CN111638342A - Sox17蛋白在制备肾透明细胞癌诊断或预后评估试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体是SOX17蛋白在制备肾透明细胞癌诊断或预后评估试剂盒中的应用。本发明SOX17蛋白与肾透明细胞癌相关性的发现为肾透明细胞癌诊断或预测预后提供了全新的生物学标志物。肾透明细胞癌患者的肿瘤组织中SOX17蛋白的表达会显著下调,且下调的幅度与患者的生存时间存在相关性,其低表达与患者的预后差显著相关,这对于肾透明细胞癌患者诊断和治疗具有重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地说,是SOX17蛋白在制备肾透明细胞癌诊断或预后评估试剂盒中的应用。
背景技术
肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC)是起源于肾上皮细胞的恶性肿瘤,简称为肾癌,约占成人恶性肿瘤的2%-3%。2018年肾癌占全球新发肿瘤的2.2%,死亡率约为1.8%。在泌尿系统肿瘤中,肾癌的发病率仅次于膀胱癌。我国是世界上肾癌发病最多的国家,男性发病率大约是女性的两倍。肾透明细胞癌(Clear Cell Renal Cell Carcinoma,ccRCC)是肾癌最常见的病理类型,约占80%-90%。
目前临床上尚无早期筛查肾透明细胞癌的特异性工具。在我国,超过50%的肾透明细胞癌是由于影像学检查偶然发现的。对于早期局限性的肾透明细胞癌的治疗首选局部手术切除术,早期肾透明细胞癌手术后预后较好,但仍有30%-40%的患者在手术治疗后会发生远处转移。肾透明细胞癌具有较高的恶性倾向,25%-30%的患者确诊时已是晚期,而晚期肾透明细胞癌的根治性肾切除术的复发率为20%-40%,术后五年生存率仅为10%。由于晚期转移性肾透明细胞癌对于放疗和化疗均不敏感,临床上常常选用免疫治疗和靶向药物治疗作为术后的辅助治疗。自20世纪80年代起,以细胞因子为基础的免疫治疗,包括干扰素α和白介素2,已经开始用于转移性肾细胞癌的治疗,但对于大多数患者而言,这些药物无法达到持续的临床获益且不良作用明显,因而应用较少。而靶向药物,例如帕唑帕尼、舒尼替尼等,与传统放疗和细胞因子治疗相比,能够有效延长患者的总生存时间和无疾病进展生存时间,提高患者的生活质量,减少肿瘤负荷并降低肿瘤的侵袭性。但由于缺乏统一标准和足够的临床数据支持,目前尚未取得令人满意的效果。因此,如果能够通过有效的诊断肾透明细胞癌或者预测肾透明细胞癌患者的预后,然后通过干预预防措施,降低复发转移率,延长患者的生存期。其中,发现可供诊断或预测肾透明细胞癌的预后的新的分子标志物是亟需解决的问题,对诊断肾透明细胞癌及降低复发转移率,延长患者的生存时间有重要临床意义。
SOX17(GeneID:101925698)是SRY(Sex-determining Region Y-box)相关HMG-box17(SOX17)转录因子的启动子,在组织稳态、器官形成以及在胚胎到成年阶段的细胞命运决定中起着关键作用。SOX17在许多肿瘤的发生发展中起着重要作用,研究发现SOX17基因突变与胆管细胞癌(Cholangiocarcinoma)的预后密切相关,以SOX17作为靶分子已成为胆管细胞癌治疗的一种新策略。(参见文献:Merino-Azpitarte M,Lozano E,Perugorria MJ,etal.SOX17Regulates Cholangiocyte Differentiation and Acts as a TumorSuppressor in Cholangiocarcinoma.Journal of Hepatology,2017,S0168-8278(17);30114-9.)另有研究表明,SOX17可以通过控制修复DNA损伤基因的转录来调节食道癌对于放疗的敏感性。(参见文献:Kuo IY,Huang YL,Lin CY,et al.SOX17overexpressionsensitizes chemoradiation response in esophageal cancer by transcriptionaldown-regulation of DNA repair and damage response genes.J Biomed,2019,26(1);)还有研究发现SOX17可以通过调节白介素22来控制甲状腺乳头状癌的迁移和侵袭。(参见文献:Li W,Li F,Lei W,et al.TRIM30modulates Interleukin-22-regulated papillarythyroid Cancer cell migration and invasion by targeting Sox17for K48-linkedPolyubiquitination.Cell Commun Signal,2019,17(1);)
