KR20110113658A - 감응성 포유류에서 호흡계 질환을 유발하는 바이러스 - Google Patents

감응성 포유류에서 호흡계 질환을 유발하는 바이러스 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 바이러스학 분야에 관계한다. 본원 발명은 파라믹소비리데(Paramyxoviridae ) 과(科)의 아과 뉴모비리네(Pneumovirinae)에 속하는 네거티브-센스 단일 쇄 RNA 바이러스(MPV) 분리체를 제공하고, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속(genus)에 계통학적으로 상응하는 것으로 확인되었다.

Description

감응성 포유류에서 호흡계 질환을 유발하는 바이러스{A virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals}
본원 발명은 바이러스학에 관계한다.
과거 수십년동안 포유류에서 질환 특히, 사람에서 호흡계 질환(RTI)의 원인이 되는 몇 가지 물질에 대해 확인된 바 있다. 포유류에서 RTI의 고유 병인 물질은 사람에서 발견되는 뉴모바이러스(Pneumovirus )(hRSV), 소 또는 양과 같은 반추동물에서 발견되는 뉴모바이러스(bRSV 또는 oRSV) 속(genus)에 속하는 호흡기 합체 바이러스들이다. 사람 RSV에서 상호교차 중화검사(reciprocal cross neutralization assays)에서의 차이와 면역학적 검사에서 G 단백질의 반응성 및 G 유전자의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 2가지 hRSV 항원성 소단위를 확인하였다. 소단위내에서 aa 서열은 94%(소단위 A) 또는 98%(소단위 B) 상동성을 보이는 반면, 소단위간에는 aa 서열은 53%정도의 상동성을 나타내었다. 단클론항체, RT-PCR검사 및 RNAse 보호 검사에 따르면 소단위내에서도 추가적인 다양성을 관찰할 수 있다. 양 소단위의 바이러스들은 전세계적으로 분포되어있고, 한 계절동안에도 발생할 수 있다. 기존 면역원 존재하에 감염이 일어날 수 있으며, 재감염을 위한 항원성 변이가 엄격하게 요구되지도 않는다.(Sullender, W.M., Respiratory Syncytial Virus Genetic and Antigenic Diversity. Clinical Microbiology Reviews, 2000. 13(1): p. 1-15; Collins, P.L., McIntosh, K. and chanock, R.M., Respiratory syncytial virus. Fields virology, ed. B.N. Knipe, Howley, P.M. 1996, Philadelphia: lippencott-raven. 1313-1351; Johnson, P.R., et al., the G glycoprotein of human respiratory syncytial biruses of subgroups A and B: extensive sequence divergence between antigenically related proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 1987. 84(16): p. 5625-9; Collins, P.L., The molecular Biology of Human Respiratory Syncytial virus (RSV) of the enus Pneumovirus, in The Paramyxoviruses, D.W. Kingsbury, Editor. 1991, Plenum Press: New York. p. 103-153.)
또 다른 전형적인 뉴모바이러스(Pneumovirus)는 일반적으로 실험실 쥐에서만 발견되는 생쥐의 폐렴 바이러스(PVM)이다. 그러나, 포유류에서 관찰되는 질병의 일정 부분은 공지의 병인물질에 의해 어떻게 기인되는지 아직 밝혀지지 않고 있다.
본원 발명은 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)의 뉴모비리네(Pneumovirinae) 아과에 속하고, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속에 계통유전학적으로 상응하는 것으로 확인되는 분리된 네거티브 센스 단일 가닥 RNA 포유류 메타뉴모바이러스(mammalian metapneumovirus, MPV)를 제공한다. 확인방법은 바이러스의 핵산 서열을 결정하고, 계통유전학 분석으로 테스트함으로써 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)속에 계통학적으로 상응하게 확인할 수 있다. 예를 들면, 100개 부트스트랩(bootstraps) 및 3개 점블스(jumbles)를 이용하여, 최대한의 분류 구조를 만들고, 조류 비강기관지염의 병인학적 물질인 칠면조 비강기관염 바이러스(TRTV)로 알려진 조류 뉴모바이러스(APV)의 필수 조류 바이러스 분리체에 상응하는 것보다 CNCM, Paris에 I-2614로 기탁된 바이러스 분리체에 계통학적으로 좀더 밀접하다는 것을 발견하였다. 계통학적 분석의 경우에는 비교용 외집단 물질로써 비-MPV 핵산 서열을 수득하는 것이 가장 유익한데, 이는 도 5에서 설명하는 것과 같이 조류 뉴모바이러스 혈청타입 C(APV-C)에서 가장 유익한 외집단 분리체를 얻을 수 있다.
계통학적 분석에서는 MPV와 같은 바이러스를 확인하는 통상의 방법을 제공하나, 이들 바이러스로부터 바이러스 또는 바이러스성 단백질 또는 핵산을 확인하는 다소 과정이 더 복잡할 수 는 있지만 몇 가지 다른 가능성 있는 좀더 직접적인 방법을 제공한다. 서열 또는 기탁물을 이용하여 확인된 분리체, 바이러스성 단백질 또는 핵산과 비교하여 확인할 수 있는 바이러스, 단백질 또는 핵산과의 상동성 비율을 이용하여 대략적으로 MPV를 확인할 수 있다. 일반적으로 바이러스 종, 특히 RNA 바이러스는 유사 종으로 구성될 때가 있는 바이러스 종내에서도 이형성을 나타낸다. 따라서, 각 분리체는 여기에서 제공되는 다양한 분리체중 한 개와 다소 상이한 비율의 상관관계를 가질 수 있다.
기탁된 바이러스 I-2614와 비교를 원할 때, 본원 발명은 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)의 뉴모비리네(Pneumovirinae)에 속하고, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속에 계통유전학적으로 상응하는 것으로 확인할 수 있는 필수 포유류 네거티브 센스 단일 가닥 RNA 바이러스(MPV) 분리체를 제공하는데, 바이러스의 아미노산 서열을 결정하고, 이 아미노산 서열이 CNCM, Paris에 I-2614로 기탁된 바이러스 분리체의 아미노산에 대해 상동성 비율을 결정하여 얻을 수 있다. I-2614는 APV-C와 비교하였을 때, L-단백질, M-단백질, N-단백질, P-단백질, F-단백질에 대해 더 높은 상동성 비율을 가진다. 또는 본원 발명은 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)의 뉴모비리네(Pneumovirinae)에 속하고, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속에 계통유전학적으로 상응하는 것으로 확인할 수 있는 필수 포유류 네거티브 센스 단일 가닥 RNA 바이러스(MPV) 분리체를 제공하는데, 확인 방법은 바이러스의 핵산 서열을 결정하고, 이 핵산 서열이 CNCM, Paris에 I-2614로 기탁된 바이러스 분리체의 핵산에 대해 상동성 비율을 결정하여 얻을 수 있다. I-2614는 APV-C와 비교하였을 때, L-단백질, M-단백질, N-단백질, P-단백질, F-단백질을 인코드하는데 확인된 비율보다 더 높은 상동성 비율을 가진다.
대략적으로, 확인에 필요한 분리체 또는 분리체의 바이러스성 단백질 또는 핵산이 비교를 위한 각 분리체로써 00-1 또는 99-1을 이용하여 두 개의 별개 집단을 위해 확인된 상동성 비율 범위내에 속하는 상동성 비율을 가질 때, MPV는 여기에서 확인된 것과 같은 두 개의 MPV 혈청학적 집단중에 하나에 속한다고 간주할 수 있을 것이다. 그러나, 상동성 비율이 더 작거나 또는 APV-C로부터의 바이러스성 분리체와 구별할 필요가 있을 때, 여기에서 확인된 바와 같은 계통학적 분석에 의존하는 것이 더 바람직하다.
명심해야 할 것은 이와 같은 비율은 상동성 비율을 결정하는데 있어서, 다른 분리체를 선택할 경우에 다소 변화가 있을 수 있다는 것이다.
이와 같은 MPV를 준비하는 경우에, 본원 발명은 포유류 특히 사람에서 질환 특히 호흡계 질환의 진단 또는 치료에 이용할 수 있는 진단 수단 및 방법, 치료학적인 방법 및 수단을 제공하는 것이다. 그러나, 기본적인 포유류 MPV와 필수 조류 APV 특히, APV-C와의 유전학적인 관계로 인하여, 본원 발명에서는 조류 질병의 진단 및 치료에도 이용할 수 있는 수단 및 방법을 제공할 수도 있다. 바이러스학에서, 특정 바이러스 감염의 진단 및 치료는 이와 같은 감염을 일으키는 특정 바이러스에 가장 특이적인 물질을 이용하는 것이다. 이 경우에, MPV 감염의 진단 및 치료는 MPV에 가장 특이적인 물질을 이용하는 것이 바람직하다. 그러나, 이 대신에 특이성이 다소 약한 그러나, 충분한 교차 반응을 할 수 있는 물질을 배제하는 것은 결코 아니다. 그 이유는 이와 같은 물질이 좀더 용이하게 이용할 수 있고, 충분히 일을 수행할 수 있기 때문이다. 여기에서는 APV에서 유도된 물질, 특히 APV-C에서 유도된 물질을 이용하여 포유류에서 MPV 감염의 바이러스성 진단 및 혈청학적 진단을 실행하는 예를 제공하며, 여기의 상세한 설명에서는 새들에서 APV 항체를 감지하도록 특이적으로 고안된 ELISA를 이용하면 포유류에서 MPV 감염에 대해 충분히 가치있는 혈청학적 진단을 할 수 있다는 것을 보여준다. 이와 같은 목적에 이용할 수 있는 특히 유용한 시험은 APV 항체를 감지하도록 고안된 ELISA 테스트(혈청 또는 난황)인데, 시판되는 것으로는 SVANOVA Biotech AB, Uppsal Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala Sweden에서 제조한 APV-Ab SVANOVIR 　를 이용할 수 있다. 포유류에서 APV 감염에 대한 바이러스성 또는 혈청학적 진단은 MPV에서 유도된 물질을 이용하여 실시할 수 있는데, 상세한 설명에서는 APV 감염에 대해 충분히 가치있는 혈청학적 진단을 MPV 항체를 감지할 수 있도록 고안된 ELISA를 이용할 수 있다고 보여주고 있다. 항원과 항체가 열쇠와 자물쇠 관계라는 것을 고려할 때, 충분한 교차 반응성을 가지는 적절한 항체를 선택함으로써 다양한 항원을 감지할 수 있다. 물론, 이와 같은 교차 반응성에 의존하는 경우에, 다양한 바이러스의 각종 당 단백질사이에 존재하는 아미노산 상동성을 이용하여 물질(항원 또는 항체)을 선택할 수 있는데, 가장 상동한 단백질에 관계된 물질이 교차 반응성을 이용한 테스트에 이용하는데 가장 적합하다.
핵산 감지의 경우에, 다양한 바이러스의 이형성 핵산 서열에 기초한 프라이머 또는 프로브를 고안하는 것 대신에, 필수 포유류 또는 조류 메타뉴모바이러스(Metapneumoviruses) 사이에 차이를 감지하는 것이 좀더 직접적인 방법이 될 것이고, 이는 높은 상동성을 보이는 바이러스-특이적인 핵산 서열 스트레치에 기초한 프라이머 또는 프로브를 고안하는데 충분하다. 일반적으로 핵산 서열의 경우에, 90% 또는 그이상의 상동성은 엄격한 하이브리드 조건하에서 진단 테스트에서 필요한 충분한 교차 반응성을 보장한다.
본원 발명은 동물 특히 포유류, 좀더 특별하게는 사람에서 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단하는 방법을 제공하는데, 본원 발명에 따르는 MPV 특이적인 핵산 또는 항체와 샘플을 반응시켜, 바이러스 분리체 또는 이들의 성분이 동물의 시료에 존재하는지를 결정하는 것이고, 포유류에서 MPV 감염을 혈청학적으로 진단하는 방법은 본원 발명에 따른 MPV-특이적인 단백질 분자 또는 이들의 단편 또는 항체와 시료를 반응시켜 MPV에 특이적인 항체가 포유류의 시료에 존재하는지를 결정하는 것이다. 또한 본원 발명은 MPV 감염을 진단할 수 있는 진단 키트를 제공하는데, 이 키트는 MPV, MPV-특이적인 핵산, 단백질 분자 또는 이들의 단편, 본원 발명에 따른 항원 또는 항체로 구성된다. 본원 발명은 더 바람직하게는 MPV를 감지하는 수단을 제공하는데, 이 수단은 당분야에 이용할 수 있는 형광 또는 효소를 이용한 감지 시스템과 같은 여기성 집단으로 구성된다(예를 들면, 적절한 진단 키트는 IF, ELISA, 중화검사, RT-PCR 검사로 구성된다). 미확인된 바이러스 성분 또는 이의 합성 유사체 예를 들면, 핵산, 단백질 분자 또는 이들의 단편이 MPV-특이상으로 확인될 것인지를 결정하기 위해, 여기에서 제공하는 것과 같은 계통학적 분석을 이용하여, 공지의 비-MPV(APV-C가 가장 적절하게 이용됨) 서열과 공지의 MPV 서열과의 서열 상동성을 비교함으로써, 바이러스 성분의 핵산 또는 아미노산 서열, 적절하게는 10개 뉴클레오티드 또는 아미노산, 더욱 적절하게는 적어도 25개 뉴클레오티드 또는 아미노산, 가장 적절하게는 적어도 40개 뉴클레오티드 또는 아미노산을 충분히 분석할 수 있다. MPV 또는 비-MPV 서열과의 상관관계 정도에 따라, 성분 또는 합성된 유사체를 확인할 수 있다.
본원 발명은 또한 포유류에서 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단할 수 있는 방법을 제공하는데, APV에서 유도된 교차 반응성 핵산(적절하게는 혈청타입 C) 또는 APV와 반응성이 있는 교차-반응성 항체와 시료를 반응시켜 바이러스성 분리체 또는 이의 성분이 포유류 시료에 존재하는지 결정하는 것으로 구성되고; 포유류에서 MPV 감염을 혈청학적으로 진단하는 방법은 APV에서 유도된 단백질성 분자 또는 이의 단편 또는 항원과 시료를 반응시켜, APV 또는 이의 성분에 직접적으로 관계하는 교차-반응성 항체가 포유류의 시료에 존재하는지를 감지하는 것으로 구성된다. 또한, 본원 발명은 MPV 감염 진단용 APV 또는 APV-항체 감지용으로 최초 고안된 진단 키트, 특히 사람에서 MPV 감염을 감지하기 위해 고안된 키트를 이용하는 것이다.
또한, 본원 발명은 새에서 APV 감염을 바이러스학적으로 진단하는 방법을 제공하는데, MPV에서 유도된 교차-반응성 핵산 또는 MPV와 반응성이 있는 교차-반응성 항체와 시료를 반응시켜 새의 시료에 바이러스성 분리체 또는 이들의 성분이 존재하는지를 결정하고; 새에서 혈청학적으로 APV 감염을 진단하는 방법은 MPV에서 유도된 단백질 분자 또는 이의 단편 또는 항원과 시료를 반응시켜, MPV 또는 이의 성분에 대한 교차-반응성 항체가 새의 시료에 존재하는지를 결정하는 것으로 구성된다. 또한, 본원 발명은 APV 감염을 진단하기 위한 MPV 또는 MPV-항체 감지용으로 고안된 진단 키트를 이용하는 것을 제공하고, 특히, 닭, 오리 또는 칠면조와 같은 가금류에서 APV 감염을 감지하기 위해 고안된 진단 키트를 이용하는 것을 제공한다.
전술한 것과 같은 치료와 함께, 다소 간접적이기는 하지만, 좀더 상동성있는 접근법이 이용될 필요가 있을 때 별견된 교차 반응성을 유사한 용도를 사용할 수 있다. 좀더 상동성이 큰 MPV 백신을 이용할 수 없을 경우에, MPV 감염에 대한 긴급 백신주사와 같은 지체할 수 없는 백신주사는 APV에서 유도된 백신 조제물(적절하게는 타입 C)을 이용하여 실시할 수 있고, 역으로, APV 감염에 대한 백신주사도 MPV에서 유도된 백신 조제물을 이용하는 것도 고려할 수 있다. 또한, 역유전자 기술을 이용하여 백신으로 이용할 수 있는 키메라 APV-MPV 바이러스 구조체를 만들 수 있게 되었고, 이는 원하는 수준으로 각 균주의 분리체를 감쇠시킬 수 있는 것과는 별개의 분야이다. 유사한 역유전자 기술을 이용하면, 백신 조제에 이용할 수 있는 RSV-MPV 또는 PI3-MPV와 같은 키메라 파라믹소바이러스-메타뉴모바이러스(paramyxovirus-metapneumovirus)를 만드는 것도 가능하다. 이와 같은 구조물은 특히 호흡계 질환을 퇴치할 수 있는 복합 백신으로 특효가 있다.
본원 발명은 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)의 뉴모비리네(Pneumovirinae)에 아과에 속하고, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속에 속하나 고유 뉴모바이러스(pneumovirus)로는 확인되지 않는, 신규한 병인 물질 즉, 필수 포유류 네거티브 센스 단일 가닥 RNA 바이러스(MPV) 분리체(이하 "MPV"라고 칭함), MPV-특이적인 성분 또는 이의 합성 유사체를 제공한다. 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)를 닮은 포유류 바이러스 예를 들면, 포유류에서 질병을 일으키는 또는 바이러스에 대해 중성 숙주로 기본적인 역할을 하는 포유류에서 분리할 수 있는 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)를 닮은 포유류 바이러스는 아직까지 발견되지 않았다. 일반적으로 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)는 가금류에서 중성 숙주로 제한되었거나 또는 질병의 원인 물질로 여겨져 조류의 뉴모바이러스(Pneumovirus)로 알려져 있었다. 최근에 오리의 APV 분리체에 대한 설명이 있었고(FR 2 801 607), 또한 APV 감염은 중성 숙주로 조류에 기본적으로 한정된다고 설명한바 있다.
본원 발명은 분리형 포유류 뉴모바이러스(이하 "MPV"라고 칭함)를 제공하는데, 이는 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속의 것과는 구별되는 유전자 순서 및 아미노산 서열로 구성되는데, 이는 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)의 뉴모비리네(Pneumovirinae)에 아과(sub-family) 내에 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)에 연관된 계통학적으로 연관성이 있는 것으로 보여지고 있다. 비록 현재까지, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)를 새들에서만 분리하였지만, 다른 동물 종 가령, 포유류에서 물질적으로는 별개의 것이나, 관련이 있는 바이러스를 확인할 수 있다. 여기에서, 사람으로부터 MPV를 반복적으로 분리하였고, 이때, APV는 존재하지 않아KT다. 또한, APV와는 달리, MPV는 기본적으로 닭이나 칠면조에서 복제를 하지 않거나 거의 하지 않았는데, 이는 사이토메갈로 꼬리 짧은 원숭이에서는 쉽게 볼 수 있는 것이다. 포유류에서 APV의 복제를 발견하였다는 문헌은 없다. 또한, MPV에 대한 특이적인 항-혈청은 MPV를 중화시키나, APV A, B, C에 대해 생성된 항-혈청은 동일한 정도로 MPV를 중화시키지 못하였고, 이와 같은 교차 반응성의 결핍은 MPV가 다른 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)라는 또 다른 증거를 제공하는 것이다. 또한, APV와 MPV는 유사한 유전자 순서를 공유하나, MPV의 G와 SH 단백질은 APV의 것과는 상당히 상이한 것으로, 핵산 또는 아미노산 수준에서 모두 상당한 서열 상동성을 나타내지 않았다. APV와 MPV 분리체를 구별하기 위한 진단 검사 또는 이들 상이한 바이러스에 대해 생성된 항체 구별을 위한 검사는 이들 단백질중 하나 또는 두 개 모두에 기초하여 개발하는 것이 유익할 것이다(예를 들면, IF, ELISA, 중화검사, RT-PCR 검사). 그러나, MPV의 좀더 연관된 N, P, M, F, L 단백질에서 얻은 서열 또는 항원 정보와 APV의 각 단백질과의 서열 상동성 분석을 이용하면 MPV와 APV를 구별할 수 있을 것이다. 예를 들면, MPV에서 얻은 서열 정보를 계통학적으로 분석하면 MPV와 APV는 두 개의 별개 바이러스라는 것이 나타난다. 특히, 계통학적 구조에서 APV와 MPV는 별개의 바이러스 계통이라는 것을 볼 수 있다. 또한, MPV는 적어도 50년간 인간들에게 퍼져있었고, 따라서, 적어도 50년간 종간 감염이 일어났을 수도 있지만, 이는 일상적인 일은 아니다. MPV CPE가 tMK 또는 다른 세포 배양액에서 hRSV 또는 hPIV-1에 의한 것과 실제 구별할 수 없기 때문에, MPV는 현재까지 주목을 받지 않았을 것이다. tMK(제3기 원숭이 신장 세포, 즉, 세포 배양액에서 3대 계대배양에서의 MK 세포)는 1차 또는 2차 배양액과 비교하였을 때 저렴하기 때문에 적절하게 이용된다. CPE는 고유 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)의 일부 특징과 함께, 세포가 신속하게 내부 파열을 나타낸 후, 단층으로부터 세포가 일탈하여, 합포체를 형성하는 특징을 가진다. 세포는 통상(매번 그런 것은 아니지만), 접종후 10일 내지 10일에 고유 물질에서 바이러스의 3대 계대배양후에 CPE를 나타내는데, 이는 hRSV 또는 hPIV-1과 같은 다른 바이러스에 의한 CPE 보다는 다소 늦은 편이다.
기본적으로 질병의 주도 물질로써, 파라믹소바이러스는 매년 전세계적으로 수많은 동물과 사람의 죽음의 원인이 되었다. 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)는 모노네가비리얼(Mononegavirales)(네거티브-센스 단일 가닥 RNA 바이러스) 체계내에서 과(科)를 이루는데, 아과로는 파라믹소비리데(Paramyxovirinae) 및 뉴모비리네(Pneumovirinae)가 포함된다. 후자의 아과는 현재 뉴모바이러스(pneumovirus)와 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)에 속한다. 사람의 호흡기 합체 바이러스(hRSV)-뉴모바이러스(Pneumovirus) 속-는 전세계적으로 신생아 및 유아시기에 후부 호흡계 감염의 유일한 가장 중요한 원인이 되는 것이다. 뉴모바이러스(Pneumovirus)속의 또 다른 구성원으로는 소 및 양 호흡계 합체 바이러스 및 생쥐의 폐렴 바이러스(PVM)가 포함된다. 조류 뉴모바이러스(APV)는 칠면조 비강기관지염 바이러스(TRTV)로 알려진 것으로, 조류의 비강기관지염의 병인성 물질이며, 칠면조의 상위 호흡계 감염의 원인 물질로써, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속으로 최근에 지정을 받은 유일한 것이고, 전술한 것과 같이, 아직은 감염과 연관되어 있지 않으며, 더욱이 포유류 질병과는 무관하다. APV의 혈청성 소단위는 G 당단백질을 인지하는 단클론 항체를 이용한 G 당단백질의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 및 중화반응 검사를 기초하여 구별하였다. A, B, D 소단위 내에서, G 단백질은 소단위간에 98.5 내지 99.7% 아미노산 서열 상동성을 나타내나, 단위간에는 31.2-38%정도의 아미노산 서열 상동성을 나타낸다(Callins, M.S., Gough, R.E.and Alexander, D.J., Antigenic differentiation of avian pneumovirus isolates using polyclonal antisera and mouse monoclonal antibodies. Avian Pathology, 1993. 22: p. 469-479.; Cook, J.K.A., Jones, B.V., Elis, M.M., Antigenic differentiation of strains of turkey rhinotracheitis virus using monoclonal antibodies. Avian Pathology, 1993. 22: p. 257-273; Bayon-Auboyer, M.H., et al., Nucleotide sequences of the F, L and G protein genes of two-A/non-B avian pneumoviruses (APV) reveal a novel APV subgroup. J Gen Virol, 2000. 81(pt 11): p. 2723-33; Seal, B.S., Matrix protein gene nucleotide and predicted amino acid sequence demonstrate that the first US avian pneumovirus isolate is distint from European strains. Virus Res, 1998. 58(1-2): p. 45-52; Bayon-Auboyer, M.H., et al., Comparison of F-, G- and N-based RT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitis virus. Arch Virol, 1999. 144(6): p. 1091-109; Juhasz, K. and A.J. Easton, Extensive sequence variation in the attachment (G) protein gene of avian pneumovirus: evidence for two disinct subgroups. J Gen Virol, 1994. 75(Pt 11) p. 2873-80.)
WO00/20600에서는 또 다른 형태의 APV 혈청형을 제공하는데, 콜로라도 APV 분리체를 설명하고 있으며, in vitro 혈청 중화검사를 이용하여, 공지의 APV 또는 TRT와 비교하였다. 우선, 콜로라도 분리체는 인지된 TRT 분리체에 대해 단일특이적인 단클론성 항혈청에 대해 테스트하였다. 콜로라도 분리체는 TRT 균주중 어느것에 대한 단일특이적인 항혈청으로 중화되지 않았다. 그러나, 소단위 A 균주에 대해 생성된 하이퍼이뮨 항혈청으로는 중화되었다. 이와 같은 항혈청은 상동성 바이러스를 1:400역가로 중화시켰고, 콜로라도 분리체는 1:80역가에서 중화되었다. 상기 방법을 이용하여, 콜로라도 분리체는 TRT 단클론 항체에 대해 테스트를 받았다. 각 경우에, 상호 중화반응 역가는 <10이었다. 콜로라도 분리체에 대해 생성된 단일 특이적인 항혈청 또한, 두 소집단의 TRT 균주에 대해 테스트를 받았는데, 테스트를 받은 어느 것도 콜로라도 분리체에 대한 항혈청으로 중화되지는 않았다.
APV의 콜로라도 균주는 TRT 바이러스의 소단위 A 또는 B로 감염을 시켰을 때, SPF 닭을 보호하지는 못하였다. 이 결과에서 콜로라도 분리체는 Bayon-Auboyer et al(J. Gen. Vir. 81:2723-2733(2000))에서 제시한 바와 같은 조류 뉴모바이러스의 추가 혈청타입일 수도 있을 것이다.
적절한 구체예에서, 본원 발명은 메타뉴모바이러스(현재까지 미지의 포유류성 바이러스)에 속하는 분리체 MPV를 제공하는데, 이는 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)의 뉴모비리네(Pneumovirinae)와는 별개의 유전자 순서로 구성된다. 두 개 속의 분류는 이들 유전자의 배열에 기초하고; 메타뉴모바이러스는 일반적으로 NS1 또는 NS2와 같은 비-구조적인 단백질이 부족하고(see also Randhawa et al., J. Vir. 71:9849-9854(1997)), 유전자 순서는 뉴모바이러스의 것과는 상이하다
(RSV:'3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5', APV:'3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5') 4,5,6.
본원 발명에서 제공하는 MPV 또는 이에 상응하는 바이러스 분리체는 EM 분석으로 파라믹소바이러스 유사 입자라는 것이 밝혀졌다. 분류와 일치하게, MPV 또는 이에 계통학적으로 또는 분류학적으로 상응하는 바이러스 분리체는 클로로포름으로 처리하는 것에 감응성이 있고, tMK 세포 또는 이에 기능적으로 등가의 세포상에 선택적으로 배양되고, 대부분 세포 배양액에서 필수적으로 트립신 의존적이다. 또한,가장 고전적으로 이용되는 적혈구 세포와의 혈구응집 활성 부족과 전형적인 CPE로, 여기에서 제공되는 바이러스는 RSV와 같이 고유의 뉴모바이러스와 연관이 있을 것이다. 대부분 파라믹소바이러스는 혈구응집 활성을 가지고 있으나, 대부분의 뉴모바이러스는 그렇지 못하다(13). 본원 발명에 따른 MPV에는 M2 단백질을 인코드하는 핵산 단편에 두 번째 오버래핑 ORF(M2-2)을 포함하는데, 일반적으로 다른 대부분의 뉴모바이러스에서 설명되는 것과 같다.(Ahmadian et al., J. Gen. Vir. 80:2011-2016(1999)).
본원 발명에 의해 제공되는 바이러스 분리체를 추가 발견하기 위해서는 병이 든 동물 또는 사람에서 취한 시료를 테스트하여, 아과 뉴모비리네(Pneumovirinae)가 존재하는 지를 파악하고, 기능상의 NS1 또는 NS2를 인코드하는 유전자가 존재하는지에 대해 수득된 바이러스를 검사하는데, 이미 언급한 바와 같이 RSV와 같은 뉴모바이러스와는 다른 유전자 배열을 가진다는 것을 설명할 수 있다. 또한, MPV와 계통학적으로 상관관계에 있는 바이러스 분리체는 여기에서 제공하는 MPV 분리체에서 취한 핵산을 이용한 교차-하이브리드반응 실험으로 발견할 수 있고, 또는 MPV 분리체에서 특이적으로 유도시킨 항원 또는 이뮤노겐에 대한 특이적인 단클론 항체를 이용한 전통적인 교차-혈청학 실험을 이용해서도 발견할 수 있다.
새로 분리된 바이러스 분리체는 MPV에 계통학적으로 상응하여, 분류학적으로 상응하는 것으로, 프로토타입 MPV 분리체와 충분히 유사한 핵산 또는 아미노산 서열로 구성되어, 분리체는 구조적으로도 이와 상응하거나 또는 아과(Pneumovirinae)내에 메타뉴모바이러스 속(Metapneumovirus)과 밀접한 관련이 있는 것으로 보여진다. MPV와 동일한 과(科)의 현재까지 공지된 임의 다른 바이러스(APV 서브타입 C)사이에 개별 단백질 수준에서 구조적 상응성을 정의하는 최대 아미노산 서열 상동성의 경우, 매트릭스는 87%, 핵단백질은 88%, 인단백질은 68%, 융합단백질은 56-64%정도이고, 이는 다른 바이러스 특히 APV-C의 서열과 비교하였을 때, 도 6에서 볼 수 있는 것과 같은 서열과 비교하여 추론할 수 있다. 높은 상동성을 가지거나 상기 언급한 것과 같은 최대치의 상동성을 각각 보유하는 개별 단백질 또는 전체 바이러스 분리체는 MPV에 계통학적으로 그리고 분류학상으로 상응하는 것으로 간주되며, 도6에서 볼 수 있는 것과 같은 서열과 구조적으로 상응하는 핵산 서열로 구성된다. 본원 발명은 기탁된 바이러스에 계통학적으로 상응하는 바이러스를 제공한다.
다른 바이러스와 유사하게, 여기에서 제공되는 서로 다른 분리된 필수 포유류 네거티브-센스 단일 가닥 RNA간에 어느 정도의 변이가 발견된다는 것이다. 계통학 분류도에서, L, M, N, F 유의 일부분의 비교 서열 분석을 기초하여, 바이러스 분리체에 적어도 2가지 유전학적 군상에서 확인할 수 있었다. 바이러스 핵산 또는 아미노산 서열(바이러스 서열)상에 그리고, RSV와 같은 다른 뉴모바이러스에 유사성에서 핵산 및 아미노산 차이에 기초하여, 이와 같은 MPV 유전자형은 MPV의 서브타입을 나타낸다. MPV 분리체의 유전학상 군체 각각에서, 뉴클레오티드 수준에서 상동성 비율은 L의 경우에 94-100; M의 경우에 91-100; N의 경우에 90-100; F의 경우에 93-100이고, 아미노산 수준에서 상동성 비율은 L의 경우 91-100이고; M의 경우 98-100이고; N의 경우 96-100이고; F의 경우 98-100이다. 도 18내지 28에서 추가 비교한 것을 볼 수 있다. 지금까지 확인된 여기에서 제공하는 분리형 포유류 네거티브-센스 단일 쇄 RNA(MPV 분리체) 전체 군에서 뉴클레오티드 수준에서의 최소 상동성 비율은 L과 M의 경우 81; N의 경우 83; F의 경우 82이다. 아미노산 수준에서 이 비율은 L과 N의 경우 91; M의 경우 94; F의 경우 95이다. 여기에서 제공하는 실시예로써 MPV 분리체 또는 분리형 F 유전자의 바이러스 서열은 Seal et al., Vir. Res. 66:139147(2000)에서 예로 설명한 것과 같은 APV-C 융합(F) 유전자의 각 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과의 아미노산에 대해 81%미만의 뉴클레오티드 서열 상동성 또는 82%미만의 아미노산 서열 상동성을 나타낸다. 또한, MPV 또는 분리형 MPV L 유전자의 바이러스 서열은 Randhawa et al., J. Gen. Vir. 77:3047-3-51(1996)에서 설명한 APV-A 중합효소 유전자의 각 뉴클레오티드 EH는 아미노산 서열에 대해 61%미만의 뉴클레오티드 서열 상동성 또는 63%미만의 아미노산 서열 상동성을 나타낸다.
