ile

Cys

Leu

Leu

Leu

Phe

Leu

Ile

Ser

Asn

Pro

Ser

1

5

10

15

Ser

Cys

Ile

Gin

Glu

Thr

Tyr

Asn

Glu

Glu

Ser

Cys

Ser

Thr

Val

Thr

20

25

30

Arg

Gly

Tyr

Lys

Ser

Val

Leu

Arg

Thr

Gly

Trp

Tyr

Thr

Asn

Val

Phe

35

40

45

Asn

Leu

Glu

Ile

Gly

Asn

Val

Glu

Asn

Ile

Thr

Cys

Asn

Asp

Gly

Pro

50

55

60

Ser

Leu

Ile

Asp

Thr

Glu

Leu

Val

Leu

Thr

Lys

Asn

Ala

Leu

Arg

Glu

65

70

75

80

PL 213 926 B1

Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gin 85

Val Ala Lys Glu Ser Arg Leu Ser 90 95

Ser Pro Arg Arg Arg Arg Phe Val 100

Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val 105 110

Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala 115 120

Gly Val Ala Leu Ala Lys Thr Ile 125

Arg Leu Glu Gly Glu Val Lys Ala 130 135

Ile Lys Asn Ala Leu Arg Asn Thr 140

Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly 145 150

Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 155 160

Ala Val Asn Asp Leu Lys Glu Phe 165

Ile Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 170 175

Ile Asn Gin Asn Lys Cys Asn Ile 180

Ala Asp Ile Lys Met Ala Ile Ser 185 190

Phe Gly Gin Asn Asn Arg Arg Phe 195 200

Leu Asn Val Val Arg Gin Phe Ser 205

Asp Ser Ala Gly Ile Thr Ser Ala 210 215

Val Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 220

Asp Glu Leu Val Arg Ala Ile Asn 225 230

Arg Met Pro Thr Ser Ser Gly Gin 235 240

Ile Ser Leu Met Leu Asn Asn Arg 245

Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 250 255

Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Asp 260

Gly Thr Val Val Tyr Met Val Gin 265 270

Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Glu 275 280

Thr Pro Cys Trp Arg Val Val Ala 285

Ala Pro Leu Cys Arg Lys Glu Lys 290 295

Gly Asn Tyr Ala Cys Ile Leu Arg 300

Glu Asp Gin Gly Trp Tyr Cys Thr 305 310

Asn Ala Gly Ser Thr Ala Tyr Tyr 315 320

PL 213 926 B1

Pro Asn Lys Asp Asp Cys Glu Val Arg Asp Asp Tyr Val Phe Cys Asp 325 330 335

Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Leu Glu Val Glu Gin Cys Asn Tyr 340 345 350

Asn Ile Ser Thr Ser Lys Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365

Pro Val Ser Met Val Ala Leu Thr Pro Leu Gly Gly Leu Val Ser Cys 370 375 380

Tyr Glu Ser Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Lys Val Gly Ile Ile 385 390 395 400

Lys Gin Leu Gly Lys Gly Cys Thr His Ile Pro Asn Asn Glu Ala Asp 405 410 415

Thr Ile Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gin Leu Ser Lys Val Val Gly 420 425 430

Glu Gin Arg Thr Ile Lys Gly Ala Pro Val Val Asn Asn Phe Asn Pro 435 440 445

Ile Leu Phe Pro Glu Asp Gin Phe Asn Val Ala Leu Asp Gin Val Phe 450 455 460

Glu Ser Ile Asp Arg Ser Gin Asp Leu Ile Asp Lys Ser Asn Asp Leu 465 470 475 480

Leu Gly Ala Asp Ala Lys Ser Lys Ala Gly Ile Ala Ile Ala Ile Val 485 490 495

Val Leu Val Ile Leu Gly Ile Phe Phe Leu Leu Ala Val Ile Tyr Tyr 500 505 510

Cys Ser Arg Val Arg Lys Thr Lys Pro Lys His Asp Tyr Pro Ala Thr 515 520 525

Thr Gly His Ser Ser Met Ala Tyr Val Ser 530 535

<210>	23
<211>	542 ·
<212>	PRT
<213>	Ptasi pneumowirus B
<400>	23

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

Ser Ser Gly Gin Ile Ser Leu Met 245

Leu Asn Asn Arg Ala Met Val Arg 250 255

Arg Lys Gly Phe Gly Ile Leu Ile 260

Gly Val Tyr Gly Gly Thr Val Val 265 270

Tyr Met Val Gin Leu Pro Ile Phe 275 280

Gly Val Ile Glu Thr Pro Cys Trp 285

Arg Val Val Ala Ala Pro Leu Cys 290 295

Arg His Glu Arg Glu Ser Tyr Ala 300

Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gin Gly 305 310

Trp Tyr Cys Thr Asn Ala Gly Ser 315 320

Thr Ala Tyr Tyr Pro Asn Glu Asp 325

Asp Cys Glu Val Arg Asp Asp Tyr 330 335

Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala Gly 340

Ile Asn Val Ala Ser Glu Val Glu 345 350

Gin Cys Asn His Asn Ile Ser Thr 355 360

Ser Thr Tyr Pro Cys Lys Val Ser 365

Thr Gly Arg His Pro Val Ser Met 370 375

Val Ala Leu Thr Pro Leu Gly Gly 380

Leu Val Ser Cys Tyr Glu Gly Val 385 390

Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Lys 395 400

Val Gly Ile Ile Lys Gin Leu Asn 405

Lys Gly Cys Thr His Ile Pro Asn 410 415

Asn Glu Ala Asp Thr Ile Thr Ile 420

Asp Asn Thr Ile Tyr Gin Leu Ser 425 430

Lys Val Val Gly Glu Gin Arg Thr 435 440

Ile Lys Gly Ala Pro Val Val Asn 445

Asn Phe Asn Pro Leu Leu Phe Pro 450 455

Glu Asp Gin Phe Asn Val Ala Leu 460

Asp Gin Val Phe Glu Ser Val Asp 465 470

Lys Ser Lys Asp Leu Ile Asp Lys 475 480

PL 213 926 B1

Ser

Asn

Asp

Leu

Leu

Asp

Ile

Glu

Val

Lys

Ser

Asn

Ile

Gly

Ala

Ala

485

490

495

Leu

Ala

Ile

Thr

Ile

Leu

Val

Val

Leu

Ser

Met

Leu

Ile

Ile

Val

Gly

500

505

510

Ile

Ala

Tyr

Tyr

Val

Val

Lys

Lys

Arg

Lys

Ala

Lys

Thr

Ser

Asn

Gly

515

520

525

Tyr

Pro

Lys

Thr

Thr

Gly

Gin

Ser

Asn

Met

Gly

Tyr

Ile

Ser

530 535 540 <210> 24 <211> 537 <212> PRT <213> Ptasi pneumowirus C <400> 24

Met 1

Ser

Trp

Lys

Val 5

Val

Leu

Leu

Leu

Val 10

Leu

Leu

Ala

Thr

Pro 15

Thr

Gly

Gly

Leu

Glu 20

Glu

Ser

Tyr

Leu

Glu 25

Glu

Ser

Tyr

Ser

Thr 30

Val

Thr

Arg

Gly

Tyr 35

Leu

Ser

Val

Leu

Arg 40

Thr

Gly

Trp

Tyr

Thr 45

Asn

Val

Phe

Thr

Leu 50

Glu

Val

Gly

Asp

Val 55

Glu

Asn

Leu

Thr

Cys 60

Thr

Asp

Gly

Pro

Ser 65

Leu

Ile

Arg

Thr

Glu 70

Leu

Glu

Leu

Thr

Lys 75

Asn

Ala

Leu

Glu

Glu 80

Leu

Lys

Thr

Val

Ser 85

Ala

Asp

Gin

Leu

Ala 90

Lys

Glu

Ala

Arg

Ile 95

Met

Ser

Pro

Arg

Lys 100

Ala

Arg

Phe

Val

Leu 105

Gly

Ala

Ile

Ala

Leu 110

Gly

Val

Ala

Thr

Ala 115

Ala

Ala

Val

Thr

Ala 120

Gly

Val

Ala

Ile

Ala 125

Lys

Thr

Ile

Arg

Leu 130

Glu

Gly

Glu

Val

Ala 135

Ala

Ile

Lys

Gly

Ala 140

Leu

Arg

Lys

Thr

Asn

Glu

Ala

Val

Ser

Thr

Leu

Gly

Asn

Gly

Val

Arg

Val

Leu

Ala

Thr

145 150 155 160

PL 213 926 B1

Ala Val Asn Asp Leu Lys Asp Phe Ile Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 175

Ile Asn Arg Asn Lys Cys Asp Ile Ser Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190

Phe Gly Gin Tyr Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gin Phe Ser 195 200 205

Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220

Ala Glu Leu Val Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ser Gly Gin 225 230 235 240

Ile Asn Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255

Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Val Tyr Ile Val Gin 260 265 270

Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Val Lys Ala 275 280 285

Ala Pro Leu Cys Ser Gly Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300

Glu Asp Gin Gly Trp Tyr Cys Gin Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320

Pro Asn Glu Glu Asp Cys Glu Val Arg Ser Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335

Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Lys Glu Ser Glu Glu Cys Asn Arg 340 345 350

Asn Ile Ser Thr Thr Lys Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365

Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380

Tyr Asp Gly Met Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Lys Val Gly Ile Ile 385 390 395 400

PL 213 926 B1

Arg Pro Leu Gly Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Ser Asn Gin Asp Ala Asp 405 410 415

Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gin Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430

Glu Gin His Thr Ile Lys Gly Lys Pro Val Ser Ser Asn Phe Asp Pro 435 440 445

Ile Glu Phe Pro Glu Asp Gin Phe Asn Ile Ala Leu Asp Gin Val Phe 450 455 460

Glu Ser Val Glu Lys Ser Gin Asn Leu Ile Asp Gin Ser Asn Lys Ile 465 470 475 480

Leu Asp Ser Ile Glu Lys Gly Asn Ala Gly Phe Val Ile Val Ile Val 485 490 495

Leu Ile Val Leu Leu Met Leu Ala Ala Val Gly Val Gly Val Phe Phe 500 505 510

Val Val Lys Lys Arg Lys Ala Ala Pro Lys Phe Pro Met Glu Met Asn 515 520 525

Gly Val Asn Asn Lys Gly Phe Ile Pro 530 535

<210>	25
<211>	574
<212>	PRT
<213>	Bydlęcy	syncytialny wirus	oddechowy
<400>	25
Met Ala	. Thr Thr	Ala Met Arg Met	Ile Ile Ser Ile Ile Phe Ile Ser

Thr Tyr Val Thr His Ile Thr Leu Cys Gin Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30

Tyr Gin Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Val Thr Ile Glu Leu Ser Lys Ile 50 55 60

Gin Lys Asn Val Cys Lys Ser Thr Asp Ser Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80

PL 213 926 B1

Gin Glu Leu Glu Arg Tyr Asn Asn Ala Val Val Glu Leu Gin Ser Leu 85 90 95

Met Gin Asn Glu Pro Ala Ser Phe Ser Arg Ala Lys Arg Gly Ile Pro 100 105 110

Glu Leu Ile His Tyr Thr Arg Asn Ser Thr Lys Lys Phe Tyr Gly Leu 115 120 125

Met Gly Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Ile 130 135 140

Gly Ser Ala Val Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Glu Leu Leu Pro Gin Val Asn 195 200 205

Asn His Asp Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gir. 210 215 220

Gin Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Ala Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240

Ala Gly Ile Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gin Lys Lys 260 265 270

Leu Met Ser Ser Asn Val Gin Ile Val Arg Gin Gin Ser Tyr Ser Ile 275 280 285

Met Ser Val Val Lys Glu Glu Val Ile Ala Tyr Val Val Gin Leu Pro 290 295 300

Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320

PL 213 926 B1

Leu Cys Thr Thr Asp Asn Lys Glu 325

Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp 340

Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 345 350

Pro Gin Thr Glu Thr Cys Lys Val 355 360

Gin Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro 370 375

Thr Asp Val Asn Leu Cys Asn Thr 380

Asp Ile Phe Asn Thr Lys Tyr Asp 385 390

Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 395 400

Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr 405

Ser Ile Gly Ala Ile Val Ser Cys 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala 420

Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp 435 440

Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu 450 455

Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly 460

Lys Ala Leu Tyr Ile Lys Gly Glu 465 470

Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe 485

Asp Ala Ser Ile Ala Gin Val Asn 490 495

Ala Lys Ile Asn Gin Ser Leu Ala 500

Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu 505 510

Leu His Ser Val Asp Val Gly Lys 515 520

Ser Thr Thr Asn Val Val Ile Thr 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Val Val 530 535

Val Ile Leu Met Leu Ile Ala Val 540

Gly Leu Leu Phe Tyr Cys Lys Thr 545 550

Lys Ser Thr Pro Ile Met Leu Gly 555 560

PL 213 926 B1

Lys

Asp

Gin

Leu

Ser 565

Gly

Ile

Asn

Asn

Leu 570

Ser

Phe

Ser

Lys

<210> 26 <211> 574 <212> PRT

<213> Ludzki syncytialny wirus

oddechowy

<400> 26

Met

Glu

Leu

Leu

Ile

His

Arg

Leu

Ser

Ala

Ile

Phe

Leu

Thr

Leu

Ala

1

5

10

15

Ile

Asn

Ala

Leu

Tyr

Leu

Thr

Ser

Ser

Gin

Asn

Ile

Thr

Glu

Glu

Phe

20

25

30

Tyr

Gin

Ser

Thr

Cys

Ser

Ala

Val

Ser

Arg

Gly

Tyr

Phe

Ser

Ala

Leu

35

40

45

Arg

Thr

Gly

Trp

Tyr

Thr

Ser

Val

Ile

Thr

Ile

Glu

Leu

Ser

Asn

Ile

50

55

60

Lys

Glu

Thr

Lys

Cys

Asn

Gly

Thr

Asp

Thr

Lys

Val

Lys

Leu

Ile

Lys

65

70

75

80

Gin

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Ala

Val

Thr

Glu

Leu

Gin

Leu

Leu

85

90

95

Met

Gin

Asn

Thr

Pro

Ala

Ala

Asn

Asn

Arg

Ala

Arg

Arg

Glu

Ala

Pro

100

105

110

Gin

Tyr

Met

Asn

Tyr

Thr

Ile

Asn

Thr

Thr

Lys

Asn

Leu

Asn

Val

Ser

115

120

125

Ile

Ser

Lys

Lys

Arg

Lys

Arg

Arg

Phe

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Gly

Val

130

135

140

Gly

Ser

Ala

Ile

Ala

Ser

Gly

Ile

Ala

Val

Ser

Lys

Val

Leu

His

Leu

145

150

155

160

Glu

Gly

Glu

Val

Asn

Lys

Ile

Lys

Asn

Ala

Leu

Leu

Ser

Thr

Asn

Lys

165

170

175

Ala

Val

Val

Ser

Leu

Ser

Asn

Gly

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Val

180

185

190

Leu

Asp

Leu

Lys

Asn

Tyr

Ile

Asn

Asn

Gin

Leu

Leu

Pro

Ile

Val

Asn

195 200 205

PL 213 926 B1

Gin Gin Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gin 210 215 220

Gin Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Asn Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gin Lys Lys 260 265 270

Leu Met Ser Ser Asn Val Gin Ile Val Arg Gin Gin Ser Tyr Ser Ile 275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gin Leu Pro 290 295 300

Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350

Pro Gin Ala Asp Thr Cys Lys Val Gin Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr 370 375 380

Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400

Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

435 440 445

PL 213 926 B1

Thr Val

Ser Val

Gly

Asn

Thr 455

Leu

Tyr

Tyr

Val

Asn 460

Lys

Leu

Glu

Gly

450

Lys

Asn

Leu Tyr

Val

Lys

Gly

Glu

Pro

Ile

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Asp

Pro

465

470

475

480

Leu

Val

Phe Pro

Ser

Asp

Glu

Phe

Asp

Ala

Ser

Ile

Ser

Gin

Val

Asn

485

490

495

Glu

Lys

Ile Asn

Gin

Ser

Leu

Ala

Phe

Ile

Arg

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

500

505

510

Leu

His

Asn Val

Asn

Thr

Gly

Lys

Ser

Thr

Thr

Asn

Ile

Met

Ile

Thr

515

520

525

Thr

Ile

Ile Ile

Val

Ile

Ile

Val

Val

Leu

Leu

Ser

Leu

Ile

Ala

Ile

530

535

540

Gly

Leu

Leu Leu

Tyr

Cys

Lys

Ala

Lys

Asn

Thr

Pro

Val

Thr

Leu

Ser

545

550

555

560

Lys

Asp

Gin Leu

Ser

Gly

Ile

Asn

Asn

Ile

Ala

Phe

Ser

Lys

565

570

<210> :

27

<211>

537

<212>

PRT

<213> Wirus zapalenia płuc

myszy

<4oo> :

