WO2007061053A1 - 筋肉指向性プロモーターとsv40ウイルスプロモーターの混成プロモーター及びそれを含むベクター - Google Patents

筋肉指向性プロモーターとsv40ウイルスプロモーターの混成プロモーター及びそれを含むベクター Download PDF

Info

Publication number
WO2007061053A1
WO2007061053A1 PCT/JP2006/323452 JP2006323452W WO2007061053A1 WO 2007061053 A1 WO2007061053 A1 WO 2007061053A1 JP 2006323452 W JP2006323452 W JP 2006323452W WO 2007061053 A1 WO2007061053 A1 WO 2007061053A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
promoter
muscle
hybrid
vector
gene
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/323452
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shin Sasaki
Fumihiko Takeshita
Kenji Okuda
Keiko Takase
Original Assignee
Yokohama City University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yokohama City University filed Critical Yokohama City University
Priority to JP2007546504A priority Critical patent/JPWO2007061053A1/ja
Publication of WO2007061053A1 publication Critical patent/WO2007061053A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin

Definitions

  • the present invention relates to a hybrid promoter suitable for gene therapy for expressing a desired gene in an animal body including a human and a vector containing the same.
  • Non-patent Document 1 Skeletal muscle is an attractive target organ for experimental gene therapy because it easily expresses a transgene product that can be easily approached (Non-patent Document 1). From the experiment by Wolflfe (Non-patent Document 2), which showed that gene transfer directed at muscles is capable of expressing reporter gene expression, coagulation factor (Non-patent document 3), erythropoietin (Non-patent document 4, Non-patent literature 5), dystrophin (non-patent literature 6), hormones (non-patent literature 7), and the production of various therapeutic proteins such as enzymes that cause lysosomal storage diseases (non-patent literature 8) Until then. The results of these experiments shed new light on the treatment of congenital diseases. However, since long-lasting transgene expression has not been achieved, attempts to treat the disease have been difficult, and in most of the disease it has become necessary to replenish the missing protein throughout life. Yes.
  • CMV Cytomegalovirus
  • CMV promoter Cytomegalovirus immediate early gene promoter Z-enhancer
  • C AG promoter a synthetic promoter derived from it
  • CMV promoter Widely used as the most powerful promoter for targeted gene therapy.
  • the CMV promoter can strongly express the introduced gene in vivo, the activity of the transgene product is hardly observed within a few weeks after gene introduction in many animal experiments. In many cases, expression from the CMV promoter peaked 2 to 4 days after gene transfer, and decreased to the background level within 4 weeks (Non-patent document 11, Non-patent document 12, Non-patent document 13). ).
  • non-patent document 14 non-patent document 15; non-patent document 16
  • non-patent literature 17, non-patent literature 18 are considered to play an important role.
  • Muscle-specific promoters are antigen-presenting cells (APC ⁇ has little activity, but the CMV promoter with non-tissue-specific expression characteristics shows activity in APC (Non-patent Document 19).
  • Non-Patent Document 20 Non-Patent Document 21
  • muscle-specific promoters have a lower level of transgene expression.
  • Non-Patent Document 1 Lu, Q ⁇ ., Bou-Gharios, G. and Partridge, T.A .: Non-viral gene deliv ery in skeletal muscle: a protein factory. Gene Ther. 10 (2003) 131-42.
  • Non-Patent Document 2 Wolff, JA, Malone, RW, Williams, P., Chong, W "Acsadi, G” Jani, A. and Feigner, PL: Direct gene transfer into mouse muscle in vivo, science 247 (1990) 1465 -8.
  • Non-Patent Document 3 Chuah, M.K., Collen, D. and VandenDriessche, T .: Gene therapy for hemophilia. J. Gene Med. 3 (2001) 3-20.
  • Non-Patent Document 4 Kreiss, P., Bettan, M., Crouzet, J. and Scherman, D .: Erythropoietin secretion and physiological effect in mouse after intramuscular plasmid DNA electrot ransfer. J. Gene Med. 1 (1999) 245- 50.
  • Non-Patent Document 5 Bohl, D “Bosch, A” Cardona, A “Salvetti, A. and Heard, JM: Impr ovement of erythropoiesis in beta—thalassemic mice by continuous erythropoietin del ivery from muscle. Blood 95 (2000) 2793— 8.
  • Non-Patent Document 6 Chamberlain, J.S .: Gene therapy of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 11 (2002) 2355-62.
  • Non-Patent Document 7 MacColl, G.S., Goldspink, G. and Bouloux, P.M .: Using skeletal muse le as an artificial endocrine tissue. J. Endocrinol. 162 (1999) 1-9.
  • Non-Patent Document 8 Cheng, SH and Smith, AE: Gene therapy progress and prospects: gene therapy of lysosomal storage disorders. Gene Ther. 10 (2003) 1275—81.
  • Non-Patent Document 9 Boshart, M., Weber, F., Jahn, G., Dorsch- Hasler, Tsuji, Fleckenstein, B. and Schaffher, W .: A very strong enhancer is located upstream of an immediate e arly gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (1985) 521-30.
  • Non-Patent Document 12 Payette, P.J “Weeratna, R.D., McCluskie, M.J. and Davis, H.L .: Im mune— mediated destruction of transfected myocytes following DNA vaccination occu rs via multiple mechanisms. Gene Ther. 8 (2001) 1395-400.
  • Non-Patent Document 13 Gronevik, E “von Steyern, FV, Kalhovde, JM, Tjelle, TE and M at hies en, I .: Gene expression ana immune response kinetics using electroporation— m ediated DNA delivery to muscle. J. Gene Med 7 (2005) 218-27.
  • Non-Patent Document 14 Qin, L., Ding, ⁇ ⁇ , Pahud, DR, Chang, ⁇ ⁇ , Imperiale, MJ and Brom berg, JS: Promoter attenuation in gene therapy: interferon—gamma and tumor necrosis factor-alpha inhibit Hum. Gene Ther. 8 (1997) 2019-29.
  • Non-Patent Document 15 Chen, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , He, CY, Meuse, and Kay, MA: Silencing of episomal trans gene expression by plasmid bacterial DNA elements in vivo. Gene Ther. 11 (2004) 856-64.
  • Non-Patent Document 17 Payette, PJ "Weeratna, RD, McCluskie, MJ and Davis, HL: Im mune— mediated destruction of transfected myocytes following DNA vaccination occu rs via multiple mechanisms. Gene Ther. 8 (2001) 1395—400.
  • Patent Literature 18 Ghazizadeh, S., Kalish, RS and Taichman, LB: Immune-mediated loss of transgene expression in skin: implications for cutaneous gene therapy. [See com mment]. Mol. Ther. 7 (2003) 296-303 .
  • Non-Patent Document 19 Weeratna, RD, Wu, T "Efler, SM, Zhang, L. and Davis, HL: De signing gene therapy vectors: avoiding immune responses by using tissue-specific promoters. Gene Ther. 8 (2001) 1872-8.
  • Non-Patent Document 20 Dunant, P., Larochelle, N., Thirion, C, Stucka, R., Ursu, D., Petrof, BJ, Wolf, E. and Lochmuller, H .: Expression of dystrophin driven by the 1.35 — Kb MCK promoter ameliorates muscular dystrophy in fast, but not in slow muscles of tr ansgenic mdx mice. Mol. Ther. 8 (2003) 80—9.
  • Non-Patent Document 21 Yoshimura, M., Sakamoto, M., Ikemoto, M., Mochizuki, Y., Yuasa, K., Miyagoe— SUZUKI, Y. and Takeda, S.: AAV vector-mediated microdystrophin expr ession in a relatively small percentage of mdx myofibers improved the mdx phenotyp e. Mol.Ther. 10 (2004) 821—8.
  • Non-Patent Document 22 Ross, TM, Xu, Y., Bright, RA and Robinson, HI .: C3d enhancement of antibodies to hemagglutinin accelerates protection against influenza virus challenge. Nat. Immunol. 1 (2000) 127-31.
  • Non-Patent Document 23 Donoviel, DB, Shield, MA, Buskin, JN, Haugen, HS, Clegg, CH and Hauschka, SD: Analysis of muscle creatine kinase gene regulatory elements in skeletal and cardiac muscles of transgenic mice.Mol. Cell. Biol. 16 (1996) 1649- 58.
  • Non-Patent Document 24 Wang, M., Orsini, C, Casanova, D "Millan, JL, Mahfoudi, A. and Thuillier, V .: MUSEAP, a novel reporter gene for the study of long-term gene expre ssion in immunocompetent mice. Gene 279 (2001) 99-108.
  • Non-Patent Document 25 Trask, R. V., J. C. Koster, M. E. Ritchie, and J. J. Billadello. 1992.
  • the human M creatine kinase gene enhancer contains multiple functional interacting domains. Nucleic Acids Research 20: 2313-20.
  • Non-Patent Document 26 Trask, R. V "AW Strauss, and JJ Billadello. 1988. Development al regulation and tissue-specific expression of the human muscle creatine kinase gen e. Journal of Biological Chemistry 263: 17142—9
  • Non-Patent Document 27 Li, ZL, and D. Paulin. 1991. High level desmin expression depend s on a muscle-specific enhancer. Journal of Biological Chemistry 266: 6562-70
  • Non-Patent Document 28 Gao, J., Z. Li, and D. Paulin. 1998. A novel site, Mt, in the human d esmin enhancer is necessary for maximal expression in skeletal muscle.Journal of Biological Chemistry 273: 6402-9
  • the object of the present invention is to introduce the promoter and the downstream transgene into the animal muscle as compared with the case where a tissue non-specific promoter or a muscle-specific promoter is used. It is to provide a novel promoter capable of maintaining the activity of the transgene product for a long period of time after gene introduction.
  • the inventors of the present application have linked the SV40 (simian virus 40) promoter to the muscle creatine kinase promoter, which is a muscle-directed promoter, to thereby promote the promoter activity of the promoter in muscle cells.
  • S which is higher than the muscle-directed promoter but lower in promoter activity in antigen-presenting cells than a non-tissue-specific promoter.
  • the present invention relates to a muscle-directed promoter and a hybrid promoter in which the SV40 promoter is linked, or a muscle-directed promoter, and the SV40 promoter in which deletion, substitution and Z or insertion has occurred in a part of the SV40 promoter.
  • a hybrid promoter obtained by linking a promoter derived from a hybrid promoter, which exhibits higher transcriptional activity in muscle cells than the muscle-directed promoter.
  • the present invention also provides: A vector comprising the hybrid promoter of the present invention is provided.
