CN103911378A - 涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法 - Google Patents

涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103911378A
CN103911378A CN201410144264.4A CN201410144264A CN103911378A CN 103911378 A CN103911378 A CN 103911378A CN 201410144264 A CN201410144264 A CN 201410144264A CN 103911378 A CN103911378 A CN 103911378A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
disappearance
tee
here
mrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410144264.4A
Other languages
English (en)
Inventor
V·P·莫罗
G·M·伊德尔曼
周伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Scripps Research Institute
Original Assignee
Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Research Institute filed Critical Scripps Research Institute
Publication of CN103911378A publication Critical patent/CN103911378A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1051—Gene trapping, e.g. exon-, intron-, IRES-, signal sequence-trap cloning, trap vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

这里提供了mRNA翻译增强因子(TEEs)，例如，SEQ ID Nos：1-35。还提供了包括一种或者一种以上这里例举的具体TEEs或其变体、类似物或其功能性衍生物的翻译增强聚核苷酸。进一步提供了包括这种TEEs或翻译增强聚核苷酸的表达载体，以及含有这种载体的宿主细胞和表达系统。

Description

涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法
本申请是2008年12月11日递交的申请号为200880126367.0，发明名称为“涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法”的分案申请。
优先权文件的引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2007年12月11日递交的美国临时专利申请系列号61／007,440的优先权。前述申请的申请日在此作为本申请的优先权日，上述临时专利申请公开的内容在此通过引证全部并入本文。
背景技术
在真核生物中，翻译过程开始于40S核糖体亚基招募之后，可以通过m7G封端结构发生，或者通过封端独立机制发生，其中所述m7G封端结构是一种在mRNA的5’末端发现的修饰的核苷酸。通过封端独立机制发生的翻译过程被定义为翻译过程的内部启动，可以通过多种不同的机制来调节。通过其它机制完成招募之后，40S核糖体亚基移动到一种启动密码子处，在这里，加入60S核糖体亚基，开始肽合成。包含位于mRNA5’和3’末端非编码片段的序列因子能够影响翻译启动的作用。能够增强封端依赖性mRNA翻译作用效果的序列因子被命名为翻译增强因子(TEE)。
一些翻译增强因子(TEE)通过特定的机制增强翻译启动作用，所述机制包括与RNA的组成部分，包括40S核糖体亚基、18S核糖体RNA(rRNA)的碱基配对。一些翻译增强因子(TEE)还可以起到和核糖体招募为点的作用，能够促进翻译的内启动；但是，绝大多数内部核糖体进入位点(IRESe)不能起到翻译增强因子(TEE)的作用。
发明内容
在本领域内存在对更多的翻译增强因子(TEE)的需要，在生物技术和基因疗法中，翻译增强因子(TEE)能够用于调节蛋白质表达。这里公开的内容满足了这一需要和其它需要。
在一个方面，这里提供了分离的或合成的聚核苷酸序列，这种聚核苷酸序列可以作用翻译增强因子(TEE)并且包括至少一个mRNA翻译增强因子(TEE)。所述聚核苷酸序列中存在的翻译增强因子(TEE)由RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO：1)或者MSCSGCNGM WA(SEQ ID NO：2)、或者其基本上相同的序列组成。同样，在这些聚核苷酸序列中可以包括每种翻译增强因子(TEE)的一个以上拷贝(例如2个、5个、10个、25个、50个或者更多的拷贝)。
在一个实施方案中，翻译增强因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO：3)或者R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO：4)、或者其基本上相同的序列组成。在这些序列中，R1是缺失，如果存在的话，是A或者G；N1是缺失，如果存在的话，是A、C或者G，优选是A、C、或者G；S1是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是C或者G；M1是A或者C；R2是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C；R3是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失；并且，R5是缺失，如果存在的话，是A，优选是缺失；M3是缺失，如果存在的话，是C或者A，优选是C或者A；S2是缺失，如果存在的话，是C或者G，优选是C或者G；S3是G或者C；N2是G、C或者T；M4是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A或者T；R6是缺失，如果存在的话是A。
在另一个实施方案中，翻译增强因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4组成。在这个序列中，R1、R3和R4是缺失；N1是A、C或者G；S1是C或者G；M1是A或者C；R2是A或者G并且，M2是A或者C。在另一个实施方案中，翻译增强因子(TEE)由R5M3S2CS3GCN2GM4WR6组成。在这个序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的话是A或者C；S2是C或者G；S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T；M2是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A。
在一些实施方案中，聚核苷酸序列包括一种翻译增强因子(TEE)，这种翻译增强因子(TEE)具有的序列与SEQ ID NO：5-35所示序列有至少90％的一致性。在一些实施方案中，聚核苷酸序列包括一种翻译增强因子(TEE)，这种翻译增强因子(TEE)具有的序列与SEQ ID NO：5-35所示序列中的一种一致。
在一些聚核苷酸序列中，至少存在两个拷贝的翻译增强因子(TEE)。在一些聚核苷酸序列中，存在超过2个拷贝的翻译增强因子。在一些或者其它实施方案中，所述聚核苷酸序列包括至少5个拷贝的翻译增强因子(TEE)、至少10个拷贝的翻译增强因子(TEE)、至少25个拷贝的翻译增强因子(TEE)。
在一个相关方面，这里提供了用于在真核细胞中重组表达多肽的克隆或者表达载体。这种载体包括一种真核启动子，这种真核启动子与一种聚核苷酸序列可操作的相连，所述聚核苷酸序列包括至少一个这里公开的mRNA翻译增强因子(TEE)。载体中存在的翻译增强因子(TEE)由RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO：1)或者MSCSGCNGM WA(SEQ ID NO：2)、或者其基本上相同的序列组成。
在一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO：3)或者R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO：4)、或者其基本上相同的序列组成。在这些序列中，R1是缺失，如果存在的话，是A或者G；N1是缺失，如果存在的话，是A、C或者G，优选是A、C、或者G；S1是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是C或者G；M1是A或者C；R2是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C；R3是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失；并且，R5是缺失，如果存在的话，是A，优选是缺失；M3是缺失，如果存在的话，是C或者A，优选是C或者A；S2是缺失，如果存在的话，是C或者G，优选是C或者G；S3是G或者C；N2是G、C或者T；M4是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A或者T；R6是缺失，如果存在的话是A。
在另一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4组成。在这个序列中，R1、R3和R4是缺失；N1是A、C或者G；S1是C或者G；M1是A或者C；R2是A或者G并且，M2是A或者C。在另一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE)由R5M3S2CS3GCN2GM4WR6组成。在这个序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的话是A或者C；S2是C或者G；S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T；M2是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A。
在一些载体中，这种翻译增强因子(TEE)具有的序列与SEQID NO：5-35所示序列基本一致。在一些载体中，这种翻译增强因子(TEE)具有的序列与SEQ ID NO：5-35所示序列中的一种一致。
在一些载体中，所述mRNA翻译增强因子位于启动子的3’端并且能够与编码所关心的多肽的第二聚核苷酸序列直接连接。这些载体中的一些进一步包括一种第二聚核苷酸序列，这种第二聚核苷酸序列能够编码所关心的多肽，这种所关心的多肽与mRNA翻译增强因子可操作的相连。在一些载体中，mRNA翻译增强因子位于第二聚核苷酸序列的5’前导序列中。这里进一步提供了DNA疫苗，这种DNA疫苗包括一种载体，能够表达这里描述的所关心的抗原。这里进一步提供了一种宿主细胞(即，真核宿主细胞，例如CHO细胞)，这种宿主细胞被载体转染。
在进一步的方面，这里提供了重组制备所关心的多肽的方法。这些方法包括，构建一种表达载体，这种表达载体包括一种真核启动子和至少一个拷贝(例如，1、2、3、4、5、10、25、50或更多拷贝)的mRNA翻译增强因子，每个都与编码所关心多肽的聚核苷酸可操作的相连。随后，将所得表达载体转染进入真核宿主细胞(例如，CHO细胞中)，并且培养用表达载体转染的宿主细胞。在一个实施方案中，在载体中存在的mRNA翻译增强因子(TEE)由RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO：1)或者MSCSGCNGM WA(SEQ ID NO：2)、或者其基本上相同的序列组成。