27

Met

Ile

Pro Gly

Arg

Ile

Phe

Leu

Val

Leu

Leu

Val

Ile

Phe

Asn

Thr

1

5

10

15

Lys

Pro

Ile His

Pro

Asn

Thr

Leu

Thr

Glu

Lys

Tyr

Tyr

Glu

Ser

Thr

20

25

30

Cys

Ser

Val Glu

Thr

Ala

Gly

Tyr

Lys

Ser

Ala

Leu

Arg

Thr

Gly

Trp

35

40

45

His

Met

Thr Val

Met

Ser

Ile

Lys

Leu

Ser

Gin

Ile

Asn

Ile

Glu

Ser

50

55

60

Cys

Lys

Ser Ser

Asn

Ser

Leu

Leu

Ala

His

Glu

Leu

Ala

Ile

Tyr

Ser

65

70

75

80

Ser

Ala

Val Asp

Glu

Leu

Arg

Thr

Leu

Ser

Ser

Asn

Ala

Leu

Lys

Ser

85

90

95

PL 213 926 B1

Lys Arg Lys Lys Arg Phe Leu Gly Leu Ile Leu Gly Leu Gly Ala Ala 100 105 110

Val Thr Ala Gly Val Ala Leu Ala Lys Thr Val Gin Leu Glu Ser Glu 115 120 125

Ile Ala Leu Ile Arg Asp Ala Val Arg Asn Thr Asn Glu Ala Val Val 130 135 140

Ser Leu Thr Asn Gly Met Ser Val Leu Ala Lys Val Val Asp Asp Leu 145 150 155 160

Lys Asn Phe Ile Ser Lys Glu Leu Leu Pro Lys Ile Asn Arg Val Ser 165 170 175

Cys Asp Val His Asp Ile Thr Ala Val Ile Arg Phe Gin Gin Leu Asn 180 185 190

Lys Arg Leu Leu Glu Val Ser Arg Glu Phe Ser Ser Asn Ala Gly Leu 195 200 205

Thr His Thr Val Ser Ser Phe Met Leu Thr Asp Arg Glu Leu Thr Ser 210 215 220

Ile Val Gly Gly Met Ala Val Ser Ala Gly Gin Lys Glu Ile Met Leu 225 230 235 240

Ser Ser Lys Ala Ile Met Arg Arg Asn Gly Leu Ala Ile Leu Ser Ser 245 250 255

Val Asn Ala Asp Thr Leu Val Tyr Val Ile Gin Leu Pro Leu Phe Gly 260 265 270

Val Met Asp Thr Asp Cys Trp Val Ile Arg Ser Ser Ile Asp Cys His 275 280 285

Asn Ile Ala Asp Lys Tyr Ala Cys Leu Ala Arg Ala Asp Asn Gly Trp

290 295 300

Tyr Cys His Asn Ala Gly Ser Leu Ser Tyr Phe Pro Ser Pro Thr Asp

305 310 315 320

Cys Glu Ile His Asn Gly Tyr Ala Phe Cys Asp Thr Leu Lys Ser Leu

325 330 335

PL 213 926 B1

Thr Val Pro Val Thr Ser Arg Glu Cys Asn Ser Asn Met Tyr 340 345 350

Asn Tyr Asp Cys Lys Ile Ser Thr Ser Lys Thr Tyr Val Ser 355 360 365

Val Leu Thr Thr Met Gly Cys Leu Val Ser Cys Tyr Gly His 370 375 380

Cys Thr Val Ile Asn Asn Asp Lys Gly Ile Ile Arg Thr Leu 385 390 395

Gly Cys His Tyr Ile Ser Asn Lys Gly Val Asp Arg Val Gin 405 410

Asn Thr Val Tyr Tyr Leu Ser Lys Glu Val Gly' Lys Ser Ile 420 425 430

Arg Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Tyr Asp Pro Leu Ser Phe 435 440 445

Asp Lys Phe Asp Val Ala Ile Arg Asp Val Glu His Ser Ile 450 455 460

Thr Arg Thr Phe Phe Lys Ala Ser Asp Gin Leu Leu Asp Leu 465 470 475

Asn Arg Glu Asn Lys Asn Leu Asn Lys Ser Tyr Ile Leu Thr 485 490

Leu Phe Val Val Met Leu Ile Ile Ile Met Ala Val Ile Gly 500 505 510

Leu Tyr Lys Val Leu Lys Met Ile Arg Asp Asn Lys Leu Lys 515 520 525

Thr Thr

Thr Ala

Asn Ser

Pro Asp 400

Val Gly 415

Val Val

Pro Asp

Asn Gin

Ser Glu 480

Thr Leu 495

Phe Ile

Ser Lys

Ser Thr Pro Gly Leu Thr Val Leu Ser 530 535 <210> 28 <211> 269 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 28

Thr Val Asn Val Tyr Leu Pro Asp Ser Tyr Leu Lys Gly Val Ile Ser 15 10 15

PL 213 926 B1

Phe

Ser Glu Thr Asn Ala 20

Ile

Gly Ser Cys 25

Leu

Leu

Lys

Arg 30

Pro

Tyr

Leu

Lys

Asn

Asp

Asn

Thr

Ala

Lys

Val

Ala

Ile

Glu

Asn

Pro

Val

Ile

35

40

45

Glu

His

Val

Arg

Leu

Lys

Asn

Ala

Val

Asn

Ser

Lys

Met

Lys

Ile

Ser

50

55

60

Asp

Tyr

Lys

Ile

Val

Glu

Pro

Val

Asn

Met

Gin

His

Glu

Ile

Met

Lys

65

70

75

80

Asn

Val

His

Ser

Cys

Glu

Leu

Thr

Leu

Leu

Lys

Gin

Phe

Leu

Thr

Arg

85

90

95

Ser

Lys

Asn

Ile

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Asn

Met

Ile

Cys

Asp

Trp

Leu

100

105

110

Gin

Leu

Lys

Ser

Thr

Ser

Asp

Asp

Thr

Ser

Ile

Leu

Ser

Phe

Ile

Asp

115

120

125

Val

Glu

Phe

Ile

Pro

Ser

Trp

Val

Ser

Asn

Trp

Phe

Ser

Asn

Trp

Tyr

130

135

140

Asn

Leu

Asn

Lys

Leu

Ile

Leu

Glu

Phe

Arg

Lys

Glu

Glu

Val

Ile

Arg

145

150

155

160

Thr

Gly

Ser

Ile

Leu

Cys

Arg

Ser

Leu

Gly

Lys

Leu

Val

Phe

Val

Val

165

170

175

Ser

Ser

Tyr

Gly

Cys

Ile

Val

Lys

Ser

Asn

Lys

Ser

Lys

Arg

Val

Ser

180

185

190

Phe

Phe

Thr

Tyr

Asn

Gin

Leu

Leu

Thr

Trp

Lys

Asp

Val

Met

Leu

Ser

195

200

205

Arg

Phe

Asn

Ala

Asn

Phe

Cys

Ile

Trp

Val

Ser

Asn

Ser

Leu

Asn

Glu

210

215

220

Asn

Gin

Glu

Gly

Leu

Gly

Leu

Arg

Ser

Asn

Leu

Gin

Gly

Ile

Leu

Thr

225

230

235

240

Asn

Lys

Leu

Tyr

Glu

Thr

Val

Asp

Tyr

Met

Leu

Ser

Leu

Cys

Cys

Asn

245

250

255

100

PL 213 926 B1

Glu Gly Phe Ser Leu Val Lys Glu Phe Glu Gly Phe Ile
260	265
<210>	29
<211>	249
<212>	PRT
<213>	Ptasi pneumowirus A

<400> 29

Met 1

Glu

Ile

Ser

Asn 5

Glu

Ser

Val

Val

Asn Val 10

Tyr

Leu

Pro

Asp 15

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gly

Val

Ile

Ser

Phe

Ser

Glu

Thr

Asn

Ala

Ile

Gly

Ser

20

25

30

Cys

Val

Leu

Asn

Arg

Pro

Tyr

Ile

Lys

Asp

Asp

Tyr

Thr

Ala

His

Val

35

40

45

Ala

Met

Thr

Asn

Pro

Val

Ile

Glu

His

Gin

Arg

Leu

Arg

Ala

Leu

Phe

50

55

60

Lys

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Glu

Tyr

Arg

Val

Val

Glu

Pro

Leu

Met

65

70

75

80

Ile

Gin

Lys

Glu

Leu

Leu

Lys

Val

Ala

Ala

Gly

Ala

Arg

Leu

Lys

Lys

85

90

95

Leu

Lys

Lys

Trp

Leu

Gly

Arg

Ser

Lys

Asp

Ile

Ser

Glu

Val

Lys

Leu

100

105

110

Lys

Met

Val

Thr

Asp

Trp

Leu

Lys

Leu

Ser

Gin

Thr

Pro

Gly

Arg

Gly

115

120

125

Lys

Ile

Ile

Asp

Arg

Ile

Gin

Val

Glu

Asn

Leu

Pro

Asp

Trp

Leu

Glu

130

135

140

His

Trp

Phe

Asp

Ser

Trp

Leu

Ile

Leu

Asn

Asp

Val

Ile

Gin

Ser

Tyr

145

150

155

160

Arg

Cys

Leu

Glu

Val

Ser

Gin

Thr

Ser

Ala

Ile

Leu

Arg

Lys

Ser

Ser

165

170

175

Leu

Asn

Phe

Phe

Phe

Ala

Val

Ser

Ser

Phe

Gly

Cys

Ile

Ile

Ile

Ser

180

185

190

Arg

Lys

Ser

Arg

Arg

Ile

Cys

Phe

Cys

Thr

Tyr

Asn

Gin

Leu

Leu

Thr

195

200

205

PL 213 926 B1

101

Trp Lys Asp Leu Ala Leu Ser Arg Phe Asn Ala Asn Leu Cys Val Trp 210 215 220

Val Ser Asn Cys Leu Asn Ser Ala Gin Asp Gly Leu Gly Leu Arg Ser 225 230 235 240

Lys Leu Val Gly Glu Leu Leu Asn Arg 245 <210> 30 <211> 300 <212> PRT <213> Bydlęcy syncytialny wirus oddechowy <400> 30

Met Asp Thr Leu Ile His Glu Asn 1 5

Ser Thr Asn Val Tyr Leu Thr Asp 10 ' 15

Ser Tyr Leu Lys Gly Val Ile Ser 20

Phe Ser Glu Cys Asn Ala Leu Gly 25 30

Ser Tyr Leu Leu Asp Gly Pro Tyr 35 40

Leu Lys Asn Asp Tyr Thr Asn Ile 45

Ile Ser Arg Gin Lys Pro Leu Ile 50 55

Glu His Ile Asn Leu Lys Lys Leu 60

Ser Ile Ile Gin Ser Phe Val Thr 65 70

Lys Tyr Asn Lys Gly Glu Leu Gly 75 80

Leu Glu Glu Pro Thr Tyr Phe Gin 85

Ser Leu Leu Met Thr Tyr Lys Ser 90 95

Leu Ser Thr Ser Glu Leu Ile Thr 100

Thr Thr Thr Leu Phe Lys Lys Ile 105 110

Ile Arg Arg Ala Ile Glu Ile Ser 115 120

Asp Val Lys Val Tyr Ala Ile Leu 125

Asn Lys Leu Gly Leu Lys Glu Lys 130 135

Gly Lys Val Asp Arg Cys Asp Asp 140

Thr Asn Thr Thr Leu Ser Asn Ile 145 150

Val Arg Asp Asn Ile Leu Ser Val 155 160

Ile Ser Asp Asn Thr Pro Ser Thr 165

Lys Lys Pro Asn Asn Ser Ser Cys 170 175

102

PL 213 926 B1

Lys Pro Asp Gin Pro Ile Lys Thr Thr Ile Leu Cys Lys Leu Leu Ser 180 185 190

Ser Met Ser His Pro Pro Thr Trp Leu Ile His Trp Phe Asn Leu Tyr 195 200 205

Thr Lys Leu Asn Asp Ile Leu Thr Gin Tyr Arg Thr Asn Glu Ala Arg 210 215 220

Asn His Gly Tyr Ile Leu Ile Asp Thr Arg Thr Leu Gly Glu Phe Gin 225 230 235 240

Phe Ile Leu Asn Gin Tyr Gly Cys Ile Val Tyr His Lys Lys Leu Lys 245 250 255

Lys Ile Thr Ile Thr Thr Tyr Asn Gin Phe Leu Thr Trp Lys Asp Ile 260 265 270

Ser Leu Ser Arg Leu Asn Val Cys Met Ile Thr Trp Ile Ser Asn Cys 275 280 285

Leu Asn Thr Leu Asn Lys Ser Leu Gly Leu Arg Cys 290 295 300 <210> 31 <211> 300 <212> PRT <213> Syncytialny wirus oddechowy <400> 31