  • the present invention provides a vector comprising the hybrid promoter of the present invention, and a structural gene encoding a desired polypeptide, which is located downstream of the hybrid promoter and whose expression is controlled by the hybrid promoter. provide. Furthermore, the present invention provides a method for in vivo production or gene therapy of the polypeptide, which comprises introducing the vector of the present invention into an animal and producing the desired polypeptide in the animal. Furthermore, the present invention provides the use of the above-described vector of the present invention for producing a drug for in vivo production of a polypeptide or a drug for gene therapy.
  • the introduction into the animal body is greater than when a cell non-specific promoter or a muscle-directed promoter is used.
  • a promoter capable of maintaining the activity of a gene product for a long period of time after gene transfer was provided.
  • the hybrid promoter of the present invention is used as a promoter for a vector for gene transfer and gene transfer is carried out targeting muscle cells, the expression level of the transgene in the muscle cells is determined by the muscle-directed promoter alone. It becomes higher than the case of using.
  • the expression level of the transgene in the antigen-presenting cell is lower than when a cell-nonspecific promoter is used alone.
  • the activity of the transgene product in the animal body can be maintained higher than in the case of using a muscle-oriented promoter or a non-cell-specific promoter even after a long period of time has elapsed after gene introduction. Therefore, the hybrid promoter of the present invention is considered to greatly contribute to gene therapy in which a foreign gene is introduced into an animal body and expressed.
  • FIG. 1 shows schematic diagrams of the structures of various promoters characterized in the examples of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing luciferase expression levels in various cultured cells by CMV promoter and SV40 promoter.
  • FIG. 3 is a graph showing measurement results of luciferase expression levels in various cultured cells using CMV, MCK, and MCK / SV40 hybrid promoters.
  • FIG.4 The SEAP expression plasmid was introduced into the muscle by the Elect Mouth Position method. It is a figure which shows a time-dependent change of the blood SEAP activity of a mouse
  • FIG. 5 is a graph showing changes over time in blood SEAP activity when various promoters are used.
  • FIG. 7 is a graph showing the time course of plasma SEAP activity when mouse SEAP is transfected into mouse muscle or liver.
  • the promoter of the present invention is a hybrid promoter obtained by linking the SV40 promoter to a muscle-directed promoter. It is important that what is linked to the muscle-directed promoter is the SV40 promoter, and as specifically shown in the examples below, the muscle-directed promoter includes a cytomegalovirus (hereinafter referred to as cell non-specific promoter). The effect of the present invention cannot be obtained when a promoter or the ⁇ -actin promoter, which is a component of the CAG promoter, is linked.
  • the SV40 promoter itself is well known and an expression vector containing the SV40 promoter is commercially available, it can be cut out from a commercially available vector with a restriction enzyme and used.
  • the nucleotide sequence of the SV 40 promoter is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • modified promoters in which a part of the promoter base sequence is changed are known, and modified promoters of the SV40 promoter are also known.
  • SV40 promoter-derived promoter a promoter in which deletion, substitution, and selection or insertion occurs in a part of the natural SV40 promoter (SEQ ID NO: 1) (referred to as “SV40 promoter-derived promoter” in the present invention)
  • SV40 promoter-derived promoter Those that exhibit higher promoter activity than muscle creatine kinase promoter in muscle cells when combined with a muscle-directed promoter to form a hybrid promoter can also be used in the present invention.
  • Such a SV40 promoter-derived promoter preferably has 90% or more, more preferably 95% or more homology with the SV40 promoter base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the homology of the base sequence is Align both base sequences so that both bases match as much as possible (insert a gap if necessary), and set the number of mismatched bases to the total number of bases (if the number of bases in both sequences is different) The total number of bases in the shorter and shorter sequences) is expressed as a percentage.
  • the length of the SV40 promoter-derived promoter is shorter than the length of the SV40 promoter shown in SEQ ID NO: 1, the length is 90% or more of the length of the SV40 promoter shown in SEQ ID NO: 1. More preferably, it is 95% or more.
  • the number of substitutions, deletions, and Z or insertions relative to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably one or several.
  • the muscle-directed promoter included in the hybrid promoter of the present invention is a promoter that exhibits transcriptional activity in muscle cells but does not substantially exhibit transcriptional activity in antigen-presenting cells. It may be a promoter or a promoter modified from a natural promoter.
  • the term “substantially does not exhibit” means a promoter that does not exhibit its force at all, but does not exert its effect at all, but is weak enough to not impair the effects of the present invention (preferably not more than 3 times the background).
  • Examples of the muscle-directed promoter include muscle creatinine kinase (hereinafter sometimes referred to as “MCK”) promoter, desmin promoter (Non-patent Documents 27 and 28, GenBank Accession No. M63391), and the like.
  • the MCK promoter is preferred.
  • the MCK promoter itself is known.
  • the term “MCK promoter” is used to include the enhancer region.
  • the base sequence of the mouse MCK promoter used in the following examples is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence of the human MCK promoter is shown in SEQ ID NO: 4 (Non-patent Document 25, Non-patent Document 26, GenBank Accession No. M21487 J04435) o
  • SEQ ID NO: 2 the first base to the 208th position
  • the region of the base (hereinafter, the first base group may be indicated as “lnt”, for example) is the enhancer region, and the region from 995 nt to 1023 nt is the E-box region.
  • the region from 1689 nt to 1986 nt is a cis element region including an enhancer region
  • the region from 1736 nt to 1789 nt is a MyoD region.
  • the muscle-directed promoter the above-mentioned natural muscle-directed promoter can be preferably used.
  • the SV40 promoter or the SV40 promoter-derived promoter can be used.
  • a promoter with deletions, substitutions, and Z or insertions in part of it. Can be used. That is, in the case of the MCK promoter, the natural MCK promoter shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 can be used preferably.
  • the hybrid promoter linked to the SV40 promoter or the SV40 promoter-derived promoter is a natural MCK promoter in muscle cells.
  • the promoter activity is higher than that of the promoter alone, a promoter in which a deletion, substitution and Z or insertion has occurred in a part of the promoter (in the present invention, the “muscle creatinine kinase (MCK) promoter-derived promoter Can be used).
  • MCK muscle creatinine kinase
  • the above-described enzyme region or, in the case of humans, the cis-element region including the enzyme region is important for muscle-directed expression. Therefore, the enhancer region or, in the case of humans, the cis-element region should be the same as that of the natural MCK promoter or the cis-element region, or have 90% or more, more preferably 95% or more homology. Is preferred.
  • the enzyme region or cis-element region preferably has 1 to several bases for substitution, deletion and Z or insertion relative to the natural base sequence.
  • the promoter activity is exhibited only with the above-mentioned cis element region (Non-patent Document 25).
  • Non-patent Document 25 Non-patent Document 25
  • it can be used as a muscle-directed promoter.
  • the MyoD region described above is particularly important, and this region preferably has the same or a homology of 95% or more with the natural MyoD region.
  • proximal E-box region in addition to the enhancer region, and the proximal E-box region is preferably the same as or more than 90% of the proximal E-box region of the natural MCK promoter. More preferably, it has a homology of 95% or more.
  • the proximal E-box region has one or more bases of substitution, deletion and Z or insertion relative to the natural base sequence, and preferably several. In the case of the above-mentioned! /, Shift regions, if the length is shorter than the natural product, the length is preferably 90% or more of the natural product, and more preferably 95% or more.
  • the region other than the cis-element region is in the following examples, which are not so important, in the case of using the mouse MCK promoter shown in SEQ ID NO: 2 with a deletion of 494 bases after 766 nt and a deletion of 116 bases after 1144 nt
  • the effect of the present invention is also obtained. Therefore, in the case of the mouse MCK promoter, the effect of the present invention can be obtained if at least 5% of the promoter region is 60%. If the homology with the natural promoter in the 60% region on the 5 'side is 90% or more, more preferably 95% or more, the length is shorter than the natural product, the length is More than 90% is preferred, and more than 95% is preferred.
  • Non-Patent Document 25 90% or more, preferably 95% or more, and regions that exhibit promoter activity in muscle cells are not necessarily required at both ends. It can be any area that does not interfere.
  • the muscle-directed promoter and the SV40 promoter may be linked directly or via a spacer.
  • the size of the spacer is not particularly limited. Usually, it is 100 bases or less, preferably 50 bases or less.
  • both promoters are linked via a 15-base region derived from the multicloning site of a commercially available vector from which the SV40 promoter has been excised.