在一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO：3)或者R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO：4)、或者其基本上相同的序列组成。在这些序列中，R1是缺失，如果存在的话，是A或者G；N1是缺失，如果存在的话，是A、C或者G，优选是A、C、或者G；S1是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是C或者G；M1是A或者C；R2是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C；R3是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失；并且，R5是缺失，如果存在的话，是A，优选是缺失；M3是缺失，如果存在的话，是C或者A，优选是C或者A；S2是缺失，如果存在的话，是C或者G，优选是C或者G；S3是G或者C；N2是G、C或者T；M4是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A或者T；R6是缺失，如果存在的话是A。
在另一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4组成。在这个序列中，R1、R3和R4是缺失；N1是A、C或者G；S1是C或者G；M1是A或者C；R2是A或者G并且，M2是A或者C。在另一个实施方案中，载体中存在的翻译增强因子(TEE)由R5M3S2CS3GCN2GM4WR6组成。在这个序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的话是A或者C；S2是C或者G；S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T；M2是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A。
这种翻译增强因子(TEE)具有的序列与SEQ ID NO：5-35所示序列基本一致。在一些载体中，这种翻译增强因子(TEE)具有的序列与SEQ ID NO：5-35所示序列中的一种一致。这些方法中的一些还可以进一步包括从宿主细胞或者从被培养宿主细胞周围的培养基中纯化表达的重组多肽。使用这里描述的方法可以生产多种所关心的多肽。例如，这里所描述的方法适用于许多在临床上十分重要的治疗剂蛋白质。
通过参考本发明说明书的其它部分和权利要求书，可以实现对本发明特点和优势的进一步理解。
附图说明
图1是一种示意图，代表了翻译增强正反馈载体以及不同的启动子(PI)和转录增强子(P2)、转录因子(TF)基因和所关心的蛋白。
图2是一种示意图，代表了图1所示的翻译增强正反馈载体与一种第三蛋白阻碍宿主蛋白质合成。
图3显示了与大小吻合的参照构建物活性相比，5到25拷贝的各种翻译增强因子在CHO细胞中翻译增强作用的翻译增强活性。
图4显示了从不同的翻译增强因子(TEE)中衍生的一致性模体。
图5显示了相对于大小吻合的参照构建物活性，根据模体序列1(SEQ ID NO：1)或者模体序列2(SEQ ID NO：2)的合成序列的翻译增强活性。
具体实施方式
1.概述
在这里公开的是一种新型的mRNA翻译增强因子(TEE)。具体的说，如随后实施例中详细描述的，这里识别的是一些短核苷酸序列，这种短核苷酸序列能够增强哺乳动物宿主细胞(例如，CHO和BHK细胞系)中的翻译作用。这里公开的是来自这种短核苷酸序列的一致性模体或者翻译增强因子。在一个实施方案中，模体1是RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO：1)，模体2是MSCSGCNGMWA(SEQ ID NO：2)。据显示，在这些序列中，R代表A或者G；M代表A或者C；S代表G或者C；W代表A或者U(T)；并且N代表A、G、C或者U(T)。
在其他的实施方案中，模体1是R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO：3)。在这一序列中，R1是缺失，如果存在的话，是A或者G；N1是缺失，如果存在的话，是A、C或者G，优选是A、C、或者G；S1是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是C或者G；M1是A或者C；R2是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C；R3是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失。在另一个实施方案中，模体1是R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO：3)，其中R1、R3、R4是缺失，N1是A、C或者G；S1是C或者G；M1是A或者C；R2是A或者G并且M2是A或者C。
在另一个实施方案中，模体2是R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO：4)。在此序列中，R5是缺失，如果存在的话，是A，优选是缺失；M3是缺失，如果存在的话，是C或者A，优选是C或者A；S2是缺失，如果存在的话，是C或者G，优选是C或者G；S3是G或者C；N2是G、C或者T；M4是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A或者T；R6是缺失，如果存在的话是A。在另一个实施方案中，模体2是R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQID NO：4)。在此序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的话是A或者C；S2是C或者G；S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T；M2是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A。
此外，这里公开了根据一致性模体合成的其他一些具体序列(例如，SEQ ID NOs：5-35)。这些合成的序列不表示在用于识别模体序列的序列中。这些合成的序列显示增强的翻译活性。包含一个或者多个这些序列拷贝的聚核苷酸序列能够提高翻译作用25倍。
这里公开了翻译增强子，这种翻译增强子是分离的或者基本上纯的多聚核苷酸(例如，DNA)，包括至少一个这里公开的mRNA翻译增强因子(TEE)的一种或者一种以上拷贝。当与一种编码所关心多肽的多聚核苷酸可操作的相连时，这种多聚核苷酸可以起到翻译增强子的作用。示例性的翻译增强因子(TEE)显示在SEQ ID NOS：1-35中。请注意，尽管这里描述的翻译增强因子(TEE)处于脱氧核糖核苷酸序列中，本领域技术人员应当容易理解，翻译增强因子(TEE)或者包括所述翻译增强因子(TEE)的多聚核苷酸还可以包括相应的核糖核苷酸序列。这里还提供了克隆载体或者表达载体，所述载体包括这里公开的翻译增强因子(TEE)或者翻译增强子多聚核苷酸，以及怀有这些载体的宿主细胞。这里进一步提供了使用这种翻译增强因子(TEE)、所述翻译增强子多聚核苷酸和所述表达载体来增强翻译作用并产生所需多肽(例如，一种治疗剂蛋白)的方法。
除非另有陈述，这里公开的方法使用传统的分子生物学方法(包括重组技术)、微生物学方法、细胞生物学方法、生物化学方法和免疫学方法，这些方法包括在本领域技术人员已知的范围内。这些技术在现有技术文献中有很好的阐述，例如，下列参考文献描述了示范性的方法：Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring HarborPress(3rded.，2001)；Brent et ah，Current Protocols in MolecularBiology(分子生物学现有方案)，John Wiley&Sons，Inc.(Ringboued.，2003)；和Freshney，Culture of Animal Cells：A Manual of BasicTechnique(动物细胞培养：基础技术手册)，Wiley-Liss，Inc.(4thed.，2000).
2.定义
本说明书并不局限于这里描述的具体的工艺、方案和试剂，可以存在变化。本领域技术人员应该理解，这里使用的术语只起到描述具体的实施方案的目的，并不打算作为对本发明范围的限制，本发明的范围有所附权利要求书来描述。
如这里使用的，除非上下文另有明确定义，否则单数形式“一种(a)”“一个(an)”和“所述(the)”包括复数意义。因此，例如，“一种细胞”包括这种细胞的复数形式，提到“一种蛋白”包括一种或一种以上的蛋白质以及本领域技术人员已知的等同物，以此类推。
除非另有定义，否则所有这里使用的科学技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的意义。下列参考文献向本领域普通技术人员提供了许多这里所公开术语的通用定义：AcademicPress Dictionary of Science and Technology(学术出版社的科学技术词典)，Morris(Ed.)，Academic Press(学术出版社)(1sted.，1992)；Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(生物化学和分子生物学牛津词典)，Smith et al.(Eds.)，OxfordUniversity Press(牛津大学出版社)(revised ed.，2000)；Encyclopaedic Dictionary of Chemistry(化学百科全书词典)，Kumar(Ed.)，Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002)；Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology(微生物学和分子生物学词典)，Singleton et al.(Eds.)，John Wiley&Sons(3rded.，2002)；Dictionary of Chemistry(化学词典)，Hunt(Ed.)，Routledge(1sted.，1999)；Dictionary of Pharmaceutical Medicine(药物医学辞典)，Nahler(Ed.)，Springer-Verlag Telos(1994)；Dictionary of OrganicChemistry(有机化学词典)，Kumar and Anandand(Eds.)，AnmolPublications Pvt.Ltd.(2002)；andΛDictionary of Biology(OxfordPaperback Reference)，Martin and Hine(Eds.)，Oxford UniversityPress(4thed.，2000).这里提供了专用于本发明公开内容的术语的进一步的介绍。
这里使用的术语“试剂”包括任何物质、分子、因子、化合物、单位或者他们的结合。他包括但不局限于，例如，蛋白质、多肽、小有机分子、多聚糖、多聚核苷酸等等。他可以是一种天然产物、一种合成的化合物、或者一种化学化合物，或者两种或更多种物质的结合。除非另有规定，术语“试剂”、“物质”和“化合物”可以互换使用。
这里使用的术语“作用子”是指一种DNA单元，能够编码单一多肽或者蛋白质。术语“翻译单元”是指一种DNA片段，在此片段中，能够发生RNA的合成。
术语“DNA疫苗”是指一种DNA，这种DNA可以被引入到一种宿主细胞或者组织中，并且在其中通过细胞进行表达，从而产生一种信使核糖核酸(mRNA)分子，信使核糖核酸(mRNA)分子随后被翻译，从而产生一种DNA编码的疫苗抗原。
术语“所关心的基因”包括一种作用子、一种开放阅读框(ORF)或者一种密码蛋白质产物(所关心的蛋白质)的多聚核苷酸序列，所述蛋白质产物(所关心的蛋白质)的生产可以通过翻译增强因子(TEE)调节。所关心的基因的实施例包括编码治疗剂蛋白质的基因、编码营养蛋白质的基因和编码工业有效蛋白质的基因。所关心的基因还可以包括报道基因或者可选择的标记物基因，例如，增强绿色荧光的蛋白质(EGFP)、荧光素酶基因(Renilla或者Photinus)。
表达作用是一种过程，通过这种过程由DNA产生蛋白质。该过程包括基因转录变成mRNA和随后的mRNA翻译变成一种多肽。
