KR20160030178A - 신장 전구세포 - Google Patents

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Abstract

중간 중배엽 세포를 섬유모세포 성장인자(9) 및/또는 섬유모세포 성장인자(20) 및 임의로, 골 형태형성 단백질 7, 헤파린, Wnt 효능제, 레티노산, 및 RA 길항제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함하는, 네프론 전구세포(nephron progenitor cell) 및 요관 상피 전구세포(ureteric epithelial progenitor cell) 모두를 동시에 생산하기 위한 방법이 제공된다. Wnt 효능제, 레티노산 및/또는 RA 길항제의 농도는 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포의 상대적 생산을 지지하기 위해 조절될 수 있다. 중간 중배엽 세포는 궁극적으로 후기 원시선조 단계를 거쳐 인간 다능성 줄기세포로부터 유도된다. 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포는 예를 들어, 신장 회복 및 재생, 신장의 바이오프린팅(bioprinting) 및 신독성 화합물에 대한 스크리닝과 같은 최종 용도를 가질 수 있다.

Description

신장 전구세포{RENAL PROGENITOR CELLS}
본 발명은 신장 발달에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 궁극적으로 인간 다능성 줄기세포(human pluripotent stem cell)로부터 네프론 전구세포(nephron progenitor cell) 및 요관 전구세포(ureteric duct progenitor cell)를 생산하는 시험관 내 방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 연평균 8%씩 상승하는 말기 신장 질환의 유병률로 인해1, 신장 재생 전략에 대한 긴급한 필요성이 존재한다. 신장은 중간 중배엽(IM)으로부터 요관싹(UB)의 형성 및 이러한 싹과 인접 IM-유래된 후신 중간엽(MM)간의 상호작용을 거쳐 분화하는 중배엽 기관이다2. 네프론은 MM으로부터 유래된 네프론 전구 집단에서 발생한다3. IM 자체는 후기 원시선조(posterior primitive streak)로부터 유래된다4. 신장의 발달 기원이 잘 알려져 있으며2, 인간 신장의 네프론 형성은 출생 전에 완성된다5. 따라서, 손실된 네프론을 대체할 수 있는 출생 후 줄기 세포는 존재하지 않는다.
인간 다능성 줄기세포는 신장 질환에 대한 세포-기반 치료의 생성에 대해 커다란 잠재력을 갖는다. 그러나, 임상적 용도를 위한 세포의 공급원으로써 및 예를 들어, 신장 질환에 대한 치료로써의 인간 다능성 줄기세포의 실현은 네프론 및 신장의 다른 구조물을 발생시키는 필수 세포 유형을 생산하는 방법에 대한 이해 부족으로 인해 저해되었다.
요지
본 발명자들은 정상 배발생 동안 사용된 성장 인자를 사용하여 완전히 화학적으로 규명된 단층 배양 조건하에서 후기 원시선조 및 중간 중배엽(IM)을 거쳐 인간 다능성 줄기세포의 분화를 성공적으로 유도했다. 이러한 분화 프로토콜은, 시험관 내에서 네프론 형성을 포함하여 자가-조직(self-organising) 구조물을 형성하는 요관싹(UB) 및 후신 중간엽(MM)의 동기(synchronous) 유도를 야기한다. 이러한 hESC-유래된 성분은 생체외에서 폭넓은 신장 잠재력을 나타내어 다능성 줄기 세포-기반 신장 재생에 대한 잠재력을 예시한다.
따라서, 본 발명의 한가지 양태는 중간 중배엽(IM) 세포를 섬유모세포 성장인자 9(FGF9) 및/또는 섬유모세포 성장인자 20(FGF20), 및 임의로, 골 형태형성(bone morphogenic) 단백질7(BMP7), 헤파린, Wnt 효능제, 레티노산(RA), 유사체 또는 효능제, 및 RA 길항제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 제제와 접촉시켜 IM 세포로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하는 단계를 포함하는, 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하는 방법을 제공한다.
한가지 실시형태에서, IM 세포는 후기 원시선조 세포로부터 유래되거나 분화된다.
한가지 실시형태에서, 후기 원시선조 세포는 인간 다능성 줄기세포(hPSC)로부터 유래되거나 분화된다. hPSC의 비제한적인 예는 인간 배아 줄기세포(hESC) 및 유도된 인간 다능성 줄기 세포(iPSC)를 포함한다.
바람직한 형태에서, 이러한 양태는
(i) hPSC를 hPSC의 후기 원시선조 세포로의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계;
(ii) 후기 원시선조 세포를 후기 원시선조 세포의 IM 세포로의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계; 및
(iii) IM 세포를 FGF9와 단독으로 접촉시키거나 BMP7, RA, 및 RA 길항제, Wnt 효능제, 및/또는 FGF20, 및 헤파린과 함께 접촉시켜 IM 세포로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하는 일련의 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
단계 (ii)에서의 하나 이상의 제제는 바람직하게는 FGF9을 포함한다. 한가지 바람직한 실시형태에서, FGF9는 단계 (ii) 및 (iii) 동안 적어도 일부 동안 존재하거나 내내 존재한다. 특히 바람직한 실시형태에서, CHIR99021과 같은 Wnt 효능제는 단계 (i) 동안 존재한다.
한가지 실시형태에서, 상기 방법은 생존 가능한 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포를 동정하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 생존 가능한 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포의 동정은 생존 가능한 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포에 대한 마커로서 다수의 핵산 및/또는 단백질의 동시발현의 측정 또는 검출함을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 전술한 양태의 방법에 따라 생산된 단리, 농축 또는 정제된 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 전술한 양태의 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포로부터 분화시켜 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생산하는 단계를 포함하는 상기 방법인, 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포는 신장 이식 또는 만성 신장 질환 치료를 위한 전체 신장 및 신장 조직의 바이오프린팅 또는 생체조작을 위한 공급원으로써 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포는 전체 기관 탈세포화된 신장의 재세포화에 의한 재구성 또는 대체 신장의 제조를 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포는 신장 질환 및 병태의 세포 요법을 위한 공급원으로서 사용될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 하나 또는 다수의 화합물을 전술한 양태의 단리되거나 정제된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포와 접촉시키거나, 분화되거나 그 외에 그로부터 수득된 신장 세포 또는 조직과 접촉시켜 하나 또는 다수의 화합물의 신독성 여부를 측정하는 단계를 포함하는 상기 방법인, 하나 또는 다수의 화합물의 신독성을 측정하는 방법을 제공한다.
한가지 실시형태에서, 이러한 양태는 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포의 신독성 스크리닝에 대한 신장 오르가노이드로의 바이오프린팅을 제공한다.
도 1. 인간 배아 줄기세포로부터 후기 원시선조 및 중간 중배엽으로의 순차적 분화. a, 내세포괴(inner cell mass)로부터 신장계(renal lineage)로의 도식적 발달 단계. 각 단계에서 도시된 유전자는 그 단계의 특이적 마커를 나타낸다. b, 3일 배양 후, BMP4/액티빈 A(ng/mL) 또는 8μM의 CHIR99021의 상이한 비율로 유도된 MIXL1-GFP 양성 후기 원시선조 세포의 백분율을 도시하는 FACS 분석(GFP 및 전방 산란(FSC)). hESC, 출발 세포; GF 없음, 기본 배지로 3일 배양. c, d, qRT-PCR 분석에 의해 평가된 BMP4 및 액티빈 A(ng/mL) 각각의 비율에 대한 3일째의 SOX17, BRACHYURY (T) 및 MIXL1의 상대적 발현(c). CHIR99021의 상이한 농도에 대한 동일한 qRT-PCR 분석(d). 에러 바는 표준 편차(n=3 실험). e, hESC로부터 IM까지 사용된 상이한 프로토콜의 도식적 표현. f, 2일째부터 6일째까지 200ng/ml FGF9의 존재 또는 부재 하에서의 IM의 마커(PAX2, LHX1, OSR1)의 발현을 도시하는 6일째의 RT-PCR. g, 2일째부터 6일째까지 200ng/ml FGF9의 존재 또는 부재 하에서 6일째에 PAX2 단백질에 대해 양성인 세포의 백분율 정량. BMP4/액티빈 A(B/A) 및 CHIR99021(CHIR)을 통한 상이한 프로토콜 모두 80% 유도 효율을 초과하였다. 에러 바는 표준 편차(3번의 실험에서 n=5 필드). h, BMP4/액티빈 A(B/A) 또는 CHIR99021(CHIR)를 사용하는 후기 원시선조 유도를 거친 6일째의 PAX2(붉은색) 및 LHX1(녹색) 단백질의 존재 및 동시발현. (스케일=100㎛). i, 2일째부터 6일째까지 FGF9의 농도 구배를 통해 6일째의 IM (PAX2 , LHX1), PM (TBX6) 및 LPM (FOXF1)의 마커의 발현을 도시하는 qRT-PCR. 에러 바는 표준 편차(n=3 실험). j, 2일째부터 6일째까지 NOG 또는 BMP4와 함께 FGF9의 존재하에서 6일째의 중배엽 마커의 발현 변화를 도시하는 qRT-PCR. 에러 바는 표준 편차(n=3 실험). k, PAX2(붉은색)에 의해 표지된 주요 IM 집단 및 TBX6(녹색)에의해 표지된 비중복 PM을 도시하는 6일째의 IF. (스케일=100㎛).
도 2. 후기 원시선조 유도. a, 시간에 따른 다능성 유전자 발현의 감소를 도시하는, BMP4/액티빈 A(30/10 ng/ml)로 유도시킨 후 다능성 마커 OCT4 및 NANOG에 대한 시간 경과 정량적 RT-PCR. 에러 바는 표준 편차(n=3 실험). b, CHIR99021를 사용하는 후기 원시선조 유도 전(hESC)과 후(2일째)의 ES 세포, NANOG 및 ECAD의 마커에 대한 IF. (스케일=100㎛). c, CHIR99021를 사용하는 후기 원시선조 유도 후(2일째)의 후기 원시선조, T 및 MIXL1(GFP)의 마커에 대한 IF. MIXL1 내인성 프로모터에 의해 유도된 GFP 발현으로 MIXL1을 검출하였다. (스케일=100㎛). d, BMP4 및 액티빈 A(ng/mL)의 3가지 상이한 비율일 경우의 배양 시간에 따라 유도된 자발적 OSR1 발현 수준. hESC는 3일 동안 BMP4 및 액티빈 A의 3가지의 상이한 비율로 배양체를 형성했고, 그 후 14일째까지 성장 인자가 없는 조건에서 자발적으로 분화했다. 이는 높은 BMP4 및 낮은 액티빈 A(30/10)가 세포 내 개선된 OSR1 발현을 유도한다는 것을 입증한다. OSR1는 IM 및 LPM을 표지한다.
도 3. IM 단백질의 유도에 대한 FGF 신호화의 영향. a, 2일째에 BMP4/액티빈 A로 처리된 6일째의 hESC 배양에 대한 PAX2 단백질 및 FGF 신호화 억제제인 PD173074의 존재 또는 부재 하에서 2일째부터 6일째까지의 FGF2(200ng/ml), FGF8(200ng/ml), FGF9(200ng/ml) 또는 성장인자 비함유(GF 없음)에 대한 IF. (스케일=100㎛). b, IF(a)와 동일한 프로토콜로 PAX2 , LHX1 및 OSR1의 상대적 발현 수준을 조사하는 6일째의 정량적 RT-PCR. 음영으로 표시된 바는 FGF 억제제인 PD173074를 추가한 효과를 도시한다. 에러 바는 표준 편차(n=3 실험). c, 2일째에 +BMP4/액티빈 A(+FGF9 (B/A)) 또는 8μM CHIR99021(+FGF9 (CHIR))로 처리되고 이어서 2일째부터 6일째까지 FGF9 200ng/mL 또는 성장인자 없이(GF 없음) 처리된 6일째의 hESC 배양에서 IM 마커인 PAX2 및 LPM과 IM 모두의 마커인 OSR1에 대한 IF. 2차 항체 단독 대조군은 음성 대조군으로 사용되었다(2o 항체 단독)(스케일=100㎛). d, 2+일째에 8μM CHIR99021로 처리되고 이어서 2일째부터 6일째까지 FGF9 200ng/mL로 처리된 6일째의 hESC 배양에 대한 전체(총) 또는 LHX1- 및 LHX1+ 세포와의 PAX2- 및 PAX2+ 세포의 백분율을 나타내는 표. 에러 바는 표준 편차(3번의 실험에서 n=5 필드).
도 4. 초기 중배엽의 측면-중간(lateral-medial) 패턴화에 대한 BMP 신호화의 효과. a, FGF9 200ng/mL의 존재하에서 2일째부터 6일째까지 BMP4(5 또는 50ng/mL) 또는 BMP 길항제 NOG(25 또는 250ng/mL)의 존재 또는 부재 하에서 6일째의 DAPI(푸른색) 및 PAX2(붉은색)에 대한 IF. (스케일=200㎛). b, 6일째에 PM(PARAXIS 및 TBX6 ) 및 LPM(FOXF1 및 OSR1 ) 마커의 발현에 대한 이러한 BMP/NOG 구배의 효과를 조사한 qRT-PCR. 에러 바는 표준 편차(n=3 실험).
도 5. 초기 신장 발달 동안 뚜렷한 전구 및 유도 세포 집단의 예상된 유전자 발현을 도시하는 도식도. PS, 원시 선조; IM, 중간 중배엽; MM, 후신 중간엽; NP, 네프론 전구체/ 신원성 중간엽(nephrogenic mesenchyme); RV, 신장 소낭; DT, 원위 곡뇨 세관; PT, 근위 곡뇨 세관; Pod, 발세포; ND, 신장관; UB, 요관싹/ 요관 상피; CD, 집합관; MET, 중간엽의 상피로의 전이. 모든 유전자는 이탤릭체로 나타낸다. 음영으로 표시된 박스는 인접한 표시된 유전자에 대한 발현의 타이밍 및 지속기간을 나타낸다. DT, PT 및 Pod를 표시하는 특이적 유전자는 각 세포 유형 옆에 나타낸다. UB와 NP간에 발생하는 것으로 알려진 분화의 상호 유도는 UB로부터의 FGF9(신원성 중간엽 생존) 및 Wnt9b(MET)의 발현에 의하여 및 NP에 의한 GDNF(요관 분기)에 의하여 지지된다.