Met Asp Pro Ile Ile Asn Gly Asn Ser Ala Asn Val Tyr Leu Thr Asp 15 10 15

Ser Tyr Leu Lys Gly Val Ile Ser Phe Ser Glu Cys Asn Ala Leu Gly 20 25 30

Ser Tyr Ile Phe Asn Gly Pro Tyr Leu Lys Asn Asp Tyr Thr Asn Leu 35 40 45

Ile Ser Arg Gin Asn Pro Leu Ile Glu His Ile Asn Leu Lys Lys Leu 50 55 60

Asn Ile Thr Gin Ser Leu Met Ser Lys Tyr His Lys Gly Glu Ile Lys 65 70 75 80

Ile Glu Glu Pro Thr Tyr Phe Gin Ser Leu Leu Met Thr Tyr Lys Ser 85 90 95

PL 213 926 B1

103

Met

Thr

Ser Leu Glu 100

Gin

Ile

Thr

Thr 105

Thr

Asn

Leu

Leu

Lys 110

Lys

Ile

Ile

Arg

Arg

Ala

Ile

Glu

Ile

Ser

Asp

Val

Lys

Val

Tyr

Ala

Ile

Leu

115

120

125

Asn

Lys

Leu

Gly

Leu

Lys

Glu

Lys

Asp

Lys

Ile

Lys

Ser

Asn

Asn

Gly

130

135

140

Gin

Asp

Glu

Asp

Asn

Ser

Val

Ile

Thr

Thr

Ile

Ile

Lys

Asp

Asp

Ile

145

150

155

160

Leu

Leu

Ala

Val

Lys

Asp

Asn

Gin

Ser

His

Leu

Lys

Ala

Val

Lys

Asn

165

170

175

His

Ser

Thr

Lys

Gin

Lys

Asp

Thr

Ile

Lys

Thr

Thr

Leu

Leu

Lys

Lys

180

185

190

Leu

Met

Cys

Ser

Met

Gin

His

Pro

Pro

Ser

Trp

Leu

Ile

His

Trp

Phe

195

200

205

Asn

Leu

Tyr

Thr

Lys

Leu

Asn

Asn

Ile

Leu

Thr

Gin

Tyr

Arg

Ser

Ser

210

215

220

Glu

Val

Lys

Asn

His

Gly

Phe

Ile

Leu

Ile

Asp

Asn

His

Thr

Leu

Asn

225

230

235

240

Gly

Phe

Gin

Phe

Ile

Leu

Asn

Gin

Tyr

Gly

Cys

Ile

Val

Tyr

His

Lys

245

250

255

Glu

Leu

Lys

Arg

Ile

Thr

Val

Thr

Thr

Tyr

Asn

Gin

Phe

Leu

Thr

Trp

260

265

270

Lys

Asn

Ile

Ser

Leu

Ser

Arg

Leu

Asn

Val

Cys

Leu

Ile

Thr

Trp

Ile

275

280

285

Ser

Asn

Cys

Leu

Asn

Thr

Leu

Asn

Lys

Ser

Leu

Gly

290 295 300 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 32

Lys	Leu Val Asp Lys Ile Thr Ser Asp Gin His Ile Phe Ser Pro Asp
1	5	10	15

104

PL 213 926 B1

Lys

Ile Asp

Met 20

Leu Thr

Leu

Gly

Lys 25

Met

Leu

Met

Pro

Thr 30

Ile

Lys

Gly

Gin

Lys

Thr

Asp

Gin

Phe

Leu

Asn

Lys

Arg

Glu

Asn

Tyr

Phe

His

35

40

45

Gly

Asn

Asn

Leu

Ile

Glu

Ser

Leu

Ser

Ala

Ala

Leu

Ala

Cys

His

Trp

50

55

60

Cys

Gly

Ile

Leu

Thr

Glu

Gin

Cys

Ile

Glu

Asn

Asn

Ile

Phe

Lys

Lys

65

70

75

80

Asp

Trp

Gly

Asp

Gly

Phe

Ile

Ser

Asp

His

Ala

Phe

Met

Asp

Phe

Lys

85

90

95

Ile

Phe

Leu

Cys

Val

Phe

Lys

Thr

Lys

Leu

Leu

Cys

100 105 <210> 33 <211> 110 <212> PRT <213> Ptasi pneumowirus A <400> 33

Phe 1

Lys

Ser

Val

Arg 5

Lys

Ile

Val

Thr

Asp Gin His 10

Ile

Phe

Asn 15

Pro

Asp

His

Ile

Asp

Leu

Val

Met

Leu

Gly

Lys

Leu

Leu

Leu

Pro

Thr

Val

20

25

30

Arg

Ser

Asn

Ile

Asn

Asn

Asn

Lys

Pro

Ala

Thr

Glu

Asn

Phe

Phe

Asn

35

40

45

Gly

Asn

Asn

Ile

Val

Glu

Ala

Leu

Thr

Ser

Cys

Leu

Ala

Cys

His

Trp

50

55

60

Cys

Thr

Val

Leu

Ile

Leu

Leu

Thr

Thr

Glu

Asn

Ser

Ile

Phe

Gin

Lys

65

70

75

80

Glu

Trp

Gly

Asp

Gly

Phe

Ile

Thr

Asp

His

Ala

Phe

Ile

Asn

Phe

Thr

85

90

95

Trp

Phe

Leu

Met

Ser

Phe

Lys

Thr

Tyr

Leu

Leu

Cys

His

Trp

100

105

110

<210> 34 <211> 110

PL 213 926 B1

105 <212> PRT <213> Bydlęcy syncytialny wirus oddechowy <400> 34

Ile Cys 1

Lys

Leu

Asn 5

Gin

Val

Ile

Gin

Lys 10

Gin

His

Met

Phe

Leu 15

Pro

Asp Lys

Ile

Ser

Leu

Ser

Gin

Tyr

Val

Glu

Leu

Phe

Leu

Ser

Asn

Lys

20

25

30

Thr Leu

Lys

Asn

Ser

Pro

His

Ile

Ser

Ser

Asn

Leu

Val

Leu

Val

His

35

40

45

Lys Met

Ser

Asp

Tyr

Phe

Leu

His

Lys

Tyr

Val

Leu

Ser

Thr

Asn

Leu

50

55

60

Ala Gly

His

Trp

Ile

Met

Ile

Ile

Gin

Leu

Met

Lys

Asp

Ser

Lys

Gly

65

70

75

80

Ile Phe

Glu

Lys

Asp

Trp

Gly

Glu

Gly

Tyr

Ile

Thr

Asp

His

Met

Phe

85

90

95

Leu Asp

Leu

Asn

Val

Phe

Phe

Asp

Ala

Tyr

Lys

Thr

Tyr

Leu

100

105

110

<210>

35

<211>

110

<212>

PRT

<213>

Syncytialny wirus oddechowy

<400>

35

Asp Ile

His

Lys

Leu

Lys

Gin

Val

Ile

Gin

Lys

Gin

His

Met

Phe

Leu

1

5

10

15

Pro Asp

Lys

Ile

Ser

Leu

Thr

Gin

Tyr

Val

Glu

Leu

Phe

Leu

Ser

Asn

20

25

30

Lys Thr

Leu

Lys

Ser

Gly

Ser

His

Val

Asn

Ser

Asn

Leu

Ile

Leu

Ala

35

40

45

His Lys

Ile

Ser

Asp

Tyr

Phe

His

Asn

Thr

Tyr

Ile

Leu

Ser

Thr

Asn

50

55

60

Leu Ala

Gly

His

Trp

Ile

Leu

Ile

Ile

Gin

Leu

Met

Lys

Asp

Ser

Lys

65

70

75

80

Gly Ile

Phe

Glu

Lys

Asp

Trp

Gly

Glu

Gly

Tyr

Ile

Thr

Asp

His

Met

85

90

95

106

PL 213 926 B1

Phe Ile Asn Leu Lys Val Phe Phe Asn Ala Tyr Lys Thr Tyr

	100	105	110
<210> 36 <211> 4739 <212> DNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-	-1
<400> 36 acgcgtataa	attagattca	aaaaaatatg	ggacaagtga	aaatgtctct	tcaagggatt	60
cacctgagtg	atttatcata	caagcatgct	atattaaaag	agtctcagta	cacaataaaa	120
agagatgtgg	gtacaacaac	tgcagtgaca	ccctcatcat	tgcaacaaga	aataacactg	180
ttgtgtggag	aaattctgta	tgctaaacat	gctgactaca	aatatgctgc	agaaatagga	240
atacaatata	ttagcacagc	tttaggatca	gagagagtgc	agcagattct	gaggaactca	300
ggcagtgaag	tccaagtggt	cttaaccaga	acgtactctc	tggggaaaat	taaaaacaat	360
aaaggagaag	atttacagat	gttagacata	cacggggtag	agaagagctg	ggtagaagag	420
atagacaaag	aagcaaggaa	aacwatggca	accttgctta	aggaatcatc	aggtaatatc	480
ccacaaaatc	agaggccctc	agcaccagac	acacccataa	tcttattatg	tgtaggtgcc	540
ttaatattca	ctaaactagc	atcaaccata	gaagtgggac	tagagaccac	agtcagaagg	600
gctaaccgtg	tactaagtga	tgcactcaag	agatacccta	gaatggacat	accaaagatt	660
gccagatcct	tctatgactt	atttgaacaa	aaagtgtatc	acagaagttt	gttcattgag	720
tatggcaaag	cattaggctc	atcatctaca	ggcagcaaag	cagaaagtct	atttgttaat	780
atattcatgc	aagcttatgg	ggccggtcaa	acaatgctaa	ggtggggggt	cattgccagg	840
tcatccaaca	atataatgtt	aggacatgta	tccgtccaag	ctgagttaaa	acaggtcaca	900
gaagtctatg	acttggtgcg	agaaatgggc	cctgaatctg	gacttctaca	tttaaggcaa	960
agcccaaaag	ctggactgtt	atcactagcc	aactgtccca	actttgcaag	tgttgttctc	1020
ggaaatgcct	caggcttagg	cataatcggt	atgtatcgag	ggagagtacc	aaacacagaa	1080
ttattttcag	cagctgaaag	ttatgccaaa	agtttgaaag	aaagcaataa	aataaatttc	1140
tcttcattag	gacttacaga	tgaagagaaa	gaggctgcag	aacatttctt	aaatgtgagt	1200
gacgacagtc	aaaatgatta	tgagtaatta	aaaaagtggg	acaagtcaaa	atgtcattcc	1260
ctgaaggaaa	agatattctt	ttcatgggta	atgaagcagc	aaaattagca	gaagctttcc	1320
agaaatcatt	aagaaaacca	ggtcataaaa	gatctcaatc	tattatagga	gaaaaagtga	1380
atactgtatc	agaaacattg	gaattaccta	ctatcagtag	acctgcaaaa	ccaaccatac	1440
cgtcagaacc	aaagttagca	tggacagata	aaggtggggc	aaccaaaact	gaaataaagc	1500

PL 213 926 B1

107

aagcaatcaa	agtcatggat	cccattgaag	aagaagagtc	taccgagaag	aaggtgctac	1560
cctccagtga	tgggaaaacc	cctgcagaaa	agaaactgaa	accatcaact	aacaccaaaa	1620
agaaggtttc	atttacacca	aatgaaccag	ggaaatatac	aaagttggaa	aaagatgctc	1680
tagatttgct	ctcagataat	gaagaagaag	atgcagaatc	ttcaatctta	acctttgaag	1740
aaagagatac	ttcatcatta	agcattgagg	ccagattgga	atcaatagag	gagaaattaa	1800
gcatgatatt	agggctatta	agaacactca	acattgctac	agcaggaccc	acagcagcaa	1860
gagatgggat	cagagatgca	atgattggcg	taagagagga	attaatagca	gacataataa	1920
aggaagctaa	agggaaagca	gcagaaatga	tggaagagga	aatgaktcaa	cgatcaaaaa	1980
taggaaatgg	tagtgtaaaa	ttaacagaaa	aagcaaaaga	gctcaacaaa	attgttgaag	2040
atgaaagcac	aagtggagaa	tccgaagaag	aagaagaacc	aaaagacaca	caagacaata	2100
gtcaagaaga	tgacatttac	cagttaatta	tgtagtttaa	taaaaataaa	caatgggaca	2160
agtaaaaatg	gagtcctacc	tągtagacac	ctatcaaggc	attccttaca	cagcagctgt	2220
tcaagttgat	ctaatagaaa	aggacctgtt	acctgcaagc	ctaacaatat	ggttcccttt	2280
gtttcaggcc	aacacaccac	cagcagtgct	gctcgatcag	ctaaaaaccc	tgacaataac	2340
cactctgtat	gctgcatcac	aaaatggtcc	aatactcaaa	gtgaatgcat	cagcccaagg	2400
tgcagcaatg	tttgtacttc	ccaaaaaatt	tgaagtcaat	gcgactgtag	camtcgatga	2460
atatagcaaa	ctggaatttg	acaaactcac	agtctgtgaa	gtaaaaacag	tttacttaac	2520
aaccatgaaa	ccatacggga	tggtatcaaa	atttgtgagc	tcagccaaat	cagttggcaa	2580
aaaaacacat	gatctaatcg	cactatgtga	ttttatggat	ctagaaaaga	acacacctgt	2640
tacaatacca	gcattcatca	aatcagtttc	aatcaaagag	agtgagtcag	ctactgttga	2700
agctgctata	agcagtgaag	cagaccaagc	tctaacacag	gccaaaattg	caccttatgc	2760
gggattaatt	atgatcatga	ctatgaacaa	tcccaaaggc	atattcaaaa	agcttggagc	2820
tgggactcaa	gtcatagtag	aactaggagc	atatgtccag	gctgaaagca	taagcaaaat	2880
atgcaagact	tggagccatc	aagggacaag	atatgtcttg	aagtccagat	aacaaccaag	2940
caccttggcc	aagagctact	aaccctatct	catagatcat	aaagtcacca	ttctagttat	3000
ataaaaatca	agttagaaca	agaattaaat	caatcaagaa	cgggacaaat	aaaaatgtct	3060
tggaaagtgg	tgatcakttt	ttcattgtta	ataacacctc	racacggtct	taaagagagc	3120
tacttagaag	agtcatgtag	cactataact	gaaggatatc	tcagtgttct	gaggacaggt	3180
tggtacacca	atgtttttac	actggaggta	ggcgatgtag	agaaccttac	atgtgccgat	3240
ggacccagct	taataaaaac	agaattagac	ctgaccaaaa	gtgcactaag	agagctcaga	3300
acagtttctg	ctgatcaact	ggcaagagag	gagcaaattg	aaaatcccag	acaatctaga	3360

108

PL 213 926 B1

ttcgttctag	gagcaatagc	actcggtgtt	gcaactgcag	ctgcagttac	agcaggtgtt	3420
gcaattgcca	aaaccatccg	gcttgaaagt	gaagtaacag	caattaagaa	tgccctcaaa	3480
aagaccaatg	aagcagtatc	tacattgggg	aatggagttc	gtgtgttggc	aactgcagtg	3540
agagaactga	aagattttgt	gagcaagaat	ctaacacgtg	caatcaacaa	aaacaagtgc	3600
gacattgctg	acctgaaaat	ggccgttagc	ttcagtcaat	tcaacagaag	gttcctaaat	3660
gttgtgcggc	aattttcaga	caacgctgga	ataacaccag	caatatcttt	ggacttaatg	3720
acagatgctg	aactagccag	agctgtttcc	aacatgccaa	catctgcagg	acaaataaaa	3780
ctgatgttgg	agaaccgtgc	aatggtaaga	agaaaagggt	tcggattcct	gataggagtt	3840
taoggaagct	ccgtaattya	catggtgcaa	ctgccaatct	ttggggttat	agacacgcct	3900
tgctggatag	taaaagcagc	cccttcttgt	tcaggaaaaa	agggaaacta	tgcttgcctc	3960
ttaagagaag	accaaggatg	gtattgtcaa	aatgcagggt	caactgttta	ctacccaaat	4020
gaaaaagact	gtgaaacaag	aggagaccat	gtcttttgcg	acacagcagc	aggaatcaat	4080
gttgctgagc	agtcaargga	gtgcaacata	aacatatcta	ctactaatta	cccatgcaaa	4140
gttagcacag	gaagacatcc	tatcagtatg	gttgcactat	ctcctcttgg	ggctytggtt	4200
gcttgctaca	agggagtgag	ctgttccatt	ggcagcaaca	gagtagggat	catcaagcaa	4260
ctgaacaaag	gctgctctta	tataaccaac	caagacgcag	acacagtgac	aatagacaac	4320
actgtatacc	agctaagcaa	agttgaaggc	gaacagcatg	ttataaaagg	aaggccagtg	4380
tcaagcagct	ttgacccagt	caagtttcct	gaagatcaat	tcaatgttgc	acttgaccaa	4440
gttttcgaga	gcattgagaa	cagtcaggcc	ttggtggatc	aatcaaacag	aatcctaagc	4500
agtgcagaga	aaggaaacac	tggcttcatc	attgtaataa	ttctaattgc	tgtccttggc	4560
tctaccatga	tcctagtgag	tgtttttatc	ataataaaga	aaacaaagag	acccacagga	4620
gcacctccag	agctgagtgg	tgtcacaaac	aatggcttca	taccacataa	ttagttaatt	4680
aaaaataaat	taaaataaat	taaaattaaa	aataaaaatt	tgggacaaat	cataatgtc	4739

<210> 37 <211> 399 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 00-1

<400> 37

Met Gly Gin

Val

Lys

Met

Ser

Leu

Gin

Gly

Ile

His

Leu

Ser

Asp

Leu

1

5

10

15

Ser Tyr Lys

His

Ala

Ile

Leu

Lys

Glu

Ser

Gin

Tyr

Thr

Ile

Lys

Arg

20

25

30

PL 213 926 B1

109

110

PL 213 926 B1

Gin Val	Thr	Glu Val	Tyr Asp Leu 295	Val	Arg Glu	Met 300	Gly Pro Glu	Ser
	290
Gly	Leu	Leu	His Leu	Arg Gin Ser	Pro	Lys Ala	Gly	Leu Leu Ser	Leu
305				310		315			320
Ala	Asn	Cys	Pro Asn	Phe Ala Ser	Val	Val Leu	Gly	Asn Ala Ser	Gly
			325			330		335
Leu	Gly	Ile	Ile Gly	Met Tyr Arg	Gly	Arg Val	Pro	Asn Thr Glu	Leu
			340		345			350
Phe	Ser	Ala	Ala Glu	Ser Tyr Ala	Lys	Ser Leu	Lys	Glu Ser Asn	Lys
		355		360				365
Ile	Asn	Phe	Ser Ser	Leu Gly Leu	Thr	Asp Glu	Glu	Lys Glu Ala	Ala
	370			375			380
Glu	His	Phe	Leu Asn	Val Ser Asp	Asp	Ser Gin	Asn	Asp Tyr Glu
385				390		395
<210>	38
<211>	781
<212> :	DNA
<213> :	Ludzki metapneumowirus 00-1

<400> 38

caagaaaaaa	actgttccac	tgttaatgtc	tatcttcctg	actcatatct	taaaggagtg	60
atttccttta	gtgagactaa	tgcaattggt	tcatgtctct	taaaaagacc	ttacctaaaa	120
aatgacaaca	ctgcaaaagt	tgccatagag	aatcctgtta	tcgagcatgt	tagactcaaa	180
aatgcagtca	attctaagat	gaaaatatca	gattacaaga	tagtagagcc	agtaaacatg	240
caacatgaaa	ttatgaagaa	tgtacacagt	tgtgagctca	cattattaaa	acagttttta	300
acaaggagta	aaaatattag	cactctcaaa	ttaaatatga	tatgtgattg	gctgcagtta	360
aagtctacat	cagatgatac	ctcaatccta	agttttatag	atgtagaatt	tatacctagc	420
tgggtaagca	attggtttag	taattggtac	aatctcaaca	agttgattct	ggaattcagg	480
aaagaagaag	taataagaac	tggttcaatc	ttgtgtaggt	cattgggtaa	attagttttt	540
gttgtatcat	catatggatg	tatagtcaag	agcaacaaaa	gcaaaagagt	gagcttcttc	600
acatacaatc	aactgttaac	atggaaagat	gtgatgttaa	gtagattcaa	tgcaaatttt	660
tgtatatggg	taagcaacag	tctgaatgaa	aatcaagaag	gggtagggtt	gagaagtaat	720
ttgcaaggca	tattaactaa	taagctatat	gaaactgtag	attatatgct	tagtttatgt	780
t						781

PL 213 926 B1

111 <210> 39 <211> 250 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 39

Gin Glu Lys Asn Cys Ser Thr Val Asn Val Tyr Leu Pro Asp Ser Tyr 15 10 15

Leu Lys Gly Val Ile Ser Phe Ser Glu Thr Asn Ala Ile Gly Ser Cys 20 25 30

Leu Leu Lys Arg Pro Tyr Leu Lys Asn Asp Asn Thr Ala Lys Val Ala 35 40 45

Ile Glu Asn Pro Val Ile Glu His Val Arg Leu Lys Asn Ala Val Asn 50 55 60

Ser Lys Met Lys Ile Ser Asp Tyr Lys Ile Val Glu Pro Val Asn Met 65 70 75 80

Gin His Glu Ile Met Lys Asn Val His Ser Cys Glu Leu Thr Leu Leu 85 90 95

Lys Gin Phe Leu Thr Arg Ser Lys Asn Ile Ser Thr Leu Lys Leu Asn 100 105 110

Met Ile Cys Asp Trp Leu Gin Leu Lys Ser Thr Ser Asp Asp Thr Ser 115 120 125

Ile Leu Ser Phe Ile Asp Val Glu Phe Ile Pro Ser Trp Val Ser Asn 130 135 140

Trp Phe Ser Asn Trp Tyr Asn Leu Asn Lys Leu Ile Leu Glu Phe Arg 145 150 155 160

Lys Glu Glu Val Ile Arg Thr Gly Ser Ile Leu Cys Arg Ser Leu Gly 165 170 175

Lys Leu Val Phe Val Val Ser Ser Tyr Gly Cys Ile Val Lys Ser Asn

180 185 190

Lys Ser Lys Arg Val Ser Phe Phe Thr Tyr Asn Gin Leu Leu Thr Trp

195 200 205

Lys Asp Val Met Leu Ser Arg Phe Asn Ala Asn Phe Cys Ile Trp Val

210 215 220

112

PL 213 926 B1

Ser Asn Ser Leu Asn Glu Asn Gin Glu Gly Val Gly Leu Arg Ser Asn 225 230 235 240

Leu Gin Gly Ile Leu Thr Asn Lys Leu Tyr Glu Thr Val Asp Tyr Met 245 250 255

Leu Ser Leu Cys 260 <210> 40 <211> 327 <212> DNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 40

ataagctagt	agataagata	acttctgatc	aacatatctt	cagtccagac	aaaatagata	60
tgttaacact	ggggaaaatg	ctcatgccca	ctataaaagg	tcagaaaaca	gatcagttcc	120
tgaacaagag	agagaattat	ttccatggga	ataatcttat	tgagtctttg	tcagcagcgt	180
tagcatgtca	ttggtgtggg	atattaacag	agcaatgtat	agaaaataat	attttcaaga	240
aagactgggg	tgacgggttc	atatcggatc	atgcttttat	ggacttcaaa	atattcctat	300
gtgtctttaa	aactaaactt	ttatgta				327

