CN108884438B - 肝细胞的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了由人多能干细胞生产肝细胞的方法。将干细胞接种到包含两种层粘连蛋白的细胞培养基底上。然后将干细胞暴露于不同的细胞培养基以诱导分化。与在不同基底上培养的肝细胞相比，所得的肝细胞具有更高的代谢能力。

Description

肝细胞的生产方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年10月30日提交的美国临时专利申请序列No.62/248,389的优先权。这些申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
干细胞是未分化的细胞，其随后衍生出特化细胞。多能干细胞可以分化成三种胚层(内胚层、中胚层或外胚层)中的任一者。受精后，多能干细胞形成人体内的每种细胞类型，包括可塑性较低的干细胞群，如成体干细胞、胎儿干细胞和羊膜干细胞。胚胎干细胞是一种多能干细胞，并具有广泛的自我更新能力和多能性。最近，通过被称为体细胞重新编程的过程，由哺乳动物的终末分化细胞生成了另一种类型的多能干细胞(诱导多能干细胞)。使干细胞变成更为特化的细胞的过程被称为分化，例如内胚层祖细胞分化成肝细胞。
由干细胞衍生的体细胞是用于基础科学和转化科学的大量的细胞来源。虽然颇具前景，但要使这成为现实则需要克服许多障碍。特别是，目前的方案产生功能可变且寿命长的肝细胞，这是在分化过程中使用不明确的成分的结果。
Figure BDA0001714316350000011
和血清的使用是最初的例子，并且仍然是肝细胞分化步骤中批次与批次之间变异性的来源。
Figure BDA0001714316350000012
是从小鼠Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉瘤肿瘤组织获得的复杂肿瘤和BM样提取物。
Figure BDA0001714316350000013
主要含有小鼠LN-111、IV型胶原蛋白、基底膜蛋白聚糖和巢蛋白，但也含有不同量的其他物质，包括生长因子和细胞蛋白质，因此其组成不确定，并且各批次间有所不同。最近的研究已经使用小分子来取代生长因子，虽然这极大地降低了工艺成本，但小分子可能会有一些脱靶效应。而且，那些研究使用
Figure BDA0001714316350000014
和血清来驱动分化过程，因此本质上将是可变的。其结果是，难以产生可靠的、可再现的肝细胞培养物。此外，如果要在临床上使用这些细胞，则制造过程必须符合GMP指南。为了遵守这些指南，含有动物性衍生物的产品受到严格控制。
因此，希望发展这样的方法，该方法能够在化学成分确定的、不含异源物的、不含病原体的并且批次之间稳定的条件下，使干细胞分化成为已分化细胞，特别是肝细胞。理想的是，这些方法应该提供来自GMP等级人胚胎干细胞(hESC)的大量的这类已分化细胞。
发明内容
本文公开了用于生产具有更多自然特性和更多分化功能的肝细胞的方法。通常而言，这些方法包括：在细胞培养基底上接种人多能干细胞，所述细胞培养基底包含(i)第一层粘连蛋白，其为层粘连蛋白-521以及(ii)第二层粘连蛋白，其选自由层粘连蛋白-111和层粘连蛋白-221所构成的组中，其中层粘连蛋白-521和第二层粘连蛋白各自为完整蛋白质或蛋白质片段；以及培养人多能干细胞以得到肝细胞。所得的肝细胞显示出有效的肝细胞特化(specification)、组织、成熟以及细胞功能和稳定性的显著改善。据信，层粘连蛋白抑制不适当的基因调控网络，该基因调控网络控制细胞增殖、干细胞自我更新以及结肠和成纤维细胞特化。干细胞本身应该为研究用等级和GMP等级。
层粘连蛋白-521与第二层粘连蛋白的重量比可以为约1:4至约1:1。换言之，与层粘连蛋白-521相比，第二层粘连蛋白更多。
可以通过以下步骤进行人多能干细胞的培养：(a)在含有活化素A和Wnt3a的内胚层分化培养基中培养细胞；(b)在成肝细胞分化培养基中培养细胞；(c)然后在含有氢化可的松(HC)、肝细胞生长因子(HGF)和制瘤素m(OSM)的肝细胞成熟培养基中培养细胞。
可以将细胞在内胚层分化培养基中培养约60小时至约84小时的一段时间。可以将细胞在成肝细胞分化培养基中培养约73小时至约180小时的一段时间。可以将细胞在肝细胞成熟培养基中培养至少216小时。
内胚层分化培养基可以包含RPMI 1640和B27。内胚层分化培养基中活化素A的含量可以为约50ng/mL至约150ng/mL。内胚层分化培养基中Wnt3a的含量可以为约20ng/mL至约100ng/mL。
成肝细胞分化培养基可以由KO-DMEM、20％的血清替代物、1％的非必需氨基酸、0.1mM的β-巯基乙醇和1％的二甲基亚砜制成。肝细胞成熟培养基中肝细胞生长因子的含量可以为约5ng/mL至约20ng/mL。肝细胞成熟培养基中制瘤素m的含量可以为约10ng/mL至约30ng/mL。
或者，可以根据Avior方案或Cameron方案对人多能干细胞进行培养。
所得的肝细胞可以显示至少600,000RLU/mg/mL的CYP1A2活性。或者，所得的肝细胞可以显示至少800,000RLU/mg/mL的CYP3A活性。
有时，细胞培养基底还包含钙粘蛋白。钙粘蛋白可以为e-钙粘蛋白。(第一层粘连蛋白+第二层粘连蛋白)与钙粘蛋白的重量比可以为约5:1至约15:1。
通常，细胞培养基底不含有任何分化抑制剂、饲养细胞、分化诱导物或细胞凋亡抑制剂。
以下更具体地公开了本公开的这些和其他非限制性特征。
附图简要说明
本专利或申请文件包括至少一幅带有颜色的图。在提出请求并支付必要费用后，官方将提供附有彩图的本专利或专利申请公开的副本。
下面是附图的简要说明，其目的在于说明本文所公开的示例性实施方案，而不是为了对其进行限制的目的。
图1为分化方案的说明，包括代表性视野的相差图像(contrast image)、各分化阶段存在的细胞类型、所使用的生长因子/分子和培养基以及各阶段的时间线。
图2为一组表明在以下三种不同基底上的分化之前和之后的多能干细胞形态的12张显微镜照片：对照培养基(MG)；层粘连蛋白-521(LN 521)；以及比例为1:3的层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111的组合(LN111)。图中还示出兔、鼠和羊抗血清的IgG对照染色。
图3为一组在图2的三种不同基底上的分化期间的OCT4、Nanog、FOXA2、AFP、HNF4A和ALB表达的六幅柱状图。对于各图，黑色柱为MG；虚线柱为LN 521，而白色柱为LN 111。y轴为相对表达，并且x轴为天数，四组柱为分化的第0天、第3天、第9天和第18天。用管家基因GAPDH对表达进行归一化。根据通过以Tukey事后检验的单向ANOVA所测量的结果，单星号(*)表示p<0.05，而双星号(**)表示p<0.01。
图4为一组生长在三种不同基底上的内胚层细胞和肝细胞的共计15张显微镜照片(放大倍率为10倍至20倍)，图中示出了在分化的第3天，FOXA2、SOX17、甲胎蛋白(AFP)、肝细胞核因子4α(HNF4A)和细胞角蛋白19(CK19)的表达。图中示出了阳性细胞百分比和标准偏差。用hoescht 33342对细胞进行复染。
图5为一组在分化的第18天、生长在图2的三种不同基底上的肝细胞的白蛋白(ALB)、e-钙粘蛋白(E CAD)和细胞增殖标志物Ki67的表达的九张显微镜照片(放大倍率为10倍)。图中示出了阳性细胞百分比和标准偏差。
图6为一组生长在图2的三种不同基底上的肝细胞的CYP2D6和CYP3A4表达的六张显微镜照片(放大倍率为10倍)，以及CYP1A2和CYP3A代谢活性的相应柱状图。图中示出了阳性细胞百分比和标准偏差。在两幅图上，y轴为RLU/mg/mL，而x轴为分化的第16天、第18天、第20天、第22天、第24天和第26天。根据通过以Bonferroni事后检验的单向ANOVA所测量的结果，单星号(*)表示p<0.05，而双星号(**)表示p<0.01。虚线表示培养物中原代肝细胞的平均CYP活性。
图7为一组示出由在图6的三种不同基底上培养的肝细胞产生白蛋白和甲胎蛋白的两幅柱状图。对于各图，黑色柱为MG；虚线柱为LN 521，而白色柱为LN 111。y轴为ng/mg/mL/24小时。x轴为天数，四组柱为分化的第20天、第22天、第24天和第26天。
图8为一组生长在图2的三种不同基底上的肝细胞的、排列成三行的九张显微镜照片(放大倍率为10倍)。最上面一行为在培养的第24天的细胞的相差图像。中间一行为使用CDFDA染色的多药耐药性相关蛋白(MRP-1)和HNF4a的共染色。绿色点为HNF4a，而点周围的红色线为MRP-1。
图9A为胚胎干细胞(ESC)、新鲜分离的原代人肝细胞(FH)和从图2的三种不同基底得到的肝细胞样细胞(HLC)中变异最大的1,000个基因的主要成分分析。两个主要成分(PC1和PC 2)一起构成86.5％的变异。y轴为PC 2，并且范围为-60至+30，间隔为10。x轴为PC 1，范围为-60至+100，间隔为20。