  • Promoter activity in muscle cells of a promoter is determined by using a vector in which a reporter gene such as a gene such as luciferase, alkaline phosphatase or j8 galactosidase is linked downstream of the promoter, as specifically described in the following examples. It can be measured by preparing and introducing it into myoblasts and measuring the expression level of the reporter gene.
  • the myoblast is a progenitor cell of the muscle cell, and the activity in the muscle cell can be evaluated by measuring the activity in the myoblast.
  • the promoter activity of the hybrid promoter of the present invention in muscle cells is higher than that when a muscle-directed promoter alone is used as a promoter, and preferably 3 times or more promoter activity (ie, expression level of reporter gene) Have more than 3 times).
  • promoter activity in muscle cells This is about 3 to 5 times that of the muscle-directed promoter alone.
  • the activity of a promoter in an antigen-presenting cell is typically represented by preparing a vector in which a reporter gene such as a luciferase gene is linked downstream of the promoter.
  • the expression level of the reporter gene can be measured by introducing it into macrophages, which are antigen-presenting cells.
  • the promoter activity in the macrophage of the hybrid promoter of the present invention is lower than that when the CMV promoter is used as a promoter, and preferably has a promoter activity of 1/10 or less. In a preferred hybrid promoter, the promoter activity in macrophages is about 1/10 to 1/15 when the CMV promoter is used as the promoter.
  • the present invention provides Sarakuko, a vector comprising the hybrid promoter of the present invention.
  • the vector of the present invention may be a plasmid vector or a viral vector having the same structure as a commonly used gene transfer vector except that the promoter is the above hybrid promoter.
  • a structural gene encoding the desired protein is inserted downstream of the hybrid promoter.
  • the present invention also provides a vector comprising such a hybrid promoter and a structural gene encoding a desired polypeptide that is located downstream of the hybrid promoter and whose expression is controlled by the hybrid promoter.
  • the desired protein is a protein to be produced in the animal body.
  • factors related to blood coagulation such as factor VIII, factor IX, von Willebrand factor, and erythro
  • factors related to blood coagulation such as factor VIII, factor IX, von Willebrand factor, and erythro
  • factors related to blood coagulation include hematopoietic factors such as poietin, growth hormones, dystrophin, and various enzymes that are deficient in congenital enzyme deficiencies.
  • a vector containing a structural gene encoding these proteins can be used for gene therapy.
  • intramuscular administration is preferable. It does not matter whether the vector used is a plasmid vector or an adenovirus-derived virus vector. Administration can be performed by intramuscular injection of a solution or suspension in which the vector is dissolved or suspended in a medium such as physiological saline. The dose to be administered in this case is appropriately set depending on the purpose of administration, the nature of the vector, etc. In some cases, the plasmid is usually about 1 to 10 milligrams.
  • Non-Patent Document 2 2 The starting plasmid for a series of constructs, CMV promoter + intron A, ⁇ shea growth hormone terminator primary, pGA consisting Kan f, and pUC backbone (Non-Patent Document 2 2).
  • the pGA vector is a well-known vector that is widely used, and can be obtained from Emory University Vaccine Center.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the promoter analyzed in this example.
  • the mouse MCK promoter (nucleotides 1256 to +7; GeneB ank Accession No.
  • AF188002 is derived from the genomic DNA of RAW264.7 cells using primer pairs 5 '-gac tag tec act acg ggt cta ggc tgc cc-3' and 5 ccc aag PCR amplification was performed using ctt ggg ggc age ccc tgt gc c cct ggg-3 ′.
  • CMV promoter ⁇ ⁇ ⁇ h intron A in pGA was excised by digestion with Spe I and Hindlll and replaced with the Spel-Hindlll MCK promoter amplicon.
  • Non-patent Document 10 the Spel-EcoRI CAG promoter fragment (Non-patent Document 10) from which the pCAGGS vector power was also excised was replaced with CMV promoter + intron A to obtain a pGA-CAG vector.
  • the MCK promoter including the enhancer region (Non-patent Document 23) and other promoters were ligated together.
  • the SV40 promoter was excised from the pGL3-control vector (trade name, Promega, Madison, Wis.) Using Smal and Hindlll, or Nhel and Hindlll.
  • pGA-MCK was digested with Smal and HindIII, or Nhel and Hindlll and then ligated with the Smal-Hindlll or Nhel-Hindlll SV40 promoter fragment, respectively.
  • Ra Igeshiyon product includes a hybrid promoter of the present invention including MCK Enhansa and SV40 promoter was named P GA- MCK / SV40 (L) and PGA- MCK / SV40 (S), respectively (these promoters portion These are called “MCK / SV40 (L)” and “pGA-MC K / SV40 (S)”, respectively).
  • the CMV enhancer in pGA-CAG was removed using Spel and Ncol, the ends were blunted, and then the end-blunted Spel-Smal with the enzyme region.
  • a plasmid pGA-MCK / ⁇ -cutin containing a hybrid promoter composed of the MCK enhancer and the ⁇ ⁇ ⁇ -actin promoter was obtained.
  • pGA-MCK / CMV containing a hybrid promoter composed of the MCK enhancer and the CMV promoter was prepared.
  • Reporter genes include firefly luciferase (luc) derived from pGL3-Control (Promega), human secreted alkaline phosphatase (SEAP) derived from pSEAP2-Basic (BD-Clontech, Palo Alto, Calif.). as Kuroyungu mice SEAP according, or mouse j8- galactosidase gene of (pSV-b- galactosidase control vector-derived), using the appropriate restriction sites were inserted in the constructed vector (multi P GA vector Inserted in the cloning site). All plasmids were produced by growing transformed E. coli DH-5a in LB medium and then purified on a Qiagen endotoxin-free DNA purification column (Qiagen, Hilden, Germany)
  • SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of the prepared hybrid promoter MCK / SV40 (L).
  • lnt to 6nt is a restriction enzyme site
  • 7nt to 149nt is a partial region of MCK promoter
  • 1150nt to l164nt force 3 ⁇ 4GL3-control (trade name) partial region of multicloning site of vector 1165nt to 1367nt force V40 promoter.
  • Mouse myoblast C2C 12 (literature or source: American type culture collection, Manas sas, VA 20108, USA: ATCC No. CRL-1772) and mouse macrophage RAW264.7 cell (literature or source: ATCC No. TIB) -71) was cultured at 37 ° C in DMEM high Darcos supplemented with 10% FCS. They were planted in 96-well tissue culture plates and grown to reach 50-70% confluency. Cells were then transiently transfected with a reporter plasmid that expresses luc under the control of various promoters using FuGene 6 transfection reagent (Roche, Mannheim, Germany). Transformation The test was performed according to the method described in FuGene 6 Mayorale.
  • the fluorescence signal was measured with a microplate noreluminometer (Veritas, Turner Biosystems, Sunnyvale, Calif.) Using the Dua Glo Luciferase Atsy kit (Promega) according to the manufacturer's instructions. .
  • phRL-TK Promega
  • renilla luciferase was used to standardize the firefly reporter activity.
  • mice Female BALB / c mice were purchased from Japan SLC Co., Ltd. (Shizuoka, Japan) and raised in the animal facility of Yokohama City University School of Medicine. DNA injection, electoral position, and blood collection from the orbital venous plexus were all performed under intoxication by subcutaneous injection of a 4: 1 mixture of ketamine and xylazine. Animal experiments were conducted with the approval of the Institute's Animal Care and Use Committee. In the erect mouth position, the quadriceps muscle is exposed, a 30-gauge needle is inserted to a depth of 2 to 3 mm, and 100 g of plasmid dissolved in physiological saline is injected.
  • a square wave electroporator (CUY21 EDIT (Nepa Gene)) was used to apply electric pulses 6 times at 30V. The pulse width was 50 ms, the pulse interval was 100 ms, and the polarity was reversed after three pulse stimuli. Thereafter, the incision was closed with a surgical tap. Blood samples were regularly collected by collecting blood from the orbital venous plexus and stored at -20 ° C until Atsy. Plasma SEAP activity was measured using a SEAP reporter gene chemiluminescence assay kit (Roche) using a microplate fluorescence reader according to the manufacturer's instructions.
  • a SEAP reporter gene chemiluminescence assay kit (Roche) using a microplate fluorescence reader according to the manufacturer's instructions.
  • FIG. 1 shows lucidity of various cultured cells by CMV promoter and SV40 promoter. The ferase expression level is shown. Jurkat (lymphocytes), K562 (leukemia cells), and HeLa (eclampsia cells) were compared. In all cells, gene expression by the SV40 promoter was extremely lower than the CMV promoter.
  • Fig. 3 shows the measurement results of luciferase expression levels in various cultured cells using CMV, MCK, and MCK / SV40 hybrid promoters. Comparison was made between RAW (macrophages) and C2C 12 (myoblasts). Gene expression by the MCK / SV40 promoter was about halfway between the CMV promoter and the MCK promoter. Note that “luc w / o promoter 1” in FIG. 3 is the luciferase activity of a cell incorporating a luciferase gene without a promoter, and is a background when the promoter activity is zero.
  • Figure 4 shows the changes over time in the blood SEAP activity of mice in which the SEAP expression plasmid has been introduced into the muscle by the electopore method.
  • FIG. 5 shows the time course of blood SEAP activity when various promoters are used.
  • the MCK / SV40 (L) promoter which is the hybrid promoter of the present invention, showed the highest performance.
  • FIG. 7 shows the time course of plasma SEAP activity when mouse SEAP is transfected into mouse muscle or liver. Since mouse SEAP is non-immunogenic because it is a homologous protein for mice, its expression level is proportional to the activity of the promoter. The MCK / SV40 (L) promoter was very weakly expressed in the liver and was not capable of gaining power.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