<210> 41 <211> 108 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 41

Lys Leu Val Asp Lys Ile Thr Ser Asp Gin His Ile Phe Ser Pro Asp 15 10 15

Lys Ile Asp Met Leu Thr Leu Gly Lys Met Leu Met Pro Thr Ile Lys 20 25 30

Gly Gin Lys Thr Asp Gin Phe Leu Asn Lys Arg Glu Asn Tyr Phe His 35 40 45

Gly Asn Asn Leu Ile Glu Ser Leu Ser Ala Ala Leu Ala Cys His Trp 50 55 60

Cys Gly Ile Leu Thr Glu Gin Cys Ile Glu Asn Asn Ile Phe Lys Lys 65 70 75 80

Asp Trp Gly Asp Gly Phe Ile Ser Asp His Ala Phe Met Asp Phe Lys 85 90 95

PL 213 926 B1

113

Ile Phe Leu Cys Val Phe Lys Thr Lys Leu Leu Cys 100 105 <210> 42 <211> 391 <212> PRT <213> Ludzki syncytialny wirus oddechowy A <400> 42

Met Ala Leu 1

Ser Ser 20

Lys 5 Ser

Val Lys

Lys Tyr

Leu Asn Asp

Thr Arg

Leu Ser

Asn Thr

Lys Gly 30

Asp 15 Asp

Gin Ser

Thr

Ile 25

10 Gin

Leu Leu

Ser

Ile

Asp

Thr

Pro

Asn

Tyr

Asp

Val

Gin

Lys

His

Ile

Asn

Lys

Leu

Cys

35

40

45

Gly

Met

Leu

Leu

Ile

Thr

Glu

Asp

Ala

Asn

His

Lys

Phe

Thr

Gly

Leu

50

55

60

Ile

Gly

Met

Leu

Tyr

Ala

Met

Ser

Arg

Leu

Gly

Arg

Glu

Asp

Thr

Ile

65

70

75

80

Lys

Ile

Leu

Arg

Asp

Ala

Gly

Tyr

His

Val

Lys

Ala

Asn

Gly

Val

Asp

85

90

95

Val

Thr

Thr

His

Arg

Gin

Asp

Ile

Asn

Gly

Lys

Glu

Met

Lys

Phe

Glu

100

105

110

Val

Leu

Thr

Leu

Ala

Ser

Leu

Thr

Thr

Glu

Ile

Gin

Ile

Asn

Ile

Glu

115

120

125

Ile

Glu

Ser

Arg

Lys

Ser

Tyr

Lys

Lys

Met

Leu

Lys

Glu

Met

Gly

Glu

130

135

140

Val

Ala

Pro

Glu

Tyr

Arg

His

Asp

Ser

Pro

Asp

Cys

Gly

Met

Ile

Ile

145

150

155

160

Leu

Cys

Ile

Ala

Ala

Leu

Val

Ile

Thr

Lys

Leu

Ala

Ala

Gly

Asp

Arg

165

170

175

Ser

Gly

Leu

Thr

Ala

Val

Ile

Arg

Arg

Ala

Asn

Asn

Val

Leu

Lys

Asn

180

185

190

Glu

Met

Lys

Arg

Tyr

Lys

Gly

Leu

Leu

Pro

Lys

Asp

Ile

Ala

Asn

Ser

195

200

205

114

PL 213 926 B1

Phe

Tyr Glu 210

Val

Phe

Glu

Lys 215

His

Pro

His

Phe

Ile 220

Asp

Val

Phe

Val

His

Phe

Gly

Ile

Ala

Gin

Ser

Ser

Thr

Arg

Gly

Gly

Ser

Arg

Val

Glu

225

230

235

240

Gly

Ile

Phe

Ala

Gly

Leu

Phe

Met

Asn

Ala

Tyr

Gly

Ala

Gly

Gin

Val

245

250

255

Met

Leu

Arg

Trp

Gly

Val

Leu

Ala

Lys

Ser

Val

Lys

Asn

Ile

Met

Leu

260

265

270

Gly

His

Ala

Ser

Val

Gin

Ala

Glu

Met

Glu

Gin

Val

Val

Glu

Val

Tyr

275

280

285

Glu

Tyr

Ala

Gin

Lys

Leu

Gly

Gly

Glu

Ala

Gly

Phe

Tyr

His

Ile

Leu

290

295

300

Asn

Asn

Pro

Lys

Ala

Ser

Leu

Leu

Ser

Leu

Thr

Gin

Phe

Pro

His

Phe

305

310

315

320

Ser

Ser

Val

Val

Leu

Gly

Asn

Ala

Ala

Gly

Leu

Gly

Ile

Met

Gly

Glu

325

330

335

Tyr

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Asn

Gin

Asp

Leu

Tyr

Asp

Ala

Ala

Lys

Ala

340

345

350

Tyr

Ala

Glu

Gin

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Val

Ile

Asn

Tyr

Ser

Val

Leu

355

360

365

Asp

Leu

Thr

Ala

Glu

Glu

Leu

Glu

Ala

Ile

Lys

His

Gin

Leu

Asn

Pro

370

375

380

Lys

Asp

Asn

Asp

Val

Glu

Leu

385

390

<210>

43

<211>

279

<212>

PRT

<213>

Ptasi pneumowirus B

<400>

43

Met

Ser

Leu

Pro

Glu

Gly

Lys

Asp

Ile

Leu

Met

Met

Gly

Ser

Glu

Ala

1

5

10

15

Ala

Lys

Leu

Ala

Glu

Ala

Tyr

Gin

Gin

Ser

Ile

Lys

Asn

Ser

Thr

Ser

20

25

30

PL 213 926 B1

115

Val Arg Arg Ser Ile Ser Gly Asp Pro Val Ser Thr Val Ser Glu Lys 35 40 45

Val Pro Leu Pro Pro Leu Cys Ser Ser Glu Thr Ser Arg Gly Ala Cys 50 55 60

Ile Arg Pro Thr Lys Ser Thr Leu Pro Pro Ile Lys Glu Val Glu Ser 65 70 75 80

Ile Tyr Pro Lys Leu Pro Thr Ala Pro Pro Asp Ala Met Ile Glu Thr 85 90 95

Ala His Pro Ile Gly Ala Pro Lys Lys Ala Gin Lys Arg Val Lys Phe 100 105 110

Glu Ser Ser Lys Ala Gly Lys Tyr Thr Lys Leu Glu Glu Glu Ala Leu 115 120 125

Glu Leu Leu Ser Asp Pro Asp Glu Asp Asn Asp Glu Lys Ser Ser Val 130 135 140

Leu Thr Phe Glu Glu Lys Asp Asn Ala Pro Ser Ser Ile Glu Ala Arg 145 150 155 160

Leu Glu Ala Ile Glu Glu Lys Leu Ser Met Ile Leu Gly Met Leu Lys 165 170 175

Thr Leu Ser Ile Ala Thr Ala Gly Pro Thr Ala Ala Arg Asp Gly Ile 180 185 190

Arg Asp Ala Met Val Gly Val Arg Glu Glu Leu Ile Asn Ser Ile Met 195 200 205

Ala Glu Ala Lys Gly Lys Ile Ala Glu Ile Ile Lys Glu Glu Asp Ala 210 215 220

Gin Arg Ala Lys Ile Gly Asp Gly Ser Val Lys Leu Thr Glu Lys Ala

225 230 235 240

Arg Glu Leu Asn Arg Met Leu Glu Asp Gin Ser Ser Ser Gly Glu Ser

245 250 255

Glu Thr Glu Ser Glu Glu Thr Glu Pro Asp Thr Asp Gly Glu Asn Asp

260 265 270

116

PL 213 926 B1

Asp Ile Tyr Ser Phe Asp Met 275 <210> 44 <211> 241 <212> PRT <213> Ludzki syncytialny wirus oddechowy A <400> 44

Met Glu Lys Phe Ala Pro Glu Phe His Gly Glu Asp Ala Asn Asn Arg 15 10 15

Ala Thr Lys Phe Leu Glu Ser Ile Lys Gly Lys Phe Thr Ser Pro Lys 20 25 30

Asp Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ile Ile Ser Val Asn Ser Ile Asp Ile 35 40 ' 45

Glu Val Thr Lys Glu Ser Pro Ile Thr Ser Asn Ser Thr Ile Ile Asn 50 55 60

Pro Thr Asn Glu Thr Asp Asp Thr Ala Gly Asn Lys Pro Asn Tyr Gin 65 70 75 80

Arg Lys Pro Leu Val Ser Phe Lys Glu Asp Pro Thr Pro Ser Asp Asn 85 90 95

Pro Phe Ser Lys Leu Tyr Lys Glu Thr Ile Glu Thr Phe Asp Asn Asn 100 105 110

Glu Glu Glu Ser Ser Tyr Ser Tyr Glu Glu Ile Asn Asp Gin Thr Asn 115 120 125

Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asp Arg Ile Asp Glu Lys Leu Ser Glu 130 135 140

Ile Leu Gly Met Leu His Thr Leu Val Val Ala Ser Ala Gly Pro Thr 145 150 155 160

Ser Ala Arg Asp Gly Ile Arg Asp Ala Met Ile Gly Leu Arg Glu Glu 165 170 175

Met Ile Glu Lys Ile Arg Thr Glu Ala Leu Met Thr Asn Asp Arg Leu 180 185 190

Glu Ala Met Ala Arg Leu Arg Asn Glu Glu Ser Glu Lys Met Ala Lys 195 200 205

PL 213 926 B1

117

Asp Thr Ser Asp Glu Val Ser Leu Asn Pro Thr Ser Glu Lys Leu Asn 210 215 220

Asn Leu Leu Glu Gly Asn Asp Ser Asp Asn Asp Leu Ser Leu Glu Asp 225 230 235 240

Phe <210> 45 <211> 256 <212> PRT <213> Ludzki syncytialny wirus oddechowy A <400> 45

Met Glu Thr Tyr Val Asn Lys Leu His Glu Gly Ser Thr Tyr Thr Ala

5 10 ' 15

Ala Val Gin Tyr Asn Val Leu Glu Lys Asp Asp Asp Pro Ala Ser Leu 20 25 30

Thr Ile Trp Val Pro Met Phe Gin Ser Ser Met Pro Ala Asp Leu Leu 35 40 45

Ile Lys Glu Leu Ala Asn Val Asn Ile Leu Val Lys Gin Ile Ser Thr 50 55 60

Pro Lys Gly Pro Ser Leu Arg Val Met Ile Asn Ser Arg Ser Ala Val 65 70 75 80

Leu Ala Gin Met Pro Ser Lys Phe Thr Ile Cys Ala Asn Val Ser Leu 85 90 95

Asp Glu Arg Ser Lys Leu Ala Tyr Asp Val Thr Thr Pro Cys Glu Ile 100 105 110

Lys Ala Cys Ser Leu Thr Cys Leu Lys Ser Lys Asn Met Leu Thr Thr 115 120 125

Val Lys Asp Leu Thr Met Lys Thr Leu Asn Pro Thr His Asp Ile Ile

130 135 140

Ala Leu Cys Glu Phe Glu Asn Ile Val Thr Ser Lys Lys Val Ile Ile

145 150 155 160

Pro Thr Tyr Leu Arg Ser Ile Ser Val Arg Asn Lys Asp Leu Asn Thr

165 170 175

118

PL 213 926 B1

Leu

Glu

Asn

Ile Thr 180

Thr

Thr Glu

Phe 185

Lys

Asn Ala

Ile

Thr 190

Asn

Ala

Lys

Ile

Ile

Pro Tyr

Ser

Gly Leu

Leu

Leu

Val Ile

Thr

Val

Thr

Asp

195

200

205

Asn

Lys

Gly

Ala Phe

Lys

Tyr Ile

Lys

Pro

Gin Ser

Gin

Phe

Ile

Val

210

215

220

Asp

Leu

Gly

Ala Tyr

Leu

Glu Lys

Glu

Ser

Ile Tyr

Tyr

Val

Thr

Thr

225

230

235

240

Asn

Trp

Lys

His Thr

Ala

Thr Arg

Phe

Ala

Ile Lys

Pro

Met

Glu

Asp

245

250

255

<210>

46

<211> 1

574

<212> :

PRT

<213> Ludzki syncytialny wirus

oddechowy A

<400>

46

Met

Glu

Leu

Leu Ile

Leu

Lys Ala

Asn

Ala

Ile Thr

Thr

Ile

Leu

Thr

1

5

10

15

Ala

Val

Thr

Phe Cys

Phe

Ala Ser

Gly

Gin

Asn Ile

Thr

Glu

Glu

Phe

20

25

30

Tyr

Gin

Ser

Thr Cys

Ser

Ala Val

Ser

Lys

Gly Tyr

Leu

Ser

Ala

Leu

35

40

45

Arg

Thr

Gly

Trp Tyr

Thr

Ser Val

Ile

Thr

Ile Glu

Leu

Ser

Asn

Ile

50

55

60

Lys

Glu

Asn

Lys Cys

Asn

Gly Thr

Asp

Ala

Lys Val

Lys

Leu

Ile

Lys

65

70

75

80

Gin

Glu

Leu

Asp Lys

Tyr

Lys Asn

Ala

Val

Thr Glu

Leu

Gin

Leu

Leu

85

90

95

Met

Gin

Ser

Thr Pro

Pro

Thr Asn

Asn

Arg

Ala Arg

Arg

Glu

Leu

Pro

100

105

110

Arg

Phe

Met

Asn Tyr

Thr

Leu Asn

Asn

Ala

Lys Lys

Thr

Asn

Val

Thr

115

120

125

Leu

Ser

Lys

Lys Arg

Lys

Arg Arg

Phe

Leu

Gly Phe

Leu

Leu

Gly

Val

130

135

140

PL 213 926 B1

119

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val 145 150

Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys 165

Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly 180

Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp 195 200

Lys Gin Leu Leu Pro Ile Val Asn 205

Lys Gin Ser Cys Ser Ile Ser Asn 210 215

Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gin 220

Gin Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu 225 230

Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser 245

Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met 260

Pro Ile Thr Asn Asp Gin Lys Lys 265 270

Leu Met Ser Asn Asn Val Gin Ile 275 280

Val Arg Gin Gin Ser Tyr Ser Ile 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val 290 295