图9B为一组示出了图9A样品的基因调控网络状态的三幅柱状图。y轴为基因调控网络分数(GRN-Score)，并且以变异％为单位。最左侧的ESC、肝脏和结肠的柱为训练分数，并代表最大可能分数。
图9C为一组使用模糊聚类技术得到的簇，并组成三种“超级簇”。示出了12幅柱状图。在各柱状图中，y轴为log2倍变化，即不同于对照组的倍数。
图10为一组表明接种在图2的三种基底上的原代人肝细胞中的CYP1A2、CYP3A、甲胎蛋白和白蛋白表达和48小时后检验代谢能力的柱状图。CYP1A2和CYP3A图的y轴为RLU/mg/mL。甲胎蛋白图的y轴为ng/mg/mL。白蛋白图的y轴为μg/mg/ml/24小时。在所有四幅柱状图中，黑色柱为男性肝细胞，而白色柱为女性肝细胞。
图11为一组干细胞衍生的肝细胞的三张显微镜照片，其多药耐药蛋白1(MPR-1)染色18天后，生长在比例为1:3的层粘连蛋白-221/层粘连蛋白-521、比例为1:1的层粘连蛋白-221/层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-521上的干细胞衍生的肝细胞。
图12为一组表明MPR-1染色18天后的在层粘连蛋白-221/层粘连蛋白-521的比例为1:3、层粘连蛋白-221/层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-521的比例为1:1上的干细胞衍生的肝细胞的CYP1A2和CYP3A活性的两幅柱状图。
图13为一组表明Avior和Cameron分化步骤如何影响在层粘连蛋白-221/层粘连蛋白-521的比例为1:3、层粘连蛋白-221/层粘连蛋白-521以及层粘连蛋白-521的比例为1:1的基底上的培养基中的干细胞衍生的肝细胞的图。对于这两幅图，y轴为RLU/mg/mL。对于各基底，Avior方案结果在左侧，Cameron方案结果在右侧。
图14为一组将各种标志物染色的、在三种不同基底上生长的MAN12细胞的共15张显微镜照片。
图15为一组在图14的三种不同基底上的分化期间的甲胎蛋白、白蛋白、CYP1A2和CYP3A表达的四幅柱状图。对于各图，黑色柱为MG；虚线柱为LN 521，而白色柱为LN 111。甲胎蛋白和白蛋白图的y轴为ng/mg/mL/24小时。CYP1A2和CYP3A图的y轴为RLU/mg/ml。根据通过以Tukey事后检验的单向ANOVA所测量的结果，单星号(*)表示p<0.05，而双星号(**)表示p<0.01。
图16为一组将各种标志物染色的、在三种不同基底上生长的MAN11细胞的共15张显微镜照片。
图17为一组在图16的三种不同基底上的分化期间的甲胎蛋白、白蛋白、CYP1A2和CYP3A表达的四幅柱状图。对于各图，黑色柱为MG；虚线柱为LN 521，而白色柱为LN 111。甲胎蛋白和白蛋白图的y轴为ng/mg/mL/24小时。CYP1A2和CYP3A图的y轴为RLU/mg/ml。根据通过以Tukey事后检验的单向ANOVA所测量的结果，双星号(**)表示p<0.01。
图18A-18E为示出培养以形成肝细胞样细胞的人胚胎干细胞(hESC)的三维球状体的图片。图18A为在聚(羟乙基甲基丙烯酸甲酯)中形成的随机尺寸的球状体的照片。图18B为在琼脂糖中形成的尺寸为50μm至100μm的球状体的照片。图18C为在琼脂糖中形成的尺寸为100μm至150μm的球状体的照片。图18D为在琼脂糖中形成的尺寸为150μm至200μm的球状体的照片。图18E为示出所生成的肝细胞球状体尺寸范围的柱状图。y轴以微米(μm)为单位，并且以50μm的间隔从0μm计到250μm。
图19A至19D示出了肝细胞球状体中肝基因表达的图。
图19A示出了Foxa2基因随时间推移的相对表达的柱状图。y轴以200的间隔从0计到1400。x轴从左到右计为第0天、第3天、第8天和第18天。对于各天，左侧的柱为H9细胞系，而右侧的柱为Man12细胞系。
图19B示出了HNF4α基因随时间推移的相对表达的柱状图。y轴以5000的间隔从0计到30000。x轴从左到右计为第0天、第3天、第8天和第18天。对于各天，左侧的柱为H9细胞系，而右侧的柱为Man12细胞系。
图19C示出了随时间推移，甲胎蛋白(AFP)表达增加的倍数的柱状图。y轴以200,000的间隔从0计到1,800,000。x轴从左到右计为第0天、第3天、第8天和第18天。对于各天，左侧的柱为H9细胞系，而右侧的柱为Man12细胞系。
图19D示出了随时间推移，白蛋白(ALB)表达增加的倍数的柱状图。y轴以10,000的间隔从0计到50,000。x轴从左到右计为第0天、第3天、第8天和第18天。对于各天，左侧的柱为H9细胞系，而右侧的柱为Man12细胞系。
图20A为一组在第18天进行的四种免疫染色。最左侧的染色为e-钙粘蛋白。中间偏左的染色为HNF4a。中间偏右的染色为DAPI。最右侧的染色为其他三个染色的叠加图。各染色的左下角的线表示20μm。
图20B为一组在第30天进行的四种免疫染色。最左侧的染色为白蛋白。中间偏左的染色为HNF4a。中间偏右的染色为DAPI。最右侧的染色为其他三个染色的叠加图。各染色的左下角的线表示20μm。
图21为一组都在第18天进行的、排列为A行和B行、每行四种染色的八种免疫染色。A行为小的肝细胞球状体，B行为大的肝细胞球状体。最左侧的列为Ki67。中间偏左的列为ZO-1。中间偏右的列为DAPI。最右侧的列为其他三列的叠加图。各染色的左下角的线表示20μm。
图22A示出了肝细胞球状体随时间推移的AFP分泌的图。y轴为ng/mg蛋白质/ml，并且以2,000的间隔从0计到12,000。x轴从左到右计为第23天、第30天、第44天和第50天。
图22B为示出肝细胞球状体随时间推移的ALB分泌的图。y轴为ng/mg蛋白质/ml，并且以100的间隔从0计到900。x轴从左到右计为第23天、第30天、第44天和第50天。
图23A为一组在第18天拍摄的、示出在三维肝细胞球状体中产生的CYP3A的三张照片。各染色的左下角的线表示20μm。
图23B为一组在第18天拍摄的、示出在三维肝细胞球状体中产生的CYP2D6的三张照片。各染色的左下角的线表示20μm。
图23C示出了CYP3A功能随时间推移的柱状图。y轴为RLU/mg蛋白质/ml，并且以100,000的间隔从0计到600,000。x轴从左到右计为第23天、第27天、第30天、第44天、第50天和第60天。
图23D示出了CYP2D6代谢功能的柱状图。左侧的柱为DMSO，而右侧的柱为BMS-827278。y轴为荧光度计数，并且以200,000的间隔从0计到1,600,000。BMS-827278细胞活性的降低与酶活性成正比。
发明详述
结合附图，可对本文所述的组合物和方法有更完整的理解。为了方便且易于理解本发明，这些图仅为示意性代表图，因此它们的意图不在于定义或限制示例性实施方案的范围。
尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语旨在仅用于表示被选择用来说明附图的实施方案的特定结构，并且不意味着定义或限制本公开的范围。在附图和下文中，应当理解相似的数字标记表示具有类似功能的组分。
本文所述所有的出版物、专利和专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
除非上下文另有明确规定，否则本文中的单数形式“一个”、“一种”和“所述”也包括复数形式。
如在说明书和权利要求中所使用的，术语“包含”可以包括“由......组成”和“基本上由......组成”的实施方案。本申请中使用术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”及其变体是开放式的过渡短语、术语或表达，其目的在于说明所述成分/步骤的存在，并允许存在其他成分/步骤。然而，这样的描述应解释为：也可将成分或方法描述为“由所列举的成分/步骤组成”和“基本上由所列举的成分/步骤组成组成”，其允许仅存在所述成分/步骤，以及可能由此产生的任何杂质，并排除其他成分/步骤。
本申请的说明书和权利要求书中的数值应理解为包括这样一类数值，即当其折合到相同位数的有效数字时是相同的数值，也包括这样一类数值，即其与所限定的数值的差距小于本申请中所描述的常规测量技术会产生的实验误差的值。
本发明公开的所有范围都包括引入的端点值，并可以单独组合(例如，“从2至10”的范围包括端点2和10以及所有的中间值)。
术语“约”可用于包括在不改变该值基本功能的情况下而变化的任何数值。当与范围联用时，“约”也公开了两个端点的绝对值所限定的范围，例如，“从约2至约4”也公开了“从2至到4”的范围。所述术语“约”可以指给定值加或减10％。