プロモーターとその下流の導入遺伝子を動物の筋肉に導入した場合に、組織非特異的なプロモーター又は筋肉特異的プロモーターを用いた場合に比べて、該動物体内における該導入遺伝子産物の活性を、遺伝子導入後の長期間に渡って維持することができる、新規なプロモーターが開示されている。該プロモーターは、筋肉指向性プロモーターと、SV40プロモーターを連結した混成プロモーター、又は筋肉指向性プロモーターと、SV40プロモーターの一部に欠失、置換及び／若しくは挿入が生じたSV40プロモーター由来プロモーターとが連結されて成る混成プロモーターであって、筋肉細胞内において前記筋肉指向性プロモーターよりも高い転写活性を発揮する。

Description

明 細 書
筋肉指向性プロモーターと SV40ウィルスプロモーターの混成プロモータ 一及びそれを含むベクター
技術分野
[0001] 本発明は、ヒトを含む動物体内で所望の遺伝子を発現させる遺伝子治療に適した 混成プロモーター及びそれを含むベクターに関する。
背景技術
[0002] 骨格筋はアプローチがし易ぐ導入遺伝子産物を容易に発現するので、実験的遺 伝子治療の魅力的な対象臓器となっている（非特許文献 1)。筋肉を指向した遺伝子 導入は、レポーター遺伝子発現の発現が可能であることを示した Wolflfeによる実験（ 非特許文献 2)から、凝固因子 (非特許文献 3)、エリスロポイエチン (非特許文献 4、非 特許文献 5)、ジストロフィン (非特許文献 6)、ホルモン (非特許文献 7)、及びリソソーム 蓄積症の原因となる酵素群 (非特許文献 8)のような種々の治療的タンパク質の生産 に至るまで、急速に発展してきた。これらの実験結果は先天性疾患の治療に新たな 光明を投じた。しかしながら、長期間持続的する導入遺伝子の発現が達成されてい ないために該疾患の治療に応用する試みは難航しており、該疾患の大部分におい て欠損タンパク質を生涯にわたって補充する必要が生じている。
[0003] サイトメガロウィルス (CMV)前初期遺伝子プロモーター Zェンハンサー (以後 CMV プロモーターと呼ぶ）（非特許文献 9)又はそれより派生した合成プロモーターである C AGプロモーター (非特許文献 10)は、筋肉を対象とした遺伝子治療のためのもっとも 強力なプロモーターとして広く用いられている。 CMVプロモーターは生体内で導入遺 伝子を強く発現させることができるが、多くの動物実験において遺伝子導入後数週 間のうちに導入遺伝子産物の活性はほとんど認められなくなってしまう。多くの例で、 CMVプロモーターからの発現は遺伝子導入後 2ないし 4日でピークに達し、 4週間以 内にバックグラウンドレベルにまで低下した (非特許文献 11、非特許文献 12、非特許 文献 13)。このような導入遺伝子の発現減弱では、ベクター DNAと宿主の免疫応答の 相互作用に起因する非特許文献 14、非特許文献 15;非特許文献 16)、免疫系によ る遺伝子導入細胞の排除が重要な役割を果たしている (非特許文献 17、非特許文 献 18)とされる。従って、長期的な導入遺伝子発現を成功させる鍵は、導入遺伝子産 物に対する免疫応答の誘導をいかに回避するかにかかっている。筋肉特異的プロモ 一ターは抗原提示細胞 (APC冲でほとんど活性を持たないが、組織非特異的な発現 特性をもつ CMVプロモーターは APC中で活性を示すので (非特許文献 19)、筋肉特 異的プロモーターの使用は (非特許文献 20、非特許文献 21)先述の導入遺伝子発 現細胞に対する免疫応答を回避するための有効な手段である。しかしながら、この方 法の最大の欠点は、糸且織非特異的な CMVプロモーターと比較して、筋肉特異的プロ モーターは導入遺伝子の発現レベルが低い点である。
非特許文献 1 : Lu, Q丄.， Bou-Gharios, G. and Partridge, T.A.: Non-viral gene deliv ery in skeletal muscle: a protein factory. Gene Ther. 10 (2003) 131-42.
非特許文献 2 : Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, P., Chong, W" Acsadi, G" Jani, A. and Feigner, P.L.: Direct gene transfer into mouse muscle in vivo, science 247 ( 1990) 1465-8.
非特許文献 3 : Chuah, M.K., Collen, D. and VandenDriessche, T.: Gene therapy for hemophilia. J. Gene Med. 3 (2001) 3-20.
非特許文献 4 : Kreiss, P., Bettan, M., Crouzet, J. and Scherman, D.: Erythropoietin secretion and physiological effect in mouse after intramuscular plasmid DNA electrot ransfer. J. Gene Med. 1 (1999) 245-50.
非特許文献 5 : Bohl, D" Bosch, A" Cardona, A" Salvetti, A. and Heard, J.M.: Impr ovement of erythropoiesis in beta— thalassemic mice by continuous erythropoietin del ivery from muscle. Blood 95 (2000) 2793—8.
非特許文献 6 : Chamberlain, J.S.: Gene therapy of muscular dystrophy. Hum. Mol. G enet. 11 (2002) 2355-62.
非特許文献 7 : MacColl, G.S., Goldspink, G. and Bouloux, P.M.: Using skeletal muse le as an artificial endocrine tissue. J. Endocrinol. 162 (1999) 1-9.
非特許文献 8 : Cheng, S.H. and Smith, A.E.: Gene therapy progress and prospects: gene therapy of lysosomal storage disorders. Gene Ther. 10 (2003) 1275—81. 非特許文献 9 : Boshart， M., Weber, F.， Jahn, G.， Dorsch- Hasler, Κ·， Fleckenstein, B. and Schaffher, W.: A very strong enhancer is located upstream of an immediate e arly gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (1985) 521-30.
特言午文献 10 : MiyazaKi， J., Takaki, S., Araki, Κ·， Tashiro, F., Tominaga, A., Takat su， K. and Yamamura, K.: Expression vector system based on the chicken beta— acti n promoter directs efficient production of interleukm- 5. Gene 79 (1989) 269-77. 非特許文献 l l : Bettan， M., Emmanuel, F" Darteil, R" Caillaud, J.M., Soubrier, F" Delaere, P., Branelec, D.， Mahfoudi, A., Duverger, N. and Scherman, D.: High-level protein secretion into blood circulation after electric pulse-mediated gene transfer i nto skeletal muscle. Mol. Ther. 2 (2000) 204—10.
非特許文献 12 : Payette, P.J" Weeratna, R.D., McCluskie, M.J. and Davis, H.L.: Im mune— mediated destruction of transfected myocytes following DNA vaccination occu rs via multiple mechanisms. Gene Ther. 8 (2001) 1395-400.
非特許文献 13 : Gronevik， E" von Steyern, F.V., Kalhovde, J.M., Tjelle, T.E. and M at hies en, I.: Gene expression ana immune response kinetics using electroporation— m ediated DNA delivery to muscle. J. Gene Med. 7 (2005) 218-27.
非特許文献 14 : Qin， L., Ding, Υ·， Pahud, D.R., Chang, Ε·， Imperiale, M.J. and Brom berg, J.S.: Promoter attenuation in gene therapy: interferon— gamma and tumor necr osis factor-alpha inhibit trans gene expression. Hum. Gene Ther. 8 (1997) 2019-29. 非特許文献 15 : Chen， Ζ·Υ·， He, C.Y., Meuse,し and Kay, M.A.: Silencing of episom al trans gene expression by plasmid bacterial DNA elements in vivo. Gene Ther. 11 ( 2004) 856-64.
特言午文献 lb : Reyes— Sandoval, A. and Ertl, H.C.: CpG methylation of a plasmid ve ctor results in extended trans gene product expression by circumventing induction of immune responses. Mol. Ther. 9 (2004) 249—61·
