ES2896548T3

ES2896548T3 - Métodos de producción de hepatocitos

Info

Publication number: ES2896548T3
Application number: ES16801292T
Authority: ES
Inventors: Louise Kristina Hagbard; Carl Gunnar Jesper Ericcson; Katherine Rachel Cameron; David Colin Hay; Stuart John Forbes; Hassan Rashidi
Original assignee: University of Edinburgh; Biolamina AB
Current assignee: University of Edinburgh; Biolamina AB
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-29
Publication date: 2022-02-24
Anticipated expiration: 2036-10-29
Also published as: WO2017072580A1; DK3368657T3; CA3003566C; EP3368657B1; CN108884438B; US10683486B2; US11713448B2; CA3003566A1; AU2016344599A1; US20200308551A1; CN108884438A; EP3368657A1; AU2016344599B2; US20170121686A1

Abstract

Un método de producción de hepatocitos, que comprende: sembrar en placa células madre humanas pluripotentes en un sustrato de cultivo celular que comprende (i) una primera laminina que es laminina-521 y (ii) una segunda laminina que es laminina-221, en donde la laminina-521 y la segunda laminina son cada una ya sea una proteína intacta o un fragmento de proteína; y cultivar las células madre humanas pluripotentes para obtener los hepatocitos.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de producción de hepatocitos

Antecedentes

Una célula madre es una célula indiferenciada de la que derivan posteriormente células especializadas. Las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en cualquiera de las tres capas germinales: endodermo, mesodermo o ectodermo. Después de la fecundación, las células madre pluripotentes forman todos los tipos de células del cuerpo humano, incluyendo las poblaciones de células madre menos plásticas, tales como las células madre adultas, las células madre fetales y las células madre amnióticas. Las células madre embrionarias son un tipo de célula madre pluripotente y posee una amplia capacidad de autorrenovación y pluripotencia. Más recientemente, se produjeron otro tipo de células madre pluripotentes, las células madre pluripotentes inducidas, a partir de células de mamíferos diferenciadas terminalmente mediante un proceso denominado reprogramación de células somáticas. El proceso mediante el cual una célula madre se convierte en una célula más especializada recibe el nombre de diferenciación, por ejemplo, la diferenciación de células progenitoras endodérmicas en hepatocitos.

Las células somáticas derivadas de células madre representan una gran fuente de células para la ciencia básica y aplicable. Aunque prometedoras, hay que superar muchos obstáculos para convertir esto en realidad. En particular, los protocolos actuales producen hepatocitos de función y longevidad variables, que es el producto del uso de componentes no definidos en el proceso de diferenciación. El uso de Matrige® y suero son ejemplos destacados, y sigue siendo una fuente de variabilidad entre lotes en procedimientos de diferenciación de hepatocitos. Matrigel® es un complejo extracto tumoral y de tipo BM obtenido de tejidos tumorales de sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murino. Matrigel® contiene principalmente LN-111 murino, colágeno de tipo IV, perlecán y nidógeno, pero también cantidades variables de otros materiales, incluyendo factores de crecimiento y proteínas celulares y, por lo tanto, su composición es indefinida y varía entre lotes. En estudios más recientes se han usado moléculas pequeñas para reemplazar factores de crecimiento, pero aunque esto reduce drásticamente los costes del proceso, las moléculas pequeñas pueden tener algunos efectos inespecíficos. Además, los estudios usaron Matrigel® y suero para impulsar el proceso de diferenciación y, por lo tanto, serán variables por naturaleza. Como resultado, es difícil generar cultivos fiables y reproducibles de hepatocitos. Además, si estas células han de usarse clínicamente, los procesos de fabricación deben cumplir las directrices de BPF. Para cumplir estas directrices, los productos que contienen derivados animales están estrictamente controlados.

El documento EP 3059307 A1 describe un método para producir hepatocitos que comprende el cultivo de células madre pluripotentes sobre un soporte recubierto con laminina-111, laminina-521 o una mezcla de las mismas. Cameron et.al. (Stem Cell Reports 2015, vol. 5, n.° 6, pág. 1250-1262) describen que las lamininas recombinantes impulsan la diferenciación y la autoorganización de hepatocitos derivados de hESC. Takayama et.al. (Stem Cell Reports 2013, vol.

1, n.° 4, páginas 322-335) describe el cultivo de células humanas de tipo hepatoblasto derivadas de ES/iPS en LN-111 humano, seguido de la diferenciación en hepatocitos en Matrigel. El documento US2013/0330825 describe un método para obtener una población de células diana diferenciadas a partir de una célula madre pluripotente indiferenciada sobre una matriz que comprende dos isoformas de laminina, de las cuales una que soporta las células pluripotentes puede ser laminina-521. Kikkawa et.al. (J Biomed Mater Res Parte A 2011:99A:203-210) describe el mantenimiento de la diferenciación hepática mediante péptidos de fijación de hepatocitos derivados de cadenas de laminina.

Sería deseable desarrollar métodos que permitan la diferenciación de células madre en condiciones químicamente definidas, libres de material xenogénico, libres de patógenos y estables entre lotes en células diferenciadas, particularmente hepatocitos. Deseablemente, dichos métodos deben proporcionar grandes cantidades de dichas células diferenciadas a partir de células madre embrionarias humanas (hESC) de calidad BPF.

Breve descripción

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. En la presente descripción se describen métodos para producir hepatocitos con propiedades más naturales y una función más diferenciada. Generalmente, estos métodos comprenden: sembrar en placa células madre humanas pluripotentes en un sustrato de cultivo celular que comprende (i) una primera laminina que es laminina-521 y (ii) una segunda laminina que es laminina-221, en donde la laminina-521 y la segunda laminina son cada una ya sea una proteína intacta o un fragmento de proteína; y cultivar las células madre humanas pluripotentes para obtener los hepatocitos. Los hepatocitos resultantes presentan una especificación, organización y maduración de hepatocitos eficientes, así como mejoras significativas en la función y la estabilidad celulares. Se cree que las lamininas suprimen las redes de regulación génica inapropiadas que controlan la proliferación celular, la autorrenovación de células madre y la especificación para el colon y los fibroblastos. Las propias células madre deben ser de calidad de investigación y BPF.

La relación de peso de la laminina-521 con respecto a la segunda laminina puede ser de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 1:1. En otras palabras, existe más cantidad de la segunda laminina en comparación con la laminina-521.

El cultivo de las células madre humanas pluripotentes puede realizarse: (a) cultivando las células en un medio de diferenciación del endodermo que contiene activina A y Wnt3a; (b) cultivando las células en un medio de diferenciación de hepatoblastos; y (c) después cultivando las células en un medio de maduración de hepatocitos que contiene hidrocortisona (HC), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y oncostatina m (OSM).