与本发明内容可能有关的一些公知的参考文献包括：Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Sambrook等人，1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press),GeneExpression Technology(Methods in Enzymology,Vol.185,D.Goeddel编著，1991.Academic Press,San Diego,Calif.),"Guide to Protein Purification"inMethods in Enzymology(M.P.Deutshcer编著，(1990)Academic Press,Inc.)；PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Innis等人，1990.Academic Press,San Diego,Calif.),Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,SecondEd.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,N.Y.),Gene Transfer and ExpressionProtocols，pp.109-128,E.J.Murray编著，The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.)，或者the Ambion1998Catalog(Ambion,Austin,Tex.)。
本文中所使用的术语“层粘连蛋白-521”是指通过将α5、β2和γ1链连接在一起形成的蛋白质。该术语应解释为包括重组层粘连蛋白-521和来自天然来源的异源三聚体层粘连蛋白-521。
本文中所使用的术语“层粘连蛋白-111”是指通过将α1、β1和γ1链连接在一起形成的蛋白质。该术语应解释为包括重组层粘连蛋白-111和来自天然来源的异源三聚体层粘连蛋白-111。
本文中所使用的术语“层粘连蛋白-221”是指通过将α2、β2和γ1链连接在一起形成的蛋白质。该术语应解释为包括重组层粘连蛋白-221和来自天然来源的异源三聚体层粘连蛋白-221。
术语“完整”是指蛋白质由α链、β链和γ链的所有结构域构成，由三条链连接在一起形成异三聚体结构。所述蛋白质不会分解为单独的链、片段或功能域。术语“链”是指层粘连蛋白的整条α、β或γ链。术语“片段”是指具有与另一分子或受体结合活性的任意一个、两个或三个功能结构域的蛋白质片段。然而，链不应该被认为是片段，因为每个链具有超过三个这样的结构域。类似地，完整的层粘连蛋白不应被视为片段。功能性结构域的例子包括域I、II、III、IV、V、VI和G结构域。
层粘连蛋白为主要存在于基底层中的异源三聚体糖蛋白家族。它们通过一侧与相邻的细胞受体进行结合而相互作用，并且与其他层粘连蛋白分子或其它基质蛋白(如胶原、巢蛋白或蛋白聚糖)结合而发挥作用。层粘连蛋白分子也是重要的信号分子，其能够强烈地影响细胞的行为和功能。层粘连蛋白对于维持细胞/组织表型，以及在组织修复和发育中促进细胞生长和分化是重要的。
层粘连蛋白是大的多结构域蛋白，其具有常见的结构组织。层粘连蛋白分子在一个分子中集合了不同的基质和细胞相互作用的功能。层粘连蛋白蛋白分子包含一个α链亚基、一个β链亚基和一个γ链亚基，这些亚基通过卷曲螺旋结构域结合在一起成为三聚体。在天然的组织中，12种已知的层粘连蛋白亚基链能够形成至少15种三聚体层粘连蛋白类型。三聚体层粘连蛋白结构中具有对其它层粘连蛋白和基底层分子以及膜结合受体有结合活性的可识别结构域。例如，VI、IVb和IVa结构域形成球状结构，V、IIIb和IlIa结构域(其含有富含半胱氨酸的类EGF元件)形成棒状结构。三种链的I和II结构域参与形成三股卷曲螺旋结构(长臂)。
已经发现存在于人组织中的五种不同的α链、三种β链和三种γ链具有至少15种不同的组合。基于它们的发现历史，这些分子被命名为层粘连蛋白-1至层粘连蛋白-15，然而另一种命名法则是根据它们的链的组成来描述这些同种型，例如层粘连蛋白-111(层粘连蛋白-1)，其包含α-1链、β-1链和γ-1链。已经确认了层粘连蛋白的四种结构确定的家族组。第一组的5种确认的层粘连蛋白分子均具有β1链和γ1链，它们的α-链组成(α1至α5链)有所不同。第二组的5种确认的层粘连蛋白分子(包括层粘连蛋白-521)均具有β2链和γ1链，它们的α-链组成也有所不同。第三组确认的层粘连蛋白分子具有一个确认的成员(层粘连蛋白-332)，其链组成为α3β3γ2。第四组确认的层粘连蛋白分子具有一个确认的成员(层粘连蛋白-213)，其具有新鉴定的γ3链(α2β1γ3)。
本公开涉及培养干细胞以得到行为更像原代肝细胞的分化的肝细胞的更有效的方法。具体而言，将干细胞在含有层粘连蛋白-521以及选自层粘连蛋白-111和层粘连蛋白-221中的第二层粘连蛋白的基底上培养。这使得相比于在含有细胞外基质的不明确和替代混合物的基底上生长的细胞，更多分化的肝细胞具有更自然的行为。
分化的细胞通常需要两种物质以生存和繁殖：(1)为细胞提供结构支持的基底或涂覆物；以及(2)为细胞提供营养的细胞培养基。基底或涂覆物(1)通常形成为容器(例如陪替氏培养皿)中或多孔板的孔中的层。不同的细胞培养基在适当时间间隔与含有两种层粘连蛋白的基底组合使用，从而获得具有更多天然功能/性质的成熟肝细胞。
可以与本文公开的方法和材料一起使用的干细胞为人多能干细胞。这样的干细胞可以包括诱导的多能干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、胎儿干细胞、羊膜干细胞以及通常任何多能干细胞。
首先，将干细胞接种到细胞培养基底上。该基底包含两种层粘连蛋白。第一层粘连蛋白为层粘连蛋白-521(LN-521)。第二层粘连蛋白为层粘连蛋白-111(LN-111)或层粘连蛋白-221(LN-221)。虽然在优选的实施方案中层粘连蛋白为完整的蛋白质，但是各层粘连蛋白可以为完整的蛋白质或蛋白质片段。
可以将干细胞接种在细胞培养基底的表面上以得到常规的单层培养物(即，二维的或2D)。在一些可选的实施方案中，在含有层粘连蛋白的细胞培养基底上接种后，可以将干细胞悬浮并重新接种以得到三维结构(3D)。可以(例如)使用悬浮法或通过使用可以控制球状体尺寸的微量培养板平台来得到3D球状体。例如，可以使用诸如聚(羟乙基甲基丙烯酸甲酯)(聚HEMA)或琼脂糖之类的基底来形成3D球状体。例如，琼脂糖含有控制聚集体可生长的尺寸的微孔。其他3D培养技术为本领域已知的。在低粘附培养板上的悬浮培养可以生成不同尺寸的异质聚集体群，例如50μm至500μm。
在具体的实施方案中，预期的是，基底中层粘连蛋白-521与层粘连蛋白-111/221的重量比为约1:4至约1:2，包括约1:4至约1:1(即层粘连蛋白-521少于层粘连蛋白-111/221)。具体而言，层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111激活α6β1整联蛋白，进而使PI3K/Akt通路的激活。这增强了分化的肝细胞的多能性、自我更新和/或增殖。许多不同的分子可以激活PI3K/Akt通路，尽管效率不同。例如，TGFβ1和bFGF激活该通路。使用层粘连蛋白-521或层粘连蛋白-111能够使这些分子在细胞培养基中的量减少。使用层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111允许以单细胞悬液方式传代而不需要加入对细胞不利的rho激酶(ROCK)抑制剂来提高单细胞酶解后的细胞存活率。
在一些实施方案中，细胞培养基底还可以包含钙粘蛋白。钙粘蛋白为一类1型跨膜蛋白，其在细胞粘合中发挥重要作用，确保组织内的细胞结合在一起。钙粘蛋白依赖于钙(Ca2+)离子而起作用。钙粘蛋白也被称为桥粒芯蛋白和桥粒胶蛋白。钙粘蛋白在结构上含有胞外Ca2+结合结构域。在具体的实施方案中，用于细胞培养基底中的钙粘蛋白为上皮钙粘蛋白或e-钙粘蛋白。两种层粘连蛋白与钙粘蛋白的重量比可以为约5:1至约15:1，或者约5:1至约10:1。
将细胞培养基底与多种细胞培养基组合使用以得到所需的肝细胞。使用四种不同的细胞培养基，将在下文对它们进行描述并且在本文中将它们称为mTeSR1、内胚层分化培养基、成肝细胞分化培养基和肝细胞成熟培养基。
如(Ludwig,T.E.,Bergendahl,V.,Levenstein,M.E.,Yu,J.,Probasco M.D.和Thomsom,J.A.(2006)；Feeder-independent culture of human embryonic stem cells；Nat Methods 8,637-646)所述制备mTeSR1培养基，但有几个例外。首先，使用重组人FGF碱性(R@DSystems)代替zbFGF。其次，将在已制备好的培养基中添加的胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂(Invitrogen)用作成分的来源，来代替文章中所述的方法。这购自Stem CellTechnologies(目录号05857)。