非特許文献 17 : Payette, P.J" Weeratna, R.D., McCluskie, M.J. and Davis, H.L.: Im mune— mediated destruction of transfected myocytes following DNA vaccination occu rs via multiple mechanisms. Gene Ther. 8 (2001) 1395—400. 特許文献 18 : Ghazizadeh, S., Kalish, R.S. and Taichman, L.B.: Immune-mediated loss of transgene expression in skin: implications for cutaneous gene therapy. [see co mment]. Mol. Ther. 7 (2003) 296-303.
非特許文献 19 : Weeratna, R.D., Wu, T" Efler, S.M., Zhang, L. and Davis, H.L.: De signing gene therapy vectors: avoiding immune responses by using tissue-specific pr omoters. Gene Ther. 8 (2001) 1872-8.
非特許文献 20 : Dunant, P., Larochelle, N., Thirion, C, Stucka, R., Ursu, D.， Petrof , B.J. , Wolf, E. and Lochmuller, H.: Expression of dystrophin driven by the 1.35— kb MCK promoter ameliorates muscular dystrophy in fast, but not in slow muscles of tr ansgenic mdx mice. Mol. Ther. 8 (2003) 80—9.
非特許文献 21 : Yoshimura, M., Sakamoto, M., Ikemoto, M., Mochizuki, Y., Yuasa, K., Miyagoe— SUZUKI, Y. and Takeda, S. : AAV vector-mediated microdystrophin expr ession in a relatively small percentage of mdx myofibers improved the mdx phenotyp e. Mol.Ther. 10 (2004) 821—8.
非特許文献 22 : Ross, T.M., Xu, Y.， Bright, R.A. and Robinson, HI.: C3d enhance ment of antibodies to hemagglutinin accelerates protection against influenza virus ch allenge. Nat. Immunol. 1 (2000) 127-31.
非特許文献 23 : Donoviel, D.B., Shield, M.A., Buskin, J.N., Haugen, H.S., Clegg, C. H. and Hauschka, S.D. : Analysis of muscle creatine kinase gene regulatory elements in skeletal and cardiac muscles of transgenic mice. Mol. Cell. Biol. 16 (1996) 1649- 58.
非特許文献 24 : Wang, M., Orsini, C , Casanova, D" Millan, J.L., Mahfoudi, A. and Thuillier, V.: MUSEAP, a novel reporter gene for the study of long-term gene expre ssion in immunocompetent mice. Gene 279 (2001) 99-108.
非特許文献 25 : Trask, R. V., J. C. Koster, M. E. Ritchie, and J. J. Billadello. 1992. The human M creatine kinase gene enhancer contains multiple functional interacting domains. Nucleic Acids Research 20:2313-20.
非特許文献 26 : Trask, R. V" A. W. Strauss, and J. J. Billadello. 1988. Development al regulation and tissue-specific expression of the human muscle creatine kinase gen e. Journal of Biological Chemistry 263:17142—9
非特許文献 27 : Li, Z. L., and D. Paulin. 1991. High level desmin expression depend s on a muscle-specific enhancer. Journal of Biological Chemistry 266:6562—70 非特許文献 28 : Gao, J., Z. Li, and D. Paulin. 1998. A novel site, Mt, in the human d esmin enhancer is necessary for maximal expression in skeletal muscle. Journal of Bi ological Chemistry 273:6402-9
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の目的は、プロモーターとその下流の導入遺伝子を動物の筋肉に導入した 場合に、組織非特異的なプロモーター又は筋肉特異的プロモーターを用いた場合 に比べて、該動物体内における該導入遺伝子産物の活性を、遺伝子導入後の長期 間に渡って維持することができる、新規なプロモーターを提供することである。
課題を解決するための手段
[0006] 本願発明者らは、鋭意研究の結果、筋肉指向性プロモーターである筋クレアチュン キナーゼプロモーターに、 SV40(simian virus 40)プロモーターを連結することにより、 プロモーターの筋肉細胞内でのプロモーター活性力 S、該筋肉指向性プロモーターよ りも高ぐ一方、抗原提示細胞内でのプロモーター活性が、組織非特異的なプロモー ターよりも低ぐそれによつて、該プロモーターとその下流の導入遺伝子を動物の筋 肉に導入した場合に、組織非特異的なプロモーター又は筋肉指向性プロモーターを 用いた場合に比べて、該動物体内における該導入遺伝子産物の活性を、遺伝子導 入後の長期間に渡って維持することができることを実験的に確認し、本発明を完成し た。
[0007] すなわち、本発明は、筋肉指向性プロモーターと、 SV40プロモーターを連結した混 成プロモーター、又は筋肉指向性プロモーターと、 SV40プロモーターの一部に欠失 、置換及び Z若しくは挿入が生じた SV40プロモーター由来プロモーターとが連結さ れて成る混成プロモーターであって、筋肉細胞内において前記筋肉指向性プロモー ターよりも高い転写活性を発揮する混成プロモーターを提供する。また、本発明は、 上記本発明の混成プロモーターを含むベクターを提供する。さらに、本発明は、上記 本発明の混成プロモーターと、該混成プロモーターの下流に位置し、該混成プロモ 一ターによりその発現が制御される、所望のポリペプチドをコードする構造遺伝子と を含むベクターを提供する。さら〖こ、本発明は、上記本発明のベクターを動物に導入 し、所望のポリペプチドを動物体内で生産させることを含む、該ポリペプチドの体内生 産方法又は遺伝子治療方法を提供する。さらに本発明は、上記本発明のベクターの 、ポリペプチドの体内生産用薬剤又は遺伝子治療用薬剤の製造のための使用を提 供する。
発明の効果
[0008] 本発明により、プロモーターとその下流の導入遺伝子を動物の筋肉に導入した場 合に、細胞非特異的プロモーター又は筋肉指向性プロモーターを用いた場合に比 ベて、該動物体内における該導入遺伝子産物の活性を、遺伝子導入後の長期間に 渡って維持することができるプロモーターが初めて提供された。本発明の混成プロモ 一ターを、遺伝子導入用ベクターのプロモーターとして用い、筋肉細胞を標的として 遺伝子導入を行なうと、筋肉細胞内での導入遺伝子の発現量が、筋肉指向性プロモ 一ターを単独で用いた場合よりも高くなる。一方、抗原提示細胞内での導入遺伝子 の発現量が、細胞非特異的プロモーターを単独で用いた場合よりも低くなる。その結 果、遺伝子導入後、長期間経過後も、動物体内での導入遺伝子産物の活性を、筋 肉指向性プロモーターや細胞非特異的プロモーターを用いた場合よりも高く維持す ることができる。従って、本発明の混成プロモーターは、外来遺伝子を動物体内に導 入して発現させる遺伝子治療に大いに貢献するものと考えられる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]本発明の実施例で性状解析した各種プロモーターの構造の模式図を示す。
[図 2]CMVプロモーターと SV40プロモーターによる、各種培養細胞におけるルシフエ ラーゼ発現レベルを示す図である。
[図 3]CMV、 MCK、および MCK/SV40混成プロモーターによる、各種培養細胞にお けるルシフェラーゼ発現レベルの測定結果を示す図である。
[図 4]エレクト口ポレーシヨン法により筋肉内に SEAP発現プラスミドを遺伝子導入され たマウスの血中 SEAP活性の経時変化を示す図である。
[図 5]種々のプロモーターを用いた場合の血中 SEAP活性の経時変化を示す図であ る。
[図 6]CAG、 CMV、 MCK/SV40の三種のプロモーターの転写制御下に j8—ガラタト シダーゼを発現するプラスミドをマウスにエレクト口ポレーシヨン法により筋肉内に投与 した後の血清中抗 lacZ IgG力価の測定結果を示す図である。
[図 7]マウス SEAPをマウスの筋肉または肝臓内に遺伝子導入した場合の血漿中の S EAP活性の経時変化を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 上記の通り、本発明のプロモーターは、筋肉指向性プロモーターに、 SV40プロモー ターを連結して混成プロモーターとしたものである。筋肉指向性プロモーターに連結 するものは SV40プロモーターであることが重要であり、下記実施例において具体的 に示されるように、筋肉指向性プロモーターに、細胞非特異的プロモーターであるサ イトメガロウィルス（以下、「CMV」と略すことがある）プロモーターや、 CAGプロモータ 一の構成要素である βーァクチンプロモーターを連結した場合には本発明の効果は 得られない。