세계에서 MPV 균주의 서열 다변성은 다른 바이러스와 비교하였을 때 다소 높은 편이다. 결과적으로 9개 바이러스 분리체의 N, M, F, L ORF2에서 부분적인 뉴클레오티드 서열 분석을 통하여 2가지 잠재적인 유전자 군상을 확인하였다. 90-100% 뉴클레오티드 상동성이 한 군상에서 확인되었고, 군상간에는 81-88% 상동성이 관찰되었다. 더 많은 바이러스 분리체상에서 수득된 서열 정도에서는 두 가지 유전자형이 존재한다는 것을 확인할 수 있다. 군상 A의 프로토타입 바이러스 분리체 ned/00/01; 군상 B의 프로토타입 바이러스 분리체 ned/99/01을 교차 중화반응 검사에 이용하여, 유전자형이 다른 혈청타입 또는 소단위에 연관이 있는 지를 검사하였다. 이들 자료에서 우리는 여기에서 제공하는 것과 같이, I-2614 분리체에 대해 L의 경우 64%; M의 경우 87%; N의 경우 88%; P의 경우 68%; F의 경우 81%; M2-1의 경우 84%; M2-2의 경우 58%이상의 아미노산 상동성을 나타내는 필수 포유류 바이러스 분리체를 분리형 포유류 네거티브-센스 단일 쇄 RNA로 분류하였다. 특히 L과 M의 경우 81: N의 경우 83; F의 경우 82인 프로토타입 MPV 분리체의 뉴클레오티드 수준에서 최소 비율의 상동성을 가지는 일반적인 이들 바이러스 분리체는 여기에서 제공하는 MPV 집단의 구성원이 된다. 아미노산 수준에서 이들 비율은 L과 N의 경우 91; M의 경우 94; F의 경우 95가 된다. 주어진 바이러스 분리체의 경우에 아미노산 서열 상동성 비율이 L과 N의 경우 90; M의 경우 93; F의 경우 94이상인 경우에, 바이러스 분리체는 도5에서 나타낸 MPV 분리체 군과 유사하다. 주어진 바이러스 분리체의 아미노산 서열 상동성 비율이 L의 경우 94; N의 경우 95; M과 F의 경우 97이상인 경우에, 바이러스 분리체는 도 5에서 볼 수 있는 것과 같은 유전자형 군상중 하나에 속하는 것으로 확인할 수 있다. 유전자 군상으로 정의되는 이들 상동성 비율은 RSV 상응 유전자내 유전자 군상에서 발견되는 상동성 정도와 유사하다는 것이 주목할 만하다.
간단하게 설명하면, 본원 발명은 파라믹소비리데(Paramyxoviridae ) 과(科)의 아과 뉴모비리네(Pneumovirinae)에 속하고, 바이러스의 게놈의 적절한 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 계통학 분류에서 이를 테스트하여, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)에 계통학적으로 상응하다고 확인되는 분리형 포유류 네거티브-센스 단일 쇄 RNA 바이러스(MPV)를 제공하는데, 이때 계통학적 유사 분류는 100개의 부트스트랩(bootstraps)s 및 3개의 점블스(jumbles)를 이용하면, 조류 비강기관지염의 원인물질인 칠면조 비강기관지염 바이러스(TRTV)로 알려진 조류 뉴모바이러스(APV)의 바이러스 분리체에 상응하는 정도이상으로 I-2614(CNCM, Paris에 기탁된) 바이러스 분리체에 좀더 계통학적으로 근접하다는 것을 발견할 수 있다.
상세한 설명에서 밝힌 것과 같이 RAP-PCR 단편 1 내지 10중 임의 것이 계통학 분류에 이용할 수 있는 적절한 핵산 게놈 단편의 시료가 될 수 있고, 이는 도 4 또는 5에서 볼 수 있는 것과 같은 다양한 계통학 분석으로 이어진다. MPV의 핵단백질(N), 인단백질(P), 매트릭스단백질(M), 융합 단백질(F) 유전자의 계통학 분석에서는 미국내 조류에 주로 발견되는 조류 뉴모바이러스, APV 혈청타입 C와 가장 큰 서열 상동성이 있는 것으로 나타났다.
적절한 구체예에서, 본원 발명은 본원 발명은 파라믹소비리데(Paramyxoviridae ) 과(科)의 아과 뉴모비리네(Pneumovirinae)에 속하고, 바이러스의 게놈의 적절한 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 계통학 분류에서 이를 테스트하여, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)에 계통학적으로 상응하다고 확인되는 분리형 포유류 네거티브-센스 단일 쇄 RNA 바이러스(MPV)를 제공하는데, 이때 계통학적 유사 분류는 100개의 부트스트랩(bootstraps)s 및 3개의 점블스(jumbles)를 이용하면, 조류 비강기관지염의 원인물질인 칠면조 비강기관지염 바이러스(TRTV)로 알려진 조류 뉴모바이러스(APV)의 바이러스 분리체에 상응하는 정도이상으로 I-2614(CNCM, Paris에 기탁된) 바이러스 분리체에 좀더 계통학적으로 근접하다는 것을 발견할 수 있는데, 이때, 테스트에 이용되는 적절한 단편은 바이러스의 바이러스성 단백질을 인코드하는 개방 해독틀이 된다.
적절한 개방 해독틀(ORF)은 N 단백질을 인코드하는 ORF로 구성된다. 분리체 I-1624의 N-단백질과 분서된 N-단백질이 적어도 91%, 적절하게는 95% 전반적인 아미노산 상동성이 발견되는 경우에, 분석된 바이러스 분리체는 본원 발명에 따른 적절한 MPV 분리체로 구성된 것이다. 나타낸 바와 같이, MPV 유전자 지도에서 첫 번WO 유전자는 394개 아미노산 단백질을 인코드하고, 다른 뉴모바이러스의 N 단백질과 상당한 상동성을 나타낸다. N ORF의 길이는 APV-C의 N ORF 길이와 동일하고(표 5), 다른 파라믹소바이러스의 것보다는 작다(Barr et al(1991)). 아미노산 서열 분석에서는 APV-C와 최대 상동성을 나타내고(88%), 다른 파라믹소바이러스와는 7-11%만의 상동성을 나타낸다(표 6). Barr et al(1991)은 모노네가비리알(Mononegavirales) 목(目)에 속하는 바이러스간에 세 군데 유사한 부분; A, B, C을 확인하였다. 같은 바이러스 과(科)내에 유사성이 가장 높으나, 이들 부분은 바이러스 과(科)간에도 상당히 보존된 것이다. 이들 전부에서, MPV는 APV-C와 97% 아미노산 상동성을, APV-B와는 89% 상동성을, APV-A와는 92% 상동성을, RSV 및 PVM와는 66-73% 상동성을 가지는 것으로 나타났다. 아미노산 잔기 160과 340사이에 부분은 메타뉴모바이러스간에 상당히 보존되어 있고, 뉴모비리네(Pneumovirinae)와는 다소 보존성이 떨어지는 것으로 보인다(Miyahara et al., 1992; Li et al., 1996; Barr et al., 1991). 이는 MPV가 메타뉴모바이러스라는 것과 일치하고, 이 특정 부분은 APV C와 99% 유사성을 나타낸다.
계통학 분석에 유용한 다른 적절한 개방 해독틀(ORF)은 P 단백질을 인코하는 ORF이다. 분리체 I-1624의 P-단백질과 분석된 P 단백질이 전체 아미노산 동질성에서 적어도 70%, 적절하게는 적어도 85% 정도가 될 경우에, 분석된 바이러스 분리체는 본원 발명에 따른 적절한 MPV 분리체로 구성된 것이다. 게놈 지도에서 두 번째 ORF는 294aa 단백질을 코드하는데, 이는 APV-C의 P 단백질과 68% aa 서열 상동성을 가지지만, RSV의 P 단백질과는 22-26%의 상동성을 가진다(표 6). MPV의 P 유전자는 실제 1개의 ORF를 가지고, 이는 많은 다른 파라믹소바이러스에서 취한 P와 유사한 것이다(Reviewed in Lamb and Kolakofsky, 1996; Sedlmeier et al., 1998). APV A, B; RVM와는 대조적이고, RSV, APV-C와는 유사하게, MPV P ORF는 시스테인잔기가 부족하다. Ling(1995)은 모든 뉴모바이러스간에 매우 유사성이 큰 부분(aa 185-241)이 뉴클레오캡시드 복합체의 구조적 일체성을 유지하거나 RNA 합성 과정에 중요한 역할을 한다고 제시한 바 있다. 높은 유사성을 가지는 이 부분이 MPV에서 발견되었는데, 특히 보전성 구성을 고려할 때, APV-C와는 100% 유사성을, APV-A, B와는 93% 유사성을, RSV와는 81% 유사성을 가지는 것으로 나타났다. MPV P의 C-말단은 글루타민 잔기가 많은 부분으로 APV에서 설명한 것과 같다(Ling et al., 1995).
계통학 분석에 유용한 다른 적절한 개방 해독틀(ORF)은 M 단백질을 인코하는 ORF이다. 분리체 I-1624의 M-단백질과 분석된 M 단백질이 전체 아미노산 동질성에서 적어도 94%, 적절하게는 적어도 97% 정도가 될 경우에, 분석된 바이러스 분리체는 본원 발명에 따른 적절한 MPV 분리체로 구성된 것이다. 게놈 지도에서 세 번째 ORF는 254aa 단백질을 코드하는데, 이는 다른 뉴모바이러스의 M ORF와 닮았다. MPV의 M ORF는 다른 메타뉴모바이러스의 M ORF와 동일한 크기를 가지고(표5), APV의 매트릭스 단백질과는 높은 aa 서열 상동성을 나타내고(76-87%), RSV, PVM는 조금 낮은 상동성을 나타내고(37-38%), 다른 파라믹소바이러스의 것과는 10% 또는 이하의 작은 상동성을 나타낸다(표 6). Easton(1997)은 모든 뉴모바이러스의 매트릭스 단백질 서열을 비교하여, 14 내지 19잔기에서 MPV에서도 보존되어 있는 보전된 핵사펩티드를 발견하였다(도 10). M의 주요 ORF내에 또는 이와 겹쳐지는 RSV, PVM, APV의 경우에, 작은 두 번째 ORF가 확인되었다(bRSV에서는 52aa와 51aa; RSV에서는 75aa; PVM에서는 46aa; APV에서는 51aa).(Yu et al., 1992; Easton et al., 1997; Samal et al., 1991; Satake et al., 1984). 우리는 MPV의 M ORF에서 두 개의 작은 ORF를 주목하였다. 54aa 잔기로 된 하나의 작은 ORF는 주요 M ORF에서 발견되었는데, 뉴클레오티드 2281에서 시작하는 것이고; 다른 작은 ORF은 33aa 잔기로 구성된 것으로 뉴클레오티드 2893에서 시작하는 M의 주요 ORF와 겹치는 것을 발견하였다(자료는 제공하지 않음). RSV와 APV의 두 번째 ORF와 유사하게, 다른 뉴모바이러스의 ORF와 이들 두 번째 ORF간에는 상당한 상동성은 없었고, 실제 시작 및 종료 신호가 결여되었다. 또한, APV와 RSV의 이들 두 번째 ORF에 상응하는 단백질이 합성된다는 증거도 보고된 바 없다.
계통학 분석에 유용한 다른 적절한 개방 해독틀(ORF)은 F 단백질을 인코하는 ORF이다. 분리체 I-1624의 F-단백질과 분석된 F 단백질이 전체 아미노산 동질성에서 적어도 95%, 적절하게는 적어도 97% 정도가 될 경우에, 분석된 바이러스 분리체는 본원 발명에 따른 적절한 MPV 분리체로 구성된 것이다. MPV의 F ORF는 M ORF에 인접하게 위치하고 있으며, 이는 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속 구성원간에 특징이 된다. MPV의 F 유전자는 539aa 단백질을 코드하는데, 이는 APV-C F보다 두 개 aa 잔기가 더 많은 것이다(표 5). aa 서열 분석에서, APV-C와는 81% 상동성을 가지고, APV-A, B와는 67% 상동성을, 뉴모바이러스 F 융합단백질과는 33-39% 상동성을 가지고, 다른 파라믹소바이러스와는 10-18%정도의 상동성을 가진다(표 6). 파라믹소바이러스의 F 단백질간에 보존된 특징중에 하나이고, MPV에서도 볼 수 있는 특징은 시스테인 잔기의 분포이다(Morrison, 1988; Yu et al., 1991). 메타뉴모바이러스는 F1에서 12개의 시스테인 잔기를 공유한다(7개는 모든 파라믹소바이러스에서 보존된 것이다); F2에서는 2개를 공유한다(1개는 모든 파라믹소바이러스에서 보존된 것이다). MPV의 F ORF에 있는 3개의 N-연결된 글리코실화 가능 부분중에 어느 것도 RSV와 공유하지는 않으며, APV와는 두 개 부분(위치 66과 389)이 공유한다. MPV에서 세 번째, 독특한 N-연결된 글리코실화 가능 부분은 위치 206이다(도 11). 다른 파라믹소바이러스와는 상동성이 적지만, MPV의 F 단백질은 다른 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)의 F 단백질에서 설명한 것과 일치하는 전형적인 융합 단백질 특징을 나타낸다(Morrison, 1988). 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)의 F 단백질은 불활성 전구체(F0)로 합성되어, 숙주 세포 단백질분해효소에 의해 절단되어, 아미노 말단 F2 소단위와 큰 카르복시 말단 F1 소단위로 된다. 절단 부분으로 알려진 위치는(Collins et al., 1996) 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)내서 보존되어있다. MPV의 절단 부위는 잔기 RQSR를 포함한다. 아르기닌(R) 잔기는 APV, RSV와 공유하나, 글루타민(Q), 세린(S) 잔기는 사람의 파라인플루엔자 바이러스 타입 1(human parainfluenza virus type 1), 센다이 바이러스(Sendai virus), 모르빌리바이러스(morbilliviruses)와 같은 다른 파라믹소바이러스와 공유한다(자료 제공하지 않음). F1의 아미노 말단에 있는 소수성 부분은 막 융합 도메인으로 기능을 하는 것으로 보이고, 파라믹소바이러스 및 모르빌리바이러스 간에 상당한 서열 상동성을 나타내고, 뉴모바이러스와는 그 정도가 덜한 것으로 나타났다(Morrison, 1988). 이들 26개 잔기(위치 137-163, 도 11)는 MPV 및 APV-C간에 보존되어있는데, 이는 이 부분이 메타뉴모바이러스간에 상당히 보존된 부분이라는 것과 일치한다(Naylor et al, 1998; Seal et al., 2000).
APV 및 다른 파라믹소바이러스의 F 2 소단위에서 볼 수 있는 것과 같이, MPV는 RSV와 비교하였을 때, 22개 aa 잔기가 결손된 것으로 나타났다(위치 107-128, 도 11). 또한, RSV 및 APV의 경우에, 신호 펩티드 및 고정 도메인이 서브타입내에서 보존되어 있으며, 이는 서브타입간에 상당한 다양성을 나타내는 것으로 나타났다(Plows et al., 1995; Naylor et al., 1998). F2 아미노 말단에서 MPV(aa 10-35, 도 11)의 신호 펩티드는 APV-C와는 어느 정도의 서열 유사성을 나타내는데(26개 aa 잔기중에 18개가 유사), 다른 APV나 RSV와는 보존성이 적다. APV-C와 약간의 상동성을 나타내기는 하지만, F1의 카르복시 말단에 있는 막 고정 도메인에서는 훨씬 많은 다양성이 나타난다.
계통학 분석에 유용한 다른 적절한 개방 해독틀(ORF)은 M2 단백질을 인코하는 ORF이다. 분리체 I-1624의 M2-단백질과 분석된 M2 단백질이 전체 아미노산 동질성에서 적어도 85%, 적절하게는 적어도 90% 정도가 될 경우에, 분석된 바이러스 분리체는 본원 발명에 따른 적절한 MPV 분리체로 구성된 것이다. M2 유전자는 뉴모바이러스(Pneumovirus)에 독특한 것이고, 두 개의 겹쳐지는 ORF가 모든 뉴모바이러스에서 관찰되었다. 첫 번째 주요 ORF는 바이러스 중합효소의 진행성을 강화시키는 M2-1 단백질을 나타내고(Collins et al., 1995; Collins, 1996), 유전자 내 부분에 해독부분을 나타낸다(Hardy et al., 1998; Fearns et al., 1999). F 유전자에 인접하게 있는 MPV의 M2-1 유전자는 187aa 단백질을 인코드하고(표 5), APV-C의 M2-1과 최대 상동성(84%)을 나타낸다(표 6). 모든 뉴모바이러스와 비교하였을 때, M2-1는 단백질의 아미노-말단 절단에서 최대한으로 보존된 것으로 볼 수 있는데(Collins et al., 1990; Zamora et al., 1992; Ahmadian et al., 1999), 이는 MPV가 단백질의 처음 80개 aa 잔기에서 APV-C와 100% 유사성을 나타낸다는 것과 일치한다(도 12A). MPV M2-1 단백질에는 처음 30aa 잔기내에 위치하고 있는 3개의 시스테인을 포함하는데, 이는 모든 뉴모바이러스종간에 보존된 것이다. 이와 같은 시스테인 농도는 아연이 결합된 단백질에서 흔히 볼 수 있다(Ahmadian et al., 1991; Cuesta et al., 2000). 뉴모바이러스의 M2-1 ORF와 겹쳐지는 두 번째 ORF2(M2-2)는 위치에서는 보존된 편이나 서열에서는 보존된 것이 아니어서 이는 바이러스 RNA 복제 및 전사간의 전환 제어가 관계된 것으로 보고 있다(Collins et al., 1985; Elango et al., 1985; Baybutt et al., 1987; Collins et al., 1990; Ling et al., 1992; Zamore et al., 1992; Alansari et al., 1994; Ahmadian et al., 1999; Bermingham et al., 1999). MPV의 경우에, M2-2 ORF는 M2-1 ORF에서 뉴클레오티드 512에서 출발하는데(도 7), 이는 APV-C의 경우와 동일한 출발점이다. M2-2 ORF의 길이는 APV-C, MPV와 동일한 길이, 즉, 71aa 잔기가 된다. M2-2 ORF 서열 비교에서, MPV와 APV-C간에는 56% 아미노산 서열 상동성을 나타내고, MPV, APV-A, Brks에는 26-27%만의 서열 상동성을 나타낸다(표 6).
계통학 분석에 유용한 다른 적절한 개방 해독틀(ORF)은 L 단백질을 인코하는 ORF이다. 분리체 I-1624의 L-단백질과 분석된 L 단백질이 전체 아미노산 동질성에서 적어도 91%, 적절하게는 적어도 95% 정도가 될 경우에, 분석된 바이러스 분리체는 본원 발명에 따른 적절한 MPV 분리체로 구성된 것이다. 다른 네거티브 가닥 바이러스와 비교에서, MPV 게놈의 마지막 ORF는 복제 및 전사 복합체의 RNA-의존성 RNA 중합효소 성분이다. MPV의 L 유전자는 2005개의 aa 단백질을 코드하는데, 이는 APV-A 단백질의 것보다 1개 잔기가 더 많은 것이다(표 5). MPV의 L 단백질은 APV-A와는 64% 유사성을 가지고; RSV와는 42-44% 유사성을 가지고, 다른 파라믹소바이러스와는 약 13%의 유사성을 가진다(표 6). Poch et al.(1989; 1990)에서는 분절안된 네거티브 가닥 RNA 바이러스내에 6개의 보존된 도메인을 확인하였는데, 이들 도메인중 도메인 III는 중합효소 기능에 필수적인 것으로 간주되는 네가지 핵 중합효소 모티프를 포함한다. 이들 모티프(A, B, C, D)는 MPV L 단백질에서 아주 잘 보존되어 있고, 모티프 A, B, C에서는 MPV는 다른 모든 뉴모바이러스와 100% 유사성을 공유하고, 모티프 D에서 MPV는 APV와는 100% 유사성을 공유하고, RSV와는 92% 유사성을 공유한다. 전체 도메인 III에서(L ORF에서 aa 625-847), MPV는 APV와 83% 상동성을 공유하고, RSV와는 67-68% 상동성을 공유하고, 다른 파라믹소바이러스는 26-30%와 상동성을 공유한다(도 15). 또한, 중합효소 모티프에 추가하여, 뉴모바이러스 L 단백질에는 콘센서스 ATP 결합 모티프 K(X)21GEGAGN(X)20K(SEQ ID NO: 105)(Stec, 1991)에 준하는 서열을 포함한다. MPV L ORF에는 APV와 유사한 모티프를 포함하는데, 이때, APV는 중간 잔기의 공간이 하나 빠져있다; K(x)22GEGAGN(X)19K(SEQ ID NO: 106).
계통학 분석에 유용한 가장 적절한 개방 해독틀(ORF)은 SH 단백질을 인코하는 ORF이다. 분리체 I-1624의 SH-단백질과 분석된 SH 단백질이 전체 아미노산 동질성에서 적어도 30%, 적절하게는 적어도 50%, 가장 적절하게는 적어도 75% 정도가 될 경우에, 분석된 바이러스 분리체는 본원 발명에 따른 적절한 MPV 분리체로 구성된 것이다. MPV의 M2에 인접하여 위치한 유전자는 183개 aa 단백질을 인코드한다(도 7). 뉴클레오티드 서열 및 이의 유추한 아미노산 서열 분석에서는 다른 RNA 바이러스 유전자 또는 유전자 생성물과 뚜렷한 상동성이 나타나지는 않은 것으로 나타났다. MPV의 SH ORF는 현재까지 공지된 가장 긴 SH ORF이다.(표 5). SH ORF의 aa 잔기의 조성은 APV, RSV, MPV와 상대적으로 유사한데, 가장 큰 비중은 트레오닌 및 세린이다(MPV, APV, RSV A, RSV B, bRSV, PVM에서 각각 세린/트레오닌 함량 비는 22%, 18%, 19%, 20.0%, 21%, 28%이다). MPV의 SH ORF에는 10개의 시스테인 잔기를 포함하지만, APV SH에는 16개의 시스테인 잔기를 포함하고 있다. 모든 뉴모바이러스에는 N-글리코실화 가능 부위가 비슷한 개수를 가진다(MPV 2, APV 1, RSV 2, bRSV 3, PVM 4). MPV SH 단백질 및 APV의 SH, RSV의 소수성 프로파일은 유사한 구조적 특징을 가지는 것으로 나타났다(도 13B). APV 및 MPV의 SH ORF는 친수성 N-말단(aa 1-30); 잠재적인 막 연결 도메인으로 작용하는 중앙 소수성 도메인(aa 30-53); 잔기 160 부근의 두 번째 소수성 도메인; 친수성 C-말단을 가진다. 대조적으로, RSV SH는 APV 및 MPV ORF의 C-말단 절반이 부족한 것으로 나타났다. 모든 뉴모바이러스 SH 단백질에서, 소수성 도메인은 염기성 아미노산에 인접해 있는데, 이 또한, MPV의 SH ORF에서 볼 수 있는 것이다(aa 29, 54).
계통학 분석에 유용한 가장 적절한 개방 해독틀(ORF)는 G 단백질을 인코하는 ORF이다. 분리체 I-1624의 G-단백질과 분석된 G 단백질이 전체 아미노산 동질성에서 적어도 30%, 적절하게는 적어도 50%, 가장 적절하게는 적어도 75% 정도가 될 경우에, 분석된 바이러스 분리체는 본원 발명에 따른 적절한 MPV 분리체로 구성된 것이다. MPV의 G ORF는 SH 유전자에 인접하여 위치하는데, 이는 236개 aa 단백질을 인코드한다. 두 번째 작은 ORF가 이 ORF다음에 바로 나타나는데, 이는 68개 aa 잔기를 인코드하나(pos. 6973-7179), 출발 코돈을 가지고 있지 않다. 194개 aa 잔기로 된 상이한 개방 해독틀의 세 번째 주요 ORF는 이들 ORF 두 개와 겹쳐지나 시작 코돈이 없다(뉴클레오티드 6416-7000). 이 ORF 다음에는 동일한 개방 해독틀의 네 번째 ORF가 이어져 있는데(nt 7001-7198), 네 번째 ORF는 65개 aa 잔기를 코드하나, 시작 코돈을 가지고 있지 않다. 마지막으로, 97개 aa 잔기로 된 ORF(시작 코돈없음)이 세 번째 개방 해독틀에서 발견되었다(nt 6444-6737, 도 1). 첫 번째 ORF와는 달리, 다른 ORF는 실제 시작 코돈 또는 유전자 종료 서열이 없다(하기 참고). 236개 aa 잔기의 G ORF는 MPV 부착 단백질의 적어도 일부분이 되는 것 같지만, 추가 코딩 서열이 일부 RNA 교정과정을 통하여 부착 단백질의 일부분으로 또는 별개 단백질로 발현된다는 것을 배제할 수 없다. APV 및 RSV의 경우에, 주요 G ORF이후에 부차적인 ORF가 발견되지는 않았지만, APV 및 RSV는 모두 G의 주요 ORF내에 부차적인 ORF를 가지고 있었다. 그러나, 이들 ORF의 발견에 대한 증거가 부족하고, 상이한 바이러스에 대해 예상 aa 서열간에 상동성이 없었다(Ling et al., 1992). MPV G내에 부차적인 ORF는 다른 G 단백질의 성질을 나타내지 않았고, ORF가 추가로 발현되는지에 대해서는 더 조사를 해야 한다. 네 개 ORF 모두를 이용한 BLAST 분석에서 다른 공지의 바이러스 유전자 또는 유전자 생성물과 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 수준에서 특별한 상동성을 나타내지는 않았다. 이는 hRSV A, B(53%)(Johnson et al., 1987)와 APV A, B(38%)(Juhasz et al., 1994)와 같은 다른 G 단백질에서 볼 수 있는 상동성이 낮다는 것과 일치한다. MPV ORF의 대부분이 길이 및 서열에서 APV의 것과 닮았지만, MPV의 G ORF는 APV의 G ORF보다는 상대적으로 작았다(표 5). aa 서열에서는 세린과 트레오닌 함량이 32%로 나타났는데, 이는 RSV의 경우에 32%, APV의 경우에 24%보다 더 높은 것이다. G ORF는 또한, 8.5% 프롤린 잔기를 포함하는데, 이 또한 RSV의 경우에 8%, APV의 경우에 7%보다도 높은 것이다. 단백질의 3차 구조의 주요 결정 부분이 되는 뮤신 기원의 당 단백질에서도 APV, RSV, MPV의 G 단백질에서 비정상적으로 프롤린 잔기가 많다는 것이 관찰되었다(Collins et al., 1983; Wertz et al., 1985; Jentoft, 1990). MPV의 G 상에서 N-연결된 글리코실화 가능 부위의 수는 다른 뉴모바이러스의 수와 비슷하였다; MPV의 경우에는 5개; hRSV는 7개; bRSV는 5개; APV는 3 내지 5개를 가진다.
MPV G의 예상된 소수성 프로파일은 다른 뉴모바이러스와 비슷한 성질을 나타내었다. 아미노-단부에는 친수성 부분에 있어, 짧은 소수성 부분(aa 33-35), 주로 친수성인 카르복시 단부를 포함한다(도 14B). 전체적인 조직은 고정된 타입 II 막통과 단백질의 것과 일치하고, APV 및 RSV의 G 단백질에 있는 부분에 상응한다. MPV의 G ORF에는 1개의 시스테인 잔기를 가지는데, 이는 RSV와 APV의 것과는 대조적이다(각각 5개, 20개).
Francki, R.I.B., Faquet, C.M., Knudson, D.L., and Brown, F., Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the international committee on Taxonomy of Viruses. Arch Virol, 1991. Supplement 2: p. 140-144에서 볼 수 있는 실시예와 같은 고유의 혈청학적 분석에 따르면, MPV 분리체는 여기에서 제공하는 혈청타입에 속하는 것을 확인할 수 있고, 이는 동물의 항혈청(상세한 설명에서 제공하는 것과 같이 흰족제비 또는 기니아 피그에서 얻은 시료를 이용)을 이용한 정량적인 중화반응으로 결정하였을 때와 같이 면역학적 독특한 성질에 기초하여 정의된다. 이와 같은 혈청타입은 다른 것과는 교차 반응을 하지 않고, 양 방향에서 상동성에 대한 이형성 역가 비율이 >16을 나타내었다. 중화반응에서 일방 또는 양방향(상동성에 대한 이형성 역가는 8 또는 16)에서 두 개 바이러스간에 어느 정도의 교차 반응성을 나타내고, 실제 생체물리학적/생화학적으로 차이가 있는 DNA가 존재하는 경우에, 혈청타입의 독특하다고 할 수 있다. 중화반응에서 일방 또는 양방향에서 교차 반응이 뚜렷하게 나타나면(상동성에 대한 이형성 역가가 8보다 적은 경우), 분리체의 혈청타입이 상동성이 있다고 본다. 언급한 것과 같이, 분리체 I-2614와 같은 유용한 프로토타입 분리체, 또는 MPV 분리체 00-1를 제공한다.
여기에서 제공하는 것과 같이, 분리형 필수 포유류 네거티브-센스 단일 쇄 RNA로 바이러스를 추가 분류하는 것은 G 및 SH 단백질에 상동성을 기초하여 이루어진다. 일반적으로 APV(새에서 분리된)와 MPV(사람에서 분리된) N, P, M, F, M2, L ORF산에 전반적인 아미노산 서열 상동성이 64 내지 88이 되고, APV와 MPV의 넌-코딩 부분에서 뉴클레오티드 서열 상동성이 발견되었고, 기본적으로는 사람의 분리체(MPV)의 ORF중 두 개와 다른 파라믹소바이러스의 ORF중 임의의 것 사이에는 뚜렷한 아미노산 서열 상동성이 발견되지 않았다. 바이러스 게놈에서 아미노산 함량, 친수성 프로파일, 이들 ORF의 위치는 이들이 G와 SH 단백질 유사체를 나타낸다는 것을 보여준다. APV 및 MPV간에 서열 상동성, 이들의 유사한 게놈 구조(3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5'), 계통학적 분석은 첫 번째로 포유류 메타뉴모바이러스로 MPV가 분류된다는 것을 보여주는 증거가 된다. 새로운 MPV 분리체는 바이러스 분리, tMK 또는 다른 세포상에서의 특징, RT-PCR 또는 서열 분석, 계통학 구조 분석, 바이러스 중화검사와 같은 혈청학적 기술, 간접 면역 형광 검사, 직접 면역형광 검가, FAC 분석, 또는 다른 면역학적 기술을 이용하여 확인될 수 있다.
가령, 본원 발명은 본원에 제시된 MPV의 추가 분리체를 동정하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 필수적으로 MPV-감염되지 않은 또는 특이적-병원균-없는 기니아 피그나 흰족제비(상세한 설명에서 동물은 비강내 접종하지만 근육내 혹은 피내 접종과 같은 다른 접종 방법이 가능하고, 다른 실험 동물을 이용하는 것도 가능하다)을 프로토타입(prototype) 분리체 I-2614 또는 관련된 분리체로 접종하는 단계로 구성된다. 혈청은 0일, 접종후 2주, 3주 시점에 동물로부터 수집한다. 동물은 바이러스 중화(VN) 분석 및 개별 분리체 I-2614에 대한 간접적인 IFA에서 측정된 바와 같이 특이적으로 혈청전환(seroconvert)하고, 혈청전환된 동물로부터 얻은 혈청은 상기 추가 분리체의 면역학적 검출에 사용된다.