도 6. 시험관 내 hES 세포로부터 요관 및 후신 전구세포의 단계적 일시적 유도. a, 신장 발달 유도(BMP4:액티빈 A/FGF9/FGF9:BMP7:RA)에 사용된 초기 hESC 유도된 분화 프로토콜에 대한 도식적 표현. 선 아래 숫자는 분화의 일수(day)를 나타낸다. b, 신장 분화의 각 단계를 나타내는 유전자에 대한 0일째부터 17일째까지의 시간경로 RT-PCR. 이는 후기 원시선조(MIXL1 , LHX1), IM(LHX1 , PAX2 , OSR1), MM(OSR1 , SIX2 , WT1. GDNF , HOXD11) 및 UE(PAX2, CRET, HOXB7)에 대한 유전자를 포함한다. PAX6은 외배엽 관련 증거가 없음을 입증하기 위해 포함되었다. NC, DNA 주형(template)이 없는 음성 대조군. c, PAX2(붉은색) 및 ECAD(녹색) 이중 양성 상피 구조(상부 패널) 및 이러한 상피 구조를 둘러싸는 WT1(붉은색) 양성 집단(하부 패널)의 형성을 도시하는 6일째부터 17일째까지의 시간경로 IF.(스케일=200㎛) d, 유도된 분화 시간경로에 걸친 hESC 배양 내에 존재하는 WT1+ 또는 SIX2+ 세포 비율의 정량. 이러한 단백질의 동시발현은 MM/ 네프론 전구(NP) 집단을 표시하지만, WT1 단백질은 또한 이후에 네프론을 분화 시 발현된다. 에러 바는 표준 편차(n=3 실험). e, 분화 14일째는 ECAD+ UE 주위에 MM(ECAD_ SIX2+)의 존재를 보였다. (스케일=200μM) f, 신장 발달 유도에 사용되는 대안적 hESC 유도된 분화 프로토콜(CHIR99021/FGF9)의 도식적 표현. 선 아래 숫자는 분화의 일수를 나타낸다. g, (b)에서 나타낸 바와 같이 신장 분화의 각 단계를 나타내는 CHIR99021/FGF9을 사용한 분화를 통한 0일째부터 18일째까지의 시간경로 RT-PCR. h, (c)에서 나타낸 바와 같이 단백질에 대한 CHIR99021/FGF9를 사용한 분화를 통한 0일째부터 18일째까지의 시간경로 IF. (스케일=200㎛) i, CHIR99021/FGF9를 사용한 분화 후 (d)에 기재된 바와 같은 정량. 에러 바는 표준 편차(3번의 실험에서 n=5 필드). j, 14일째에서 SIX2+의 존재는 ECAD+ UE 주변에 중간엽 세포를 농축시켰다.(스케일=100㎛) k, PAX2+GATA3- MM 부위에 인접한 17일째의 PAX2+GATA3+ UE를 도시하는 17일째 IF 현미경. (스케일=50㎛)
도 7. 요관 상피 형성에 대한 RA의 양성 효과. a, 분화 12일째의 EdU 삽입 분석. EdU에 30분 동안 노출시켜 PAX2+ 전-상피(pre-epithelium) 구조뿐만 아니라 PAX2 음성 세포 또한 증식 중이라는 것을 밝혀냈다. 흰색 화살촉은 PAX2+ 세포에서 EdU 삽입을 나타낸다. (스케일=100㎛) b, BMP4/액티빈 A를 사용한 후기 원시선조 유도 후 6일째의 IM 세포를 11일 동안 FGF9와 함께 상이한 RA 농도로 배양했다. UE 마커인 PAX2+ECAD+에 대한 IF는 UE 구조가 RA 용량-의존적 방식으로 유도되었음을 나타냈다. (스케일=200㎛) c, BMP4:액티빈 A/FGF9/FGF9:BMP7:RA 프로토콜을 사용한 분화의 22일째의 RT-PCR은 발세포에 대한 SYNPO , NPHS1 및 WT1; 원위 세관 또는 집합관에 대한 AQP2 및 SCNNB1 및 근위 세관에 대한 AQP1 및 SLC3A1를 포함하는 성숙한 신장 세포 유형으로의 분화를 나타내는 유전자 발현을 밝혀냈다. NC, DNA 주형이 없는 음성 대조군. d, 2개의 중요 발세포 마커인 틈새 격막 단백질 SYNPO(녹색) 및 핵 WT1(붉은색)의 동시발현을 나타내는 BMP4/액티빈 A를 사용한 22일째 분화의 IF. 핵산 또한 DAPI로 염색된다. (스케일=50㎛)
도 8. CHIR99021/FGF9 유도된 분화 이후 hESC의 네프론 유도에 대한 신장 잠재력 및 증거의 평가. a, 6일째 CHIR99021/FGF9를 사용하여 초기 유도한 후 추가로 5일 동안 FGF9와 함께 상이한 RA 농도로 유도시키거나 성장 인자 없이(GF 없음) 유도시킨 분화 12일째의 hESC-유래된 세포. PAX2 및 ECAD 단백질에 대한 IF는 UE 구조가 RA 용량 의존적인 방식으로 유도되었다는 것을 밝혀냈다. (스케일=200㎛) b, 주요 신장 마커(SIX2, HOXD11, HOXB7, FOXD1), 다능성 마커(OCT4) 및 생식선/부신 피질 마커(SOX9, SF1, GATA6)에 대한 qRT-PCR. BMP4/액티빈 A(B/A) 또는 CHIR99021(CHIR) 프로토콜을 사용하는 분화 18일째의 유전자 발현 수준은 GAPDH로 표준화되며 미분화된 hESC에서의 수준과 비교되었다. 인간 태아 신장 RNA는 양성 대조군으로 사용되었다. 에러 바는 표준 편차(n=3 실험). c, 유도 12일째에 일부 WT1+ MM 세포(붉은색)가 또한 HOXD11+(녹색)이었다는 것을 나타내는 IF. HOXD11은 MM 및 신장 기질(HOXD11+WT1-) 모두를 포함하는 후신 부위의 특이적인 마커이다. (스케일=200㎛) d, 위상차 현미경을 사용한 분화(CHIR99021/FGF9) 18일 후의 저배율 사진 및 WT1(붉은색)에 대한 IF. WT1+ 중간엽의 클러스터가 배아 신장에서 볼 수 있는 바와 같은 UE를 둘러싼다. (스케일=200㎛) e, ECAD+ UE(녹색)을 빽빽히 둘러싸는 18일째 WT1+ 및 SIX2+ 중간엽(붉은색). (스케일=50㎛) f, JAG1 및 CDH6의 존재에 의해 평가되는 바와 같이 초기 네프론/ RV로 둘러싸인 PAX2+ECAD+ UE를 나타내는 18일째의 IF 공초점 현미경. 점선으로 둘러싸인 부위는 PAX2+GATA3+ECAD+ UE 구조이다. 대괄호로 표시되는 부위는 옆의 오른쪽 패널에서 확대된다. (스케일=25㎛)(확대된 스케일=10㎛).
도 9. 신장계에 대한 H9 hES 세포주 및 iPS 세포주의 분화. a, b, H9 hESC(a) 및 CRL2429 C11 iPS 세포(b)의 분화 6일 및 14일째의 DAPI(푸른색), PAX2(붉은색) 또는 SIX2(붉은색)에 대한 면역형광. (스케일=200㎛)
도 10. hESC-유래된 신장 전구세포의 마우스 신장 세포의 재응집물로의 통합. a, 신장 잠재력에 대한 재응집 검정의 도식도. 배아 12.5일 내지 13.5일의 마우스 신장을 단일 세포로 분리하여 12일 내지 13일된 hESC-유래된 유도 신장 세포와 조합하고, 필터막 상에서 펠렛을 형성하여 4일 동안 공기-배지 경계면에서 배양하였다. 마우스 신장 세포에 대한 hESC-유래된 세포의 비율은 4 내지 96이었다. b, 미분화된 hESC-유래된 거대 낭종 형성(녹색)을 나타내는, 음성 대조군으로서 구성적으로 GFP(ENVY 세포주)를 발현하는 미분화된 hESC를 사용하는 재응집 검정. (스케일=200㎛) c, 분화 13일째의 마우스 배아 12.5일 내지 13.5일의 신장 세포와 hESC-유래된 세포의 재응집 검정. 모든 통합된 hES 세포-유래된 세포는 인간 미토콘드리아 항체(HuMt) 또는 인간 핵 항체(HuNu)(녹색)에 의해 검출되었다. 흰색 화살촉은 마우스 신장 구조로 통합된 인간 세포를 가르킨다. PAX2+ 및 CALB+ 세관은 UE를 나타낸다. CDH6+ 및 JAG1+ 구조는 신장 소낭을 나타낸다. SIX2+ 및 WT1+ 비상피 세포는 MM/NP를 나타낸다. 모든 이미지는, hESC가 BMP4:액티빈 A/FGF9/FGF9:BMP7:RA 프로토콜을 사용하여 분화되는 CALB+ UE 및 SIX2+ MM로의 통합을 제외하고는, CHIR99021/FGF9 프로토콜을 사용하여 분화된 hESC의 통합을 도시한다. (스케일=50μM)
도 11. 자가-조직화 이벤트에 대한 3D 배양 환경의 효과. a, 재플레이팅(replating) 검정의 도식. 6일째의 IM 세포를 수거하여 고농도 또는 저농도에서 재플레이팅하였다. 그 후 12일 동안 세포를 배양하였다(200ng/mL의 FGF9로 6일 동안 배양 한 후 성장 인자 없이 또 다른 6일동안 배양). 고동도로 플레이팅된 세포가 균일한 세포층을 형성한 반면, 저농도로 플레이팅된 세포는 반구형 콜로니를 형성하였다. b, 6일째의 유도된 IM 세포를 재플레이팅하여 18일째에 단층 또는 반구형 콜로니를 형성하였다. 세포를 UE의 경우 ECAD로, MM의 경우 WT1으로 염색하였다. 보다 발달한 구조는 아마도 상호간에 유도적인 세포 집단의 근접성으로 인하여 반구형 콜로니 내에서 보여졌다. (스케일=100μM)
도 12. 분화된 hESC의 3D 배양 후 자가-조직화의 증거. a, 3D 배양에 사용되는 과정의 도식. 분화 18일 후의 hESC-유래된 세포(CHIR99021/FGF9)를 수거하여 단일 세포로 분리하고, 펠렛을 형성한 후, 필터막 상에서 공기-배지 경계면에서 10% FCS/DMEM로 배양하였다. 4일 배양 후, 펠렛을 파라핀 포매하고 절단하였다. (스케일=200μM) b, 다양한 중요 단백질(hESC-유래된 세포)의 발현을 도시하는 3D 배양된 펠렛의 파라핀 포매된 단면의 IF. ECAD(녹색)은 상피의 존재를 나타낸다. PAX2+ 상피가 UE를 나타내는 반면, PAX2+ 비상피는 MM 및 그의 유도체를 나타낸다. AQP2과 ECAD의 동시발현은 UE의 유도체인 집합관의 형성을 나타낸다. 여기서 나타낸 WT1 염색은 MM/NP를 표시한다. MM/NP의 상피 유도체는 JAG1에 의해 표시되는 신장 소낭 및 AQP1 및 SLC3A1에 의해 표시되는 근위 세관을 포함한다. 대조군으로서, 13.5일된 마우스 배아 신장 세포를 분리하여 펠렛을 형성한 다음, 분석 전 hESC-유래된 세포(E13.5 mEK 세포)와 동일한 방식으로 배양하였다. (스케일=25μM)
도 13. 마이크로생물반응기가 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피로의 분화에 필요한 정확한 성장 인자 농도의 계승 최적화에 사용될 수 있다는 증거. 이러한 마이크로생물반응기는 27행 X 10웰을 포함하고, 각 행은 3개의 상이한 성장 인자, FGF9, BMP7 및 레티노산의 상이한 조합을 갖는다. 판독은 E-카데린(푸른색, 상피), GATA3(녹색, 요관 상피) 및 WT1(붉은색, 네프론-형성 중간엽)에 대한 면역형광이다.
도 14. 후속 유도단계가 끝난 후 이러한 배양의 최종 분화에 의해 평가되는, 단계 1 분화의 최적화. 단계 1에서 CHIR99021를 증가시키면 E-카데린 양성(녹색) 요관 상피의 양을 증가시키며, 6μM CHIR99021에서 상피 대 네프론 전구세포가 최적 몰비(WT1에 대한 항체로 붉은색으로 표시됨)를 갖는다. 제시된 배양은 18일째에 배양을 중단하였다.
도 15. 다능성에서 후기 원시선조로의 단계 1 분화의 최적화의 결과를 개요하는 도표. 결과는 초기 CHIR99021 유도의 농도 및 기간이 각각의 출발 세포에 따라 다를 수 있고 이는 최적 신장 분화를 위해 최적화를 필요로 할 수 있다는 것이다.
도 16. 추가의 최적화 단계의 목표 및 적절한 꼬리 후신 중간엽 집단의 생성을 입증하는 RA 신호화의 길항제를 포함하는 이론적 근거를 개요하는 도표. 간략하게는, 발달 배아에서 RA 신호화에 구배가 존재하여, 활성은 꼬리 말단에서 가장 높고 꼬리 돌기 내 RA 분해에 대한 효소의 생산은 배아 말기에 RA 신호화를 감소시킨다. 영구 신장(후신)은 후지 수준에서 발생하고 따라서 상대적으로 낮은 RA 활성 존에 존재함직하고, 반면 요관싹을 발생시키는 상피는 조기에 발생하며 따라서 상대적으로 높은 RA 활성 존에 존재한다.
도 17. 단계 2 및 3의 분화의 변화를 통한 네프론 전구세포 유도의 최적화 도표. 이는 낮은 수준의 CHIR99021과 함께 1μM 또는 5μM으로 첨가된 레티노산 수용체 활성 길항제인 AGN193109가 포함됨을 보인다.
도 18. 분화 12일 또는 18일째에 평가되는, 후신 중간엽 마커 Hoxd11 및 Six2의 발현에 대한 분화 4일째부터의 CHIR99021 및/또는 AGN193109 첨가의 효과를 도시하는 정량적 PCR 결과.
도 19. 분화 18일째에 평가되는, 다른 캡 중간엽/네프론 전구세포 마커(Six1, Six2 , Eya1 , WT1)의 발현에 대한 분화 4일째부터의 CHIR99021 및/또는 AGN193109 첨가의 효과를 도시하는 정량적 PCR 결과.
도 20. 인간 iPSC 세포주 C11의 네프론 전구세포 및 요관 상피를 포함하는 신장 오르가노이드로의 지시된 분화. 본 분화에 사용된 프로토콜을 hESC 세포주 HES3의 분화에 사용되는 것과 비교하여 도표로 나타낸다. 이는 추가적인 2일의 CHIR99021을 포함한다. 이미지는 배양 20일째 후 발생하는 오르가노이드를 도시한다. WT1+ 중간엽(붉은색)은 분지 요관 상피(녹색)를 둘러싼다.