Las células pueden cultivarse en el medio de diferenciación del endodermo durante un período de aproximadamente 60 horas a aproximadamente 84 horas. Las células pueden cultivarse en el medio de diferenciación de hepatoblastos durante un período de aproximadamente 73 horas a aproximadamente 180 horas. Las células pueden cultivarse en el medio de maduración de hepatocitos durante al menos 216 horas.

El medio de diferenciación del endodermo puede incluir RMPI 1640 y B27. La activina A en el medio de diferenciación del endodermo puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml. El Wnt3a en el medio de diferenciación del endodermo puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml.

El medio de diferenciación de hepatoblastos puede estar hecho de KO-DMEM, Reemplazo de Suero al 20 %, aminoácidos no esenciales al 1 %, beta-mercaptoetanol 0,1 mM y sulfóxido de dimetilo al 1 %. El factor de crecimiento de hepatocitos en el medio de maduración de hepatocitos puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml. La oncostatina m en el medio de maduración de hepatocitos puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml.

Alternativamente, el cultivo de las células madre humanas pluripotentes podría realizarse de acuerdo con el procedimiento de Avior o el procedimiento de Cameron.

Los hepatocitos resultantes pueden presentar una actividad de CYP1A2 de al menos 600.000 ULR/mg/ml. Alternativamente, los hepatocitos resultantes pueden presentar una actividad de CYP3A de al menos 800.000 ULR/mg/ml.

En ocasiones, el sustrato de cultivo celular comprende además una cadherina. La cadherina puede ser la cadherina e. La relación de peso de (la primera laminina la segunda laminina) con respecto a la cadherina puede ser de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 15:1.

Generalmente, el sustrato de cultivo celular no contiene inhibidores de la diferenciación, células alimentadoras, inductores de la diferenciación o inhibidores de la apoptosis.

Estas y otras características no limitantes de la descripción se describen más particularmente a continuación.

Breve descripción de las figuras

Lo siguiente es una breve descripción de las figuras, que se presentan con el fin de ilustrar las realizaciones ilustrativas descritas en la presente descripción y no con el fin de limitar las mismas.

La FIG. 1 es una representación de un protocolo de diferenciación, que incluye imágenes de contraste de fases de campos de visión representativos, tipos celulares presentes en cada etapa de diferenciación, factores/moléculas de crecimiento y medios utilizados, y la línea temporal para cada etapa.

La FIG. 2 es un conjunto de 12 fotomicrografías que ilustran la morfología de las células madre pluripotentes antes y después de la diferenciación en tres sustratos diferentes: medio de control (MG); laminina-521 (LN 521); y una combinación de laminina-521 y laminina-111 en una relación 1:3 (LN 111). También se muestran la tinción de control para antisueros de IgG de conejo, ratón y oveja.

La FIG. 3 es un conjunto de seis gráficos de barras de la expresión de OCT4, Nanog, FOXA2, AFP, HNF4A y ALB durante la diferenciación en los tres sustratos diferentes de la FIG. 2. En cada gráfico, la barra oscura es MG; la barra discontinua es LN 521 y la barra de color blanco es LN 111. El eje y corresponde a la expresión relativa y el eje x corresponde a los días, siendo las cuatro barras los días 0, 3, 9 y 18 de diferenciación. La expresión se ha normalizado con respecto al gen constitutivo GAPDH. Un asterisco individual (*) indica p<0,05 y un asterisco doble (**) indica p<0,01 como se mide mediante ANOVA de una sola vía con ensayo a posteriori de Tukey.

La FIG. 4 es un conjunto de 15 fotomicrografías totales de células del endodermo y hepáticas cultivadas en los tres sustratos diferentes, con un aumento de 10x-20x, que muestran la expresión de FOXA2, SOX17, alfa-fetoproteína (AFP), factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4A) y citoqueratina 19 (CK19), el día 3 de diferenciación. Se muestra el porcentaje de células positivas y la desviación estándar. Las células se contratiñeron con hoescht 33342.

La FIG. 5 es un conjunto de nueve fotomicrografías de hepatocitos cultivados en los tres sustratos diferentes de la FIG.

2 , con un aumento de 10x, con expresión de albúmina (ALB), cadherina e (E CAD) y el marcador de proliferación celular Ki67, el día 18 de diferenciación. Se muestra el porcentaje de células positivas y la desviación estándar.

La FIG. 6 es un conjunto de seis fotomicrografías de células hepáticas cultivadas en los tres sustratos diferentes de la FIG. 2 , con un aumento de 10x, con expresión de CYP2D6 y CYP3A4, así como los correspondientes gráficos de barras de la actividad metabólica de CYP1A2 y CYP3A. Se muestra el porcentaje de células positivas y la desviación estándar. En los dos gráficos, el eje y corresponde a ULR/mg/ml y el eje x corresponde a los días 16, 18, 20, 22, 24 y 26 de diferenciación. Un asterisco individual (*) indica p<0,05 y un asterisco doble (**) indica p<0,01 como se mide mediante ANOVA de una sola vía con ensayo a posteriori de Bonferroni. La línea de puntos indica la actividad de CYP promedio de los hepatocitos primarios en cultivo.

La FIG. 7 es un conjunto de dos gráficos de barras que muestran la producción de albúmina y alfa fetoproteína por hepatocitos cultivados en los tres sustratos diferentes de la FIG. 6. En cada gráfico, la barra oscura es MG; la barra discontinua es LN 521 y la barra de color blanco es LN 111. El eje y corresponde a ng/mg/ml/24 horas. El eje x corresponde a los días, siendo las cuatro barras los días 20, 22, 24 y 26 de diferenciación.

La FIG. 8 es un conjunto de nueve fotomicrografías de células hepáticas cultivadas en los tres sustratos diferentes de la FIG. 2 , con un aumento de 10x, dispuestas en tres filas. La fila superior es una imagen de contraste de fases de las células el día 24 de cultivo. La fila del medio es una cotinción de proteína asociada a resistencia a múltiples fármacos (MRP-1) y HNF4a, usando la tinción CDFDA. Los puntos de color verde son HNF4a y las líneas de color rojo alrededor de los puntos son MRP-1.

La FIG. 9A es un análisis de componentes principales de los 1.000 genes con mayor varianza en células madre embrionarias (ESC), hepatocitos humanos primarios recién aislados (FH) y células de tipo hepatocito (HLC) obtenidas de los tres sustratos diferentes de la FIG. 2. Los dos componentes primarios (PC 1 y PC 2) constituyeron juntos el 86,5 % de variación. El eje y corresponde a PC 2, y varía de -60 a 30 a intervalos de 10. El eje x corresponde a PC 1, y varía de -60 a 100 a intervalos de 20.