Leu Ala Tyr Val Val Gin Leu Pro 300

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro 305 310

Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu 325

Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp 340

Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 345 350

Pro Gin Ala Glu Thr Cys Lys Val 355 360

Gin Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro 370 375

Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val 380

120

PL 213 926 B1

Asp 385 Asp

Ile Val

Phe Ser

Asn Ser

Pro Ser 405

Lys 390 Val

Tyr Ile

Asp Cys

Lys Leu 410

Ile 395 Gly

Met Ala

Thr Ile

Ser Val

Lys Ser 415

Thr 400 Cys

Thr

Ser

Tyr

Gly

Lys

Thr

Lys

Cys

Thr

Ala

Ser

Asn

Lys

Asn

Arg

Gly

Ile

Ile

420

425

430

Lys

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Cys

Asp

Tyr

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Met

Asp

435

440

445

Thr

Val

Ser

Val

Gly

Asn

Thr

Leu

Tyr

Tyr

Val

Asn

Lys

Gin

Glu

Gly

450

455

460

Lys

Ser

Leu

Tyr

Val

Lys

Gly

Glu

Pro

Ile

Ile

Asn

Phe

Tyr

Asp

Pro

465

470

475

480

Leu

Val

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Phe

Asp

Ala

Ser

Ile

Ser

Gin

Val

Asn

485

490

495

Glu

Lys

Ile

Asn

Gin

Ser

Leu

Ala

Phe

Ile

Arg

Lys

Ser

Asp

Glu

Leu

500

505

510

Leu

His

Asn

Val

Asn

Ala

Gly

Lys

Ser

Thr

Thr

Asn

Ile

Met

Ile

Thr

515

520

525

Thr

Ile

Ile

Ile

Val

Ile

Ile

Val

Ile

Leu

Leu

Ser

Leu

Ile

Ala

Val

530

535

540

Gly

Leu

Leu

Leu

Tyr

Cys

Lys

Ala

Arg

Ser

Thr

Pro

Val

Thr

Leu

Ser

545

550

555

560

Lys

Asp

Gin

Leu

Ser

Gly

Ile

Asn

Asn

Ile

Ala

Phe

Ser

Asn

565

570

<210>

47

<211>

187

<212>

PRT

<213>

Ludzki metapneumowirus

<400>

47

Met

Ser

Arg

Lys

Ala

Pro

Cys

Lys

Tyr

Glu

Val

Arg

Gly

Lys

Cys

Asn

1

5

10

15

PL 213 926 B1

121

Arg

Gly

Ser

Glu 20

Cys

Lys

Phe

Asn

His 25

Asn

Tyr

Trp

Ser

Trp 30

Pro

Asp

Arg

Tyr

Leu

Leu

Ile

Arg

Ser

Asn

Tyr

Leu

Leu

Asn

Gin

Leu

Leu

Arg

35

40

45

Asn

Thr

Asp

Arg

Ala

Asp

Gly

Leu

Ser

Ile

Ile

Ser

Gly

Ala

Gly

Arg

50

55

60

Glu

Asp

Arg

Thr

Gin

Asp

Phe

Val

Leu

Gly

Ser

Thr

Asn

Val

Val

Gin

65

70

75

80

Gly

Tyr

Ile

Asp

Asp

Asn

Gin

Ser

Ile

Thr

Lys

Ala

Ala

Ala

Cys

Tyr

85

90

95

Ser

Leu

His

Asn

Ile

Ile

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Val

Glu

Val

Arg

Gin

100

105

110

Ala

Arg

Asp

Asn

Lys

Leu

Ser

Asp

Ser

Lys

His

Val

Ala

Leu

His

Asn

115

120

125

Leu

Val

Leu

Ser

Tyr

Met

Glu

Met

Ser

Lys

Thr

Pro

Ala

Ser

Leu

Ile

130

135

140

Asn

Asn

Leu

Lys

Arg

Leu

Pro

Arg

Glu

Lys

Leu

Lys

Lys

Leu

Ala

Lys

145

150

155

160

Leu

Ile

Ile

Asp

Leu

Ser

Ala

Gly

Ala

Glu

Asn

Asp

Ser

Ser

Tyr

Ala

165

170

175

Leu

Gin

Asp

Ser

Glu

Ser

Thr

Asn

Gin

Val

Gin

180

185

<210>

48

<211>

184

<212>

PRT

<213>

Ptasi pneumowirus C

<400>

48

Met

Ser

Arg

Lys

Ala

Pro

Cys

Lys

Tyr

Glu

Val

Arg

Gly

Lys

Cys

Asn

1

5

10

15

Arg

Gly

Ser

Glu

Cys

Lys

Phe

Asn

His

Asn

Tyr

Trp

Ser

Trp

Pro

Asp

20

25

30

Arg

Tyr

Leu

Leu

Leu

Arg

Ser

Asn

Tyr

Leu

Leu

Asn

Gin

Leu

Leu

Arg

35

40

45

122

PL 213 926 B1

Asn Thr Asp 50	Arg	Ser Asp Gly Leu Ser 55	Leu	Ile	Ser 60	Gly	Ala	Gly	Arg
Asp Asp Arg 65	Thr	Gin Asp Phe Val Leu 70	Gly	Ser 75	Thr	Asn	Val	Val	Gin 80
Asn Tyr Ile	Asp	Asn Asn Glu Asn Ile 85	Thr 90	Lys	Ala	Ser	Thr	Cys 95	Tyr
Ser Leu Tyr	Asn 100	Ile Ile Lys Gin Leu 105	Gin	Glu	Thr	Asp	Val 110	Arg	Gin
Ala Arg Asp 115	Asn	Lys Val Asp Asp Ser 120	Lys	His	Val	Ala 125	Leu	His	Asn
Leu Val Leu 130	Ser	Tyr Met Glu Met Ser 135	Lys	Thr	Pro 140	Ala	Ser	Leu	Ile
Asn Asn Leu 145	Lys	Lys Leu Pro Lys Glu 150	Lys	Leu 155	Lys	Lys	Leu	Ala	Lys 160
Leu Ile Ile Glu Leu Ser Ala Gly Val 165 Met Gin Asp Ser Ala Asn Ser Asp 180 <210> 49 <211> 186 <212> PRT <213> Ptasi pneumowirus B <400> 49	Glu 170	Asn	Asp	Ser	Thr	Ala 175	Ala
Met Ser Gly 1	Arg	Asn Pro Cys Arg Tyr 5	Glu 10	Thr	Arg	Gly	Arg	Cys 15	Asn
Arg Gly Ser	Ser 20	Cys Thr Phe Asn His 25	Asn	Tyr	Trp	Ser	Trp 30	Pro	Asp
His Val Leu 35	Leu	Val Arg Ala Asn Tyr 40	Met	Leu	Asn	Gin 45	Leu	Val	Arg
Asn Thr Asp 50	Arg	Thr Asp Gly Leu Ser 55	Leu	Ile	Ser 60	Gly	Ala	Gly	Arg
Glu Asp Arg 65	Thr	Gin Asp Phe Val Leu 70	Gly	Ser 75	Ala	Asn	Val	Val	Gin 80

PL 213 926 B1

123

Asn Tyr Ile Glu Gly Asn Ala Thr Ile Thr Lys Ser Ala Ala Cys Tyr 85 90 95

Ser Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Gin Leu Gin Glu Asn Asp Val Lys Ser 100 105 110

Ala Arg Asp Leu Met Val Asp Asp Pro Lys His Val Ala Leu His Asn 115 120 125

Leu Val Leu Ser Tyr Ile Asp Met Ser Lys Asn Pro Ala Asn Leu Ile 130 135 140

Asn Ser Leu Lys Arg Leu Pro Lys Glu Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys 145 150 155 160

Ile Ile Ile Gin Leu Ser Ala Gly Ser Glu Gly Glu Asn Ala Asn Ser 165 170 175

Asn Thr Leu Gin Lys Gly Asp Ser Ser Asn 180 185 <210> 50 <211> 186 <212> PRT <213> Wirus zapalenia krtani i tchawicy indyków A <400> 50

Met Ser Arg Arg Asn Pro Cys Arg Tyr Glu Ile Arg Gly Lys Cys Asn 15 10 15

Arg Gly Ser Ser Cys Thr Phe Asn His Asn Tyr Trp Ser Trp Pro Asp 20 25 30

His Val Leu Leu Val Arg Ala Asn Tyr Met Leu Asn Gin Leu Leu Arg 35 40 45

Asn Thr Asp Arg Thr Asp Gly Leu Ser Leu Ile Ser Gly Ala Gly Arg 50 55 60

Glu Asp Arg Thr Gin Asp Phe Val Leu Gly Ser Ala Asn Val Val Gin

70 75 80

Asn Tyr Ile Glu Gly Asn Thr Thr Ile Thr Lys Ser Ala Ala Cys Tyr

90 95

Ser Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Gin Leu Gin Glu Asn Asp Val Lys Thr

100 105 110

124

PL 213 926 B1

Ser

Arg

Asp 115

Ser

Met

Leu

Glu

Asp 120

Pro

Lys

His

Val

Ala 125

Leu

His

Asn

Leu

Ile

Leu

Ser

Tyr

Val

Asp

Met

Ser

Lys

Asn

Pro

Ala

Ser

Leu

Ile

130

135

140

Asn

Ser

Leu

Lys

Arg

Leu

Pro

Arg

Glu

Lys

Leu

Lys

Lys

Leu

Ala

Lys

145

150

155

160

Ile

Ile

Leu

Gin

Leu

Ser

Ala

Gly

Pro

Glu

Ser

Asp

Asn

Ala

Ser

Gly

165

170

175

Asn

Thr

Leu

Gin

Lys

Gly

Asp

Ser

Asn

Asn

180 185 <210> 51 <211> 194 <212> PRT

<213> Ludzki syncytialny wirus	oddechowy A
<400> 51
Met Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys 1 5	Phe Glu Ile Arg Gly His Cys Leu 10 15
Asn Gly Lys Arg Cys His Phe Ser 20	His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro 25 30
His Ala Leu Leu Val Arg Gin Asn 35 40	Phe Met Leu Asn Arg Ile Leu Lys 45
Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr 50 55	Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala 60
Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr 65 70	Ala Leu Gly Val Val Gly Val Leu 75 80
Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn 85	Asn Ile Thr Lys Gin Ser Ala Cys 90 95
Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Thr 100	Glu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Lys 105 110
Lys Leu Arg Asp Asn Glu Glu Leu 115 120	Asn Ser Pro Lys Ile Arg Val Tyr 125
Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu 130 135	Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gin 140

PL 213 926 B1

125

Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr 145 150 155 160

Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His Lys Ser Ile Thr Ile Asn Asn Pro 165 170 175

Lys Glu Ser Thr Val Ser Asp Thr Asn Asp His Ala Lys Asn Asn Asp 180 185 190

Thr Thr <210> 52 <211> 195 <212> PRT <213> Ludzki syncytialny wirus oddechowy B <400> 52

Met Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys Phe Glu Ile Arg Gly His Cys Leu 15 10 15

Asn Gly Arg Arg Cys His Tyr Ser His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro 20 25 30

His Ala Leu Leu Val Arg Gin Asn Phe Met Leu Asn Lys Ile Leu Lys 35 40 45

Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala 50 55 60

Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr Ala Leu Gly Ile Val Gly Val Leu 65 70 75 80

Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile Thr Lys Gin Ser Ala Cys 85 90 95

Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Ile Glu Ile Asn Ser Asp Asp Ile Lys 100 105 110

Lys Leu Arg Asp Asn Glu Glu Pro Asn Ser Pro Lys Ile Arg Val Tyr 115 120 125

Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gin 130 135 140

Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr 145 150 155 160

126

PL 213 926 B1

Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His Lys Ser Ile Ile Ile Ser Asn Pro 165 170 175

Lys Glu Ser Thr Val Asn Asp Gin Asn Asp Gin Thr Lys Asn Asn Asp 180 185 190

Ile Thr Gly 195 <210> 53 <211> 186 <212> PRT <213> Bydlęcy syncytialny wirus oddechowy <400> 53

Met Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys 1 5

Tyr Glu Ile Arg Gly His Cys Leu 10 ' 15

Asn Gly Lys Lys Cys His Phe Ser 20

His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro 25 30

His Ala Leu Leu Val Arg Gin Asn 35 40

Phe Met Leu Asn Lys Ile Leu Lys 45

Ser Met Asp Arg Asn Asn Asp Thr 50 55

Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala 60

Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr 65 70

Ala Leu Gly Val Ile Gly Val Leu 75 80

Glu Ser Tyr Leu Gly Ser Ile Asn 85

Asn Ile Thr Lys Gin Ser Ala Cys 90 95

Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Ala 100

Glu Ile Asn Asn Asp Asp Ile Lys 105 110

Arg Leu Arg Asn Lys Glu Val Pro 115 120

Thr Ser Pro Lys Ile Arg Ile Tyr 125

Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Asp 130 135

Ser Asn Lys Arg Asn Thr Lys Gin 140

Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu 145 150

Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr 155 160

Ile Lys Asn Thr Ile Asp Ile His 165

Asn Glu Ile Asn Gly Asn Asn Gin 170 175

PL 213 926 B1

127

Gly Asp Ile Ile Val Asn Glu Gin Asn Glu
	180	185
<210>	54
<211>	176
<212>	PRT
<213>	Wirus zapalenia	płuc myszy

<400> 54

Met 1

Ser

Val

Arg

Pro 5

Cys

Lys

Phe

Glu Val 10

Gin Gly Phe Cys

Ser 15

Arg

Gly

Arg

Asn

Cys

Lys

Tyr

Ser

His

Lys

Tyr

Trp

Glu

Trp

Pro

Leu

Lys

20

25

30

Thr

Leu

Met

Leu

Arg

Gin

Asn

Tyr

Met

Leu

Asn

Arg

Ile

Tyr

Arg

Phe

35

40

45

Leu

Asp

Thr

Asn

Thr

Asp

Ala

Ile

Ser

Asp

Val

Ser

Gly

Phe

Asp

Ala

50

55

60

Pro

Gin

Arg

Thr

Ala

Glu

Tyr

Ala

Leu

Gly

Thr

Ile

Gly

Val

Leu

Lys

65

70

75

80

Ser

Tyr

Leu

Glu

Lys

Thr

Asn

Asn

Ile

Thr

Lys

Ser

Ile

Ala

Cys

Gly

85

90

95

Ser

Leu

Ile

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Leu

Asp

Val

Gly

Leu

Val

Ile

Gin

100

105

110

Ala

Arg

Asp

Ser

Asn

Thr

Glu

Asp

Thr

Asn

Tyr

Leu

Arg

Ser

Cys

Asn

115

120

125

Thr

Ile

Leu

Ser

Tyr

Ile

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Lys

Arg

Gin

Ile

Ile

130

135

140

His

Ile

Leu

Lys

Arg

Leu

Pro

Val

Gly

Val

Leu

Cys

Asn

Leu

Ile

Gin

145

150

155

160

Ser

Val

Ile

Ser

Ile

Glu

Glu

Lys

Ile

Asn

Ser

Ser

Met

Lys

Thr

Glu

165

170

175

<210>	55
<211>	71
<212>	PRT
<213>	Ludzki metapneumowirus
<400>	55

128

PL 213 926 B1

Met 1

Thr

Leu

His

Met 5

Pro

Cys

Lys

Thr

Val 10

Lys

Ala

Leu

Ile

Lys 15

Cys

Ser

Glu

His

Gly

Pro

Val

Phe

Ile

Thr

Ile

Glu

Val

Asp

Asp

Met

Ile

20

25

30

Trp

Thr

His

Lys

Asp

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Ser

Asp

Gly

Ile

Val

Lys

35

40

45

Ser

His

Thr

Asn

Ile

Tyr

Asn

Cys

Tyr

Leu

Glu

Asn

Ile

Glu

Ile

Ile

50

55

60

Tyr

Val

Lys

Ala

Tyr

Leu

Ser

65

70

<210>

56

<211>

71

<212>

PRT

<213>

Ptasi pneumowirus C

<400>

56

Met

Thr

Leu

Gin

Leu

Pro

Cys

Lys

Ile

Val

Gin

Thr

Leu

Ile

Lys

Cys

1

5

10

15

Gly

Glu

His

Gly

Leu

Ile

Phe

Leu

Lys

Met

Lys

Leu

Asp

Asp

Met

Val

20

25

30

Trp

Thr

Lys

Asn

Glu

Leu

Val

Asp

Ile

Ile

Ser

Thr

Glu

Ile

Val

Lys

35

40

45

Val

His

Ala

Asn

Ile

Phe

Lys

Cys

Arg

Leu

Glu

Asp

Ile

Glu

Ile

Ile

50

55

60

Tyr

Val

Lys

Thr

Phe

Leu

Ser

65

70

<210>

57

<211>

73

<212>

PRT

<213>

Ptasi pneumowirus B

<400>

57

Met

Pro

Ile

Val

Ile

Pro

Cys

Lys

Arg

Val

Thr

Ala

Val

Ile

Arg

Cys

1

5

10

15

Asn

Thr

Leu

Gly

Val

Cys

Leu

Phe

Lys

Arg

Thr

Tyr

Glu

His

Asn

Ile

20

25

30

PL 213 926 B1

129

Ile Asn Leu	Gly	Asp Leu	Ile	Glu Glu Val 40	Ala	Arg	Met 45	Ile	Ile	Ile
	35
Asp His	Ile	Asn	Arg Lys	Gin	Cys Asn Glu	Cys	Arg	Lys	Asp	Phe	Glu
50				55			60
Phe Val	Ala	Val	Tyr Thr	Ser	Tyr Thr
65			70
<210>	58
<211>	73
<212>	PRT
<213> ’	Wirus zapalenia krtani i tchawicy indyków A
<400>	58
Met Pro	Val	Val	Ile Pro	Cys	Arg Arg Val	Thr	Ala	Ile	Ile	Lys	Cys
1			5		10					15
Asn Ala	Leu	Gly	Leu Cys	Met	Val Arg Lys	Ile	Tyr	Asp	Tyr	Ser	Ile
		20			25				30
Ala Ser	Trp	Ser	Asp Leu	Ile	Glu Glu Val	Ala	Asn	Met	Val	Leu	Ile
	35				40			45
Asp His	Ile	Asn	Arg Lys	Gin	Cys Val Glu	Cys	Arg	Lys	Asp	Phe	Glu
50				55			60
Phe Ile	Ala	Ile	Tyr Thr	Ser	Tyr Asn
65			70
<210>	59
<211>	90
<212>	PRT
<213>	Ludzki syncytialny wirus oddechowy A
<400>	59
Met Thr	Met	Pro	Lys Ile	Met	Ile Leu Pro	Asp	Lys	Tyr	Pro	Cys	Ser
1			5		10					15
Ile Thr	Ser	Ile	Leu Ile	Thr	Ser Arg Cys	Arg	Val	Thr	Met	Tyr	Asn
		20			25				30
Gin Lys	Asn	Thr	Leu Tyr	Phe	Asn Gin Asn	Asn	Pro	Asn	Asn	His	Met
	35				40			45
Tyr Ser	Pro	Asn	Gin Thr	Phe	Asn Glu Ile	His	Trp	Thr	Ser	Gin	Glu
50				55			60

130

PL 213 926 B1

Leu 65

Ile

Asp

Thr

Ile

Gin Asn 70

Phe Leu Gin

His 75

Leu

Gly

Ile

Ile

Glu 80

Asp

Ile

Tyr

Thr

Ile

Tyr Ile

Leu Val Ser

85

90

<210>

60

<211>

90

<212>

PRT

<213>

Ludzki syncytialny wirus oddechowy B

<400>

60

Met

Thr

Lys

Pro

Lys

Ile Met

Ile Leu Pro

Asp

Lys

Tyr

Pro

Cys

Ser

1

5

10

15

Ile

Ser

Ser

Ile

Leu

Ile Ser

Ser Glu Ser

Met

Ile

Ala

Thr

Phe

Asn

20

25

30

His

Lys

Asn

Ile

Leu

Gin Phe

Asn His Asn

His

Leu

Asp

Asn

His

Gin

35

40

45

Arg

Leu

Leu

Asn

Asn

Ile Phe

Asp Glu Ile

His

Trp

Thr

Pro

Lys

Asn

50

55

60

Leu

Leu

Asp

Ala

Thr

Gin Gin

Phe Leu Gin

His

Leu

Asn

Ile

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

Ile

Tyr

Thr

Ile

Tyr Ile

Leu Val Ser

85

90

<210>

61

<211>

90

<212>

PRT

<213>

Bydlęcy syncytialny wirus oddechowy

<400>

61

Met

Asn

Asn

Ser

Asn

Ile Ile

Ile Phe Pro

Glu

Lys

Tyr

Pro

Cys

Ser

1

5

10

15

Ile

Ser

Ser

Leu

Leu

Ile Lys

Asn Glu Asn

Asp

Val

Ile

Val

Leu

Ser

20

25

30

His

Gin

Asn

Val

Leu

Asp Tyr

Leu Gin Phe

Gin

Tyr

Pro

Cys

Asn

Met

35

40

45

Tyr

Ser

Gin

Asn

His

Met Leu

Asp Asp Ile

Tyr

Trp

Thr

Ser

Gin

Glu

50

55

60

PL 213 926 B1

131

Leu Ile Glu Asp Val Leu Lys Ile Leu His Leu Ser Gly Ile Ser Ile 65 70 75 80

Ser Lys Tyr Val Ile Tyr Val Leu Val Leu 85 90

<210>	62
<211>	97
<212>	PRT
<213>	Wirus zapalenia płuc	myszy
<400>	62
Met Gin Ser Asp Pro Ile Cys	His Leu His Arg Gly Glu Asp Lys Phe