这里使用的术语“内源性”是指一种通常发现在野生型宿主体内的基因，而这里使用的术语“外源性”是指通常不能在野生型宿主体内发现的基因。
这里使用的“宿主细胞”涉及一种活细胞，在这种活细胞中，异源多聚核苷酸序列能够被引入或者已经被引入。所述活细胞包括经过培养的细胞和活组织内部的细胞。向细胞中引入异源多聚核苷酸序列的方法是本领域内已知的，例如，转染方法、电穿孔方法、磷酸钙沉淀、微量注射法、转化方法、病毒传染法、和／或其他方法。通常，所述被引入细胞中的异源多聚核苷酸序列是一种可复制的表达载体或者克隆载体。在一些实施方案中，宿主细胞可以被设计并在其染色体或者基因组上合成一种需要的基因。本领域普通技术人员已知的许多宿主细胞都可以被使用(例如，CHO细胞)作为宿主。例如，参见Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室操作指南)，ColdSpring Harbor Press(冷泉港出版社)(3red.，2001)；和Brent et al，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现有方案)，John Wiley&Sons，Inc.(ringbou ed.，2003).。在一些实施方案中，所述宿主细胞是一种真核细胞。
这里使用的术语“同系物”是指一种序列，这种序列与参照序列(例如，这里公开的特异性mRNA翻译增强因子)具有基本上一致的结构(例如，核苷酸序列)。通常，所述同系物能够维持增强所关心的基因编码的mRNA翻译作用的能力。通过在如上所述的参照序列上制造突变，在表达载体上适当的位置插入突变序列并进行活性筛选同系物，所述表达载体包括一种启动子，所述启动子可操作的与一种报道基因或者所关心的基因相连接。然后，可以将表达载体引入宿主细胞，从而检测基因编码的蛋白质的翻译作用。如果报道基因的翻译与在参照增强子序列控制的情况下报道基因的翻译作业相同的话，突变序列就是一种功能性的同系物。
术语″诱导剂″是用来指那些从一种可诱导翻译的调节因子来影响翻译的一种化学的、生物学的或物理的试剂。作为对诱导剂的响应，从该元件的翻译通常从头开始或提高表达的基本的或组成水平。诱导剂可以是，例如，细胞遭受一种应激状态，例如，一种热或冷冲击，一种毒剂例如一种重金属离子，或一种营养，激素，生长因子，等等的缺乏；或者可以是一种化合物，这种化合物是那些影响细胞的生长或者分化状态的物质，例如一种激素或者一种生长因子。
惯用语″分离的或者纯化的多聚核苷酸″意思是包含一个多聚核苷酸序列(例如，DNA)，这个多聚核苷酸序列是从自然存在的有机体的基因组中立即连接的序列的两头分离到的。纯化的多聚核苷酸可以是一种双链或者单链的寡聚核苷酸；结合进载体的一种多聚核苷酸片段；一种被插入到真核的或者原核生物的基因组中的片段；或者是用作探针的一种片段，惯用语″基本上纯的，″当指一种多聚核苷酸时，意思是该分子已经与其他的伴随的生物组分分离开的，所以，一般地，在一个样品中它至少有百分之85或者更大的百分比。
术语“核苷酸序列”，“核酸序列”，“核酸”，或者“多聚核苷酸序列”，指的是一种脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸聚合物，它是单链的或者是双链的形式，并且除非另外限定，包含那些以类似于自然地存在核苷酸的方式杂交到核酸中的已知的自然的核苷酸的类似物。核苷酸序列可以是，例如，原核生物的序列，真核生物的信使核糖核酸序列，来自真核生物的信使核糖核酸的互补DNA序列，来自真核生物的脱氧核糖核酸的基因组脱氧核糖核酸序列(例如，哺乳动物脱氧核糖核酸)，和合成的脱氧核糖核酸或者核糖核酸序列，但并不限于这些。
术语“启动子”意思是一种能够指导转录并且是在转录的起始的核苷酸序列。各种各样的启动子序列在本领域中是已知的。这些因子可以包含，但不局限于，TATA-盒子，CCAAT-盒子，噬菌体核糖核酸聚合酶特异的启动子(例如，T7，SP6，和T3启动子)，一种SP1位点，和一种环AMP响应因子。如果该启动子是可诱导的类型，则它的活性随诱导剂而增加。
五个主要的引物或者未翻译的区域(5′引物，5′引物序列或者5′UTR)是一种特殊的的信使核糖核酸(mRNA)和编码它的脱氧核糖核酸的片段。它起始于+1位点(转录开始的位置)并且刚好在编码区域的起始密码子(通常是AUG)前结束。在细菌中，它可能包含通常所说的Shine-Delgarno序列的一种核糖体结合部位(RBS)。5′引物可能是一百或更长的核苷酸，并且3′UTR可能更长(直至几千个K碱基长)。
术语“可操作地连接”或者“可操作地联系”指的是遗传因子之间功能的连接，它们以一种那些能使它们进行它们正常的功能的方式来连接。例如，当一个基因的转录在启动子的控制之下它可操作地连接到该启动子上并且产生的转录产物是正确地被转换为由该基因正常地编码的蛋白质。同样地，如果它允许上调由该基因转录的信使核糖核酸的翻译，翻译增强因子可操作地与所关心的基因相联系。
适合于定向连接反应的核苷酸序列，例如，多酶连接子，是那些提供了位点或者将一个多聚核苷酸序列定向连接成载体的一种表达载体的一个区域。一般地，一种定向多酶连接子是一种核苷酸序列，它定义为两个或更多限制性核酸内切酶识别序列，或者限制位点。当限制分裂时，这两个位点产生粘性末端这样多聚核苷酸序列可以连接到表达载体上。在一种实施方案中，当限制分裂时，这两个限制酶切位点提供了粘性末端也就是说非互补的并且因此允许定向插入一种多聚核苷酸序列到盒子中。例如，适合于定向连接的核苷酸序列可以包含一种核苷酸序列，它定义为多次定向克隆方法。适合于定向连接的核苷酸序列的位置定义为多限制酶切位点，它称为一个多克隆位点。
对治疗来说的术语“患者”指的是分类为哺乳动物的任何动物，例如，人和非人的哺乳动物。非人类的动物的实例包含狗，猫，牛，马，绵羊，猪，山羊，兔，等等。除了注解的时候外，术语“病人”或者“患者”在这里可互换使用。在一种实施方案中，患者是人。
转录因子指的是那些要求开始或者调节转录的任何多肽。例如，这些因子包含，但不局限于，c-Myc，c-Fos，c-Jun，CREB，cEts，GATA，GAL4，GAL4／Vp16，c-Myb，MyoD，NF-κB，细菌噬菌体-特异核糖核酸聚合酶，Hif-1，和TRE。编码这些因子的序列的实例包含，但不局限于，基因银行登记号K02276(c-Myc)，K00650(c-fos)，BC002981(c-Jun)，M27691(CREB)，X14798(cEts)，M77810(GATA)，K01486(GAL4)，AY136632(GAL4／Vp16)，M95584(c-Myb)，M84918(MyoD)，2006293A(NF-κB)，NP853568(SP6RNA聚合酶)，AAB28111(T7RNA聚合酶)，NP523301(T3RNA聚合酶)，AF364604(HIF-I)，andX63547(TRE)。
一种“基本上相同的”核苷酸或者氨基酸序列指的是一种核苷酸或者氨基酸序列，它包含一种序列，其至少90％的序列与通过在这里所描述的众所周知的程序(例如，BLAST)使用标准参数来测定的对照序列相同。这些序列同一性可以是至少95％，至少98％，和至少99％。在一些实施方案中，患者序列具有同对照序列相比大致一样的长度，那就是说，那就是说，由大致一样数量的连续的氨基酸残基(对于多肽序列)或者核苷酸残基(对于多聚核苷酸序列)组成。
序列同一性可以很容易地用本领域技术人员所已知的各种各样的方法来确定。例如，BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用缺省字长(W)11，期望值(E)10，M=5，N=-4，来对两条链作比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用缺省字长(W)3，期望值(E)10，和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))。序列同一性的百分比通过在一个比较窗口上比较两个最佳地-定位序列来确定，为了这两个序列最佳的定位在这里比较窗口中多聚核苷酸序列部分与对照序列(它不包含增加的部分或者删除部分)相比可能包含增加的部分或者删除部分(也就是，缺口)。百分比的计算由位点的数目来确定，在这些位点处存在于这两个序列中的相同的核酸碱基或者氨基酸残基来得到匹配位点的数目，将匹配位点的数目除以比较窗口中总的位点数目并且将结果乘以100来得到序列同一性的百分比。
术语“翻译增强因子(TEE)”指的是那些增加由信使核糖核酸产生的多肽或者蛋白质的数量，高于由于单独的帽子结构的翻译水平的顺式活性序列。本领域技术人员已知的TEE的实例包含Gtx同源结构域蛋白质的5′引物中的序列(Chappell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101：9590-9594，2004)。另外，在这里所公开的新的TEE，例如，SEQ ID NO：1-35。除非另作说明，TEE指的既是信使核糖核酸序列中的翻译增强因子也是脱氧核糖核酸序列中相应的编码序列因子。
“翻译增强子多聚核苷酸”或者“翻译增强子多聚核苷酸序列”是包含一种或多种这里所示例的特异的TEE(也就是，SEQ IDNO：1-35)或者它们的变体，同源物或者功能衍生物的多聚核苷酸。一种特异的TEE的一个或者多拷贝可以存在于该多聚核苷酸中。翻译增强子多聚核苷酸中的TEE可以组成一个或者多个序列片段。一个序列片段可以怀有一种或多种这里所示例的特异的TEE，每隔TEE均已一个或者多个拷贝的形式存在。当多重序列片段存在于一种翻译增强子多聚核苷酸中时，他们可以是同源的或者异源的。因此一种翻译增强子多聚核苷酸中的多重序列片段可以怀有相同的或者不同的类型的在这里所示例的特异的TEE，每一个特异的TEE的拷贝份数是相同的或者不同的，并且／或者每个序列片段内的TEE是相同的或者不同的组成。
术语“治疗”或者“减轻”包含化合物或者药剂的给药患者来防止或者延缓一种疾病(例如，一种心脏机能障碍)的症状，并发症，或者生化的征候，减轻这些症状或者阻止或者抑制该疾病，状态或者病症的进一步的发展。需要治疗的患者包含已经遭受该疾病或者病症以及那些有该病症倾向的或者那些将预防该病症的病人。
治疗可以在该疾病后显现预防(预防或者延缓该疾病的发病，或者预防它的临床的或者临床症状不显的症状的显现)或者治疗的抑制或者减轻症状。在心脏重塑和／或心力衰竭的治疗中，一种治疗剂可以直接减少该疾病的病状，或者致使该疾病对其他的治疗剂的治疗更敏感。
术语“载体”或者“构造”指的是多聚核苷酸序列因子以一种固定的组织类型排列以致与这些因子可操作地连接的基因／基因产物的表达可以预见地控制。一般地，他们是可传染的多聚核苷酸序列(例如，质粒或者病毒)，一种外来的脱氧核糖核酸片段可以接合到这些多聚核苷酸序列中以便将外来的脱氧核糖核酸引入到宿主细胞来加速它的复制和／或转录。
克隆载体是是一种脱氧核糖核酸序列(一般为一种质粒或者噬菌体)，它能够在宿主细胞中自主复制，并且它具有一个或者少量的限制性核酸内切酶识别位点。一种外来的脱氧核糖核酸片段可以在这些位点接合进该载体以便该片段的复制和克隆。该载体可以包含一种或多种标记来用于识别转化的细胞。例如，标记可以提供了四环素或者氨苄青霉素抗性。
表达载体类似于克隆载体但是它在转化进入宿主后能够诱导那些已经克隆到该载体中的脱氧核糖核酸的表达。被克隆的脱氧核糖核酸通常受某些调节的序列例如启动子或者增强子的控制(也就是，可操作的联系到)。启动子序列可以是结构的，可诱导的或者可抑制的。
表达载体类似于克隆载体但是它在转化进入宿主后能够诱导那些已经克隆到该载体中的脱氧核糖核酸的表达。被克隆的脱氧核糖核酸通常受某些调节的序列例如启动子或者增强子的控制(也就是，可操作地连接到)。启动子序列可以是结构的，可诱导的或者可抑制的。
III.翻译增强子多聚核苷酸和重组载体
在这里提供了分离或者基本上纯化的作为翻译增强子功能的多聚核苷酸。这些翻译增强子多聚核苷酸包含治这里所公开的特异的信使核糖核酸翻译增强子因子(TEE)或者它们的变体，同源物或者功能性的衍生物。翻译增强子多聚核苷酸可以包含一种或多种序列片段，这些序列片段包含一致的Motif1(SEQ IDNO：1)，Motif2(SEQ ID NO：2)，Motif1a(SEQ ID NO：3)，或者Motif2a(SEQ ID NO：4)。一些翻译增强子多聚核苷酸可以包含一种或多种序列片段，这些序列片段包含如SEQ ID NO：5-35所示的特异的信使核糖核酸TEE的一个。如下面的实例所证明的，那些怀有这些信使核糖核酸TEE中的一个的载体中所关心的多肽的表达导致蛋白质产量显著的增加。除了如SEQ ID NO：135所示的信使核糖核酸TEE之外，信使核糖核酸TEE也可以包含序列，这些序列基本上和这些例证序列的一个一致并且可以保持在宿主细胞中所关心的一种可操作地连接的基因的表达增强的基本的功能特性。