内胚层分化培养基包含RPMI 1640(Life Technologies目录号11875-093)和1XB27。可从Life Technologies获得不含维生素A的B27补充剂(目录号12587-010)。内胚层分化培养基中活化素A(Peprotech，目录号120-14E)的含量为约50ng/mL至约150ng/mL(包括约100ng/mL)。内胚层分化培养基中Wnt3a(R&D，目录号1324-WN/CF)的含量为约20ng/mL至约80ng/mL(包括约50ng/mL)。
成肝细胞分化培养基由77.5体积％的KO-DMEM(Life Technologies目录号10829-018)、20体积％的血清替代物(Life Technologies目录号10828-028)、0.5体积％的Glutamax(Life Technologies目录号35050-038)、1体积％的非必需氨基酸(LifeTechnologies目录号11140-035)、0.1mM的β-巯基乙醇(Life Technologies目录号31350-010)和1体积％的二甲基亚砜(Life Technologies目录号d5879)制成。
肝细胞成熟培养基由含有1％的Glutamax(Life Technologies目录号35050-038)的HepatoZYMETM培养基(Life Technologies目录号17705-021)制成。肝细胞成熟培养基中肝细胞生长因子(Peprotech，目录号100-39)的含量为约5ng/mL至约20ng/mL(包括约10ng/mL)。肝细胞成熟培养基中制瘤素m(Peprotech，目录号300-10)的含量为约10ng/mL至约30ng/mL(包括约20ng/mL)。最后，肝细胞成熟培养基中氢化可的松的浓度为约5微摩尔(μM)至约20μM(包括约10μM)。
回到图1，首先将干细胞接种到由如上所述的两种层粘连蛋白构成的细胞培养基底上，并用mTeSR1培养基饲养约1天至约3天。如果需要3D细胞结构，那么将干细胞重新接种以得到3D细胞结构。然后通过去除mTeSR1培养基并将内胚层分化培养基应用于接种的干细胞(2D或3D)来启动分化。将细胞在内胚层分化培养基中培养约60小时至约84小时(包括约72小时(即3天))的一段时间。可以定期更换培养基，例如每24小时。
接下来，去除内胚层分化培养基，并将成肝细胞分化培养基应用于接种的干细胞。将细胞在成肝细胞分化培养基中培养约108小时至约132小时(包括约120小时(即5天))的一段时间。可以定期更换培养基，例如每48小时。
接下来，去除成肝细胞分化培养基，并将成肝细胞成熟培养基应用于接种的细胞(2D或3D)。将细胞在成肝细胞成熟培养基中培养至少144小时(即6天)的一段时间。可以定期更换培养基，例如每24小时。这导致干细胞分化和成熟的总时间段为约14天，其分化为肝细胞。
或者，根据Avior方案对干细胞进行培养。Avior方案使用内胚层分化培养基、肝特化培养基、肝分化培养基和肝成熟培养基。下表确定了Avior方案中各培养基中所使用的所有成分：
Figure BDA0001714316350000141
Figure BDA0001714316350000151
Figure BDA0001714316350000161
在Avior方案中，在37℃和5％CO2下，将多能干细胞在潮湿的培养箱中培养直至细胞达到50％的汇合度。而且，干细胞在分化之前可以具有二维(2D)或三维(3D)结构。通过将干细胞暴露于内胚层分化培养基72小时来启动分化，每24小时用新鲜的培养基进行更换。72小时后，将细胞暴露于肝特化培养基4天，每24小时用新鲜的培养基进行更换。接下来，将细胞暴露于肝分化培养基5天，每24小时用新鲜的培养基进行更换。最后，将细胞暴露于肝成熟培养基4天，每24小时用新鲜的培养基进行更换，总共16天。
作为另一种选择方案，根据Cameron方案对干细胞进行培养。Cameron方案使用与上述三种培养基非常相似的内胚层分化培养基、成肝细胞分化培养基和肝细胞成熟培养基。下表确定了Cameron方案中各培养基中所使用的所有成分：
Figure BDA0001714316350000162
Figure BDA0001714316350000171
在Cameron方案中，在37℃和5％CO2下，将多能干细胞在潮湿的培养箱中培养直至细胞达到20％至30％的汇合度。而且，干细胞在分化之前可以具有二维(2D)或三维(3D)结构。通过将培养基更换为内胚层分化培养基来启动分化。在72小时的一段时间中，每24小时用新鲜的培养基进行更换。72小时后，将培养基更换为肝细胞分化培养基5天，每48小时更换一次。5天后，将培养基更换为肝细胞成熟培养基，每48小时更换一次直至第20天。细胞逐渐显示出从长而尖的和三角形的形状到呈现多边形外观肝脏特征形态的形态变化。
约14天后，可以通过标志物的表达来验证细胞的身份(即它们已分化成肝细胞)，标志物包括CYP3A4、CYP1A2、Oct4、Nanog、白蛋白、甲胎蛋白(AFP)、FOXA2、HNF4A、SOX17、CK19和CYP2D6。然后将肝细胞备以用于所需的用途。
由细胞培养基底和各种细胞培养基形成的细胞培养体系非常有效地用于在成分完全确定的环境以及无饲养细胞或任何细胞凋亡抑制剂的不含异源物的条件下由干细胞生成肝细胞。值得注意的是，Cameron方案生成的肝细胞通常比Avior方案生成的肝细胞更稳定，因为它们具有更长时间的细胞色素P450 1A2和3A活性(10天相对于1-2天)。预期的是，细胞培养体系的成分完全确定且不含异源物。该体系(即基底和任意细胞培养基)也应该没有任何分化抑制剂、饲养细胞或分化诱导物或细胞凋亡抑制剂。饲养细胞的实例包括小鼠成纤维细胞或人包皮成纤维细胞。分化诱导物的实例包括Noggin或角质形成细胞生长因子。
以下实施例为了进一步解释本公开。这些例子仅仅是示例性的，并非旨在将根据本公开制成的装置限制于所述材料、条件、工艺参数。例子
实施例1
细胞培养
将H9人胚胎干细胞(hESC)在潮湿的37℃、5％CO2的培养箱中培养并维持。然后在96孔板中制备三种不同的基底。用Matrigel(MG)预涂覆第一种基底，并用作对照。用5微克/平方厘米(μg/cm2)的层粘连蛋白-521(LN-521)涂覆第二种基底。用5μg/cm2的重量比为1:3的层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111的混合物(Biolamina，瑞典)涂覆第三种基底(本文缩写为LN-111)。
通过将不含血清的mTESR1培养基(Stem Cell Technologies)更换为内胚层分化培养基，在40％汇合度时启动分化，该内胚层分化培养基为含有1x B27(LifeTechnologies)、100ng/mL的活化素A(PeproTech)和50ng/mL的Wnt3a(R&D)的RPMI 1640。在72小时中，每24小时更换培养基。在第4天，将内胚层分化培养基更换为成肝细胞分化培养基，并且在之后的五天中，每隔一天更换培养基。这五天的培养基由KO-DMEM(LifeTechnologies)、血清替代物(Life Technologies)、0.5％的Glutamax(LifeTechnologies)、1％的非必需氨基酸(Life Technologies)、0.2％的β-巯基乙醇(LifeTechnologies)和1％的二甲基亚砜(Sigma)构成。在第9天，将分化的细胞在补充有10ng/mL的肝细胞生长因子(Peprotech)和20ng/mL的制瘤素m(Peprotech)的含有1％的Glutamax(Life Technologies)的肝细胞成熟培养基HepatoZYME(Life Technologies)中培养。
根据供应商Life Technologies的说明书，将冷冻的人肝细胞接种并维持。简言之，将冷冻的肝细胞在解冻培养基(Life Technologies，目录号CM3000)中复苏，并接种在预涂覆的96孔板上。细胞有效地附着到所有基质，并将其在设定为37摄氏度并且CO2水平设定为5％的培养箱中维持。在接种后24小时，将培养基更换为孵育培养基(目录号CM4000)。
图1包含四行以说明分化方案。最上面的A行包含一组相差图像，其提供了各阶段期间细胞的代表性视野。B行列出了在各分化阶段存在的细胞类型(即，多能干细胞、定形内胚层、肝祖细胞和肝细胞样细胞)。C行列出了方案的各阶段所使用的生长因子/分子和培养基。D行指示分化方案的各阶段的时间。最后阶段(肝细胞成熟)可以延续超过11天。
方法
使用Trizol试剂从细胞中分离总RNA。使用Nanodrop系统对RNA定量和质量进行评估。将Life Technologies Superscript III逆转录试剂盒用于制备cDNA。用Taqman FastAdvance Mastermix和适当的引物对进行定量PCR，并使用Roche LightCycler 480实时PCR系统进行分析。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)对基因表达进行归一化并表示成相对于对照样品(分化第0天的hESC)的相对表达。将定量PCR一式三份进行。使用Roche LightCycler480软件(1.5版本)进行数据分析。通过统计学函数student t-检验来测量显著性水平，其中有效值为p值小于0.05的值。