然而目前尚无SOX17在肾透明细胞癌中相关的研究报道,SOX17在肾透明细胞癌发生发展中的分子机制仍不清楚。并且目前还未见SOX17蛋白在制备肾透明细胞癌诊断或预测肾透明细胞癌患者预后的应用的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供SOX17蛋白的新应用,特别是在制备肾透明细胞癌诊断或预后评估试剂盒中的应用。
本发明的第一方面,提供SOX17蛋白在制备肾透明细胞癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。
本发明经过广泛而深入的研究,首次发现,采用免疫组化方法检测SOX17蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量,基于SOX17蛋白的表达量与肾透明细胞癌的这种相关性,以该蛋白作为分子标志物,对其表达量进行检测可以作为预测肾透明细胞癌患者预后的判断指标。
进一步的,所述的试剂或试剂盒检测SOX17蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量。
进一步的,所述的试剂或试剂盒采用免疫组化方法检测SOX17蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量。
更进一步的,所述的试剂或试剂盒是将SOX17蛋白作为分子标记,利用SOX17单克隆抗体或多克隆抗体,以及免疫组化试剂,分析SOX17蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量,预测肾透明细胞癌患者的预后。
进一步的,所述的SOX17单克隆抗体,为商品化抗体,如兔SOX17单克隆抗体(Abcamab224637)。
进一步的,所述的免疫组化试剂包括二甲苯,乙醇,3%H2O2溶液,1%BSA封闭液,DAB显色试剂,苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
SOX17蛋白高表达的肾透明细胞癌患者预后更好,SOX17蛋白低表达的肾透明细胞癌患者预后较差。根据上述方法检测肾透明细胞癌组织中SOX17表达情况,进行评分,H-score低于100分为低表达,H-score等于或高于100分为高表达,肾透明细胞癌组织中SOX17高表达的肾透明细胞癌患者预后较好。
肾透明细胞癌组织中SOX17的低表达是一个显著独立的预测肾透明细胞癌患者总体生存时间和无疾病进展生存时间的危险因素。
肾透明细胞癌组织中SOX17的表达相比传统临床病理指标如TNM分期、SSIGN评分等在预测肾透明细胞癌患者预后方面具有更好的预测价值。
进一步的,所述的检测SOX17蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量的方法,包括以下步骤:
(a)利用免疫组化试剂二甲苯,乙醇,3%H2O2溶液,1%BSA封闭液,DAB显色试剂,苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG将肾透明细胞癌组织切片进行免疫组化染色;
(b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片;
(c)根据免疫组化染色结果H-score评分原则,给出评分。
更进一步的,所述的方法具体步骤如下:
(1)制备肾透明细胞癌组织石蜡切片,60℃烤箱过夜;
(2)切片脱腊至水;
(二甲苯Ⅰ①10min→二甲苯Ⅱ②10min→二甲苯Ⅲ③10min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→双蒸水5min)
(3)3%H2O2溶液,室温放置20min;
(4)双蒸水洗5min×3;
(5)抗原修复:切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸30min;
(6)自然冷却至室温,双蒸水洗5min×3;
(7)1%BSA封闭30min,37℃;
(8)甩去封闭液,不洗,直接加一抗(兔SOX17单克隆抗体,购自Abcam公司,稀释比例1:50)。置入湿盒中4℃冰箱过夜16小时;
(9)4℃取出,室温复温15min,然后0.01M PBS洗5min×4;
(10)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG,购自中国福州迈新生物公司,即用型,无需稀释)45min,37℃;
(11)0.01M PBS洗5min×4,DAB显色2-10min,镜下观察;
(12)双蒸水终止显色,苏木素复染10秒;
(13)分化后自来水返蓝,蒸馏水浸泡;
(14)脱水透明,盖玻片覆盖;
(15)显微镜下观察阳性染色,于肾透明细胞癌组织随机选取3个视野并拍照;
(16)采用高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。具体评分如下:
1.染色强度评分标准:阴性0分,弱阳性1分,中等阳性2分,强阳性3分。
2.阳性细胞所占比例评分标准:分别评估弱阳性、中等阳性、强阳性细胞的百分比。