翻译增强子多聚核苷酸中的序列片段可以包含如SEQ IDNO：1-35所示的仅仅一个特异的信使核糖核酸TEE或者几个信使核糖核酸TEE。存在于一种序列片段中的每一个特异的信使核糖核酸TEE，该序列片段中只能仅有该信使核糖核酸TEE的一个拷贝。替代地，每一个信使核糖核酸TEE的多拷贝可以存在于各自的序列片段中。一般地，翻译增强子多聚核苷酸中不同的信使核糖核酸TEE因子可以是操作上连接的彼此靠近或者被那些长度1到大约100核苷酸不等的间隔核苷酸序列分开。一些翻译增强子多聚核苷酸包含仅仅一个序列片段。其它的翻译增强子多聚核苷酸包含大量的序列片段。在后面的实施方案中，该序列片段可以是同源的或者异源的。
因此，一些实施方案涉及一种翻译增强子多聚核苷酸序列片段，它包含一种信使核糖核酸TEE序列，这些信使核糖核酸TEE序列与如SEQ ID NO：1-35所示的序列的一个一样或者基本上一致。其它的实施方案涉及一种翻译增强子多肽序列片段，它包含如SEQ ID NO：1-35所示的一种特异的信使核糖核酸TEE的2，3，4，5，10，25，50或更多拷贝。在一些实施方案中，该翻译增强子多聚核苷酸涉及一种序列片段，它包含超过一个(例如，2，3，4，5，或更多)如SEQ ID NO：1-35所示的不同的信使核糖核酸TEE或者它们的变体或者同源物。在这些实施方案中，每一个特异的信使核糖核酸TEE可以以一种或多种拷贝(例如，2，3，4，5，10，25或更多拷贝)的形式存在。在其它的实施方案中，该翻译增强子多聚核苷酸包含超过一个上面注解的序列片段。不同的序列片段可以按照特异的信使核糖核酸的类型和每个特异的信使核糖核酸TEE所怀有的拷贝数目来一致。替代地，多重序列片段可以在特异的信使核糖核酸TEE的类型和／或每个特异的信使核糖核酸TEE的拷贝数目上有所不同。在任何实施方案中，除了如SEQ ID NO：1-35所示的信使核糖核酸TEE外，这些特异的TEE的变体或者带有基本上一致的序列的同源物也是能使用的。
在此公开的特异的信使核糖核酸TEE或者翻译增强子多聚核苷酸可用于构造重组克隆载体或者表达载体。这些载体对于表达所关心的多肽或者蛋白质是非常有用的，例如，一种治疗的蛋白质。他们还可以用于治疗的应用例如脱氧核糖核酸疫苗或者基因治疗。重组载体可以由一种质粒，病毒或者其他的本领域技术人员已知的载体通过插入或者结合这里所描述的特异的信使核糖核酸TEE或者翻译增强子多聚核苷酸的一个或者多个来构建。这些载体的实例在下面的实施例中会讨论到。一般地，该载体包含一种适合于表达一种宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中所关心的多肽的启动子。在该载体中，一种包含TEE的序列是可操作地连接到该启动子，例如，在3′到该启动子。序列片段包含如上所述的一种TEE或者一种翻译增强子多聚核苷酸。该载体另外可以怀有一种适合于编码所关心的多肽的多聚核苷酸序列的定向连接的核苷酸的序列。例如，一种多酶连接子可以用于克隆该多聚核苷酸序列以便该克隆序列可操作地连接到该启动子和包含TEE的序列并且置于该启动子和包含TEE的序列的控制之下。多酶连接子是那些可以有一系列的三或更多间距小的限制性核酸内切酶识别序列的多聚核苷酸序列(参见，例如，Sambrook等，supra)。在一些实施方案中，如实施例中所阐述的，该载体允许多聚核苷酸序列克隆进该载体某一位置以便TEE存在于编码所关心的多肽的转录信使核糖核酸的5′引物端。
除了启动子和包含TEE的序列之外，在这里所描述的一些重组载体进一步地包含所关心的一种基因或者编码所关心的一种蛋白质或者一种多肽的多聚核苷酸。所关心的基因或者多聚核苷酸序列是可操作的连接到一种启动子序列和TEE，这种启动子序列和TEE促进了宿主细胞中插入的多聚核苷酸序列的转录效率。真核生物的信使核糖核酸的翻译在AUG密码子处开始，AUG编码信使核糖核酸的甲硫氨酸。因此，启动子和所关心的基因之间的连接将不会包含任何用于甲硫氨酸的插入密码子。这些密码子的存在可能引起融合蛋白质的形成(如果AUG密码子在作为所关心的基因的相同阅读框位置)或者缩氨酸的形成，这样或者终止上游的可信的起始密码子或者重叠该基因，但在不同的阅读框中。在一些实施方案中，编码一种蛋白质的所关心的基因包含5′引物和3′未翻译的(UTR)序列。在其它的实施方案中，输出转录产物中的该5′引物和／或3′未翻译的区域已经先于所关心的的基因的克隆存在于该载体中。在这些实施方案中，至少一个TEE位于该5′引物和／或该3′未翻译的区域。
一般地，该翻译增强子位于转录启动子和AUG密码子之间。相对于该启动子和所关心的的基因的帽子位点TEE的精确位置不是关键性的；然而，该精确位置可能影响效率。例如，一些TEE当位于编码信使核糖核酸的5′引物中，或者3′未翻译的区域中可以增强翻译。在一些实施方案中，TEE位于所关心的的基因或者顺反子的5′前导序列中。在这些实施方案中，增强子因子位于翻译起始位点内大约1-500个核苷酸，特别地是位于翻译起始位点内大约1-100或者大约1-50个核苷酸。
通过并入上面描述的的翻译增强子多聚核苷酸，重组载体可以有如SEQ ID NO：1-35所示的一种或多种该特异的翻译增强子因子。对于任何这些特异的增强子因子，该载体可以怀有仅仅一个该增强子因子的拷贝或者相同增强子因子的多个拷贝。例如，为了增加由一种联合顺反子的多肽表达，如SEQ ID NO：1-35所示的特异的TEE的2，5，10，20，35，50或者75个拷贝的串联体可以存在于一些重组表达载体中。其它的载体有多重序列片段，这些多重序列片段可以独立地包含一种或多种在这里所示例的特异的TEE序列。
另外，重组或者表达载体可以包含辅助的序列因子。例如，载体可以包含一种复制的起点，和特异的标记，这些标记允许转染的或者转化的宿主细胞的表型选择。存在于载体实施方案其他因子的变化取决于宿主细胞类型，但通常包含涉及转录和翻译的开始和转录的终止序列信号。翻译增强子序列也可能存在。载体还可以编码序列，该多腺苷酸化作用包含带有相同转录单位，控制因子例如核糖体结合部位，和多腺苷酸化作用位点，被那些允许在宿主细胞中克隆，表达，和转化的相同的或者不同的启动子，序列辅助的转录单位所控制的辅助的转录单位。在一些实施方案中，该载体还可以包含编码一种分子标记的多聚核苷酸，该标记可以便于从那些不表达所报道的基因的宿主细胞中分离那些表达该报道基因的宿主细胞。
在一些实施方案中，重组载体打算用于在真核生物的宿主细胞中表达所关心的蛋白质。如下面所详细描述的，这些包含各种各样的哺乳动物细胞以及昆虫细胞或者植物细胞。在一些实施方案中，提供了脱氧核糖核酸疫苗，它表达来自这里所公开的表达载体的一种靶子抗原。适合用于真核生物中的大量载体是本领域技术人员所已经知道的。实例包含用于哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.263：3521，1988)；用于昆虫细胞中表达的baculo病毒衍生的载体；及其他如Botstein等，Miami Winter Symp.19：265，1982；Broach Cell28：203，1982；Bollon等，J.Cin.Hematol.Oncol.10：39，1980；和细胞生物学：一种综论，Goldstein和Prescott(eds.)，学术出版社公司，美国(1980)描述的用于真核生物的表达的载体。在一些实施方案中，该翻译增强子因子或者多聚核苷酸结合进脱氧核糖核酸构造设计用于同源重组。这些构造的描述，例如，Capecchi，TIG5：70，1989；Mansour etα／.，自然336：348，1988；Thomas et al，细胞51：503，1987；and Doetschman et al，自然330：576，1987。
为了所关心的蛋白质的载体表达，信使核糖核酸TEE或者翻译增强子多聚核苷酸一般存在于可操作地连接到调节因子例如如上所述的一种启动子的载体中。取决于所关心的特殊蛋白质和使用的载体／宿主系统，许多不同的启动子可以用于重组载体中。能被使用的启动子的实例包含老鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等，J.MoI.Appl.Gen.1：273，1982)；疱疹病毒的快速的早期和TK启动子(Yao等，J.Virol.69：6249-6258，1995)；SV40早期启动子(Benoist等自然290：304-310，1981)；和人CMV启动子(Boshart等细胞41：521-530，1985)；CaMV的35S核糖核酸和19S核糖酸启动子(Brisson等，自然，310：511，1984；Odell等，自然，313：810，1985)；来自玄参花叶病毒(FMV)的全长转录产物启动子(GoWda等，J.Cell Biochem.，13D：301，1989)和来自烟草花叶病毒的外壳蛋白启动子(Takamatsu等，EMBO J.6：307，1987)。可用于构造重组表达载体的辅助的启动子包含来自核酮糖双磷酸盐羧化酶(ssRUBISCO)的小亚基的松的-可诱导的启动子(Coruzzi等，EMBO J.，3：1671，1984；和Broglie等，科学，224：838，1984)；甘露碱合成酶基因启动子(Velten等，EMBO J.，3：2723，1984)；胭脂碱合成酶(NOS)启动子(ShaW等，Nucl.Acids Res.，12：7831-46，1984)；章鱼碱合成酶(OCS)启动子Koncz等，EMBO J.2：1597-603，1983)；和热休克启动子，例如，大豆hspl7.5-E或者hspl7.3B(Gurley等，MoI.Cell.Biol.，6：559，1986；Severin等，Plant MoI.Biol.，15：827，1990)。
启动子可以既包含结构的也可以包含可诱导的自然的启动子以及设计的启动子。CaMV启动子是结构的启动子的实例。为使其最有用，可诱导的启动子将1)在诱导物不存在时提供低的表达；2)在诱导物存在时提供了高的表达；3)使用那些不干扰植物的正常的生理学的诱导程序；和4)对其他的基因的表达无效。
在一些实施方案中，该重组载体可以选择性地包含一种可选择的标记。该标记一般地编码一种性状或者一种允许选定区域的表现型，或者用于包含该标记的宿主细胞筛选。在一种实施方案中，该标记基因是一种抗生素抗性基因由此合适的抗生素可用于从那些没有转化的细胞之中筛选转化的植物细胞。合适的可选择的标记的实例包含腺苷脱氨酶，二氢叶酸还原酶，潮霉素-B-磷酸转移酶，胸苷激酶，黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和氨基苷3′-氧-磷酸转移酶II(卡那霉素，新霉素和G418抗性)。其他的合适的标记将是本领域技术人员所已知的，例如，荧光标记例如GUS报道基因(uidA)，荧光素酶或者GFP基因。
IV.用于提高所关心的多肽的产量的宿主细胞
翻译增强子多聚核苷酸和有关的载体在各种各样的工业和医疗的应用中是有用的。在一些实施方案中，提供了使用这些表达载体／宿主细胞体系用于表达治疗的蛋白质或者工业的公用事业在增加的水平上的蛋白质的用法。例如，可以用载体表达的治疗的蛋白质可以包含治疗的抗体例如赫赛汀，来自各种各样的病原体的多肽抗原例如细菌或者病毒(例如，大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，疟疾，艾滋病病毒，狂犬病病毒，HBV，和巨细胞病毒)引起的疾病，及其他蛋白质例如乳铁传递蛋白，硫氧还蛋白和β-caseinvaccine。其他的合适的蛋白质或者多肽适当包含，例如，营养地重要的蛋白质；发育增进因素；用于植物早开花的蛋白质；在某些环境条件下给植物提供保护的蛋白质，例如，对于金属或者其他的有毒物质有抗性的蛋白质，例如除草剂或者杀虫剂；给予温度极限耐受性应激相关蛋白质；给予真菌，细菌，病毒，昆虫和线虫抗性的蛋白质；特效的商业价值的蛋白质，例如，涉及代谢途径的酶，例如EPSP合成酶。