随后对hESC衍生的肝细胞进行免疫细胞化学分析。在-20℃下，将细胞培养物在100％的冰冷的甲醇中固定30分钟，并在室温下将相邻的细胞用PBS缓冲液预洗涤两次。将细胞单层用含有10％牛血清白蛋白的0.1％的PBS-吐温溶液封闭1小时。随后，在4摄氏度下将单层细胞与用PBS-0.1％吐温/1％BSA稀释的一抗孵育过夜。24小时后，除去一抗，并用PBS-0.1％吐温/1％BSA将固定的单层细胞洗涤三次。在室温下将细胞与在PBS-0.1％吐温/1％BSA中稀释的合适的二抗孵育1小时，并用PBS洗涤三次。然后将培养物用PermaFluorTM水性封固剂固定，并用NucBlue Hoescht 33342复染。用配有LD PlanNeoFluar物镜的ZeissAxio Observer Z1显微镜对细胞进行成像，并将Zeiss AxioCamMR3相机用于图像采集。通过Zeiss Axiovision SE 64Rel 4.8对图像进行处理，并使用Zeiss Axiovision4.9.1.0版本进行分析。从至少5个随机视野估算阳性细胞的百分比和标准偏差。
分化前
图2为一组放大倍率为10倍的、组织成三列和四行的12张显微镜照片。最左侧的列为MG基底，中间的列为LN-521基底，最右侧的列为LN-511基底。A行为一组分化开始之前在三种不同基底上的多能干细胞形态的相差图像。B行为一组显微镜照片，其示出了分化开始前在三种不同基底上的八聚体4(OCT4)的免疫荧光染色。C行为一组显微镜照片，其示出了分化开始前在三种不同基底上的Nanog蛋白质的免疫荧光染色。D行为一组显微镜照片，其示出了兔、鼠和羊抗血清的免疫球蛋白G对照染色。
在所有三种基底上的细胞粘附、增殖并分化成肝细胞样细胞(HLC)。重新接种之后24小时后，如图1的A行、B行和C行所示，ESC显示了适当的特征性细胞形态，包括干细胞相关标志物OCT4和Nanog的适当的表达水平，在各基底上有细微差异。在显微镜照片上还可以看到基底中OCT4和Nanog的表达水平，并将其列于下表中。
Figure BDA0001714316350000201
Figure BDA0001714316350000211
分化分析
重新接种之后24小时，使用不含血清的步骤启动分化。在分化过程中收集细胞提取物，并在第0天、第3天、第9天和第18天评估mRNA。值得注意的是，如通过定量PCR所证实的，所有分化步骤都实现了使细胞群通过定形内胚层从多能性转变为成肝细胞样细胞并随后转变为肝细胞。需要提醒的是，“LN-511”标注是指包含重量比为1:3的层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111的混合物的基底。
图3为一组六幅柱状图，示出了分化期间在三种基底(MG、LN-521和LN-511)上的六种不同基因的基因表达，其名称在各图上方。用管家基因GAPDH对基因表达进行归一化。如图所示，在所有基底上，多能性标志物OCT4和Nanog随时间推移而减少。在所有基底上，内胚层相关基因FOXA2在第3天达到峰值，之后减少。甲胎蛋白(AFP)的表达在所有基底上各不相同。在MG基底和LN-521基底上的细胞在表达中遵循同样的趋势，在第9天达到峰值，然后在第18天减少。相反地，在LN-111基底上的细胞的AFP表达随时间推移而逐渐增加，在第18天达到峰值。在第3天，在所有基底上均检测到HNF4A，但到第9天时，在表达模式上出现了显著的差异。在MG和LN-521基底上，HNF4A在第9天最高，在第18天减少，而在LN-511基底上，HNF4A表达在第18天显著增加。在重复实验之间观察到HNF4A基因表达的变化，但是这似乎不影响下游分化并且不体现在HNF4蛋白水平中。在所有基底上，白蛋白(ALB)的表达从第9天开始上调。在LN-511基底上，从第9天到第18天看到了白蛋白水平的最大增量(约10,000倍)，这相比于MG和LN-521基底(两者均为p<0.001)是显著的。
成肝细胞特化
接下来，测定分化过程的效率。图4为一组生长在三种不同基底上的内胚层细胞和肝细胞在分化的第3天的15张显微镜照片(放大倍率为10倍或20倍(以标度表示))。将显微镜照片组织成三列，每种基质(MG、LN-521和LN-111)一列，并分成五行，每种标志物(FOXA2、SOX17、AFP、HNF4A和细胞角蛋白19(CK19))一行。下表列出了每种标志物的阳性细胞百分比和标准偏差。
基底 FOXA2 SOX17 AFP HNF4A CK19
MG 82.8％±2.1 74.8％±8.3 90.8％±1.1 88.5％±2.5 96.8％±2.0
LN-521 80.4％±3.5 92.6％±1.8 98.3％±0.9 86.4％±2.3 98.5％±1.0
LN-111 88.1％±2.3 87.2％±6.9 95.3％±2.0 85.9％±1.8 97.2％±1.5
在第3天，在所有基底上均表达了FOXA2。大部分细胞在MG、LN-521和LN-111基底上。三种基底间的SOX17染色更为不同；它在MG上最低，而在LN-521上最高。随着细胞分化的进行和对肝的命运的确定，细胞开始表达高水平的成肝细胞标志物。在所有三种基底上，在大部分细胞中表达了AFP、HNF4a和CK19。所有三种基底上的肝细胞特化表现相当并且高效，并且在三种基底上观察到的hESC形态的初始差异似乎不影响使用该方法的动力学或细胞分化效率。然而，在LN-521和LN-511基底上分化的肝细胞中观察到细胞尺寸增加了约2倍(参见CK19显微镜照片)。如图所示，在所有三种基质上的肝细胞特化表现相当并且高效。在三种基质上观察到的hESC形态的任何初始差异似乎都不影响动力学、效率或细胞分化。
肝细胞成熟
成肝细胞特化之后，细胞培养物向肝细胞分化。通过对白蛋白(ALB)、E-钙粘蛋白(E CAD)、细胞增殖标志物(Ki67)、细胞色素p450 2D6(CYP2D6)和细胞色素p450 3A4(CYP3A4)的免疫染色来对肝细胞特化进行评估。
图5为一组在分化第18天的肝细胞的九张显微镜照片。将显微镜照片组织成三列，每种基质(MG、LN-521和LN-111)一列，并分成三行，每种标志物(ALB、E CAD和Ki67)一行。下表列出了每种标志物的阳性细胞百分比和标准偏差。
基底 白蛋白 E CAD Ki67
MG 91.6％±0.7 76.5％±0.7 29.8％±3.7
LN-521 89.5％±8.7 67.4％±4.4 17.4％±6.2
LN-511 91.3％±4.0 73.7％±3.7 15.9％±6.6
观察到matrigel和层粘连蛋白群之间的蛋白质生成的相似模式。在所有三种基底上的细胞中均检测到白蛋白染色，在MG基底上表达量最高，而在LN-521基底上表达量最低。E-钙粘蛋白(E CAD)在调节肝细胞与细胞接触和涉及细胞空间调节方面是重要的。在MG和LN-111基底上表达最高。然而，在LN-521基底上观察到具有较亮染色的色点。虽然免疫染色研究示出了细胞群之间的等同性，但在不同的基底上观察到了细胞分裂的差异，与LN-521和LN-111基底相比，在MG基底上增殖的细胞更多。
肝细胞功能
鉴于细胞组织和细胞分裂是肝细胞功能的重要因素，因而研究了在体外的肝细胞代谢能力。首先使用充分表征的抗血清来检测由干细胞衍生的肝细胞的细胞色素P450的表达。从第16天至第26天，使用pGlo技术来测量CYP3A活性和CYP1A2活性。将CYP活性表示成每毫克蛋白质每毫升培养基的相对光单位(RLU)。通过student t-检验来测量显著性水平。
图6为一组肝细胞中基因表达的六张显微镜照片和两幅柱状图。将显微镜照片组织成三列，每种基底(MG、LN-521和LN-111)一列，并分成两行，每种标志物(CYP2D6和CYP3A4)一行。下表列出了每种标志物的阳性细胞百分比和标准偏差。
基底 CYP2D6 CYP3A
MG 84.4％±2.1 95.4％±2.6
LN-521 85.7％±5.7 91.3％±3.7
LN-111 82.5％±5.0 90.6％±2.9
在各基底上，所有细胞均表达出高水平的各标志物。如两幅柱状图所示，虽然蛋白质表达量似乎相当，但干细胞衍生的肝细胞CYP功能变化显著。在LN-111基底上，CYP1A2活性随时间推移而增加，并且在所有时间点均显著高于MG基底的CYP1A2活性。在层粘连蛋白-521上，CYP1A2活性提高，并且总是显著高于对照组的活性。在第26天，两种层粘连蛋白基底上的细胞均显示出比培养中的原代人肝细胞(由虚线表示)显著更多的CYP1A2功能。在LN-111基底上，CYP3A功能增加高达25倍。相对于MG对照基底上的细胞和原代肝细胞，两种层粘连蛋白基底上的细胞显示出显著增加的代谢功能。