예로써, 본원 발명은 사람에서 중증의 RTI를 유발할 수 있는 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)의 새로운 구성원, 사람 메타뉴모바이러스(metaneumovirus) 또는 메타뉴모바이러스-유사 바이러스(MPV)의 특성화를 제시한다(이의 최종 분류는 바이러스 분류 위원회의 논의를 기다리고 있으며, 본원의 MPV는 APV와 분류학적으로 상응한다). MPV에 의해 유발되는 질환의 임상적 징후는 hRSV에 의해 유발되는 임상적 징후, 예를 들면 기침, 근육통, 구토, 열병, 세기관지염이나 폐렴, 결막염 또는 이들의 합병증과 거의 유사하다. hRSV에서처럼, 감염된 어린이, 특히 나이가 매우 적은 어린이는 입원을 요할 수도 있다. 예로써, 2001년 1월 19일 CNCM, Institute Pasteur, Paris에 I-2614로 기탁된 MPV, 또는 이와 계통유전학적으로 상응하는 바이러스 분리체를 여기에 제시한다. 따라서, 본원 발명은 도 6a, 6b, 6c에 도시된 핵산 서열과 계통유전학적으로 상응하거나 이들과 구조적으로 상응하는 핵산 또는 기능적 단편을 포함하는 바이러스를 제시한다. 특히, 본원 발명은 100개의 부트스트랩(bootstrap)과 3개의 점블(jumble)을 이용하여 최대 유사성 트리를 산출하는 계통유전학적 트리 분석법으로 검증이후 조류 비기관염의 병인인 칠면조 비기관염 바이러스(TRIV)로 알려져 있는 조류 독감바이러스(APV)의 바이러스 분리체보다는 CNCM, Paris에 I-2614로 기탁된 바이러스 분리체에 계통유전학적으로 좀더 상응하는 것으로 특성화되는 바이러스를 제시한다. 상기 계통유전학적 트리 분석에서 외집단(outgroup)으로 AVP-C 바이러스 분리체를 사용하는 것이 특히 유용한데, 상기 분리체는 가장 가까우면서 필수적으로 비-포유동물 바이러스이다.
우리는 여러 관찰에 기초하여 새로운 사람 바이러스를 사람 메타뉴모바이러스 또는 메타뉴모바이러스-유사 바이러스(MPV)로 명명할 것으로 제안한다. EM 분석에서 파라믹소비리데-유사 입자가 확인되었다. 분류에 맞게, MPV는 클로로포름 치료에 민감한 것으로 나타났다. MPV는 tMK 세포에서 최적 배양되고 트립신 의존성이다. MPV에 의해 유발된 증상 및 전형적인 CPE와 혈구응집 활성의 결핍은 이 바이러스가 hRSV와 밀접하게 연관한다는 것을 암시한다. 대부분의 파라믹소바이러스가 혈구응집 활성을 갖고 있지만, 대부분의 뉴모바이러스는 그렇지 않다.
예로써, 본원 발명은 중증 RTI를 앓는 28명의 어린이로부터 취한 비인후 흡입물 검체로부터 이전에 동정되지 않았던 파라믹소바이러스를 제시한다. 이들 어린이의 임상적 증상은 hRSV에 의해 유발되는 증상과 거의 유사하였다. 27명의 환자는 5세 미만의 어린이였고, 이들중 절반은 1 내지 12개월이었다. 다른 환자는 18세이었다. 모든 개체는 상부 RTI로 인해 기침, 근육통, 구토, 열병, 세기관지염, 중증 폐렴 증상을 보였다. 이들 환자중 대부분은 1 내지 2주동안 입원하였다.
이들 환자로부터 분리된 바이러스는 네거티브 위상차 전자 현미경에서 파라믹소바이러스 형태를 가졌지만 공지된 사람과 동물 파라믹소바이러스에 특이적인 항혈청과 반응하지 않았다. 이들은 2가지 분리체에서 만들어진 혈청을 이용한 간접적인 면역형광 분석(IFA)에서 서로 밀접하게 연관하는 것으로 확인되었다. 이들 분리체중 9개의 서열분석에서 상기 바이러스가 APV와 다소 연관한다는 것이 밝혀졌다. 바이러스학적 데이터, 서열 상동성, 게놈 조직에 기초하여, 우리는 상기 바이러스가 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속의 한 구성원이라고 제안한다. 혈청학 조사에서, 상기 바이러스는 네덜란드에서 혈청우세(seroprevalence)가 5세이하 어린이에서 거의 100%에 육박하기 때문에 상대적으로 흔한 병원균인 것으로 나타났다. 게다가, 혈청우세는 1958년에 사람으로부터 수집된 혈청에서 동등하게 높았는데, 이는 상기 바이러스가 40년이상동안 사람 개체군에 유포되고 있었다는 것을 시사한다. 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속의 이런 새로운 구성원의 동정은 바이러스 호흡기 감염에서 진단 분석의 수단과 방법, 검사 키트와 백신 또는 혈청이나 항체 조성물의 개발 및 MPV 감염의 치료에 유용한 항바이러스를 검사 혹은 선별하는 방법을 결과한다.
이런 측면에서, 본원 발명은 본원 발명에 따른 바이러스로부터 수득가능한 분리되거나 재조합된 핵산 또는 이의 바이러스-특이적인 기능적 단편을 제시한다. 특히, 본원 발명은 MPV 핵산을 동정하는데 적합한 프라이머 및/또는 프로브를 제시한다.
또한, 본원 발명은 본원 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터를 제시한다. 우선, MPV 게놈(또는 이의 일부)을 보유하는 플라스미드 벡터, MPV 게놈(또는 이의 일부)을 보유하는 바이러스 벡터(예, 파라믹소바이러스, 우두 바이러스, 레트로바이러스, 바쿨로바이러스) 또는 다른 바이러스나 병원균의 게놈(또는 이의 일부)을 보유하는 MPV와 같은 벡터를 제시한다. 이에 더하여, 2가지 중요 파라미터에 기초하여 재조합 네거티브 가닥 바이러스의 생산을 위한 다양한 역 유전 기술을 기술한다. 첫째, 이런 바이러스의 생산은 네거티브 센스 바이러스 RNA(vRNA) 게놈 또는 이의 상보적 사본(cRNA)의 부분이나 전장 사본의 복제에 의존한다. 상기 vRNA 또는 cRNA는 감염성 바이러스로부터 분리되거나, 시험관내 전사후ㆍ생산되거나 또는 핵산의 트랜스펙션후 세포에서 생산될 수 있다. 둘째, 재조합 네거티브 가닥 바이러스의 생산은 기능적 중합효소 복합체에 의존한다. 전형적으로, 뉴모바이러스의 중합효소 복합체는 N, P, L, M2 단백질로 구성되지만 이들에 국한되지 않는다. 중합효소 복합체 또는 이의 구성요소는 바이러스 입자로부터 분리되거나, 한가지이상 구성요소를 발현하는 세포로부터 분리되거나 또는 특정 발현 벡터의 트랜스펙션후 생산될 수 있다.
MPV의 감염성 사본은 전술한 vRNA, cRNA, 또는 이들 RNA를 발현하는 벡터가 전술한 중합효소 복합체16 ,17,18,19,20,21,22에 의해 복제될 때 수득될 수 있다. MPV 게놈의 대부분이나 전부를 포함하는 전장 사본을 산출하기 위한 미니레플리콘 또는 역 유전 시스템의 생산을 위하여, 예로써 APV(Randhawa et al., 1997) 또는 MPV 자체로부터 수득가능한 3'말단 및/또는 5'말단 핵산 서열을 이용하면 충분한다.
또한, 본원 발명은 본원 발명에 따른 핵산이나 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제시한다. MPV의 중합효소 구성요소(아마도 N, P, L, M2, 하지만 이들에 국한되지 않음)를 보유하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 적절한 세포형(박테리아, 곤충세포, 진핵세포)에서 이들 구성요소의 발현을 위하여 원핵세포에서 산출된다. MPV 게놈의 전장이나 일부 사본을 보유하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 시험관내 혹은 생체내에서 바이러스 핵산의 발현을 위하여 원핵세포에서 산출된다. 후자 벡터는 키메라 바이러스 또는 키메라 바이러스 단백질의 생산을 위하여 다른 바이러스 서열을 보유하거나, 복제 결함성 바이러스의 생산을 위하여 바이러스 게놈의 일부가 결핍되거나 또는 약독화된 바이러스의 생산을 위하여 돌연변이, 결실 혹은 삽입을 보유할 수 있다.
MPV(야생형, 약독화, 복제-결함성 또는 키메라)의 감염성 사본은 전술한 최신 기술에 따라 중합효소 구성요소의 동시-발현후 생산될 수 있다.
이에 더하여, 한가지이상 전장이나 부분 MPV 단백질을 일시적으로 또는 안정적으로 발현하는 진핵세포가 사용될 수 있다. 이런 세포는 트랜스펙션(단백질이나 핵산 벡터), 감염(바이러스 벡터) 또는 형질도입(바이러스 벡터)으로 만들 수 있는데, 전술한 야생형, 약독화, 복제-결함성 또는 키메라 바이러스의 상보성(complementation)에 유용하다.
키메라 바이러스는 2가지이상 바이러스23 ,24,26으로부터 보호하는 재조합 백신의 산출에 특히 유용하다. 가령, RSV의 한가지이상 단백질을 발현하는 MPV 바이러스 벡터 또는 MPV의 한가지이상 단백질을 발현하는 RSV 벡터는 이런 벡터로 예방접종된 개체를 양 바이러스 감염으로부터 보호할 것으로 예상된다. 유사한 접근방식은 PI3 또는 다른 파라믹소바이러스에 적용될 수 있다. 약독화 바이러스와 복제-결함성 바이러스는 다른 바이러스에서처럼 생균 백신을 이용한 예방접종에 사용될 수 있다.
적절한 구체예에서, 본원 발명은 본원 발명에 따른 핵산으로 인코드되는 단백질성 분자나 메타뉴모바이러스-특이적 바이러스 단백질 또는 이의 기능적 단편을 제시한다. 유용한 단백질성 분자는 예로써 본원 발명에 따른 바이러스부터 유도가능한 유전자 또는 게놈 단편으로부터 유래된다. 본원에서 제시된 이런 분자 또는 이의 항원성 단편은 예로써 진단 방법이나 키트 및 아단위 백신과 같은 제약학적 조성물에 유용하다. 항원이나 아단위 면역원으로 봉입을 위한 F, SH 및/또는 G 단백질, 또는 이의 항원성 단편이 특히 유용하지만, 불활화된 전체 바이러스 역시 사용될 수 있다. 계통유전학적 분석에서 동정된 재조합 핵산 단편에 의해 인코드되는 단백질성 물질 역시 유용한데, 이들은 생체내(예, 보호 목적이나 진단 항체 제공을 위하여) 또는 시험관내(예, 합성 항체를 산출하는데 유용한 파아지 전시 기술 또는 다른 기술로) 계통유전학적 분석에서 특히 MPV 특이적 항체를 유도하는데 유용한 ORF의 범위내에 존재한다.
또한, 본원 발명에 따른 단백질성 분자 혹은 MPV-특이적인 기능적 단편을 포함하는 항원과 특이적으로 반응하는 자연 다클론이나 단클론 항체 또는 합성(예, (파아지)라이브러리-유래된 결합 분자) 항체를 제시한다. 이런 항체는 MPV로 바이러스 분리체를 동정하는 방법에 유용한데, 상기 방법은 상기 바이러스 분리체 또는 이의 구성요소를 본원에 제시된 항체와 반응시키는 단계로 구성된다. 이는 예로써 정제되거나 정제되지 않은 MPV 또는 이의 일부분(단백질, 펩티드)으로 ELISA, RIA, FACS 또는 유사한 형식의 항원 검출 분석법(Current Protocols in Immunology)을 이용하여 달성할 수 있다. 대안으로, 감염된 세포 또는 세포 배양액이 고전적인 면역형광이나 면역조직화학적 기술로 바이러스 항원을 동정하는데 사용될 수 있다.
MPV로 바이러스 분리체를 동정하는 다른 방법은 특히 포유동물 바이러스가 사람 바이러스인 경우에, 상기 바이러스 분리체 또는 이의 구성요소를 본원 발명에 따른 바이러스 특이적 핵산과 반응시키는 단계로 구성된다.
이런 방식으로, 본원 발명은 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)의 아과 뉴모비리네(Pneumovirinae)의 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)속으로 동정될 가능성이 높은 네거티브-센스 단일 가닥 RNA 바이러스에 분류학적으로 상응하는 포유동물 바이러스로 본원 발명에 따른 방법으로 동정가능한 바이러스 분리체를 제시한다.
상기 방법은 포유동물의 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단하는 방법으로 유용한데, 상기 방법은 상기 포유동물의 시료를 본원 발명에 따른 핵산이나 항체와 반응시켜 상기 시료에서 바이러스 분리체 또는 이의 구성요소의 존재를 확인하는 단계로 구성된다. PCR(또는 당분야에 공지된 다른 증폭이나 혼성화 기술)의 이용, 또는 면역형광 검출(또는 당분야에 공지된 다른 면역학적 기술)의 이용과 같은 실례는 상세한 설명에 상세하게 기술한다.
본원 발명은 또한, 포유동물의 MPV 감염을 혈청학적으로 진단하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 상기 포유동물의 시료를 본원 발명에 따른 단백질성 분자나 이의 단편 또는 항원과 반응시켜 상기 시료에서 MPV 혹은 이의 구성요소에 특이적으로 항체의 존재를 확인하는 단계로 구성된다.
본원에서 밝힌 방법과 수단은 바이러스학적 또는 혈청학적 진단에서 MPV 감염을 진단하는 진단 키트에 특히 유용하다. 이런 키트 또는 분석물은 본원 발명에 따른 바이러스, 핵산, 단백질성 분자나 이의 단편, 항원 및/또는 항체를 포함한다. 본원 발명에 따른 바이러스, 핵산, 단백질성 분자나 이의 단편, 항원 및/또는 항체는 예로써, 특히 사람에서 MPV 감염의 치료나 예방 및/또는 호흡기 질환의 치료나 예방을 위한 제약학적 조성물의 생산에도 사용된다. 바이러스의 약독화는 다른 종의 관련된 바이러스 사용, 실험실 동물을 통한 연속 계대배양 및/또는 조직/세포 배양, 분자 클론의 특정부위 돌연변이유발, 관련된 바이러스간 유전자나 유전자 단편의 교환이 포함하지만 이들에 국한되지 않는 이런 목적으로 개발된 기존의 방법으로 달성할 수 있다.
본원 발명에 따른 바이러스, 핵산, 단백질성 분자나 이의 단편, 항원 및/또는 항체를 포함하는 제약학적 조성물은 예로써 MPV 감염 및/또는 호흡기 질환을 치료 혹은 예방하는 방법에 사용될 수 있는데, 상기 방법은 본원 발명에 따른 제약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계로 구성된다. 이는 상기 개체가 5살 미만의 사람일 때 가장 유용한데, 그 이유는 유아와 어린이가 전술한 바와 같이 사람 MPV에 감염될 가능성이 가장 높기 때문이다. 일반적으로, 급성 단계에서 환자는 다른 호흡기 질환을 전조하는 상부 호흡기 증상을 보인다. 하부 호흡기 질환은 다른 좀더 중증의 질환을 전조한다.
본원 발명은 또한, 호흡기 질환의 치료에 유용한 항바이러스제를 수득하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 본원 발명에 따른 바이러스를 포함하는 세포 배양액이나 실험 동물을 확립하고, 상기 배양액이나 동물을 후보 항바이러스제로 처리하고, 상기 바이러스 또는 상기 배양액이나 동물의 감염에 대한 상기 약물의 효과를 확인하는 단계로 구성된다. 이런 항바이러스제의 전형은 본원에 제시된 MPV-중화 항체 또는 이의 기능적 구성요소를 포함하지만, 다른 성격의 항바이러스제도 수득된다. 본원 발명은 또한, 제약학적 조성물, 특히 MPV 감염에 의해 유발되는 호흡기 질환의 치료를 위한 제약학적 조성물의 제조에서 본원 발명에 따른 항바이러스제의 용도를 제시하고, MPV 감염이나 호흡기 질환을 치료 혹은 예방하는 방법에 유용하고 본원 발명에 따른 항바이러스제를 함유하는 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 방법은 이런 제약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계로 구성된다.
본원 발명은 상세한 설명에서 구체적으로 설명한다.
1980년부터 2000년까지 중증 호흡기 질환 환자로부터 이전에 동정되지 않았던 28가지의 바이러스 분리체를 발견하였다. 이들 비동정된 28가지 바이러스 분리체는 tMK 세포에서는 천천히 성장하고, VERO 세포와 A549 세포에서는 성장이 불량하며 MDCK 또는 병아리 배아 섬유아세포에서는 거의 증식하지 않았다. 이들 바이러스 분리체 대부분은 10일과 14일 사이에 tMK 세포에서 3회 계대배양후 CPE를 유도하였다. 이런 CPE는 tMK 세포 또는 다른 세포 배양액에서 hRSV 또는 hPIV 의해 유도되고 합포체 형성으로 특성화되는 CPE와 실제로 구별되지 않았는데, 합포체 형성이후 세포는 급속 내부 파괴를 보이고 이후 단층으로부터 세포가 이탈하였다. 일반적으로, 이들 세포는 원천 물질로부터 3회 계대배양후 hRSV 또는 hPIV와 같은 다른 바이러스에 의해 유도되는 CPE보다 다소 늦은 접종후 10일 내지 14일에 CPE를 보였다.
짧은 외피 돌출이 13 내지 17 나노미터이고 150 내지 600 나노미터 범위의 파라믹소바이러스-유사 입자의 존재를 확인하는 EM 분석에 감염된 tMK 세포의 상층액을 사용하였다. 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)와 같은 외피 바이러스의 생물학적 특성과 일관하게, 표준 클로로포름 또는 에테르 처리는 tMK 세포에 대한 감염성의 >104TCID50 감소를 유발하였다. 바이러스-감염된 tMK 세포 배양 상층액은 칠면조, 병아리, 기니아 피그 적혈구에서 혈구응집활성을 보이지 않았다. 배양동안, 바이러스 복제는 검사된 세포에서 트립신 의존성으로 나타났다. 이들 바이러스학적 데이터는 새로 동정된 바이러스가 분류학적으로 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)의 구성원이라는 것을 암시한다.
파라믹소바이러스(Paramyxovirinae 9), hPIV 1-4, 센다이 바이러스, 5형 원숭이 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, hRSV, 홍역, 이하선염, 니파(Nipah), 헨드라(Hendra), 투피아(Tupaia), 마푸에라(Mapuera) 바이러스에 특이적인 프라이머-세트를 이용하여 역 전사와 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 분석을 위하여 15가지의 동정되지 않은 바이러스로 감염된 tMK 세포로부터 RNA를 분리하였다. RT-PCR 분석은 잠재적으로 관련된 바이러스를 검출하기 위하여 낮은 엄밀도에서 실시하고, 상동성 바이러스 스톡으로부터 분리된 RNA는 대조군으로 이용하였다. 이용가능한 대조군이 개별 바이러스-특이적 프라이머와 양성 반응을 보이는 반면, 새로 동정된 바이러스는 임의의 프라이머 세트와 반응하지 않았는데, 이는 상기 바이러스가 검사된 바이러스와 밀접하게 연관하지 않는다는 것을 암시한다.
2가지의 바이러스-감염된 tMK 세포 배양 상층액을 사용하여 기니아 피그와 흰족제비을 비강내 접종하였다. 혈청은 접종후 0일, 2주, 3주에 이들 동물로부터 수집하였다. 이들 동물은 임상적 증상을 보이지는 않았지만, 상동성 바이러스에 대한 바이러스 중화(VN) 분석 및 간접적인 IFA에서 혈청전환이 확인되었다. 혈청은 간접적인 IFA에서 전술한 공지된 파라믹소바이러스 및 PVM과 반응하지 않았다. 이후, 기니아 피그와 흰족제비 감염전후 혈청으로 기존에 동정되지 않았던 바이러스 분리체가 선별되었는데, 이들중 28가지는 감염후 혈청과의 간접 IFA에서 분명하게 양성이었는데, 이들이 혈청학적으로 밀접하게 관련되거나 또는 동일하다는 것을 암시한다.
RAP PCR
미지의 바이러스 분리체에 대한 서열 정보를 얻기 위하여, RAP-PCR10으로 알려진 무작위 PCR 증폭 전략을 이용하였다. 이를 위하여, tMK 세포는 바이러스 분리체중 하나(분리체 00-1)와 대조군 hPVI-1로 감염시켰다. 양 배양액이 유사한 수준의 CPE를 보이면, 배양 상층액에서 바이러스는 연속 20-60% 슈크로즈 그레디언트에서 정제하였다. 농도 구배된 분취물은 EM으로 바이러스-유사 입자를 검사하고, RNA는 대략 50% 슈크로즈를 함유하는 분취물로부터 분리되었는데, 여기서 뉴클레오캡시드가 관찰되었다. 양 바이러스 분취물로부터 분리된 동등 함량의 RNA는 RAP-PCR에 사용하고, 이후 시료는 3% NuSieve 아가로즈 겔에서 나란히 동작시킨다. 동정되지 않은 바이러스에 특이적인 20개의 상이하게 나타난 밴드는 겔로부터 후속으로 정제하고 플라스미드 pCR2.1(Invitrogen)에 클론하고 벡터-특이적 프라이머로 서열분석하였다. 이들 서열을 이용하여 BLAST 소프트웨어(/BLAST/)로 GenBank 데이터베이스상의 서열과 상동성을 검색하였을 때, 20개의 단편중 10개가 APV/TRTV 서열에 유사성을 보였다.
이들 10개의 단편은 핵단백질(N; 단편 1과 2), 매트릭스 단백질(M; 단편 3), 융합단백질(F; 단편 4,5,6,7), 중합효소 단백질(L; 단편 8,9,10)을 코딩하는 유전자에 위치하였다(도 2). 이후, 본원의 RAP PCR 단편 및 뉴모바이러스(Pneumovirinae 6 )에 대한 공개된 리더와 테일러 서열에 기초하여 바이러스 게놈의 3'단부에 대한 서열 정보를 완결하는 PCR 서열을 설계하였다. 이들 단편은 증폭하였는데, 이들중 단편 A는 N 개방해독틀(ORF)의 3'최말단에 걸쳐 있고, 단편 B는 인단백질(P) ORF에 걸쳐 있고, 단편 C는 M과 F ORF간 간격을 메웠다(도 2). 이들 3가지 단편의 서열분석에서 바이러스 게놈의 3'최말단에서 NS1와 NS2 ORF의 부재 및 M ORF에 인접하는 F ORF의 위치가 확인되었다. 이런 게놈 조직은 메타뉴모바이러스 APV의 조직과 유사한데, 이는 서열 상동성과도 일치한다. 전체적으로, N, P, M, F ORF에서 번역된 서열은 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속 구성원과 평균 30-33% 상동성 및 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속 구성원과 평균 66-68% 상동성을 보였다. SH와 G ORF의 경우에, 이들 속 구성원과 식별가능한 상동성이 발견되지 않았다. N에서 발견된 아미노산 상동체는 예로써 도 3의 아미노산 서열과 다른 바이러스의 개별 N 단백질의 아미노산 서열을 비교한 추정에서 hRSV와 대략 40% 상동성 및 이의 유전학적으로 가장 근접한 APV-C와 88% 상동성을 보였다. P에 대한 아미노산 서열은 hRSV와 대략 25% 상동성, APV-C와 66-68% 상동성을 보였고, M은 hRSV와 대략 36-39% 상동성, APV-C와 대략 87-89% 상동성 보였고, F는 hRSV와 대략 40% 상동성, APV-C와 대략 87-89% 상동성을 보였고, M2-1은 뉴모바이러스와 대략 34-36% 상동성, APV-C와 대략 84-86% 상동성을 보였고, M2-2는 뉴모바이러스와 대략 15-17% 상동성, APV-C와 대략 56% 상동성을 보였고, L에서 수득된 단편은 뉴모바이러스와 평균 44% 상동성, APV-C와 대략 64% 상동성을 보였다.
계통유전학
동정되지 않은 바이러스 분리체로부터 얻은 뉴클레오티드 서열을 이용한 BLAST 검색에서 뉴모바이러스와 구성원과 일차적으로 상동성이 확인되었지만, 단백질 서열에 기초한 상동체는 다른 파라믹소바이러스와도 일부 유사성을 보였다. 새로 동정된 바이러스 분리체와 뉴모비리네(Pneumovirinae) 구성원간 상관관계의 지표로서, 계통유전학적 트리는 이들 바이러스의 N, P, M, F ORF에 기초하여 구성되었다. 모드 4개의 계통유전학적 트리에서, 새로 동정된 바이러스 분리체는 APV와 가장 연관하였다.(도 4). 밝혀진 4가지 APV 혈청형에서, USA의 조류에서 주로 발견되는 메타뉴모바이러스인 APV 혈청형 C가 새로 동정된 바이러스와 가장 높은 유사성을 보였다. 하지만, APV 혈청형 D의 경우에는 단지 부분적인 서열 정보만 가능하다는 점은 주의해야 한다.
다양한 새로 동정된 바이러스 분리체의 상관관계를 확인하기 위하여, 8개 내지 9개의 분리체(F의 경우 8개, N, M, L의 경우 9개)로부터 수득된 서열 정보에 기초하여 계통유전학적 트리를 구성하였다. 이를 위하여, 후속으로 직접 서열분석되는 N, M, F, L ORF에서 짧은 단편을 증폭하도록 설계된 프라이머로 RT-PCR를 실시하였다. 이전에 혈청학적 측면에서 연관된 것으로 확인되었던 9개의 바이러스 분리체 역시 유전적으로 밀접하게 연관하는 것으로 확인되었다. 실제로, 9개 분리체 모두 APV보다는 상호간에 좀더 밀접하게 연관하였다. 이들 계통유전학적 트리에 이용되는 서열 정보가 제한적이기는 하지만, 9개 분리체는 2개의 군: 한 군은 분리체 94-1, 99-1, 99-2; 다른 군은 분리체 94-2; 93-1; 93-2; 93-3; 93-4; 00-1로 구분할 수 있다(도 5).
혈청우세
사람 개체군에서 상기 바이러스의 혈청우세를 연구하기 위하여, 동정되지 않은 바이러스 분리체중 하나로 감염된 tMK 세포를 이용한 간접 IFA로 상이한 연령 범주의 사람으로부터 얻은 혈청을 검사하였다. 이런 분석에서 6개월 내지 12개월된 어린이의 25%가 상기 바이러스에 항체를 가지며 5살이 되면 거의 100%의 어린이가 혈청양성인 것으로 확인되었다. 간접 IFA로 검사된 총 56개의 혈청 시료가 VN 분석법으로 검사되었다. 이들 시료중 51개(91%)에서 VN 분석의 결과(역가>8)는 간접 IFA의 결과(역가>32)와 일치하였다. IFA에서 양성으로 확인된 4개의 시료는 VN 검사에서는 음성(역가>8)이었고, 1개의 시료는 IFA에서 음성(역가<32)이고 VN 검사에서는 양성(역가 16)이었다(표 2).
1958년 사람(연령 범위: 8-99세)에서 취한 72개의 혈청으로 실시된 IFA에서는 100% 혈청우세를 나타내는데, 이는 상기 바이러스가 40년이상동안 사람 개체군에 유포되고 있었다는 것을 시사한다. 이에 더하여, 다수의 이런 혈청을 이용한 VN 분석은 IFA 데이터를 뒷받침하였다(표 2).
N, M, P, F 유전자의 유전 분석에서 MPV가 뉴모바이러스(Pneumovirinae) 속(평균 30%)에 비하여 최근에 제안된 메타뉴모바이러스(Metapneumovirinae) 속에 좀더 높은 서열 상동성(평균 63%)을 갖는 것으로 밝혀졌는데, 이는 APV/TRTV의 게놈 구조와 유사한 게놈 구조를 입증한다. RSV('3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5')의 게놈 구조와는 대조적으로, 메타뉴모바이러스는 NS1와 NS2 유전자가 부족하고 M과 L간 유전자의 상이한 위치배열(3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')을 갖는다. 본원 바이러스 분리체에서 M과 F 유전자간 ORF의 결핍과 N에 인접한 NS1과 NS2의 결핍 및 APV와의 높은 아미노산 서열 상동성은 사람으로부터 분리된 MPV가 포유동물, 특히 사람 기원의 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속의 첫 번째 구성원으로 분류되는 이유이다.
계통유전학 분석에서 서열 정보가 수득된 9개의 MPV 분리체가 밀접하게 연관하는 것으로 확인되었다. 서열 정보가 제한적이긴 하지만, 이들은 실제로 임의의 조류 메타뉴모바이러스보다는 상호간 좀더 밀접하게 연관하였다. 밝혀진 4가지 APV 혈청형 중에서, 혈청형 C가 N, P, M, F에 기초한 MPV에 밀접하게 연관하였다. 하지만, 혈청형 D의 경우 F 유전자의 부분적인 서열만 GenBank로부터 입수가능하고 혈청형 B의 경우 단지 M, N, F 서열만 입수가능하다는 점은 주의해야 한다. MPV 분리체는 계통유전학적 트리에서 2개의 클러스트를 형성하였다. hRSV와 APV의 경우에는 상이한 유전적ㆍ혈청학적 아형이 기술되었다. MPV 분리체의 2가지 유전 클러스터가 기능적으로도 상이한 혈청학적 아군을 대표하는 지는 현재 시점에서는 알 수 없다. 본 연자들의 혈청학적 조사에서는 MPV가 공통적인 사람 병원균인 것으로 나타났다. 중증 RTI를 앓는 어린이로부터 얻은 임상 시료에서 상기 바이러스의 반복된 분리는 MPV의 임상적ㆍ경제적 영향이 높다는 것을 암시한다. 바이러스 검출과 혈청학에 기초한 새로운 진단 분석은 이런 바이러스 병원균의 발병률 및 임상적ㆍ경제적 영향의 좀더 상세한 설명을 가능하게 할 것이다.
IFA와 VN 결과(5개 시료)간 약간의 차이는 IFA에서는 IgG 혈청 항체만 검출되는 반면 VN 분석에서는 강과 아강의 항체가 검출된다는 사실에 기인하거나, 또는 양 분석간 민감성의 차이에 기인할 수도 있다. IFA의 경우 16의 절단값(cut-off value)이 이용되고, 반면 VN의 경우 8의 절단값이 이용된다.
다른 한편, IFA와 VN간 차이는 새로 동정된 바이러스의 상이한 혈청형간 차이를 암시할 수도 있다. MPV가 APV와 가장 밀접하게 연관하는 것으로 보이기 때문에, 상기 사람 바이러스는 조류로부터 기원한 것으로 추정된다. 1958년 사람에서 취한 혈청 시료의 분석에서 MPV가 40년이상동안 사람 개체군에서 만연하였다는 것을 확인되었는데, 이는 1958년 훨씬 이전에 인수공통 전염병이 발생하였다는 것을 시사한다.
재료와 방법
시료 수집
과거 수십년동안 본 연자들은 RTI를 앓는 어린이로부터 비인후 흡입물을 수집하고, 정기적으로 바이러스의 존재를 검사하였다. 모든 비인후 흡입물은 인플루엔자 바이러스 A와 B형, hRSV, 사람 파라인플루엔자 바이러스(hPIV) 1 내지 3형에 대한 형광 표지된 항체를 이용한 직접 면역형광 분석법(DIF)으로 검사하였다. 또한, 비인후 흡입물은 VERO 세포, 3기 게잡이원숭이 신장(tMK) 세포, 사람 내피 폐(HEL) 세포, 마빈 독 신장(MDCK) 세포를 비롯한 다양한 세포주에서 신속 쉘 바이알 기술로 바이러스 분리를 실시하였다. 2 내지 3회 계대배양후 세포변성효과(CPE)를 보이고 DIF에서 음성인 시료는 인플루엔자 바이러스 A, B, C형, hRSV A와 B형, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 사람 파라인플루엔자 바이러스(hPIV) 1 내지 4형, 센다이 바이러스, 원숭이 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스에 대한 바이러스 특이적 항체를 이용한 간접 면역형광 분석법(IFA)으로 검사하였다. 많은 경우에 원인균이 동정되지만, 일부 시료는 검사된 모든 바이러스에 음성이었다.
직접 면역형광 분석( DIF )
RTI 환자로부터 얻은 비인후 흡입물 시료는 전술한 바와 같이 DIF와 바이러스 분리에 사용되었다. 시료는 -70℃로 저장하였다. 간단히 말하면, 비인후 흡입물은 5 ㎖ Dulbecco MEM(Bio Whittaker, Walkersville, MD)으로 희석하고 볼텍스 혼합기에서 1분동안 완전하게 혼합한다. 이후, 현탁액은 10분동안 840 x g에서 원심분리한다. 침전물은 다중스팟 슬라이드(Nutacon, Leimuiden, The Netherlands)에 전개하고, 상층액은 바이러스 분리에 사용하였다. 건조후, 세포는 실온에서 1분동안 아세톤에 고정시켰다. 세척후, 슬라이는 상업적으로 입수가능한 FITC-표지된 바이러스 특이적 항-혈청, 예를 들면 인플루엔자 A와 B, hRSV, hPVI 1 내지 3(Dako Glostrup, Denmark)과 함께 37℃에서 15분동안 배양하였다. PBS에서 3회, 수돗물에서 1회 세척후, 슬라이드는 글리세롤/PBS 용액(Citifluor, UKO Canterbury, UK)에 넣고 뚜껑을 덮는다. 슬라이드는 Axioscop 형광 현미경(Carl Zeiss B.V, Weesp, the Netherlands)으로 분석하였다.