10 15

Phe Tyr Glu Asn Arg Met Ile Arg Leu Pro Lys Tyr Tyr Pro Ala Ile 20 25 ' 30

Leu His Lys Met Tyr Ile Ile Arg Val Asn Arg Asn Thr Tyr Asp Gly 35 40 45

Ser Gly Pro Ser Thr Ile Ile Asp Ala Gly Lys Ser Val Val Trp Asn 50 55 60

Arg Val Asp Val Ile Ala Cys Val Lys Glu Ala Leu Cys Cys Ile Glu 65 70 75 80

Phe Ser Trp Asn Asn Gin Val Ile Ile Asp Phe Asp Tyr Ser Gin Ala 85 90 95

Arg <210> 63 <211> 183 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus <400> 63

Met 1

Ile

Thr

Leu Asp Val 5

Ile

Lys

Ser

Asp Gly Ser 10

Ser

Lys

Thr Cys 15

Thr

His

Leu

Lys

Lys

Ile

Ile

Lys

Asp

His

Ser

Gly

Lys

Val

Leu

Ile

20

25

30

Val

Leu

Lys

Leu

Ile

Leu

Ala

Leu

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Val

Thr

Ile

35

40

45

132

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

133

Pro Thr Asp Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ser Pro Gin His Pro Thr Gin 85 90 95

Gin Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Phe Ala Ala Ser Ala Ser Ser 100 105 110

Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Pro Pro 115 120 125

Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140

Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro Arg Thr Ser Ser Arg Thr 145 150 155 160

His Ser Pro Pro Arg Ala Thr Thr Arg Thr Ala Arg Arg Thr Thr Thr 165 170 175

Leu Arg Thr Ser Ser Thr Arg Lys Arg Pro Ser Thr Ala Ser Val Gin 180 185 190

Pro Asp Ile Ser Ala Thr Thr His Lys Asn Glu Glu Ala Ser Pro Ala 195 200 205

Ser Pro Gin Thr Ser Ala Ser Thr Thr Arg Ile Gin Arg Lys Ser Val 210 215 220

Glu Ala Asn Thr Ser Thr Thr Tyr Asn Gin Thr Ser 225 230 235 <210> 65 <211> 223 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus <400> 65

Asn Tyr Ile Ala Arg Ala Ser Ile Val Thr Asp Leu Ser Lys Phe Asn 15 10 15

Gin Ala Phe Arg Tyr Glu Thr Thr Ala Ile Cys Ala Asp Val Ala Asp

25 30

Glu Leu His Gly Thr Gin Ser Leu Phe Cys Trp Leu His Leu Ile Val

40 45

Pro Met Thr Thr Met Ile Cys Ala Tyr Arg His Ala Pro Pro Glu Thr

55 60

134

PL 213 926 B1

Lys 65	Gly Glu Tyr Asp	Ile Asp 70	Lys	Ile	Glu	Glu 75	Gin	Ser	Gly	Leu	Tyr 80
Arg	Tyr His Met Gly	Gly Ile	Glu	Gly	Trp	Cys	Gin	Lys	Leu	Trp	Thr
	85				90					95
Met	Glu Ala Ile Ser	Leu Leu	Asp	Val	Val	Ser	Val	Lys	Thr	Arg	Cys
	100			105					110
Gin	Met Thr Ser Leu	Leu Asn	Gly	Asp	Asn	Gin	Ser	Ile	Asp	Val	Ser
	115		120					125
Lys	Pro Val Lys Leu	Ser Glu	Gly	Leu	Asp	Glu	Val	Lys	Ala	Asp	Tyr
	130	135					140
Ser	Leu Ala Val Lys	Met Leu	Lys	Glu	Ile	Arg	Asp	Ala	Tyr	Arg	Asn
145		150				155					160
Ile	Gly His Lys Leu	Lys Glu	Gly	Glu	Thr	Tyr	Ile	Ser	Arg	Asp	Leu
	165				170					175
Gin	Phe Ile Ser Lys	Val Ile	Gin	Ser	Glu	Gly	Val	Met	His	Pro	Thr
	180			185					190
Pro	Ile Lys Lys Ile	Leu Arg	Val	Gly	Pro	Trp	Ile	Asn	Thr	Ile	Leu
	195		200					205
Asp	Asp Ile Lys Thr	Ser Ala	Glu	Ser	Ile	Gly	Ser	Leu	Cys	Gin
	210	215					220
<210> .66
<211> 223
<212> PRT
<213> Ptasi pneumowirus A
<400> 66
Asn	Tyr Ile Ala Arg	Ala Ser	Ile	Val	Thr	Asp	Leu	Ser	Lys	Phe	Asn
1	5				10					15
Gin	Ala Phe Arg Tyr	Glu Thr	Thr	Ser	Val	Cys	Ala	Asp	Val	Ala	Asp
	20			25					30
Glu	Leu His Gly Thr	Gin Ser	Leu	Phe	Cys	Trp	Leu	His	Leu	Thr	Val
	35		40					45
Ser	Ser Thr Thr Met	Ile Cys	Thr	Tyr	Arg	His	Ala	Pro	Pro	Asp	Thr
	50	55					60

PL 213 926 B1

135

Gly Gly Ile Tyr Asp Ile Asp Gin Ile Pro Glu Gin Ser Gly Leu Tyr 65 70 75 80

Arg Phe His Met Gly Gly Ile Glu Gly Trp Cys Gin Lys Met Trp Thr 85 90 95

Met Glu Ala Ile Ser Leu Leu Asp Val Val Ser Val Arg Asn Arg Val 100 105 110

Gin Leu Thr Ser Leu Leu Asn Gly Asp Asn Gin Ser Ile Asp Val Ser 115 120 125

Lys Pro Val Arg Leu Thr Gly Ala Gin Thr Glu Ile Gin Ala Asp Tyr 130 135 140

Ser Leu Ala Ile Lys Met Leu Thr Ala Val Arg Asp Ala Tyr Tyr Asn 145 150 155 160

Ile Gly His Lys Leu Lys Glu Gly Glu Thr Tyr Val Ser Arg Asp Leu 165 170 175

Gin Phe Met Ser Lys Thr Ile Gin Ser Glu Gly Val Met Tyr Pro Ala 180 185 190

Ala Ile Lys Lys Val Leu Arg Val Gly Pro Trp Ile Asn Thr Ile Leu 195 200 205

Asp Asp Ile Lys Thr Ser Met Glu Ala Ile Gly Ser Leu Cys Gin 210 215 220 <210> 67 <211> 224 <212> PRT <213> Ludzki syncytialny wirus oddechowy A <400> 67

Asn Tyr Ile Ser Lys Cys Ser Ile Ile Thr Asp Leu Ser Lys Phe Asn 15 10 15

Gin Ala Phe Arg Tyr Glu Thr Ser Cys Ile Cys Ser Asp Val Leu Asp

25 30

Glu Leu His Gly Val Gin Ser Leu Phe Phe Trp Leu His Leu Ala Ile

40 45

Pro His Val Thr Ile Ile Cys Thr Tyr Arg His Ala Pro Pro Tyr Ile

55 60

136

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

137

Lys Asp His Val Val Asn Leu Asn Glu Val Asp Glu Gin Ser Gly Leu 65 70 75 80

Tyr Arg Tyr His Met Gly Gly Ile Glu Gly Trp Cys Gin Lys Leu Trp 85 90 95

Thr Ile Glu Ala Ile Ser Leu Leu Asp Leu Ile Ser Leu Lys Gly Lys 100 105 HO

Phe Ser Ile Thr Ala Leu Ile Asn Gly Asp Asn Gin Ser Ile Asp Ile 115 120 125

Ser Lys Pro Val Arg Leu Ile Glu Gly Gin Thr His Ala Gin Ala Asp 130 135 140

Tyr Leu Leu Ala Leu Asn Ser Leu Lys Leu Leu' Tyr Lys Glu Tyr Ala 145 150 155 160

Gly Ile Gly His Lys Leu Lys Gly Thr Glu Thr Tyr Ile Ser Arg Asp 165 170 175

Met Gin Phe Met Ser Lys Thr Ile Gin His Asn Gly Val Tyr Tyr Pro 180 185 190

Ala Ser Ile Lys Lys Val Leu Arg Val Gly Pro Trp Ile Asn Thr Ile 195 200 205

Leu Asp Asp Phe Lys Val Ser Leu Glu Ser Ile Gly Ser Leu Thr Gin 210 215 220

<210>	69
<211>	224
<212>	PRT
<213>	Bydlęcy	syncytialny wirus oddechowy
<400>	69
Asn Tyr Ile Ser	Lys Cys Ser Ile Ile Thr Asp Leu Ser Lys Phe Asn

Gin Ala Phe Arg Tyr Glu Thr Ser Cys Ile Cys Ser Asp Val Leu Asp

25 30

Glu Leu His Gly Val Gin Ser Leu Phe Ser Trp Leu His Leu Thr Ile

40 45

Pro Phe Ala Thr Val Ile Cys Thr Tyr Arg His Ala Pro Pro Tyr Ile

55 60

138

PL 213 926 B1

Arg 65	Asn	His	Ile	Thr Asp 70	Leu Asn Lys Val	Asp 75	Glu Gin	Ser	Gly	Leu 80
Tyr	Arg	Tyr	His	Met Gly	Gly Ile Glu Gly	Trp	Cys Gin	Lys	Leu	Trp
				85	90				95
Thr	Ile	Glu	Ala	Ile Ser	Leu Leu Asp Leu	Ile	Ser Ile	Lys	Gly	Lys
			100		105			110
Phe	Ser	Ile	Thr	Ala Leu	Ile Asn Gly Asp	Asn	Gin Ser	Ile	Asp	Ile
		115			120		125
Ser	Lys	Pro	Ile	Lys Leu	Asn Glu Gly Gin	Thr	His Ala	Gin	Ala	Asp
	130				135		140
Tyr	Leu	Leu	Ala	Leu Lys	Ser Leu Lys Leu	Leu	Tyr Lys	Glu	Tyr	Ala
145				150		155				160
Ser	Ile	Gly	His	Lys Leu	Lys Gly Thr Glu	Thr	Tyr Ile	Ser	Arg	Asp
				165	' 170				175
Met	Gin	Phe	Met	Ser Lys	Thr Tle Gin His	Asn	Gly Val	Tyr	Tyr	Pro
			180		185			190
Ala	Ser	Ile	Lys	Lys Val	Leu Arg Val Gly	Pro	Trp Ile	Asn	Thr	Ile
		195			200		205
Leu	Asp	Asp	Phe	Lys Val	Ser Met Glu Ser	Ile	Gly Ser	Leu	Thr	Gin
	210				215		220
<210>	70
<211>	223
<212>	PRT
<213>	Ludzki wirus grypy rzekomej 2
<400>	70
Phe	Glu	Leu	Ser	Ala Cys	Phe Ile Thr Thr	Asp	Leu Ala	Lys	Tyr	Cys
1				5	10				15
Leu	Gin	Trp	Arg	Tyr Gin	Thr Ile Ile His	Phe	Ala Arg	Thr	Leu	Asn
			20		25			30
Arg	Met	Tyr	Gly	Val Pro	His Leu Phe Glu	Trp	Ile His	Leu	Arg	Leu
		35			40		45
Ile	Arg	: Ser	Thr	Leu Tyr	Val Gly Asp Pro	Phe	Asn Pro	Pro	Ala	Ala

55 60

PL 213 926 B1

139

Thr Asp Ala Phe Asp Leu Asp Lys Val Leu Asn Gly Asp Ile Phe Ile 65 70 75 80

Val Ser Lys Gly Gly Ile Glu Gly Leu Cys Gin Lys Met Trp Thr Met 85 90 95

Ile Ser Ile Ser Val Ile Ile Leu Ser Ser Ala Glu Ser Lys Thr Arg 100 105 110

Val Met Ser Met Val Gin Gly Asp Asn Gin Ala Ile Ala Val Thr Thr 115 120 125

Arg Val Pro Arg Ser Leu Pro Ser Ile Gin Lys Lys Glu Leu Ala Tyr 130 135 140

Ala Ala Ser Lys Leu Phe Phe Glu Arg Leu Arg Ala Asn Asn Tyr Gly 145 150 155 160

Leu Gly His Gin Leu Lys Ala Gin Glu Thr Ile Ile Ser Ser Thr Phe 165 170 175

Phe Ile Tyr Ser Lys Arg Val Phe Tyr Gin Gly Arg Ile Leu Thr Gin 180 185 190

Ala Leu Lys Asn Ala Ser Lys Leu Cys Leu Thr Ala Asp Val Leu Gly 195 200 205

Glu Cys Thr Gin Ala Ser Cys Ser Asn Ser Ala Thr Thr Ile Met 210 215 220 <210> 71 <211> 224 <212> PRT <213> Wiris choroby Newcastle <400> 71

Arg Arg Arg Val Ala Thr Phe Ile Thr Thr Asp Leu Gin Lys Tyr Cys 15 10 15

Met Asp Thr Thr Met Phe Val Gly Asp Pro Phe Asn Pro Pro Ser Asp 50 55 60

Leu Asn Trp Arg Tyr Gin Thr Ile Lys Leu Phe Ala His Ala Ile Asn

25 30

Gin Leu Met Gly Leu Pro His Phe Phe Glu Trp Ile His Leu Arg Leu

40 45

140

PL 213 926 B1

Pro Thr Asp Cys Asp Leu Ser Arg Val Pro Asn Asp Asp Ile Tyr Ile 65 70 75 80

Val Ser Ala Arg Gly Gly Ile Glu Gly Leu Cys Gin Lys Leu Trp Thr 85 90 95

Met Ile Ser Ile Ala Ala Ile Gin Leu Ala Ala Ala Arg Ser His Cys 100 105 110

Arg Val Ala Cys Met Val Gin Gly Asp Asn Gin Val Ile Ala Val Thr 115 120 125

Arg Glu Val Arg Ser Asp Asp Ser Pro Glu Met Val Leu Thr Gin Leu 130 135 140

His Gin Ala Ser Asp Asn Phe Phe Lys Glu Leu Ile His Val Asn His 145 150 155 160

Leu Ile Gly His Asn Leu Lys Asp Arg Glu Thr Ile Arg Ser Asp Thr 165 170 175

Phe Phe Ile Tyr Ser Lys Arg Ile Phe Lys Asp Gly Ala Ile Leu Ser 180 185 190

Gin Val Leu Lys Asn Ser Ser Lys Leu Val Leu Val Ser Gly Asp Leu 195 200 205

Ser Glu Asn Thr Val Met Ser Cys Ala Asn Ile Ala Ser Thr Val Ala 210 215 220

<210>	72
<211>	224
<212>	PRT
<213>	Wirus	Sendai
<400>	72
Tyr Glu Thr	Leu Ser

Leu Asn Trp Arg Phe Glu Ser Thr Ala Leu Phe Gly Gin Arg Cys Asn 20 25 30

Glu Ile Phe Gly Phe Lys Thr Phe Phe Asn Trp Met His Pro Val Leu 35 40 45

Glu Lys Cys Thr Ile Tyr Val Gly Asp Pro Tyr Cys Pro Val Ala Asp 50 55 60

PL 213 926 B1

141

Arg 65

Met His

Arg Gin Leu Gin Asp 70

His

Ala

Asp 75

Ser

Gly

Ile

Phe

Ile 80

His

Asn

Pro

Arg

Gly

Gly

Ile

Glu

Gly

Tyr

Cys

Gin

Lys

Leu

Trp

Thr

85

90

95

Leu

Ile

Ser

Ile

Ser

Ala

Ile

His

Leu

Ala

Ala

Val

Arg

Val

Gly

Val

100

105

110

Arg

Val

Ser

Ala

Met

Val

Gin

Gly

Asp

Asn

Gin

Ala

Ile

Ala

Val

Thr

115

120

125

Ser

Arg

Val

Pro

Val

Ala

Gin

Thr

Tyr

Lys

Gin

Lys

Lys

Asn

His

Val

130

135

140

Tyr

Glu

Glu

Ile

Thr

Arg

Tyr

Phe

Gly

Ala

Leu

Arg

His

Val

Met

Phe

145

150

155

160

Asp

Ile

Gly

His

Glu

Leu

Lys

Leu

Asn

Glu

Thr

Ile

Ile

Ser

Ser

Lys

165

170

175

Met

Phe

Val

Tyr

Ser

Lys

Arg

Ile

Tyr

Tyr

Asp

Gly

Lys

Ile

Leu

Pro

180

185

190

Gin

Cys

Leu

Lys

Ala

Leu

Thr

Arg

Cys

Val

Phe

Trp

Ser

Glu

Thr

Leu

195

200

205

Val

Asp

Glu

Asn

Arg

Ser

Ala

Cys

Ser

Asn

Ile

Ser

Thr

Ser

Ile

Ala

210 215 220 <210> 73 <211> 224 <212> PRT

<213> :	Ludzki wirus	grypy rzekomej 3
<400>	73
Tyr Glu 1	Thr Val Ser 5	Cys Phe Leu Thr Thr Asp Leu Lys Lys Tyr Cys 10 15
Leu Asn	Trp Arg Tyr 20	Glu Ser Thr Ala Leu Phe Gly Glu Thr Cys Asn 25 30
Gin Ile	Phe Gly Leu 35	Asn Lys Leu Phe Asn Trp Leu His Pro Arg Leu 40 45
Glu Gly 50	Ser Thr Ile	Tyr Val Gly Asp Pro Tyr Cys Pro Pro Ser Asp 55 60