도 21. 인간 iPSC 세포주 C32의 네프론 전구세포 및 요관 상피를 포함하는 신장 오르가노이드로의 지시된 분화. 이미지는 배양 18일째 후 발생하는 오르가노이드를 도시한다. WT1+ 중간엽(붉은색)은 분지 요관 상피(녹색)를 둘러싼다.
본 발명은 적어도 부분적으로 중간 중배엽(IM)으로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포의 동기적(synchronous), 동시적(stimultaneous) 분화를 촉진하도록 조절되는 특이적 시험관 내 배양 조건의 동정에 근거를 둔다. 더욱 구체적으로, 헤파린과 FGF9 단독 또는 헤파린과 골 형태형성 단백질7(BMP7), 레티노산(RA), RA 길항제, Wnt 효능제, 및/또는 FGF20을 포함하는 하나 이상의 제제와의 조합은 중간 중배엽의 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포로의 분화를 촉진시키는 것을 가능하게 한다. 이에 덧붙여, 시험관 내 배양 방법은 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하기 위하여 인간 배아 줄기세포를 후기 원시선조, IM 및 후신 중간엽 단계를 거쳐 분화시키기 위한 시스템을 제공한다. 유리하게는, RA, RA 길항제 및/또는 Wnt 효능제 같은 특정 분자의 존재 또는 부재가 요관 상피 전구세포 대비 네프론 전구세포, 또는 그 반대의 생산을 우선적으로 촉진하기 위해 조절될 수 있다.
네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포는 동시에 유도되고, 생체 내에서 서로의 분화를 지시하며, 요관 트리 및 네프론 전구세포 중간엽을 포함하는 상이한 세관 상피 구조로 발달할 수 있으며, 이 동안 상피 구조는 네프론 전구세포를 유지하도록 요관 팁을 대체한다. 따라서, 이는 본 발명에 따라 생산된 hESC-유래된 요관 상피 및/또는 네프론 전구세포는 요관 및 중간엽 구획 모두로부터 신장 세포로 분화하도록 지시될 수 있다는 것을 제시한다. 게다가, 또한, 이러한 세포의 '자가-조직' 능력은 예를 들어, 신장 생체조작에 의해 신장 복구를 촉진시키는데 활용될 수 있다. 또한, 상기 기재된 바와 같은 네프론 전구세포, 그로부터 유래된 네프론 또는 "자가-조직화된" 신장 오르가노이드는, 이전에는 테스트에 적합한 세포를 생산하지 못함으로써 방해되었던, 신독성 테스트에 적합할 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료들은 본 발명의 실시 또는 테스트, 바람직한 방법 및 재료에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문맥에서 달리 요구하는 경우를 제외하고는, 용어 "포함하다" 및 예를 들어, "포함하는", "포함하다" 및 "포함되는"과 같은 상기 용어의 변형은 추가의 첨가물, 성분, 정수 또는 단계를 배제되도록 의도되지 않는다.
부정 관사 "하나"는 하나 또는 하나 이외의 것을 배제시키는 것으로 이해되지 않아야 한다. 예를 들어, "하나의" 세포는 하나의 세포, 하나 이상의 세포 및 다수의 세포를 포함한다.
본 발명의 목적 상, "단리된"은 그의 본래 상태에서 제거되었거나 달리는 인간 조작을 받았던 물질을 의미한다. 단리된 물질(예를 들어, 세포)은 보통 그의 본래 상태를 동반하는 성분으로부터 실질적으로 또는 본질적으로 유리(free)할 수 있거나, 보통 그의 천연 상태에서 그를 동반하는 성분과 함께 인공적인 상태로 존재하도록 조작될 수 있다.
"농축된" 또는 "정제된"은 농축 또는 정제 이전의 상태와 비교하여 특정 상태(예를 들어, 농축되거나 정제된 상태)에서 높은 발생률, 표현 또는 빈도를 갖는 것을 의미한다.
용어 "분화시키다", "분화하는" 및 "분화된"은 발달 경로의 조기 또는 초기 단계로부터 발달 경로의 후기 또는 보다 성숙한 단계로의 세포의 진행에 관한 것이다. 이러한 맥락에서 "분화된"은 완전히 분화되고, 다능성 또는 발달 경로 또는 다른 발달 경로를 따라 추가로 진행하는 능력을 잃어버린 세포를 의미하거나 암시하지 않는다는 것을 알 수 있을 것이다. 분화는 세포 분열에 의해 수반될 수 있다.
"전구세포"는 자기 재생과 함께 또는 자기 재생 없이 하나 또는 다수의 발달 경로를 따라 분화하는 것이 가능한 세포이다. 전형적으로, 전구세포는 단분화능이거나 올리고포텐트(oligopotent)이며 적어도 제한된 자기 재생이 가능하다.
본 기술 분야에서 잘 알 수 있는 바와 같이, 세포의 단계 또는 분화 단계는 하나 또는 다수의 마커의 발현 및/또는 비발현으로 특징지어질 수 있다. 이러한 맥락에서, "마커"는 세포의 게놈, 세포 집단, 계통, 구획 또는 아집단에 의해 코딩되는 핵산 또는 단백질을 의미하며, 마커의 발현 또는 발현 패턴은 발달 동안 변화한다. 핵산 마커의 발현은, 이에 제한하는 것은 아니지만, 핵산 서열 증폭(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응) 및 핵산 혼성화(예를 들어, 마이크로어세이, 노던 혼성화, 인사이투 혼성화)를 포함하는 종래 기술에 공지된 임의의 기술로 검출되거나 측정될 수 있다. 단백질 마커의 발현은, 이에 제한하는 것은 아니지만, 유동 세포 분석법, 면역 조직 화학, 면역블로팅, 단백질 검정, 단백질 프로파일링(예를 들어, 2D 겔 전기영동)을 포함하는 종래 기술에 공지된 임의의 기술로 검출되거나 측정될 수 있다.
본 발명의 한가지 양태는 중간 중배엽(IM) 세포를 BMP7, 레티노산(RA), RA 길항제, Wnt 효능제, 섬유모세포 성장인자 9(FGF9) 및/또는 FGF20, 및 헤파린과 접촉시켜 IM 세포로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하는 단계를 포함하는, 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하는 방법을 제공한다.
본원에 언급한 "레티노산" 또는 "RA"는 레티노산(예를 들어, 모든 트랜스 RA 및 9-시스 RA를 포함하는), 유사체 및/또는 RA와 유사한 생물학적 활성을 갖는 레티노산 수용체(RAR) 효능제의 모든 형태를 포함한다. 다양한 상이한 RA 유사체 및 RAR 효능제(RARα, β 또는 γ에 비선택적 및 선택적인 효능제를 포함하는)는, 예를 들어, R & D systems and Tocris Bioscience에서 시판된다.
"RA 길항제"에 대한 구체적 언급은 레티노산 수용체(RAR)을 통해 RA 신호화를 억제, 차단하거나 방지하는 RAR 길항제 및 임의의 다른 분자를 포함한다. RAR 길항제의 비제한적인 예로는, 이에 제한하는 것은 아니지만, AGN193109, LE 135,　ER 50891, BMS 493, BMS 453 및 MM 11253를 포함한다. 또한 이러한 정의는 RA 길항제가 대안적으로 또 다른 리간드의 결합으로부터 RAR을 통한 신호화의 차단을 모방하는 가능성을 배제하지 않는다.
본원에 사용된 "Wnt 효능제"는 바람직하게는 다른 비정규 Wnt 신호화 경로의 맥락이 아닌, 정규 Wnt 신호화 경로의 맥락에서 GSK3(예를 들어, GSK3-β)을 억제하는 분자이다. Wnt 효능제의 비제한적인 예로는 CHIR99021, LiCl SB-216763, CAS 853220-52-7 및, Santa Cruz Biotechnology and R & D system과 같은 공급원으로부터 시판되는 다른 Wnt 효능제를 포함한다. 이러한 정의는 Wnt 효능제가 하나 이상의 GSK3β 활성 억제제를 모방하는 가능성을 절대적으로 배제하여 읽어서는 안된다.
또한 FGF9 및 FGF20과 같은 섬유모세포 성장인자는, FGF9이 바람직하지만, 교환가능하다는 것으로 이해될 것이다. 헤파린은 전형적으로 FGF2, FGF9 및/또는 FGF20과 같은 섬유모세포 성장인자의 생물학적 활성을 촉진하거나 증진하는데 포함된다.
FGF9, BMP7, 레티노산(RA), RA 길항제, Wnt 효능제, FGF20 및 헤파린 각각의 바람직한 농도는 이하에 보다 자세히 기재될 것이다. RA 효능제 또는 유사체, RA 길항제 및/또는 Wnt 효능제와 같은 특정 분자의 존재 또는 부재를 조절하거나 조작하여 우선적으로 네프론 전구세포 대비 요관 상피 전구의 생산 또는 그 반대의 생산을 촉진시키는 것이 참고 될 것이다.
본원에 사용되는 "네프론 전구세포"는, 이에 제한하는 것은 아니지만, 연결 분절과 같은 상피 네프론, 원위 곡뇨 세관(DCT) 세포, 원위 곧은 세관(distal straight tubule, DST), 근위 곧은 세관(proximal straight tubule, PST) 분절 1 및 2, PST 세포, 발세포, 사구체 내피 세포(glomerular endothelial cell), 헨레(Henle)의 상승 고리 및/또는 헨레의 하강 고리를 포함하는 상피 전이로의 초기 중간엽을 거쳐 모든 네프론 분절(집합관 외의)로 분화시킬 수 있는 후신 중간엽으로부터 유래된 전구세포이다. 또한 네프론 전구세포는 자기 재생이 가능하다.
후신 중간엽의 특징적 또는 대표적 마커의 비제한적인 예로는, 이에 제한하는 것은 아니지만, WT1, SIX1 , SIX2 , SALL1 , GDNF 및/또는 HOXD11 를 포함한다. 네프론 전구세포의 특징적 또는 대표적 마커의 비제한적인 예로는, 이에 제한하는 것은 아니지만, WT1, SIX1 , SIX2 , CITED1 , PAX2 , GDNF , SALL1 , OSR1 및 HOXD11를 포함한다.
"요관 상피 전구세포"는 신장 조직 및/또는 집합관 같은 구조로 발달할 수 있는 중신관(mesonephric duct) 또는 그의 유도체 요관싹으로부터 유래된, 수득가능한 또는 발생하는 상피 전구세포를 의미한다.
요관 상피 전구세포의 특징적 또는 대표적 마커의 비제한적인 예로는, 이에 제한하는 것은 아니지만, HOXB7 , cRET , GATA3 , CALB1 , E- CADHERIN 및 PAX2 를 포함한다.
상기에 기재된 바와 같이, 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포는 FGF9와 단독으로 존재하거나, BMP7, 레티노산(RA), 효능제 또는 유사체, AGN193109과 같은 RA 길항제 및/또는 FGF20 및 바람직하게는 헤파린을 포함하는 하나 이상의 제제와의 조합으로 존재하는 중간 중배엽(IM) 세포로부터 분화된다.
"중간 중배엽(IM)" 세포는 후기 원시선조로부터 발생하고, 궁극적으로 요관 및 신장 및 생식샘과 같은 다른 조직을 포함하는 비뇨생식계로 발달할 수 있는 배아 중배엽 세포를 의미한다. 중간 중배엽의 특징적 또는 대표적 마커의 비제한적인 예로는 PAX2, OSR1 및/또는 LHX1를 포함한다.
또한, IM 세포의 생산은 IM 세포가 존재하는 다른 세포 유형이 없는 IM 세포의 순수한 또는 동종 집단이라는 것을 암시하는 것을 의미하지 않는다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, "IM 세포" 또는 "IM 세포 집단"에 대한 언급은 세포 또는 세포 집단이 IM 세포를 포함한다는 것을 의미한다.
적절하게는, 본 발명에 따른 IM 세포는, 이하에 보다 자세히 기재될 바와 같이, 후기 원시선조 세포를 후기 원시선조 세포의 IM 세포로의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 제제와 접촉시킴으로써 생산된다.
바람직하게는, IM 세포는 후기 원시선조 세포를 후기 원시선조 세포의 IM 세포로의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 제제와 접촉시킴으로써 생산된다.
전형적으로, 하나 이상의 제제는 섬유모세포 성장인자 9(FGF9) 및, 임의로, AGN193109와 같은 RA 길항제 및/또는 FG2 및/또는 FGF20과 같은 하나 이상의 다른 FGF를 포함한다.
"후기 원시선조(PPS)" 세포는 포유류 배아 발달의 초기 단계 동안 포배를 형성하는 원시 선조 구조의 후단의 세포로부터 수득가능한 세포 또는 이와 기능적으로 및/또는 표현형적으로 상응하는 세포를 의미한다. 후기 원시선조는 좌우 대칭을 확립하고, 낭배 형성 부위를 결정하며 배엽 형성을 개시한다. 전형적으로, 후기 원시선조는 중배엽의 전구(즉, 중배엽으로 추정되는)이며 전기 원시선조는 내배엽의 전구(즉, 내배엽으로 추정되는)이다. 후기 원시선조의 특징적 또는 대표적 비제한적인 예로 Brachyury (T)을 포함한다. 전기 원시선조의 특징적 또는 대표적 비제한적인 예는 SOX17이다. MIXL1는 후기 및 전기 원시선조 모두에 의해 발현될 수 있다.
또한, 후기 원시선조 세포의 생산은, 후기 원시선조 세포가 존재하는 다른 세포 유형이 없는 후기 원시선조 세포의 순수한 또는 동종 집단이라는 것을 암시하는 것을 의미하지 않는다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, "후기 원시선조 세포" 또는 "후기 원시 선조 세포 집단"에 대한 언급은 세포 또는 세포 집단이 후기 원시선조 세포를 포함한다는 것을 의미한다.
적절하게는, 본 발명에 따른 후기 원시선조 세포는, 이하에 보다 자세히 기재될 바와 같이, hPSC 세포를 hPSC 세포의 후기 원시선조 세포로의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 제제를 접촉시킴으로써 생산된다.
전형적으로, 하나 이상의 제제는 골 형태형성 단백질 4(BMP4), 액티빈 A 및/또는 CHIR99021과 같은 Wnt 효능제를 포함한다.
"인간 다능성 줄기세포" 및 "hPSC"라는 용어는 다능성을 보이는 인간 조직으로부터 유래된, 수득가능한 또는 발생하는 세포를 지칭한다. hPSC는 인간 배아 줄기세포일 수 있거나 인간 유도된 다능성 줄기세포일 수 있다.
인간 다능성 줄기세포는 내세포괴로부터 유래될 수 있거나 야마나카(Yamanaka) 인자를 사용하여 많은 태아 또는 성인 체세포 유형으로부터 재프로그램화될 수 있다. hPSC의 생성은 체세포 핵이식을 사용하여 가능할 수 있다.