바이러스 분리
바이러스 분리를 위하여 tMK 세포(RIVM, Bilthoven, The Netherlands)는 유리 슬라이드(Costar, Cambridge, UK)를 보유하는 24웰 평판에서 배양하는데, 배지는 10% 우 태아 혈청(Bio Whittaker, Vervier, Belgium)으로 보충하였다. 배양에 앞서, 평판은 PBS로 세척하고 Hanks 염(ICN, Costa mesa, CA)을 함유한 Eagle MEM을 공급하는데, 이의 0.5 ℓ는 0.26 g HaHCO3, 0.025 M Hepes(Biohittaker), 2mM L-글루타민(Biowhittaker), 100 단위 페니실린, 100㎍ 스트렙토마이신(Biowhittaker), 0.5 g 락탈부민(Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands), 1.0 g D-글루코오스(Merck, Amsterdam, The Netherlands), 5.0 g 펩톤(Oxid, Haarlem, The Netherlands), 0.02% 트립신(Life Technoligies, Bethesda, MD)으로 보충된다. 평판은 삼중의 웰당 0.2 ㎖ 비인후 흡입물 시료의 상층액을 접종하고, 이후 1시간동안 840 x g로 원심분리한다. 접종후, 평판은 37℃에서 최대 14일동안 배양하고, 배지는 매주 1회 교체하고, 배양액은 매일 CPE를 검사한다. 14일후, 세포는 2차 계대배양으로부터 긁어모으고 14일동안 배양한다. 이 단계는 3차 계대배양동안 반복한다. 유리 슬라이드를 이용하여 후술한 바와 같이 간접 IFA로 바이러스의 존재를 증명하였다.
동물 면역화
새로 발견된 바이러스에 대한 흰족제비과 기니아 피그 특이적 항혈청은 별도의 가압된 글러브 박스에 사육된 2마리의 특이적 병원균 없는 흰족제비과 2마리 기니아 피그의 실험적 비강 감염으로 만들었다. 2 내지 3주후, 모든 동물은 심장 천자로 방혈하였는데, 이들의 혈청은 참고 혈청으로 사용되었다. 혈청은 후술한 바와 같이 간접 IFA로 전술한 바이러스를 검사하였다.
간접 IFA 에 의한 항원 검출
감염된 tMK 세포를 함유하는 IFA에서 간접 IFA를 실시하였다. PBS로 세척후, 슬라이드는 바이러스 특이적 항원과 함께 37℃에서 30분동안 배양하였다. 전술한 바와 같이 인플루엔자 A, B, C형, hPIV 1 내지 3형, hRSV에 대한 단클론항체가 DIF에 사용되었다. hPIV 4형, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 센다이 바이러스, 원숭이 바이러스 5형, 뉴캐슬병 바이러스의 경우, 다클론항체(RIVM) 및 흰족제비과 기니아 피그 참조 혈청이 사용되었다. PBS로 3회 세척과 수돗물로 1회 세척후, 슬라이드는 첫 번째 배양에 사용된 혈청에 대한 2차 항체로 염색하였다. 다클론 항혈청에 대한 2차 항체는 염소-항-흰족제비(KPL, Guilford, UK, 40 , 생쥐-항-토끼(Dako, Glostrup, Denmark, 20배 희석), 토끼-항-병아리(KPL, 20배 희석), 생쥐-항-기니아 피그(Dako, 20배 희석)이었다.
간접 IFA 에 의한 사람에서 항체의 검출
바이러스 특이적 항체의 검출을 위하여, 감염된 tMK 세포는 커버슬립에 차가운 아세톤으로 고정시키고 PBS로 세척하며 1 내지 16배 희석된 혈청 시료로 염색하였다. 후속으로, 시료는 PBS(Dako)에서 80배 희석된 FITC-표지된 토끼 항 사람 항체로 염색하였다. 슬라이드는 전술한 바와 같이 처리하였다.
MPV 의 바이러스 배양
전술한 바와 같은 배지에 tMK 세포의 합류이하 단층은 24웰 평판에서 2 또는 3회 계대배양후 CPE를 보이는 시료의 상층액을 접종하였다. 배양액은 매일 CPE를 검사하고, 배지는 매주 1회 교체하였다. 각 분리체에서 CPE가 상이하기 때문에, 모든 배양액은 새로운 바이러스 분리체에 대한 흰족제비 항체를 이용한 간접 IFA로 12일 내지 14일에 검사하였다. 양성 배양액은 3회 동결-해동하고, 이후 상층액은 저속 원심분리로 맑게 하고 등분하며 -70℃에서 동결한다. 배양 상층액에서 바이러스의 50% 조직 배양 감염성 분량(TCID50)은 전술한 바와 같이 측정하였다.
바이러스 중화 분석
VN 분석은 8배 희석액에서 출발하여 사람과 동물 혈청의 연속 2배 희석액으로 실시하였다. 희석된 혈청은 96웰 평판에서 성장한 tMK 세포의 접종에 앞서 100 TCID50 바이러스와 함께 1시간동안 배양하고, 이후 평판은 850 x g에서 원심분리하였다. 배지는 3일과 6일후 교체하고 IFA는 접종 8일후 MPV에 대한 펠렛 항체로 실시하였다. VN 역가는 세포 배양액에서 음성 IFA 및 CPE 저해를 유도하는 혈청 시료의 최소 희석으로 정의되었다.
바이러스 특성화
혈구응집분석과 클로로포름 민감성 검사는 전술한 바와 같이 실시하였다. EM 분석의 경우, 바이러스는 4℃에서 17000 x g로 마이크로-원심분리로 감염된 세포 배양 상층액으로부터 농축하고, 이후 펠렛은 PBS에 재현탁시키고 음성 대조 EM으로 검사하였다. RAP-PCR의 경우, 바이러스는 60% 슈크로즈 상에서 한외-원심분리(150000 x g, 4℃에서 2시간)로 감염된 tMK 세포 상층액으로부터 농축하였다. 후속으로, 60% 슈크로즈 계면은 PBS로 희석하고 275000 x g, 4℃에서 16시간동안 원심분리된 20-60% 연속 슈크로즈 그레디언트의 상부에 층을 만들었다. 슈크로즈 그레디언트 분취물은 EM과 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 이후 은 염색으로 바이러스-유사 입자의 존재를 검사하였다. 뉴클레오캡시드를 보유하는 것으로 나타난 대략 50% 슈크로즈 분취물은 RNA 분리 및 RAP-PCR에 사용되었다.
RNA 분리
RNA는 제조업자의 지시에 따라 High Pure RNA 분리 키트(Roche Diagnostics, Almere The Netherlands)를 이용하여 감염된 세포 배양액의 상층액 또는 슈크로즈 그레디언트 분취물로부터 분리하였다.
RT - PCR
공지된 파라믹소바이러스에서 RT-PCR 분석을 위한 바이러스-특이적 올리고뉴클레오티드 서열은 부록 1에 기술한다. 1ekserP RT-PCR은 50 mM Tris.HCl pH 8.5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 2 mM 디티오트레이톨, 200μM 각 dNTP, 10 단위 재조합 RNAsin(promega, Leioden, The Netherlands), 10 단위 AMV RT(Promega, Leiden The Netherlands), 5 단위 Amplitaq Gold DNA 중합효소(PE Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel The Netherlands), 5 ㎕ RNA를 함유하는 50 ㎕ 반응물에서 실시하였다. 사이클링 조건은 42℃에서 45분과 95℃에서 7분 1회; 95℃에서 1분, 42℃에서 2분, 72℃에서 3분 40회 반복; 72℃에서 10분 1회이다.
RAP - PCR
RAP-PCR은 전술한 바와 같이 실시하였다. 올리고뉴클레오티드 서열은 부록 2에 기술한다. RT 반응을 위하여, 10 ng/㎕ 올리고뉴클레오티드, 10 mM 디티오레이톨, 500 ㎛ 각 dNTP, 25 mM Tris-HCl pH 8.3, 75 mM MCl, 3 mM MgCl2를 함유하는 10 ㎕ 반응물에 2 ㎕ RNA가 사용되었다. 반응 혼합물은 70℃에서 5분동안, 37℃에서 5분동안 배양하고, 이후 200 단위 Superscript RT 효소(LifeTechnologies)를 첨가하였다. 37℃에서 배양은 55분동안 지속하고, 반응은 72℃에서 5분 배양으로 종결시켰다. RT 혼합물은 희석하여 8 ng/㎕ 올리고뉴클레오티드, 300 ㎛ 각 dNTP, 15 mM Tris-HCl pH 8.3, 65 mM KCl, 3.0mM MgCl2, 5 단위 Taq DNA 중합효소(PE Biosystems)를 함유하는 50 ㎕ PCR 반응물을 만들었다. 사이클링 조건은 94℃에서 5분, 40℃에서 5분, 72℃에서 1분 1회; 94℃에서 1분, 56℃에서 2분, 72℃에서 1분 40회 반복; 72℃에서 5분 1회이다. RAP-PCR후, 15 ㎕ RT-PCR 산물은 3% NuSieve 아가로즈 겔(FMC BioProducts, Heerhugowaard The Netherlands)에 나란히 동작시켰다. MPV에 특이적인 개별적으로 나타나는 단편은 제조업자의 지시에 따라 Qiaquick Gel Extraction 키트(Qiagen, Leusden, The Netherlands)를 이용하여 겔로부터 정제하고 pCR2.1 벡터(Invitrogen, Groninge, The Netherlands)에 클론하였다.
서열 분석
벡터 pCR2.1(Invitrogen)에 클론된 RAP-PCR 산물은 M13-특이적 올리고뉴클레오티드로 염기서열분석하였다. RT-PCR로 수득된 DNA 단편은 Qiaquick Gel Extraction 키트(Qiagen, Leusden, The Netherlands)를 이용하여 아가로즈 겔로부터 정제하고, PCR에 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오티드로 직접 염기서열분석하였다. 서열 분석은 Dynamic ET 종결부위 염기서열분석 키트(Amersham Pharmacia Biotech, Rosendaal, The Netherlands) 및 ABI 373 자동화 DNA 서열분석장치(PE Biosystem)로 실시하였다. 모든 기술은 제조업자의 지시에 따라 실시하였다.
RT - PCR 에 의한 MPV 게놈 단편의 산출
RAP-PCR 단편간 틈새 A, B, C를 연결하는 PCR 단편을 산출하기 위하여(도 2), 바이러스 분리체 00-1로부터 분리된 RNA에서 전술한 바와 같은 RT-PCR 분석을 이용하였다. 다음의 프라이머가 사용되었다:
단편 A의 경우: 리더에서 설계된 TRI(5'-AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3')(SEQ ID NO: 107) 및 N에서 수득된 RAP-PCR 단편의 3' 단부에서 설계된 N1(5'-CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3')(SEQ ID NO: 108).
단편 B의 경우: N에서 수득된 RAP-PCR 단편의 5'단부에서 설계된 N2(5'-CATGCAAGCTTATGGGGC-3')(SEQ ID NO: 109) 및 M에서 수득된 RAP-PCR 단편의 3' 단부에서 설계된 M1(5'-CAGAGTGGTTATTGTCAGGGT-3')(SEQ ID NO: 110).
단편 C의 경우: M에서 수득된 RAP-PCR 단편의 5' 단부에서 설계된 M2(5'-GTAGAACTAGGAGCATATG-3')(SEQ ID NO: 111) 및 F에서 수득된 RAP-PCR 단편의 3' 단부에서 설계된 F1(5'-TCCCCAATGTAGATACTGCTTC-3')(SEQ ID NO: 112).
단편은 전술한 바와 같이 겔로부터 정제하고 클론하고 염기서열분석하였다.
MPV 를 진단하기 위한 RT - PCR
9개 MPV 분리체의 N, M, F, L ORF중 일부의 증폭 및 염기서열분석을 위하여, 프라이머 N3(5'-GCACTCAAGAGATACCCTAG-3')(SEQ ID NO: 113)과 N4(5'-AGACTTTCTGCTTTGCTGCCTG-3')(SEQ ID NO: 114)를 사용하여 151개 뉴클레오티드 단편을 증폭하였고, 프라이머 M3(5'-CCCTGACAATAACCACTCTG-3')(SEQ ID NO: 115)과 M4(5'-GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC-3')(SEQ ID NO: 116)를 사용하여 252개 뉴클레오티드 단편을 증폭하였고, 프라이머 F7(5-TGCACTATCTCCTCTTGGGGCTTTG-3')(SEQ ID NO: 117)과 F8(5'-TCAAAGCTGCTTGACACTGGCC-3')(SEQ ID NO: 118)을 사용하여 221개 뉴클레오티드 단편을 증폭하였고, 프라이머 L6(5'-CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3')(SEQ ID NO:119)과 L7(5'-CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3')(SEQ ID NO: 120)을 사용하여 173개 뉴클레오티드 단편을 증폭하였다. RT-PCR, 겔 정제, 직접 염기서열분석은 전술한 바와 같이 실시하였다. 추가로 사용된 프로브는 다음과 같다:
M에 사용된 프로브: 5'-TGC TTG TAC TTC CCA AAG-3'(SEQ ID NO: 121)
N에 사용된 프로브: 5'-TAT TTG AAC AAA AAG TGT-3'(SEQ ID NO: 122)
L에 사용된 프로브: 5'-TGGTGTGGGATATTAACAG-3'(SEQ ID NO:123)
계통유전학 분석
모든 계통유전학적 트리에서 DNA 서열은 ClustalW 소프트웨어 패키지로 정렬하고, 최대 유사성 트리는 100개의 부트스트랩(bootstrap)과 3개의 점블(jumble)을 이용한 Phylip 3.5 프로그램의 DAN-ML 소프트웨어 패키지로 만들었다. 계통유전학적 트리의 산출에 사용되었던 이전에 공개된 서열은 아래의 등록 번호로 GenBank로부터 입수가능하다: 모든 ORF의 경우: hRSV: NC001781; bRSV: NC001989; F ORF의 경우: PVM, D11128; APV-A, D00850; APV-B, Y14292; APV-C, AF187152; N ORF의 경우: PVM, D10331; APV-A, U39295; APV-B, U39296; APV-C, AF176590; M ORF의 경우: PMV, U66893; APV-A, X58639; APV-B, U37586; APV-C, AF262571; P ORF의 경우: PVM, 09649; APV-A, U22110, APV-C, AF176591. MPV의 9가지 상이한 바이러스 분리체에 대한 계통유전학적 분석은 APV 균주 C를 외집단으로 하여 실시하였다.
도면에서 약어: hRSV: 사람 RSV; bRSV: 소 RSV; PVM: 생쥐의 폐렴 바이러스; APV-A, B, C: A, B, C형 조류 뉴모바이러스.
MPV 를 동정하는 방법의 실례
시료 수집
바이러스 분리체를 찾기 위하여, 바람직하게는 포유동물, 예를 들면 사람, 육식 동물(개, 고양이, 족제비 등), 말, 반추 동물(소, 양, 염소 등), 돼지, 토끼, 조류(가금, 타조 등)로부터 유래된 비인후 흡입물, 목과 코 면봉시료, 기관지 폐포 세척액을 검사해야 한다. 조류의 배설강(CLOACA) 면봉시료와 똥을 검사할 수도 있다. 혈청은 면역학적 분석, 예를 들면 ELISA, 바이러스 중화 분석을 위하여 수집해야 한다.
수집된 바이러스 시료는 5 ㎖ Dulbecco MEM 배지(Bio Whittaker, Walkersville, MD)로 희석하고 볼텍스 혼합기에서 1분동안 완전하게 혼합한다. 이후, 현탁액은 10분동안 840 x g에서 원심분리한다. 침전물은 다중스팟 슬라이드(Nutacon, Leimuiden, The Netherlands)에 전개하고, 상층액은 바이러스 분리에 사용하였다.
바이러스 분리
바이러스 분리를 위해, tMK 세포(RIVM, Bilthoven, The Netherlands)를 글라스 슬라이드(Costar, Cambridge, UK)를 포함하는 24웰 평판에 배양하는데, 사용된 배지는 하기에서 설명하는 것과 같은 10% 태아 송아지 혈청(BioWhittaker, Vervier, Belgium)이 보충된 것이다. 접종하기 전에, 평판은 PBS로 세척하고, Hanks' 염(ICN, Costa mesa, CA)+0.52/liter gram NaHCO3, 0.025M Hepes(Biowhittaker), 2mM L-글루타민(Biowhittaker), 200 units/liter 페니실린, 200㎍/liter 스트렙토마이신(Biowhittaker), 1gram/liter 락타알부민(Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands), 2.0gram/liter D-글루코즈(Merck, Amsterdam, The Netherlands), 10gram/liter 펩톤(Oxoid, Haarlem, The Netherlands), 0.02% 트립신(Life Technologies Bethesda, MD)이 보충된 Eagle's MEM으로 세척하였다. 평판에 비인두 흡착 시료 상층액을 웰당 0.2㎖로 3회 중복 접종하고, 1시간동안 840xg에서 원심분리하였다. 접종후에, 평판은 배지를 일주일 간격으로 교환하면서 최대 14일간 37℃에서 배양하고, 배양액에서 CPE를 매일 체크한다. 14일 후에, 두 번째 계대배양액에서 세포를 긁어내어, 추가 14일간 배양하였다. 이 단계는 3대 계대배양에서 반복한다. 글라스 슬라이드를 이용하면, 하기에서 설명하는 것과 같이 간접 IFA으로 바이러스가 존재하는 지를 설명할 수 있다. CPE는 분리체에 따라서, 8일 내지 14일 경에 3대 계대배양후에 일반적으로 관찰할 수 있다. CPE는 tMK 또는 다른 세포 배양액에서 hRSV 또는 hPIV에 의해 생성되는 것과 실제 분간할 수는 없다. 그러나, hRSV에는 4일경에 CPE가 개시된다. CPE는 합포체 형성을 특징으로 하는데, 그후에 세포는 신속한 내분열이 나타나고, 단층으로부터 세포가 일탈된다. 일부 분리체의 경우에, CPE 관찰이 곤란하고, IFA를 이용하면, 이들 배양액에서 바이러스가 존재하는지를 확인할 수 있다.
MPV 의 바이러스 배양액
상기에서 설명하는 것과 같이 tMK 세포의 준-합류 단층에 24웰 평판상에서 2대 또는 3대 계대배양후에 CPE를 나타내는 시료 상층액 접종하였다. 매일 배양액에서의 CPE를 점검하고, 배지는 일주일 간격으로 교환한다. 각 분리체간에 CPE가 상이하기 때문에, 새로운 바이러스 분리체에 대한 흰족제비 항체를 이용한 간접 IFA를 이용하여 12 내지 14일 경에 모든 배양액을 테스트하였다. 양성반응 배양액은 냉동-해동과정을 3회 반복하고, 그 다음 저속 원심분리를 이용하여, 상층액을 맑게 한 후, -70℃에 냉동 보관한다. 배양 상층액에서 바이러스의 50% 조직 배양 감염성 약량(TCID50)은 이 분야에 공지의 기술을 이용하여 결정하였다.
바이러스 특징
당분야에 이용되는 정립된 기술을 이용하여 혈구응집 검사 및 클로로포름 감응성 테스트를 실시하였다. EM 분석에서, 바이러스는 4℃ 17000 x g 마이크로-원심분리기에서 감염된 세포 배양액 상층액으로부터 바이러스를 농축시키고, 펠렛은 PBS를 이용하여 재현탁시키고, 네거티브 대비 EM으로 검사하였다.
간접 IFA 을 이용한 항원 검사
수득된 견본은 설명한 것과 같이 처리하였고, 시료 침전물은 다중스팟 슬라이드에 전개한다. 건조후에, 세포는 실온에서 1분간 아세톤을 이용하여 고정시켰다.
또는, 바이러스는 글라스 슬라이드를 포함하는 24웰 슬라이드상에서 tMK 세포위에 배양시켰다. 이와 같은 글라스 슬라이드는 PBS로 세척시키고, 실온에서 1분간 아세톤을 이용하여 고정시켰다.
PBS로 씻어낸 후에, 슬라이드는 1:50 내지 1:100의 비율로 PBS로 희석시킨 다클론성 항체를 이용하여, 37℃ 30분간 배양시켰다. 면역화된 흰족제비와 기니아 피그를 이용하여 다클론항체를 얻었으나, 이와 같은 항체는 다양한 동물에서도 얻을 수 있으며, 각 면역화반응에서 다클론 항체의 희석 비율을 다양하게 할 수 있다. PBS로 3회 세척한 후에, 슬라이드는 37℃에서 30분간 FITC 라벨된 염소-항-흰족제비 항체(KPL, Guilford, UK, 40 fold diluted)와 함께 배양하였다. PBS로 3회 씻어낸 후에, 1회 수돗물로 씻어내고, 슬라이드는 글리세롤/PBS 용액에 담그고(Citifluor, UKC, Canterbury, UK) 뚜껑을 덮는다. 슬라이드는 Axioscop 형광 현미경을 이용하여 분석하였다(Carl Zeiss B.V., Weesp, the Netherlands).
사람, 포유류, 반추동물 및 다른 동물에서 간접 IFA 를 이용하여 항체 감지
바이러스 특이적인 항체를 감지하기 위해, MPV로 감염된 tMK 세포를 덮개 슬라이드상에서 아세톤을 이용하여 고정시키고(위에서 설명), PBS로 씻어낸 후, 1 내지 16배 희석비로 혈청 시료와 함께 37℃에서 30분간 배양하였다. PBS로 2회 씻어내고, 수돗물로 1회 씻어낸 후, 슬라이드는 이용된 종(Dako)에 대한 부차 항체-FITC-라벨과 함께 30분간 37℃에서 배양시켰다.
항체는 형광 염료로 직접 라벨시킬 수도 있고, 이는 직접 면역 형광 검사에 이용된다. FITC 대신에 다른 형광 염료를 이용할 수도 있다.
동물 면역화반응
별도의 가압 글러브 박스내에 가둔 2가지 특정 병인균이 없는 흰족제비 및 두 마리 기니아 피그의 비강 감염 실험을 이용하여 새로 발견된 바이러스에 대한 흰족제비 및 기니아 피그 항혈청을 만들 수 있다. 2 내지 3 주후에, 동물의 심장 천자로 피를 내고, 기준 혈청으로 이용하였다. 하기에서 설명하는 것과 같은 간접 IFA를 이용하여 모든 기존의 바이러스에 대해 혈청을 테스트하였다. 다른 동물 종은 특정 항체 조제물에 이용할 수 있고, 다른 항원 조제에도 이용될 수도 있다.
바이러스 중화 검사( VN assay )
VN 검사는 8배 희석한 사람 및 동물의 혈청을 연속하여 2배 희석한 것으로 실시하였다. 희석된 혈청은 96웰 평판상에 생장된 tMK 세포로 접종시키기 전에 바이러스의 100 TCID50으로 1시간동안 접종시키고, 평판은 840 x g에서 원심분리시킨다. 상기에서 설명하는 동일한 배양 배지를 이용하였다. 배지는 3일과 6일에 교환하였고, 8일 후에, IFA를 실시였다(상기 설명 참고). VN 역가는 세포 배양액에서 CPE 저해와 네거티브 IFA 결과를 초래하는 혈청 샘플의 최저 희석배로 정의한다.
RNA 분리
제조업자의 지시에 따라(Roche Diagnostics Almere, The Netherlands), High Pure RNA분리 키트를 이용하여 감염된 세포 상층액 또는 과당 그레디언트 분류로부터 RNA를 분리하였다. RNA는 당분야에 공지된 다른 과정(Current Protocols in Moecular Biology)을 이용하여 분리할 수도 있다.
RT - PCR
50mM Tris HCl-pH 8.5, 50mM NaCl, 4mM MgCl2, 2mM 디티오트레톨, 200μM 각dNTP, 10U 재조합 RNAsin(Promega, Leiden, the Netherlands), 10units AMV RT (Promega, Leiden, The Netherlands), 5units Amplitaq Gold DNA 중합효소(PE Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel The Netherlands), 5㎕ RNA를 포함하는 50㎕ 반응액에서 원스텝 RT-PCR을 실행하였다. 사이클링 조건은 42℃에서 45분간, 95℃에서 7분간 1회; 95℃에서 1분간; 42℃에서 2분간; 72℃에서 3분간을 40회 반복하고, 72℃에서 10분간 1회 실시하는 것이다.
진단용 PCR에 이용된 프라이머:
핵단백질에서 151개 뉴클레오티드 단편으로 증폭되는 N3(5'-GCACTCAAGAGATACCCTAG-3')(SEQ ID NO: 124)과 N4(5'-AGACTTTCTGCTTTGCTGCCTG-3')(SEQ ID NO:125).
매트릭스단백질에서 252개 뉴클레오티드 단편으로 증폭되는 M3(5'-CCCTGACAATAACCACTCTG-3')(SEQ ID NO: 126)과 M4(5'-GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC-3')(SEQ ID NO:127).
중합효소 단백질에서 173개 뉴클레오티드 단편으로 증폭되는 L6(5'-CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3')(SEQ ID NO: 128)과 L7(5'-CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3')(SEQ ID NO: 129).
MPV 서열에 기초하여 다른 프라이머를 고안할 수도 있고, 특정 목적을 위해 다른 완충액이나 검사 조건을 이용할 수도 있다.
서열 분석
Dyenamic ET 종료 서열화 키트(Amersham Pharmacia Biotech Roosendaal, The Netherlands)와 ABI 373 자동 DNA 서열화기(PE Biosystem)를 이용하여 서열 분석을 실시하였다. 모든 기술은 제조업자의 지시에 따른다. PCR에 이용되는 동일한 올리고뉴클레오티드와 함께 PCR 단편을 바로 서열화시킬 수 있고, 또는 Qiaquick Gel Extraction kit(Qiagen, Leusden, The Netherlands)을 이용한 겔에서 단편을 정제하고, 제조업자의 지시에 따라 pCR2.1 벡터(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)내에 클론시키고, M13-특이적인 올리고뉴클레오티드로 서열화시킬 수도 있다.
게놈의 3' 단부를 분석하는데 이용되는 올리고뉴클레오티드( NS1 / NS2 없음)
프라이머 TR1(5'-AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3')(SEQ ID NO: 130)은 Randhawa(1997)가 공개한 hRSV 및 APV를 위한 추적자 및 리더 서열에 기초하여 고안된 것이고, 프라이머 N1(5'-CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3')(SEQ ID NO: 131)은 N 단백질내에 수득된 서열을 기초하여 고안한 것이다. RT-PCR 검사 및 서열화과정은 상기에서 설명한 것과 같이 실시한다. RT-PCR은 약 500개 염기쌍의 생성물을 제공하는데, 이는 두 개 ORF의 정보를 포함하기에는 너무 작고, 이들 서열의 해독으로 ORF가 나타나지는 않았다.
ELISA 를 이용한 사람, 포유류, 반추동물 또는 다른 동물에서의 항체 감지
파라믹소비리데(Paramyxoviridae)에서, N 단백질이 가장 풍부한 단백질이고, 이 단백질에 대한 면역 반응은 감염 초기에 나타난다. 이와 같은 이유로, N 단백질의 재조합 소스를 적절히 이용하여, MPV에 대한 항체 감지를 위한 ELISA 검사를 개발할 수 있다. 항체 감지에 적합한 항원에는 MPV 바이러스에 감염된 또는 노출된 환자의 임의 MPV-특이적인 항체와 복합된 임의 MPV 단백질이 포함된다. 본원 발명에서 적절한 항원에는 MPV에 노출된 환자에서 면역 반응을 주로 제공하여, 환자의 항체에 의해 주로 바로 인지되는 것들이 포함된다. 특별히 적절한 항원에는 MPV의 N, F, G 단백질이 포함된다. 면역 기술에 이용되는 항원은 고유 항원 또는 이들의 변형물이 될 수도 있다. 분자 생물학에서 공지된 기술을 이용하여 MPV 항원의 아미노산 서열을 변경시켜, 면역학적 기술에 이용될 수 있는 변형된 항원을 만들 수 있다.
유전자 클로닝, 발현 벡터에서의 유전자 조작, 이형 숙주에 있는 유전자에 의해 인코드된 단백질의 발현 방법은 잘 공지되어 있고, 이와 같은 기술을 이용하여 발현 벡터, 숙주 세포를 제공할 수 있고, 진단 검사에 이용할 수 있는 재조합 항원을 생산하기 위해 숙주에서 항원을 인코드하는 클론된 유전자를 발현시키는 방법도 공지되어 있다(See for instance: Molecular cloning, A laboratory menual and Current Protocols in Molecular Biology). 다양한 발현시스템을 이용하여 MPV 항원을 만들 수 있다. 예를 들면, 대장균(E. Coli) 바실러스 스브틸리스(B. subtilis), 이스트, 곤충세포, 포유류 세포에서 단백질을 생산하는데 적절한 다양한 발현 벡터가 설명되어 있고, 이들중 임의의 것을 이용하여, 노출된 환자에서 항-MPV 항체를 감지하는데 적절한 MPV 항원을 만들 수 있다.
바쿨로바이러스 발현 시스템은 단백질의 필수 프로세싱 장점을 보유하고, 따라서 이것이 적절하다. 시스템은 MPV 항원의 직접 발현에 대한 폴리헤드린 프로모터를 이용한다(Matsuura et al. 1987, J. Gen. Virol. 68:1233-1250).
재조합 바쿨로-바이러스에 의해 생성된 항원은 환자에서 항-MPV 항체에 대한 다양한 면역학적 검사에 이용될 수 있다. 바이러스 특이적인 항체를 감지하기 위한 실제 임의 면역학적 검사에서 자연산 바이러스를 대신하여 이용될 수 있다. 검사에는 직간접 검사, 샌드위치 검사, 평판 또는 비드를 이용하는 것과 같은 고형상 검사, 액상 검사가 포함된다. 적절한 검사에는 1차 및 2차 항체를 이용하는 것과 단백질 A와 같은 항체 결합 시약을 이용하는 것이 포함된다. 또한, 본원 발명에서는 다양한 감지 방법이 이용될 수 있는데, 발색, 형광, 인광, 화학적 발광, 발광 및 방사능 활성 방법등이 포함된다.
본원 발명은 포유류 특히 사람에서 질환 특히 호흡계 질환의 진단 또는 치료에 이용할 수 있는 진단 수단 및 방법, 치료학적인 방법 및 수단을 제공하는 것이다. 그러나, 기본적인 포유류 MPV와 필수 조류 APV 특히, APV-C와의 유전학적인 관계로 인하여, 본원 발명에서는 조류 질병의 진단 및 치료에도 이용할 수 있는 수단 및 방법을 제공할 수도 있다.
본원 발명은 동물 특히 포유류, 좀더 특별하게는 사람에서 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단하는 방법을 제공한다.
본원 발명은 MPV 감염을 진단할 수 있는 진단 키트를 제공하는데, 이 키트는 MPV, MPV-특이적인 핵산, 단백질 분자 또는 이들의 단편, 본원 발명에 따른 항원 또는 항체로 구성된다. 본원 발명은 더 바람직하게는 MPV를 감지하는 수단을 제공하는데, 이 수단은 당분야에 이용할 수 있는 형광 또는 효소를 이용한 감지 시스템과 같은 여기성 집단으로 구성된다
본원 발명은 또한 포유류에서 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단할 수 있는 방법을 제공하는데, APV에서 유도된 교차 반응성 핵산(적절하게는 혈청타입 C) 또는 APV와 반응성이 있는 교차-반응성 항체와 시료를 반응시켜 바이러스성 분리체 또는 이의 성분이 포유류 시료에 존재하는지 결정하는 것으로 구성되고; 포유류에서 MPV 감염을 혈청학적으로 진단하는 방법은 APV에서 유도된 단백질성 분자 또는 이의 단편 또는 항원과 시료를 반응시켜, APV 또는 이의 성분에 직접적으로 관계하는 교차-반응성 항체가 포유류의 시료에 존재하는지를 감지하는 것으로 구성된다. 또한, 본원 발명은 MPV 감염 진단용 APV 또는 APV-항체 감지용으로 최초 고안된 진단 키트, 특히 사람에서 MPV 감염을 감지하기 위해 고안된 키트를 이용하는 것이다.