[0011] SV40プロモーター自体は周知であり、 SV40プロモーターを含む発現ベクターが巿 販されているので、市販のベクターから制限酵素で切り出して用いることができる。 SV 40プロモーターの塩基配列を配列表の配列番号 1に示す。また、プロモーターの塩 基配列の一部を変更した改変プロモーターも種々知られており、 SV40プロモーター の改変プロモーターも知られている。本発明においても、天然の SV40プロモーター（ 配列番号 1)の一部に欠失、置換及び Ζ若しくは挿入が生じたプロモーター (本発明 において、「SV40プロモーター由来プロモーター」と呼ぶ）であって、任意の筋肉指向 性プロモーターと連結して混成プロモーターとした場合に、筋肉細胞内において、筋 肉クレアチュンキナーゼプロモーターよりも高いプロモーター活性を発揮するものも 本発明にお 、て用いることができる。このような SV40プロモーター由来プロモーター は、配列番号 1に示す SV40プロモーターの塩基配列と好ましくは 90%以上、さらに 好ましくは 95%以上の相同性を有することが好ましい。ここで、塩基配列の相同性は 、両者の塩基ができるだけ多く一致するように（必要ならばギャップを挿入する）両塩 基配列を整列させ、不一致の塩基数を、全塩基数 (両者の配列で全塩基数が異なる 場合には短 、方の配列の全塩基数)で除したものを百分率で表したものであり、 BLA
STのような周知のソフトにより容易に算出することができる。なお、 SV40プロモーター 由来プロモーターの長さが配列番号 1に示す SV40プロモーターの長さよりも短!ヽ場 合には、その長さは、配列番号 1に示す SV40プロモーターの長さの 90%以上である ことが好ましぐさらに好ましくは 95%以上である。また、配列番号 1の塩基配列に対 する置換、欠失及び Z又は挿入の塩基数が 1個な 、し数個のものが好まし 、。
[0012] 本発明の混成プロモーターに含まれる筋肉指向性プロモーターは、筋肉細胞内で は転写活性を発揮するが、抗原提示細胞内では転写活性を実質的に発揮しないプ 口モーターであり、天然のプロモーターでも天然のプロモーターを改造したプロモー ターであってもよい。「実質的に発揮しない」は、全く発揮しないか又は発揮するとし ても本発明の効果を害さない程度に弱く（好ましくはバックグランドの 3倍以下)程度 にし力発揮しないプロモーターを意味する。筋肉指向性プロモーターとしては、筋肉 クレアチニンキナーゼ（以下、「MCK」と呼ぶことがある）プロモーター、デスミンプロモ 一ター (非特許文献 27及び 28、 GenBank Accession No. M63391)等を例示すること ができ、これらのうち、 MCKプロモーターが好ましい。 MCKプロモーター自体は公知 である。なお、本発明において、「MCKプロモーター」という語は、ェンハンサー領域 まで含む意味で用いている。下記実施例で用いた、マウス MCKプロモーターの塩基 配列を配列番号 2に示す。また、ヒト MCKプロモーターの塩基配列を配列番号 4に示 す（非特許文献 25、非特許文献 26、 GenBank Accession No. M21487 J04435)oなお 、配列番号 2中、第 1番目の塩基〜第 208番目の塩基 (以下、例えば第 1番目の塩 基を「lnt」のように表示することがある）の領域がェンハンサー領域であり、 995nt〜10 23ntの領域が E-box領域である。また、配列番号 4中、 1689nt〜1986ntの領域がェン ハンサー領域を含むシスエレメント領域 (cis element)であり、この中の 1736nt〜1789n tの領域が MyoD領域である。
[0013] 筋肉指向性プロモーターは、上記した天然の筋肉指向性プロモーターを好ましく用 いることができるが、 SV40プロモーター又は上記 SV40プロモーター由来プロモーター と連結した混成プロモーターが、筋肉細胞内において天然の筋肉指向性プロモータ 一単独よりも高いプロモーター活性を発揮するものとなる場合には、その一部に欠失 、置換及び Z若しくは挿入が生じたプロモーターを用いることができる。すなわち、 M CKプロモーターの場合、配列番号 2や配列番号 4に示す天然の MCKプロモーター を好ましく用いることができる力 SV40プロモーター又は SV40プロモーター由来プロ モーターと連結した混成プロモーターが、筋肉細胞内において天然の MCKプロモー ター単独よりも高いプロモーター活性を発揮するものとなる場合には、その一部に欠 失、置換及び Z若しくは挿入が生じたプロモーター (本発明において、「筋肉クレア チニンキナーゼ (MCK)プロモーター由来プロモーター」と呼ぶことがある）を用いるこ とができる。この場合、上記したェンノヽンサ一領域又はヒトの場合にはェンノヽンサ一 領域を含むシスエレメント領域は、筋肉指向性発現のために重要である。従って、ェ ンハンサー領域又はヒトの場合にはシスエレメント領域は、天然の MCKプロモーター のェンノヽンサ一領域又はシスエレメント領域と同一か又は 90%以上、さらに好ましく は 95%以上の相同性を有することが好ましい。また、ェンノヽンサ一領域又はシスエレ メント領域は、天然型の塩基配列に対する置換、欠失及び Z又は挿入の塩基数が 1 個ないし数個のものが好ましい。なお、ヒトの MCKプロモーターの場合には、上記し たシスエレメント領域のみあればプロモーター活性を発揮することが知られているの で (非特許文献 25)、シスエレメント領域を含んで 、れば本発明にお 、て筋肉指向性 プロモーターとして用いることが可能である。また、シスエレメント領域の中でも特に上 記した MyoD領域が重要であり、この領域は、天然の MyoD領域と同一か又は 95%以 上の相同性を有することが好ましい。さらに、マウスの場合、ェンハンサー領域に加え 、近位 E-box領域も有することが好ましぐ近位 E-box領域も天然の MCKプロモータ 一の近位 E-box領域と同一か又は 90%以上、さらに好ましくは 95%以上の相同性を 有することが好ましい。また、近位 E-box領域は、天然型の塩基配列に対する置換、 欠失及び Z又は挿入の塩基数が 1個な 、し数個のものが好ま ヽ。上記した!/、ずれ の領域の場合も、天然物よりも長さが短い場合には、その長さは天然物の 90%以上 が好ましぐさらには 95%以上が好ましい。
なお、ェンハンサー領域又はヒト MCKの場合にはシスエレメント領域以外の領域は それほど重要ではなぐ下記実施例では、配列番号 2に示すマウス MCKプロモータ 一の 766nt以降の 494塩基を欠失させたもの及び 1144nt以降の 116塩基を欠失させた ものを用いている力 いずれの場合も本発明の効果が得られている。従って、マウス MCKプロモーターの場合、プロモーター領域のうち、少なくとも 5'側の 60%の領域があ れば、本発明の効果を得ることができる。また、 5'側の 60%の領域の天然プロモーター との相同性は 90%以上、さらに好ましくは 95%以上が好ましぐ天然物よりも長さが 短い場合には、その長さは天然物の 90%以上が好ましぐさらには 95%以上が好ま しい。また、上記の通り、ヒトの MCKプロモーターの場合には、上記したシスエレメント 領域のみあればプロモーター活性を発揮することが知られて 、るので (非特許文献 2 5)、シスエレメント領域又は該領域と 90%以上、好ましくは 95%以上の相同性を有 し、筋肉細胞内においてプロモーター活性を発揮する領域を含んでいれば、その両 端の領域は必ずしも必要ではなぐまた、本発明の効果を阻害しない任意の領域と することちでさる。
[0015] 筋肉指向性プロモーターと、 SV40プロモーターとは、直接連結してもよいし、スぺー サーを介して連結してもよい。後者の場合、スぺーサ一のサイズは特に限定されない 力 通常、 100塩基以下、好ましくは 50塩基以下である。下記実施例では、 SV40プロ モーターを切り出した市販のベクターのマルチクローユング部位に由来する 15塩基 の領域を介して両プロモーターが連結されて 、る。
[0016] プロモーターの筋肉細胞内でのプロモーター活性は、下記実施例に具体的に記載 するように、プロモーターの下流にルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ又は j8 ガラクトシダーゼ等の遺伝子のようなレポーター遺伝子を連結したベクターを作製 し、これを筋芽細胞に導入して前記レポーター遺伝子の発現量を測定することにより 測定することができる。なお、筋芽細胞は筋肉細胞の前駆細胞であり、筋芽細胞内で の活性を測定することにより筋肉細胞内での活性を評価することができる。本発明の 混成プロモーターの筋肉細胞 (筋芽細胞）内でのプロモーター活性は、筋肉指向性 プロモーター単独をプロモーターとして用いた場合よりも高ぐ好ましくは 3倍以上の プロモーター活性 (すなわちレポーター遺伝子の発現量が 3倍以上）を有する。好ま しい混成プロモーターでは、筋肉細胞 (筋芽細胞）内でのプロモーター活性は、天然 の筋肉指向性プロモーター単独をプロモーターとして用いた場合の 3〜5倍程度で ある。
[0017] プロモーターの抗原提示細胞中での活性は、下記実施例に具体的に記載するよう に、プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子を連結し たベクターを作製し、これを代表的な抗原提示細胞であるマクロファージに導入して 前記レポーター遺伝子の発現量を測定することにより測定することができる。本発明 の混成プロモーターのマクロファージ内でのプロモーター活'性は、 CMVプロモーター をプロモーターとして用いた場合よりも低ぐ好ましくは 1/10以下のプロモーター活性 を有する。好ましい混成プロモーターでは、マクロファージ内でのプロモーター活性 は、 CMVプロモーターをプロモーターとして用いた場合の 1/10〜1/15程度である。
[0018] 本発明は、さら〖こ、上記本発明の混成プロモーターを含むベクターを提供する。本 発明のベクターは、プロモーターが上記混成プロモーターであることを除き、常用さ れている遺伝子導入用ベクターと同様な構成を有していてよぐプラスミドベクターで もウィルスベクターでもよい。混成プロモーターの下流には、所望のタンパク質をコー ドする構造遺伝子が挿入される。本発明は、このような、混成プロモーターと、該混成 プロモーターの下流に位置し、該混成プロモーターによりその発現が制御される、所 望のポリペプチドをコードする構造遺伝子とを含むベクターをも提供する。所望のタ ンパク質は、動物の体内で生産すべきタンパク質であり、遺伝子治療を目的とする場 合には例えば、第 VIII因子、第 IX因子、 von Willebrand因子などの血液凝固に関わる 因子やエリスロポイエチンのような造血因子、あるいは成長ホルモン、ジストロフィン、 先天的酵素欠損症にぉ ヽて欠損して 、る種々の酵素などが挙げられる。これらのタ ンパク質をコードする構造遺伝子を含むベクターは、遺伝子治療用として用いること ができる。
[0019] これらの遺伝子治療用ベクターを投与する場合、筋肉内投与が好ましい。使用する ベクターはプラスミドベクターであるか、アデノウイルスなどに由来するウィルスベクタ 一であるかを問わない。投与は、ベクターを生理食塩水等の媒体に溶解又は懸濁さ せた溶液又は懸濁液を筋肉内注射することにより行なうことができる。この場合の投 与量は、投与の目的やベクターの性質等により適宜設定されるが、成人に投与する 場合、プラスミドでは通常、 1〜10ミリグラム程度である。