La FIG. 9B es un conjunto de tres gráficos de barras que muestran los estados de la red reguladora de genes para las muestras de la FIG. 9A . El eje y corresponde a la Puntuación de la Red Reguladora de Genes (Puntuación GRN) y está en unidades de % de varianza. Las barras de ESC, Hígado y Colon del extremo izquierdo son las puntuaciones de entrenamiento y representan la máxima puntuación posible.

La FIG. 9C es un conjunto de grupos obtenidos usando técnicas de agrupación difusa y organizados en tres “ supergrupos” . Se muestran 12 gráficos de barras. En cada gráfico de barras, el eje y corresponde al factor de cambio log2, es decir, el múltiplo de la diferencia con respecto al control.

La FIG. 10 es un conjunto de gráficos de barras que ilustran la expresión de CYP1A2, CYP3A, alfa fetoproteína y albúmina en hepatocitos humanos primarios cultivados en placa en los tres sustratos de la FIG. 2 y examinados para determinar la competencia metabólica después de 48 horas. El eje y para los gráficos de CYP1A2 y CYP3A corresponde a ULR/mg/ml. El eje y para el gráfico de alfa fetoproteína corresponde a ng/mg/ml. El eje y para el gráfico de albúmina corresponde a pg/mg/ml/24 horas. En los cuatro gráficos de barras, la barra de color negro corresponde a hepatocitos masculinos y la barra de color blanco corresponde a hepatocitos femeninos.

La FIG. 11 es un conjunto de tres fotomicrografías de hepatocitos derivados de células madre cultivados sobre laminina-221/laminina-521 en una relación 1:3, laminina-221/laminina-521 en una relación 1:1 y laminina-521, teñidos para determinar la proteína 1 de resistencia a múltiples fármacos (MPR-1) después de 18 días.

La FIG. 12 es un conjunto de dos gráficos de barras que ilustran la actividad de CYP1A2 y CYP3A de hepatocitos derivados de células madre sobre laminina-221/laminina-521 en una relación 1:3, laminina-221/laminina-521 en una relación 1:1 y laminina-521, teñidos con MPR-1 después de 18 días.

La FIG. 13 es un conjunto de gráficos que ilustran cómo los procedimientos de diferenciación de Avior y Cameron afectaron a hepatocitos derivados de células madre en cultivo sobre sustratos de laminina-221/laminina-521 en una relación 1:3, laminina-221/laminina-521 en una relación 1:1 y laminina-521 pura. En ambos gráficos, el eje y corresponde a ULR/mg/ml. Para cada sustrato, el resultado del procedimiento de Avior está a la izquierda y el resultado del procedimiento de Cameron está a la derecha.

La FIG. 14 es un conjunto de 15 fotomicrografías totales de células MAN 12 cultivadas en los tres sustratos diferentes, teñidas para diversos marcadores.

La FIG. 15 es un conjunto de cuatro gráficos de barras de expresión de alfa fetoproteína, albúmina, CYP1A2 y CYP3A durante la diferenciación en los tres sustratos diferentes de la FIG. 14. En cada gráfico, la barra oscura es MG; la barra discontinua es LN 521 y la barra de color blanco es LN 111. El eje y para los gráficos de alfa fetoproteína y albúmina corresponde a ng/mg/ml/24 horas. El eje y para los gráficos de CYP1A2 y CYP3A corresponde a ULR/mg/ml. Un asterisco individual (*) indica p<0,05 y un asterisco doble (**) indica p<0,01 como se mide mediante ANOVA de una sola vía con ensayo a posteriori de Tukey.

La FIG. 16 es un conjunto de 15 fotomicrografías totales de células MAN11 cultivadas en los tres sustratos diferentes, teñidas para diversos marcadores.

La FIG. 17 es un conjunto de cuatro gráficos de barras de expresión de alfa fetoproteína, albúmina, CYP1A2 y CYP3A durante la diferenciación en los tres sustratos diferentes de la FIG. 16. En cada gráfico, la barra oscura es MG; la barra discontinua es LN 521 y la barra de color blanco es LN 111. El eje y para los gráficos de alfa fetoproteína y albúmina corresponde a ng/mg/ml/24 horas. El eje y para los gráficos de CYP1A2 y CYP3A corresponde a ULR/mg/ml. Un asterisco doble (**) indica p<0,01 como se mide mediante ANOVA de una sola vía con ensayo a posteriori de Tukey. Las FIG. 18A-18E son imágenes que muestran esferoides tridimensionales de células madre embrionarias humanas (hESC) cultivadas para formar células de tipo hepatocito. La FIG. 18A es una imagen de esferoides de tamaño aleatorio formados en poli(metacrilato de hidroxietil metilo). La FIG. 18B es una imagen de esferoides de tamaño 50 |um a 100 |um formados en agarosa. La FIG. 18C es una imagen de esferoides de tamaño 100 |um a 150 |um formados en agarosa. La FIG. 18D es una imagen de esferoides de tamaño 150 |um a 200 |um formados en agarosa. La FIG. 18E es un gráfico de barras que muestra el intervalo de tamaños de hepatoesferas creado. El eje y está en micrómetros (|um) y va de 0 a 250 a intervalos de 50.

Las FIG. 19A-19D son gráficos que muestran la expresión génica hepática en hepatoesferas.

La FIG. 19A es un gráfico de barras que muestra la expresión relativa a lo largo del tiempo del gen Foxa2. El eje y va de 0 a 1400 a intervalos de 200. El eje x, de izquierda a derecha, corresponde a día 0, día 3, día 8 y día 18. Para cada día, la barra de la izquierda corresponde a la estirpe celular H9 y la barra de la derecha corresponde a la estirpe celular Man12. La FIG. 19B es un gráfico de barras que muestra la expresión relativa a lo largo del tiempo del gen HNF4a. El eje y va de 0 a 30000 a intervalos de 5000. El eje x, de izquierda a derecha, corresponde a día 0, día 3, día 8 y día 18. Para cada día, la barra de la izquierda corresponde a la estirpe celular H9 y la barra de la derecha corresponde a la estirpe celular Man12. La FIG. 19C es un gráfico de barras que muestra el factor de aumento de la expresión de alfa fetoproteína (AFP) a lo largo del tiempo. El eje y va de 0 a 1.800.000 a intervalos de 200.000. El eje x, de izquierda a derecha, corresponde a día 0, día 3, día 8 y día 18. Para cada día, la barra de la izquierda corresponde a la estirpe celular H9 y la barra de la derecha corresponde a la estirpe celular Man12.

La FIG. 19D es un gráfico de barras que muestra el factor de aumento de la expresión de albúmina (ALB) a lo largo del tiempo. El eje y va de 0 a 50.000 a intervalos de 10.000. El eje x, de izquierda a derecha, corresponde a día 0, día 3, día 8 y día 18. Para cada día, la barra de la izquierda corresponde a la estirpe celular H9 y la barra de la derecha corresponde a la estirpe celular Man12.