"인간 배아 줄기세포", "hES 세포" 및 "hESC"라는 용어는 성숙한 동물에 존재하는 모든 세포 유형을 산출하는 능력을 갖는 자기 재생 및 다능성 또는 전분화능(totipotent)인 인간 배아 또는 포배로부터 유래된, 수득가능한 또는 발생하는 세포를 지칭한다. 인간 배아 줄기세포(hESC)는 예를 들어, 인간 생체 내 착상 전 배아, 시험관 내 수정된 배아, 또는 포배 단계로 확장된 단세포 인간 배아로부터 수득된 인간 포배로부터 단리 될 수 있다.
"유도된 다능성 줄기세포" 및 "iPSC"라는 용어는 OCT4 , SOX2 , KLF4 및 c- MYC의 바람직한 조합을 포함하는, 전사 인자와 같은 외인성 유전자의 발현을 통하여 임의의 재프로그램화된 유형의 인간 성인 체세포로부터 다능성 단계로 유래가능한, 수득가능한 또는 발생하는 세포를 지칭한다. hiPSC는 hESC에 상당하는 다능성 수준을 보이지만 분화 이전의 유전자 교정 및 세포 전달과 공존하거나 공존하지 않는 자가 요법을 위하여 환자로부터 유래 될 수 있다.
보다 일반적으로는, 본원에 기재된 방법은 임의의 환자로부터 유래된 임의의 다능성 줄기세포 또는 변형되어 유전자-편집을 사용한 돌연변이 모델을 생성하는 hPSC 또는 유전자-편집을 사용하여 교정된 돌연변이 hPSC에 적용될 수 있다. 유전자-편집은 CRISPR, TALEN 또는 ZF 뉴클레아제 기법의 방식에 의해 가능할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다양한 형식은 하기의 일련의 단계를 포함한 방법을 제공하며, 이는 전술한 바로부터 알 수 있을 것이다:
(i) hPSC를 hPCS의 후기 원시선조 세포로의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계;
(ii) 후기 원시선조 세포를 후기 원시선조 세포의 중간 중배엽 세포로의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계; 및
(iii) 중간 중배엽 세포를 FGF9 및, 임의의, BMP7, 레티노산, AGN193109와 같은 RA 길항제, CHIR99021와 같은 Wnt 효능제, FGF20, 및 헤파린의 하나 이상과 접촉시켜 중간 중배엽 세포로부터 후신 중간엽 세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하는 단계.
이러한 일련의 단계는 다음과 같이 이하에 기재될 것이다.
(i) hPSC의 후기 원시선조로의 분화
전술한 바로부터 알 수 있는 바와 같이, 이에 제한되는 것은 아니지만, APEL 분화 배지(Ng et al., 2008, Nat. Protoc. 3: 768)같은 혈청이 없는 적절한 배지에서 hPSC를 BMP4, 액티빈 A 및/또는 CHIR99021와 접촉시켜 적절하게 후기 원시선조 세포를 포함하는 후기 원시선조 세포를 생산한다. hPSC는 hESC 또는 iPSC일 수 있다.
적절하게는, BMP4는 약 5 내지 40ng/mL의 농도이고 액티빈 A는 약 30 내지 40ng/mL의 농도이다. 한가지 실시형태에서 BMP4의 농도는 약 20 내지 35 ng/mL, 또는 보다 바람직하게는 약 30ng/mL이다. 한가지 실시형태에서, 액티빈 A의 농도는 약 5 내지 30ng/mL, 또는 보다 바람직하게는 10ng/mL이다. 적절하게는, 최적의 상대적 활성 비율은 3:1 내지 1:6의 BMP4 대 액티빈 A의 범위이다. 바람직하게는, 최적의 상대적 활성 비율은 액티빈 A에 대하여 3:1 내지 1:1 BMP4의 범위이다.
일부 실시형태에서, CHIR99021와 같은 Wnt 효능제는 약 0.5 내지 50μM, 바람직하게는 약 4 내지 30μM, 보다 바람직하게는 약 5 내지 20μM 또는 유리하게는 약 8μM의 농도 범위일 수 있다. 특정 실시형태에서, CHIR99021는 BMP4 및 액티빈 A 없이 단독으로 존재한다.
줄기세포 집단은 36 내지 120 시간동안 배지에서 BMP4, 액티빈 A 및/또는 CHIR99021와 같은 Wnt 효능제와 함께 배양될 수 있다.
일부 비제한적인 실시형태에서, 세포는 hESC에 필요한 것보다 더 긴 기간동안 BMP4, 액티빈 A 및/또는 CHIR99021과 접촉할 수 있다. 예로써, iPSC 같은 세포는 최대 96 내지 120 시간 동안 BMP4, 액티빈 A 및/또는 CHIR99021와 접촉할 수 있다.
매 24 내지 48시간 마다 배양 배지를 교환할 수 있다.
이론에 제한되는 것은 아니지만, 본원에 기재된 바와 같이 hPSC를 BMP4, 액티빈 A 및/또는 CHIR99021와 같은 Wnt 효능제와 접촉시킴은 후기 원시선조를 포함하는 원시 선조(PS)의 형성을 가져온다. 이는 중배엽 및 내배엽 조직의 생성으로의 초기 단계이다. 전형적으로, hPSC의 분화는 후기 원시선조의 특징적인 마커를 발현하는 세포(즉, 중배엽으로 추정되는) 및 전기 원시선조의 특징적인 마커를 발현하는 세포(즉, 내배엽으로 추정되는)를 포함하는 세포의 혼재된 집단에 대한 것이다.
후기 원시선조(중배엽으로 추정되는)의 특징적인 마커의 비제한적인 예로 Brachyury (T)를 포함한다.
전기 원시선조(내배엽으로 추정되는)의 특징적인 마커의 비제한적인 예는 SOX17이다.
(ii) 후기 원시선조 세포의 중간 중배엽( IM ) 으로의 분화
적절하게는, 후기 원시선조 세포 또는 후기 원시선조 세포를 포함하는 혼재된 원시 선조 집단을 APEL 분화 배지와 같은 혈청이 없는 적절한 배지에서 적어도 FGF9 및, 임의로, FGF2 및/또는 FGF20 및/또는 레티노산(RA) 길항제를 포함하는 하나 이상의 섬유모세포 성장인자(FGF)와 접촉시킨다.
전형적으로, 길항제를 신호화하는 레티노산은 레티노산 수용체(RAR) 억제제 또는 AGN193109와 같은 길항제이다.
적절하게는, FGF2, FGF9 및/또는 FGF20은 약 100 내지 400ng/mL의 농도이다. 바람직한 실시형태에서, FGF2, FGF9 및/또는 FGF20은 약 150 내지 300ng/mL 또는 유리하게는 약 200ng/mL의 농도이다. 한가지 실시형태에서, RA 길항제(예를 들어, AGN193109)의 농도는 약 0.1 내지 10μM 또는 보다 바람직하게는 0.5 내지 5μM이다.
세포를 적어도 96시간 내지 최대 190 내지 200시간 동안 FGF9와 단독으로 접촉시키거나 FGF2 및/또는 FGF20 및/또는 RA 길항제(예를 들면, AGN193109)와 함께 접촉시킨다. 바람직하게는, 세포를 약 96시간 동안 FGF9와 단독으로 접촉시키거나 FGF2 및/또는 FGF20 및/또는 RA 길항제(예를 들어, AGN193109)와 함께 접촉시킨다.
매 40 내지 48시간마다 배양 배지를 교환할 수 있다.
한가지 실시형태에서, 후기 원시선조 세포(전형적으로 후기 원시선조(중배엽으로 추정되는) 및 전기 원시선조(내배엽으로 추정되는)의 특징적인 마커를 발현하는)를 FGF9와 단독으로 접촉시키거나 FGF2 및/또는 FGF20과 함께 접촉시킴은 세포의 중간 중배엽(IM)의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단으로의 분화를 초래한다. 중간 중배엽의 특징적인 마커의 비제한적인 예로는 PAX2, LHX1 및 OSR1를 포함한다.
(iii) 중간 중배엽( IM )의 네프론 전구 및 요관 상피 전구세포로의 분화
적절하게는, 후기 원시선조 세포를 FGF2, FGF9 및/또는 FGF20과 접촉시켜, 결과적으로 IM세포가 APEL 분화 배지와 같은 혈청이 없는 적절한 배지에서 FGF9와 단독으로 접촉되거나, BMP7, RA, RA 길항제, FGF20, Wnt 효능제 및/또는 헤파린 중 하나 이상과 함께 접촉된다.
적절하게는, FGF9은 약 20ng 내지 1㎍/mL의 농도이다. 바람직한 실시형태에서, FGF9는 약 50 내지 500ng/mL, 보다 바람직하게는 약 100 내지 300ng/mL 또는 유리하게는 약 200ng/mL의 농도이다. 전형적으로, 헤파린은 약 0.1 내지 10㎍/mL, 바람직하게는 약 0.3 내지 5㎍/mL, 0.5 내지 2㎍/mL 또는 유리하게는 약 1㎍/mL의 농도로 포함된다.
실시형태에서, FGF20은 약 20ng 내지 1㎍/mL의 농도이다. 바람직한 실시형태에서, FGF20은 약 50 내지 500ng/mL, 보다 바람직하게는 약 100 내지 300ng/mL 또는 유리하게는 약 200ng/mL의 농도이다.
FGF20은 유사한 생물학적 활성은 갖는 이러한 제제로서 FGF9를 대체하거나 보완할 수 있음을 알 수 있을 것이다.
실시형태에서, BMP7은 약 25 내지 75ng/mL의 농도이다. 바람직한 실시형태에서, BMP7은 약 35 내지 60ng/mL, 45 내지 55ng/mL 또는 유리하게는 약 50ng/mL의 농도이다.
실시형태에서, RA는 약 10pM 내지 1μM의 농도이다. 바람직한 실시형태에서, RA는 약 30pM 내지 0.5μM, 보다 바람직하게는 약 50pM 내지 0.2μM 또는 유리하게는 약 0.1μM의 농도이다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 사전 데이터는 고농도의 RA가 요관 상피 전구세포 비율의 상대적 증가를 촉진하며 저농도의 RA가 요관 상피 전구세포 비율의 상대적 감소를 촉진함을 시사한다.
실시형태에서, AGN193109와 같은 RA 길항제는 약 50pM 내지 10μM의 농도이다. 바람직한 실시형태에서, AGN193109는 약 0.01μM 내지 5μM, 보다 바람직하게는 약 0.1μM 내지 5μM 또는 유리하게는 약 1μM의 농도이다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 사전 데이터는 고농도의 AGN193109가 후신 중간엽 세포 비율의 상대적 증가를 촉진함을 시사한다.
실시형태에서, CHIR99021와 같은 Wnt 효능제는 약 0.1μM 내지 10μM, 바람직하게는 약 0.2μM 내지 5μM 또는 보다 바람직하게는 약 1 내지 2μM 범위의 농도이다.
본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 기존 데이터는 Wnt 효능제가 IM 세포로부터의 네프론 전구세포 생산의 상대적 증가를 촉진함을 시사한다. 바람직하게는, 세포를 적어도 72시간 내지 최대 360시간 동안 FGF9와 단독으로 접촉시키거나, BMP7, RA, Wnt 효능제, RA 길항제 및/또는 FGF2과 헤파린 중의 하나 이상과 함께 접촉시킨다. 바람직하게는, 세포를 약 160 내지 220시간 또는 보다 바람직하게는 약 190 내지 200시간 동안 접촉시킨다.
매 48 내지 72시간마다 배양 배지를 교환할 수 있다.
전형적으로, 본원에 기재된 바와 같이, 중간 중배엽 세포를 FGF9와 단독으로 접촉시키거나 BMP7, RA, RA 길항제, Wnt 효능제 및/또는 FGF20 및 바람직하게는 헤파린 중 하나 이상과 함께 접촉함은 중간 중배엽 세포를 후신 중간엽 세포 및 요관 상피 세포 계통으로 분화시킨다. 후신 중간엽 계통은 약 72시간 동안 FGF9 및 헤파린과 배양한 후에 궁극적으로 생산되는 네프론 전구세포를 포함한다. 또한 RA 유사체 또는 효능제 및/또는 RA 길항제의 존재, 부재 및/또는 농도는 본 방법에 의해 생산되는 후신 중간엽과 비교하여 본 방법에 의해 생산되는 요관 상피의 상대적 양을 조작하기 위해 선택될 수 있다. 이전에 기재된 바와 같이, RA는 후신 중간엽의 비용으로 요관 상피의 형성을 촉진하지만 AGN193109와 같은 RA 길항제는 요관 상피의 비용으로 후신 중간엽의 형성을 촉진한다. 또한 CHIR99021와 같은 Wnt 효능제는 요관 상피의 비용으로 후신 중간엽의 생존 및/또는 형성을 촉진한다.
이에 제한하는 것은 아니지만, 후신 중간엽 계통의 세포 또는 그의 세포의 특징적 또는 대표적 마커의 비제한적인 예로는 WT1, SIX1 , SIX2 , SALL1 , GDNF 및/또는 HOXD11를 포함한다.
이에 제한하는 것은 아니지만, 네프론 전구세포의 특징적 또는 대표적 마커의 비제한적인 예로는 WT1, SIX2 , CITED1 , PAX2 , GDNF , SALL1 및 HOXD11를 포함한다.
이에 제한하는 것은 아니지만, 요관 상피 계통 세포의 특징적 또는 대표적 마커의 비제한적인 예로는 HOXB7 , GATA3 , CALB1 , E- CADHERIN , PAX2 및/또는 cRET, 를 포함한다.
네프론 전구세포는 WT1, SIX2 , CITED1 , PAX2 , GDNF , SALL1 및 HOXD11의 동시발현에 기반한 hPSC 세포 배양 방법의 개시 이후 11 내지 15일, 또는 유리하게는 14일(11 내지 15일의 범위)에 최대한으로 생성될 가능성이 있다.
요관 상피 전구세포는 HOXB7 , cRET , E- CADHERIN 및 PAX2의 동시발현에 기반한 hPSC 세포 배양 방법의 개시 이후 적어도 10일, 또는 유리하게는 14일에 최대한으로 생성될 수 있다.
본 방법의 바람직한 형태에서, FGF9는 본원에 기재된 (ii) 및 (iii) 단계 동안 적어도 일부동안 존재하거나 내내 존재한다. 보다 바람직하게는, CHIR99021과 같은 Wnt 효능제는 본원에 기재된 (i) 단계에서 적어도 일부동안 존재한다.