[0020] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実 施例に限定されるものではない。
実施例
[0021] 1.材料及び方法
(1) プラスミドの構築及び調製
一連の構築物に対する出発プラスミドは、 CMVプロモーター +イントロン A、ゥシ成 長ホルモンターミネータ一、 Kanf、及び pUCバックボーンから成る pGA (非特許文献 2 2)である。なお、 pGAベクターは、広く用いられている周知のベクターであり、ェモリー 大学ワクチンセンターなどより入手可能である。図 1は本実施例で性状解析したプロ モーターの模式図を示す。マウス MCKプロモーター (ヌクレオチド 1256から +7; GeneB ank Accession No. AF188002)は、 RAW264.7細胞のゲノム DNAからプライマーペア 5' -gac tag tec act acg ggt cta ggc tgc cc- 3'及び 5し ccc aag ctt ggg ggc age ccc tgt gc c cct ggg- 3'を用いて PCR増幅した。 pGA中の CMVプロモータ^ ~ ~ hイントロン Aは Spe I及び Hindlllで消化することにより切り出し、 Spel-Hindlll MCKプロモーター単位複製 配列で置き換えた。同様に、 pCAGGSベクター力も切り出された Spel-EcoRI CAGプロ モーター断片 (非特許文献 10)を CMVプロモーター +イントロン Aと置き換え、 pGA- C AGベクターを得た。一連のハイブリッドプロモーターを創出するため、ェンハンサー 領域を含む MCKプロモーター (非特許文献 23)及び他のプロモーターを共にライゲ ーシヨンした。 SV40プロモーターは、 Smal及び Hindlll、又は Nhel及び Hindlllを用いて pGL3-controlベクター (商品名、 Promega, Madison,ウィスコンシン州)から切り出した 。 pGA-MCKは、 Smal及び HindIII、又は Nhel及び Hindlllで消化し、次いでそれぞれ S mal- Hindlll又は Nhel-Hindlll SV40プロモーター断片と共にライゲーシヨンした。該ラ ィゲーシヨン産物は MCKェンハンサー及び SV40プロモーターを含む本発明の混成 プロモーターを含んでおり、それぞれ PGA- MCK/SV40 (L)及び pGA- MCK/SV40 (S )と命名した（これらのプロモーター部はそれぞれ、「MCK/SV40 (L)」及び「pGA-MC K/SV40 (S)」と呼ぶ）。 pGA- CAG中の CMVェンハンサ一は Spel及び Ncolを用いて除 去し、末端を平滑化し、次いでェンノヽンサ一領域を有する末端平滑ィ匕した Spel-Smal MCK断片で置き換えることにより、 MCKェンハンサー及び-ヮトリ βーァクチンプロ モーターから成るハイブリッドプロモーターを含むプラスミド pGA-MCK/ β 了クチン を得た。同様に、 pGAベクター中の CMVェンハンサーを MCKェンハンサ一と置き換 えることにより、 MCKェンハンサー及び CMVプロモーターから成るハイブリッドプロモ 一ターを含む pGA- MCK/CMVを作製した。レポーター遺伝子として、 pGL3- Control (Promega)由来のホタルルシフェラーゼ (luc)、 pSEAP2- Basic (BD- Clontech, Palo Alt o,カリフォルニア州)由来のヒト分泌性アルカリフォスファターゼ (SEAP)、非特許文献 2 4に記載の通りクローユングされたマウス SEAP、又はマウス j8—ガラクトシダーゼ遺伝 子（pSV-b- galactosidase control vector由来）を、適切な制限部位を用いて、構築し たベクター中に挿入した（PGAベクターのマルチクロー-ング部位に挿入）。全てのプ ラスミドは、形質転換した大腸菌 DH-5 aを LB培地中で増殖させることにより生産し、 次いで Qiagenエンドトキシンフリー DNA精製カラム（Qiagen, Hilden,独国)で精製した
[0022] 作製した上記混成プロモーター MCK/SV40 (L)の塩基配列を配列番号 3に示す。
配列番号 3中、 lnt〜6ntは制限酵素部位、 7nt〜l 149ntが MCKプロモーターの部分 領域、 1150nt〜l 164nt力 ¾GL3- control (商品名）ベクターのマルチクローユング部位 の部分領域、 1165nt〜1367nt力 V40プロモーターである。また、配列番号 3の 771nt 〜776nt力Nhel部位であり、 MCK/SV40 (S)では、配列番号 3の 774ntから 1149ntが欠 失して 、る (さらに、 1150nt〜l 164ntの pGL3- control (商品名 )ベクターのマルチクロ 一ユング部位の部分領域も、切断した制限酵素が異なるため、一部異なる)。
[0023] (2) トランスフエクシヨン及びルシフェラーゼアツセィ
マウス筋芽細胞 C2C 12 (文献又は入手先： American type culture collection, Manas sas, VA 20108, USA:ATCC No.CRL- 1772)及びマウスマクロファージ RAW264.7細 胞（文献又は入手先： ATCC No. TIB-71)は、 10% FCSを添カ卩した DMEM高ダルコ一 ス中で 37°Cにて培養した。それらを 96ゥエル組織培養プレート中に植え、 50〜70% のコンフルーエンシーに達するまで増殖させた。次いで、 FuGene 6トランスフエクショ ン試薬 (Roche, Mannheim,独国)を用いて、種々のプロモーターの制御下で lucを発 現するレポータープラスミドで細胞を一過的にトランスフエタトした。トランスフエクショ ンは FuGene 6のマ-ユアノレに記載の方法に従って行なった。トランスフエクシヨンから 2日後、製造者の指示書に従い Dua卜 Gloルシフェラーゼアツセィキット (Promega)を用 いて、マイクロプレートノレミノメータ (Veritas, Turner Biosystems, Sunnyvale,カリフォノレ ユア州)で蛍光シグナルを測定した。第二のレポーターベクターとして、ゥミシィタケル シフェラーゼを発現する phRL-TK (Promega)を用いて、ホタルレポーター活性を標準 化した。
[0024] (3) 動物の取り扱いならびに血漿 SEAP活性の測定
日本 SLC株式会社 (静岡、 日本国)より雌の BALB/cマウスを購入し、横浜市立大学 医学研究院の動物施設内で飼育した。 DNA注入、エレクト口ポレーシヨン、及び眼窩 静脈叢からの採血は全て、ケタミン及びキシラジンの 4 : 1混合物の皮下注射による麻 酔下で行なった。動物実験は、研究機関の動物管理使用委員会による承認の下で 行なわれた。エレクト口ポレーシヨンでは、大腿四頭筋を露出させ、 30ゲージの針を 2 〜3mmの深さまで刺し込み、生理食塩水に溶解した 100 gのプラスミドを注入した 後、筋束を円形白金電極 (直径： 10mm、間隔：約 5mm、 CUY650-10, Nepa Gene, 千葉県)で挟んだ。矩形波エレクト口ポレーター (square wave electroporator) CUY21 EDIT (Nepa Gene)により、 30Vにて電気パルスを 6回印加した。パルス幅は 50ms、ノ ルス間隔は 100msとし、 3回のパルス刺激の後に極性を反転させた。その後外科タリ ップで切開部を閉鎖した。眼窩静脈叢力もの採血により定期的に血液サンプルを得 て、アツセィまで— 20°Cにて保存した。血漿 SEAP活性は、製造者の指示書に従い、 マイクロプレート蛍光リーダーを用いて SEAPレポーター遺伝子化学発光アツセィキッ ト（Roche)を使用して測定した。
[0025] (4) 統計
統計学的解析は、 StatView J- 4.02ソフトウェア (Abacus Concepts, Berkeley,カリフ オル-ァ州)を用いた対応のある t検定 (paired t- test)により行い、 pく 0.05を有意と定 我した。
[0026] 2. 結果
(1) CMVプロモーター及び SV40プロモーター各種培養細胞中のプロモーター活'性 図 2に、 CMVプロモーターと SV40プロモーターによる、各種培養細胞におけるルシ フェラーゼ発現レベルを示す。 Jurkat (リンパ球）、 K562 (白血病細胞）、 HeLa (子宫ガ ン細胞）の 3種で比較した。いずれの細胞でも SV40プロモーターによる遺伝子発現は CMVプロモーターより極端に低かった。
[0027] (2) マクロファージ及び筋芽細胞内での各種プロモーターの活性
図 3に、 CMV、 MCK、および MCK/SV40混成プロモーターによる、各種培養細胞 におけるルシフェラーゼ発現レベルの測定結果を示す。 RAW (マクロファージ）と C2C 12 (筋芽細胞）で比較した。 MCK/SV40プロモーターによる遺伝子発現は CMVプロモ 一ターと MCKプロモーターの中間くらいであった。なお、図 3中「luc w/oプロモータ 一」は、プロモーターなしでルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ細胞のルシフェラー ゼ活性であり、プロモーター活性が 0の場合のバックグランドである。
[0028] (3) トランスフ クシヨン後の導入遺伝子産物の血中レベル
エレクト口ポレーシヨン法により筋肉内に SEAP発現プラスミドを遺伝子導入されたマ ウスの血中 SEAP活性の経時変化を図 4に示す。本発明の混成プロモーターである M CK/SV40(L)プロモーターによる遺伝子発現は長期間持続した。
[0029] 同様に、種々のプロモーターを用いた場合の血中 SEAP活性の経時変化を図 5に 示す。全プロモーターの中で本発明の混成プロモーターである MCK/SV40(L)プロモ 一ターが最も高 、パフォーマンスを示した。
[0030] (4) 導入遺伝子産物に対する血中抗体の測定
CAG、 CMV、 MCK/SV40の三種のプロモーターの転写制御下に j8—ガラクトシダ ーゼを発現するプラスミドをマウスにエレクト口ポレーシヨン法により筋肉内に投与した 後の血清中抗 lacZ IgG力価の測定結果を図 6に示す。投与は 0と 4週目に行い、抗 体価の測定は 2と 6週目に行った。 CAG、 CMVプロモーターでは抗体の誘導が明ら かである力 MCK/SV40(L)プロモーターでは抗体はほとんど検出されなかった。
[0031] (5) 筋肉内又は肝臓内に遺伝子導入した場合の導入遺伝子の発現量の比較
マウス SEAPをマウスの筋肉または肝臓内に遺伝子導入した場合の血漿中の SEAP 活性の経時変化を図 7に示す。マウス SEAPはマウスにとって同種タンパクのため免 疫原性がないので、プロモーターの活性に発現レベルが比例している。 MCK/SV40( L)プロモーターでは肝臓では非常に弱い発現し力得られな力つた。