La FIG. 20A es un conjunto de cuatro inmunotinciones realizadas el día 18. La tinción más a la izquierda corresponde a cadherina e. La tinción central izquierda corresponde a HNF4a. La tinción central derecha corresponde a DAPI. La tinción más a la derecha es una superposición de las otras tres tinciones. La línea de la parte inferior izquierda de cada tinción indica 20 |um.

La FIG. 20B es un conjunto de cuatro inmunotinciones realizadas el día 30. La tinción más a la izquierda corresponde a albúmina. La tinción central izquierda corresponde a HNF4a. La tinción central derecha corresponde a DAPI. La tinción más a la derecha es una superposición de las otras tres tinciones. La línea de la parte inferior izquierda de cada tinción indica 20 |um.

La FIG. 21 es un conjunto de ocho inmunotinciones, dispuestas en una fila A y una fila B con cuatro tinciones cada una, todas realizadas el día 18. La Fila A correspondía a hepatoesferas pequeñas y la Fila B correspondía a hepatoesferas grandes. La columna más a la izquierda corresponde a Ki67. La columna central izquierda corresponde a ZO-1. La columna central derecha corresponde a DAPI. La columna más a la derecha es una superposición de las otras tres columnas. La línea de la parte inferior izquierda de cada tinción indica 20 |um.

La FIG. 22A es un gráfico que muestra la secreción de AFP a lo largo del tiempo por hepatoesferas. El eje y corresponde a ng/mg de proteína/ml y va de 0 a 12.000 a intervalos de 2.000. El eje x, de izquierda a derecha, corresponde a día 23, día 30, día 44 y día 50.

La FIG. 22B es un gráfico que muestra la secreción de ALB a lo largo del tiempo por hepatoesferas. El eje y corresponde a ng/mg de proteína/ml y va de 0 a 900 a intervalos de 100. El eje x, de izquierda a derecha, corresponde a día 23, día 30, día 44 y día 50.

La FIG. 23A es un conjunto de tres imágenes tomadas el día 18 que muestran el CYP3A producido en hepatoesferas tridimensionales. La línea de la parte inferior izquierda de cada tinción indica 20 |um.

La FIG. 23B es un conjunto de tres imágenes tomadas el día 18 que muestran el CYP2D6 producido en hepatoesferas tridimensionales. La línea de la parte inferior izquierda de cada tinción indica 20 |um.

La FIG. 23C es un gráfico de barras que muestra la función de CYP3A a lo largo del tiempo. El eje y corresponde a ULR/mg de proteína/ml y va de 0 a 600.000 a intervalos de 100.000. El eje x, de izquierda a derecha, corresponde a día 23, día 27, día 30, día 44, día 50 y día 60.

La FIG. 23D es un gráfico de barras que muestra la función metabólica de CYP2D6. La barra de la izquierda corresponde a DMSO y la barra de la derecha corresponde a BMS-827278. El eje y corresponde al recuento de luminiscencia y va de 0 a 1.600.000 a intervalos de 200.000. Una reducción de la viabilidad celular para BMS-827278 es proporcional a la actividad enzimática.

Descripción detallada

Puede obtenerse una comprensión más completa de las composiciones y los métodos descritos en la presente descripción por referencia a las figuras adjuntas. Estas figuras son meramente representaciones esquemáticas basadas en la comodidad de uso y la facilidad para demostrar la presente descripción y, por lo tanto, no pretenden definir o limitar el alcance de las realizaciones ilustrativas.

Aunque en la siguiente descripción se usan términos específicos en aras de la claridad, estos términos pretenden referirse únicamente a la estructura particular de las realizaciones seleccionadas para la ilustración en las figuras y no pretenden definir o limitar el alcance de la descripción. El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. En las figuras y en la siguiente descripción a continuación, ha de comprenderse que designaciones numéricas similares se refieren a componentes de función similar.

Las formas singulares “ un” , “ una” y “el/la” incluyen las formas referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión “que comprende” puede incluir las realizaciones “que consiste en” y “que consiste esencialmente en” . Las expresiones “comprende(n)” , “ incluye(n)” , “que tiene(n)” , “tiene(n)” , “puede(n)” , “contiene(n)” y variantes de las mismas, como se usan en la presente descripción, pretenden ser expresiones, términos o palabras de transición abiertas que requieren la presencia de los ingredientes/etapas mencionados y permiten la presencia de otros ingredientes/etapas. Sin embargo, debe considerarse que dicha descripción también describe composiciones o procesos como “que consisten en” y “que consisten esencialmente en” los ingredientes/etapas enumerados, lo que permite la presencia solamente de los ingredientes/etapas nombrados, junto con cualquier impureza que pueda ser resultado de los mismos, y excluye otros ingredientes/etapas.

Debe comprenderse que los valores numéricos en la memoria descriptiva y las reivindicaciones de la presente solicitud incluyen los valores numéricos que son iguales cuando se reducen al mismo número de cifras significativas y los valores numéricos que difieren del valor declarado en menos del error experimental de la técnica de medición convencional del tipo descrito en la presente solicitud para determinar el valor.

Todos los intervalos descritos en la presente descripción incluyen el punto final citado y son independientemente combinables (por ejemplo, el intervalo de “de 2 a 10” incluye los puntos finales, 2 y 10, y todos los valores intermedios).

El término “aproximadamente” puede usarse para incluir cualquier valor numérico que pueda variar sin cambiar la función básica de ese valor. Cuando se usa con un intervalo, “aproximadamente” también describe el intervalo definido por los valores absolutos de los dos puntos finales, por ejemplo, “de aproximadamente 2 a aproximadamente 4” también describe el intervalo “de 2 a 4” . El término “aproximadamente” puede referirse a más o menos el 10 % del número indicado.

Varias referencias bien conocidas que pueden ser relevantes para la presente descripción incluyen: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et.al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, Calif.), “Guide to Protein Purification” en Methods in Enzymology (M. P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et.al. 1990. Academic Press, San Diego, California), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Segunda Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. Nueva York, N.Y.), Gene Transfer and Expression Protocols, págs. 109-128, ed., E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.) o el Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, Tex.).

Como se usa en la presente descripción, la expresión “ laminina-521” se refiere a la proteína formada uniendo las cadenas a5, p2 y y1 entre sí. La expresión debe interpretarse como que abarca tanto la laminina-521 recombinante como la laminina-521 heterotrimérica procedentes de fuentes de origen natural.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “ laminina-111” se refiere a la proteína formada uniendo las cadenas a1, p1 y y1 entre sí. La expresión debe interpretarse como que abarca tanto la laminina-111 recombinante como la laminina-111 heterotrimérica procedentes de fuentes de origen natural.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “ laminina-221” se refiere a la proteína formada uniendo las cadenas a2, p2 y y1 entre sí. La expresión debe interpretarse como que abarca tanto la laminina-221 recombinante como la laminina-221 heterotrimérica procedentes de fuentes de origen natural.