이의 특히 바람직한 방법은 하기의 일련의 단계를 포함한다:
(a) 인간 다능성 줄기(hPSC) 세포를 hPSC 세포의 후기 원시선조 세포로의 분화를 촉진시키는 CHIR99021과 접촉시키는 단계;
(b) 후기 원시선조 세포를 FGF9와 단독으로 접촉시키거나 AGN193109와 같은 RA 길항제와 함께 접촉시켜 후기 원시선조 세포의 IM 세포로의 분화를 촉진시키는 단계; 및
(c) IM 세포를 FGF9 및 헤파린과 단독으로 접촉시키거나 AGN193109와 같은 R
A 길항제와 함께 접촉시켜 IM 세포로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하는 단계.
이러한 바람직한 형태에 따라서, 약 18 내지 20일의 총 배양 기간 동안 hES 세포의 초기 집단으로부터 신장 분화를 촉진시키는 것이 가능하다.
전술한 관점에서, BMP4, BMP7, 액티빈 A, FGF2, FGF9 및 FGF20와 같은 단백질 제제에 대한 언급은, 이에 제한하는 것은 아니지만, 인간, 마우스 및 래트를 포함하는 임의의 포유류 기원의 고유한 또는 재조합의 또는 화학적 합성 단백질을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 단백질은 종래 기술에 잘 공지된 바와 같은 화학적 수정, 글리코실화, 지질화, 바이오틴과 같은 라벨 및 에피토프 태그 또는 융합 파트너와 같은 추가적인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 단백질은 일반 실험실 또는 제조 공정에 의해 상업적으로 수득될 수 있고/있거나 재조합의 또는 화학적 합성 단백질로 제조될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 생산된 단리된 또는 정제된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포를 제공한다.
네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포는 전술하여 기재된 바와 같이 적절한 배양 기간 후에 수득될 수 있고 일부 선택적인 실시형태에서 표면 마커의 동시발현에 따라 추가로 농축되거나 정제될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 세포 농축 또는 정제는, 이에 제한하는 것은 아니지만, 유동 세포계산 세포 분리(예를 들어, FACS), 양성 또는 음성 세포 선별, 마그네틱 면역비드(예를 들어, DynabeadsTM), 패닝, 농축 분리, 보충물 매개된 용해 등을 포함하는 종래 기술에 공지된 임의의 기술 또는 공정에의한 것일 수 있다.
신장 재생 및 이식
만성 신장 질환은 매년 3100만의 미국인 및 170만의 호주인이 앓는 심각한 질병이다. 환자들은 증상을 보이기 전에 그들 신장의 90%를 잃을 수 있으며, 이는 신부전 및 투석 또는 신장 이식을 초래한다. 말기 신장 질환에 대한 미국의 2010년 의료 보험 지출은 28억 달러로 추정되었다.
따라서, 본 발명의 양태는 신장 또는 신장 세포 또는 조직을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 단리된 또는 정제된 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포로부터 신장 또는 신장 세포 또는 조직을 분화시켜 신장 또는 신장 세포 또는 조직을 생산하는 단계를 포함한다.
본 발명은 요관 상피의 세포 및 후신 중간엽 계통 또는 구획의 생산을 위한 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 세포는 동시에 유도되며 시험관 내에서 서로의 분화를 지시한다. 이러한 세포는 요관 트리 및 네프론 전구 중간엽을 포함하는 별개의 세관 상피 구조로 발달할 수 있다. 따라서 본 발명에 따라 생산되는 hPSC 세포-유래된 요관 상피 및/또는 네프론 전구세포가 요관 및 장관막 중간엽 구획 모두로부터 신장 세포로의 분화가 지시될 수 있음이 제시된다.
적절한 조건 하에서, 네프론 전구세포는, 이에 제한하는 것은 아니지만, 연결 분절과 같은 네프론 상피, 원위 곡뇨 세관(DCT) 세포, 원위 곧은 세관(DST) 세포, 근위 곧은 세관(PST) 분절 1 및 2, PST 세포, 발세포, 사구체 내피 세포, 헨레의 상승 고리 및/또는 헨레의 하강 고리를 포함하는 임의의 네프론 분절(집합관 외의)로 분화할 수 있다.
게다가, 따라서 이러한 세포의 '자가-조직' 능력은 신장 조직 또는 기관 생체조작의 방식처럼 신장 복구를 촉진시키는데 활용될 수 있다.
이러한 양태의 한가지 실시형태는 단리된 또는 정제된 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포를 인간에게 채용적으로 전달 또는 이식하여 신장 또는 신장 세포 또는 조직을 생성할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
이러한 실시형태에 따라서, 단리된 또는 정제된 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포의 신장 또는 신장 세포 또는 조직의 분화가 시험관 내에서 발생할 수 있다.
이러한 양태의 또 다른 실시형태에서, 단리된 또는 정제된 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포의 신장 또는 신장 세포 또는 조직 또는 이러한 전구의 시험관 내 분화를 적어도 부분적으로 포함한다. 적절하게는, 시험관 내에서 적어도 부분적으로 분화된 세포 신장, 또는 신장 세포 또는 조직, 또는 이의 전구는 인간에게 채용적으로 전달 또는 이식된다.
한쪽 또는 양쪽에 따른 실시형태에서, 신장, 신장 세포 또는 조직은 신장, 이의 세포 또는 조직의 재생을 촉진시키거나 재생에 기여한다.
한가지 실시형태는 조작되거나 인공적인 신장을 생산하기 위한 단리된 네프론 전구 및/또는 요관 상피 전구의 용도를 제공한다. 예를 들어, 단리된 네프론 전구 및/또는 요관 상피 전구는 탈세포화된 인간 신장과 같은 스캐폴드, 폴리에스터 플리스 또는 생체분해 가능한 폴리머 스캐폴드 내에서 삽입되어 재생된 신장 관 구조를 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 신장 투석을 지원하거나 촉진시키는 장치에서 단리된 네프론 전구 및/또는 요관 상피 전구로부터 분화된 신장 세포 또는 조직의 용도를 제공한다. 예를 들어, 생체인공적인 신장은 신장 세포, 또는 그의 전구를 반응기 내로 접종함으로써 투석과 병행하는 용도의 '신장 지원 장치'를 생산할 수 있을 것이다.
또한, 본원에 기재된 단리된 네프론 전구 및/또는 요관 상피 전구로부터 분화되거나 달리 수득된 신장 세포 또는 조직을 사용한 “바이오프린팅된” 신장 또는 다른 네프론-포함 기관, 오르가노이드 또는 기관-유사 구조도 고려된다.
단지 예로써, 인비테크(Invetech)와 제휴된 오르가노보(Organovo)는 인간 기관을 재현하기 위해 인간 세포를 원하는 방향으로 배치시키는 하이드로겔 스캐폴드를 사용하는 기관 인쇄기를 개발했다. 본원에 기재된 단리된 네프론 전구 및/또는 요관 상피 전구로부터 분화되거나 달리 수득된 신장 세포 또는 조직은 상기 언급된 오르가노보 기계과 같은 기계와 함께 사용되어 “바이오프린팅된” 인간 신장 오르가노이드 또는 신장을 발달시킬 수 있다.
또한 본원에 기재된 단리된 네프론 전구 및/또는 요관 상피 전구의 유도된 분화는 세포 요법을 위한 정제된, 분화된 신장 세포 아류형의 잠재적인 공급원을 제공할 수 있음을 알 수 있을 것이다.
예를 들어, 본원에 기재된 단리된 네프론 전구 및/또는 요관 상피 전구는 특정 유전적으로 유전된 신장 병태의 유전자 교정 후에 신장 세포 또는 조직을 재생하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 알포트 증후군(COL4A3 돌연변이) 및 다낭성 신장 질환(PKD1, PKD2 등)을 포함하는 단일 유전자 신장 장애의 교정은 유전자 교정은 후에 본원에 기재된 단리된 네프론 전구 및/또는 요관 상피 전구로부터의 신장 조직의 재생에 의해 지원되거나 촉진될 수 있다.
특정 실시양태에서, 유전적 신장 질환을 앓는 환자로부터 유래된, 수득된 또는 발생하는 iPS 세포주는 시험관 내 유전적 돌연변이의 회복에 사용될 수 있다. 이러한 세포는 본 발명의 방법에 따라 사용되어 자가 세포 요법을 위해 환자에게 투여될 수 있다.
신독성 스크리닝
또한 본원에 기재된 단리된 네프론 전구 및/또는 요관 상피 전구의 유도된 분화는 신독성 스크리닝을 위해 정제된, 분화된 신장 세포, 신장 오르가노이드 또는 신장 조직 아류형의 잠재적 공급원을 제공할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
약물 및 세포-기반 요법을 포함하는, 질환 예방을 목적으로 하는 개입의 개발은 시험관 내 약물 테스트에 대한 1급 인간 신장 세포의 가용성 부족으로 인해 어려움을 겪는다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 하나 또는 다수의 화합물의 신독성을 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 또는 다수의 화합물을 단리 및 정제 후의 오르가노이드로서 본원에 기재된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포 또는 분화되거나 이로부터 달리 수득된 신장 세포 또는 조직과 접촉시켜 하나 또는 다수의 화합물의 신독성 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 본 방법은 오르가노이드를 사용하여 수행되거나 단리된 또는 정제된 네프론 전구세포로부터, 또는 네프론 전구세포로부터 유래된 신장 세포 또는 조직으로 수행된다.
수많은 유용한 약물은 직접적 세관 효과(예를 들어, 아미노글리코사이드 항생제, 시스플라틴, 방사성대조 배지, NSAID, ACE 억제제), 간질성 신염(예를 들어, β 락탐 항생제, 리튬, CsA, 페니토인과 같은 항-간질성 약물) 또는 예를 들어, 사구체 신염과 같은 신독성 부작용을 갖는다. 따라서, 본원에 기재된 단리된 또는 정제된 네프론 전구세포로부터 분화되거나 달리 수득되는 정의된, 특정한 신장 세포 및 조직 유형을 사용하여 새로운 또는 현존하는 약물을 테스트하는 것이 유리할 수 있다.
신독성은 이에 제한하는 것은 아니지만, Qiagen로부터의 Human Nephrotoxity RT2 Profiler™ PCR Array 또는 Eurofins로부터의 High Content Analysis (HCA) Multiplexed Nephrotoxity Assay에 의한 것과 같은 감소된 크레아티닌 클리어란스 또는 바이오마커 발현을 포함하는 시험관 내 신장 세포 기능에 대한 임의의 적절한 테스트에 의해 평가되거나 측정될 수 있다.
본 발명을 용이하게 이해하고 실제적인 효과에 투입할 수 있도록 하기 위하여, 기준은 하기의 비제한적인 실시예로 이뤄진다.
실시예
물질 및 방법
hESC 배양 및 분화
HES3(MIXL1 GFP/wt )세포를 일반적으로 20% 녹아웃 혈청 교환(Life Technologies), 100μM MEM NEAA(Life Technologies), 110μM 2-머캅토에탄올(Life Technologies), 1 x 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies), 1 x 글루타맥스(Life Technologies) 및 10ng/mL bFGF(R&D systems)으로 보충된 F12/DMEM(Life Technologies)에서 조사된 MEF 영양(feeder) 세포에 배양하였다. 분화를 시작하기 전날, 세포를 마트리겔 코팅된 96-웰 플레이트에 12,000-15,000세포/cm2로 플레이팅하였다. 세포를 밤새 배양한 후, 이전에 설정된 혈청비함유 배지 APEL중의 2 내지 3일 동안 30ng/mL BMP4(R&D systems) 및 10ng/mL 액티빈 A(R&D systems) 또는 8μM CHIR99021에 노출시킨 후, 4일 동안 APEL 배지 중의 200ng/mL FGF9 및 1μg/mL 헤파린에 노출시켜 IM 세포를 유도하였다. 이어서, BMP4/액티빈 A 유도의 경우, 세포를 4 내지 11일 동안 200ng/mL FGF9, 50ng/mL BMP7, 0.1μM RA 및 1μg/mL 헤파린에 노출시켰다. CHIR99021 유도의 경우, 세포를 6일 동안 200ng/mL FGF9 및 1μg/mL 헤파린에 노출시킨 후 또 다른 6일 동안 APEL 기본 배지에서 배양하였다. 배지는 매 2일마다 교환하였다.
플루오레세인-활성화된 세포 분류
미분화된 또는 분화된 hESC로부터 세포 현탁액을 제조하였다. hESC를 37 oC 에서 5분 동안 트리플 설렉트(TripLE Select, Life Technologies)로 수거하고 뾰족한 피펫을 사용하여 분리하였다. 40μm 나일론 메쉬를 통해 세포를 여과시킨 후, 2 x 106세포/ml의 최종 밀도에서 0.5% FCS 및 1mM EDTA를 포함하는 PBS에서 재현탁시켰다. 사멸 세포를 표시하기 위하여 50mg/ml의 최종 농도에서 프로피디움 아이오다이드(Sigma)를 첨가하였다. FACS Aria(Becton Dickinson)로 FACS 분석을 수행하였다. 프로피디움 아이오다이드에 기반한 플롯에서 사멸 세포를 배제하였다. 모든 FACS 분석을 성공적으로 3회 초과로 반복하였고 대표적인 결과를 도시하였다.
면역 세포 화학
세포를 4 oC에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드와 혼합한 후에 PBS로 세척하였다. 그 후 세포를 실온에서 1시간 동안 1% BSA, 0.2% 밀크, 0.3% 트리톤 X/PBS로 차단하고, 1차 항체와 함께 4 oC에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음의 항체 및 희석이 사용되었다: 토끼 항-PAX2(1:200, #71-6000, Zymed Laboratories Inc.), 염소 항-OSR1(1:75, #sc-67723, Santa Cruz Biotechnology), 염소 항-LHX1(1:75, #sc-19341, Santa Cruz Biotechnology), 마우스 항-TBX6(1:200, AF4744, R&D systems), 염소 항-SOX17(1:200, #AF1924, R&D systems), 토끼 항-SIX2(1:200, #11562-1-AP, Proteintech), 마우스 항-ECAD(1:200, #610181, BD Biosciences), 토끼 항-WT1(1:100, #sc-192, Santa Cruz Biotechnology), 마우스 항-HOXD11(1:200, #SAB1403944, Sigma-Aldrich), 염소 항-GATA3(1:200, AF2605, R&D systems), 토끼 항-JAG1(1:200, #ab7771, Abcam), 토끼 항-CDH6(1:100, #HPA007047, Sigma Aldrich) 및 염소 항-SYNPO(1:200, #sc-21537, Santa Cruz Biotechnology). 2차 항체는: 알렉사(Alexa)-488-접합된 염소 항-토끼, 알렉사-594-접합된 당나귀 항-토끼, 알렉사-488-접합된 당나귀 항-염소 및 알렉사-594-접합된 염소 항-마우스(1:250, Life Technologies)였다. Nikon Ti-U 현미경 또는 차이스(Zeiss) LSM 510 메타 UV 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하였다. 모든 FACS 분석을 성공적으로 3회 초과로 반복하였고 대표적인 결과를 도시하였다.