为了确定代谢能力的这些巨大变化是否与增加的蛋白质生成相关，因而使用市售的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对由hESC衍生的肝细胞和冷冻肝细胞所产生的白蛋白和甲胎蛋白(AFP)进行定量。在hESC分化期间的第20天至第26天，在指定的时间点收集不同的培养基。在接种到市售培养基或经层粘连蛋白涂覆的表面之后24小时，收集原代肝细胞培养基底。将样品制成一式三份，并在FLUOStar Omega多模式酶标仪上测量。将蛋白质生成表示为ng或μg蛋白质/毫克蛋白质/毫升培养基。结果示于图7中，其中在分化的第20天、第22天、第24天和第26天测量这两种蛋白质的表达。尽管代谢能力有巨大变化，但通过ELISA未检测到白蛋白或AFP分泌的显著差异。因此，可以假设，任何差异都很可能是由于在基底上的细胞组织的差异造成的。
功能性组织
图8为一组来自分化的第24天的九张显微镜照片。将显微镜照片组织成三列，每种基质(MG、LN-521和LN-111)一列，并分成三行。
显微镜照片的最上面一行(A)示出相差图像。在LN-521和LN-111基底上培养的干细胞衍生的肝细胞显示出更多原代肝细胞样的外观，通常具有核区非常明显的双细胞核。相差图像还表明在培养皿内肝细胞在小叶状结构中排列，从而使人联想到再生肝。
中间一行(B)示出了MRP1和HNF4a的共免疫染色。在这些小叶结构周围，检测到MRP-1(一种重要的基底膜标志物)的阳性染色。只有在LN-521和LN-111基底上分化的肝细胞在体外表现出有组织的肝细胞网络。这与显示更多的个别和点状染色的MG基底上的细胞形成了鲜明的对比。
为了确定这些细胞是否能够流出胆汁，用5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(CDFDA)对细胞进行处理，CDFDA被代谢为荧光性CDF并且经由多药耐药性相关蛋白2(MRP2)而流出。将hESC衍生的肝细胞与2μM的5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(CDFDA)一起孵育30分钟。然后用含有钙和镁的冰冷的PBS洗涤培养物。将细胞收集用于成像或保存用于流出的定量。对于荧光定量，更换肝成熟培养基，并将细胞在37摄氏度下孵育30分钟。通过荧光光谱法，使用FLUOStar Omega多模式酶标仪在485/585nm处测量CDFDA从细胞向培养基中的流出。
结果示于显微镜照片的最下面一行(C)中。值得注意的是，细胞组织与相对于MG基底，在LN-521和LN-111基底上分化的细胞中更为活跃的胆汁流出相对应。
全基因组分析
上文讨论的结果证明在层粘连蛋白上，干细胞向肝细胞的分化得到改善。为了理解哪些基因调控网络支持这一点，进行了广泛且公正的生物信息学分析。为此目的，使ESC在MG、LN-521和LN-511基底上进行分化。应该记住，“LN-511”标记是指包含重量比为1:3的层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111混合物的基底。应用标准分化方案并对三个独立实验的全基因组表达谱进行分析。将数据与先前的研究(Godoy等,J.Hepatol.,2015年5月25日,pii:S0168-8278(15)00340-2,doi:10.1016/j.jhep.2015.05.013)进行比较，先前的研究使用了新鲜分离的原代人肝细胞(FH)、ESC和
Figure BDA0001714316350000251
-分化的肝细胞样细胞(HLC、D17和D21)。然后将这些数据与MG、LN-521和LN-511基底(分别为D24、L521和L111)的干细胞衍生的肝细胞进行比较。
图9A为通过CellNet生成的主成分分析，分析了在市售培养基中分化的第17天、第21天和第24天以及在LN-521和LN-511基底上分化的第24天时，在ESC、FH和HLC中变异最高的1,000个基因。结果表明，层粘连蛋白引导的分化将产生的HLC转移至新鲜肝细胞(FH)。本研究中差异表达的基因的数目(MG和LN-521基底之间为556，MG和LN-111基底之间为664，经FDR校正)可被认为是较多的。
图9B示出了从新鲜分离的原代人肝细胞(FH)、ESC和三种不同基底中对照基底分化的肝细胞样细胞(HLC)中的基因表达谱得到的基因调节网络状态。最左侧的ESC、结肠和肝脏的训练分数用深蓝色表示，并代表各细胞/组织的最大分数。根据最大细胞/组织特异性分数来计算所查询样品的分数(浅蓝色)。可以看到，与MG分化分数相比，LN-521和LN-111分数中的GRN-ESC分数显著降低。在两种层粘连蛋白中，LN-111基底显示出比LN-521基底显著更强的效果。层粘连蛋白和MG HLC之间的GRN-结肠分数也显著降低。LN-111基底再次显示出比LN-521基底显著更强的效果。与期望的对GRN-ESC和GRN-Colon分数的抑制相比，层粘连蛋白基底相比于对照MG基底的GRN-肝脏分数没有显著改善。该结果与单个肝脏基因(HNF4a，图3中的白蛋白)得到的数据形成对照，单个肝脏基因得到的数据示出了相比于MG基底，层粘连蛋白基底的HLC的明显增加。这种差异表明了，比较全基因组趋势与单个的人工挑选的基因以避免误解的重要性。
图9C为一组使用Godoy 2015参考文献中公开的模糊聚类技术得到三种超级簇后生成的图表。将在肝细胞样细胞中具有相似表达模式的基因分组为与三种不同的功能相关的三种超级簇：成熟的肝功能(I行和II行)；增殖(III行)和细胞外基质(ECM)/迁移(IV行和V行)。对于各单独的基因簇图表(例如，簇2＝528个基因)，绘制六个不同的样品以示出各基因的表达水平。在各基因簇图表中，第一个点(从左侧开始)代表人胚胎干细胞(hESC)，第二个点为17天后在MG基底上生长的干细胞衍生的肝细胞样细胞(HLC)；第三个点为21天后在MG基底上生长的干细胞衍生的HLC；第四个点为24天后在MG基底上生长的干细胞衍生的HLC；第五个点为24天后在LN-521基底上生长的干细胞衍生的HLC；第六个点为24天后在LN-111混合基底上生长的干细胞衍生的HLCs。例如，对于I行，基因簇2＝528个基因，相比于24天后在LN-521基底上生长的干细胞衍生的肝细胞样细胞的表达水平(约0)，hESCs的表达水平极低(约-1.75)。下表中列出了这些大概的表达水平结果的表格，簇名称后面的括号中列出了行号。图9C中还列出了与基因相关的生物基序、代表性基因的选择、代表性转录因子的选择和转录因子结合位点的选择。如各图中所示，在所有三种增殖相关的簇中，层粘连蛋白导致对HLCs中的基因表达的抑制显著强于对照培养基。
Figure BDA0001714316350000271
Figure BDA0001714316350000272
Figure BDA0001714316350000273
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Figure BDA0001714316350000292
Figure BDA0001714316350000293
Figure BDA0001714316350000294
Figure BDA0001714316350000301
在HLC中具有相似表达模式的基因的簇产生三种超级簇，代表“成熟肝功能”基序、“增殖”基序和“细胞外基质(ECM)/迁移”基序。KEGG和GO基序在各基因簇中过表达。表中还指出了各簇和各基序的代表性基因。与对照MG基底相比，在LN-111基底上的HLC中簇V的斜体列出的基因在HLC中以较低水平表达。在对应于超级簇“增殖”的簇5、簇10和簇6中，观察到对照MG基底和LN-521以及LN-111基底之间的平均基因表达水平的差异显著。在所有三种增殖相关簇中，层粘连蛋白基底导致了比MG基底明显更强的抑制(簇III和簇IV；图7c)。在“成熟肝功能”簇内，相比于对照
Figure BDA0001714316350000303
MG基底，可以认为层粘连蛋白基底使若干单个基因能够得到较高的表达，例如，补体成分3(C3)、补体因子I(CF-1)、血纤维蛋白溶酶原(PLG)和FXR(NR1H4)(补充表X)，但作为基因簇没有显著的差异。
图10为一组表明了原代人肝细胞代谢和蛋白质产生的四幅柱状图。将来自男性和女性的原代人肝细胞(PHH)接种在MG、LN-521和LN-111基底上，并在48小时后检测其代谢能力。在男性(黑色柱)和女性(白色柱)PHH两者中，相对于对照MG基底，含有层粘连蛋白的基底上的CYP1A2和CYP3A活性增加。通过ELISA分析PHH白蛋白和甲胎蛋白的分泌。未产生可检测水平的甲胎蛋白，并且在女性PHH中的LN-521基底上，提高了白蛋白生成。
讨论
对三种不同的基底进行检测，一种为对照
Figure BDA0001714316350000302
基底，另两种含有层粘连蛋白。虽然在三种基底上产生了相似数量的干细胞衍生的肝细胞，但是在它们的细胞结集、组织和功能中观察到明显的差异。通过使用两种层粘连蛋白亚型模拟肝细胞生态位的关键要素，使肝细胞分化得到显著改善，从而显著增强了细胞组织和功能。值得注意的是，当在层粘连蛋白上培养干细胞衍生的肝细胞时，CYP1A2和CYP3A功能等同于或优于原代人肝细胞，并且它们可在数日内的培养中保持稳定。通过MRP1染色证实了两种层粘连蛋白上增强的肝细胞组织，并使CDFDA的微管分泌(canalicular excretion)得到改善，从而表明了干细胞衍生的肝细胞的体外成熟特征