또한, 본원 발명은 새에서 APV 감염을 바이러스학적으로 진단하는 방법을 제공하는데, MPV에서 유도된 교차-반응성 핵산 또는 MPV와 반응성이 있는 교차-반응성 항체와 시료를 반응시켜 새의 시료에 바이러스성 분리체 또는 이들의 성분이 존재하는지를 결정하고; 새에서 혈청학적으로 APV 감염을 진단하는 방법은 MPV에서 유도된 단백질 분자 또는 이의 단편 또는 항원과 시료를 반응시켜, MPV 또는 이의 성분에 대한 교차-반응성 항체가 새의 시료에 존재하는지를 결정하는 것으로 구성된다. 또한, 본원 발명은 APV 감염을 진단하기 위한 MPV 또는 MPV-항체 감지용으로 고안된 진단 키트를 이용하는 것을 제공하고, 특히, 닭, 오리 또는 칠면조와 같은 가금류에서 APV 감염을 감지하기 위해 고안된 진단 키트를 이용하는 것을 제공한다.
도 1A에서는 표 1: 분리체 00-1과 다른 뉴모비리네 구성원의 아미노산 서열간 상동성 비율을 포함한다. 비율(x100)은 N, P, M, F 및 L에서 2가지 RAP-PCR 단편(8과 9/10)의 아미노산 서열에 부여한다. 분석에 사용된 수납 번호는 재료와 방법 섹션에 기술한다.
도 1B에서는 표 2: 면역형광과 바이러스 중화 분석법을 이용하여 연령군으로 분류된 사람에서 hMPV의 혈청우세를 포함한다.
도 2에서는 분리체 00-1에서 RAP-PCR과 RT-PCR로 수득된 단편의 위치와 크기로 APV 게놈의 개요도를 도시한다. 1 내지 10의 단편은 RAP-PCR로 수득한다. 단편 A는 RT-PCR 단편 1과 2에서 프라이머 및 APV와 PSV6의 리더와 테일러 서열의 정렬에 기초하여 설계된 프라이머로 수득하였다. 단편 B는 RAP-PCR 단편 1과 2 및 RAP-PCR 단편 3에서 설계된 프라이머로 수득하였다. 단편 C는 RAP-PCR 단편 3 및 RAP-PCR 단편 RAP-PCR 4,5,6,7에서 설계된 프라이머로 수득하였다.
모든 계통유전학적 트리(도 3-5)에서 DNA 서열은 ClustalW 소프트웨어 패키지로 정렬하고, 최대 유사성 트리는 100개의 부트스트랩(bootstrap)과 3개의 점블(jumble)을 이용한 Phylip 3.5 프로그램의 DAN-ML 소프트웨어 패키지로 만들었다. 계통유전학적 트리의 산출에 사용되었던 이전에 공개된 서열은 아래의 등록 번호로 GenBank로부터 입수가능하다: 모든 ORF의 경우: hRSV: NC001781; bRSV: NC001989; F ORF의 경우: PVM, D11128; APV-A, D00850; APV-B, Y14292; APV-C, AF187152; N ORF의 경우: PVM, D10331; APV-A, U39295; APV-B, U39296; APV-C, AF176590; M ORF의 경우: PMV, U66893; APV-A, X58639; APV-B, U37586; APV-C, AF262571; P ORF의 경우: PVM, 09649; APV-A, U22110, APV-C, AF176591. MPV의 9가지 상이한 바이러스 분리체는 APV 균주를 외집단으로 하여 실시하였다.
도면에서 약어: hRSV: 사람 RSV; bRSV: 소 RSV; PVM: 생쥐의 폐렴 바이러스; APV-A, B, C: A, B, C형 조류 뉴모바이러스.
도 3에서는 아과 뉴모비리네(Pneumovirinae) 구성원과 바이러스 분리체 00-1의 의 N(SEQ ID NO: 1-7), P(SEQ ID NO: 8-13), M(SEQ ID NO: 14-20), F(SEQ ID NO: 21-27) ORF를 비교한다. 이런 배열은 바이러스 분리체 00-1의 완전 N(SEQ ID NO: 1), P(SEQ ID NO: 8), M(SEQ ID NO: 14), F(SEQ ID NO: 21) 단백질과 부분 L 단백질(SEQ ID NO 28과 SEQ ID NO: 32)의 아미노산 서열을 보여준다. 분리체 00-1과 다른 바이러스간 구별되는 아미노산 서열을 도시하는데, 동일한 아미노산은 피리어드(period)로 표시하고, 차이는 대시(dash)로 표시한다. 번호는 단백질에서 아미노산 위치에 상응한다. 분석에 사용되는 등록 번호는 재료와 방법 섹션에 기술한다. APV-A, B 또는 C: 조류 뉴모바이러스 A(SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:33), B(SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, 또는 C형(SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:24), b-또는 hRSV: 소(SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:34) 또는 사람(SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:35) 호흡기 합포체 바이러스, PVM: 생쥐의 폐렴 바이러스(SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:27). L8: L 위치에서 RAP-PCR로 수득된 단편 8, L9/10: L 위치에서 RAP-PCR로 수득된 단편 9와 10의 공통서열. P 배열에서 APV-B 서열은 Genebank에서 입수할 수 없었고, L 배열에서는 bRSV, hRSV, APV-A 서열만 입수가능하였다.
도 4에서는 뉴모바이러스 속의 구성원과 바이러스 분리체 00-1의 N, P, M, F ORF의 계통유전학적 분석법을 도시한다. 계통유전학적 분석은 다음의 유전자로부터 얻은 바이러스 서열에서 실시하였다: F(패널 A), N(패널 B), M(패널 C), P(패널 D). 이런 계통유전학적 트리는 100개의 부트스트랩과 3개의 점블을 이용한 최대 유사성 분석에 기초한다. 뉴클레오티드 변화 개수를 나타내는 스케일을 각 트리에 도시한다.
도 5에서는 9가지 일차 MPV 분리체의 F패널 A), N(패널 B), M(패널 C), P(패널 D) ORF의 일부 및 이와 유전적으로 가장 근접한 APV-C에 대한 계통유전학적 상관관계를 도시한다. 뉴클레오티드 변화 개수를 나타내는 스케일을 각 트리에 도시한다. APV-C에 대한 등록 번호: 패널 A: D00850; 패널 B: U39295; 패널 C: X58639; 패널 D: U65312.
도 6A에서는 MPV 분리체 00-1 게놈의 3' 단부로부터 얻은 뉴클레오티드(SEQ ID NO: 36)와 아미노산(SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 21) 서열 정보를 도시한다. ORF를 제시한다. N: 핵단백질에 대한 ORF; P: 인단백질에 대한 ORF; M: 매트릭스 단백질에 대한 ORF; F: 융합단백질에 대한 ORF; GE: 유전자 종결; GS: 유전자 개시.
도 6B와 C에서는 MPV 00-1 분리체의 중합효소 유전자(L)에서 수득된 단편으로부터 얻은 뉴클레오티드와 아미노산 서열 정보를 도시한다. L에서 단편의 위치는 APV-C(등록 번호 U65312)와의 단백질 상동성에 기초한다. 번역된 단편 8(도 6B)(SEQ ID NO: 38과 SEQ ID NO: 39)은 아미노산 8 내지 243에 위치하고, 단편 9와 10의 공통 서열(도 6C)(SEQ ID NO: 40과 SEQ ID NO: 41)은 APV-C L ORF의 아미노산 1358 내지 1464에 위치한다.
도 7에서는 MPV 분리체 00-1의 게놈 지도를 도시한다. 시작과 종결 코돈의 뉴클레오티드 위치는 각 ORF에서 표시한다. L ORF를 가로지르는 이중선은 L 유전자의 단축된 표현을 나타낸다. 지도아래 3개의 해독틀은 일차 G ORF(nt 6262-6972) 및 중복되는 잠재적 이차 ORF를 나타낸다.
도 8에서는 MPV 핵단백질(SEQ ID NO: 1)과 다른 뉴모바이러스 핵단백질(SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7)의 예상 아미노산 서열의 배열을 도시한다. Barr(1991)에 의해 동정된 보존된 영역은 박스로 표시하고 A, B, C로 표지한다. 뉴모바이러스간 보존된 영역(Li, 1996)은 회색 음영(shade)으로 도시한다. 차이는 대시로 표시하고, MPV와 비교하여 동일한 아미노산 잔기의 위치는 피리어드(period)로 표시한다.
도 9에서는 MPV 인단백질(SEQ ID NO: 8)과 다른 뉴모바이러스 인단백질(SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13)의 아미노산 서열을 비교한다. 높은 상동성 영역(Ling, 1995)은 박스로 표시하고, 글루타메이트 풍부한 영역은 회색 음영으로 표시한다. 차이는 대시로 표시하고, MPV와 비교하여 동일한 아미노산 잔기의 위치는 피리어드(period)로 표시한다.
도 10에서는 MPV 매트릭스 단백질(SEQ ID NO: 14)과 다른 뉴모바이러스 매트릭스 단백질(SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20)의 추정 아미노산 서열을 비교한다. 보존된 헥사펩티드서열(Easton, 1997)은 회색 음영으로 표시한다. 차이는 대시로 표시하고, MPV와 비교하여 동일한 아미노산 잔기의 위치는 피리어드(period)로 표시한다.
도 11에서는 MPV 융합단백질(SEQ ID NO: 21)과 다른 뉴모바이러스 융합단백질(SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27)의 예상 아미노산 서열의 배열을 도시한다. 보조된 시스테인 잔기는 박스로 표시하고, N-연결된 당화 부위는 밑줄로 표시하며, F0의 절단 부위는 이중의 밑줄로 표시하고, 융합펩티드, 신호펩티드, 막 정착 도메인은 회색 음영(shade)으로 도시한다. 차이는 대시로 표시하고, MPV와 비교하여 동일한 아미노산 잔기의 위치는 피리어드(period)로 표시한다.
도 12에서는 MPV M2 ORF와 다른 뉴모바이러스 M2 ORF의 아미노산 서열을 비교한다. M2-1 ORF의 배열은 패널 A(SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54)에 도시하는데, 보존된 아미노산 단부(Collins, 1990; Zamora, 1999)는 회색 음영으로 표시한다. 3개의 보조된 시스테인 잔기는 굵은 글씨체로 쓰고 #으로 표시한다. M2-2 ORF의 배열은 패널 B(SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62)에 도시한다. 차이는 대시로 표시하고, MPV와 비교하여 동일한 아미노산 잔기의 위치는 피리어드(period)로 표시한다.
도 13에서는 MPV SH ORF의 아미노산 서열 분석법을 도시한다. (A) 세린과 트레오닌 잔기는 회색 음영으로, 시스테인 잔기는 굵은 글씨체로, 소수성 영역은 이중의 밑줄로 표시된 MPV SH ORF의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 63). 번호는 소수성 도메인의 측면에 위치하는 염기성 아미노산의 위치를 나타낸다. (B) MPV, APV-A, hRSV-B의 SH 단백질의 소수성 플랏 배열. 17개 아미노산의 윈도우(window)와 함께 Kyte와 Doolittle(1982)의 과정을 이용하였다. 화살표는 강한 소수성 도메인을 표시한다. ORF내에서 위치는 X-축에 제시한다.
도 14에서는 MPV G ORF의 아미노산 서열 분석법을 도시한다. (A) 세린, 트레오닌, 프롤린 잔기는 회색 음영으로, 시스테인 잔기는 굵은 글씨체로, 소수성 영역은 이중의 밑줄로 표시된 MPV G ORF의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 64). 잠재적인 N-연결된 당화 부위는 1개의 밑줄로 표시한다. (B) MPV, APV-A, hRSV-B의 G 단백질의 소수성 플랏 배열. 17개 아미노산의 윈도우(window)와 함께 Kyte와 Doolittle(1982)의 과정을 이용하였다. 화살표는 소수성 도메인을 표시하고, ORF내에서 위치는 X-축에 제시한다.
도 15에서는 MPV(SEQ ID NO: 65)와 다른 파라믹소바이러스(SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75)의 중합효소 유전자의 보존된 도메인의 아미노산 서열을 비교한다. 도메인 III을 도시하는데, 도메인 Ⅲ에서 4개의 보존된 중합효소 모티프(A, B, C, D)(Poch 1998, 1999)는 박스로 표시한다. 차이는 대시로 표시하고, MPV와 비교하여 동일한 아미노산 잔기의 위치는 피리어드(period)로 표시한다. hPIV3: 3형 사람 파라인플루엔자 바이러스; SV: 센다이 바이러스; hPIV-2: 2형 사람 파라인플루엔자 바이러스; NDV: 뉴캐슬병 바이러스; MV: 홍역 바이러스; 니파(nipah): 니파바이러스.
도 16에서는 MPV와 선별된 파라믹소바이러스의 M2-1과 L ORF의 계통유전학적 분석법을 도시한다. M2-1 ORF는 다른 뉴모바이러스(Pneumovirinae) 속 구성원의 M2-1 ORF와 함께 배열되고(A) L ORF는 도 15의 범례에서 밝힌 뉴모바이러스(Pneumovirinae) 속과 선별된 다른 파라믹소바이러스의 L ORF와 함께 배열되었다(B). 계통유전학적 트리는 100개의 부트스트랩과 3개의 점블을 이용한 최대 유사성 분석으로 만들었다. 뉴클레오티드 변화 개수를 나타내는 스케일은 각 트리에 도시한다. 트리에서 번호는 공통 트리에 기초한 부트스트랩 수치를 나타낸다.
도 17에서는 hMPV 분리체 00-1의 비-코딩 서열을 도시한다. (A) ORF와 게놈 단부 사이의 비-코딩 서열은 파지티브 센스에 도시한다. 좌측에서부터 우측으로, 지정된 ORF의 종결 코돈을 도시하고, 이후 지정된 후속 ORF의 비-코딩 서열, 유전자 개시 신호, 출발 코돈을 도시한다. 번호는 hMPV 유전자지도에서 출발과 종결 코돈의 첫 번째 위치를 나타낸다. 공개된 유전자 단부 신호와 유사성을 보이는 서열은 밑줄로 표시하고, UAAAAAU/A/C에 유사성을 보이는 서열은 서열 위 직선으로 표시한다(SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84). (B) hMPV의 게놈 단부의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90). hMPV의 게놈 단부는 상호 및 APV 게놈 단부와 배열한다. 밑줄된 영역은 APV와 RSV의 3'와 5' 단부 서열에 기초한 RT-PCR 분석법에 사용되는 프라이머 서열을 나타낸다(Randhawa et al., 1997; Mink et al., 1991). 굵게 이탤릭체로 표시된 뉴클레오티드는 N 유전자의 유전자 개시 신호의 일부이다. Le: 리더 Tr: 테일러.
도 18에서는 2가지 프로토타입 hMPV 분리체와 APV-A 및 APV-C를 비교한다; 다양한 바이러스 단백질을 인코드하는 핵산에 대한 DNA 유사성 매트릭스.
도 19에서는 2가지 프로토타입 hMPV 분리체와 APV-A 및 APV-C를 비교한다; 다양한 바이러스 단백질에 대한 단백질 유사성 매트릭스.
도 20에서는 2가지 프로토타입 hMPV 분리체 핵단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 91)을 도시한다.
도 21에서는 2가지 프로토타입 hMPV 분리체 인단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 92)을 도시한다.
도 22에서는 2가지 프로토타입 hMPV 분리체 매트릭스단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 92)을 도시한다.
도 23에서는 2가지 프로토타입 hMPV 분리체의 융합단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 94)을 도시한다.
도 24에서는 2가지 프로토타입 hMPV 분리체의 M2-1 단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 95)을 도시한다.
도 25에서는 2가지 프로토타입 hMPV 분리체의 M2-2 단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 96)을 도시한다.
도 26에서는 2가지 프로토타입 hMPV 분리체의 짧은 소수성 단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 97)을 도시한다.
도 27에서는 2가지 프로토타입 hMPV 분리체의 부착 당단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 98)을 도시한다.
도 28에서는 2가지 프로토타입 hMPV 분리체의 중합효소 단백질의 N-말단의 아미노산 배열(SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100)을 도시한다.
도 29에서는 ned/00/01 및/또는 ned/99/01으로 접종된 12마리 기니아 피그의 목과 코 면봉시료에 대한 RT-PCR 분석의 결과를 도시한다.
도 30A에서는 ned/00/01로 감염되고 ned/00/01(GP 4, 5, 6) 또는 ned/99/01 (GP 1, 3)로 재감염된 기니아 피그에서 ned/00/01과 ned/99/01에 대한 IgG 반응을 도시한다.
도 30B에서는 ned/99/01로 감염되고 ned/00/01(GP 8, 9) 또는 ned/99/01(GP 10, 11, 12)로 재감염된 기니아 피그에서 ned/00/01과 ned/99/01에 대한 IgG 반응을 도시한다.
도 31에서는 ned/00/01 또는 ned/99/01로 감염된 기니아 피그로부터 얻은 혈청에서 ned/00/01와 ned/99/01 ELISA의 특이성을 도시한다.
도 32에서는 3마리 상동성(00-1/00-1) 감염된 기니아 피그, 2마리 상동성(99-1/99-1) 감염된 기니아 피그, 2마리 이질성(99-1/00-1) 감염된 기니아 피그, 2마리 이질성(00-1/99-1) 감염된 기니아 피그의 ned/00/01와 ned/99/01 ELISA에 대한 평균 IgG 반응을 도시한다.
도 33에서는 hMPV 감염된 기니아 피그의 APV 저해의 평균 비율을 도시한다.
도 34에서는 ned/00/01, ned/99/01, APV-C에 대한 ned/00/01와 ned/99/01 감염된 기니아 피그의 바이러스 중화 역가를 도시한다.
도 35에서는 ned/00/01로 접종(2회)된 마카크 게잡이원숭이의 목 면봉시료에서 RT-PCR 분석의 결과를 도시한다.
도 36A(상부의 2가지 패널)에서는 ned/00/01로 감염(재감염)된 2마리 마카크 게잡이원숭이의 ned/00/01에 대한 IgA, IgM, IgG 반응을 도시한다.
도 36B(하부 패널)에서는 ned/00/01로 감염된 2마리 마카크 게잡이원숭이의 APV에 대한 IgG 반응을 도시한다.
도 37에서는 사람 혈청에서 IgG 항체의 검출을 위한 hMPV ELISA와 APV 저해 ELISA의 이용을 비교한다.
실시예 1
재조합 N 단백질을 이용한 간접 항- MPV IgG EIA
항원으로 재조합 N 단백질(곤충(Sf9) 세포에 있는 제조합 바쿨로 바이러스로 생성된)을 이용한 간접 IgG EIA로 실행할 수 있다. 항원 조제를 위해서는 Sf9세포는 재조합 바쿨로바이러스로 감염시키고, 감염후에 3-7일간 배양하였다. 세포 현탁액은 PBS, pH 7.2로 2회 씻어내고, 세포 밀도를 5.0 x 106 cells/㎖로 조정한 후에, 냉동-해동을 3회 반복시켰다. 덩어리가 큰 세포 찌꺼기는 저속 원심분리(500 x g 15분간)시키고, 상층액을 회수하여, 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다. 감염안된 세포는 네거티브 대조 항원의 경우와 유사하게 처리하였다.
냉동-해동 용해물질 100㎕을 이용하여 미량적정 평판에 피복시키고, 이때 희석배수 범위는 1:50 내지 1:1000이 된다. 감염안된 세포 용해물질은 이중 웰에서 실시하고, 이를 네거티브 대조로 이용한다. 하룻밤동안 배양 한 후에, 평판은 PBS/0.05% Tween으로 2회 씻어낸다. 테스트 혈청은 1:50 내지 1:200 비율로 ELISA 완충액(PBS, 2%까지 정상 염소 혈청과 0.5% 소 혈청 알부민, 0.1% 우유 보충)d,로 희석시킨 다음 37℃에서 1시간동안 배양시킨다.
평판은 PBS/0.05%Tween으로 2회 씻어낸다. 양고추냉이 과산화효소로 표지된 염소 항-사람(또는 다른 종에 대해 발생된) IgG(1:3000 내지 1:5000 비율로 ELISA 완충액으로 희석시킴)를 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 배양시켰다. 그 다음 평판을 PBS/0.05%Tween으로 2회 씻어내고, 수돗물로 1회 씻은 후에, 효소 기질 TMB, 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘(Sigma)과 함께 실온에서 15분간 배양시켰다. 반응은 100㎕ 2M 인산을 이용하여 중단시킨다. 자동화된 미량 적정 판독기를 이용하여, 450㎚에서 발생 변화를 판독한다.
실시예 2: 재조합 핵단백질을 이용한 캡쳐 항- MPV IgM EIA
항원으로 재조합 핵단백질 또는 임의 다른 재조합 단백질을 이용한 캡쳐 IgM EIA를 Erdman et al(1990) J. Clin. Microb. 29:1466-1471)에서 설명하는 방법을 상기에서 설명한 것과 같이 변형시켜 실시할 수 있다. Dako에서 수득한 것과 같은 친화력을 이용하여 정제한 항-사람 IgM 캡쳐 항체(또는 다른 종에 대한 항체)를 0.1M 탄산 완충액 pH9.6에서 웰당 250ng 농도로 미량 적정 평판의 웰에 첨가한다. 실온에서 하룻밤동안 배양시킨 후에, 평판은 PBS/0.05%Tween으로 2회 씻어낸다. 100㎕ 테스트 혈청(ELISA 완충액으로 1:200 내지 1:1000으로 희석됨)을 삼중 웰에 첨가시키고, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 그 다음 평판은 PBS/0.05%Tween으로 2회 씻어낸다.
냉동-해동된(재조합 바이러스로 감염된) Sf21세포 용해물질을 1:100 내지 1:500으로 ELISA 완충액으로 희석시켜, 웰에 첨가시키고, 37℃에서 2시간동안 배양시켰다. 감염안된 세포 용해물질은 네거티브 대조로 이용하고, 이중 웰상에서 실시하였다. 그 다음 평판은 PBS/0.05%Tween으로 3회 씻어낸 후에, MPV에 대한 항체를 ELISA 완충액을 이용하여 적절하게 희석시킨 100㎕를 함께 37℃에서 1시간동안 배양시켰다. PBS/0.05%Tween으로 2회 씻어낸 후에, 평판은 양고추냉이 과산화효소 라벨된 2차 항체(토끼-항-흰족제비)와 함께 배양시키고, 37℃에서 20분간 배양시킨다. 그 다음 평판은 PBS/0.05%Tween으로 5회 씻어낸 후에, 효소 기질 TMB, 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘(Sigma)과 함께 실온에서 15분간 배양시켰다. 반응은 100㎕ 2M 인산을 이용하여 중단시킨다. 자동화된 미량 적정 판독기를 이용하여, 450㎚에서 발생 변화를 판독한다.
재조합 핵산(또는 다른 재조합 단백질)을 이용한 캡쳐 IgM EIAs의 감응성 및 전체 MPV 바이러스의 감응성을 비교하는데, 임상학적으로 MPV 바이러스 감염된 급성 및 회복기상에 있는 환자의 혈청 쌍을 이용한다. 재조합 핵단백질 캡쳐 EIA의 감응성은 건강한 사람에서 얻은 시료와 다른 파라믹소바이러스 감염된 환자에서 얻은 시료를 테스트하여 결정한다.
바쿨로바이러스 발현에 의해 생성된 재조합 MPV 융합 및 당단백질을 이용한 EIA의 가능성.
당단백질 G와 F는 MPV 비리온의 2가지 막통과 외피 당단백질로써 주요 중화 및 보호 항원을 나타낸다. 바쿨로바이러스 시스템과 같은 벡터 바이러스 시스템에서 이와 같은 당단백질의 발현은 MPV 특이적인 항체 감지를 위한 검사에 이용할 수 있는 재조합 항원 소스를 제공한다. 또한, 핵단백질과 복합하여 사용하면, MPV에 대한 항체를 감지하는 효소 면역검사 감응성을 추가 강화시킬 수 있다.
여기에서 설명하는 것에 또 다른 방법으로 다양한 다른 면역학적 검사(Current Protocols in Immunology)를 이용할 수 있다.
바이러스 분리체를 찾기 위해, 사람, 육식동물(개, 고양이, 물개), 말, 반추동물(소, 양, 염소), 돼지, 토끼, 새(가금류)로부터 비인후 흡입물, 목, 비강 면봉시료, 기관지 기포 세척액, 기관지 면봉시료를 검사할 수 있다. 새로부터, 배설물, 내장 면봉시료, 배설물을 또한 검사할 수 있다. 모든 시료의 경우에, 혈청학(항체 및 항원 감지등), 바이러스 분리, 핵산 감지 기술을 시행하여 바이러스를 감지할 수 있다. 정제된 MPV(또는 이의 일부분 가령, 단백질 또는 펩티드)로 쥐(또는 다른 동물)에 면화주사를 주고, 정립된 하이브리도마 기술을 이용하여, 단클론 항체를 만들 수 있다(Current protocols in Immunology). 또는 이 목적으로 파아지 디스플레이 기술을 이용할 수 있다(Current protocols in Immunology). 유사하게, 감염된 사람 또는 동물에서 또는 면역화된 사람 또는 동물로부터 다클론 항체를 수득할 수 있다(Current protocols in Immunology).
NS1 및 NS2 단백질의 존재여부 감지는 웨스턴 블랏팅, IFA, 다양한 항체 조제물을 이용한 면역 침전 기술을 이용하여 실행할 수 있다. 바이러스 분리체내에 NS1 및 NS2 유전자 또는 이의 유사체의 존재여부 감지는 공지의 NS1 및 NS2 유전자뿐만 아니라 핵산 하이브리드 반응 기술을 이용한 PCR을 이용하여 실행할 수 있다.
바이러스 게놈의 3'단부에 NS1 및 NS2 유전자의 존재여부 감지를 결정하기 위해, PCR를 실행하는데, 게놈의 3' 단부에 특이적인 프라이머를 이용한다. 우리 경우에는 바이러스 게놈의 3' 해독안된 부분에 특이적인 프라이머를 이용하고, N ORF에 있는 프라이머를 이용하였다. PCR 산물의 길이 또는 뉴클레오티드 서열을 이용하면 NS1 및 NS2 유전자의 존재여부가 감지된다. NS1 및 NS2 유전자에 특이적인 프라이머를 바이러스 게놈의 3'단부의 다른 부분(해독안된 부분 또는 N, M, F ORF)에 특이적인 프라이머와 복합하여 사용하면, NS1 및 NS2 유전자가 존재한다는 것을 알 수 있다. PCR에 추가하여, 분자 클로닝, 핵산 하이브리드 반응과 같은 다양한 기술을 동일한 목적에 이용할 수 있다.
실시예 3: MPV 의 상이한 혈청타입/소단위
9개 바이러스 분리체의 N, M, F, L ORF에 부분적인 뉴클레오티드 서열을 분석하면 두 가지 잠재적인 유전자 군상을 확인할 수 있다. 군상내에서는 90-100% 뉴클레오티드 상동성을 가지고, 군상간에는 81-88% 상동성을 나타낸다. 다른 바이러스 분리체에서 수득한 추가 정보로 두 가지 유전자형이 존재한다는 것을 확인하였다. 군상 A 프로토타입으로 바이러스 분리체 ned/00/01과 군상 B 프로토타입 바이러스 분리체 ned/99/01을 교차 중화 반응 검사에 이용하여, 유전자형이 다른 혈청형 또는 소단위에 상관관계가 있는 지를 검사하였다.
결과
중합효소 유전자내에 위치하는 프라이머를 이용한 RT-PCR 검사에서, 우리는 비인후 흡입물 시료로부터 추가 30개의 바이러스 분리체를 확인하였다. 이들 새로운 분리체와 기존의 9개 분리체의 매트릭스 부분과 중합효소 유전자 부분 서열 정보를 이용하여 계통학적인 분류 구조를 작성하였다(도 16). 이들 구조를 분석하면, 두 가지 유전자형 군상이 존재한다는 것을 확인할 수 있는데; A군에서 프로토타입으로 바이러스로써 바이러스 분리체 ned/00/01과 군상 B 프로토타입 바이러스로써 바이러스 분리체 ned/99/01. 이들 군간에 상동성은 81-85%이다.
바이러스 분리체 ned/00/01과 ned/99/01을 흰족제비에 접종하면, 바이러스-특이적인 항혈청을 만들 수 있다. 이와 같은 항혈청은 이들 두 가지 바이러스와 함께 바이러스 중화 검사에 이용되었다.
바이러스 중화 반응 역가
분리체 00-1 분리체 99-1
preserum
흰족제비 A
(00-1)		 □2

 □2
흰족제비 A
22 dpi
(00-1)		 64

 □2
preserum
흰족제비 B
(99-1)		 □2

 □2
흰족제비 B
22 dpi
(99-1)		 4

 64
분리체 00-1의 경우, 역가는 32(64/2)배 상이하다.
분리체 99-1의 경우, 역가는 16(64/4)배 상이하다.
또한, 6마리 기니아 피그에 바이러스 (ned/00/01 또는 ned/99/01)를 접종하였다. 비인후 흡입물 시료상에서 RT-PCR 검사 결과 감염후 2일 내지 10일까지 바이러스 복제가 있었던 것을 알 수 있다. 감염 후 70일경에 기니아 피그에 상동성 또는 이형성 바이러스로 자극을 주었고, 네 가지 모든 경우에서 바이러스 복제가 감지되었다.
1차 감염 바이러스
복제		 2차 감염 바이러스
복제
기니아 피그 1-3 00-1 2/3 99-1 1/2
기니아 피그 4-6 00-1 3/3 00-1 1/3
기니아 피그 7-9 99-1 3/3 00-1 2/2
기니아 피그 10-12 99-1 3/3 99-1 1/3
주: 2차 감염의 경우에 기니아 피그 2와 9는 더 이상 사용하지 않았다.
1차 시도후에 항혈청을 이용한 바이러스 중화반응 검사에서는 흰족제비를 이용하여 실시한 VN 검사와 동일한 결과를 나타내었다(VN 역가에서 >16배 이상 차이).
이 실시예에서 제시한 결과는 두 가지 유전자형이 존재한다는 것을 확인시켰으며, 이는 MPV의 두 가지 혈청형에 상응하는 것으로 이형 또는 상동성 바이러스로 반복 감염이 가능하다는 것을 보여주었다.
실시예 4: 추가 서열 결정
이 실시예에서는 MPV의 개방 해독틀(ORF)의 서열 추가 분석과 내부 서열 및 게놈 말단의 부분 서열에 대해 설명하고 있다.
MPV의 핵단백질(N), 인단백질(P), 매트릭스단백질(M), 융합단백질(F) 유전자의 서열 분석에서는 미합중국에서 새들에게서 주로 발견되는 조류 뉴모바이러스, APV 혈청타입 C와 높은 서열 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 분석에서는 바이러스 게놈의 3'말단에서 비구조적 단백질 NS1 및 NS2가 없음을 나타내고, 매트릭스 단백질에 바로 인접한 융합 단백질의 위치를 나타내었다. 우리는 22K(M2) 단백질, 작은 소수성(SH) 단백질, 부착(G) 단백질, 중합효소(L) 단백질 유전자, 인터제닉 부분 및 트레일러 서열을 나타내었다. 기존에 설명한 서열과 복합하면, 유전자 말단의 최말단 12-15 뉴클레오티드를 제외하고는 MPV 게놈 서열을 완성하였고, MPV의 게놈 구조를 완성하였다. MPV 게놈 서열과 APV A, B, C, RSV 서브타입 A 및 B, PVM 및 다른 파라믹소바이러스의 서열을 나란히 비교하면, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속에서 MPV 분류에 대한 강력한 증거를 제공할 수 있다.
결과
서열화 전략
MPV 분리체 00-1(van den Hoogen et al., 2001)는 제3기 원숭이 신장(tMK)세포에서 증식시켜, 접종 3주후에 상층액으로부터 분리한 RNA를 RT-PCR 분석시에 주형으로 이용하였다. 프라이머는 MPV 00-1(van den Hoogen et al., 2001)에 이용할 수 있는 부분적인 서열 정보뿐만 아니라 APV 및 RSV(Randhawa et al., 1997; Mink et al., 1991)의 리더 및 트레일러 서열 정보를 이용하여 고안하였다. 우선, 기존에 수득된 생성물, 길이가 500bp 내지 4Kb인 단편을 RT-PCR 증폭을 통하여 만든 후에, 직접 서열을 결정하였다. 게놈 서열은 전체 MPV 게놈을 나타내는 500 내지 800bp 크기의 겹쳐지는 RT-PCR 일련의 단편을 생성시켜 확인할 수 있다. 모든 PCR 단편의 경우에, 두 가닥 모두 바로 서열화시켜, 증폭을 최소화시키고, 서열화에 따른 오류를 최소화시켰다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 이용하여, BLAST 소프트웨어(www.ncbi.nlm.gov/BLAST)를 이용하여 Genebank 데이터베이스에 있는 서열과의 상동성에 대해 조사하였다. 게놈상에 공지의 바이러스 유전자 및 이들 위치와의 상동성을 기초하여 개방 해독틀(ORF) 단백질 이름을 부여하였다. 이 정보를 기초로 하여, MPV에 대한 유전자 지도를 작성하였다(도 7). MPV 게놈은 길이가 13378개 뉴클레오티드이고, 이 구조는 APV의 게놈 구조와 유사하다. 아래에서는 ORF와 MPV의 비-코딩 서열과 다른 파라믹소바이러스간에 비교를 하였고, 중요한 유사성과 차이에 대해 논의하였다.