3.染色强度评分与对应评分的阳性细胞百分比相乘,得出H-score评分,范围0-300分。
根据上述方法检测肾透明细胞癌组织中SOX17表达情况,进行评分,H-score低于100分为低表达,H-score等于或高于100分为高表达,肾透明细胞癌组织中SOX17高表达的肾透明细胞癌患者预后较好。
本发明的第二方面,提供一种评估肾透明细胞癌患者预后的试剂盒,所述的试剂盒中包含检测SOX17蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量的试剂。
进一步的,所述的试剂盒中包含:SOX17单克隆抗体或多克隆抗体,以及免疫组化试剂。
进一步的,所述的免疫组化试剂包括二甲苯,乙醇,3%H2O2溶液,1%BSA封闭液,DAB显色试剂,苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
本发明的第三方面,提供SOX17蛋白在制备肾透明细胞癌诊断试剂或试剂盒中的应用。
进一步的,所述的试剂或试剂盒检测SOX17蛋白在肿瘤组织中的表达量。
本发明的有益效果在于:
1.本发明的SOX17蛋白与肾透明细胞癌相关性的发现,为预测肾透明细胞癌患者预后提供了全新的生物标志物,SOX17蛋白高表达的肾透明细胞癌患者预后较好。
2.本发明利用免疫组化技术、显微镜拍照和H-scoee评分半定量测定肿瘤组织中SOX17蛋白的表达量,并结合术后随访信息,确定SOX17蛋白表达量与肾透明细胞癌患者的生存时间存在相关性,SOX17蛋白能用于判断肾透明细胞癌患者预后的生物标志物。对于肾透明细胞癌患者,可以利用穿刺获得肾透明细胞癌组织进行SOX17表达水平的检测,从而评估患者的预后。
3.肾透明细胞癌患者的肿瘤组织中SOX17蛋白的表达会显著下调,且下调的幅度与患者的生存时间存在相关性,其低表达与患者的预后差显著相关,这对于肾透明细胞癌患者诊断和治疗具有重要的指导意义。
附图说明
图1为458例肾透明细胞癌患者癌组织及癌旁正常组织中SOX17的免疫组化染色的代表性图,可见肿瘤组织中SOX17表达高低情况。
图2为中心一343例肾透明细胞癌患者的ROC分析图,得出最佳截断值cut off为100。
图3为肾透明细胞癌患者SOX17低表达组和高表达组的生存分析图,可见SOX17高表达组中的患者预后更好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1:
选取两个中心共458例肾透明细胞癌患者的癌组织石蜡切片(肾透明细胞癌组织切片两个中心分别来自上海长海医院343例、复旦大学上海肿瘤中心115例,由2名病理科医生确诊为肾透明细胞癌),采用免疫组化方法检测SOX17蛋白在肾透明细胞癌患者癌组织及癌旁正常组织中的表达量并计算免疫组化评分,具体步骤如下:
(1)制备肾透明细胞癌组织石蜡切片,60℃烤箱过夜;
(2)切片脱腊至水;
(二甲苯Ⅰ①10min→二甲苯Ⅱ②10min→二甲苯Ⅲ③10min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→双蒸水5min)
(3)3%H2O2溶液,室温放置20min;
(4)双蒸水洗5min×3;
(5)抗原修复:切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸30min;
(6)自然冷却至室温,双蒸水洗5min×3;
(7)1%BSA封闭30min,37℃;
(8)甩去封闭液,不洗,直接加一抗(兔SOX17单克隆抗体,购自Abcam公司,稀释比例1:50)。置入湿盒中,4℃冰箱过夜16小时;
(9)4℃取出,室温复温15min,然后0.01M PBS洗5min×4;
(10)滴加二抗,45min,37℃;
(11)0.01M PBS洗5min×4,DAB显色2-10min,镜下观察;
(12)双蒸水终止显色,苏木素复染10秒;
(13)分化后自来水返蓝,蒸馏水浸泡;
(14)脱水透明,盖玻片覆盖;
(15)显微镜下观察阳性染色,于肾透明细胞癌组织随机选取3个视野并拍照;
(16)采用H-score评分方法,即高倍镜下综合染色强度和阳性细胞比例进行半定量分析,具体评分标准如下:
1.染色强度评分标准:阴性0分,弱阳性1分,中等阳性2分,强阳性3分。
2.阳性细胞所占比例评分标准:分别评估弱阳性、中等阳性、强阳性细胞的百分比。
3.染色强度评分与对应评分的阳性细胞百分比相乘,得出H-score评分,范围0-300分。
采用以上免疫组化方法的试验步骤检测SOX17蛋白在458例肾透明细胞癌患者癌组织及癌旁正常组织中表达情况,并依据评分标准进行评分。结果表明:87.34%的患者癌组织SOX17表达水平相对癌旁正常组织低,提示SOX17在肾透明细胞癌组织中是低表达的(见图1)。
实施例2:
结合预后信息,把实施例1的两个中心合并的458例肾透明细胞癌患者分成中心一(上海长海医院343例)和中心二(复旦大学上海肿瘤中心115例)。利用中心一的343例患者的SOX17蛋白的H-score评分根据5年生存时间为标准进行接受者操作特征曲线(ReceiverOperating Characteristic Curve,ROC)分析,数据分析采用R软件(3.5.3版本),得出最佳截断值cut off为100(见图2)。