在这里所描述的怀有所关心的基因的重组载体和信使核糖核酸TEE或者增强子多聚核苷酸可以通过使用本领域技术人员已知的任何方法引入到合适的宿主细胞中。例如，载体可以通过磷酸钙共同沉淀，通过传统的机械的程序例如微量注射或者电转化，通过脂质体包裹的质粒插入，和通过病毒载体的方法转染到宿主细胞中。这些方法全都是众所周知的并且本领域技术人员熟练操作，，例如，Brent等，分子生物学通用操作规程，John Wiley&Sons，公司(ringbou等，2003)；和Weissbach&Weissbach，植物分子生物学方法，学术出版社，纽约，VIII节，421-463页，1988。怀有该转染的重组载体的宿主细胞可以使用载体上的选定区域标记来确定和分离。大量受体细胞可以在选择含有包含载体的细胞的培养基中生长。这些细胞可以直接使用或者该表达重组蛋白质可以按照传统方法例如抽提，沉淀，色谱法，亲合方法，电泳等等来纯化。使用的正确的程序取决于产生的特殊蛋白质和利用的的特殊的载体／宿主表达体系。
在一种实施方案中，用于表达该重组载体的宿主细胞是真核生物的细胞。真核生物的载体宿主系统，和哺乳动物表达体系，允许适当的表达哺乳动物蛋白质的翻译后修饰存在，例如，适当的进行主要的转录产物，糖基化作用，磷酸化作用和有益地表达产物的分泌。所以，真核细胞例如哺乳动物细胞可以是用于所关心的的一种多肽的蛋白质的宿主细胞。这些宿主细胞系的实例包含CHO，BHK，HEK293，VERO，HeLa，COS，MDCK，NSO和W138。
在一些实施方案中，使用设计的哺乳动物细胞系统，这些哺乳动物细胞系统利用重组病毒或者病毒因子来指导所关心的的蛋白质的表达。例如，当使用腺病毒表达载体时，与TEE或者翻译增强子多聚核苷酸一起的所关心的蛋白质的编码序列可以连接到腺病毒转录／翻译控制复合物，例如，延迟的启动子和分成三部分的前导序列。然后这些嵌合的基因可以通过体外或者体内重组被插入到腺病毒基因组中。病毒的基因组的非必要的区域中插入将产生一种重组病毒，它有活力并且能够在受感染宿主中表达所关心的多肽(例如，see Logan&Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：3655-3659，1984)。替代地，牛痘病毒7.5K启动子可以被使用，(例如，参见，Mackett等，Proc.Natl.Natl.Acad.Sci.美国，79：7415-7419，1982；Mackett等，J.Virol.49：857-864，1984；Panicali等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：4927-4931，1982)。特别有兴趣的是基于牛乳头状瘤病毒的载体，它能够复制作为超染色体因子(Sarver等，MoI.Cell.Biol.1：486，1981)。通过在质粒中包含一种可选择的标记这些载体能被用于稳定的表达，例如新的基因。替代地，逆转录病毒基因组可以修改用作一种能够引入并且指导所关心的基因在宿主细胞中表达的载体(Cone&Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6349-6353，1984)。高水平表达也可以使用可诱导的启动子，包括但不限于，金属硫蛋白HA启动子和热休克启动子来完成。
用于重组载体表达的宿主细胞还可以是酵母。可以使用包含结构的或者可诱导的启动子的大量载体。参见，例如，Brent等，分子生物学通用操作规程，John Wiley&Sons，公司(ringbou等，2003)；和酵母的分子生物学，Strathem等(eds.)，冷泉港出版(1982)。可以使用一种结构的酵母启动子例如ADH或者LEU2或者一种可诱导的启动子例如GAL。替代地，可以使用载体促进外来脱氧核糖核酸序列整合进入到酵母染色体中。
如果使用植物表达载体，所关心的的基因的表达可以由大量启动子的任何一个来推动。例如，可以使用病毒启动子例如CaMV的35S核糖核酸和19S核糖核酸启动子(Brisson等，自然310-511-514，1984)或者烟草花叶病毒的外壳蛋白启动子(Takamatsu等，EMBO J.，6：307311，1987)。替代地，可以使用植物启动子例如RUBISCO的小亚基(Coruzzi等，EMBO J.3：16711680，1984；和Broglie等，科学224：838-843，1984)或者热休克启动子(Gurley等，MoI.Cell.Biol.，6：559-565，1986)。
可用于带有重组载体的所关心的蛋白质的表达的一种替代的表达体系是昆虫体系。在这样的一种体系中，苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)被用作一种表达外来基因的载体。该病毒生长在草地贪夜蛾细胞中。绑定多肽编码序列的核苷酸-锌指可以克隆进该病毒的不重要的区域并且置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子))的控制之下。绑定多肽编码序列的核苷酸-锌指的成功插入将引起多角体蛋白基因的失活和非封闭的重组病毒(也就是，通过多角体蛋白基因用于编码缺乏蛋白质外衣的病毒)的产生。然后这些重组病毒用于感染细胞，在这些细胞中，插入基因得到表达。参见，例如，Smith等J.Biol.46：584，1983；和Smith，美国专利号4,215,051)。
一旦重组载体被引入合适的宿主细胞，表达的重组蛋白质可以按照常用方法例如抽提，沉淀，色谱法，亲和层析，电泳等等来纯化。使用正确的方法既取决于产生的特殊蛋白质又取决于利用的特殊的表达体系。对于长期的，高产率的重组蛋白质，稳定的表达是优选的。胜于使用包含复制起点的载体，宿主细胞可以转化带有允许稳定的整合载体进入宿主染色体的载体。带有稳定地整合的编码所关心的蛋白质的多聚核苷酸的宿主细胞可以逐渐形成中心，该中心可以依次克隆并且扩大为细胞系。例如，随着外来脱氧核糖核酸的进入设计的细胞可以允许在一种增菌培养基中生长1-2日，然后转到一种选择培养基中。
V.治疗的应用
进一步地提供了载体体系，这些载体体系可以用于各种各样的治疗的应用。例如，用于蛋白质的治疗的表达的一种载体可以由上面描述的带有一种信使核糖核酸TEE或者翻译增强子多聚核苷酸和编码治疗的蛋白质的一种多聚核苷酸构成。其他的实例包含用于疫苗中的载体以便可以实现增加抗原产量。
疫苗通常可以由一种表达载体组成，在这里疫苗抗原的表达是由于一个或多个翻译增强子因子(例如，SEQ ID NOs：1-35)的存在而增强的。在一些实施方案中，脱氧核糖核酸疫苗可以传递和表达多于一个抗原。除了编码该疫苗抗原和该翻译增强子因子的序列之外，脱氧核糖核酸疫苗载体一般地也包含一种用于在真核生物的细胞中有活性的转录开始的启动子。这些脱氧核糖核酸疫苗载体可以根据本领域技术人员众所周知的方法来生成。例如，用于给定抗原的脱氧核糖核酸疫苗的制造和使用方法的描述见，例如，Gurunathan等，Ann.Rev.Immunol.，18：927，2000；Krieg，Biochim.Biophys.Acta.，1489：107，1999；Cichutek，Dev.Biol.Stand.，100：119，1999；Davis，Microbes Infect.，1：7，1999；和Leitner，疫苗，18：765，1999。
上面描述的任何载体可以用于表达脱氧核糖核酸疫苗中的一种疫苗抗原。可用于结构的脱氧核糖核酸疫苗的辅助载体可以包含病毒载体例如ALVAC(一种金丝雀痘病毒)，MVA(一种牛痘变体)，和ADV5(腺病毒5)载体，以及质粒载体例如pUC19(ATCC#_37254)，pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)，pNGVL(国家的基因载体实验室，密西根州大学，MI)，p414cyc(ATCC#_87380)，pBSL130(ATCC#_87145)，和pECV25(ATCC#_77187)。可以用于疫苗载体的启动子的实例包含，例如，SV40早期启动子，巨细胞病毒快速的早期启动子／增强子，和各种各样的在这里所描述的真核生物的启动子。
疫苗抗原的不同的系列可以由脱氧核糖核酸疫苗来表达。这些包含，例如，艾滋病病毒-I抗原，肝炎C病毒抗原，乙型肝炎病毒抗原，单纯性疱疹病毒抗原，痘病毒抗原，流感病毒抗原，麻疹病毒抗原，登革热病毒抗原，痢疾内变形虫抗原，塞姆利基森林病毒抗原，乳头状瘤病毒抗原，间日疟原虫和恶性疟原虫抗原。可以在脱氧核糖核酸疫苗中表达的抗原的补充信息可以从网址DNAvaccine.com处获得。
脱氧核糖核酸疫苗可用于使任何患者免疫以防止或者保护阻止病原体的传染(例如，艾滋病病毒传染)。这些患者包含人和非人的动物例如啮齿动物(例如老鼠，家属和豚鼠)，猪，小鸡，雪貂，非人的灵长类。本技术领域技术了脱氧核糖核酸疫苗给药到合适的患者的方法。参见，例如，Webster等，Vacc，12：14951498，1994；Bernstein等，疫苗，17：1964，1999；Huang等，ViralImmunol.，12：1，1999；Tsukamoto等，病毒学257：352，1999；Sakaguchi等，疫苗，14：747，1996；Kodihalli等，J.Virol.，71：3391，1997；Donnelly等，疫苗，15：865，1997；Fuller等，疫苗，15：924，1997；Fuller等，免疫细胞生物学，75：389，1997；Le等，疫苗，18：1893，2000；Boyer等，J.Infect.Dis.，181：476，2000。
除了增强通过使用在这里所描述的特殊的TEE或者信使核糖核酸翻译增强子多聚核苷酸的疫苗抗原的表达之外，脱氧核糖核酸疫苗还可以用带有一种辅助的合适的辅料配制，可以使用的辅料包含，例如，磷酸铝或者铝羟基磷酸物，单磷酰基-脂质体A，QS-21皂角苷，地塞米松，CpG脱氧核糖核酸序列，霍乱毒素，细胞因子或者趋化因子。这些辅料增强脱氧核糖核酸疫苗的免疫原性。制备这些改进的脱氧核糖核酸疫苗的方法是本领域技术人员已知的。参见，例如，Ulmer e／α／.，疫苗18：18，2000；Schneerson等，J.Immunol.147：2136-2140，1991；Sasaki等，Immunol.65：3520-3528，1997；Lodmell等，疫苗，18：10591066，2000；Sasali等，J.Virol.72：4931，1998；Malone等，J.Biol.Chem.269：29903，1994；Davis等，J.Immunol.15：870，1998；Xin等，临床免疫，92：90，1999；Agren等，免疫细胞生物学76：280，1998；和Hayashi等，疫苗，18：3097-3105，2000。
在一些实施方案中，提供了用于增强治疗各种各样的疾病的治疗的蛋白质的表达的方法。在这些方法中，怀有翻译增强子因子或者多聚核苷酸并且表达治疗的蛋白质的表达载体通过载体和靶细胞的相互作用，体外或者体内转染进入靶细胞。组合物以一足够量给药患者使得患者体内引起治疗性的响应。在大量的文献中这些基因治疗方法已经用于矫正获得和继承遗传缺陷，癌，和病毒感染。参见，例如，Anderson，科学256：808-813，1992；Nabel&Feigner，TIBTECH11：211-217，1993；Mitani&Caskey，TIBTECH11：162-166，1993；Mulligan，科学926-932，1993；Dillon，TIBTECH11：167-175，1993；Miller，自然357：455-460，1992；Van Brunt，生物技术6：1149-1154，1998；Vigne等，Restorative Neurol，和Neurosci.8：35-36，1995；Kremer&Perricaudet，Br.Med.Bull.51：31-44，1995；Haddada等，微生物学和免疫学中现行主题(Doerfler&Bohm eds.，1995)；和Yu等，基因治疗1：13-26，1994。
在这里所描述的治疗的方法适合于治疗各种各样的疾病和病症。这些包含各种各样的器官系统的恶性肿瘤，例如，肺，胸部，淋巴的，胃肠的，和生殖-泌尿道。也适合于治疗腺癌，包含恶性肿瘤例如大多数结肠癌，肾细胞癌，前列腺癌，肺的非小细胞癌，小肠的癌瘤，和食道癌。包含在这里所公开的一种信使核糖核酸TEE或者翻译增强子多聚核苷酸的重组表达载体对治疗非恶性的细胞-增生疾病例如牛皮癣，寻常天疱疮，白塞氏综合征，和类脂组织细胞增多病也是有用的。实质上，任何用治疗的蛋白质可以治疗或者改善的任何病症被认为是对用表达载体治疗敏感的，该表达载体由于载体中翻译增强子因子的存在而在增多的水平上表达该治疗的蛋白质。