면역 형광법
펠렛을 4 oC에서 10분 동안 4% PFA로 고정하고, 파라핀에 포메하여 7μm 두께로 절단하였다. 절편을 실온에서 1시간 동안 양 혈청으로 차단한 후, 항원 비차단 용액(Antigen Unmasking Solution, Vector labs)을 사용하여 항원 회복을 수행하였다. 1차 항체를 4 oC에서 밤새 인큐베이션하고 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음의 항체 및 희석이 사용되었다: 토끼 항체-CALB1(1:200, #C2724, Sigma-Aldrich), 토끼 항체-AQP1(1:200, sc-20810, Santa Cruz Biotechnology), 토끼 항체-AQP2(1:200, AB3274, Millipore), 토끼 항체-SLC3A1(1:100, 16343-1-AP, Proteintech) 및 토끼 항-인간 특이적 미토콘드리아(HuMt)(1:800, #ab92824, Abcam). 항-인간 특이적 핵(HuNu)(1:800, #MAB1281, Merck)과 염색하기 위해 OCT 화합물(Sakura)에서 포메된 동결된 절편을 사용하였다. 올림푸스 BX-51 현미경 또는 차이스(Zeiss) LSM 510 메타 UV 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하였다. 모든 FACS 분석을 성공적으로 3회 초과로 반복하였고 대표적인 결과를 도시하였다.
유전자 발현 분석
RNeasy 마이크로 키트(RNeasy micro kit, QIAGEN)를 사용하여 세포에서 전체 RNA를 추출하고 슈퍼 스크립트 III 역전사효소(Super Script III reverse transcriptase, Life Technologies)를 사용하여 100ng 초과의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. ABI PRISM 7500 실시간-PCR 기계에 의해 사이버 그린(Syber Green, Applied Biosystems)으로 정량적 RT-PCR(qRT-PCR) 분석을 수행하였다. 먼저 모든 절대적 데이터를 GAPDH에 대해 표준화시킨 후, 대조군 샘플에 대해 표준화 시켰다(델타-델타-Ct 방법). 통상의 RT-PCR 분석을 원태크 DNA 폴리머라아제 원테크(OneTaq) DNA 폴리머라아제(NEB)를 사용하여 제조자의 교시에 따라 수행하였다. 모든 PCR 분석을 성공적으로 3회 초과로 반복하였고 대표적인 이미지를 도시하였다. RT-PCR 및 qRT-PCR에 사용된 프라이머 서열을 나열한다(표 1 및 표 2).
유도된 세포의 비율 정량화
PAX2+, LHX1+, SOX17+, SIX2+ 또는 WT1+에 대해 양성인 분화된 세포의 비율을 정량하기 위해서, 세포를 핵 염색물인 DAPI와 함께 각 항체로 면역형광적으로 염색하였다. 전체 세포에 대한 분화된 세포의 비율을 올림푸스 BX-51 현미경의 10X 배율을 사용하여 실험 당 1 또는 2개의 대표적인 필드(3번의 독립 실험에서 총 3 내지 5개의 대표적인 필드, 총 1 내지 1.5 x 103개의 세포)에서 이미지 J를 사용하여 수동으로 계수하였다.
3 D 배양
hESC-유래된 유도된 신장 세포를 수거하고 분화 12 내지 13일째에 트리플 설렉트(TripLE select, Life Technologies)를 사용하여 단일 세포로 분리하였다. 세포를 x400 g에서 2분 동안 회전시켜 펠렛을 형성한 후 10μg/cm2의 콜라겐 IV(Becton Dickinson) 코트와 함께 직경 13mm의 0.4μM 구멍을 갖는 필터막(#7060-1304 Whatman) 상에 플레이팅하였다. 이 필터를 4일 동안 10% FCS/DMEM의 배양 배지 상에 부유시켰다.
재응집 검정
재응집 검정은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다5,29. 간략하게는, 필터막을 콜라겐 IV로 10μg/cm2로 코팅하였다. 재조합될 배아 신장 세포를 제조하기 위하여, 12.5 내지 13.5일된 마우스로부터 배아 신장을 10분 동안 37 oC에서 아큐타아제(Accutase, Life Technologies)로 분해시키고 수동으로 피펫팅하여 분리시켰다. 100μm 나일론 메쉬를 통하여 세포를 여과시킨 후, 4-10 x 105개의 배아 신장 세포를 4%의 hESC-유래된 세포와 재조합시킨 후 펠렛을 형성하기 위하여 2분 동안 x400 g에서 원심분리하였다. 상기와 같이 제조된 필터막 상에 펠렛을 플레이팅한 후, 10% FCS/DMEM 배양 배지를 사용하여 4일 동안 배양하였다.
결과
본 발명자들은 hESC가 특정한 최종 결과6를 표시하거나 배제시키는 유전자를 포함하는, 신장 발달의 중요한 세포 구획으로 분화하는 것에 대해 3가지 단계 프레임워크를 정의했다(도 1a). 중배엽 및 내배엽 모두에 대한 전구세포 집단인 원시 선조는 액티빈 A7를 사용하여 마우스 ES 세포(mESC)로부터 유도될 수 있으며, BMP4 및 액티빈 A의 반대되는 구배는 마우스에서 전기(내배엽) 대비 후기(중배엽) 원시 선조를 특징짓는다8 ,9. 또한 정규 Wnt 신호화는 마우스 및 인간 ESC의 원시선조에 대한 유도제로서 보고되었다7 ,10. 초기에 IM이 후기 원시선조로부터 발생했기 때문에, 본 발명자들은 먼저 hESC가 마우스와 유사한 방식으로 이러한 모르포겐에 반응하는지 테스트하였다. 이전에 본 발명자들은, 20/100(ng/mL)의 BMP4/액티빈 A가, GFP가 원시선조의 강력한 마커인 MIXL1 유전자 좌위를 녹킹한(knocked), hESC 세포주인 MIXL1 GFP /wt 로부터 GFP+원시선조를 유도한다는 것을 밝혔다11. 본 발명자들은, 단층 배양에서 이러한 리포터 세포주를 사용하여, 최적의 분화를 위하여 BMP4 및 액티빈 A(5/200, 20/100, 30/10, 30/0 및 0/0ng/mL)의 수개의 조합 또는 정규 Wnt 신호화 효능제인, CHIR99021(5, 7, 9μM)의 다양한 농도를 테스트하였다. 모든 시험관 내 실험은 화학적으로 규명된 혈청-비함유 배지 조건12하에서 수행되었다. MIXL1, T(후기 원시선조), 및 SOX17(전기 원시선조)의 상대적인 발현은, 높은 BMP4/낮은 액티빈 A(30/10) 또는 높은 CHIR99021(>7μM)이 후기 원시선조에 최적이라는 것을 제시하였다(도 1c,d; 도 2a-c). 두 조건 하에서, 세포의 약 90%는 GFP+가 되었다(도 1b).
분화의 제2 단계는 원시선조로부터 IM을 유도하는 것이었다. 낭배 형성 후, 최종적인 중배엽은 IM, 측엽(PM) 및 측판 중배엽(LPM)을 발생시킬 수 있다. 다능성 세포의 신장 분화를 조사하는 기존의 연구는 IM 및 심지어 MM 형성의 확고한 마커로서 OSR1에 의존했다13. 그러나 OSR1발현은 중배엽 줄기에서 보여지며 LPM로 확장된다14. 원시선조의 초기 유도(BMP4/액티빈 A(30/10), 3일) 이후 자발적인 분화는, RT-PCR 또는 면역형광(IF)에 의하여 OSR1 발현(도 2d)을 나타냈지만 보다 결정적인 IM 마커(PAX2 및 LHX1 14-16)의 증거를 나타내지는 않았다. 이는 적절하게 다음 단계를 유도하는 추가의 성장 인자에 대한 필요성을 나타냈다. FGF 신호화가 하나의 가능한 요건이었다. FGF8은 원시선조로부터 후기 줄기 중배엽까지 발현되고 FGF9는 IM 및 PM17,18에서 발현된다. 시험관 내 MM 생존은 FGF2/BMP719 또는 FGF920에서의 배양으로 지지된다. 따라서, 본 발명자들은 후기 원시선조로부터 IM을 유도하기 위하여 3개의 FGF 패밀리 구성원인 FGF2, FGF8 및 FGF9의 능력을 테스트하였다. hESC-유도된 후기 원시선조를 IF 및 qRT-PCR로 분석하기 전 4일 동안 200ng/mL의 FGF2, 8 또는 9로 처리하였다(도 1e). FGF8이 아닌 FGF2 또는 FGF9의 존재 하에서 OSR1, PAX2 및 LHX1이 80% 초과의 세포 PAX2+에서 동시발현되었고, 이는 차별적인 IM 유도(도 1f-h)를 시사한다. FGF2 또는 FGF9에 반응하는 PAX2 및 LHX1 유도는 FGFR1 및 FGFR3에 대한 화학적 억제제인 PD173074에 의해 극적으로 억제되었다(도 3a,b). FGF9에 의한 IM 유도는 LPM 마커(FOXF1(도 1i) 및 OSR1(도 3b))의 억제와 함께 용량 의존적(200ng/ml에서 최적)이었다. BMP4/액티빈 A 또는 CHIR99021로의 초기 유도 후 FGF9로 유도한 후 PAX2 및 OSR1 단백질의 세포 c-국소화가 관찰되었으며, 79.5%(표준편차±4.7%; n=5)의 세포에서 LHX1 및 PAX2 단백질이 공동-국소화 되었다. 그러므로, FGF 신호는 후기 원시선조 이후 IM를 효율적으로 특징짓기에 충분하다. 초기 중배엽 발달에서, BMP 신호화는 측면-중간 패턴화를 조절하는 중요한 모르포겐이다. 낮은 BMP4는 IM을 유도하지만, 높은 BMP4는 LPM을 유도하고 BMP 신호화의 NOG(noggin)-매개된 길항작용은 PM21에 요구된다. 본 발명자들은 BMP4 및 NOG를 FGF9와 함께 사용하여 시험관 내에서 이러한 패턴화를 재생산하였다(도 1j). 여기서, FOXF1는 NOG에 의해 효율적으로 억제되는 반면, IM 마커 PAX2 및 LHX1의 유도는 오직 FGF9이 단독으로 존재하거나 NOG가 낮은 수준으로 존재할 경우에만 지속되었다(도 1j; 도 4a,b). PM 마커 TBX6가 IM 마커와 유사한 방식으로 작용하였지만(도 4b), 발현은 낮았다. IF는 TBX6+ 세포가 PAX2+ IM 세포(도 1k)를 완전히 배재한 소수의 집단임을 밝혀냈다. 또한, 원시선조는 내배엽으로의 분화가 가능하지만, IF는 단지 0.244%(± 0.099% 표준편차; n=5)의 세포만이 중배엽으로의 분화의 특이성을 확증하는 확고한 내배엽 마커(SOX17)에 대해 양성이었다는 것을 밝혔다.
포유류에서, IM은 신장, 생식선 및 부신으로 분화한다. 이를 형성하기 위한 제1 구조는 신장관(ND)이며, 이를 따라 3개의 짝을 이룬 배설 기관(머리부터 꼬리의 순서로 전신, 중신, 후신)이 동일한 신형성삭(nephrogenic cord)으로부터 형성된다. 출생 후에는 최종 영구 신장을 나타내는 후신만 존재한다. 후신 형성시 핵심은 중요 세포 성분간의 상호 유도적 이벤트이다(도 5). MM은 GDNF의 생산을 통하여 요관싹(UB)/ 요관 상피(UE)의 생성을 유도한다. UE는 FGF9의 생산을 통하여 MM의 생존을 촉진하며 Wnt 신호화를 통한 네프론 형성을 유도한다. 형성 후, 각 네프론은 네프론을 포함하는 수많은 기능적으로 상이한 세포 유형을 형성하기 위해 신장하고 분열한다(도 5). 레티노산(RA)이 요관 상피 성장을 촉진할 수 있고22 RA 및 BMP7은 이전에 mESC로부터 신장 계통을 유도하는 것으로 나타났으며23, FGF9은 시험관 내에서 마우스 네프론 전구세포를 유지할 수 있다는 증거에 기초하여20, 본 발명자들은 BMP7/액티빈 A를 사용한 초기 유도 이후 6일 내지 17일 동안 200ng/mL의 FGF9, 50ng/mL의 BMP7 및 0.1nM의 RA를 첨가하였다(도 6a). 전체 분화 프로토콜에 걸친 RT-PCR(도 6b)은 원시 선조(MIXL1, LHX1)의 IM(OSR1, PAX2, LHX1)에 이어서 MM(SIX2, WT1, GDNF, HOXD11)으로의 단계적인 분화를 나타냈다. HOXD11의 발현은 중신보다는 후신을 나타냈다24. 중요하게는, 동시 유도 ND/UE 유전자(C-RET 25 및 HOXB7 26)도 관찰되었다(도 6b). 사실, IF는 14일부터 ECAD+PAX2+ 상피 구조의 형성을 입증하였다(도 6c). 이러한 초기 상피 구조의 형성은 용량 의존적인 방식으로 RA에 의해 촉진되었으며(도 7b), 이는 또한 UE의 존재를 입증하였다22,27. 이러한 집단 및 주변 중간엽 모두는 시험관 내 증식의 증거를 밝혔다(도 7a). 신장 발달에서와 같이, SIX2 및 WT1에 대해 양성인 초기 중간엽 필드는 ECAD+ UE 구조를 둘러쌌으며(도 6c,e), 이러한 집단은 14일에 가장 우세하였다(도 6d). 이 시기 이후 WT1+세포 비율(%)은 계속 증가하였고, 이는 가능하게는 네프론 전구세포 및 더욱 분화된 네프론 구조 모두에서 이러한 단백질의 발현을 반영한다(도 6c). 22일째의 RT-PCR은 발세포(SYNPO, NPHS1 및 WT1), 근위 세관(AQP1 및 SLC3A1) 및 집합관 유전자(AQP2 및 SCNNB1)의 발현에 기반한 추가의 분화에 대한 증거를 나타냈다(도 7c). IF은 비록 초기 네프론 마커가 분명하지 않다 하더라도 WT1 및 SYNPO 단백질의 동시존재를 입증하였고 이는 발세포의 형성을 시사한다(도 7d).