实施例3:
结合预后信息,把实施例2中得到的cut off值把中心一343例、中心二115例以及两个中心合并的458例患者分为SOX17高表达组(H-score大于或等于100)和SOX17低表达组(H-score小于100),进行病理特征统计分析,数据分析采用SPSS软件(17.0版本),结果表明SOX17高表达组具有更低的TNM分期、WHO/ISUP核分级以及SSIGN评分(见表1-3)。
表1中心一的肾透明细胞癌患者SOX17表达与临床病理特征的相关性研究
表2中心二的肾透明细胞癌患者SOX17表达与临床病理特征的相关性研究
表3两个中心合并的肾透明细胞癌患者SOX17表达与临床病理特征的相关性研究
实施例4:
结合预后信息,把实施例3的患者(中心一343例、中心二115例以及两个中心合并的458例患者)进行生存分析,数据分析采用R软件(3.5.3版本),生存曲线分析使用Kaplan-Meier法,两组之间比较用log-rank检验。结果表明:SOX17高表达组患者的预后更好(见图3)。
实施例5:
结合预后信息,把实施例3的患者(中心一343例、中心二115例以及两个中心合并的458例患者)进行影响肾透明细胞癌患者预后的危险因素的单因素和多因素Cox回归分析,数据分析采用R软件(3.5.3版本),结果表明SOX17低表达是一个显著独立的预测肾透明细胞癌患者较低总体生存时间和无疾病进展生存时间的危险因素(见表4-6)。
表4中心一的单因素和多因素Cox回归分析
表5中心二的单因素和多因素Cox回归分析
表6两个中心合并的单因素和多因素Cox回归分析
实施例6:
结合预后信息,把实施例3的患者(中心一343例、中心二115例以及两个中心合并的458例患者)进行一致性指数C-index分析,数据分析采用R软件(3.5.3版本),结果表明SOX17与临床指标如TNM分期、SSIGN评分等相比具有更好的预测价值(见表7)。
表7中心一、中心二以及两个中心合并的一致性指数C-index分析
由以上试验结果可知,通过采用免疫组化的方法检测SOX17蛋白分子表达量,结果表明SOX17蛋白的表达量与肾透明细胞癌患者的预后具有相关性,因此,以SOX17蛋白作为分子标志物,对其表达量进行检测能指导肾透明细胞癌诊断或预后评估。相应的,特异性抗SOX17蛋白的抗体,包括单克隆抗体和多克隆抗体,能用于制备判定肾透明细胞诊断或预后评估的试剂或试剂盒,这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (8)
1.SOX17蛋白在制备肾透明细胞癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的SOX17蛋白在制备肾透明细胞癌预后评估试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的试剂或试剂盒检测SOX17蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量。
3.根据权利要求2所述的SOX17蛋白在制备肾透明细胞癌预后评估试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的试剂或试剂盒采用免疫组化方法检测SOX17蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量。
4.根据权利要求3所述的SOX17蛋白在制备肾透明细胞癌预后评估试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的试剂或试剂盒是将SOX17蛋白作为分子标记,利用SOX17单克隆抗体或多克隆抗体,以及免疫组化试剂,分析SOX17蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量,预测肾透明细胞癌患者的预后。
5.一种评估肾透明细胞癌患者预后的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中包含检测SOX17蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中包含:SOX17单克隆抗体或多克隆抗体,以及免疫组化试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述的免疫组化试剂包括二甲苯,乙醇,3%H2O2溶液,1%BSA封闭液,DAB显色试剂,苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
8.SOX17蛋白在制备肾透明细胞癌诊断试剂或试剂盒中的应用。
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