142

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

143

Asp 65

Ala

His

Ile

Pro

Leu 70

Tyr

Lys

Val

Pro

Asn 75

Asp

Gin

Ile

Phe

Ile 80

Lys

Tyr

Pro

Met

Gly

Gly

Ile

Glu

Gly

Tyr

Cys

Gin

Lys

Leu

Trp

Thr

85

90

95

Ile

Ser

Thr

Ile

Pro

Tyr

Leu

Tyr

Leu

Ala

Ala

Tyr

Glu

Ser

Gly

Val

100

105

110

Arg

Ile

Ala

Ser

Leu

Val

Gin

Gly

Asp

Asn

Gin

Thr

Ile

Ala

Val

Thr

115

120

125

Lys

Arg

Val

Pro

Ser

Thr

Trp

Pro

Tyr

Asn

Leu

Lys

Lys

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Ala

Arg

Val

Thr

Arg

Asp

Tyr

Phe

Val

Ile

Leii

Arg

Gin

Arg

Leu

His

145

150

155

160

Asp

Ile

Gly

His

His

Leu

Lys

Ala

Asn

Glu

Thr

Ile

Val

Ser

Ser

His

165

170

175

Phe

Phe

Val

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ile

Tyr

Tyr

Asp

Gly

Leu

Leu

Val

Ser

180

185

190

Gin

Ser

Leu

Lys

Ser

Ile

Ala

Arg

Cys

Val

Phe

Trp

Ser

Glu

Thr

Ile

195

200

205

Val

Asp

Glu

Thr

Arg

Ala

Ala

Cys

Ser

Asn

Ile

Ala

Thr

Thr

Met

Ala

210 215 220 <210> 75 <211> 224 <212> PRT <213> Wirus Nipah

<400> '

75

Phe 1

Asp

Thr

Val

Ser 5

Ala

Phe

Leu

Thr

Thr 10

Asp

Leu

Lys

Lys

Phe 15

Cys

Leu

Asn

Trp

Arg 20

Tyr

Glu

Ser

Met

Ala 2 5

Ile

Phe

Ala

Glu

Arg 30

Leu

Asp

Glu

Ile

Tyr 35

Gly

Leu

Pro

Gly

Phe 40

Phe

Asn

Trp

Met

His 45

Lys

Arg

Leu

Glu

Arg 50

Ser

Val

Ile

Tyr

Val 55

Ala

Asp

Pro

Asn

Cys 60

Pro

Pro

Asn

Ile

144

PL 213 926 B1

Asp 65

Lys

His

Met

Glu Leu Glu 70

Lys

Thr

Pro

Glu 75

Asp

Asp

Ile

Phe

Ile 80

His

Tyr

Pro

Lys

Gly Gly Ile

Glu

Gly

Tyr

Ser

Gin

Lys

Thr

Trp

Thr

85

90

95

Ile

Ala

Thr

Ile

Pro Phe Leu

Phe

Leu

Ser

Ala

Tyr

Glu

Thr

Asn

Thr

100

105

110

Arg

Ile

Ala

Ala

Ile Val Gin

Gly

Asp

Asn

Glu

Ser

Ile

Ala

Ile

Thr

115

120

125

Gin

Lys

Val

His

Pro Asn Leu

Pro

Tyr

Lys

Val

Lys

Lys

Glu

Ile

Cys

130

135

140

Ala

Lys

Gin

Ala

Gin Leu Tyr

Phe

Glu

Arg

Leu

Arg

Met

Asn

Leu

Arg

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

His

Asn Leu Lys

Ala

Thr

Glu

Thr

Ile

Ile

Ser

Thr

His

165

170

175

Leu

Phe

Ile

Tyr

Ser Lys Lys

Ile

His

Tyr

Asp

Gly

Ala

Val

Leu

Ser

180

185

190

Gin

Ala

Leu

Lys

Ser Met Ser

Arg

Cys

Cys

Phe

Trp

Ser

Glu

Thr

Leu

195

200

205

Val

Asp

Glu

Thr

Arg Ser Ala

Cys

Ser

Asn

Ile

Ser

Thr

Thr

Ile

Ala

210

215

220

<210>

76

<211>

57

<212> :

RNA

<213> :

Ludzki metapneumowirus 00-1

<400> 76 acgagaaaaa aacgcguaua aauuagauuc caaaaaaaua ugggacaagu gaaaaug 57 <210> 77 <211> 29 <212> RNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 77 uaauuaaaaa agugggacaa gucaaaaug 29 <210> 78 <211> 38 <212> RNA

PL 213 926 B1

145 <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 78 uaguuuaaua aaaauaaaca augggacaag uaaaaaug <210> 79 <211> 128 <212> RNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 79 uaacaaccaa gcaccuuggc caagagcuac uaacccuauc ucauagauca uaaagucacc 60 auucuaguua uauaaaaauc aaguuagaac aagaauuaaa ucaaucaaga acgggacaaa 120 uaaaaaug 128 <210> 80 <211> 71 ' <212> RNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 80 uaguuaauua aaaauaaagu aaauuaaaau aaauuaaaau uaaaaauaaa aauuugggac aaaucauaau g <210> 81 <211> 36 <212> RNA <213> Ludzki metapneumowirus <400> 81 uaguaaaaac acaucagagu gggauaaaug acaaug <210> 82 <211> 207 <212> RNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 82

uaaauguuaa	caccagau.ua	ggauccaucc	aagucuguua	guucaacaau	uuaguuauuu	60
aaaaauauuu	ugaaaacaag	uaaguuucua	ugauacuuca	uaauaauaag	uaauaauuaa	120
uugcuuaauc	aucaucacaa	cauuauucga	aaccauaacu	auucaauuua	aaaaguaaaa	180
aacaauaaca	ugggacaagu	aguuaug				207

<210> 83 <211> 215 <212> RNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 83 uaacaaaaaa uacaaaauaa cucuaagaua aaccaugcag acaccaacaa uggagaagcc

146

PL 213 926 B1 aaaagacaau ucacaaucuc cccaaaaagg caacaacacc auauuagcuc ugcccaaauc ucccuggaaa aaacacucgc ccauauacca aaaauaccac aaccacccca agaaaaaaac ugggcaaaac aacacccaag agacaaauaa caaug

120

180

215 <210>

<211>

<212>

182

RNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 84

ugaa.aaa.uga.	uaaaaaugau	aaaauaggug	acaacuucau	acuauuccaa	aguaaucauu	60
ugauuaugca	auuauguaau	aguuaauuaa	aaacuaaaaa	ucaaaaguua	gaaacuaaca	120
acugucauua	aguuuauuaa	aaauaagaaa	uuauaauugg	auguauacgg	uuuuuuucuc	180
gu						182

<210> 85 <211> 45 <212> RNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 85 ucccauauuu uuuuggaauc uaauuuauac gcguuuuuuu cucgu <210> 86 <211> 44 <212> RNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 86 acgagaaaaa aaccguauac auccaauuau aauuucuuau uuuu <210> 87 <211> 45 <212> RNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 87 acgagaaaaa aaccguauac auccaauuau aauuucuuau uuuua <210> 88 <211> 45 <212> RNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 88 acgagaaaaa aaccguauuc aucaaauuuu uagcuuuuag uuuuu <210> 89 <211> 44

PL 213 926 B1

147 <212> ΕΝΑ <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 89 cccauauuuu uuuggaaucu aauuuauacg cguuuuuuuc ucgu <210> 90 <211> 44 <212> RNA <213> Ludzki metapneumowirus 00-1 <400> 90 cccauuauuu uucuagaacc ugcuugaaug cguuuuuuuc ucgu <210> 91 <211> 394 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 99-1 <400> 91

Met Ser Leu Gin Gly Ile His Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 15 10 15

Ile Leu Lys Glu Ser Gin Tyr Thr Ile Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30

Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gin Gin Glu Ile Thr Leu Leu Cys 35 40 45

Gly Glu Ile Leu Tyr Thr Lys His Thr Asp Tyr Lys Tyr Ala Ala Glu 50 55 60

Ile Gly Ile Gin Tyr Ile Cys Thr Ala Leu Gly Ser Glu Arg Val Gin 65 70 75 80

Gin Ile Leu Arg Asn Ser Gly Ser Glu Val Gin Val Val Leu Thr Lys 85 90 95

Thr Tyr Ser Leu Gly Lys Gly Lys Asn Ser Lys Gly Glu Glu Leu Gin 100 105 110

Met Leu Asp Ile His Gly Val Glu Lys Ser Trp Ile Glu Glu Ile Asp 115 120 125

Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Val Thr Leu Leu Lys Glu Ser Ser Gly 130 135 140

Asn Ile Pro Gin Asn Gin Arg Pro Ser Ala Pro Asp Thr Pro Ile Ile 145 150 155 160

148

PL 213 926 B1

Leu Leu Cys Val Gly Ala Leu Ile Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr Ile 165 170 175

Glu Val Gly Leu Glu Thr Thr Val Arg Arg Ala Asn. Arg Val Leu Ser 180 185 190

Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Arg Ile Asp Ile Pro Lys Ile Ala Arg 195 200 205

Ser Phe Tyr Glu Leu Phe Glu Gin Lys Val Tyr Tyr Arg Ser Leu Phe 210 215 220

Ile Glu Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala 225 230 235 240

Glu Ser Leu Phe Val Asn Ile Phe Met Gin Ala Tyr Gly Ala Gly Gin 245 250 255

Thr Leu Leu Arg Trp Gly Val Ile Ala Arg Ser Ser Asn Asn Ile Met 260 265 270

Leu Gly His Val Ser Val Gin Ser Glu Leu Lys Gin Val Thr Glu Val 275 280 285

Tyr Asp Leu Val Arg Glu Met Gly Pro Glu Ser Gly Leu Leu His Leu 290 295 300

Arg Gin Ser Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu Ala Asn Cys Pro Asn 305 310 315 320

Phe Ala Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly Ile Ile Gly 325 330 335

Met Tyr Arg Gly Arg Val Pro Asn Thr Glu Leu Phe Ser Ala Ala Glu 340 345 350

Ser Tyr Ala Arg Ser Leu Lys Glu Ser Asn Lys Ile Asn Phe Ser Ser 355 360 365

Leu Gly Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Ala Ala Glu His Phe Leu Asn 370 375 380

Met Ser Gly Asp Asn Gin Asp Asp Tyr Glu 385 390

PL 213 926 B1

149 <210> 92 <211> 294 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 99-1 <400> 92

Met Ser Phe Pro Glu Gly Lys Asp Ile Leu Phe Met Gly Asn Glu Ala 15 10 15

Ala Lys Ile Ala Glu Ala Phe Gin Lys Ser Leu Lys Lys Ser Gly His 20 25 30

Lys Arg Thr Gin Ser Ile Val Gly Glu Lys Val Asn Thr Ile Ser Glu 35 40 45

Thr Leu Glu Leu Pro Thr Ile Ser Lys Pro Ala Arg Ser Ser Thr Leu 50 55 60

Leu Glu Pro Lys Leu Ala Trp Ala Asp Asn Ser Gly Ile Thr Lys Ile 65 70 75 80

Thr Glu Lys Pro Ala Thr Lys Thr Thr Asp Pro Val Glu Glu Glu Glu 85 90 95

Phe Asn Glu Lys Lys Val Leu Pro Ser Ser Asp Gly Lys Thr Pro Ala 100 105 110

Glu Lys Lys Ser Lys Phe Ser Thr Ser Val Lys Lys Lys Val Ser Phe 115 120 125

Thr Ser Asn Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Lys Leu Glu Lys Asp Ala Leu 130 135 140

Asp Leu Leu Ser Asp Asn Glu Glu Glu Asp Ala Glu Ser Ser Ile Leu 145 150 155 160

Thr Phe Glu Glu Lys Asp Thr Ser Ser Leu Ser Ile Glu Ala Arg Leu 165 170 175

Glu Ser Ile Glu Glu Lys Leu Ser Met Ile Leu Gly Leu Leu Arg Thr

180 185 190

Leu Asn Ile Ala Thr Ala Gly Pro Thr Ala Ala Arg Asp Gly Ile Arg

195 200 205

Asp Ala Met Ile Gly Ile Arg Glu Glu Leu Ile Ala Glu Ile Ile Lys

210 215 220

150

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

151

Ala 145

Leu

Cys Asp

Phe

Met 150

Asp Leu Glu Lys

Asn 155

Ile

Pro

Val

Thr

Ile 160

Pro

Ala

Phe

Ile

Lys

Ser

Val

Ser

Ile

Lys

Glu

Ser

Glu

Ser

Ala

Thr

165

170

175

Val

Glu

Ala

Ala

Ile

Ser

Ser

Glu

Ala

Asp

Gin

Ala

Leu

Thr

Gin

Ala

180

185

190

Lys

Ile

Ala

Pro

Tyr

Ala

Gly

Leu

Ile

Met

Ile

Met

Thr

Met

Asn

Asn

195

200

205

Pro

Lys

Gly

Ile

Phe

Lys

Lys

Leu

Gly

Ala

Gly

Thr

Gin

Val

Ile

Val

210

215

220

Glu

Leu

Gly

Ala

Tyr

Val

Gin

Ala

Glu

Ser

Ile

Ser

Arg

Ile

Cys

Lys

225

230

235

240

Ser

Trp

Ser

His

Gin

Gly

Thr

Arg

Tyr

Val

Leu

Lys

Ser

Arg

245 250 <210> 94 <211> 539 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 99-1

<400> 94

Lys

Val 5

Met

Ile

Ile

Ile

Ser 10

Leu

Leu

Ile

Thr

Pro 15

Gin

Met 1

Ser

Trp

His

Gly

Leu

Lys 20

Glu

Ser

Tyr

Leu

Glu 25

Glu

Ser

Cys

Ser

Thr 30

Ile

Thr

Glu

Gly

Tyr 35

Leu

Ser

Val

Leu

Arg 40

Thr

Gly

Trp

Tyr

Thr 45

Asn

Val

Phe

Thr

Leu 50

Glu

Val

Gly

Asp

Val 55

Glu

Asn

Leu

Thr

Cys 60

Thr

Asp

Gly

Pro

Ser 65

Leu

Ile

Lys

Thr

Glu 70

Leu

Asp

Leu

Thr

Lys 75

Ser

Ala

Leu

Arg

Glu 80

Leu

Lys

Thr

Val

Ser 85

Ala

Asp

Gin

Leu

Ala 90

Arg

Glu

Glu

Gin

Ile 95

Glu

Asn

Pro

Arg

Gin 100

Ser

Arg

Phe

Val

Leu 105

Gly

Ala

Ile

Ala

Leu 110

Gly

Val

152

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

153

Asn

Ile

Ser Thr 355

Thr Asn Tyr Pro 360

Cys

Lys

Val

Ser Thr Gly 365

Arg

His

Pro

Ile

Ser

Met

Val

Ala

Leu

Ser

Pro

Leu

Gly

Ala

Leu

Val

Ala

Cys

370

375

380

Tyr

Lys

Gly

Val

Ser

Cys

Ser

Ile

Gly

Ser

Asn

Trp

Val

Gly

Ile

Ile

385

390

395

400

Lys

Gin

Leu

Pro

Lys

Gly

Cys

Ser

Tyr

Ile

Thr

Asn

Gin

Asp

Ala

Asp

405

410

415

Thr

Val

Thr

Ile

Asp

Asn

Thr

Val

Tyr

Gin

Leu

Ser

Lys

Val

Glu

Gly

420

425

430

Glu

Gin

His

Val

Ile

Lys

Gly

Arg

Pro

Val

Ser'

Ser

Ser

Phe

Asp

Pro

435

440

445

Ile

Lys

Phe

Pro

Glu

Asp

Gin

Phe

Asn

Val

Ala

Leu

Asp

Gin

Val

Phe

450

455

460

Glu

Ser

Ile

Glu

Asn

Ser

Gin

Ala

Leu

Val

Asp

Gin

Ser

Asn

Lys

Ile

465

470

475

480

Leu

Asn

Ser

Ala

Glu

Lys

Gly

Asn

Thr

Gly

Phe

Ile

Ile

Val

Val

Ile

485

490

495

Leu

Val

Ala

Val

Leu

Gly

Leu

Thr

Met

Ile

Ser

Val

Ser

Ile

Ile

Ile

500

505

510

Ile

Ile

Lys

Lys

Thr

Arg

Lys

Pro

Thr

Gly

Ala

Pro

Pro

Glu

Leu

Asn

515

520

525

Gly

Val

Thr

Asn

Gly

Gly

Phe

Ile

Pro

His

Ser

530

535

<210> 95 <211> 187 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 99-1 <400> 95