이러한 데이터는 신장 발달에 필요한 다수의 상호작용 세포 구획의 협조된 분화를 시사한다. 기존의 연구가 유도 프로토콜에서 RA 및 BMP7을 사용한 반면, 본 발명자들의 데이터는 이것이 추가의 분화에 최적이 아닐 수 있음을 시사한다. 본 발명자들은 이를 SIX2의 일시적 발현, 분산된 중간엽의 존재 및 발달 신장에서 MM의 특징인 중간엽 PAX2 발현의 부재에 근거를 둔다. 초기 CHIR99021 유도 이후 RA/FGF9의 첨가는 UE 주변의 농축된 PAX2+ MM의 비용으로 강력한 UE를 생성하였다(도 8a). 반대로, 또한 FGF9 단독에서의 연장된 분화(12일 후 모든 요소가 제거됨을 주목하라; 도 6f)는, 신장 마커의 더 빠른 유도 및 SIX2와 같은 MM 유전자의 보다 연장된 발현과 함께, PS, IM 및 MM/UE의 단계적 유도를 유도했다(도 6g,h,i). 또 다른 UE 마커인 GATA3는 PAX2+ UE에서 동시발현되었으며, 보다 중요하게는, MM이 발달 신장에서 보여지듯이 UE 팁 주변에 밀집되게 나타났다(도 6h,j,k). 결정적으로, 이러한 프로토콜은 중간엽 및 UE 모두에서 PAX2 발현에 대한 증거(도 6k)를 나타내었으며 이는 신원성 잠재력을 더욱 시사한다. 최종적으로, WT1+ 및 WT1-세포 모두에서 HOXD11의 발현은 신장 기질의 추가적인 존재를 입증하며(도 8c), 이는 또한 FOXD1의 발현에 의해 지지된다(도 8b).
배아 발생동안, 또한 IM은 생식선 및 부신피질을 발생시킨다. 이러한 조직에 대한 마커의 발현 수준은 인간 태아 신장에서 보여진 것보다 높지 않았으며(도 8b), 이는 이러한 대안적인 운명이 유의하게 선택되지 않는다는 것을 시사한다. 하나의 hESC 세포주에서 또 다른 세포주로의 이러한 분화 프로토콜의 가변성은 H9 hESC 세포주 및 인간 iPS 세포주 CRL2429 C11을 사용하여 조사되었다(도 9). 또한, 후기 원시선조의 초기 유도, FGF9에 반응한 IM의 후속적 유도 및 계속 이어지는 분화도 이러한 세포주를 사용하여 관찰되었다.
신장 발달에 있어 모든 필수적인 세포 집단인 것으로 보이는 집단의 형성은, 자가-조직화 조직을 생성하기 위해 서로 신호하기 위한 이러한 세포의 잠재력을 시사했다. 결정적으로, 이는 네프론 형성을 포함해야 한다. 이러한 발생에 대한 능력을 추가로 평가하기 위해서, 본 발명자들은 초기 12일 내지 18일에 본 발명의 CHIR99021/FGF9 유도 프로토콜을 사용한 후 성장인자를 회수한 이러한 슈도-2D 배양의 자발적 분화를 조사하였다(도 8d-f). 18일째에, 연장 ECAD+ UE은 3가지 MM 마커(WT1, SIX2 및 PAX2)에 대해 양성인 중간엽 클럼프(clump)에 의해 둘러싸였다(도 8d-f). 이러한 MM은 JAG1 및 CDH6 단백질에 의해 나타나는 바와 같이 초기 네프론/신장 소포(RV)인 것처럼 보이는 것을 형성하였다(도 8f, 도 5). 또한 본 발명자들은 네프론 성숙 동안 시험관 내에서 발생하는 바와 같은 UE 및 RV를 연결하는 루멘의 형성을 관찰하였다(도 8f, 우측 하단).
네프론 형성은, 근위 세관을 통해 사구체로부터 원위 세관까지 각 네프론 분절의 정체 및 기능을 정의하는 특이적인 마커의 발현과 함께, 분할, 패턴화 및 분화2의 복잡한 과정을 거쳐 후기-RV로 진행한다(도 5). 신장 조직으로의 기능적 통합을 테스트하기 위해서, 본 발명자들은 테스트 집단의 신장 잠재력의 엄격한 검정을 대표하는 기존에 규정된 재응집 검정을 사용하였다7 ,28,29(도 10a). 이러한 검정에서, 마우스 배아의 신장은 단일 세포로 분리된 후 미분화된 hESC(대조군) 또는 신장 분화 12 내지 13일째에의 hESC로 재응집되었다. 재응집 배양을 한지 4일 후, 이를 절단하고 IF를 사용하여 검사하였다. hESC로부터 유래된 세포를 인간 미토콘드리아 DNA 항체를 사용하여 동정하였다(도 10c 화살촉). CHIR99021/FGF9 프로토콜을 사용하여 유도된 hESC-유래된 세포는 PAX2+CALB+ UE(상단 패널), CDH6+JAG1+ 초기 네프론/ RV(중간 패널) 및 SIX2+WT1+ 네프론 전구 중간엽(하단 패널)을 포함하는 발달 신장의 모든 주요 세포 구획으로 통합되었지만, BMP4:액티빈 A/FGF9/FGF9:BMP7:RA만을 사용하여 유도된 hESC-유래된 세포는 단지 MM 및 UE로 통합되었다. 이러한 통합이 미분화된 hES 세포를 포함하는 재응집에서는 발생하지 않았다. 대신, 신장 발달의 완전한 파괴 및 hES-유래된 상피와 라이닝된(lined) 거대 낭종의 형성을 초래하였다(도 10b).
생체 내에서, 신장은 3차원을 형성한다. 단리된 배아의 신장은 공기-배지 경계면에서 오르가노이드로서 성장할 수 있으며, 성공적으로 주변 MM에 반응하여 분지 요관 상피 분지를 형성하고 네프론 형성, 패턴화 및 초기 분할을 겪는다. hESC 분화는 자가-조직화 및 형태형성에 불리한 환경을 나타낼 수 있는 단층으로서 수행되었다. 자가-조직화에 대한 배양물의 모양의 효과를 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 IM 투입(commitment, 6일째) 이후 상이한 세포 밀도에서 분화 hESC 배양물을 옮겨 재플레이팅한 후(도 11a) CHIR99021/FGF9 프로토콜에 따라 배양을 계속했다. 18일째에, 높은 밀도로 재플레이팅된 배양물은 균일한 단층을 형성했지만, 낮은 밀도로 재플레이팅된 배양물은 플래이트에 걸쳐 분리된 수많은 작은 반구형의 오르가노이드를 생성하였다. WT1+ MM 및 ECAD+ UE는 이 두 조건 모두에서 존재하였지만, 더 작은 반구형의 콜로니는 긴밀하게 들어찬 보다 진화된 구조를 형성했고(도 11b), 이는 더 나은 3D환경 증진된 자가-조직화를 시사한다.
모든 필수적인 세포 집단이 신장 형태형성을 위해 존재하는 경우, 신장 분화가 지시되는 hESC 배양물은 임의의 다른 지지세포 없이 신장 오르가노이드를 형성할 수 있을 것이다. 이를 테스트하기 위해서, 18일째에 분화된 hESC 배양물은 효소로 분리시키고 절편 배양 4일 전에 원심분리하여 펠렛을 형성하였다(도 12a). 이는 배아의 마우스 신장 절편 배양(성장 인자가 없는 10%FCS/DMEM)에 대한 표준 배양 조건을 대표한다. 생성된 펠렛의 조직학적 분석은, UE 마커(PAX2 및 AQP2) 또는 근위 세관 마커(AQP1 및 SLC3A1)에 대해 공동-IF를 나타내는 ECAD+세관을 나타냈다. ECAD+ UE를 둘러싼 WT1+PAX2+ MM의 존재가 또한 관찰되었고 이는 JAG1+ECAD+ RV 형성에 대한 증거였다(도 12b hESC-유래됨). 모든 이러한 구조는 정상 마우스 배아 신장의 분리 및 재응집을 통해 형성된 동일한 구조와 구별할 수 없었고(도 12b E13.5 mEK), 이는 CHIR99021/FGF9 지시된 분화 프로토콜 이후에 존재하는 세포의 순수 자가-조직화 능력을 입증한다. 3번의 독립 실험으로부터 펠렛을 분석하였으며 83%가 자가-조직화 구조를 나타내었다(5/6 펠렛). 분화의 동일한 수준은 BMP4:액티빈 A/FGF9/FGF9:BMP7:RA 이후 관찰되지 않았다.
본원에 기재된 방법은, 이러한 발달 세포와 조직 간의 상호작용을 포함하고 상호작용에서 비롯하는 네프론-형성 중간엽 및 요관 상피 모두의 동시 유도를 촉진시킨다. 세포 및 조직 유형 모두는 단계 2 및 3을 통해 FGF9와 단독으로도 다양한 정도로 형성된다. BMP7, RA 및 Wnt 효능제와 같은 다른 인자의 첨가는 생산되는 중간엽 및 요관 상피의 상대 존재비에 관한 결과를 달리할 것이다.
중간엽 및 네프론을 최적으로 생산하기 위해서, 단계 2에서의 FGF9은 다음 단계를 패턴화하는데 충분하다. 하지만 단계 3에서 FGF9와 함께 BMP7의 첨가가 중간엽을 다소 개선시키지만, 보다 중요하게는 요관 트리를 보다 덜 "시트-형(sheet-like)"이도록 한다. 또한, 너무 많은 FGF9도 궁극적으로 최적이 아니라고 제안된다. 이는 마이크로생물반응기 연구에서 평가되었고, 그 결과는 도 13에 도시되었다.
RA에 관하여, 증가하는 RA는 중간엽의 비용으로 요관 상피의 생산을 증가시킨다(예를 들어, 보다 부적절한 GATA3+ 중간엽을 생성함).
또한, 본 발명자들은 CHIR99021의 역할을 추가로 분석하였고 처음 2일의 배양에 더 많이 존재할수록 더 많은 요관싹이 생성되고 8μM 보다 6μM에서 보다 잘 생산된다는 것을 밝혀냈다(도 14). 그러나, CHIR99021에서의 더 긴 시간(2일 대비 4일)은, 궁극적으로 보다 성숙한 발세포 마커를 형성하는 능력을 보이는 더 많은 중간엽을 갖는, 더 많은 시트 대비 세관 구조를 야기한다. 도 15에 요약되는 바와 같이, 또한 각 세포주는 단계 1에서 CHIR99021의 농도 및 기간에 대한 최적화가 필요할 가능성이 있다.
추가로, 본 발명자들이 계속해서 단계 2 및 3을 통해 CHIR99021(단계 1에 사용된 Wnt 효능제)를 1μM로 계속 포함시키고 RA의 길항제(예를 들어, AGN193109)를 첨가하는 경우, 중간엽의 생산이 개선된다. 이는 본 발명자들이 중간엽을 중신(즉, 발달 동안 퇴행) 대비 후신(즉, 영구 신장을 생성)에 가깝게 배면화(posteriorising)하기 때문이다. 본 발명자들은 증가된 HOXD11 발현(후신에 보다 특이적임) 및 SIX2, SIX1, WT1, EYA1(즉, 모두 후신에서 더 높음)면에서 이러한 보다 나은 중간엽 결과를 측정한다. 본 발명자들은 여전히 이들의 존재와 함께 요관 상피를 생산하지만 이들의 존재 없이 또는 RA와 함께 만큼은 생산하지 않을 것이다. 이는 도 16 내지 19에 요약되어 있다. 이러한 추가적인 최적화에 기반하여, 각각에 대해 어느 정도의 CHIR, RA 또는 RA 길항제, FGF9 및/또는 BMP7가 필요할 수 있도록 상이한 출발 세포(예를 들어, 상이한 환자로부터의 상이한 hPSC)가 각 단계의 용량 및 타이밍에 대한 그들의 반응을 다소 달리할 것이라는 것을 제안한다. 따라서, 상이한 환자 세포주에 대한 반응의 최적화는 세포주에다 발생할 것이라는 가능성이 크다. 더욱 중요하게는, 네프론에 결정적인 유전자에서 돌연변이를 갖는 환자 세포주를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 단계 3 또는 단계 2 및 3에서 CHIR99021 및 AGN193106과 같은 RA 길항제를 사용함으로써 형성되는 중대엽의 극대화(예를 들어, 더 많은 후신 중간엽의 생산)를 선택할 수 있다. 반대로, 집합관에 작용하는 유전자 돌연변이를 갖는 환자에서, 본 발명자들은 단계 3에서 초기에 적은 CHIR99021를 갖고 RA를 첨가함으로써 유도되는 요관 상피를 극대화(예를 들어, 더 많은 요관싹을 생산)할 수 있다.
도 20 및 21은 본원에 기재된 방법이 환자-유래된 iPSC 및 hESC에 작용한다는 증거를 도시한다. 데이터는 2개의 상이한 환자 세포주로부터 제시된다.
발달 및 상처 회복 동안의 '자가-조직화하는' 세포의 능력은 오랫동안 서류로 입증되어왔다30. '자가-조직화'동안, 상이한 세포 유형은 서로에 대해 특정한 패턴을 취함으로써 기관 내에 존재하는 복합체 구조를 생성한다. 이러한 과정은 특이적인 세포-세포 인식으로 여겨지며 적절한 리간드-수용체 신호화 및 세포-기질 상호작용을 요구할 가능성이 있다. hESC를 배양물에서 분화하도록 유도했던 최근의 연구는, 안배, 뇌하수체 또는 장과 같이 복잡한 조직의 3D 형태형성이 세포 성분의 '자가-조직화'를 통해 발생할 수 있다는 것을 밝혔다31-33. 이는 세포의 복합 응집체가 패턴을 형성하거나 '자가-조직화'하는 정교한 능력을 암시한다. 몇 가지 기존의 연구는 hESC의 IM, 발세포 또는 근위 세관으로의 유도된 분화를 보고하였다.6,13,34,35 사용된 성장 인자 요법이 유사하였음에도 불구하고, 어떠한 연구도 UB 및 MM-유래된 구조의 동시 유도 또는 자가-조직화를 보고한 바는 없었다. 몇 가지의 결정적인 차이가 본 발명자들의 접근법에 존재한다. 본 발명은 최근 MM 생존에 결정적인 것으로 밝혀진 FGF9를 활용하는 제1 접근법이다. FGF9 및 FGF20의 손실은 신장 무발생을 야기하며, FGF9의 부재는 MM의 계속적 발달을 지원할 수 없게 한다20. 본 발명자들은 이를 본 발명자들의 프로토콜의 결정적이고 특징적인 성분으로 간주한다. 둘째로, 특히 IM 단계에서 종점을 확인하기 위한 유전자/단백질 조합의 동시발현에 대한 엄격한 요구는 본 발명자들이 보다 확실하게 성공을 평가하도록 하였다. 추가로, 본 발명자들은 후속의 분화에 대한 아집단을 분류하지 않음으로써 주변 비표적 세포 유형의 영향이 전체로 배양물에 미치도록 하였다. 신장 발달의 다양한 단계에서 신호화하는 기재된 PM 및 꼬리돌기의 역할을 생각할 때36,37, 이는 신장 형성에 필요한 모든 소통하는 세포 유형의 협조된 분화를 증진시켰을 수 있다.