El término “ intacta” se refiere a que la proteína se compone de todos los dominios de la cadena a, la cadena p y la cadena y, estando las tres cadenas unidas entre sí para formar la estructura heterotrimérica. La proteína no se descompone en cadenas, fragmentos o dominios funcionales separados. El término “cadena” se refiere a la totalidad de la cadena alfa, beta o gamma de la proteína laminina. El término “fragmento” se refiere a cualquier fragmento de proteína que contenga uno, dos o tres dominios funcionales que posean actividad de unión a otra molécula o receptor. Sin embargo, una cadena no debe considerarse un fragmento porque cada cadena posee más de tres de dichos dominios. De forma similar, una proteína de laminina intacta no debe considerarse un fragmento. Los ejemplos de dominios funcionales incluyen los Dominios I, II, III, IV, V, VI y el dominio G.

Las lamininas son una familia de glicoproteínas heterotriméricas que residen principalmente en la lámina basal. Actúan a través de interacciones de unión con receptores celulares vecinos, por un lado, y mediante la unión a otras moléculas de laminina u otras proteínas de la matriz, tales como colágenos, nidógenos o proteoglicanos. Las moléculas de laminina también son moléculas de señalización importantes que pueden influir fuertemente en el comportamiento y la función celulares. Las lamininas son importantes tanto para mantener el fenotipo celular/tisular como para promover el crecimiento y la diferenciación celulares en la reparación y el desarrollo tisulares.

Las lamininas son proteínas grandes y de múltiples dominios, con una organización estructural común. La molécula de laminina integra diversas funciones interactivas de matriz y célula en una sola molécula. Una molécula de proteína laminina comprende una subunidad de cadena a, una subunidad de cadena p y una subunidad de cadena y, todas ellas unidas en un trímero a través de un dominio superenrollado. Las doce cadenas de subunidades de laminina conocidas pueden formar al menos 15 tipos de laminina trimérica en los tejidos nativos. Dentro de las estructuras de laminina trimérica existen dominios identificables que poseen actividad de unión hacia otras moléculas de laminina y lámina basal, y receptores unidos a membrana. Por ejemplo, los dominios VI, IVb y IVa forman estructuras globulares, y los dominios V, lllb y IlIa (que contienen elementos de tipo EGF ricos en cisteína) forman estructuras de tipo varilla. Los dominios I y II de las tres cadenas participan en la formación de una estructura superenrollada tricatenaria (el brazo largo).

Existen cinco cadenas alfa, tres cadenas beta y tres cadenas gamma diferentes que se han encontrado en tejidos humanos en al menos quince combinaciones diferentes. Estas moléculas se denominan laminina-1 a laminina-15 basándose en su descubrimiento histórico, pero una nomenclatura alternativa describe las isoformas basándose en su composición de cadenas, por ejemplo, laminina-111 (laminina-1) que contiene cadenas alfa-1, beta-1 y gamma-1. Se han identificado cuatro grupos de lamininas de familia estructuralmente definida. El primer grupo de cinco moléculas de laminina identificadas comparten las cadenas p1 y y1, y varían por su composición de cadena a (cadena a1 a a5). El segundo grupo de cinco moléculas de laminina identificadas, incluyendo la laminina-521, comparten las cadenas p2 y y1, y de nuevo varían por su composición de cadena a. El tercer grupo de moléculas de laminina identificadas tiene un miembro identificado, la laminina-332, con una composición de cadena de a3p3y2. El cuarto grupo de moléculas de laminina identificadas tiene un miembro identificado, la laminina-213, con la cadena y3 recién identificada (a2p1 y3).

La presente descripción se refiere a métodos más eficientes de cultivo de células madre para obtener hepatocitos diferenciados que se comporten más como hepatocitos primarios. En particular, las células madre se cultivan en un sustrato que contiene laminina-521 y una segunda laminina que es la laminina-221. Esto da como resultado hepatocitos más diferenciados con un comportamiento más natural que las células cultivadas en sustratos que contienen una combinación indefinida y alternativa de matrices extracelulares.

Las células diferenciadas típicamente requieren dos cosas para sobrevivir y reproducirse: (1) un sustrato o recubrimiento que proporciona un soporte estructural para la célula; y (2) un medio de cultivo celular para proporcionar nutrición a la célula. El sustrato o recubrimiento (1) se forma típicamente como una capa en un recipiente, por ejemplo, una placa de Petri o en el pocillo de una placa de múltiples pocillos. La aplicación de medios de cultivo celular diferentes a intervalos de tiempo apropiados junto con los sustratos que contienen dos lamininas da como resultado hepatocitos maduros con funciones/propiedades más naturales.

Las células madre que pueden usarse con los métodos y materiales descritos en la presente descripción son células madre humanas pluripotentes. Dichas células madre pueden incluir células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, células madre adultas, células madre fetales, células madre amnióticas y, generalmente, cualquier célula madre pluripotente.

Inicialmente, las células madre se siembran en placa en un sustrato de cultivo celular. El sustrato contiene dos lamininas. La primera laminina es laminina-521 (LN-521). La segunda laminina es laminina-221 (LN-221). Cada laminina puede ser una proteína intacta o un fragmento de proteína, aunque en realizaciones preferidas las lamininas son proteínas intactas.

Las células madre pueden cultivarse en placa en la superficie del sustrato de cultivo celular para obtener cultivos monocapa convencionales (es decir, bidimensionales o 2D). En algunas realizaciones alternativas, después de sembrar en placa en el sustrato de cultivo celular que contiene laminina, las células madre pueden suspenderse y volver a sembrarse en placa para obtener estructuras tridimensionales (3D). Pueden obtenerse esferoides 3D, por ejemplo, usando métodos de suspensión o mediante el uso de una plataforma de microplacas que permita controlar el tamaño de los esferoides. Por ejemplo, pueden usarse sustratos tales como poli(metacrilato de hidroxietil metilo) (poli-HEMA) o agarosa para formar los esferoides 3D. La agarosa, por ejemplo, contiene micropocillos que controlan el tamaño al que puede crecer el agregado. Se conocen en la técnica otras tecnologías de cultivo en 3D. El cultivo en suspensión en placas de baja adherencia puede generar una población heterogénea de agregados con tamaños variables, por ejemplo, de 50 pm a 500 pm.