这些观察结果与在含有层粘连蛋白的基底上分化的细胞群中较好的肝细胞组织和CYP P450活性相一致。鉴于层粘连蛋白在肝脏生物学中的不同作用，将研究扩展到当前的黄金标准来源，即来自男性和女性供体的原代肝细胞。值得注意的是，正如在hESC肝细胞中所观察到的，层粘连蛋白涂覆的表面更好地支持了CYP p450活性，但没有显著改善白蛋白分泌。
由于相比于
Figure BDA0001714316350000313
当使用层粘连蛋白基底时，一些选定的肝脏标志物的分析结果表明肝脏分化的改善，因而进行了全基因组表达分析。第一个目的是回答不同的基底/基质是否会引起全基因表达的显著改变或仅引起微小改变。先前的研究已经表明，基质的类型可以引起主要的表型改变，如细胞极性和细胞凋亡敏感性的差异。考虑到本研究中差异表达的基因的数目(
Figure BDA0001714316350000311
和LN-521基底之间为556，Matrigel和LN-111混合基底之间为664，经FDR校正)，可以认为差异是主要的。可以得出结论，相比与于
Figure BDA0001714316350000312
对照基底，含有层粘连蛋白的基底具有三种特定的特征。第一，更为有效地抑制干细胞特性基因的表达，使层粘连蛋白上的干细胞标志物LIN28A和c-kit减少了四倍。第二，层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111的混合物更为有效地抑制增殖相关的基因表达。第三，通过层粘连蛋白-111改善目前使用的肝细胞分化方案的固有的副作用，即诱导不需要的结肠相关和成纤维细胞相关的基因表达。因此，全基因组分析清楚地确认了在含有层粘连蛋白的基底上分化的HLs的改善。重要的是，可以确定在存在层粘连蛋白-111的情况下，一些单个基因使肝细胞分化得到改善。例如，相比于
Figure BDA0001714316350000321
基底，在含有层粘连蛋白-111的基底上的C3、触珠蛋白、血纤维蛋白溶酶原和转录因子FXR增加了至少2倍。
本发明的结果显示了重组层粘连蛋白在干细胞衍生的肝细胞的分化和代谢功能方面的支持性特性。hESC衍生的肝细胞在人层粘连蛋白上显示出改善的形态、组织、稳定性和细胞功能，其与男性和女性原代肝细胞相当。
实施例2
在三种不同的基底上由人胚胎干细胞产生干细胞衍生的肝细胞。第一种基底为纯的层粘连蛋白-521(LN-521)。第二种基底为层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-221的重量比为1:3的混合物(221(1:3))，即层粘连蛋白-221更多，为层粘连蛋白-521的三倍量。第三种基底为层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-221的重量比为1:1的混合物(221(1:1))。在第18天，将细胞固定并对多药耐药性蛋白1(MPR1)进行染色。
图11示出了三种基底的显微镜照片。相比于接种在LN-521或221(1:1)基底上的细胞，接种在221(1:3)基底上的细胞表现出更复杂的组织构成。如图12所示，这也与细胞功能相对应。与其他两种基底相比，重新接种在221(1:3)基底上的干细胞衍生的肝细胞在功能方面更有优势。
实施例3
在三种不同的基底上由人胚胎干细胞生成干细胞衍生的肝细胞。第一种基底为纯的层粘连蛋白-521(LN-521)。第二种基底为层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-221的重量比为1:3的混合物(221(1:3))。第三种基底为层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-221的重量比为1:1的混合物(221(1:1))。对Cameron方案和Avior方案进行相互比较。
图13为一组示出两种步骤的肝细胞功能的两幅柱状图。特别地，Avior方案声称两种诱导成分(维生素K(MK4)和石胆酸(LCA))的使用可以显著改善肝细胞分化。使用MK4和LCA两者都没有观察到上述益处。
相比于接种在LN-521或221(1:1)基底上的细胞，接种在221(1:3)基底上的细胞表现更好。值得注意的是，当测量成人肝细胞功能(CYP1A2)时，通过Cameron方案得到的干细胞衍生的肝细胞表现优于通过Avior方案提供的干细胞衍生的肝细胞。当测量胎儿和成人肝功能(CYP3A)时，Avior方案表现出更好的性能。使用Avior方案，LCA和MK4引起对干细胞衍生的肝细胞的主要毒性作用，导致细胞在第18天死亡。通常，干细胞衍生的肝细胞在分化过程的27天中显示出功能和活性，从而表明当与Avior方案相比时，Cameron方案在体外产生更稳定的肝细胞和成人样细胞群。
实施例4
将MAN12细胞(一种GMP等级细胞系)接种在三种不同的基底上。第一种基底为作为对照的
Figure BDA0001714316350000331
(MG)。用5微克/平方厘米(μg/cm2)的层粘连蛋白-521(LN-521)涂覆第二种基底。用5μg/cm2的重量比为1:3的层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111的混合物(Biolamina，瑞典)(本文缩写为LN-111)涂覆第三种基底。然后根据Cameron方案对细胞进行分化。
图14为一组放大倍率为10倍的、在分化的第24天拍摄的15张显微镜照片，组织成三列和五行。最左侧的列为MG基底，中间的列为LN-521基底，最右侧的列为LN-111基底。A行为一组形态相差图像。标度为200μm。B行为一组显微镜照片，示出了在三种不同的基质上白蛋白(ALB)的免疫荧光染色。C行为一组显微镜照片，示出了细胞色素P450 3A(CYP3A)的免疫荧光染色。D行为一组显微镜照片，示出了多药耐药性蛋白1(MRP1)的免疫荧光染色。E行为一组显微镜照片，示出了羊、鼠和兔抗血清的免疫球蛋白G对照染色。
图15为一组四幅柱状图。第一行的两幅图示出了在分化的第24天通过ELISA分析的对于甲胎蛋白和白蛋白的肝细胞蛋白质分泌(n＝3)。在三种基质中没有观察到显著的差异。第二行的两幅图示出了在第18天、第20天和第24天，对于CYP1A2和CYP3A活性的CYPp450活性的代谢功能。下表列出了两种标志物的阳性细胞百分比和标准偏差。
基底 ALB CYP3A
MG 87.5％±4.8 87.5％±4.8
LN-521 83.3％±8.5 81.5％±8.6
LN-511 88.8％±6.0 80.2％±3.1
实施例5
将MAN11细胞(另一种GMP等级细胞系)接种在三种不同的基底上。第一种基底作为对照的为
Figure BDA0001714316350000341
(MG)。用5微克/平方厘米(μg/cm2)的层粘连蛋白-521(LN-521)涂覆第二种基底。用5μg/cm2的重量比为1:3的层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111的混合物(Biolamina，瑞典)(本文缩写为LN-111)涂覆第三种基底。然后根据Cameron方案对细胞进行分化。
图16为一组放大倍率为10倍的15张显微镜照片，组织成三列和五行。最左侧的列为MG基底，中间的列为LN-521基底，最右侧的列为LN-111基底。A行为一组形态相差图像。标度为200μm。B行为一组显微镜照片，示出了在三种不同的基底上白蛋白(ALB)的免疫荧光染色。C行为一组显微镜照片，示出了细胞色素P450 3A(CYP3A)的免疫荧光染色。D行为一组显微镜照片，示出了多药耐药性蛋白1(MRP1)的免疫荧光染色。E行为一组显微镜照片，示出了羊、鼠和兔抗血清的免疫球蛋白G对照染色。所有这些照片均在第18天拍摄。下表列出了两种标志物的阳性细胞百分比和标准偏差。
基底 ALB CYP3A
MG 89.2％±7.3 85.5％±8.1
LN-521 89.2％±6.0 90.8％±9.9
LN-511 89.7％±5.5 89.5％±5.5
图17为一组四幅柱状图。第一行的两幅图示出了在分化的第18天通过ELISA分析的对于甲胎蛋白和白蛋白的肝细胞蛋白质分泌(n＝3)。在LN 521(p＝2.01091E-06)和LN111(p＝1.20688E-06)两者上均观察到甲胎蛋白(AFP)显著降低。在LN 521上，白蛋白显著增加(p＝1.23378E-05)。第二行的两幅图示出了在第18天，对于CYP1A2和CYP3A活性的CYPp450活性的代谢功能。在三种基质中没有观察到显著的差异。
参照实施例4和实施例5两者，如通过免疫染色所检测的，MAN11和MAN12细胞在所有三种基底上有效地分化，大部分细胞(>80％)表达白蛋白和CYP3A。在三种基底上也表现出相同水平的细胞组织，尽管在含有层粘连蛋白的基底上的细胞结构在形态上更明确并显示出明显的六角形的形态。此外，在LN-521和LN-111基底上的HLC显示出MRP1染色的网络；表明这些细胞群更为极化。值得注意的是，与MAN11和MAN12衍生的肝细胞相比，H9衍生的肝细胞显示出更接近原代肝细胞的代谢特征。然而，LN-521和LN-111基底两者均提高了MAN12衍生的肝细胞的代谢活性，并显著降低了MAN11衍生的肝细胞中的胎儿蛋白质分泌，从而表明了显著的进步。