大量传送方法可用于在这里所描述的实践治疗的方法。这些方法对本领域技术人员是众所周知的。非病毒载体传送系统包含脱氧核糖核酸质粒，裸露的核苷酸，和带有一种运载工具例如脂质体的核苷酸复合物。病毒载体传送系统包含脱氧核糖核酸和核糖核酸病毒，它在传送给细胞后有游离基因或者整合基因组。核苷酸的非病毒传递方法包含脂质体转染，微量注射，基因枪方法，病毒颗粒，脂质体，免疫脂质体，聚阳离子或者脂：酸共轭物，裸露的脱氧核糖核酸，人工的病毒粒子，和DNA的增强吸收药剂。脂质体转染的描述见，例如，美国专利号5,049，386，美国专利号4,946,787；和美国专利号4，897，355并且脂质体转染试剂是商业上销售的(例如，Transfectam和Lipofectin)。适合于多聚核苷酸的有效的受体识别脂转染的阳离子的和中性类脂包含那些，例如，WO91／17424和WO91／16024中所描述的。可以传送到细胞(体外给药)或者靶组织(体内给药)。
在许多基因治疗应用中，需要基因治疗载体高度专一的传送到一种特定的组织类型。一般地病毒载体通过病毒外表面上的病毒外壳蛋白表达配位体成为融合蛋白质的方式改进以对给定的细胞有专一性。选择的配位体对所关心的细胞上存在的已知的受体是有亲和力的。例如，Han等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92：9747-9751，1995)报道说莫洛尼鼠科的白血病毒可以改进来表达人heregulin融合到gp70，并且该重组病毒感染某些表达人表皮生长因子受体的人乳癌细胞。这个原则可以延至其他的表达一种配位体融合蛋白质的病毒对和表达一种受体的靶细胞。例如，丝状的噬菌体可以设计来显示抗体片段(例如，FAB或者Fv)，这些抗体片段对于任何选择的细胞的受体实际上有特殊的绑定亲合力。尽管上面描述的申请首要对于病毒载体，相同原则可以被用于非病毒载体。这些载体可以被设计包含那些认为有利于特定的靶细胞吸收的特殊的吸收序列。
表达载体通过给个体患者给药传送到体内，一般地通过系统的给药(例如，静脉内的，腹膜内的，肌肉的，皮下的，或者颅内的输注)或者局部施用，如下所述。替代地，载体可以体外传送给细胞，例如自个体患者的细胞外植体(例如，淋巴细胞，骨髓抽出物，组织切片)或者万能供血者造血干细胞，然后通常在选择并入载体的细胞后将该细胞植入到患者体内。对于诊断，研究，或者对于基因治疗(例如，通过转染的细胞再输注进入宿主生物体)的体外细胞转染对本领域那些熟练的技术人员是众所周知的。在一种实施方案中，细胞可以从患者体内分离，用核苷酸(基因或者互补DNA)转染，并且再注回到患者体内(例如患者)。适合于体外转染的各种各样的细胞类型是本领域技术人员所熟知的(参见，例如，Freshney等，动物细胞培养，一种基本技术指南(第三版，1994)和为了评述怎样分离和培养来自患者的细胞在这里列举的对照)。
实施例
提供下列实施例作为进一步阐述，但并不限制其范围。其他的变形对于本发明所属领域普通技术人员来讲是显而易见的并且包括在本发明所附的权利要求保护的范围内。
实施例1识别翻译增强子的正反馈载体体系
TEE的识别包括一种双重的单作用子正反馈载体的使用：一种是编码Ga14VP16转录因子的顺反子，另一种是编码Renilla荧光素酶的顺反子。两种顺反子包含带有4拷贝的上游活化序列(UAS)的一种最小的启动子，这种启动子当绑定到Ga14VP16上增强了转录。当被引入细胞时，该最小的启动子驱使信使核糖核酸和编码蛋白质极低的水平。那些可以增强翻译进入Ga14VP16顺反子的5′引物的序列驱使Ga14VP16信使核糖核酸的翻译。然后Ga14VP16蛋白质可以绑定这两种启动子增强转录，驱使它自己的转录和在两个基因的启动子中通过特异的结合部位的另一个顺反子的转录从而开始正反馈环路。TEE从随机的核苷酸序列库中被识别。在一种实施方案中，仅仅使用编码增强的GFP(EGFP)的顺反子并且改善信噪比允许每个转染的细胞的单个库质粒的分离。确认包括在正反馈体系和非放大载体体系两者中的试验。
图表1阐述了一种示意图，代表了翻译增强正反馈载体以及不同的启动子(PI)和转录增强子(P2)、转录因子(TF)基因和所关心的蛋白。转录因子基因和所关心的基因可以在相同的或者不同的质粒上。对于选定区域的应用，一种随机的核苷酸序列(N)，n个核苷酸长度，存在于转录因子信使核糖核酸的5′引物中。起翻译增强子因子(TEE)作用的序列将便于这个信使核糖核酸的翻译。然后编码的转录因子将绑定到两个基因的启动子中的位点并且增强它们的转录。在一种具体实施方案中，该构造表达两个信使核糖核酸：一个编码所关心的蛋白质，它可以是一种报道的蛋白质；另一个编码一种转录因子。两个信使核糖核酸的转录都是通过最小的启动子驱动的但可以通过经由位于两个基因的启动子中的转录因子的结合部位的转录因子的表达来增强。少量转录因子信使核糖核酸由最小的启动子表达但是这个信使核糖核酸的翻译被编码转录因子的信使核糖核酸的5′引物中的障碍所阻断。这个障碍可以是一种稳定的茎-圈结构和／或上游AUG起始密码子。这些转录因子的合成取决于编码这个因子的信使核糖核酸中翻译增强子的存在。
图2阐述了翻译增强子驱使的正反馈载体与一种第三蛋白阻碍宿主蛋白质合成。开头两个基因(转录因子基因和所关心的基因)除了所有三种信使核糖核酸包含在它们的5′引物中包含一种球座之外与图1中的是相同的。通过阻断宿主信使核糖核酸翻译并且减少与它们的竞争第三蛋白质(例如，轮状病毒NSP3蛋白质)将增强开头两个编码的信使核糖核酸的翻译。第三基因在启动子P3的转录控制之下，启动子P3是一种结构的启动子或者一种可诱导的启动子。P3也可以包含启动子因子P1和P2。对于选定区域的应用，对于所关心的基因的信使核糖核酸和第三蛋白质将包含一种已知的TEE，同时该转录因子基因将包含一种随机的核苷酸序列。在这个方案中，TEE抵抗第三蛋白质的活性。对于一种蛋白质生产应用，所有三个基因可以包含一种已知的抵抗第三蛋白质活性的TEE。该三个基因可以在一个，两个，或者三个不同的质粒上。
使用正反馈体系来识别TEE的更详细的步骤在前面已经描述过，例如，PCT出版物WO2007／025008。
实施例2一致的翻译增强子模体的识别
使用如上所述的一种双重的单作用子正反馈载体系统，那些在中国仓鼠卵巢(CHO)及其他细胞系，包含BHK(小型的仓鼠肾)细胞中起翻译增强子作用许多短的核苷酸序列被识别。这些翻译增强子因子(TEE)长度范围在七个到十二个不等。如图3所示，这些TEE的多拷贝在CHO细胞中增强了蛋白质产量直到25倍。在每一个实施例中，在荧光虫荧光素酶顺反子的5′引物中至少有5个相同的TEE连接的拷贝。第一个结构是不包含TEE的大小对比对照。结构被短暂地转染的进CHO细胞并且在2日后试验。翻译效率涉及大小对比对照结构的活性。在图3中，顶端13条信号号分别低于相应的对照条信号的由13个不同的TEE的5个拷贝得到的结果。其次的两个条信号显示了5个或者15个拷贝的另一个TEE的翻译增强活性。底下的条信号阐明了当使用5-25个拷贝时又一个TEE序列的翻译增强活性。
这些TEE的几个显示了序列相似性，并且被公认的一致的模体由这些TEE来识别(参见图4)。TEE模体的两个实施方案的序列如下：RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO：1)，和MSCSGCNGMWA(SEQ ID NO：2)。注意到在这些序列中，R表示A或者G，M表示A或者C，S表示G或者C，W表示A或者U，以及N表示A，G，C或者U。
在另一个实施方案中，模体Ia序列是模体1是R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO：3)。在这一序列中，R1是缺失，如果存在的话，是A或者G；N1是缺失，如果存在的话，是A、C或者G，优选是A、C、或者G；S1是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是C或者G；M1是A或者C；R2是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C；R3是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失。在另一个实施方案中，模体1是R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ IDNO：3)，其中R1、R3、R4是缺失，N1是A、C或者G；S1是C或者G；M1是A或者C；R2是A或者G并且M2是A或者C。
在另一个实施方案中，模体2a序列R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO：4)。在此序列中，R5是缺失，如果存在的话，是A，优选是缺失；M3是缺失，如果存在的话，是C或者A，优选是C或者A；S2是缺失，如果存在的话，是C或者G，优选是C或者G；S3是G或者C；N2是G、C或者T；M4是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A或者T；R6是缺失，如果存在的话是A。在另一个实施方案中，模体2是R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO：4)。在此序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的话是A或者C；S2是C或者G；S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T；M2是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A。
实施例3合成的信使核糖核酸翻译增强子因子的活性
基于上述注释的一致模体，合成大略相当于模体1和2的各种各样的特异的TEE序列并且试验翻译增强活性(参见表格1的SEQ ID NO：5-35)。包含试验序列的脱氧核糖核酸片段由两个重叠，互补的寡聚核苷酸彼此合成以及退火后生成。退火的寡聚核苷酸在每个末端有未配对的核苷酸，它对使用EcoR1以及BamH1.克隆进载体提供了粘末端。该片段在如实施例1中所述的正反馈表达载体中被克隆进荧光素酶报道基因信使核糖核酸的5′引物。包含模体序列的Renilla荧光素酶结构然后短暂地转染进CHO细胞。3日后对细胞试验这些测试序列增强翻译的能力。一种对比对照(对照)质粒在克隆区域中包含polyA。报道基因多肽的翻译效率上TEE的效果如图5所示。
结果表明一致的模体是可预计相当于这些的模体的一个的一种TEE的翻译增强活性的。也如同该图中显示的，基于模体1的TEE序列比那些基于模体2的TEE序列往往引起更高的增强翻译水平。
表1相当于一致的模体1(M1)和2(M2)
在这里所描述的新的翻译增强子可以有各种各样的实际的和工业的应用。例如，他们可以最小化与工业规模培养有关的成本并且减少药剂成本。较高的蛋白质浓度还可以便于蛋白质提纯。另外，这些翻译增强子增强子可以实现那些由于弱的蛋白质表达而不可能的过程，例如从一种脱氧核糖核酸疫苗中表达足够的抗原来产生一种免疫反应。这些可用于显著地提高哺乳动物细胞中特殊蛋白质的产率。例如，许多治疗的蛋白质在CHO细胞中被表达以确保正确的翻译后过程，CHO细胞是最常使用的用于大规模生产治疗的蛋白质。除工业的蛋白质生产之外，翻译增强子在各种各样的载体体系中有潜在的使用。例如，为了研究目的，蛋白质治疗的表达，和脱氧核糖核酸疫苗，为了增强抗原产量。
尽管本发明说明书包含了具体实施方案并参照其优选的实施方案进行了描述，但这些并不应被认为是本发明要求保护的范围或者任意可以要求保护的范围的限制，这只是对特定实施方案特点的描述。本发明所属领域普通技术人员可以理解，在不脱离这里描述的本发明的意思的情况下，在形式和细节上，本发明可以存在多种变化。在本发明说明书中描述的某些特点以及相互独立的实施方案还可以被结合到一个实施方案中。反之，单一实施方案所具有的各种特点可以分别被结合在多个实施方案中或者结合在任意合适的子结合中。此外，尽管上面描述的特点以结合的方式发挥作用或者最初以结合的方式要求保护，但在某些情况下，可以从这种要求保护的结合中删除一种或一种以上特点，并且要求保护的结合可以包括一种亚结合或者亚结合的变体。本发明的范围被随后的权利要求书定义。
在说明书中引用的所有的出版物、数据库、GenBank序列、专利和专利申请通过引证在此全部并入本文，如同其中每个都被分别地特定的显示通过引证并入本文。