뉴클레오티드(N) 유전자
나타낸 바와 같이, MPV의 게놈 지도에서 처음 유전자는 394개 aa 단백질을 인코드하고, 다른 뉴모바이러스의 N 단백질과 상당한 상동성을 나타낸다. N ORF의 길이는 APV-C의 N ORF의 길이와 동일하고(표 5), 다른 파라믹소바이러스의 것보다는 작다(Barr et al., 1991). 아미노산 서열 분석으로 APV-C와는 최대 상동성을 나타내었고(88%); 다른 파라믹소바이러스와는 단지 7-11%의 상동성을 나타내었다(표 6).
Barr et al(1991)은 모노네가비리알(Mononegavirales) 목(目)에 속하는 바이러스간에 유사성을 가지는 3 부분; : A, B, C을 확인하였다(도 8). 바이러스 과내에서 유사성이 최대로 나타나기는 하지만, 이들 부분은 바이러스 과(科)사이에서도 상당히 보존되어있다. 이들 세부분 모두에서, MPV는 APV-C와는 97% aa 서열 상동성을 나타내었고, APV-B와는 89% 상동성을; APV-A와는 92% 상동성을; RSV 및 PVM와는 66-73% 상동성을 나타내었다. 아미노산 잔기160 및 340사이에 부분은 메타뉴모바이러스간에도 상당히 보존되어 있으나 뉴모비리네(Pneumovirinae)에서는 다소 그 정도가 낮았다(Miyahara et al., 1992; Li et al., 1996; Barr et al., 1991). 이는 MPV가 APV C와는 100% 상동성을 나타내어 MPV가 메타뉴모바이러스라는 것과 일치한다.
인단백질 (P) 유전자
유전자 지도에서 두 번째 ORF는 294aa 단백질을 인코드하는데, APV-C P 단백질과는 68% 아미노산 서열 상동성을 공유하고, RSV의 P 단백질과는 22-26%만의 상동성을 공유한다(표 6). MPV의 P 유전자는 실제 한 개 ORF를 포함하고, 이는 많은 다른 파라믹소바이러스에서 취한 P와 유사하다(Reviewed in Lamb and Kolakofsky, 1996; Sedlmeier et al., 1998).
APV A 및 B, PVM와는 대조적이고, RSV 및 APV-C과는 유사하게, MPV P ORF는 시스테인 잔기가 결여되어있다. Ling(1995)은 모든 뉴모바이러스간에 매우 상동성이 높은 부분(aa 185-241)은 RNA 합성 공정 또는 뉴클레오캡시드 복합체의 구조적 일체성을 유지하는데 중요한 역할을 한다고 제시하였다. 이와 같은 유사성이 높은 부분은 MPV에서도 발견되는데(도 9) 특히, 보존성 대입부를 고려할 때, APV-C와는 100%, APV-A 및 B와는 93%, RSV와는 약 81% 상동성을 나타낸다. MPV P 단백질의 C-말단에는 APV(Ling et al., 1995)에서 설명한 것과 같이 글루타민 잔기가 많다.
매트릭스(M) 단백질 유전자
MPV의 세 번째 ORF는 254aa 단백질을 코드하는데, 이는 다른 뉴모바이러스의 M ORF와 닮았다. MPV의 M ORF는 다른 메타뉴모바이러스의 M ORF와 크기가 정확하게 일치하고(표 5), APV의 매트릭스 단백질과 서열 상동성이 높고(78-87%), RSV 및PVM와는 서열 상동성이 낮고(37-38%), 다른 파라믹소바이러스와는 10% 또는 그 미만의 상동성을 가진다(표 6).
Easton(1997)은 모든 뉴모바이러스의 매트릭스 단백질의 서열을 비교하였고, MPV에서도 보존된 것으로 나타나는 잔기 14 내지 19에서 보존된 헵타펩티드를 발현하였다(도 10). RSV, PVM, APV의 경우에, M의 주요 ORF내에 또는 이와 겹쳐지는 작은 두 번째 ORF가 확인되었다(bRSV에서는 52aa 및 51; RSV의 경우에 75aa; PVM의 경우에 46aa; APV의 경우에 51aa)(Yu et al., 1992; Easton et al., 1997; Samal et al., 1991; Satake et al., 1984). 우리는 MPV의 M ORF내에 두 개의 작은 ORF를 주목하였다. 54aa 잔기로 된 한 개의 작은 ORF는 주요 M ORF에서 발견되었다(단편 1, 도 7). 이는 뉴클레오티드 2281에서 시작되는 것이고, 다른 33aa 잔기로 된 작은 ORF는 뉴클레오티드 2893에서 시작되는 M의 주요 ORF와 겹쳐지는 것을 발견하였다(단편 2, 도 7). RSV 및 APV의 두 번째 ORF와 유사하게, 다른 뉴모바이러스의 두 번째 ORF와 이들 두 번째 ORF간에 상당한 유사성은 없었고, 실제 시작 또는 종료 신호가 부족하였다. 또한, APV 및 RSV의 이와 같은 두 번째 ORF에 상응하는 단백질 합성에 대한 증거에 대해서도 보고된 바 없다.
융합 단백질 (F) 유전자
MPV의 F ORF는 M ORF에 인접하여 위치하고, 이는 메타뉴클레오티드(Metapneumovirus) 속의 구성원에 대한 특징을 가진다. MPV의 F 유전자는 539aa 단백질을 인코드하는데, 이는 APV-C의 F보다는 두 개의 aa 잔기가 더 많다(표 5). aa 서열 분석 결과에서, APV-C와는 88% 상동성을 나타내고, APA-A 및 B와는 67% 상동성을 나타내고; 뉴모바이러스 F와는 33-39% 상동성을 나타내고, 다른 파라믹소바이러스와는 단지 10-18%의 상동성을 나타낸다(표 6). 파라믹소바이러스의 F 단백질 가운데 보존된 특징중에 하나(MPV에서도 볼 수 있는 것으로)는 시스테인 잔기 분포이다(Morrison, 1988; Yu et al, 1991). 메타뉴모바이러스는 Fa에 12개의 시스테인 잔기를 공유하는데(7개는 모든 파라믹소바이러스에서 보존된 특징); F2에서는 두 개 시스테인 잔기를 공유한다(1개는 모든 파라믹소바이러스간에 보존된 것). MPV의 F ORF에 존재하는 3군데 N-연결된 글리코실화 가능 부위중에는 RSV와 공유하는 것은 없으며, 두 개(위치 74와 389)는 APV와 공유한다. 세 번째, 독특한 MPV의 N-글리코실화 가능 부위는 위치 206에 있다(도 11).
다른 파라믹소바이러스와의 서열 상동성이 낮은데도 불구하고, MPV의 F 단백질 은 다른 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)의 F 단백질에서 설명한 것과 일치하는 전형적인 융합 단백질 특징을 나타낸다(Morrison, 1988). 파라믹소비디데(Paramyxoviridae )의 F 단백질은 비활성 전구물질(F0)로 합성되고, 숙주 세포 프로테아제에 의해 절단되어, 아미노 말단 F2 소단위와 큰 카르복시 말단 F1 소단위가 만들어진다. 제시된 절단 부위는 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)간에 보존되어있다. MPV의 절단 부위는 잔기 RQSR를 포함한다. 아르기닌(R) 잔기는 APV, RSV와 공유하나, 글루타민(Q), 세린(S) 잔기는 사람의 파라인플루엔자 바이러스 타입 1(human parainfluenza virus type 1), 센다이 바이러스(Sendai virus), 모르빌리바이러스(morbilliviruses)와 같은 다른 파라믹소바이러스와 공유한다(자료 제공하지 않음).
F1의 아미노 말단에 있는 소수성 부분은 막 융합 도메인으로 기능을 하는 것으로 보이고, 파라믹소바이러스 및 모르빌리바이러스 간에 상당한 서열 상동성을 나타내고, 뉴모바이러스와는 그 정도가 덜한 것으로 나타났다(Morrison, 1988). 이들 26개 잔기(위치 137-163, 도 11)는 MPV 및 APV-C간에 보존되어있는데, 이는 이 부분이 메타뉴모바이러스간에 상당히 보존된 부분이라는 것과 일치한다(Naylor et al, 1998; Seal et al., 2000).
APV 및 다른 파라믹소바이러스의 F 2 소단위에서 볼 수 있는 것과 같이, MPV는 RSV와 비교하였을 때, 22개 aa 잔기가 결손된 것으로 나타났다(위치 107-128, 도 11). 또한, RSV 및 APV의 경우에, 신호 펩티드 및 고정 도메인이 서브타입내에서 보존되어 있으며, 이는 서브타입간에 상당한 다양성을 나타내는 것으로 나타났다(Plows et al., 1995; Naylor et al., 1998). F2 아미노 말단에서 MPV(aa 10-35, 도 11)의 신호 펩티드는 APV-C와는 어느 정도의 서열 유사성을 나타내는데(26개 aa 잔기중에 18개가 유사), 다른 APVs나 RSV와는 보존성이 적다. APV-C와 약간의 상동성을 나타내기는 하지만, F1의 카르복시 말단에 있는 막 고정 도메인에서는 훨씬 많은 다양성이 나타난다.
22K( M2 ) 단백질
M2 유전자는 뉴모바이러스(Pneumovirus)에 독특한 것이고, 두 개의 겹쳐지는 ORF가 모든 뉴모바이러스에서 관찰되었다. 첫 번째 주요 ORF는 바이러스 중합효소의 진행성을 강화시키는 M2-1 단백질을 나타내고(Collins et al., 1995; Collins, 1996), 유전자 내 부분에 해독부분을 나타낸다(Hardy et al., 1998; Fearns et al., 1999). F 유전자에 인접하게 있는 MPV의 M2-1 유전자는 187aa 단백질을 인코드하고(표 5), APV-C의 M2-1과 최대 상동성(84%)을 나타낸다(표 6). 모든 뉴모바이러스와 비교하였을 때, M2-1은 단백질의 아미노-말단 절단에서 최대한으로 보존된 것으로 볼 수 있는데(Collins et al., 1990; Zamora et al., 1992; Ahmadian et al., 1999), 이는 MPV가 단백질의 처음 80개 aa 잔기에서 APV-C와 100% 유사성을 나타낸다는 것과 일치한다(도 12A). MPV M2-1 단백질에는 처음 30aa 잔기내에 위치하고 있는 3개의 시스테인을 포함하는데, 이는 모든 뉴모바이러스종간에 보존된 것이다. 이와 같은 시스테인 농도는 아연이 결합된 단백질에서 흔히 볼 수 있다(Ahmadian et al., 1991; Cuesta et al., 2000).
뉴모바이러스의 M2-1 ORF와 겹쳐지는 두 번째 ORF2(M2-2)는 위치에서는 보존된 편이나 서열에서는 보존된 것이 아니어서 이는 바이러스 RNA 복제 및 전사간의 전환 제어가 관계된 것으로 보고 있다(Collins et al., 1985; Elango et al., 1985; Baybutt et al., 1987; Collins et al., 1990; Ling et al., 1992; Zamore et al., 1992; Alansari et al., 1994; Ahmadian et al., 1999; Bermingham et al., 1999). MPV의 경우에, M2-2 ORF는 M2-1 ORF에서 뉴클레오티드 512에서 출발하는데(도 7), 이는 APV-C의 경우와 동일한 출발점이다. M2-2 ORF의 길이는 APV-C, MPV와 동일한 길이, 즉, 71aa 잔기가 된다. M2-2 ORF 서열 비교에서, MPV와 APV-C간에는 56% 아미노산 서열 상동성을 나타내고, MPV, APV-A, Brk에는 26-27%만의 서열 상동성을 나타낸다(표 6).
작은 소수성 단백질( SH ) ORF
MPV의 M2에 인접하여 위치한 유전자는 183개 aa 단백질을 인코드한다(도 1 및 7). 뉴클레오티드 서열 및 이의 유추한 아미노산 서열 분석에서는 다른 RNA 바이러스 유전자 또는 유전자 생성물과 뚜렷한 상동성이 나타나지는 않은 것으로 나타났다. 이는 뉴모바이러스 SH 단백질간에 서열 상동성이 낮기 때문에 놀라운 일은 아니다. MPV의 가상 SH ORF는 현재까지 공지된 가장 긴 SH ORF이다.(표 1). SH ORF의 aa 잔기의 조성은 APV, RSV, MPV와 상대적으로 유사한데, 가장 큰 비중은 트레오닌 및 세린이다(MPV, APV, RSV A, RSV B, bRSV, PVM에서 각각 세린/트레오닌 함량 비는 22%, 18%, 19%, 20.0%, 21%, 28%이다). MPV의 SH ORF에는 10개의 시스테인 잔기를 포함하지만, APV SH에는 16개의 시스테인 잔기를 포함하고 있다. hMPV의 SH ORF에는 2군데 N-연결된 글리코실화 부분(aa 76 및 121)을 포함하나, APV의 경우에는 1개, RSV는 2개 또는 3개, PVM의 경우에는 4개를 가진다.
MPV SH 단백질 및 APV의 SH, RSV의 소수성 프로파일은 유사한 구조적 특징을 가지는 것으로 나타났다(도 7B). APV 및 MPV의 SH ORF는 친수성 N-말단을 가지고; 잠재적인 막 연결 도메인으로 작용하는 중앙 소수성 도메인(hMPV의 경우 aa 30-53); 두 번째 소수성 도메인(aa 155-170); 친수성 C-말단을 가진다. 대조적으로, RSV SH는 APV 및 MPV ORF의 C-말단 절반이 부족한 것으로 나타났다. 모든 뉴모바이러스 SH 단백질에서, 소수성 도메인은 염기성 아미노산에 인접해 있는데, 이 또한, MPV의 SH ORF에서 볼 수 있는 것이다(aa 29, 54).
부착 당단백질(G) ORF
MPV의 G ORF는 SH 유전자에 인접하여 위치하는데, 이는 236개 aa 단백질을 인코드한다(nt6262-6972, 도1). 두 번째 작은 ORF가 이 ORF다음에 바로 나타나는데, 이는 68개 aa 잔기를 인코드하나(nt 6973-7179), 출발 코돈을 가지고 있지 않다. 194개 aa 잔기로 된 상이한 개방 해독틀의 세 번째 주요 ORF는 이들 ORF 두 개와 겹쳐지나 시작 코돈이 없다(뉴클레오티드 6416-7000). 이 ORF 다음에는 동일한 개방 해독틀의 네 번째 ORF가 이어져 있는데(nt 7001-7198), 네 번째 ORF는 65개 aa 잔기를 코드하나, 시작 코돈을 가지고 있지 않다. 마지막으로, 97개 aa 잔기로 된 ORF(시작 코돈없음)이 세 번째 개방 해독틀에서 발견되었다(nt 6444-6737, 도 1). 첫 번째 ORF와는 달리, 다른 ORF는 실제 시작 코돈 또는 유전자 종료 서열이 없다(하기 참고). 236개 aa 잔기의 G ORF는 MPV 부착 단백질의 적어도 일부분이 되는 것 같지만, 추가 코딩 서열이 일부 RNA 교정과정을 통하여 부착 단백질의 일부분으로 또는 별개 단백질로 발현된다는 것을 배제할 수 없다. APV 및 RSV의 경우에, 주요 G ORF이후에 부차적인 ORF가 발견되지는 않았지만, APV 및 RSV는 모두 G의 주요 ORF내에 부차적인 ORF를 가지고 있었다. 그러나, 이들 ORF의 발견에 대한 증거가 부족하고, 상이한 바이러스에 대해 예상 aa 서열간에 상동성이 없었다(Ling et al., 1992). MPV G내에 부차적인 ORF는 다른 G 단백질의 성질을 나타내지 않았고, ORF가 추가로 발현되는지에 대해서는 더 조사를 해야 한다.
모든 ORF 모두를 이용한 BLAST 분석에서 다른 공지의 바이러스 유전자 또는 유전자 생성물과 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 수준에서 특별한 상동성을 나타내지는 않았다. 이는 hRSV A, B(53%)(Johnson et al., 1987)와 APV A, B(38%)(Juhasz et al., 1994)와 같은 다른 G 단백질에서 볼 수 있는 상동성이 낮다는 것과 일치한다.
MPV ORF의 대부분이 길이 및 서열에서 APV의 것과 닮았지만, MPV의 G ORF는 APV의 G ORF보다는 상대적으로 작았다(표 1). aa 서열에서는 세린과 트레오닌 함량이 34%로 나타났는데, 이는 RSV의 경우에 32%, APV의 경우에 24%보다 더 높은 것이다. G ORF는 또한, 8.5% 프롤린 잔기를 포함하는데, 이 또한 RSV의 경우에 8%, APV의 경우에 7%보다도 높은 것이다. 단백질의 3차 구조의 주요 결정 부분이 되는 뮤신 기원의 당 단백질에서도 APV, RSV, MPV의 G 단백질에서 비정상적으로 프롤린 잔기가 많다는 것이 관찰되었다(Collins et al., 1983; Wertz et al., 1985; Jentoft, 1990). MPV의 G 상에서 N-연결된 글리코실화 가능 부위의 수는 다른 뉴모바이러스의 수와 비슷하였다; MPV의 경우에는 5개; hRSV는 7개; bRSV는 5개; APV는 3 내지 5개를 가진다.
MPV G의 예상된 소수성 프로파일은 다른 뉴모바이러스와 비슷한 성질을 나타내었다. N-단부에는 친수성 부분에 있어, 짧은 소수성 부분(hMPV의 경우 aa 33-35), 주로 친수성인 카르복시 단부를 포함한다(도 8B). 전체적인 조직은 고정된 타입 II 막통과 단백질의 것과 일치하고, APV 및 RSV의 G 단백질에 있는 부분에 상응한다. MPV의 G ORF에는 1개의 시스테인 잔기를 가지는데, 이는 RSV와 APV의 것과는 대조적이다(각각 5개, 20개). G 유전자에 있는 4개의 부차적인 ORF중 두 개만이 한 개의 추가 시스테인 잔기를 가지고, 이들 네 개의 잠재적인 ORF는 12-20% 세린 및 트레오닌 잔기 그리고, 6-11% 프롤린잔기를 포함한다.
중합효소 유전자(L)
다른 네거티브 가닥 바이러스와 비교에서, MPV 게놈의 마지막 ORF는 복제 및 전사 복합체의 RNA-의존성 RNA 중합효소 성분이다. MPV의 L 유전자는 2005개의 aa 단백질을 코드하는데, 이는 APV-A 단백질의 것보다 1개 잔기가 더 많은 것이다(표 5). MPV의 L 단백질은 APV-A와는 64% 유사성을 가지고; RSV와는 42-44% 유사성을 가지고, 다른 파라믹소바이러스와는 약 13%의 유사성을 가진다(표 6). Poch et al.(1989; 1990)은 분절안된 네거티브 가닥 RNA 바이러스내에 6개의 보존된 도메인을 확인하였는데, 이들 도메인중 도메인 III는 중합효소 기능에 필수적인 것으로 간주되는 네 가지 핵 중합효소 모티프를 포함한다. 이들 모티프(A, B, C, D)는 MPV L 단백질에서 아주 잘 보존되어 있고, 모티프 A, B, C에서는 MPV는 다른 모든 뉴모바이러스와 100% 유사성을 공유하고, 모티프 D에서 MPV는 APV와는 100% 유사성을 공유하고, RSV's와는 92% 유사성을 공유한다. 전체 도메인 III에서(L ORF에서 aa 627-903), MPV는 APV와 77% 상동성을 공유하고, RSV와는 61-62% 상동성을 공유하고, 다른 파라믹소바이러스는 23-27%와 상동성을 공유한다(도 15). 또한, 중합효소 모티프에 추가하여, 뉴모바이러스 L 단백질에는 콘센서스 ATP 결합 모티프 K(X)21GEGAGN(X)20K(Stec, 1991)에 준하는 서열을 포함한다. MPV L ORF에는 APV와 유사한 모티프를 포함하는데, 이때, APV는 중간 잔기의 공간이 하나 빠져있다; K(x)22GEGAGN(X)19K.
계통유전학적 분석
뉴모바이러스(Pneumovirus)의 구성원과 MPV간에 상관관계를 나타내는 지시물질로써, N, P, M, F ORF에 대한 계통학적 구조에 대해 이미 작성되었고(van den Hoogen et al., 2001), MPV와 APV-C간에 상당히 밀접한 관계가 있다는 것을 밝혔다. MPV SH와 G 유전자는 다른 파라믹소바이러스의 것과 상동성이 낮기 때문에, 이들 유전자에 대한 신뢰할만한 계통학적 구조가 아직 작제될 수 없다. 또한, 뉴모바이러스(Pneumovirus)와 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 구성원간에 뚜렷한 게놈상의 구조로 인하여 전제적인 게놈 서열에 기초한 계통학적 구조를 만드는 것이 불가능하다. 따라서, 우리는 이미 공개된 것에 추가하여, M2 및 L db에 대한 계통학적 구조만을 작제하였다. 뉴모비리네(Pneumovirinae) 아과내에 APV와 MPV간에 밀접한 관계가 있다는 것을 확인할 수 있다.
MPV 비-코딩 서열
파라믹소바이러스의 게놈의 유전자 결합부에는 유전자의 시작 및 끝부분(유전자 개시 및 유전자 종료 신호)에 짧지만 매우 보존된 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이는 전사의 개시 및 종료에 기능을 하는 것으로 보인다(Curran et al., 1999). MPV의 모든 유전자간에 유전자내 서열을 비교하면, N, P, M, F, M2, G의 유전자 시작 신호에 콘센선스 서열(GGGACAAGU)(SEQ ID NO: 166)이 나타내는데(도 17A), 이는 메타뉴모바이러스의 콘센선스 유전자 시작 신호와 동일하다(Ling et al., 1992; Yu et al., 1992; Li et al., 1996; Bayon-Auboyer et al., 2000). MPV의 SH 및 L 유전자의 유전자 시작 신호는 이들 콘센선스와는 상당히 다른 것으로 밝혀졌다(SH: GGGAUAAAU(SEQ ID NO: 167), L:GAGACAAAU(SEQ ID NO: 168)). APV의 경우에, L의 유전자 시작 신호는 이 콘센선스와도 다르다는 것이 밝혀졌다:AGGACCAAT(SEQ ID NO: 169)(APV-A)(Randhawa et al., 1996) 및 GGGACCAGT(SEQ ID NO:170)(APV-D)(Bayon-Auboyer et al., 2000)(Bayon-Auboyer et al., 2000).
APV와 MPV의 유전자 시작 서열과는 대조적으로, APV의 콘센선스 유전자 종료 서열 UAGUUAAUU(SEQ ID NO: 171)(Randhawa et al., 1996)은 MPV의 유전자간 서열에서는 발견되지 않았다. 대부분의 유전자에서 발견되는 반복 서열(G-L 유전자간 부분 제외)은 U AAAAA U/A/C로써, 이는 유전자 종료 신호로 작용할 가능성이 있다. 그러나, 우리는 mRNA대신에 바이러스 RNA를 서열화시켰기 때문에, 한정적인 유전자 종료 신호로 할당할 수없고, 따라서 추가 조사를 요한다. 뉴모바이러스의 유전자간 부분은 크기 및 서열이 다양하다(Current et al., 1999; Blumberg et al., 1991; Collins et al., 1983). MPV의 유전자간 부분은 APV 및 RSV와는 상동성이 없는 것으로 나타났고, 크기도 10 내지 228개 뉴클레오티드로 다양하게 나타났다(도 17B). MPV의 M과 F ORF의 유전자간 부분에는 2차 ORF의 일부가 포함되어 있는데, 이는 1차 M ORF에서 시작된다(상기 참고). SH 및 G 사이에 유전자간 부분에는 192개 뉴클레오티드가 포함되어 있고, 세 개의 모든 개방 해독틀에 있는 다양한 종요-코돈이 존재하는 것에 기초하여 코딩 능력을 가지는 것으로 보이지는 않는다. G와 L사이에 유전자간 부분에는 241개 뉴클레오티드가 포함되어 있는데, 여기에는 추가 ORF가 포함되어 있을 수 있다(상기 참고). 흥미로운 것은 L ORF의 시작부분은 이들 2차 ORF에 위치한다는 것이다. APV의 L 유전자는 앞선 G ORF에서 시작하지 않는 반면에, RSV의 L ORF는 앞선 M2 유전자에서 시작한다. 파라믹소바이러스의 게놈 3' 및 5' 극단에는 짧은 유전자외 부분이 리더 및 트레일러 서열이라고 불리는데, 리더의 대략 처음 12개 뉴클레오티드와 트레일러의 마지막 12개 뉴클레오티드가 상보적이며, 이는 아마도 이들 각각에 바이러스 프로모터의 기초 원소가 포함되어 있기 때문이다(Current et al., 1999; Blumberg et al., 1991; Mink et al., 1986). MPV와 APV의 3' 리더는 모두 길이가 41개 뉴클레오티드인데, 이들 바이러스에서 뉴클레오티드 16 내지 41사이 부분에 어느 정도의 상동성(26개 뉴클레오티드중 18개)을 볼 수 있다(도 17B). 전술한 것과 같이, MPV의 게놈 지도의 처음 15개 뉴클레오티드는 APV 게놈에 기초한 프라이머 서열에 기초한 것이다. MPV의 5'트레일러 길이(188개 뉴클레오티드)는 RSv 5'트레일러의 크기(155개 뉴클레오티드)를 닮았다. MPV의 트레일러의 극단 40개 뉴클레오티드 배열과 APV의 트레일러의 배열은 32개 뉴클레오티드중 21개가 상동성이 있는 것으로 나타났고, APV의 게놈 서열에 기초한 프라이머 서열을 나타내는 극단 12개 뉴클레오티드는 제외된다. 우리의 서열 분석에서 메타뉴모바이러스의 구조(3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')와 닮은 게놈 구조와 3'단부에는 NS1 및 NS2 유전자가 없다는 것이 밝혀졌다. MPV와 APV 유전자사이에 발견되는 높은 서열 상동성은 이들 두 바이러스간에 밀접한 관계가 있다는 것을 강조한다. MPV의 N, P M, F, M2-1, M2-2 유전자에서, APV-C와 전반적으로 79%의 아미노산 상동성이 나타났다. 사실, 이들 유전자의 경우에, APV-C와 MPV는 RSA-A 및 B 또는 APV-A 및 B와 같은 다른 속의 소단위사이에서 볼 수 있는 서열 상동성과 같은 범위에서 서열 상동성이 있는 것으로 나타났다. APV-C와 MPV사이에 밀접한 관계는 계통학적 분석에서도 볼 수 있는데, 이 분석에서는 APV-A 및 B를 포함하는 가지와는 떨어진 동일한 가지에 항상 MPV와 APV-C가 있다. 동일한 게놈 구조, 서열 상동성 및 계통학적 분석은 MPV가 모두 포유류로부터 분리될 수 있는 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)에 처음 구성원이 된다는 것을 보여준다.
N, M, F, L 유전자에서 MPV의 상이한 바이러스 분리체간에 발견된 서열 변이는 다른 유전자형이 존재할 가능성이 있다는 것을 나타낸다(van den Hoogen et al., 2001). MPV 및 APV-C간에 밀접한 관계는 숙주 범위에 반영되지 않았는데, 그 이유는 MPV와는 대조적으로 APV는 새에 감염되기 때문이다(van den Hoogen et al., 2001). 숙주 범위에서 이와 같은 차이는 매우 다양한 이들 바이러스간에 SH 및 G 단백질 간에 차이에 의해 결정될 수 있다. MPV의 SH 및 G 단백질에서는 임의 다른 바이러스의 SH 및 G 단백질과는 상당한 아미노산 서열 상동성을 나타나지 않았다. 비록 아미노산 함량 및 소수성 플랏이 이들 ORF를 SH 및 G로 정의할 수 있지만, 이들 기능을 평가하기 위해서는 실험 자료가 요구된다. 이와 같은 분석은 이들 SH 및 G db에 추가 겹쳐지는 ORF의 역할에 희망을 줄 수 있다. 또한, APV-C의 SH 및 G db상의 서열 분석으로 MPV의 SH 및 G 단백질의 기능과 APV-C와의 관계에 대해 더 잘 파악할 수 있게 한다. MPV의 비-코딩 부분은 APV와 상당히 유사한 것으로 나타났다. APV와 MPV의 3' 리더 및 5' 트레일러 서열은 상당한 정도의 유사성을 나타내었다. 유전자간 부분의 길이는 APV와 MPV의 것과 항상 같은 것은 아니지만, 대부분 ORF의 콘센선스 유전자 시작 신호는 동일한 것으로 나타났다. 대조적으로 APV의 유전자 종료 신호는 MPV게놈에서는 발견되지 않았다. 비록 우리는 대부분의 유전자간 부분에 반복 서열(U AAAAA U/A/C)(SEQ ID NO: 172)을 발견하였으나, 바이러스 mRNA의 서열 분석으로 이와 같은 유전자 종료 서열을 정식으로 묘사할 수 있다. cDNA 말단 공정의 변형된 신속한 증폭(RACE)을 이용하여 극단 3' 말단에 있는 15개 뉴클레오티드에 대한 서열 정보와 5' 말단의 12개 뉴클레오티드에 대한 서열 정보를 얻을 수 있다. 다른 관련된 바이러스에 대해 다른 사람들에 의해 이와 같은 기술이 성공하였다는 것이 입증되었다(Randhawa, J.S. et al., Rescue of synthetic minireplicons establishes the absence of the NS1 and NS2 genes from avian pneumovirus. J. Virol, 71, 9849-9854(1997); Mink, M.A., et al. Nucleuotide sequences of the 3' leader and 5' trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA. Virology 185, 615-24(1991). 3' vRNA 리더 서열의 서열을 결정하기 위해, 폴리-A-중합효소를 이용하여 정제된 vRNA에 호모폴리머 A 꼬리를 첨가하고, 리더서열은 폴리-T 중합효소 및 N 유전자에 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시킨다. 5'vRNA 트레일러 서열을 결정하기 위해, L 유전자에 있는 프라이머와 역전사효소를 이용하여 트레일러 서열의 cDNA 복사본을 만들고, 말단 전이효소로 cDNA의 호모폴리머 dG RH리를 붙인다. 결과적으로 트레일러 부분은 L 유전자에 있는 프라이머와 폴리-C-프라이머를 이용하여 증폭시킬 수 있다. 또 다른 전략으로써, vRNA는 자신에 또는 합성 링커에 결찰시키고, 리더와 트레일러 부분은 L 및 N 유전자에 있는 프라이머 및 링커-특이적인 프라이머를 이용하여 증폭시킬 수 있다. 5' 트레일러 서열의 경우에, 정제된 vRNA의 직접적인 디데옥시뉴클레오티드 서열화를 실행할 수 있다(Randhawa, 1997). 이와 같은 접근방식을 이용하여, 우리는 hMPV 게놈의 말단의 서열을 정확하게 분석할 수 있다. 여기에서 제공하는 서열 정보는 진단 테스트, 백신 생성 및 MPV에 대한 항-바이러스 및 MPV 감염에 대한 항바이러스를 만드는데 중요하다.