En realizaciones particulares, se contempla que la relación de peso de la laminina-521 con respecto a la laminina-211 en el sustrato sea de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 1:2, incluyendo de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 1:1 (es decir, menos laminina-521 que la laminina-211). En la presente descripción se observa que la laminina-521 y la laminina-111 activan las integrinas a6p1, lo que a su vez conduce a la activación de la vía PI3K/Akt. Esto aumenta la pluripotencia, la autorrenovación y/o la proliferación de los hepatocitos diferenciados. Muchas moléculas diferentes pueden activar la vía PI3K/Akt, aunque con eficiencias diferentes. Por ejemplo, TGF beta 1 y bFGF activan esta vía. El uso de laminina-521 o laminina-111 permite reducir la cantidad de dichas moléculas en el medio de cultivo celular. El uso de laminina-521 y laminina-511 también permite el paso de la suspensión unicelular sin la adición de inhibidor de rho-cinasa (ROCK), perjudicial para las células, para aumentar la supervivencia celular después de la disociación enzimática unicelular.

En algunas realizaciones, el sustrato de cultivo celular también puede comprender una cadherina. Las cadherinas son una clase de proteínas transmembrana de tipo 1 que desempeñan papeles importantes en la adhesión celular, garantizando que las células dentro de los tejidos se unan entre sí. Dependen de los iones de calcio (Ca2+) para actuar. Las cadherinas también se conocen como desmogleínas y desmocolinas. Estructuralmente, las cadherinas contienen dominios extracelulares de unión a Ca2+. En realizaciones particulares, la cadherina utilizada en el sustrato de cultivo celular es cadherina epitelial o cadherina e. La relación de peso de las dos lamininas con respecto a la cadherina puede ser de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 15:1, o de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 10:1.

El sustrato de cultivo celular se usa junto con múltiples medios de cultivo celular para obtener los hepatocitos deseados. Se usan cuatro medios de cultivo celular diferentes, que se describen a continuación y reciben el nombre en la presente descripción de mTeSRI, medio de diferenciación del endodermo, medio de diferenciación de hepatoblastos y medio de maduración de hepatocitos.

El medio mTeSRI se prepara como se describe en (Ludwig, T.E., Bergendahl, V., Levenstein, M.E., Yu, J., Probasco M.D. y Thomsom, J.A. (2006); Feeder- independent culture of human embryonic stem cells; Nat Methods 8, 637-646) con varias excepciones. En primer lugar, se usa FGF humano recombinante básico (R@DSystems) en lugar de zbFGF. En segundo lugar, se usó Suplemento de Insulina-Transferrina-Selenio (Invitrogen) añadido en medio ya preparado como fuente de los elementos en lugar del método descrito en el artículo. Éste es comercializado por Stem Cell Technologies (n.° de catálogo 05857).

El medio de diferenciación del endodermo incluye RMPI 1640 (n.° de catálogo de Life Technologies 11875-093) y 1X B27. El suplemento B27 sin vitamina A puede obtenerse de Life Technologies (n.° de catálogo 12587-010). Hay presente Activina A (Peprotech, n.° de catálogo 120-14E) en el medio de diferenciación del endodermo en una cantidad de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, incluyendo aproximadamente 100 ng/ml. Hay presente Wnt3a (R&D, n.° de catálogo 1324-WN/CF) en el medio de diferenciación del endodermo en una cantidad de aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 80 ng/ml, incluyendo aproximadamente 50 ng/ml.

El medio de diferenciación de hepatoblastos se compone de KO-DMEM al 77,5 % en vol (n.° de catálogo de Life Technologies 10829-018), Reemplazo de Suero al 20 % en vol (n.° de catálogo de Life Technologies 10828-028), Glutamax al 0,5 % en vol (n.° de catálogo de Life Technologies 35050-038), aminoácidos no esenciales al 1 % en vol (n.° de catálogo de Life Technologies 11140-035), beta-mercaptoetanol 0,1 mM (n.° de catálogo de Life Technologies 31350-010) y sulfóxido de dimetilo al 1 % en vol (n.° de catálogo de Life Technologies d5879).

El medio de maduración de hepatocitos se compone de medio HepatoZYME™ (n.° de catálogo de Life Technologies 17705-021), que contiene Glutamax al 1 % (n.° de catálogo de Life Technologies 35050-038). Hay presente factor de crecimiento de hepatocitos (Peprotech, n.° de catálogo 100-39) en el medio de maduración de hepatocitos en una cantidad de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml, incluyendo aproximadamente 10 ng/ml. También hay presente oncostatina m (Peprotech, n.° de catálogo 300-10) en el medio de maduración de hepatocitos, en una cantidad de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, incluyendo aproximadamente 20 ng/ml. Por último, hay presente hidrocortisona en el medio de maduración de hepatocitos en una concentración de aproximadamente 5 micromolar (pM) a aproximadamente 20 pM, incluyendo aproximadamente 10 pm.

Volviendo a la FIG. 1, las células madre se cultivan en placa primero en el sustrato de cultivo celular formado por dos lamininas, como se ha descrito anteriormente, y se alimentan con el medio mTeSRI durante aproximadamente 1 día a aproximadamente 3 días. Si se desean estructuras celulares 3D, a continuación las células madre se vuelven a sembrar en placa para obtener las estructuras celulares 3D. Después, se inicia la diferenciación retirando el medio mTeSRI y aplicando el medio de diferenciación del endodermo a las células madre cultivadas en placa (2D o 3D). Las células se cultivan en el medio de diferenciación del endodermo durante un período de aproximadamente 60 horas a aproximadamente 84 horas, incluyendo aproximadamente 72 horas (es decir, tres días). El medio puede cambiarse periódicamente, por ejemplo, cada 24 horas.

A continuación, el medio de diferenciación del endodermo se retira y se aplica el medio de diferenciación de hepatoblastos a las células madre cultivadas en placa. Las células se cultivan en el medio de diferenciación de hepatoblastos durante un período de aproximadamente 108 horas a aproximadamente 132 horas, incluyendo aproximadamente 120 horas (es decir, cinco días). El medio puede cambiarse periódicamente, por ejemplo, cada 48 horas.

A continuación, el medio de diferenciación de hepatoblastos se retira y se aplica el medio de maduración de hepatoblastos a las células madre cultivadas en placa (2D o 3D). Las células se cultivan en el medio de maduración de hepatoblastos durante un período de al menos 144 horas (es decir, seis días). El medio puede cambiarse periódicamente, por ejemplo, cada 24 horas. Esto da como resultado un período de tiempo total de aproximadamente 14 días de diferenciación y maduración de las células madre, que se diferencian en hepatocitos.