Claims (23)

1.一种分离的多核苷酸序列包含至少一种信使核糖核酸翻译增强因子(TEE)，在这里TEE由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO：3)或者R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO：4)、或者其基本上相同的序列组成，其中，R1是缺失，如果存在的话，是A或者G；N1是缺失，如果存在的话，是A、C或者G，优选是A、C、或者G；S1是缺失，如果存在的话是C或者G，优选是C或者G；M1是A或者C；R2是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是A或者G，并且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的话，是A或者C，优选是A或者C；R3是缺失，如果存在的话，是A或者G，优选是缺失；R4是缺失，如果存在的话，是C，优选是缺失；并且，R5是缺失，如果存在的话，是A，优选是缺失；M3是缺失，如果存在的话，是C或者A，优选是C或者A；S2是缺失，如果存在的话，是C或者G，优选是C或者G；S3是G或者C；N2是G、C或者T；M4是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A或者T；R6是缺失，如果存在的话是A。
2.根据权利要求1的分离的多聚核苷酸序列，在这里TEE由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4组成。在这里R1，R3和R4是缺失的；N1是A，C或G；S1是C或者G；M1是A或者C；R2是A或者G并且M2是A或者C。
3.根据权利要求1的分离的多聚核苷酸序列，在这里TEE由R5M3S2CS3GCN2GM4WR6组成，在这里R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的话是A或者C；S2是C或者G；S3是C或者G并且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T；M2是A或者C；W是缺失，如果存在的话是A。
4.根据权利要求1，2或者3中任意一项的分离的多聚核苷酸序列，在这里翻译增强因子(TEE)具有的序列与SEQ ID NO：5-35组成的序列群中选择的一个序列有至少90％的一致性。
5.根据权利要求1，2或者3中任意一项的分离的多聚核苷酸序列，在这里翻译增强因子(TEE)具有的序列与从SEQ IDNO：5-35组成的序列群中选择的一个序列相同。
6.根据权利要求1，2或者3中任意一项的分离的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少2个拷贝。
7.根据权利要求1，2或者3中任意一项的分离的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少5个拷贝。
8.根据权利要求1，2或者3中任意一项的分离的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少10个拷贝。
9.用于在真核细胞中重组表达多肽的载体，这种载体包括一种真核启动子，这种真核启动子与一种多聚核苷酸序列可操作的相连，所述聚核苷酸序列包括至少一个这里公开的mRNA翻译增强因子(TEE)，在这里TEE是从权利要求1，2或者3的TEE中选择的。
10.根据权利要求9的载体，在这里信使核糖核酸增强因子组成的序列与从SEQ ID NO：5-35组成的序列群中选择的一个序列实际上是相同的。
11.根据权利要求9的载体，在这里信使核糖核酸增强因子组成的序列与从SEQ ID NO：5-35组成的序列群中选择的一个序列是相同的。
12.根据权利要求9的载体，在这里信使核糖核酸增强因子位于3’引物端并且适合定向连接编码所关心的多肽的第二段多聚核苷酸序列。
13.根据权利要求9的载体，进一步包含编码所关心的多肽的第二段多聚核苷酸序列，这个多聚核苷酸序列可操作地连接到信使核糖核酸增强因子。
14.根据权利要求9的载体，在这里信使核糖核酸增强因子位于第二段多聚核苷酸序列的5’引物序列。
15.一种DNA疫苗包含根据权利要求9的载体。
16.一种真核宿主细胞转染根据权利要求9的载体。
17.根据权利要求16的宿主细胞，在这里宿主细胞是CHO细胞。
18.用于重组的生产一种多肽的方法包含：
(i)构建一种表达载体，这种表达载体包括一种真核启动子和mRNA翻译增强因子，每个都与编码所关心多肽的聚核苷酸可操作的相连，在这里TEE是从权利要求1，2或者3的TEE中选择的。
(ii)转染表达载体计入真核宿主细胞；并且
(iii)培养转染带有表达载体的宿主细胞；从而生产多肽。
19.根据权利要求18的方法，在这里信使核糖核酸增强因子组成的序列与从SEQ ID NO：5-35组成的序列群中选择的一个序列实际上是相同的。
20.根据权利要求18的方法，在这里信使核糖核酸增强因子组成的序列与从SEQ ID NO：5-35组成的序列群中选择的一个序列是相同的。
21.根据权利要求18的方法，进一步包含纯化的重组多肽。
22.根据权利要求18的方法，在这里宿主细胞是CHO细胞。
23.根据权利要求18的方法，在这里多肽是治疗的蛋白质。
CN201410144264.4A 2007-12-11 2008-12-11 涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法 Pending CN103911378A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US744007P 2007-12-11 2007-12-11
US61/007,440 2007-12-11