재료 및 방법
서열 분석
이미 언급한 것과 같이 3차 계대배양된 원숭이 신장 세포상에서 바이러스 분리체 00-1를 높은 역가로 증식시킨다(10,000TCID50/ml)(van den Hoogen et al., 2001). 바이러스성 RNA는 제조업자(Roch Diagnostics Almerd, The Netherlands)의 지시에 따라 High Pure RNA 분리 키트를 이용하여 감염된 세포의 상층액으로부터 분리시켰다. 프라이머는 APV/RSV의 리더 및 트레일러에 대해 공개된 서열(Randhawa et al., 1997; Mink et al., 1991)에 추가하여 기존의 공개(van den Hoogen et al., 2001)된 서열을 기초하여 고안하였고, 필요시에 요청하면 이용할 수 있다. RT-PCR 검사는 바이러스 RNA를 이용하여 실시한다(원튜브 검사-50mM Tris pH 8.5 50mM NaCl, 4.5mM MgCl2, 2mM DTT, 1μM 전방 프라이머, 1μM 역 프라이머, 0.6mM dNTP's, 20units RNAsin(Promega, Leiden, The Netherlands), 10U AMV 역전사효소(Promega, Leiden, The Netherlands), 5U Taq 중합효소(PE Applied Biosystems Nieuwerkerk aan de IJssel, The Netherlands)를 포함하는 총 용적이 50㎕). 역전사는 42℃에서 30분, 95℃에서 8분간 불활성화시켜 실행한다. cDNA는 95℃ 1분; 42℃ 2분; 72℃ 3분 과정을 40회 반복시키고, 최종 연장은 72℃에서 10분간 실시하였다. 1% 아가로즈 겔 분석후에, RT-PCR 생성물은 Qiaquick Gel Extraction kit(Qiagen, Leusden, The Netherlands)을 이용하여 겔에서 정제한 다음, Dyenamic ET 종료물질 서열화 키트(Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, the Netherlands) 및 ABI 373 자동 DNA 서열화기(PE Applied Biosystems Nieuwerkerk aan de IJssel, The Netherlands)를 이용하여 제조업자의 지시에따라 직접 서열을 결정하였다.
BioEdit 5.0.6(http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/Bioedit//bioedit.html; Hall, 1999)의 소프트웨어 패키지를 이용하여 서열을 배열한다.
계통학적 분석
계통학적 구조를 작제하기 위해, ClustaW 소프트웨어 패키지를 이용하여 DNA 서열을 배열하고, 가장 가능성이 있는 구조를 DNA-ML 소프트웨어(Phylip 3.5 프로그램)와 100 부트스트랩(bootstraps)s 및 3 점블스(jumbles)를 이용하여 만든다. 부트스트랩(bootstraps) 값은 콘센선스 패키지로 만든 컨센선스 구조에서 계한된다(Felsenstein, 1989).
MPV 게놈 서열은 Genbank에 AF37137기탁된 것을 이용할 수 있다. 여기에서 이용된 모든 서열은 Genebank에서 이용할 수 있다: AB046218(홍역 바이러스, 모든ORF), NC-001796(사람의 파라인플루엔자 바이러스 타입 3, 모든 ORF) NC-001552(센다이 바이러스, 모든 ORF), X57559(사람 파라인플루엔자 바이러스 타입 2, 모든 ORF), NC-002617(뉴캐슬질환, 모든 ORF), NC-002728(니파 바이러스, 모든 ORF), NC-001989(bRSV, 모든 ORF), M11486(hRSv A, L을 제외한 모든 ORF), NC-001803(hRSV, L ORF), NC-001781(hRSV B, 모든 ORF), D10331(PVM, N ORF), U09649(PVM, P ORF), U66893(PVM, M ORF), U66893(PVM, SH ORF), D11130(PVM, G ORF), D11128(F ORF). PVM M2 ORF는 Ahmadian(1999)에서 구하였다. AF176590(APV-C, N ORF), U39295(APV-A, N ORF), U39296(APV-B, N ORF), AF262571(APV-C, M ORF), U37586(APV-B, M ORF), X58639(APV-A, M ORF), AF176591(APV-C, P ORF), AF325443(APV-B, P ORF), U22110(APV-A, P ORF), AF187152(APV-C, F ORF), Y14292(APV-B, F ORF), D00850(APV-A, F ORF), AF176592(APV-C, M2 ORF), AF35650(APV-B, M2 ORF), X63408(APV-A, M2 ORF), U65312(APV-A, L ORF), S40185(APV-A, SH ORF).
MPV 및 다른 파라믹소바이러스의 ORF 길이
N P M F M2- M2- SH G L
1 2
MPV 394 294 254 539 187 71 183 236 2005
APV A 391 278 254 538 186 73 174 391 2004
APV B 391 279 254 538 186 73 -2 414 -2
APV C 394 294 254 537 184 71 -2 -2 -2
APV D -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 389 -2
hRSV A 391 241 256 574 194 90 64 298 2165
hRSV B 391 241 249 574 195 93 65 299 2166
bRSV 391 241 256 569 186 93 81 257 2162
PVM 393 295 257 537 176 77 92 396 -2
기타3 418- 225- 335- 539- -4 -4 -4 -4 2183-
542 709 393 565 2262
주석:
1. 아미노산 잔기의 길이
2. 서열을 이용할 수 없음
3. 기타: 사람 파라인플루엔자 바이러스 타입 2, 3, 센다이 바이러스, 홍역 바이러스, 니파 바이러스, phocine distemper 바이러스, 뉴캐슬질환 바이러스
4. 바이러스게놈에 ORF가 없음
MPV와 다른 파라믹소바이러스의 ORF간에 아미노산 서열의 상동성
N P M F M2- M2- L
1 2
APV A 69 65 78 67 72 26 64
APV B 69 51 76 67 71 27 -2
APV C 88 68 87 81 84 56 -2
hRSV A 42 24 38 34 36 18 42
hRSV B 41 23 37 33 35 19 44
bRSV 42 22 38 34 35 13 44
PVM 45 26 37 39 33 12 -2
기타3 7-11 4-9 7-10 10- -4 -4 13-
18 14
주석:
1. 공지의 G와 SH단백질에는 서열 상동성이 발견되지 않았고, 따라서 이들은 배제하였다.
2. 서열을 이용할 수 없음
3. 기타: 사람 파라인플루엔자 바이러스 타입 2, 3, 센다이 바이러스, 홍역 바이러스, 니파 바이러스, phocine distemper 바이러스, 뉴캐슬질환 바이러스
4. 바이러스게놈에 ORF가 없음
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공지의 파라믹소바이러스 RT-PCR 감지를 위해 프라이머를 사용하였다. h PIV-1에 대한 프라이머는 4개. 유행성 인하선염, 홍역, Tupaia, Mapuera, Hendra를 만들었고, 이는 서열에 기초로 이용하였다. 뉴캐슬 질환 바이러스의 프라이머는 Seal, J., J. et al; Clin. Microb., 2624-2630, 1995에서 구하였다. Nipah 및 일반적인 파라믹소바이러스의 PCR 프라이머는 Chua, K.B., et al; Science, 288 26 May 2000에서 구하였다.
바이러스 프라이머 단백질에서 위치
HPIV-1 Fwd 5'-TGTTGTCGAGACTATTCCAA-3'(SEQ ID NO: 132) HN
Rev 5'-TGTTG(T/A)ACCAGTTGCAGTCT-3'(SEQ ID NO: 133)
HPIV-2 Fwd 5'-TGCTGCTTCTATTGAGAAACGCC-3'(SEQ ID NO: 134) N
Rev 5'-GGTGAC/T TC(T/C)AATAGGGCCA-3'(SEQ ID NO: 135)
HPIV-3 Fwd 5'-CTCGAGGTTGTCAGGATATAG-3'(SEQ ID NO: 136) HN
Rev 5'-CTTTGGGAGTTGAACACAGTT-3'(SEQ ID NO: 137)
HPIV-4 Fwd 5'-TTC(A/G)GTTTTAGCTGCTTACG-3'(SEQ ID NO: 138) N
Rev 5'-AGGCAAATCTCTGGATAATGC-3'(SEQ ID NO: 139)
Mumps Fwd 5'-TCGTAACGTCTCGTGACC-3'(SEQ ID NO: 140) SH
Rev 5'-GGAGATCTTTCTAGAGTGAG-3'(SEQ ID NO: 141)
NDV Fwd 5'-CCTTGGTGAiTCTATCCGIAG-3'(SEQ ID NO: 142) F
Rev 5'-CTGCCACTGCTAGTTGiGATAATCC-3'(SEQ ID NO: 143)
Tupaia Fwd 5'-GGGCTTCTAAGCGACCCAGATCTTG-3'(SEQ ID NO: 144) N
Rev 5'-GAATTTCCTTATGGACAAGCTCTGTGC-3'(SEQ ID NO: 145)
Mapuera Fwd 5'-GGAGCAGGAACTCCAAGACCTGGAG-3'(SEQ ID NO: 146) N
Rev: 5'-GCTCAACCTCATCACATACTAACCC-3'(SEQ ID NO: 147)
Hendra Fwd 5'-GAGATGGGCGGGCAAGTGCGGCAACAG-3'(SEQ ID NO: 148) N
Rev 5'-GCCTTTGCAATCAGGATCCAAATTTGGG-3'(SEQ ID NO: 149)
Nipah Fwd 5'-CTGCTGCAGTTCAGGAAACATCAG-3'(SEQ ID NO: 150) N
`Rev 5'-ACCGGATGTGCTCACAGAACTG-3'(SEQ ID NO: 151)
HRSV Fwd 5'-TTTGTTATAGGCATATCATTG-3'(SEQ ID NO: 152) F
Rev 5'-TTAACCAGCAAAGTGTTA-3'(SEQ ID NO: 153)
Measles Fwd 5'-TTAGGGCAAGAGATGGTAAGG-3'(SEQ ID NO: 154) N
Rev 5'-TTATAACAATGATGGAGGG-3'(SEQ ID NO: 155)
전반적인 파라믹소비리데(Paramyxoviridae):
Fwd 5'-CATTAAAAAGGGCACAGACGC-3'(SEQ ID NO: 156) P
Rev 5'-TGGACATTCTCCGCAGT-3'(SEQ ID NO: 157)
RAP-PCR용 프라이머:
ZF1: 5'-CCCACCACCAGAGAGAAA-3'(SEQ ID NO: 158)
ZF4: 5'-ACCACCAGAGAGAAACCC-3'(SEQ ID NO: 159)
ZF7: 5'-ACCAGAGAGAAACCCACC-3'(SEQ ID NO: 160)
ZF10: 5'-AGAGAGAAACCCACCACC-3'(SEQ ID NO: 161)
ZF13: 5'-GAGAAACCCACCACCAGA-3'(SEQ ID NO: 162)
ZF16: 5'-AAACCCACCACCAGAGAG-3'(SEQ ID NO: 163)
CS1: 5'-GGAGGCAAGCGAACGCAA-3'(SEQ ID NO: 164)
CS4: 5'-GGCAAGCGAACGCAAGGA-3'(SEQ ID NO: 165)
CS7: 5'-AAGCGAACGCAAGGAGGC-3'(SEQ ID NO: 101)
CS10: 5'-CGAACGCAAGGAGGCAAG-3'(SEQ ID NO: 102)
CS13: 5'-ACGCAAGGAGGCAAGCGA-3'(SEQ ID NO: 103)
CS16: 5'-CAAGGAGGCAAGCGAACG-3'(SEQ ID NO: 104)
20개 단편을 성공적으로 정제하고, 서열화시켰다.
10개 단편은 APV와 서열 상동성이 있는 것으로 나타났다.
단편 1 ZF 7, 335 bp N 유전자
단편 2 ZF 10, 235 bp N 유전자
단편 3 ZF 10, 800 bp M 유전자
단편 4 CS 1, 1250 bp F 유전자
단편 5 CS 10, 400 bp F 유전자
단편 6 CS 13, 1450 bp F 유전자
단편 7 CS 13, 750 bp F 유전자
단편 8 ZF 4, 780 bp L 유전자 (단백질)
단편 9 ZF 10, 330 bp L 유전자 (단백질)
단편 10 ZF 10, 250 bp L 유전자 (단백질)
실시예 5
hMPV 의 두가지 서브타입의 추가 연구
현재까지 수득한 hMPV의 상이한 분리체들의 계통학적 분석에 기초하여, 두 가지 유전자형이 확인되었는데, 유전자형 A의 프로토타입을 가지는 바이러스 분리체 00-1과 유전자형 B의 프로토타입을 가지는 바이러스 분리체 99-1.
우리는 유전자형이 서브타입과 연관이 있고, 기존의 면역원성 존재하에 이들 서브집단의 바이러스와 재감염이 일어나며, 재감염에는 항원성 변이가 엄격하게 요구되는 것이 아닌 것으로 가정하였다. 또한, hMPV는 가금류에서 주로 발견되는 조류 뉴모바이러스와 밀접한 연관이 있는 것으로 보인다. 이들 두 가지 바이러스의 뉴클레오티드 서열은 SH 및 G 단백질을 제외하고는 상당한 서열 상동성을 보인다. 우리는 바이러스들이 테스트에서 교차 반응성을 보이고, 이와 같은 반응성은 주로 핵단백질 및 매트릭스단백질에 기초한 것이나, 이들은 테스트에서 각각 다르게 반응하는데, 실제 부착 단백질에 기초한 테스트가 된다. 바이러스 중화반응 역가에 차이는 hMPV의 2가지 유전자형이 한 바이러스에서 두 가지 다른 혈청형 타입이 된다는 것의 추가 증거를 제공하는 것이고, APV는 상이한 바이러스이다.
2가지 혈청형 타입간의 교차 반응 및 APV 및 hMPV 간의 교차 반응성
방법
hMPV용 IgG, IgA, IgM항체 감지 프로토콜
hMPV의 간접 IgG EIA는 기존에 설명된 것과 기본적으로 동일한 미량적정 평판상에서 실시하였다(Rothbarth, P.H. et al., 1999; Influenza virus serology-a comparative study. J. of Vir. Methods 78(1999) 163-169.
간략하게 설명하면, 농축 hMPV는 1% Triton X-100으로 용해시키고, 실온에서 16시간동안 체크보드 적정을 통하여 최적 작용 희석배를 결정한 후에, PBS내에 미량적정 평판에 피복시킨다. 결과적으로, 100㎕ 1:100 희석된 사람의 혈청 시료/(EIA 완충액)을 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 배양시켰다. 사람의 IgG 결합은 염소 항-사람 IgG 과산화효소 공액체(Biosource, USA)를 첨가하여 감지할 수 있다. 기질로 TMB를 첨가하여, 평판을 발현시키고, 450㎚에서 OD를 읽는다. 그 결과는 OD의 S(신호)/N(네거티브)로 나타낸다. S/N의 비율이 네거티브 대조+표준의 3배를 넘을 경우에, 혈청은 IgG의 경우에 포지티브로 간주한다.
hMPV의 IgM 및 IgA 류는 기존에 설명된 것과 같이 캡쳐 EIA을 이용하여 혈청에서 감지할 수 있다(Rothbarth, P.H et al. 1999; Influenza virus serolgy-a comparative study. J. vir. methods 78(1999) 163-169). IgA 및 IgM 감지를 위해, 항 사람 IgM 또는 IgA 특이적인 단클론 항체가 피복된 시판되는 미량적정 평판을 이용한다. 혈청은 1:100으로 희석하고, 37℃에서 1시간동안 배양하고, hMPV의 적정 작용 희석액을 각 웰에 첨가하였다(100㎕). 1시간동안 37℃에서 배양하였다. 과산화효소가 표지된 다클론성 항hMPV를 씻어낸 후에, 평판은 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 기질로 TMB를 첨가하여, 평판을 발현시키고, 450㎚에서 OD를 읽는다. 그 결과는 OD의 S(신호)/N(네거티브)로 나타낸다. S/N의 비율이 네거티브 대조+표준의 3배를 넘을 경우에, 혈청은 IgG의 경우에 포지티브로 간주한다.
APV 항체는 APV 저해 검사를 이용하여 감지하였다. APV 저해 테스트에 대한 프로토콜에는 SVANOVA Biotech AB, Uppsal Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala Sweden에서 제조한 APV-Ab SVANOVIR　 효소 면역 검사가 포함된다. 그 결과는 그 결과는 OD의 S(신호)/N(네거티브)로 나타낸다. S/N의 비율이 네거티브 대조+표준의 3배를 넘을 경우에, 혈청은 IgG의 경우에 포지티브로 간주한다.
1. 기니아 피그
A. hMPV 의 두 가지 서브타입으로 기니아 피그 (재)감염
바이러스 분리체 ned/00/01(Subtype A) 및 ned/99/01(subtype B)을 이용하여, 서브타입당 6마리 기니아 피그(기관내, 코, 눈)에 접종하였다.
6 마리 기니아 피그 - hMPV 00-1(10e6, 5TCID50)로 감염
6 마리 기니아 피그- hMPV 99-1(10e6, 5TCID50)로 감염
1차 감염 후 54일에, 기니아 피그에 상동성 및 이형성 서브타입(10e4 TCID50/ml)을 접종시켰다.
2 기니아 피그: 1st 감염 00-1; 2nd 99-1(이형성)
3 기니아 피그: 1st 감염 00-1; 2nd 00-1(상동성)
2 기니아 피그: 1st 감염 99-1; 2nd 00-1(이형성)
3 기니아 피그: 1st 감염 99-1; 2nd 99-1(상동성)
12일간(1차 감염) 또는 8 일간(2차 감염) 목 및 코의 면봉시료를 수득하고, RT-PCR 검사를 이용하여 바이러스 존재에 대해 테스트하였다.
RT - PCR 검사 결과: 도 29
결과 요약: 바이러스 분리체 ned/00/01을 접종한 기나아 피그는 감염 후 1일 내지 10일 경에 상부 호흡계 감염을 보였다. ned/99/01을 접종한 기니아 피그는 감염후 1일 내지 5일 경에 상부 호흡계 감염을 보였다. ned/99/01로 감염시킬 경우에, ned/00/01로 감염시킨 것보다 덜 심각하였다. 이형성 바이러스로 기니아 피그를 2차 접종한 경우에, 4마리 기니아 피그중 3마리에서 재감염이 있었고, 상동 바이러스로 접종한 경우에는 6마리 기니아 피그중 2마리에서 재감염이 있었다. 재감염된 이들 동물에서 임상적 징후는 거의 없었고, 재감염에 대해 보호를 받은 동물에서 임상적 징후가 없었으므로, 이는 야생형 바이러스로 접종을 하더라도 1차 감염의 보호 효과가 분명하였고, 이는 감쇠안된 형에서도 백신으로써 이형성( 및 상동성) 분리체를 이용할 수 있다는 가능성을 보여준 것이다.
2가지 hMPV 서브타입은 기니아 피그에 감염될 수 있지만, 서브타입 B(ned/99/01)가 서브타입 A(ned/00/01)보다는 감염에 있어서, 그 심각성이 덜 한 것으로 보인다(코 및 목에 바이러스가 존재하는 시간이 더 짧다). 이는 서브타입 A의 경우에는 더 많은 약량을 제공하였거나 또는 서브타입 B의 경우에의 독성이 낮기 때문일 것이다.
상동성 및 이형성 바이러스로의 재감염에 때해 기존의 면역원성이 완벽하게 보호를 하지는 못하나, 바이러스가 짧은 기간동안 존재하는 경우에는 감염이 덜 한 것으로 나타났으나, 모든 동물이 바이러스 포지티브로 되는 것은 아니다.
B. hMPV 의 2가지 서브타입으로 감염된 기니아 피그의 혈청학 연구
0, 52, 70, 80, 90, 110, 126, 160일에 기이나 피그로부터 혈청을 수득하고, ned/00/01 및 ned/99/01 항원에 대해 전체 바이러스 ELISA을 1:100배로 희석하고, 테스트하였다.
도 30A와 B: 각각의 기니아 피그에서 ned/00/01 및 ned/99/01에 대한 IgG의 반응.
도 31: ned/00/01 및 ned/99/01 ELISA의 특이성, 상동성 재감염된 기니아 피그에서 얻은 자료만을 이용한다.
도 32: 3마리의 상동성(00-1/00-1), 2마리의 상동성(99-1/99-1), 2 마리의 이형성(99-1/100-1), 2 마리의 이형성(00-1/99-1) 감염된 기니아 피그의 ned/00/01 및 ned/99/01 ELISA에 대한 평균 IgG 반응.
결과 요약
두 가지 상이한 ELISA's에 대한 반응에서 미미한 차이만 관찰되었다. 00-1 또는 99-1에 대한 전체 바이러스는 두 가지 서브타입을 구별하는 데에는 사용할 수 없다.
C. APV 항원을 가지는 기니아 피그에서 hMPV 에 대해 생성된 혈청의 반응성
감염된 기니아 피그로부터 수득한 혈청을 APV 저해 ELISA을 테스트하였다.
도 33: hMPV 감염된 기니아 피그의 APV 저해 평균 비율.
결과 요약
기니아 피그에서 hMPV에 대해 생성된 혈청은 hMPV IgG ELISA's에서 반응한 것과 동일한 방법으로 APV 저해에 반응한다.
ned/99/01에 대해 생성된 혈청은 ned/00/01에 대해 생성된 혈청보다 APV 저해 ELISA에서 저해 비율이 더 낮은 것으로 나타났다. ned/99/01로 감염된 기니아 피그는 더 낮은 역가(hMPV ELISA's에서 볼 수 있음)를 가지거나 또는 ned/99/01와 APV의 교차 반응은 ned/00/01의 것보다는 적을 것이다. 그럼에도 불구하고, APV-Ab 저해 ELISA를 이용하여 기니아 피그에서 hMPV 항체를 감지할 수 있다.
D. 기니아 피그에서 hMPV 에 대해 생성된 혈청을 이용한 바이러스 중화반응 검사
감염 후 0, 52, 70, 80일에 수득된 혈청을 ned/00/01, ned/99/01, APV-C를 이용한 바이러스 중화 검사에 이용하였다. 출발 희석비는 1:10이고, 웰당 100 TCID50을 이용하였다. 중화반응 후에, 바이러스를 tMK 세포에 제공하고, 3500 RPM에서 15분간 원심분리하였고, 그 후 배지는 새로 바꾼다.
APV 테스트를 위해 4일간 생장시키고, hMPV 테스트를 위해 7일간 생장시킨다. 세포는 80% 아세톤으로 고정시키고, IFA는 원숭이-항 hMPV fitc 라벨된 것으로 실행하였다. 착색에서 네거티브로 나타난 웰은 중화 역가로 간주한다. 각 바이러스의 경우에, 바이러스 10-log 역가 및 2배 작용 용액 역가가 포함된다.
도 34: ned/00/01, ned/99/01, APV-C에 대한 ned/00/01, ned/99/01 감염된 기니아 피그의 바이러스 중화반응 역가.
2. 짧은 꼬리 원숭이
A. hMPV 의 2가지 서브타입을 시노모로고스 ( cynomolgous ) 짧은 꼬리 원숭이에 감염
바이러스 분리체 ned/00/-1(서브타입 A)과 ned/99/01(서브타입 B)(1e5 TCID50)를 이용하여 서브타입당 2마리의 짧은 꼬리 원숭이에 접종시켰다(기관내, 코, 눈). 1차 감염후 6개월째에 원숭이에 ned/00/01을 두 번째로 접종시켰다. 목 면봉시료를 감염 후 14일(1차 감염의 경우) 또는 8일(2차 감염의 경우)동안 수득하고, RT-PCR 검사를 이용하여 바이러스가 존재하는지에 대해 테스트하였다.
도 35: ned/00/01로 2회 접종을 받은 짧은 꼬리 원숭이의 목 면봉시료상에서 RT-PCR 검사 결과
결과의 요약
바이러스 분리체 ned/00/01을 접종받은 짧은 꼬리 원숭이에서는 감염후 1일 내지 10일 경에 상부 호흡계 감염이 나타났다. 임상적인 징후로는 화농성 비염이 포함된다. 상동성 바이러스로 원숭이를 2차 접종시키면 PCR에 의해 설명되는 바와 같이 재감염이 되나 임상적인 징후는 볼 수 없다.
B. hMPV 감염된 시노모로그스 짧은 꼬리 원숭이에서 수득된 혈청의 혈청학
ned/00/01 혈청을 제공받은 원숭이를 1차 감염후 6개월 동안 수득하였다(원숭이 3의 경우에는 240일에 재감염이 나타났고, 원숭이 6의 경우에는 239일에 재감염이 나타났다). 혈청을 이용하여, ned/00/01 또는 APV에 대한 IgG 항체가 존재하는지를 테스트하고, ned/00/01에 대한 IgA 및 IgM에 대한 항체가 존재하는지도 테스트하였다.
결과 : 도 36A
ned/00/01로 재감염된 2마리 짧은 꼬리 원숭이의 ned/00/01에 대한 IgA, IgM, IgG 반응
도 36B: ned/00/01으로 감염된 2마리 짧은 꼬리 원숭이의 APV에 대한 IgG 반응
결과의 요약
두 마리 짧은 꼬리 원숭이에 ned/00/01을 성공적으로 감염시키고, 상동성 바이러스로 ned/00/01에 대한 항체 존재하에서 재감염시켰다. IgA 및 IgM 항체에 대한 반응으로 1차 감염후에 IgM 항체가 생산되었고, 재감염후에는 항체가 없었다. IgA 항체는 재감염후에만 나타났는데, 이는 1차 감염후에 면역반응이 바로 생성된다는 것을 보여주는 것이다. APV 저해 ELISA에서 테스트를 받은 짧은 꼬리 원숭이에 대해 생성된 혈청에서는 hMPV IgG ELISA에서와 같은 반응이 나타났다.
토론 및 결론
짧은 꼬리 원숭이에서 hMPV 항체는 hMPV ELISA을 이용한 경우에서와 유사한 반응성으로 APV 저해 ELISA로 감지되는데, APV 저해 ELISA는 hMPV 항체 존재헤 대해 사람의 시료를 테스트할 때 적절하다.
C, hMPV 감염된 짧은 꼬리 원숭이에서 수득한 혈청으로 바이러스 교차 중화반응 검사
결과 요약: 감염후 0일부터 229일까지 취한 혈청에서는 ned/00/01(0-80)에 대해 낮은 바이러스 중화 역가를 나타내는데, 2차 감염 후에 취한 혈청에서는 ned/00/01에 대해 높은 중화 역가를 나타낸다: >1280. 2차 감염 후에 취한 혈청에서는 ned/99/01(80-64)에 대한 중화 역가만을 나타내고, APV C바이러스를 중화시킨 혈청은 없었다.
바이러스 (교차) 중화반응 검사에서 APV-C 및 hMPV간에 교차 반응은 없었다. 이때, 교차 반응은 항체 반응 부스팅후에, ned/00/01 및 ned/99/01간의 교차 반응을 시키는 것이다.
3. 사람
생후 6개월 내지 20살 미만의 연령대 환자의 혈청으로 이미 IFA 및 ned/00/01에 대한 바이러스 중화반응 검사 테스트를 하였다(표 1 환자).
ned/00/01에 대한 ELISA에서 IgG, IgM, IgA 항체 존재에 대해 이들 다수의 혈청을 테스트하였고, APV 저해 ELISA에서 시료를 테스트하였다.
결과: 도 37: 사람 혈청에서 IgG 항체 감지를 위해 hMPV ELISA 및 APV 저해 ELISA의 비교. IgG hMPV 테스트 및 APV-Ab 테스트간에 강한 상관관계가 있고, 따라서, APV-Ab 테스트는 기본적으로 사람에서 hMPV에 대한 IgG 항체를 감지할 수 있다.
4. 가금류
96마리 닭은 APV에 대한 IgG 항체 존재에 대해 APV 저해 ELISA 및 ned/00/01 ELISA를 모두 테스트하였다.
결과의 요약: hMPV ELISA 및 APV 저해 ELISA에서 APV에 대한 항체를 감지하였다(자료 제공하지 않음).
결과의 요약:
우리는 서브타입 A의 프로토타입을 가지는 ned/00/01과 서브타입 B의 프로토타입을 가지는 ned/99/01인 hMPV의 두 가지 유전자형을 발견하였다.
"통상적인 혈청학 분석에 따르면,(Francki, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L., and Brown, F. Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the international Committee on Tzxonomy of Viruses. Arch Virol, 1991, Supplement 2: p. 140-144), 면역학적 독특함에 기초하여 두 가지 서브타입을 정의할 수 있는데, 동물의 항혈청을 이용한 정량적인 중화반응 검사로도 결정할 수 있다. 2가지 별개의 혈청타입은 서로 교차 반응을 하지 않으며 양방향에서 상동성-이형성 역가 비율이 >16인 것으로 나타났다. 중화반응에서 어느 쪽이건(상동성에 대한 이형성 역가 비율이 8 또는 16) 두 바이러스간에 어느 정도의 교차 반응을 나타내면, 생체물리학적/생화학적으로 상이한 DNA가 존재하여 혈청형에 독특함이 있는 것으로 간주한다. 중화반응에서 어느 한 방향 또는 양 방향(상동성에 대한 이형성 역가 비율이 8보다 적은 경우)에서 두 바이러스간에 뚜렷한 교차 반응이 나타나는 경우에 연구중에 분리체의 혈청타입의 동정을 나타낸다.
RSV의 경우에, 재감염은 기존 면역원성 존재하에 발생한다(상동성 및 이형성 모두 경우). hMPV의 상동성 및 이형성 혈청타입으로 기니아 피그 및 짧은 꼬리 원숭이를 감염시켜도 hMPV에 대해서는 맞는 말이 된다. 또한, hMPVdp 대한 IgA 및 IgM ELISA's에서는 IgA 항체 반응이 재감염후에만 나타난다는 것이 밝혀졌다. hMPV 또는 APV에 대해 생성된 혈청은 APV 및 hMPV ELISA에 동등하게 반응한다. 뉴클레오티드 서열 비교에서, 바이러스는 N, P, M, F 유전자에 대해 80% 아미노산 상동성을 나타내는 것으로 알려져 있다. ELISA's에서 N 및 M 단백질이 반응에 대한 주요 항원이다. 바이러스 중화반응 검사(당단백질, G, SH, F에 대해 반응하는 것으로 알려진)에서는 두 개 다른 혈청간에 차이를 보였다. APV와 hMPV가 ELISAs에서 교차 반응을 하더라도, hMPV 및 APV의 뉴클레오티드 서열의 계통학적 분석, 두 가지 다른 바이러스에 대해 생성된 혈청의 바이러스 중화반응 검사 역가, 숙주 사용에서의 차이 등으로 APV-C와 hMPV는 두 개의 서로 다른 바이러스라는 것이 밝혀졌다. 결과에 기초하여, 우리는 포유류에 hMPV 감염은 새에서 포유류로의 동물원성 감염증 사건의 결과로 간주한다. 바이러스는 이와 같은 방법(G, SH 단백질 )에 적응하여, 포유류에서 새로의 동물원성 감염은 일어날 것 같지 않아, 조류에 AVP가 존재하는 것으로 간주된다.
뉴모비리네( Pneumovirinae )에 대한 기초 정보
파라믹소비리데 과(科)에는 두 개의 아과가 포함되어 있다; 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)와 뉴모비리네(Pneumovirinae). 아과 뉴모비리네(Pneumovirinae)에는 두 가지 속이 포함되는데, 뉴모바이러스(Pneumovirus)와 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)이다. 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속에는 사람, 소, 양, 염소의 호흡기 합체 바이러스와 쥐의 폐렴 바이러스(PVM)가 포함된다. 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)속에는 조류 뉴모바이러스(APV, 이는 TRTV라고 불리기도 한다).
뉴모비리네(Pneumovirinae) 아과의 분류는 고유의 바이러스 특징, 유전자 순서 및 배열에 기초하여 이루어진다. 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속의 바이러스는 게놈의 3'단부에 두 개의 비-구조 단백질(3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5')을 가지는 것으로 파라믹소비리네(Paramyxovirinae)에서 특징적인 것이다. 대조적으로, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속에 있는 바이러스는 NS1 및 NS2 유전자가 결여되어 있고, M과 L 코딩 부분사이에 유전자 구조가 상이하다; M-F-M2-SH-G-L-5'.
파라믹소비리네(Paramyxovirinae) 아과 모두 혈구응집 활성을 가지고 있지만, 이 기능으로 아과 뉴모비리네(Pneumovirinae)만의 특징, 즉, RSV 및 APV에 없으나, PMV에 있는 특징으로 정의하지는 않는다. 파라믹소바이러스(Paramyxivirus) 및 루불라바이러스(Rubulavirus) 속(아과 Paramyxovirinae )에는 뉴라미니다제 활성이 있지만, 모르빌리바이러스(Morbillivirus 아과 Paramyxovirinae)와 뉴모바이러스(Pneumovirus) 및 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus 아과 Pneumovirinae)에는 없다.
아과 뉴모비리네(Pneumovirinae)의 두 번째 구별가능한 특징은 RSV에 의해 mRNAsodp 또다른 ORF를 제한적으로 이용하는 것에 있다. 대조적으로, 아과 파라믹소비리네(Paramyxovirinae) 예를 들면, 센다이 및 홍역 바이러스와 같은 몇몇은 신규한 단백질 합성을 위한 인단백질(P)을 인코드하는 mRNA 내에 또다른 ORF에 접근한다.