Alternativamente, las células madre se cultivan de acuerdo con el procedimiento de Avior. El procedimiento de Avior usa un medio de diferenciación del endodermo, un medio de especificación hepática, un medio de diferenciación hepática y un medio de maduración hepática. La siguiente tabla identifica todos los ingredientes utilizados en cada medio en el procedimiento de Avior:

En el procedimiento de Avior, las células madre pluripotentes se cultivan en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 % hasta que las células alcanzan una confluencia del 50 %. De nuevo, las células madre pueden tener una estructura bidimensional (2D) o tridimensional (3D) antes de la diferenciación. La diferenciación se inicia exponiendo las células madre al medio de diferenciación del endodermo durante 72 horas, reemplazándolo por medios frescos cada 24 horas.

Después de 72 horas, las células se exponen al medio de especificación hepática durante 4 días, reemplazándolo por medios frescos cada 24 horas. A continuación, las células se exponen al medio de diferenciación hepática durante 5 días, reemplazándolo por medios frescos cada 24 horas. Por último, las células se exponen al medio de maduración hepática durante 4 días, reemplazándolo por medios frescos cada 24 horas, durante un total de 16 días.

Como otra alternativa, las células madre se cultivan de acuerdo con el procedimiento de Cameron. El procedimiento de Cameron usa un medio de diferenciación del endodermo, un medio de diferenciación de hepatoblastos y un medio de maduración de hepatocitos que es muy similar a los tres medios descritos anteriormente. La siguiente tabla identifica todos los ingredientes utilizados en cada medio en el procedimiento de Cameron:

En el procedimiento de Cameron, las células madre pluripotentes se cultivan en una incubadora humidificada a 37 0C y CO²al 5 % hasta que las células alcanzan una confluencia del 20 al 30 %. De nuevo, las células madre pueden tener una estructura bidimensional (2D) o tridimensional (3D) antes de la diferenciación. La diferenciación se inicia reemplazando el medio de cultivo por el medio de diferenciación del endodermo. Los medios se reemplaza por medios frescos cada 24 horas durante un período de 72 horas. Después de 72 horas, los medios se reemplaza por el medio de diferenciación de hepatocitos durante 5 días, reemplazando cada 48 horas. Después de 5 días, los medios se reemplaza por el medio de maduración de hepatocitos, cambiando cada 48 horas hasta el día 20. Las células presentan gradualmente cambios morfológicos, pasando de una forma puntiaguda y triangular a una morfología hepática característica con aspecto poligonal.

Después de aproximadamente 14 días, la identidad de las células (es decir, que se han diferenciado en hepatocitos) puede verificarse mediante la expresión de marcadores incluyendo CYP3A4, CYP1A2, Oct4, Nanog, albúmina, alfa fetoproteína (AFP), FOXA2, HNF4A, SOX17, CK19 y CYP2D6. Después, los hepatocitos están listos para su uso en las aplicaciones deseadas.

Los sistemas de cultivo celular formados por el sustrato de cultivo celular y los diversos medios de cultivo celular funcionan muy bien para producir hepatocitos a partir de células madre en un entorno totalmente definido y en condiciones libres de material xenogénico, sin alimentadores ni inhibidores de la apoptosis. Se observa que los hepatocitos producidos por el procedimiento de Cameron son, generalmente, más estables que los producidos mediante el procedimiento de Avior, en que poseen actividad Citocromo P450 1A2 y 3A durante un período de tiempo más largo (10 días frente a 1-2 días). Se contempla que el sistema de cultivo celular estará totalmente definido y libre de material xenogénico. El sistema (es decir, tanto el sustrato como cualquier medio de cultivo celular) también debe estar desprovisto de inhibidores de la diferenciación, células alimentadoras o inductores de la diferenciación, o inhibidores de la apoptosis. Los ejemplos de células alimentadoras incluyen fibroblastos de ratón o fibroblastos de prepucio humano. Los ejemplos de inductores de la diferenciación incluyen Noggin o factor de crecimiento de queratinocitos.

Los siguientes ejemplos tienen el fin de ilustrar adicionalmente la presente descripción. Los ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden limitar los dispositivos fabricados según la descripción a los materiales, condiciones o parámetros de proceso expuestos en la misma.

Ejemplos

Ejemplo de referencia 1

Cultivo celular

Se cultivaron células madre embrionarias humanas H9 (hESC) y se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C, CO²al 5 %. Después, se prepararon tres sustratos diferentes en placas de 96 pocillos. El primer sustrato se prerrecubrió con Matrigel® (MG) y sirvió de control. El segundo sustrato se recubrió con 5 microgramos por centímetro cuadrado (pg/cm2) de laminina-521 (LN-521). El tercer sustrato se recubrió con 5 pg/cm2 de una combinación de laminina-521 y laminina-111 en una relación de peso 1:3 (Biolamina, Suecia) (abreviada en la presente descripción como LN-111).

La diferenciación se inició a una confluencia del 40 %, reemplazando el medio libre de suero mTESRI (Stem Cell Technologies) por un medio de diferenciación del endodermo - RPMI 1640 que contenía 1x B27 (Life Technologies), Activina A 100 ng/ml (PeproTech) y Wnt3a 50 ng/ml (R&D). El medio se cambió cada 24 horas, durante 72 horas. El día 4, el medio de diferenciación del endodermo se reemplazó por el medio de diferenciación de hepatoblastos, y éste se renovó cada dos días durante cinco días adicionales. El medio consistía en KO-DMEM (Life Technologies), Reemplazo de Suero (Life Technologies), Glutamax al 0,5 % (Life Technologies), aminoácidos no esenciales al 1 % (Life Technologies), p-mercaptoetanol al 0,2 % (Life Technologies) y sulfóxido de dimetilo al 1 % (Sigma) durante 5 días. El día 9, las células diferenciadas se cultivaron en medio de maduración de hepatocitos HepatoZYME (Life Technologies) que contenía Glutamax al 1 % (Life Technologies), suplementado con factor de crecimiento de hepatocitos 10 ng/ml (Peprotech) y oncostatina m 20 ng/ml (Peprotech).

Se cultivaron en placa hepatocitos humanos cultivables en crioplacas y se mantuvieron de acuerdo con las instrucciones del proveedor Life Technologies. Brevemente, los hepatocitos cultivables en crioplacas se resucitaron en medio de descongelación (Life Technologies, número de catálogo CM3000) y se cultivaron en placa en las placas de 96 pocillos prerrecubiertas. Las células se fijaron eficazmente a todas las matrices y se mantuvieron en una incubadora a 37 grados centígrados y niveles de CO2 establecidos al 5 %. 24 horas después del cultivo en placa, el medio se cambió a un medio de incubación (número de catálogo CM4000).

La FIG. 1 contiene cuatro filas que ilustran el protocolo de diferenciación. La fila superior A contiene un conjunto de imágenes de contraste de fases que proporcionan vistas representativas de las células durante cada etapa. La Fila B enumera el tipo de célula presente en cada etapa de diferenciación (es decir, células madre pluripotentes, endodermo definitivo, progenitores hepáticos y células de tipo hepatocito). La Fila C enumera los factores de crecimiento/moléculas y los medios utilizados en cada etapa del protocolo. La Fila D indica el tiempo para cada etapa del protocolo de diferenciación. La última etapa, la maduración de hepatocitos, puede prolongarse más allá del día 11.