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880126367.0A Division CN101939428B (zh) 2007-12-11 2008-12-11 涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103911378A true CN103911378A (zh) 2014-07-09

Family

ID=40386467

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880126367.0A Expired - Fee Related CN101939428B (zh) 2007-12-11 2008-12-11 涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法
CN201410144264.4A Pending CN103911378A (zh) 2007-12-11 2008-12-11 涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880126367.0A Expired - Fee Related CN101939428B (zh) 2007-12-11 2008-12-11 涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法

Country Status (8)

Country Link
US (2) US8785611B2 (zh)
EP (5) EP2610341B1 (zh)
JP (3) JP5474816B2 (zh)
CN (2) CN101939428B (zh)
AU (1) AU2008335723C1 (zh)
CA (2) CA2708766C (zh)
SG (4) SG10201408164XA (zh)
WO (1) WO2009075886A1 (zh)

Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130230884A1 (en) * 2010-07-16 2013-09-05 John Chaput Methods to Identify Synthetic and Natural RNA Elements that Enhance Protein Translation
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
PL3590949T3 (pl) 2010-10-01 2022-08-29 Modernatx, Inc. Kwasy rybonukleinowe zawierające n1-metylo-pseudouracyle i ich zastosowania
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
AU2012318752B2 (en) 2011-10-03 2017-08-31 Modernatx, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
LT2791160T (lt) 2011-12-16 2022-06-10 Modernatx, Inc. Modifikuotos mrnr sudėtys
AU2013243951A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2013151666A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
JP6144355B2 (ja) 2012-11-26 2017-06-07 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 化学修飾ｍＲＮＡ
EP2931319B1 (en) 2012-12-13 2019-08-21 ModernaTX, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
WO2014113089A2 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CA2923029A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3041938A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EA201690675A1 (ru) 2013-10-03 2016-08-31 Модерна Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды, кодирующие рецептор липопротеинов низкой плотности
EP3068888B1 (en) * 2013-11-12 2018-01-31 Vrije Universiteit Brussel Rna transcription vector and uses thereof
JP2017524357A (ja) 2014-07-16 2017-08-31 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． キメラポリヌクレオチド
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
EP3461904A1 (en) 2014-11-10 2019-04-03 ModernaTX, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
ES2908449T3 (es) 2015-09-17 2022-04-29 Modernatx Inc Polinucleótidos que contienen una región de cola estabilizadora
ES2969082T3 (es) 2015-09-17 2024-05-16 Modernatx Inc Compuestos y composiciones para la administración intracelular de agentes terapéuticos
EP3359670B2 (en) 2015-10-05 2024-02-14 ModernaTX, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
US20190225644A1 (en) 2015-10-16 2019-07-25 Modernatx, Inc. Mrna cap analogs and methods of mrna capping
WO2017066789A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Mrna cap analogs with modified sugar
WO2017066782A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Hydrophobic mrna cap analogs
WO2017066791A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Sugar substituted mrna cap analogs
ES2914225T3 (es) 2015-10-16 2022-06-08 Modernatx Inc Análogos de cap de ARNm con enlace de fosfato modificado
JP7114465B2 (ja) 2015-12-22 2022-08-08 モデルナティエックス インコーポレイテッド 薬剤の細胞内送達のための化合物および組成物
RS63135B1 (sr) 2015-12-23 2022-05-31 Modernatx Inc Postupci upotrebe polinukleotida koji kodiraju ox40 ligand
EP3400023A1 (en) 2016-01-10 2018-11-14 ModernaTX, Inc. Therapeutic mrnas encoding anti ctla-4 antibodies
WO2017127750A1 (en) 2016-01-22 2017-07-27 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
EP3442590A2 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
CA3024625A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding citrin for the treatment of citrullinemia type 2
SI3458083T1 (sl) 2016-05-18 2023-03-31 Modernatx, Inc. Polinukleotidi, ki kodirajo interlevkin-12 (IL12) in njihova uporaba
WO2017201342A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
MA45041A (fr) 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour la galactose-1-phosphate uridylyltransférase destinés au traitement de la galactosémie de type 1
WO2017201332A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding acyl-coa dehydrogenase, very long-chain for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
EP3458104A1 (en) 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding porphobilinogen deaminase for the treatment of acute intermittent porphyria
HUE059955T2 (hu) 2016-05-18 2023-01-28 Modernatx Inc Immunmoduláló polipeptideket kódoló MRNS-ek kombinációi és azok felhasználása
AU2017266932B2 (en) 2016-05-18 2023-04-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding alpha-galactosidase A for the treatment of Fabry disease
AU2017286606A1 (en) 2016-06-14 2018-12-13 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
WO2018089540A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
FI3596041T3 (fi) 2017-03-15 2023-01-31 Yhdiste ja koostumuksia terapeuttisten aineiden antamiseen solun sisään
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
US11485972B2 (en) 2017-05-18 2022-11-01 Modernatx, Inc. Modified messenger RNA comprising functional RNA elements
CA3063723A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (il12) polypeptides and uses thereof
US20200131498A1 (en) 2017-06-14 2020-04-30 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
US20210198200A1 (en) 2017-06-14 2021-07-01 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
WO2019036638A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. METHODS FOR PREPARING MODIFIED RNA
CN111315359A (zh) 2017-08-31 2020-06-19 摩登纳特斯有限公司 制备脂质纳米颗粒的方法
MA54676A (fr) 2018-01-29 2021-11-17 Modernatx Inc Vaccins à base d'arn contre le vrs
US20210163928A1 (en) 2018-04-11 2021-06-03 Modernatx, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements
JP7410135B2 (ja) 2018-09-19 2024-01-09 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療薬の細胞内送達のための化合物及び組成物
CN113271926A (zh) 2018-09-20 2021-08-17 摩登纳特斯有限公司 脂质纳米颗粒的制备及其施用方法
SG11202108100PA (en) 2019-01-31 2021-08-30 Modernatx Inc Methods of preparing lipid nanoparticles
JP2022523117A (ja) 2019-01-31 2022-04-21 モデルナティエックス インコーポレイテッド ボルテックスミキサならびにその関連する方法、システム、及び装置
US20220387628A1 (en) 2019-06-24 2022-12-08 Modernatx, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements and uses thereof
EP3987027A1 (en) 2019-06-24 2022-04-27 ModernaTX, Inc. Endonuclease-resistant messenger rna and uses thereof
KR20220133224A (ko) 2020-01-28 2022-10-04 모더나티엑스, 인크. 코로나바이러스 rna 백신
JP7438604B2 (ja) 2020-02-07 2024-02-27 モデルナティエックス インコーポレイテッド ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡドメインワクチン
BR112022020203A2 (pt) 2020-04-09 2022-11-22 Suzhou Abogen Biosciences Co Ltd Composição de nanopartículas lipídicas
CN113874507A (zh) 2020-04-09 2021-12-31 苏州艾博生物科技有限公司 冠状病毒的核酸疫苗
WO2021222304A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Modernatx, Inc. Sars-cov-2 rna vaccines
WO2021159130A2 (en) 2020-05-15 2021-08-12 Modernatx, Inc. Coronavirus rna vaccines and methods of use
WO2022002040A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
CN116710079A (zh) 2020-07-24 2023-09-05 斯特兰德生物科技公司 包含经修饰的核苷酸的脂质纳米颗粒
JP2023537887A (ja) 2020-08-20 2023-09-06 スージョウ・アボジェン・バイオサイエンシズ・カンパニー・リミテッド 脂質化合物及び脂質ナノ粒子組成物
EP4217371A1 (en) 2020-09-25 2023-08-02 ModernaTX, Inc. Multi-proline-substituted coronavirus spike protein vaccines
WO2022150712A1 (en) 2021-01-08 2022-07-14 Strand Therapeutics, Inc. Expression constructs and uses thereof
WO2022150717A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 Modernatx, Inc. Seasonal rna influenza virus vaccines
WO2022152141A2 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Polymer conjugated lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
WO2022152109A2 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
US20240100151A1 (en) 2021-01-15 2024-03-28 Moderna TX, Inc. Variant strain-based coronavirus vaccines
WO2022155530A1 (en) 2021-01-15 2022-07-21 Modernatx, Inc. Variant strain-based coronavirus vaccines
AU2022237382A1 (en) 2021-03-15 2023-09-28 Modernatx, Inc. Therapeutic use of sars-cov-2 mrna domain vaccines
WO2022212711A2 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Modernatx, Inc. Methods for identification and ratio determination of rna species in multivalent rna compositions
WO2022221335A1 (en) 2021-04-13 2022-10-20 Modernatx, Inc. Respiratory virus combination vaccines
AU2022258463A1 (en) 2021-04-14 2023-11-23 Modernatx, Inc. Influenza-coronavirus combination vaccines
WO2022245888A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 Modernatx, Inc. Seasonal flu rna vaccines and methods of use
CA3211623A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Bo YING Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
WO2022266389A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Modernatx, Inc. Alternative rna purification strategies
TW202321446A (zh) 2021-08-13 2023-06-01 美商現代公司 多管柱層析ｍＲＮＡ純化
AR127312A1 (es) 2021-10-08 2024-01-10 Suzhou Abogen Biosciences Co Ltd Compuestos lipídicos ycomposiciones de nanopartículas lipídicas
CN116064598B (zh) 2021-10-08 2024-03-12 苏州艾博生物科技有限公司 冠状病毒的核酸疫苗
CN118043306A (zh) 2021-10-08 2024-05-14 苏州艾博生物科技有限公司 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
WO2023069498A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Senda Biosciences, Inc. Mrna vaccine composition
WO2023076658A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Modernatx, Inc. Mass spectrometry of mrna
WO2023081311A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Modernatx, Inc. Methods of purifying dna for gene synthesis
WO2023092069A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Modernatx, Inc. Sars-cov-2 mrna domain vaccines and methods of use
WO2023096858A1 (en) 2021-11-23 2023-06-01 Senda Biosciences, Inc. A bacteria-derived lipid composition and use thereof
WO2023107999A2 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus mrna vaccines
WO2023122080A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Senda Biosciences, Inc. Compositions comprising mrna and lipid reconstructed plant messenger packs
WO2023132885A1 (en) 2022-01-04 2023-07-13 Modernatx, Inc. Methods of purifying dna for gene synthesis
WO2023137149A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Modernatx, Inc. In vitro transcription dna purification and recycling
WO2023150256A1 (en) 2022-02-03 2023-08-10 Modernatx, Inc. Continuous precipitation for mrna purification
WO2023196914A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Modernatx, Inc. Influenza nucleic acid compositions and uses thereof
WO2023201296A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Modernatx, Inc. Ribosomal engagement potency assay
WO2023212618A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 Strand Therapeutics Inc. Lipid nanoparticles comprising venezuelan equine encephalitis (vee) replicon and uses thereof
WO2023215498A2 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Modernatx, Inc. Compositions and methods for cd28 antagonism
WO2023230481A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Modernatx, Inc. Orthopoxvirus vaccines
WO2024010993A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Modernatx, Inc. Primer design for cell-free dna production
WO2024015890A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Modernatx, Inc. Norovirus mrna vaccines
WO2024026490A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Sqz Biotechnologies Company Polynucleotides encoding linked antigens and uses thereof
WO2024037578A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Composition of lipid nanoparticles
WO2024050483A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Modernatx, Inc. Variant strain-based coronavirus vaccines and uses thereof
WO2024089633A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Pfizer Inc. Rna molecules encoding rsv-f and vaccines containing them
WO2024097639A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Modernatx, Inc. Hsa-binding antibodies and binding proteins and uses thereof
WO2024097874A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 Modernatx, Inc. Chemical stability of mrna
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999024595A1 (en) * 1997-11-12 1999-05-20 The Brigham And Women's Hospital, Inc. The translation enhancer element of the human amyloid precursor protein gene
WO2000044896A1 (en) * 1999-01-26 2000-08-03 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Internal ribosome entry site (ires), vector containing same and uses thereof
WO2001055369A1 (en) * 2000-01-28 2001-08-02 The Scripps Research Institute Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
WO2007025008A2 (en) * 2005-08-24 2007-03-01 The Scripps Research Institute Translation enhancer-element dependent vector systems

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US6116184A (en) 1996-05-21 2000-09-12 Symetrix Corporation Method and apparatus for misted liquid source deposition of thin film with reduced mist particle size
WO1998037189A1 (en) * 1997-02-25 1998-08-27 Qbi Enterprises Ltd. Ires sequences with high translational efficiency and expression vectors containing the sequence
US6197502B1 (en) 1997-11-17 2001-03-06 Cytos Biotechnology Ag Expression cloning processes for the discovery characterization, and isolation of genes encoding polypeptides with a predetermined property
WO2001071036A2 (en) * 2000-03-17 2001-09-27 Gene Logic, Inc. Methods of preparing amplified nucleic acid molecules
WO2002019968A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 University Of Maryland Biotechnology Institute Genetically engineered co-expression dna vaccines, construction methods and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999024595A1 (en) * 1997-11-12 1999-05-20 The Brigham And Women's Hospital, Inc. The translation enhancer element of the human amyloid precursor protein gene
WO2000044896A1 (en) * 1999-01-26 2000-08-03 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Internal ribosome entry site (ires), vector containing same and uses thereof
WO2001055369A1 (en) * 2000-01-28 2001-08-02 The Scripps Research Institute Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
WO2001055371A1 (en) * 2000-01-28 2001-08-02 The Scripps Research Institute Methods of identifying synthetic transcriptional and translational regulatory elements, and compositions relating to same
WO2007025008A2 (en) * 2005-08-24 2007-03-01 The Scripps Research Institute Translation enhancer-element dependent vector systems

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHOU WEI ET AL.: "A positive feedback vector for identification of nucleotide sequences that enhance translation", 《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE OF THE UNITED STATES OF AMERICA》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2610341B1 (en) 2014-09-17
EP2231859B1 (en) 2013-01-23
EP2527439B1 (en) 2014-03-26
SG10201408164XA (en) 2015-01-29
CA2708766A1 (en) 2009-06-18
EP2527439A2 (en) 2012-11-28
EP2584038A1 (en) 2013-04-24
US20090226470A1 (en) 2009-09-10
EP2231859A1 (en) 2010-09-29
SG10201408162PA (en) 2015-01-29
EP2610341A1 (en) 2013-07-03
CA2708766C (en) 2016-02-02
JP2011505831A (ja) 2011-03-03
CA2904904A1 (en) 2009-06-18
EP2610340B1 (en) 2014-10-01
JP2014113163A (ja) 2014-06-26
JP2016104027A (ja) 2016-06-09
EP2610340A1 (en) 2013-07-03
AU2008335723C1 (en) 2013-05-30
WO2009075886A1 (en) 2009-06-18
US20130177581A1 (en) 2013-07-11
EP2527439A3 (en) 2012-12-05
WO2009075886A8 (en) 2010-11-11
SG10201408165WA (en) 2015-01-29
EP2584038B1 (en) 2014-06-25
JP5474816B2 (ja) 2014-04-16
JP5873511B2 (ja) 2016-03-01
CN101939428B (zh) 2014-05-07
AU2008335723A1 (en) 2009-06-18
SG188866A1 (en) 2013-04-30
US8785611B2 (en) 2014-07-22
CN101939428A (zh) 2011-01-05
AU2008335723B2 (en) 2012-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101939428B (zh) 涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法
CA2527225A1 (en) Modified recombinant vaccinia viruses and other microorganisms, uses thereof
CN107847577A (zh) 包含编码类M蛋白质的mRNA的癌症疫苗
KR20200036025A (ko) 메신저 리보핵산(mRNA)을 암호화하는 안정화된 핵산
Jiang et al. A novel Cre recombinase-mediated in vivo minicircle DNA (CRIM) vaccine provides partial protection against Newcastle disease virus
CN113559134B (zh) 一种用于肿瘤治疗的药物
CN112574997B (zh) 一种fbxw7环状rna的改构体及其在肿瘤药物和新冠疫苗中的应用
CN105316314B (zh) 一种高纯度的微环dna及其制备方法和应用
AU2013201458B2 (en) COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO mRNA TRANSLATIONAL ENHANCER ELEMENTS
EA009388B1 (ru) Векторы экспрессии и способы их применения
TWI260346B (en) Internal ribosome entry site of the labial gene for protein expression
KR102590276B1 (ko) 조직 특이적 발현을 위한 융합 프로모터 및 이의 용도
AU2014274623A1 (en) Compositions and Methods Related to mRNA Translational Enhancer Elements
WO2007061053A1 (ja) 筋肉指向性プロモーターとsv40ウイルスプロモーターの混成プロモーター及びそれを含むベクター
CN115960923A (zh) 一种包含非人种属调控元件的SARS-COV-2刺突蛋白mRNA及其构建方法与应用
CN118119714A (zh) 具有异源非结构蛋白的经修饰的甲病毒
CN116286810A (zh) 一种人源的增强mRNA表达的3′UTR及应用
WO2002002782A1 (en) Activation of gene expression in cloned eukaryotic genomic dna and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140709