实施例6
多能干细胞向肝细胞的分化。
将在用纯的层粘连蛋白-521涂覆的孔上培养的hESC解离成单细胞，并重悬于补充有ROCK抑制剂的mTeSR1中。为制备尺寸随机的球状体，将2ml的1×106的细胞悬浮液转移到用聚羟乙基甲基丙烯酸甲酯(聚HEMA)涂覆的6孔板中，并在静置条件下孵育过夜(图18A)。用聚-HEMA涂覆板以形成超低/非粘附性表面，其促使悬浮培养中细胞的自聚集并形成球状体。为了制备尺寸均匀的球状体，将190微升(μl)的1×106、2×106和4×106/ml的细胞悬浮液添加到预先形成的琼脂糖微孔板中并孵育过夜，以分别形成直径为50μm至100μm(图18B)、直径为100μm至150μm(图18C)和直径为150μm至200μm(图18D)的球状体。与悬浮培养相似，琼脂糖模具提供了非粘附性的表面，其促使细胞在单个孔中自聚集，然而，可以通过改变接种密度来控制球状体的尺寸。图18E比较了尺寸范围。重新接种后24小时，使用不含血清的逐步步骤启动分化，从而由H9和Man12细胞系衍生肝细胞样细胞。
基因表达分析
为了分析基因表达，在指定的时间点收集球状体并提取mRNA。如通过定量PCR所证实的，两种步骤均由H9(研究用等级细胞系)和Man12(GMP等级细胞系)得到细胞群，该细胞群通过定形内胚层从多能性转变为成肝细胞样细胞并随后转变为肝细胞。从第3天至第18天，检测到FOXA2表达(图19A)。在第8天以峰值检测到HNF4A的高水平表达，并且随着细胞在培养中成熟而下降(图19B)。甲胎蛋白(AFP)的表达在分化的第8天上调，并在第18天达到表达的峰值(图19C)。在第8天检测到低水平的白蛋白(ALB)，随后在第18天显著增加(图19D)。
人胚胎干细胞衍生的肝细胞球状体的成熟
为了评估3D肝细胞球状体的成熟，在第18天对诸如肝核因子4A(HNF4A)和E-钙粘蛋白(Ecad)之类的肝标志物的表达进行染色(图20A)。在图20B中，随后在第30天对成熟的肝细胞标志物白蛋白(绿色)和HNF4a(橙色)进行免疫染色。ZO-1为细胞极性的重要标志物，并且在大的和小的肝细胞球状体中检测到细胞-细胞接触(图21)。值得注意的是，与较大的肝细胞球状体相比，在较小的肝细胞球状体内观察到数量较少的细胞表达Ki67(细胞增殖的标志物)(图21)。为了评价肝特异性蛋白质的分泌水平，通过ELISA测定AFP和ALB水平。结果表明，AFP的生成随着肝细胞球状体的进一步成熟而降低，并且在分化的第44天下降到检测极限以下，然而ALB的生成则持续直至第50天(图22A和图22B)。
人胚胎干细胞衍生的肝细胞代谢功能
为了评估人干细胞衍生的肝细胞的代谢能力，使用抗血清检测细胞色素P450的表达。在整个3D肝细胞球状体内均检测到CYP3A和CY2D6的表达(图23A和图23B)。此外，对肝细胞球状体的P450功能性进行评价。CYP3A功能在至少33天的培养中得到认可和维持(图23C)。此外，使用被称为BMS-827278的药物化合物测定Cyp2D6代谢功能。该化合物被代谢活化成有毒的最终产物，因此细胞活性(橙色柱)的降低与酶活性成正比(图23D)。
人胚胎干细胞衍生的肝细胞的体内功能
为了评估二维(2D)和三维(3D)干细胞衍生的肝细胞支持小鼠肝功能的能力，采用肝功能降低的部分肝切除模型。将2百万个2D或3D肝细胞分别移植到门静脉内或腹腔内。对于2D细胞，移植后48小时进行30％的部分肝切除术。对于3D细胞，在进行肝切除的同时将细胞移植到腹膜中。记录部分肝切除之后7天的小鼠体重。与仅使用赋形剂的对照组相比，两个移植组的体重都显著增加。对照组约为初始体重的91％，而2D组约为初始体重的95％，并且3D组约为初始体重的100％。
我们已经开发了3D系统以衍生具有稳定表型的功能性肝细胞样细胞。这两种方案均使得由培养的hPSC有效地产生球状体并在层粘连蛋白521上维持，然而，使用悬浮方法控制成形的球状体的尺寸是具有挑战性的。与此相反，使用微量培养板平台可以控制球状体的尺寸，球状体尺寸的变化很小。
直至分化的第60天，3D肝细胞球状体仍显示出更稳定的表型和延长的代谢功能。此外，通过e-钙粘蛋白和ZO-1的明显表达，在3D条件下衍生的肝细胞样细胞显示出高度极化的结构。值得注意的是，在第18天，在小的肝细胞球状体中观察到增殖细胞的数量较少，而在较大的球状体中检测到较多数量的细胞，从而表明了在调节细胞行为中尺寸的重要性。重要的是，3D肝细胞球状体在体外表现出适当的功能并且在体内也支持哺乳动物的肝功能。
已经参照示例性实施方案对本公开进行描述。显然，在阅读和理解前面的详细描述时，其他人将会想到修改和改变。旨在将本公开解释为包括所有这些修改和改变，只要它们落入所附权利要求或其等同物的范围之内即可。

Claims (20)

1.一种生产肝细胞的方法，包括：
在细胞培养基底上接种人多能干细胞，所述细胞培养基底包含(i)第一层粘连蛋白，其为层粘连蛋白-521以及(ii)第二层粘连蛋白，其为层粘连蛋白-221，其中所述层粘连蛋白-521和所述第二层粘连蛋白各自为完整蛋白质；和
培养所述人多能干细胞以得到肝细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述层粘连蛋白-521与所述第二层粘连蛋白的重量比为1:4至1:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞的培养通过以下步骤进行：
在含有活化素A和Wnt3a的内胚层分化培养基中培养所述细胞；
在成肝细胞分化培养基中培养所述细胞；以及
在含有氢化可的松(HC)、肝细胞生长因子(HGF)和制瘤素m(OSM)的肝细胞成熟培养基中培养所述细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中将所述细胞在所述内胚层分化培养基中培养60小时至84小时。
5.根据权利要求3所述的方法，其中将所述细胞在所述成肝细胞分化培养基中培养73小时至180小时。
6.根据权利要求3所述的方法，其中将所述细胞在所述肝细胞成熟培养基中培养至少216小时。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述内胚层分化培养基中的所述活化素A的含量为50ng/mL至150ng/mL。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述内胚层分化培养基中的所述Wnt3a的含量为20ng/mL至100ng/mL。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述内胚层分化培养基包含RPMI 1640和B27。
10.根据权利要求3所述的方法，其中所述成肝细胞分化培养基由KO-DMEM、20％的血清替代物、1％的非必需氨基酸、0.1mM的β-巯基乙醇和1％的二甲基亚砜制成。
11.根据权利要求3所述的方法，其中所述肝细胞成熟培养基中的所述肝细胞生长因子的含量为5ng/mL至20ng/mL。
12.根据权利要求3所述的方法，其中所述肝细胞成熟培养基中的所述制瘤素m的含量为10ng/mL至30ng/mL的量。
13.根据权利要求1所述的方法，其中根据Avior方案对所述人多能干细胞进行所述培养，其中所述Avior方案为使用内胚层分化培养基、肝特化培养基、肝分化培养基和肝成熟培养基进行所述培养。
14.根据权利要求1所述的方法，其中根据Cameron方案对所述人多能干细胞进行所述培养，其中所述Cameron方案为使用内胚层分化培养基、成肝细胞分化培养基和肝细胞成熟培养基进行所述培养。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所得的肝细胞显示至少600,000RLU/mg/mL的CYP1A2活性。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所得的肝细胞显示至少800,000RLU/mg/mL的CYP3A活性。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养基底还包含钙粘蛋白。
18.根据权利要求17所述的方法，其中第一层粘连蛋白+第二层粘连蛋白与所述钙粘蛋白的重量比为5:1至15:1。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养基底不含有任何分化抑制剂、饲养细胞、分化诱导物或细胞凋亡抑制剂。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞在培养之前具有三维结构。
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