뉴모비리네(Paramyxovirinae)의 G 단백질은 파라믹소비리네(Paramyxovirinae)의 HN 또는 H 단백질에 유사한 구조 또는 연관성 서열을 가지지 않고, 이들 쇄 길이의 절반을 가진다. 또한, N 및 P 단백질은 파라믹소비리네(Paramyxovirinae)의 상응하는 부분보다 작고, 확실한 서열 상동성이 부족하다. 대부분의 비분절된 네거티브 쇄 RNA 바이러스는 한 개의 매트릭스(M) 단백질을 가진다.
뉴모비리네(Pneumovirinae)의 아과 구성원은 M 및 M2 단백질을 가지는 것이 예외적이다. M 단백질은 파라믹소비리네(Paramyxovirinae)의 해당부분보다는 적고, 파라믹소비리네(Paramyxovirinae)와 서열 연관성이 부족하다.
세포 배양액에서 생장시켰을 때, 뉴모비리네(Pneumovirinae)는 전형적인 세포병인적 효과를 나타내는데, 여기에는 세포의 특징적인 합포체 형성을 유도한다.(Collins, 1996).
뉴모비리네( Pneumovirinae )의 아과 뉴모바이러스 ( Pneumovirus ) 속
hRSV는 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속의 주종으로, 유아 및 어린이에서 하부 호흡계 질환의 원인이 된다(Selwyn, 1990). 또한, hRSV는 다른 환자군, 예를 들면, 면역 상충된 개체 및 노인들에서도 주요한 병인물질로 점차 인식되고 있다. RSV 또한 모든 연령대의 입원한 성인 환자가운데 집단적으로 얻은 폐질환의 주요한 원인이 된다(Englund, 1991; Falsey, 2000; Dowell, 1996). RSV의 두 가지 주요 항원성 타입(A, B)은 단클론성 및 다클론성 항체와의 반응성과 핵산 서열 분석을 기초로 하여 확인되었다(Anderson, 1985; Johnso, 1987; sullender, 2000). 특히, G 단백질을 이용하여 두 가지 서브타입을 구별하였다. RSV-A 및 B는 G상에서 단지 53%만의 아미노산 서열 상동성을 공유하는 반면에, 서브타입간에 다른 단백질은 더 높은 상동성을 공유한다(표 1)(Collins, 1996). RSV의 감지에 대해서는 면역형광 기술(DIF, IFA), 바이러스 중화반응 검사, ELISA 또는 RT-PCR 검사를 이용한다(Rothbarth, 1988; Van Milaan, 1994; Coggins, 1998). hRSV에 상당히 연관이 있는 것은 소(bRSV), 양(oRSV), 염소 RSV(oRVS)인데, bRVS가 가장 많이 연구되었다. hRSV와의 서열 상동성을 기초로 하여, 반추동물 RSV는 뉴모비리네(Pneumovirinae)의 아과의 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속으로 분류하였다(Collins, 1996). 반추동물 RSV감염 진단 및 서브타입분류는 혈청학, 항원 감지, 바이러스 분리 및 RT-PCR 검사를 복합적으로 이용한다(Uttenthal 1996; Valarcher, 1999; Oberst, 1993; Vilcek, 1994).
사람 및 소 항혈청, 단클론 항체 및 cDNA 프로브를 이용하여 bRVS의 분자 구성에 대해 몇가지 분석을 실행하였다. 이들 분석에서 hRVS 및 bRVS의 단백질 조성이 매우 유사하고, bRSV의 게놈 구성은 hRSV와 유사하였다. bRSV 및 hRSV의 경우에, G 및 F 단백질은 중요 중화 및 보호성 항원이 된다. G 단백질은 hRSV 서브타입간에 다양하고, hRSV 및 bRSV사이에서도 다양하였다(각각 53%, 28%)(Prozzi, 1997; Lerch, 1990). hRSV 및 bRSV의 F 단백질은 필적할 정도의 구조적 특징 및 항원 연관성을 나타내었다. bRSV의 F 단백질은 hRSV와 80-81% 상동성을 나타내고, 두 개의 hRSV 서브타입은 F내에서 90% 상동성을 나타내었다(Walravens, K. 1990). hRSV 및 bRSV 특이적인 단클론 상체 이용에 기초한 연구에서는 bRSV의 상이한 항원 서브타입이 존재한다는 것을 제시하였다. 서브타입 A, B, AB는 G 단백질에 대한 특이적인 모노클론 항체의 반응 패턴으로 구별하였다(Furze, 1994; Prozzi, 1997; Elvander, 1998). bRSV의 유행병학은 hRSV와 매우 유사하였다. 어린 소에 자발적인 감염은 심각한 호흡기 징후와 연관이 있는 반면에, 실험에 의한 감염은 일반적으로 약간의 병인적 변화를 수반한 가벼운 질환을 일으켰다(Elvander, 1996).
자연적으로 감염된 양(oRSV)(LeaMaster 1983) 및 염소(cRSV)(Lehmkuhl, 1980)로부터 RSV를 분리하였다. 두 균주는 모두 소 RSV와 96% 뉴클레오티드 서열 상동성을 공유하였고, 항원 교차 반응하였다. 따라서, 이들 바이러스들 또한 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속으로 분류하였다.
뉴모비리네(Pneumovirinae) 아과의 독특한 구성원인 뉴모바이러스 (Pneumovirus) 속은 쥐의 폐렴 바이러스(PVM)이다.
PVM는 실험실 동물 콜로니에 흔한 병인균으로, 특히, 쥐를 포함하는 실험실 동물에서 흔하다. 자연적으로 이루어진 감염은 증후가 없지만, 쥐의 폐에 바이러스가 통과함으로써 상부 호흡계 감염에서부터 치명적인 폐렴까지 다양한 범위의 질환에 대한 명백한 징후가 나타난다(Richter, 1988; Weir, 1988).
PVM 및 hRSV의 뉴클레오캡시드(N)와 인단백질(P)간에 제한된 혈청학적 교차반응성에 대해 설명된 바 있으나, 외부 단백질의 교차 반응성에 대해서는 나타내지 않았고, 바이러스는 바이러스 중화반응 검사에서 구별할 수 있다(Chambers, 1990a; Gimenez, 1984; Ling 1989a). PVM의 당단백질은 다른 파라믹소바이러스의 것과는 다른 것으로 보이며, 글리코실화반응 패턴에서 RSV의 것을 닮았다. 그러나, 프로세싱 측면에서, 서로 상이하다. RSV와는 다르지만, 다른 파라믹소바이러스와 유사하게, PVM은 뮤린 적혈구와 혈구응집활성을 가지고, G 단백질은 이 단백질에 대한 단클론상체가 혈구응집을 방해하기 때문에, 이 활성을 초래하는 것으로 보인다(Ling, 1989b).
PVM의 게놈은 hRSV의 것을 닮았는데, 3' 말단에 두 개의 비구조적 단백질을 포함하고, 유사한 게놈 구조를 가진다(Chambers 1990a; Chambers, 1990b). PVM NS1/NS2 유전자의 뉴클레오티드 서열은 hRSV와 상동성이 있는 것으로 감지되지는 않는다(Chambers, 1991). PVM의 일부 단백질은 hRSV와 강한 상동성을 보이지만(N:60%, F:38 내지 40%) G는 다르게 나타난다(아미노산 서열은 31% 또는 그 이상)(Barr, 1991; Barr, 1994; Chambers 1992). PVM P 유전자(RSV 또는 APV의 P는 아님)는 두 번째 ORF를 인코드하는 것으로 보고된 바 있는데, 이는 독특한 PVM 단백질이다(Collins, 1996). 바이러스 분리, 혈구응집 검사, 바이러스 중화 검사 및 다양한 형광 기술을 이용하여 새로운 PVM 분리체를 동정하였다.
뉴모비리네(Pneumovirinae)의 아과 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속내에 상이한 바이러스간에 아미노산 상동성
유전자 hRSV's bRSV's oRSV v.
hRSV		 bRSV v.
hRSV		 bRSV v.
oRSV		 PVM vs. hRSV
NS1 87 68-69 89 *
NS2 92 83-84 87 *
N 96 93 60
P - 81
M - 89
F 89 80-81 38-40
G 53 88-100 21-29 38-41 60-62 *
M2 92 94 41
SH 76 45-50 56
L -
*감지가능한 서열 상동성 없음.
메타뉴모바이러스 ( Metapneumovirus ) 속
조류 뉴모바이러스(APV)는 칠면조의 비강기관지염의 병인물질로 확인된 바 있고(McDougall 1986; Collins 1988), 따라서 칠면조 비강기관지염 바이러스(TRIV)라고 하기도 한다. 질환은 칠면조의 상부 호흡계 감염이 되며, 상당한 치사율을 초래한다. 칠면조 암컷의 경우에, 바이러스로 인하여 알 생산이 실제 감소된다. 동일한 바이러스는 병아리를 감염시킬 수 있으나, 이 종에서 주요 병인균으로서 바이러스 역할은 분명하게 정의된 바는 없지만, 번식을 하는 닭에서 팽창된 머리 징후군(SHS)이 흔히 나타난다(Cook, 2000).
비리온은 다양한 모양을 하지만, 주로 구면체로 크기는 70 내지 600㎚이며, 선형, 비-분적된 네거티브 센스 RNA 게놈을 포함하는 뉴클레오캡시드는 나선형 대칭을 나타낸다(Collins, 1986; Gir명, 1986). 이와 같은 형태는 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)의 구성원과 닮았다. APV-인코드된 단백질 및 RNAs 분석으로 이 과에는 두 개의 아과가 있는 것으로 나타났다; 파라믹소비리데 및 뉴모비리데(Paramyxoviridae and Pnemoviridae ), APV는 뉴모비리데(Paramyxoviridae)와 가장 많이 닮았다(Collins, 1988; Ling, 1988; Cavanagh, 1988).
APV는 비-구조성 단백질(NS1,NS2)을 가지지 않고, 유전자 순서(3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')는 RSV와 같은 포유류 뉴모바이러스와는 상이하였다. APV는 따라서 새로운 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속의 종으로 최근에 분류되었다(Pringle, 1999).
중화반응 패턴, ELISA, 단클론 항체와의 반응성에서 차이로 APV에는 상이한 항원성 타입이 존재하는 것으로 나타났다. G 유전자의 뉴클레오티드 서열화로 2가지 바이러스 서브타입(A, B)을 정의하게 되었고, 이들은 38%정도의 아미노산 상동성을 가진다(Collins, 1993; Juhasz, 1994). Colorado USA(Cook, 1999)에서 분리한 APV 분리체는 서브타입 A 및 B 바이러스와는 교차 중화반응이 거의 없는 것으로 나타나고, 서열 정보를 기초로 하여, 신규한 서브타입 C로 지정하였다(Seal, 1998; Seal 2000). 두 가지 non-A/non-B APVs를 France에서 분리하였는데, 이들은 서브타입 A, B, C와는 항원적으로 별개의 특징을 나타내었다. F, L, G 유전자의 아미노산 서열에 기초하여, 이들 바이러스는 신규한 서브타입 D로 다시 분류하였다(Bayon-Auboyer, 2000).
닭 또는 칠면조의 기관 배양(TOC) 또는 Vero 세포 배양에서 바이러스를 분리함으로써, APV 감염 진단을 할 수 있다. 세포병인 효과(CPE)는 1대 또는 2대 계대배양후에 일반적으로 관찰된다. 이와 같은 CPE는 세포 라운딩에서 산재된 병소 지역으로 나타나는데, 이들은 합체 형성으로 이어진다(Buys, 1989). IF 및 바이러스 중화반응 검사를 포함하는 다양한 혈청학적 검사를 개발하였다. ELISA에 의한 APV의 항체 감지가 가장 흔한 방법이다(O'Loan, 1989; Gulati, 2000). 최근에는, 중합효소 연쇄 사슬 반응(PCR)을 이용하여 APV 감염을 진단하였다. 식도에서 스웹한 것을 출발 물질로 이용한다(Bayon-Auboyer, 1999: Shin, 2000).
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Pneumonia virus of mice <400> 7 Met Ser Leu Asp Arg Leu Lys Leu Asn Asp Val Ser Asn Lys Asp Ser 1 5 10 15 Leu Leu Ser Asn Cys Lys Tyr Ser Val Thr Arg Ser Thr Gly Asp Val 20 25 30 Thr Ser Val Ser Gly His Ala Met Gln Lys Ala Leu Ala Arg Thr Leu 35 40 45 Gly Met Phe Leu Leu Thr Ala Phe Asn Arg Cys Glu Glu Val Ala Glu 50 55 60 Ile Gly Leu Gln Tyr Ala Met Ser Leu Leu Gly Arg Asp Asp Ser Ile 65 70 75 80 Lys Ile Leu Arg Glu Ala Gly Tyr Asn Val Lys Cys Val Asp Thr Gln 85 90 95 Leu Lys Asp Phe Thr Ile Lys Leu Gln Gly Lys Glu Tyr Lys Ile Gln 100 105 110 Val Leu Asp Ile Val Gly Ile Asp Ala Ala Asn Leu Ala Asp Leu Glu 115 120 125 Ile Gln Ala Arg Gly Val Val Ala Lys Glu Leu Lys Thr Gly Ala Arg 130 135 140 Leu Pro Asp Asn Arg Arg His Asp Ala Pro Asp Cys Gly Val Ile Val 145 150 155 160 Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Val Ser Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg 165 170 175 Gly Gly Leu Asp Ala Val Glu Arg Arg Ala Leu Asn Val Leu Lys Ala 180 185 190 Glu Lys Ala Arg Tyr Pro Asn Met Glu Val Lys Gln Ile Ala Glu Ser 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pneumovirus C <400> 24 Met Ser Trp Lys Val Val Leu Leu Leu Val Leu Leu Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Gly Gly Leu Glu Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Tyr Ser Thr Val Thr 20 25 30 Arg Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Thr Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Arg Thr Glu Leu Glu Leu Thr Lys Asn Ala Leu Glu Glu 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Lys Glu Ala Arg Ile Met 85 90 95 Ser Pro Arg Lys Ala Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile 115 120 125 Arg Leu Glu Gly Glu Val Ala Ala Ile Lys Gly Ala Leu Arg Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Asn Asp Leu Lys Asp Phe Ile Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 175 Ile Asn Arg Asn Lys Cys Asp Ile Ser Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Gly Gln Tyr Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 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agagaactga aagattttgt gagcaagaat ctaacacgtg caatcaacaa aaacaagtgc 3600 gacattgctg acctgaaaat ggccgttagc ttcagtcaat tcaacagaag gttcctaaat 3660 gttgtgcggc aattttcaga caacgctgga ataacaccag caatatcttt ggacttaatg 3720 acagatgctg aactagccag agctgtttcc aacatgccaa catctgcagg acaaataaaa 3780 ctgatgttgg agaaccgtgc aatggtaaga agaaaagggt tcggattcct gataggagtt 3840 tacggaagct ccgtaattya catggtgcaa ctgccaatct ttggggttat agacacgcct 3900 tgctggatag taaaagcagc cccttcttgt tcaggaaaaa agggaaacta tgcttgcctc 3960 ttaagagaag accaaggatg gtattgtcaa aatgcagggt caactgttta ctacccaaat 4020 gaaaaagact gtgaaacaag aggagaccat gtcttttgcg acacagcagc aggaatcaat 4080 gttgctgagc agtcaargga gtgcaacata aacatatcta ctactaatta cccatgcaaa 4140 gttagcacag gaagacatcc tatcagtatg gttgcactat ctcctcttgg ggctytggtt 4200 gcttgctaca agggagtgag ctgttccatt ggcagcaaca gagtagggat catcaagcaa 4260 ctgaacaaag gctgctctta tataaccaac caagacgcag acacagtgac aatagacaac 4320 actgtatacc agctaagcaa agttgaaggc gaacagcatg ttataaaagg aaggccagtg 4380 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metapneumovirus <400> 55 Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Val Lys Ala Leu Ile Lys Cys 1 5 10 15 Ser Glu His Gly Pro Val Phe Ile Thr Ile Glu Val Asp Asp Met Ile 20 25 30 Trp Thr His Lys Asp Leu Lys Glu Ala Leu Ser Asp Gly Ile Val Lys 35 40 45 Ser His Thr Asn Ile Tyr Asn Cys Tyr Leu Glu Asn Ile Glu Ile Ile 50 55 60 Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Ser 65 70 <210> 56 <211> 71 <212> PRT <213> Avian pneumovirus C <400> 56 Met Thr Leu Gln Leu Pro Cys Lys Ile Val Gln Thr Leu Ile Lys Cys 1 5 10 15 Gly Glu His Gly Leu Ile Phe Leu Lys Met Lys Leu Asp Asp Met Val 20 25 30 Trp Thr Lys Asn Glu Leu Val Asp Ile Ile Ser Thr Glu Ile Val Lys 35 40 45 Val His Ala Asn Ile Phe Lys Cys Arg Leu Glu Asp Ile Glu Ile Ile 50 55 60 Tyr Val Lys Thr Phe Leu Ser 65 70 <210> 57 <211> 73 <212> PRT <213> Avian pneumovirus B <400> 57 Met Pro Ile Val Ile Pro Cys Lys Arg Val Thr Ala Val Ile Arg Cys 1 5 10 15 Asn Thr Leu Gly Val Cys Leu Phe Lys Arg Thr Tyr Glu His Asn Ile 20 25 30 Ile Asn Leu Gly Asp Leu Ile Glu Glu Val Ala Arg 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uaaguuucua ugauacuuca uaauaauaag uaauaauuaa 120 uugcuuaauc aucaucacaa cauuauucga aaccauaacu auucaauuua aaaaguaaaa 180 aacaauaaca ugggacaagu aguuaug 207 <210> 83 <211> 215 <212> RNA <213> Human metapneumovirus 00-1 <400> 83 uaacaaaaaa uacaaaauaa cucuaagaua aaccaugcag acaccaacaa uggagaagcc 60 aaaagacaau ucacaaucuc cccaaaaagg caacaacacc auauuagcuc ugcccaaauc 120 ucccuggaaa aaacacucgc ccauauacca aaaauaccac aaccacccca agaaaaaaac 180 ugggcaaaac aacacccaag agacaaauaa caaug 215 <210> 84 <211> 182 <212> RNA <213> Human metapneumovirus 00-1 <400> 84 ugaaaaauga uaaaaaugau aaaauaggug acaacuucau acuauuccaa aguaaucauu 60 ugauuaugca auuauguaau aguuaauuaa aaacuaaaaa ucaaaaguua gaaacuaaca 120 acugucauua aguuuauuaa aaauaagaaa uuauaauugg auguauacgg uuuuuuucuc 180 gu 182 <210> 85 <211> 45 <212> RNA <213> Human metapneumovirus 00-1 <400> 85 ucccauauuu uuuuggaauc uaauuuauac gcguuuuuuu cucgu 45 <210> 86 <211> 44 <212> RNA <213> Human metapneumovirus 00-1 <400> 86 acgagaaaaa aaccguauac auccaauuau aauuucuuau 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Val Tyr Pro Lys Asn Tyr Leu Pro Glu Thr 485 490 495 Ile Lys Asn <210> 101 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 101 aagcgaacgc aaggaggc 18 <210> 102 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 102 cgaacgcaag gaggcaag 18 <210> 103 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 103 acgcaaggag gcaagcga 18 <210> 104 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 104 caaggaggca agcgaacg 18 <210> 105 <211> 49 <212> PRT <213> Human metapneumovirus <220> <221> misc_feature <222> (2)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (29)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 105 Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Gly Ala Gly Asn Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Lys <210> 106 <211> 49 <212> PRT <213> Human metapneumovirus <220> <221> misc_feature <222> (2)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (30)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 106 Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Gly Ala Gly Asn Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Lys <210> 107 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 107 aaagaattca cgagaaaaaa acgc 24 <210> 108 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 108 ctgtggtctc tagtcccact tc 22 <210> 109 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 109 catgcaagct tatggggc 18 <210> 110 <211> 21 <212> DNA 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description of artificial sequence: primer <400> 117 tgcactatct cctcttgggg ctttg 25 <210> 118 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 118 tcaaagctgc ttgacactgg cc 22 <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 119 catgcccact ataaaaggtc ag 22 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 120 caccccagtc tttcttgaaa 20 <210> 121 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 121 tgcttgtact tcccaaag 18 <210> 122 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 122 tatttgaaca aaaagtgt 18 <210> 123 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 123 tggtgtggga tattaacag 19 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 124 gcactcaaga gataccctag 20 <210> 125 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 125 agactttctg ctttgctgcc tg 22 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 126 ccctgacaat aaccactctg 20 <210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 127 gccaactgat ttggctgagc tc 22 <210> 128 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 128 catgcccact ataaaaggtc ag 22 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 129 caccccagtc tttcttgaaa 20 <210> 130 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 130 aaagaattca cgagaaaaaa acgc 24 <210> 131 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 131 ctctggtctc 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<400> 137 ctttgggagt tgaacacagt t 21 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 138 ttcngtttta gctgcttacg 20 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 139 aggcaaatct ctggataatg c 21 <210> 140 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 140 tcgtaacgtc tcgtgacc 18 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 141 ggagatcttt ctagagtgag 20 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 142 ccttggtgan tctatccgna g 21 <210> 143 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 143 ctgccactgc tagttgngat aatcc 25 <210> 144 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 144 gggcttctaa gcgacccaga tcttg 25 <210> 145 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 145 gaatttcctt atggacaagc tctgtgc 27 <210> 146 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 146 gctcaacctc atcacatact aaccc 25 <210> 147 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 147 gctcaacctc atcacatact aaccc 25 <210> 148 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 148 gagatgggcg ggcaagtgcg gcaacag 27 <210> 149 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 149 gcctttgcaa tcaggatcca aatttggg 28 <210> 150 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 150 ctgctgcagt tcaggaaaca tcag 24 <210> 151 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 151 accggatgtg ctcacagaac tg 22 <210> 152 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 152 ttaaccagca aagtgtta 18 <210> 153 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 153 ttaaccagca aagtgtta 18 <210> 154 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 154 ttagggcaag agatggtaag g 21 <210> 155 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 155 ttataacaat gatggaggg 19 <210> 156 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 156 cattaaaaag ggcacagacg c 21 <210> 157 <211> 17 <212> DNA <213> artificial 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164 ggaggcaagc gaacgcaa 18 <210> 165 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> description of artificial sequence: primer <400> 165 ggcaagcgaa cgcaagga 18 <210> 166 <211> 9 <212> RNA <213> metapneumovirus <400> 166 gggacaagu 9 <210> 167 <211> 9 <212> RNA <213> metapneumovirus <400> 167 gggauaaau 9 <210> 168 <211> 9 <212> RNA <213> metapneumovirus <400> 168 gagacaaau 9 <210> 169 <211> 9 <212> DNA <213> APV <400> 169 aggaccaat 9 <210> 170 <211> 9 <212> DNA <213> APV <400> 170 gggaccagt 9 <210> 171 <211> 9 <212> RNA <213> APV <400> 171 uaguuaauu 9 <210> 172 <211> 7 <212> RNA <213> artificial <220> <223> decription of artificial sequence: consensus sequence <400> 172 uaaaaah 7 NYI-4062535v1

Claims (39)

  1. 파라믹소비리데(Paramyxoviridae ) 과(科)의 뉴모비리네(Pneumovirinae) 아과에 속하고, 바이러스의 뉴클레오티드 서열을 결정하고 계통유전학 분류에서 이를 테스트하면, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속(genus)에 계통유전학적으로 상응하는 것으로 확인되는 분리된 네거티브-센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스(MPV)에 있어서, 계통유전학적 유사 분류는 100개의 부트스트랩(bootstraps) 및 3번의 점블스(jumbles)를 이용하여 산출되고, 조류 비강기관지염의 원인물질인 칠면조 비강기관지염 바이러스(TRTV)로 알려진 조류 뉴모바이러스(APV)의 바이러스 분리체에 상응하기보다는 CNCM(Paris)에 기탁된 I-2614 바이러스 분리체에 계통유전학적으로 더욱 밀접하며, 이때, 상기 분리된 네거티브-센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스는
    (i) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 91에 열거된 MPV 분리체 00-1 또는 99-1의 N 단백질의 아미노산 서열에 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 N 단백질;
    (ii) SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 92에 열거된 MPV 분리체 00-1 또는 99-1의 P 단백질의 아미노산 서열에 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 P 단백질;
    (iii) SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 93에 열거된 MPV 분리체 00-1 또는 99-1의 M 단백질의 아미노산 서열에 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 M 단백질;
    (iv) SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 94에 열거된 MPV 분리체 00-1 또는 99-1의 F 단백질의 아미노산 서열에 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 F 단백질;
    (v) SEQ ID NO: 47 또는 SEQ ID NO: 95에 열거된 MPV 분리체 00-1 또는 99-1의 M2-1 단백질의 아미노산 서열에 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 M2-1 단백질;
    (vi) SEQ ID NO: 55 또는 SEQ ID NO: 96에 열거된 MPV 분리체 00-1 또는 99-1의 M2-2 단백질의 아미노산 서열에 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 M2-2 단백질;
    (vii) SEQ ID NO: 99 또는 SEQ ID NO: 100에 열거된 MPV 분리체 00-1의 L 단백질의아미노산 서열에 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 L 단백질;
    (viii) SEQ ID NO: 63 또는 SEQ ID NO: 97에 열거된 아미노산 서열에 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 SH 단백질; 또는
    (ix) SEQ ID NO: 64 또는 SEQ ID NO: 98에 열거된 MPV 분리체 00-1 또는 99-1의 G 단백질의아미노산 서열에 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 G 단백질로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 네거티브 센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스.
  2. 제 1 항에 있어서, 바이러스는 (i) 포유동물 세포를 감염시킬 수 있고; (ii) 감염된 포유동물 세포의 합포체 형성을 초래할 수 있고; (iii) 150 내지 600nm 범위의 입자들을 형성하고; (iv) 클로로포름에 민감성이며; 그리고 (v)이 바이러스에 감염된 tMK는 헤마토글루티닌 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 네거티브 센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스.
  3. 제 1 항에 있어서, 서열 상동성은 상기 단백질의 연속 100개 아미노산에서 결정되는 것을 특징으로 하는 분리된 네거티브 센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스.
  4. 제 1 항에 있어서, 조류 뉴모바이러스(Pneumovirus)는 APV 타입 C(APV-C)로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 네거티브 센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스.
  5. 제 1 항에 있어서, 핵산 서열은 바이러스의 바이러스성 단백질을 인코딩하는 개방 해독틀(ORF)로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 네거티브 센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스.
  6. 제 5항에 있어서, 개방 해독틀은 N, P, M 및 F 단백질을 인코딩하는 ORF에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 네거티브 센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스.
  7. 제 5항에 있어서, 개방 해독틀은 SH 또는 G 단백질을 인코딩하는 ORF에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 네거티브 센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스.
  8. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 36 내지 41 중 어느 하나에 나타낸 서열에 상응하는 핵산 또는 계통발생학적 단편 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 네거티브 센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스.
  9. 제 1 항에 따른 바이러스로부터 수득할 수 있는 분리된 또는 재조합 핵산 또는 이의 MPV-특이적 단편에 있어서, 이 핵산은 SEQ ID NO: 36, 38, 40, 76-90, 101-104 및 107-168의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 또는 재조합 핵산 또는 이의 MPV-특이적 단편.
  10. 제 9 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제 10 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  12. 제 9 항에 따른 핵산에 의해 인코드된 것을 특징으로 하는 분리된 또는 재조합 단백질성질(proteinaceous)을 가진 물질 또는 이의 MPV-특이적 단편.
  13. 제 12 항에 따른 단백질 성질을 가진 물질을 포함하는 항원.
  14. 제 13 항에 따른 항원에 특이적인 항체.
  15. 바이러스 분리체가 MPV 인지를 확인하는 방법에 있어서, 상기 바이러스 분리체 또는 이의 성분을 제 14 항의 항체와 반응시키는 것으로 구성된 바이러스 분리체가 MPV 인지를 확인하는 방법.
  16. 바이러스 분리체가 MPV 인지를 확인하는 방법에 있어서, 상기 바이러스 분리체 또는 이의 성분을 제 9 항의 핵산과 반응시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15 항 또는 16 항에 있어서, MPV는 사람의 MPV인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 15 항 또는 16 항에 따른 방법에 따라, 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 과(科)의 뉴모비리네(Pneumovirinae) 아과에 속하고, 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속에 계통유전학적으로 상응하는 네거티브 센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스로서 확인되는 바이러스 분리체.
  19. MPV 감염 진단용 키트에 있어서, 제 1 항 내지 제8항중 어느 한 항의 바이러스, 제 9 항의 핵산, 제 12 항의 단백질성질을 가진 분자 또는 이의 단편, 제 13 항의 항원, 또는 제 14 항의 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
  20. 호흡계 질환 치료에 유용한 화합물을 수득하는 방법에 있어서, 제 1 항 내지 제8항중 어느 한 항에 따른 바이러스를 포함하는 세포 배양액 또는 비-인간 실험 동물을 만들고, 상기 배양액 또는 비-인간 동물을 후보 화합물로 처리하고, 상기 바이러스, 또는 상기 배양액 또는 비-인간 동물의 바이러스 감염에 대한 상기 화합물의 효과를 측정하고, 항바이러스 효과를 가지는 화합물을 선택하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 조류에서 APV 감염을 바이러스학적으로 진단하는 방법에 있어서, 제 11 항의 핵산 또는 제 16 항의 항체와 조류 시료를 반응시켜 상기 시료에서 바이러스 분리체 또는 이의 성분이 존재하는 지를 결정하고, 이때, 상기 핵산 또는 항체는 APV의 성분과 교차 반응성이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 조류에서 APV 감염을 혈청학적으로 진단하는 방법에 있어서, 제 12 항의 단백질 분자; 또는 제 13 항의 항원과 조류 시료를 반응시켜 상기 시료에서 APV 또는 이의 성분에 특이적인 항체가 존재하는 지를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, APV는 APV-C로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, APV는 APV-C로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 9 항에 있어서, 포유동물 시료와의 반응으로 상기 시료에서 바이러스 분리체 또는 이의 성분이 존재하는 지를 결정함으로써 포유 동물에서 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  26. 제 14 항에 있어서, 항체는 조류 뉴모바이러스(Pneumovirus)의 성분과 특이적으로 반응하며, 이 항체는 포유동물 시료와의 반응으로 상기 시료에서 바이러스 분리체 또는 이의 성분이 존재하는 지를 결정함으로써 포유 동물에서 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단하는데 이용되는 MPV의 성분과 교차-반응성을 가지는 것을 특징으로 하는 항체.
  27. 포유류에서 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단하는 방법에 있어서, 제 9 항의 핵산 또는 제 14 항의 항체와 반응시켜 상기 포유류 시료에서 바이러스 분리체 또는 이의 성분이 존재하는 지를 결정하는 것을 포함하고, 이때, 포유류는 사람이 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 포유류에서 MPV 감염을 혈청학적으로 진단하는 방법에 있어서, 제 12 항의 단백질성질의 분자 또는 이의 단편 또는 제 13 항의 항원과 반응시켜 상기 포유류시료에서 MPV 또는 이의 성분에 대해 특이적인 항체가 존재하는 지를 결정하는 것을 포함하고, 이때, 포유류는 사람이 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 20 항에 있어서, 화합물은 항바이러스 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 20 항에 있어서, 화합물은 MPV-중화 항체 또는 이의 성분인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 9 항에 따른 핵산을 유효성분으로 하며, MPV 감염 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  32. 제 10 항에 따른 벡터를 유효성분으로 하며, MPV 감염 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  33. 제 11 항에 따른 숙주 세포를 유효성분으로 하며, 호흡계 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  34. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 바이러스를 유효성분으로 하며, MPV 감염의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  35. 제 12 항의 단백질성질을 가진 분자 또는 이의 기능적인 단편을 유효성분으로 하며, MPV 감염의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  36. 제 14 항의 항체를 유효성분으로 하며, MPV 감염의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  37. 제 12 항에 있어서, 포유동물 시료와의 반응으로 상기 시료에서 바이러스 분리체 또는 이의 성분이 존재하는 지를 결정함으로써 포유 동물에서 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 단백질성질을 가진 분자.
  38. 제 13 항에 있어서, 포유동물 시료와의 반응으로 상기 시료에서 바이러스 분리체 또는 이의 성분이 존재하는 지를 결정함으로써 포유 동물에서 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 항원.
  39. 제 1 항에 있어서, 바이러스는 (i) 포유동물 세포를 감염시킬 수 있고; (ii) 감염된 포유동물 세포의 합포체 형성을 초래할 수 있고; (iii) 150 내지 600nm 범위의 입자들을 형성하고; (iv) 클로로포름에 민감성이며; 그리고 (v)이 바이러스에 감염된 tMK는 헤마토글루티닌 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 네거티브 센스 단일 쇄 RNA 포유류 메타뉴모바이러스.
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