Claims

請求の範囲
[1] 筋肉指向性プロモーターと、 SV40プロモーターとが連結した混成プロモーター、又 は筋肉指向性プロモーターと、 SV40プロモーターの一部に欠失、置換及び Z若しく は挿入が生じた SV40プロモーター由来プロモーターとが連結されて成る混成プロモ 一ターであって、筋肉細胞内において前記筋肉指向性プロモーターよりも高いプロ モーター活性を発揮する混成プロモーター。
[2] 前記筋肉指向性プロモーター力 筋肉クレアチュンキナーゼプロモーター又はそ の一部に欠失、置換及び Z若しくは挿入が生じた筋肉クレアチュンキナーゼプロモ 一ター由来プロモーターであって、前記 SV40プロモーター又は SV40プロモーター由 来プロモーターと連結された混成プロモーターの筋肉細胞内におけるプロモーター 活¾ ^ 筋肉クレアチュンキナーゼプロモーター単独のプロモーター活¾ょりも高い プロモーターである請求項 1記載の混成プロモーター。
[3] 前記筋肉クレアチュンキナーゼ由来プロモーター力 ェンノヽンサ一領域又はシス エレメント領域を有し、該ェンハンサー領域又はシスエレメント領域は、筋肉クレアチ ニンキナーゼプロモーターのェンハンサー領域又はシスエレメント領域と同一か又は 90%以上の同一性を有する請求項 2記載の混成プロモーター。
[4] 請求項 1な 、し 3の!、ずれ力 1項に記載の混成プロモーターを含むベクター。
[5] 遺伝子導入用ベクターである請求項 4記載のベクター。
[6] 請求項 1な 、し 3の!、ずれ力 1項に記載の混成プロモーターと、該混成プロモータ 一の下流に位置し、該混成プロモーターによりその発現が制御される、所望のポリべ プチドをコードする構造遺伝子とを含むベクター。
[7] 前記ポリペプチドが、動物の体内で生産すべきポリペプチドである、遺伝子治療用 のベクターである請求項 6記載のベクター。
[8] 請求項 6記載のベクターを動物に導入し、所望のポリペプチドを動物体内で生産さ せることを含む、該ポリペプチドの体内生産方法。
[9] 請求項 7記載のベクターを動物に導入し、所望のポリペプチドを動物体内で生産さ せることを含む遺伝子治療方法。
[10] 請求項 6記載のベクターの、ポリペプチドの体内生産用薬剤の製造のための使用。 [11] 請求項 7記載のベクターの、遺伝子治療用薬剤の製造のための使用。
PCT/JP2006/323452 2005-11-24 2006-11-24 筋肉指向性プロモーターとsv40ウイルスプロモーターの混成プロモーター及びそれを含むベクター WO2007061053A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007546504A JPWO2007061053A1 (ja) 2005-11-24 2006-11-24 筋肉指向性プロモーターとｓｖ４０ウイルスプロモーターの混成プロモーター及びそれを含むベクター

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005338581 2005-11-24
JP2005-338581 2005-11-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007061053A1 true WO2007061053A1 (ja) 2007-05-31

Family

ID=38067278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/323452 WO2007061053A1 (ja) 2005-11-24 2006-11-24 筋肉指向性プロモーターとsv40ウイルスプロモーターの混成プロモーター及びそれを含むベクター

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2007061053A1 (ja)
WO (1) WO2007061053A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011115207A1 (ja) * 2010-03-19 2011-09-22 国立大学法人静岡大学 プロモーター
CN114231532A (zh) * 2022-02-22 2022-03-25 广州派真生物技术有限公司 在哺乳动物肌肉中特异性启动基因的启动子序列及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAGSTORM J.N. ET AL: "Improved muscle-derived expression of human coagulation factorIX from a skeletal actin/CMV hybrid enhancer/promoter", BLOOD, vol. 95, no. 8, 2000, pages 2536 - 2542, XP003013603 *
LI S. ET AL: "Muscle-specific enhancement of gene expression by inCorp. of SV40 enhancer in the expression plasmid", GENE THERAPY, vol. 8, 2001, pages 494 - 497, XP003013604 *
TAKASE K.: "Kaihengata muscle creatinine kinase Idenshi Promoter ni yoru Kinniku Tokuiteki Hyoteki Idenshi Hatsugen Seigyo", ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN KOEN YOSHISHU, 25 November 2005 (2005-11-25), ABSTRACT, pages 759 - 3P-1170, XP003013606 *
TAKESHITA F. ET AL: "Muscle creatine kinease/SV40 hybrid promoter for muscle-targeted long-term transgene expression", JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE, vol. 19, 2007, pages 309 - 315, XP003013605 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011115207A1 (ja) * 2010-03-19 2011-09-22 国立大学法人静岡大学 プロモーター
JP2011193801A (ja) * 2010-03-19 2011-10-06 National Univ Corp Shizuoka Univ プロモーター
CN114231532A (zh) * 2022-02-22 2022-03-25 广州派真生物技术有限公司 在哺乳动物肌肉中特异性启动基因的启动子序列及其应用
CN114231532B (zh) * 2022-02-22 2022-06-17 广州派真生物技术有限公司 在哺乳动物肌肉中特异性启动基因的启动子序列及其应用
WO2023160317A1 (zh) * 2022-02-22 2023-08-31 广州派真生物技术有限公司 在哺乳动物肌肉中特异性启动基因的启动子序列及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2007061053A1 (ja) 2009-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110741082B (zh) 腺相关病毒(aav)进化枝f载体及其用途
ES2887776T3 (es) Vectores de ADN no integradores para la modificación genética de células
US11332719B2 (en) Recombinant virus and preparations thereof
KR20200111726A (ko) 무세포 합성으로부터 수득된 폐쇄 말단 DNA 벡터 및 ceDNA 벡터를 수득하는 방법
TW202028461A (zh) 核酸構築體及使用方法
CN101939428A (zh) 涉及mRNA翻译增强因子的组合物和方法
JP2024028931A (ja) 閉端ｄｎａ（ｃｅｄｎａ）ベクターを使用した導入遺伝子の制御された発現
Moss Gene therapy review
CN112662674A (zh) 靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA及其应用
US20230002788A1 (en) Aav3b variants with improved production yield and liver tropism
KR101478869B1 (ko) 마이크로ｒｎａ를 이용한 조절을 통한 암 특이적 유전자 치료제
TW202233844A (zh) Aav衣殼及含有其之組成物
KR20180117630A (ko) 압타머-조절된 폴리아데닐화를 통한 유전자 발현의 조절
Rupprecht et al. Controlled removal of a nonviral episomal vector from transfected cells
JP2024506040A (ja) Ａｑｐ１ ＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡ及びそのベクターと使用
KR20210091323A (ko) 면역조절 단백질 발현용 다유전자 구조체 및 이의 사용 방법
KR20230003477A (ko) 비-바이러스성 dna 벡터 및 인자 ix 치료제 발현을 위한 이의 용도
KR20230003478A (ko) 비-바이러스성 dna 벡터 및 고셰 치료제 발현을 위한 이의 용도
WO2007061053A1 (ja) 筋肉指向性プロモーターとsv40ウイルスプロモーターの混成プロモーター及びそれを含むベクター
Heinrich et al. Linear closed mini DNA generated by the prokaryotic cleaving-joining enzyme TelN is functional in mammalian cells
KR20220007601A (ko) 치료제 투여를 위한 조성물 및 방법
CN116019935A (zh) Ago2在制备治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物方面的用途及其蛋白、基因、转化体
KR20200132740A (ko) 요산분해효소를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 통풍의 예방 또는 치료용 조성물
US20200061210A1 (en) Novel method for gene therapy using intranasal administration of genetically modified viral vectors
CN105358690B (zh) 启动子组合物

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007546504

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06833256

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1