상기 hESC 분화 과정은 초기 네프론을 형성하도록 자가-조직화가 가능한 상호-유도 신장 전구세포 집단을 생성한다. 이는 다능성 세포 공급원으로부터 신장 조직의 생성에 대한 상당한 진보를 나타낸다. 그러나, 일반적인 신장 발달은 네프론 전구세포의 네프론으로의 분화 대비 자기-재생 간의 주의깊은 균형을 요한다. 본원에 기재된 분화된 hESC 배양물은 많은 RV의 형성을 보였으나 시간에 따라 네프론 전구세포의 상당한 손실을 보였으며, Six2 돌연변이 마우스에서 보여진 미숙한 전구세포 분화의 표현형을 환기시켰다3. 이는 중요한 도전이며, 배아 신장의 것을 보다 충분히 재생산하기 위해 잠재적으로 성장 인자, 세포외 기질 및/또는 산소 분압에 대한 변경을 요하는20 ,38, 39 분화 프로토콜의 개선 범주를 시사한다. 또한 생물반응기에서 오르가노이드 배양으로의 단계적 전환은 더 나은 3D 환경을 촉진시킬 수 있다.
요약하자면, 본원에서 본 발명자들은 다능성 세포의 자가-조직화 신장으로의 성공적인 분화를 보고한다. 신장 발달에 관련된 다양한 중요 세포 집단으로부터의 세포의 협조된 유도는 복잡한 형태형성 구조 생성을 위한 상호작용 니치에 대한 필요를 입증한다. 이러한 집단이 시험관 내에서 자가-조직화를 겪는 능력은 조직/기관 생체조작의 미래에 대한 좋은 징조이다. 본 발명자들이 분화된 hES 세포 배양물 단독으로부터 오르가노이드를 형성할 수 있다는 사실은, 조직-기반 신독성 스크리닝, 시험관 내 질환 모델 생성 또는 신장 기능을 보충하기 위한 이식가능한 오르가노이드의 개발 가능성을 연다. 또한, 이는 후기 정제를 위한 특정한 성숙 신장 세포 유형 생성의 실현 가능성을 시사한다.
이러한 방법을 이용하여 생성된 세포의 특정한 이용은 하기를 포함할 수 있다:
* 신독성 스크리닝을 위한 소형-신장 오르가노이드 또는 정제된 신장 세포 생성;
* 일반적인 또는 환자 이외의 질환 모델링을 위한 소형-신장 오르가노이드 또는 정제된 신장 세포 생성;
* 신장 질환 치료용 약물 스크리닝을 위한 소형-신장 오르가노이드 또는 정제된 신장 세포 유형 생성.
이는 마이크로생물반응기에서 또는 바이오프린팅 이후 더 큰 포맷 스크린으로 수행될 수 있다. 질환 모델링 또는 약물 스크리닝을 위해서, 본 발명자들은 개별 세포 유형을 정제하고 이들을 특정한 질환에 기초하여 유용한 정보를 제공하는 방식 또는 포맷으로 배양할 가능성이 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 예를 들어, 네프로노프티시스(nephronopthisis)와 같은 질환에 대한 낭종 형성을 평가하거나 예를 들어, 핀란드 신장애(Finnish nephropathy) 또는 알포트 증후군과 같은 질환에 대한 발세포를 생성하기위한 MM을 단리하기 위하여 UB를 단리하고 마트리겔 배지물에서 배양할 수 있다.
세포 요법 및 기관 대체 또는 회복의 특정한 예로는 하기를 포함할 수 있다:
* 세포 요법(급성 신장 손상 또는 만성 신장 손상)을 위한 신장 세포 유형 생성;
* 대체 '기관'을 형성하기 위해 다수의 작은 신장을 함께 연결하는 것이 필요할 수 있는, 전체 신장 대체 생체조작을 위한 신장 세포 유형 생성; 및/또는
* 탈세포화된 스캐폴드의 재세포화를 위한 신장 세포 유형 생성.
본 발명의 목적은 명세서 전반에 걸쳐서 본 발명의 임의의 한가지 실시형태 또는 요점의 특정한 컬렉션을 제한하지 않는 발명의 바람직한 실시형태를 기재하는 것이었다. 따라서, 본 명세서의 관점에서 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 예시된 특정한 실시형태로 이뤄질 수 있다는 것이 종래 기술의 당업자에 의하여 이해될 수 있을 것이다.
본원에 언급된 모든 컴퓨터 프로그램, 알고리즘, 특허 및 과학적 문헌이 본원에서 참고로 인용된다.
표 1: RT- PCR에 사용되는 프라이머의 서열
　 전방 (5'-3') 역방 (5'-3')
PAX2 TATGCACTGCAAAGCAGACC GAAAGGCTGCTGAACTTTGG
LHX1 ATGCAACCTGACCGAGAAGT CAGGTCGCTAGGGGAGATG
OSR1 TTCAGCTAAAGCCCCAGAGA CGGCACTTTGGAGAAAGAAG
MIXL1 GGTACCCCGACATCCACTT TTCAGAGAGAGGGGAACAGG
T AGGTACCCAACCCTGAGGAG GATGGGTGAGGGGTGTGTAG
CRET CCGCACACGGCTGCATGAGA AAGGTGCCTGGGGGTCGGTT
HOXB7 CGATGCAGGGCTTGTACCCC GGCCTCGTTTGCGGTCAGTT
SIX2 GCCGAGGCCAAGGAAAGGGAGAA AGCAGTGCGGGGCTGGATGA
WT1 CGCACGGTGTCTTCAGAGGC CCTGTATGAGTCCTGGTGTGGGT
GDNF CTGCCTGGTGCTGCTCCACA AGCTGCAGCCTGCCGATTCC
HOXD11 CCACGGTCAACTCGGGACCT TTCCTACAGACCCCGCCGTG
PAX6 GGCAACCTACGCAAGATGGC TGAGGGCTGTGTCTGTTCGG
SYNPO TCTACCATGGCTACCTGCCT TTCCGGGTAGAGAAGGAGGG
NPHS1 GAGTATGAGTGCCAGGTCGG ATGGTGATGTCAGGTGCTGG
AQP1 GCCGTGACCTTGGTGGCTCA TGGCCGCTGGTCCACACCTT
AQP2 TCTGCTCCATGAGATCACGCCA ATCGGTGGAGGCGAAGATGCA
SCNNB1 CTTCACGAGCAGAGGTCATACC GGACCTCAGAACCATTCACGGT
SLC3A1 TACGGTTCTGGCTCACAAAGGG GCTCCGAGTATTGTGTGACCG
GAPDH CGAGATCCCTCCAAAATCAA GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT
표 2: qRT - PCR에 사용되는 프라이머의 서열
　 전방 (5'-3') 역방 (5'-3')
SOX17 ACGCCGAGTTGAGCAAGA TCTGCCTCCTCCACGAAG
T AGGTACCCAACCCTGAGGA GCAGGTGAGTTGTCAGAATAGGT
MIXL1 GGTACCCCGACATCCACTT GCCTGTTCTGGAACCATACCT
OSR1 GGACCTCTGCGGAACAAG TGCAGGGAAGGGTGGATA
PAX2 GCAACCCCGCCTTACTAAT AACTAGTGGCGGTCATAGGC
LHX1 ATGCAACCTGACCGAGAAGT CAGGTCGCTAGGGGAGATG
TBX6 CATCCACGAGAATTGTACCCG AGCAATCCAGTTTAGGGGTGT
PARAXIS GCGGGCAGTGCCAAGGGCG CCCTCACCTTCAAGCAGCTGC
FOXF1 GCGGCTTCCGAAGGAAATG CAAGTGGCCGTTCATCATGC
OCT4 AGCAAAACCCGGAGGAGT CCACATCGGCCTGTGTATATC
NANOG AAGGCCTCAGCACCTACCTA ATTGGAAGGTTCCCAGTCGG
SIX2 CGCCCATGTGGGTCAGTGGG AGCCGGGAGCGCTGTAGTCA
HOXD11 GCCAGTGTGCTGTCGTTCCC CTTCCTACAGACCCCGCCGT
HOXB7 GCCTACAAATCATCCGGCCA GGTTGGAAGCAAACGCACAA
FOXD1 GACTCTGCACCAAGGGACTG CCTCGAGCGCGCTAACATAG
SOX9 CCGAAAGCGGAGCTCGAAAC AGTTTCCGGGGTTGAAACTGG
SF1 GTGTACCAAGTGTGGAGGGG AGGTGCTTCACCCAGTTCAG
GATA6 CATGACTCCAACTTCCACCT ACTTGAGCTCGCTGTTCTCG
GAPDH AGCCACATCGCTCAGACAC GCCCAATACGACCAAATCC
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Claims (29)

  1. 중간 중배엽(IM) 세포를 섬유모세포 성장인자 9(FGF9) 및/또는 섬유모세포 성장인자 20(FGF20); 및 임의로, 골 형태형성 단백질 7(BMP7), 헤파린, Wnt 효능제, 레티노산(RA), 유사체 또는 효능제, 및 RA 길항제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상과 접촉시켜 IM 세포로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하는 단계를 포함하는, 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    FGF9 및/또는 FGF20이 약 20ng 내지 1㎍/mL의 범위; 약 50 내지 500ng/mL의 범위; 약 100 내지 300ng/mL의 범위; 및 약 200ng/mL로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 농도인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    BMP7이 약 25 내지 75ng/mL의 범위; 약 35 내지 60ng/mL의 범위; 약 45 내지 55ng/mL의 범위; 및 약 50ng/mL로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 농도로 존재하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    RA, 유사체 또는 효능제가 IM 세포로부터의 요관 상피 전구세포의 상대적 생산을 증가시키는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    RA, 유사체 또는 효능제가 약 10pM 내지 1μM의 범위; 약 30 pM 내지 0.5μM의 범위; 약 50pM 내지 0.2μM의 범위; 및 약 0.1μM로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 농도로 존재하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RA 길항제가 IM 세포로부터의 네프론 전구세포의 상대적 생산을 증가시키는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RA 길항제가 약 0.5pM 내지 10μM의 범위; 약 0.01μΜ 내지 5μM의 범위; 약 0.1μΜ 내지 5μM의 범위; 및 약 1μM로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 농도로 존재하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Wnt 효능제가 IM 세포로부터의 네프론 전구세포의 상대적 생산을 증가시키는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Wnt 효능제가 약 0.1μM 내지 10μM의 범위; 약 0.2μM 내지 5μM의 범위; 및 약 1 내지 2μM의 범위로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 농도로 존재하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤파린이 약 0.1 내지 10㎍/mL의 범위의 농도로 존재하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중간 중배엽(IM) 세포가 약 72 내지 360시간 동안 FGF9와 단독으로 접촉되거나 BMP7, RA, RA 길항제, Wnt 효능제, FGF20 및/또는 헤파린 중 하나 이상과 함께 접촉되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포가 IM 세포로부터 동기에(synchronously) 또는 동시에(simultaneously) 생산되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    후기 원시선조 세포(posterior primitive streak cell)를 후기 원시선조 세포의 상기 IM 세포로의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 제제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    인간 다능성 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPCS)를 hPCS의 상기 후기 원시선조 세포로의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 제제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 hPCS가 인간 배아 줄기세포이거나 유도된 인간 다능성 줄기세포인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 인간 만능줄기(hPCS) 세포를 hPCS 세포의 후기 원시선조 세포로의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계;
    (b) 후기 원시선조 세포를 후기 원시선조 세포의 IM 세포로의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계; 및
    (c) IM 세포를 FGF9와 단독으로 접촉시키거나 BMP7; RA; RA 길항제; Wnt 효능제; FGF20 및/또는 헤파린 중 하나 이상과 함께 접촉시켜 IM 세포로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하는 일련의 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 후기 원시선조 세포와 접촉되는 상기 하나 이상의 제제가 섬유모세포 성장인자 9(FGF9) 단독이거나 FGF2 및/또는 FGF20과의 조합을 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    FGF9, FGF2 및/또는 FGF20이 약 100 내지 400ng/mL의 농도인, 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서
    상기 hPCS와 접촉되는 상기 하나 이상의 제제가 BMP4, 액티빈 A 및/또는 Wnt 효능제를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    (i) BMP4가 약 5 내지 40ng/mL의 농도; (ii) 액티빈 A가 약 3 내지 40ng/mL의 농도 및/또는; Wnt 효능제가 약 0.5 내지 50μM 범위의 농도인, 방법.
  21. 제16항에 있어서,
    (a) 인간 다능성 줄기(hPCS)세포를 Wnt 길항제와 접촉시켜 상기 hPCS 세포의 후기 원시선조 세포로의 분화를 촉진시키는 단계;
    (b) 상기 후기 원시선조 세포를 FGF9와 단독으로 접촉시키거나 RA 길항제와 함께 접촉시켜 상기 후기 원시선조 세포의 IM 세포로의 분화를 촉진시키는 단계; 및
    (c) 상기 IM 세포를 FGF9와 단독으로 접촉시키거나 BMP7; RA; 및 RA 길항제; Wnt 효능제; FGF20; 및/또는 헤파린과 함께 접촉시켜 상기 IM 세포로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생산하는 일련의 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    생존 가능한 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포를 동정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    생존 가능한 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포의 동정이, 생존 가능한 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포를 동정하거나 구별하는 마커로서 다수의 핵산 및/또는 단백질의 동시발현의 측정 또는 검출함을 포함하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 생산되는, 단리, 농축 또는 정제된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포.
  25. 제24항에 따른 상기 단리되거나 정제된 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포로부터 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 분화시켜 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생산하는 단계를 포함하는, 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생산하는 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생산하는데 사용하기 위한, 단리, 농축 또는 정제된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포.
  27. 제24항에 있어서,
    (i) 신장 이식 또는 만성 신장 질환 치료를 위한 전체 신장 및 신장 조직의 바이오프린팅(bioprinting) 또는 생체조작(bio-engineering); (ii) 전체 기관 탈세포화된(decellularized) 신장의 재세포화(recellularisation)에 의한 재구성 또는 대체 신장의 제조; 또는 (iii) 신장 질환 및 병태의 세포 요법을 위한, 방법.
  28. 하나 또는 다수의 화합물을 제26항에 따른 단리되거나 정제된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포, 또는 이로부터 분화되거나 달리는 수득된 신장 세포 또는 조직과 접촉시켜 하나 또는 다수의 화합물의 신독성(nephrotoxic) 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 하나 또는 다수의 화합물의 신독성을 측정하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 방법이 하나 또는 다수의 화합물을 신장 오르가노이드(organoid)와 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
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