Met 1

Ser Arg Lys

Ala 5

Pro Cys

Lys

Tyr Glu Val 10

Arg

Gly

Lys

Cys Asn 15

Arg

Gly

Ser

Asp

Cys

Lys

Phe

Asn

His

Asn

Tyr

Trp

Ser

Trp

Pro

Asp

20

25

30

154

PL 213 926 B1

Arg Tyr

Leu 35

Leu Leu Arg

Ser

Asn Tyr Leu Leu Asn Gin

Leu

Leu

Arg

40

45

Asn

Thr

Asp

Lys

Ala

Asp

Gly

Leu

Ser

Ile

Ile

Ser

Gly

Ala

Gly

Arg

50

55

60

Glu

Asp

Arg

Thr

Gin

Asp

Phe

Val

Leu

Gly

Ser

Thr

Asn

Val

Val

Gin

65

70

75

80

Gly

Tyr

Ile

Asp

Asp

Asn

Gin

Gly

Ile

Thr

Lys

Ala

Ala

Ala

Cys

Tyr

85

90

95

Ser

Leu

His

Asn

Ile

Ile

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Thr

Glu

Val

Arg

Gin

100

105

110

Ala

Arg

Asp

Asn

Lys

Leu

Ser

Asp

Ser

Lys

His

Val

Ala

Leu

His

Asn

115

120

125

Leu

Ile

Leu

Ser

Tyr

Met

Glu

Met

Ser

Lys

Thr

Pro

Ala

Ser

Leu

Ile

130

135

140

Asn

Asn

Leu

Lys

Lys

Leu

Pro

Arg

Glu

Lys

Leu

Lys

Lys

Leu

Ala

Arg

145

150

155

160

Leu

Ile

Ile

Asp

Leu

Ser

Ala

Gly

Thr

Asp

Asn

Asp

Ser

Ser

Tyr

Ala

165

170

175

Leu

Gin

Asp

Ser

Glu

Ser

Thr

Asn

Gin

Val

Gin

180 185 <210> 96 <211> 71 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 99-1 <400> 96

Met 1

Thr

Leu

His

Met 5

Pro

Cys

Lys

Thr

Val 10

Lys

Ala

Leu

Ile

Lys 15

Cys

Ser

Lys

His

Gly 20

Pro

Lys

Phe

Ile

Thr 25

Ile

Glu

Ala

Asp

Asp 30

Met

Ile

Trp

Thr

His 35

Lys

Glu

Leu

Lys

Glu 40

Thr

Leu

Ser

Asp

Gly 45

Ile

Val

Lys

Ser

His 50

Thr

Asn

Ile

Tyr

Ser 55

Cys

Tyr

Leu

Glu

Asn 60

Ile

Glu

Ile

Ile

PL 213 926 B1

155

Tyr Val Lys Thr Tyr Leu Ser

70 <210> 97 <211> 176 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 99-1 <400> 97

Met Lys Thr Leu Asp Val Ile Lys Ser Asp Gly Ser Ser Glu Thr Cys 15 10 15

Asn Gin Leu Lys Lys Ile Ile Lys Lys His Ser Gly Lys Val Leu Ile 20 25 30

Ala Leu Lys Leu Ile Leu Ala Leu Leu Thr Phe Phe Thr Ala Thr Ile 35 40 45

Thr Val Asn Tyr Ile Lys Val Glu Asn Asn Leu Gin Ala Cys Gin Pro 50 55 60

Lys Asn Glu Ser Asp Lys Lys Val Thr Lys Pro Asn Thr Thr Ser Thr 65 70 75 80

Thr Ile Arg Pro Thr Pro Asp Pro Thr Val Val His His Leu Lys Arg 85 90 95

Leu Ile Gin Arg His Thr Asn Ser Val Thr Lys Asp Ser Asp Thr Cys 100 105 110

Trp Arg Ile His Lys Asn Gin Thr Asn Ile Lys Ile Tyr Lys Phe Leu 115 120 125

Cys Ser Gly Phe Thr Asn Ser Lys Gly Thr Asp Cys Glu Glu Pro Thr 130 135 140

Ala Leu Cys Asp Lys Lys Leu Lys Thr Ile Val Glu Lys His Arg Lys 145 150 155 160

Ala Glu Cys His Cys Leu His Thr Thr Glu Trp Gly Cys Leu His Pro 165 170 175

<210>	98
<211>	224
<212>	PRT
<213>	Ludzki metapneumowirus 99-1
<400>	98

156

PL 213 926 B1

Met Glu Val Arg Val Glu Asn Ile Arg Ala Ile Asp Met Phe Lys Ala 15 10 15

Lys Ile Lys Asn Arg Ile Arg Ser Ser Arg Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30

Leu Ile Leu Ile Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn Ile Phe 35 40 45

Leu Ile Ile Asp His Ala Thr Leu Arg Asn Met Ile Lys Thr Glu Asn 50 55 60

Cys Ala Asn Met Pro Ser Ala Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80

Ser Thr Ala Gly Pro Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gin Gin Ala Thr Gin 85 90 95

Trp Thr Thr Glu Asn Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro Glu Gly His 100 105 110

Pro Tyr Thr Gly Thr Thr Gin Thr Ser Asp Thr Thr Ala Pro Gin Gin 115 120 125

Thr Thr Asp Lys His Thr Ala Pro Leu Lys Ser Thr Asn Glu Gin Ile 130 135 140

Thr Gin Thr Thr Thr Glu Lys Lys Thr Ile Arg Ala Thr Thr Gin Lys 145 150 155 160

Arg Glu Lys Gly Lys Glu Asn Thr Asn Gin Thr Thr Ser Thr Ala Ala 165 170 175

Thr Gin Thr Thr Asn Thr Thr Asn Gin Ile Arg Asn Ala Ser Glu Thr 180 185 190

Ile Thr Thr Ser Asp Arg Pro Arg Thr Asp Thr Thr Thr Gin Ser Ser 195 200 205

Glu Gin Thr Thr Arg Ala Thr Asp Pro Ser Ser Pro Pro His His Ala 210 215 220 <210> 99 <211> 499 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 00-1

PL 213 926 B1

157 <400> 99

Met Asp Pro Leu Asn. Glu Ser Thr Val Asn Val Tyr Leu Pro Asp Ser 15 10 15

Tyr Leu Lys Gly Val Ile Ser Phe Ser Glu Thr Asn Ala Ile Gly Ser 20 25 30

Cys Leu Leu Lys Arg Pro Tyr Leu Lys Asn Asp Asn Thr Ala Lys Val 35 40 45

Ala Ile Glu Asn Pro Val Ile Glu His Val Arg Leu Lys Asn Ala Val 50 55 60

Asn Ser Lys Met Lys Ile Ser Asp Tyr Lys Ile Val Glu Pro Val Asn 65 70 75 80

Met Gin His Glu Ile Met Lys Asn Val His Ser Cys Glu Leu Thr Leu 35 90 95

Leu Lys Gin Phe Leu Thr Arg Ser Lys Asn Ile Ser Thr Leu Lys Leu 100 105 110

Asn Met Ile Cys Asp Trp Leu Gin Leu Lys Ser Thr Ser Asp Asp Thr 115 120 125

Ser Ile Leu Ser Phe Ile Asp Val Glu Phe Ile Pro Ser Trp Val Ser 130 135 140

Asn Trp Phe Ser Asn Trp Tyr Asn Leu Asn Lys Leu Ile Leu Glu Phe 145 150 155 160

Arg Lys Glu Glu Val Ile Arg Thr Gly Ser Ile Leu Cys Arg Ser Leu 165 170 175

Gly Lys Leu Val Phe Val Val Ser Ser Tyr Gly Cys Ile Val Lys Ser 180 185 190

Asn Lys Ser Lys Arg Val Ser Phe Phe Thr Tyr Asn Gin Leu Leu Thr

195 200 205

Trp Lys Asp Val Met Leu Ser Arg Phe Asn Ala Asn Phe Cys ile Trp

210 215 220

Val Ser Asn Ser Leu Asn Glu Asn Gin Glu Gly Leu Gly Leu Arg Ser

225 230 235 240

158

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

159

Lys Arg Leu Ile Trp Ser Val Tyr Pro Lys Asn Tyr Leu Pro Glu Lys 485 490 495

Ile Lys Asn <210> 100 <211> 499 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus 99-1 <400> 100

Met Asp Pro Phe Cys Glu Ser Thr 1 5

Val Asn Val Tyr Leu Pro Asp Ser 10 15

Tyr Leu Lys Gly Val Ile Ser Phe 20

Ser Glu Thr Asn Ala Ile Gly Ser 25 30

Cys Leu Leu Lys Arg Pro Tyr Leu 35 40

Lys Asn Asp Asn Thr Ala Lys Val 45

Ala Val Glu Asn Pro Val Val Glu 50 55

His Val Arg Leu Arg Asn Ala Val 60

Met Thr Lys Met Lys Ile Ser Asp 65 70

Tyr Lys Val Val Glu Pro Val Asn 75 80

Met Gin His Glu Ile Met Lys Asn 85

Ile His Ser Cys Glu Leu Thr Leu 90 95

Leu Lys Gin Phe Leu Thr Arg Ser 100

Lys Asn Ile Ser Ser Leu Lys Leu 105 110

Asn Met Ile Cys Asp Trp Leu Gin 115 120

Leu Lys Ser Thr Ser Asp Asn Thr 125

Ser Ile Leu Asn Phe Ile Asp Val 130 135

Glu Phe Ile Pro Val Trp Val Ser 140

Asn Trp Phe Ser Asn Trp Tyr Asn 145 150

Leu Asn Lys Leu Ile Leu Glu Phe 155 160

Arg Arg Glu Glu Val Ile Arg Thr 165

Gly Ser Ile Leu Cys Arg Ser Leu 170 175

Gly Lys Leu Val Phe Ile Val Ser 180

Ser Tyr Gly Cys Val Val Lys Ser 185 190

160

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

161

<210> 104 <211> 18 <212> DNA <213> sztuczna

162

PL 213 926 B1 <220>

<223> opis sekwencji sztucznej: starter <400> 104 caaggaggca agcgaacg 18 <210> 105 <211> 49 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus

<220> <221> <222> <223>	cecha_dodatkowa (2)..(22) Xaa może być dowolnym aminokwasem występującym naturalnie
<220>
<221>	cecha_dodatkowa
<222>	(29)..(48) '
<223>	Xaa może być dowolnym aminokwasem występującym naturalnie
<400>	105
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Gly Ala Gly Asn Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45

Lys <210> 106 <211> 49 <212> PRT <213> Ludzki metapneumowirus <220>

<221> cecha_dodatkowa <222> (2)..(23) <223> Xaa może być dowolnym aminokwasem występującym naturalnie <220>

<221> cecha_dodatkowa <222> (30)..(48) <223> Xaa może być dowolnym aminokwasem występującym naturalnie <400> 106

Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

PL 213 926 B1

163

164

PL 213 926 B1

<210> 116 <211> 22

PL 213 926 B1

165

<210> 121 <211> 18 <212> DNA

166

PL 213 926 B1

<210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> sztuczna

PL 213 926 B1

167

<210> 131 <211> 22 <212> DNA <213> sztuczna

168

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

169

170

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

171

<210> 148 <211> 27 <212> DNA <213> sztuczna

172

PL 213 926 B1

<210>	153
<211>	18
<212>	DNA
<213>	sztuczna
<220>

PL 213 926 B1

173

174

PL 213 926 B1

PL 213 926 B1

175

176

Claims (25)

1. Wyizolowany metapneumowirus (MPV) ssaczy o ujemnej pojedynczej nici RNA, w którym sekwencja aminokwasowa białka N tego wyizolowanego ssaczego metapneumowirusa o ujemnej pojedynczej nici RNA jest w ponad 91% identyczna z sekwencją aminokwasową białka N o sekwencji o nr id. Sekw. 1 lub 91, przy czym identyczność oznaczona jest względem całej długości białka N.

2. Metapneumowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że ten metapneumowirus o ujemnej pojedynczej nici RNA koduje ponadto:

a) białko P wykazujące ponad 68% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka P o sekwencji o nr id. Sekw.: 8 lub 92;

b) białko M wykazujące ponad 87% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M o sekwencji o nr id. Sekw.: 14 lub 93;

c) białko F wykazujące ponad 81% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka F o sekwencji o nr id. Sekw.: 21 lub 94;

d) białko M2-1 wykazujące ponad 84% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M2-1 o sekwencji o nr id. Sekw.: 47 lub 95;

e) białko M2-2 wykazujące ponad 56% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M2-2 o sekwencji o nr id. Sekw.: 55 lub 96;

f) białko L wykazujące ponad 90% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka L o sekwencji o nr id. Sekw.: 99 lub 100;

g) białko SH wykazujące ponad 29% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka SH o sekwencji o nr id. Sekw.: 63 lub 97; albo

h) białko G wykazujące ponad 29% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka G o sekwencji o nr id. Sekw.: 64 lub 98;

przy czym identyczność sekwencji oznaczona jest względem całej długości odpowiedniego białka.

3. Metapneumowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że ten metapneumowirus o ujemnej pojedynczej nici RNA koduje:

a) białko P wykazujące ponad 68% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka P o sekwencji o nr id. Sekw.: 8 lub 92;

b) białko M wykazujące ponad 87% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M o sekwencji o nr id. Sekw.: 14 lub 93;

c) białko F wykazujące ponad 81% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka F o sekwencji o nr id. Sekw.: 21 lub 94;

d) białko M2-1 wykazujące ponad 84% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M2-1 o sekwencji o nr id. Sekw.: 47 lub 95;

e) białko M2-2 wykazujące ponad 56% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka M2-2 o sekwencji o nr id. Sekw.: 55 lub 96;

f) białko L wykazujące ponad 90% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka L o sekwencji o nr id. Sekw.: 99 lub 100;

PL 213 926 B1

177

g) białko SH wykazujące ponad 29% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka SH o sekwencji o nr id. Sekw.: 63 lub 97; i

h) białko G wykazujące ponad 29% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową białka G o sekwencji o nr id. Sekw.: 64 lub 98;

przy czym identyczność sekwencji oznaczona jest względem całej długości odpowiedniego białka.

4. Metapneumowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że genom tego wirusa zawiera sekwencję nukleotydową, która to sekwencja nukleotydowa jest w co najmniej 90% identyczna z sekwencją nukleotydową o nr id. Sekw. 36, 38 lub 40.

5. Metapneumowirus według jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że wirus ten nie ulega replikacji w gatunkach ptaków.

6. Metapneumowirus według jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że wirus ten jest wirusem atenuowanym.

7. Kompozycja immunogenna, znamienna tym, że zawiera wirusa jak określono w jednym z zastrz. 1-5, w której w szczególności zakaźnym wirusem rekombinowanym jest wirus atenuowany.

8. Wyizolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje wirusa jak określono w jednym z zastrz. 1-5.

9. Wyizolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że hybrydyzuje specyficznie w ostrych warunkach z kwasem nukleinowym jak określono w zastrz. 8, przy czym ostre warunki obejmują w szczególności hybrydyzację w buforze składającym się z 6x SSC, 50 mM Tris-HCl (pH=7,5), 1 mM

EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA i 100 ąg/ml denaturowanego DNA ze spermy łososia, przez

48 godzin w 65°C, płukanie w buforze składającym się z 2x SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll, 0,02% BSA, przez 45 minut w 37°C i płukanie w buforze składającym się z 0,1x SSC przez 45 minut w 50°C.

10. Sposób wykrywania ssaczego metapneumowirusa w próbce, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie próbki z kwasem nukleinowym jak określono w zastrz. 8 lub 9, przy czym ssaczymi MPV jest w szczególności ludzki MPV.

11. Wektor, znamienny tym, że zawiera kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 8 lub 9.

12. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 8 lub 9.

13. Wyizolowane białko, znamienne tym, że pochodzi z wirusa jak określono w jednym z zastrz. 1-5.

14. Przeciwciało, znamienne tym, że wiąże się specyficznie z wirusem jak określono w jednym z zastrz. 1-5.

15. Sposób wykrywania ssaczego metapneumowirusa w próbce, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie próbki z przeciwciałem jak określono w zastrz. 14.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że kwas nukleinowy ma co najmniej 18, co najmniej, 20, co najmniej 23 lub co najmniej 25 nukleotydów długości.

17. Sposób wirusologicznego diagnozowania infekcji MPV u ssaka, znamienny tym, że obejmuje wykrywanie w próbce od wymienionego ssaka obecności izolatu wirusa lub jego składnika poprzez kontaktowanie tej próbki z kwasem nukleinowym jak określono w zastrz. 8 lub 9.

18. Sposób serologicznego diagnozowania infekcji MPV u ssaka, znamienny tym, że obejmuje wykrywanie w próbce od wymienionego ssaka obecności przeciwciała specyficznie skierowanego przeciwko MPV lub jego składnikowi poprzez poddawanie reakcji tej próbki z białkiem jak określono w zastrz. 13.

19. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera (i) wyizolowanego metapneumowirusa ssaczego o ujemnej pojedynczej nici RNA jak określono w jednym z zastrz. 1-5 oraz (ii) farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że genom tego wirusa koduje ponadto sekwencje innych wirusów, albo genom tego wirusa może być pozbawiony części genomu wirusa do generowania replikacyjnie defektywnego wirusa i może zawierać mutacje, delecje lub insercje do generowania wirusów atentowanych.

21. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19, znamienna tym, że innym wirusem jest wirus grypy rzekomej typu 3 (PI3).

22. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera ponadto sekwencję nukleotydową RSV.

178

PL 213 926 B1

23. Zestaw diagnostyczny do diagnozowania infekcji MPV, znamienny tym, że zawiera wirusa jak określono w jednym z zastrz. 1-5, kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 8 lub 9, białko lub jego fragment jak określono w zastrz. 13 albo przeciwciało jak określono w zastrz. 14.

24. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej jak określono w zastrz. 19 lub 20 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki infekcji MPV lub choroby oddechowej.

25. Wirus według jednego z zastrz. 1-5, kompozycja według zastrz. 7, lub kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19 albo 20, znamienne tym, że wirusem jest izolat 00-1 ludzkiego MPV albo izolat 99-1 ludzkiego MPV.