Métodos

Se aisló ARN total de las células usando el reactivo Trizol. La cuantificación y la calidad del ARN se evaluó usando un sistema Nanodrop. Se empleó el kit de transcripción inversa Superscript III de Life Technologies para preparar el ADNc. Se realizó una PCR cuantitativa con Taqman Fast Advance Mastermix y el par de cebadores apropiado, y se analizó usando un sistema de PCR en tiempo real LightCycler 480 de Roche. La expresión génica se normalizó con respecto a la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y se expresó como expresión relativa sobre la muestra de control (hESC el Día 0 de diferenciación). Las PCR cuantitativas se realizaron por triplicado. El análisis de datos se realizó usando el software LightCycler 480 de Roche (versión 1.5). Los niveles de significación se midieron mediante la función estadística del ensayo t de student, en donde los valores significativos son aquellos con un valor p inferior a 0,05.

Posteriormente, se realizó un análisis inmunocitoquímico de los hepatocitos derivados de hESC. Los cultivos celulares se fijaron en metanol 100 % helado a -20 grados centígrados durante 30 minutos y las células adyacentes se prelavaron dos veces con tampón de PBS a temperatura ambiente. Las monocapas celulares se bloquearon con una solución de PBS al 0,1 %-Tween que contenía albúmina sérica bovina al 10 % durante 1 hora. Posteriormente, las monocapas se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en PBS-Tween al 0,1 %/BSA al 1 % a 4 grados centígrados durante la noche. Después de 24 horas, los anticuerpos primarios se retiraron y las monocapas fijadas se lavaron tres veces con PBS-Tween al 0,1 %/BSA al 1 %. Las células se incubaron con anticuerpos secundarios apropiados diluidos en PBS-Tween al 0,1 %/BSA al 1 % durante una hora a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con PBS. Después, los cultivos se montaron con medio de montaje acuoso PermaFluor™ y se contratiñeron con NucBIue Hoescht 33342. Se obtuvieron imágenes de las células con el microscopio Zeiss Axio Observer Z1 con objetivos LD PlanNeoFluar y se usó una cámara Zeiss AxioCamMR3 para la captación de imágenes. Las imágenes se procesaron a través de Zeiss Axiovision SE 64 Rel 4.8 y se analizaron con Zeiss Axiovision versión 4.9.1.0. El porcentaje de células positivas y la desviación estándar se estimó a partir de al menos cinco campos de visión aleatorios.

Antes de la diferenciación

La FIG. 2 es un conjunto de 12 fotomicrografías a un aumento de 10x, organizadas en tres columnas y cuatro filas. La columna más a la izquierda corresponde al sustrato MG, la columna del medio corresponde al sustrato LN-521 y la columna más a la derecha corresponde al sustrato LN-511. La Fila A es un conjunto de imágenes de contraste de fases de la morfología de las células madre pluripotentes en los tres sustratos diferentes antes del inicio de la diferenciación. La Fila B es un conjunto de fotomicrografías que muestran la tinción inmunofluorescente del octámero 4 (OCT4) en las tres matrices diferentes antes del inicio de la diferenciación. La Fila C es un conjunto de fotomicrografías que muestran la tinción inmunofluorescente de la proteína Nanog en las tres matrices diferentes antes del inicio de la diferenciación. La Fila D es un conjunto de fotomicrografías que muestran la tinción de control de inmunoglobulina G para antisueros de conejo, ratón y oveja.

Las células en las tres matrices se adhirieron, proliferaron y se diferenciaron en células de tipo hepatocito (HLC). Después de 24 horas posteriores a volver a cultivar en placa, las ESC mostraban una morfología celular característica apropiada, incluyendo niveles de expresión apropiados de los marcadores asociados a las células madre OCT4 y Nanog, con sutiles diferencias en cada sustrato, como se observa en las Filas A, B y C de la FIG. 1. Los niveles de expresión de OCT4 y Nanog entre los sustratos también son visibles en las fotomicrografías y se enumeran en la tabla a continuación.

Análisis de diferenciación

Veinticuatro horas después de volver a cultivar en placa, se inició la diferenciación usando un procedimiento libre de suero. Se recogieron extractos celulares durante la diferenciación y se evaluó el ARNm los días 0, 3, 9 y 18. Cabe destacar que todos los procedimientos de diferenciación suministraron poblaciones celulares que pasaron de la pluripotencia, a través del endodermo definitivo, a células de tipo hepatoblasto y, posteriormente, a hepatocitos, como se demostró por PCR cuantitativa. Hay que recordar que el rótulo “ LN-511 ” se refiere a un sustrato que contiene una combinación de laminina-521 y laminina-111 en una relación de peso 1:3.

La FIG. 3 es un conjunto de seis gráficos de barras que muestran la expresión génica durante la diferenciación en los tres sustratos (MG, LN-521 y LN-511) para seis genes diferentes cuyo nombre está encima de cada gráfico. La expresión génica relativa se normalizó con respecto al gen constitutivo GAPDH. Como se observa, los marcadores de pluripotencia OCT4 y Nanog disminuyeron a lo largo del tiempo en todos los sustratos. El gen asociado al endodermo FOXA2 alcanzó su máximo en todos los sustratos el día 3 y después de eso disminuyó. La expresión de la alfa-fetoproteína (AFP) varió en todos los sustratos. Las células en el sustrato MG y en el sustrato LN-521 siguieron la misma tendencia de expresión, alcanzando su máximo el día 9 y disminuyendo después el día 18. Por el contrario, las células en el sustrato LN- 111 aumentaron gradualmente la expresión de AFP a lo largo del tiempo, alcanzando su máximo el día 18. Se detectó HNF4A el día 3 en todos los sustratos, pero el día 9 surgieron diferencias significativas en los patrones de expresión. En los sustratos MG y LN-521, la expresión de HNF4A fue máxima el día 9 y disminuyó el día 18, mientras que la expresión de HNF4A aumentó significativamente el día 18 en el sustrato LN-511. Se observó una variación en la expresión del gen HNF4A entre los duplicados experimentales, sin embargo, esto no pareció afectar a la diferenciación posterior y no se reflejó en los niveles de proteína HNF4. La expresión de la albúmina (ALB) se reguló positivamente a partir del día 9 en todos los sustratos. Los niveles de albúmina del día 9 al día 18 experimentaron el mayor aumento en el sustrato LN-511 (aproximadamente 10.000 veces), lo que fue significativo en comparación con los sustratos MG y LN-521 (ambos p<0,001).

Especificación de hepatoblastos

A continuación, se midió la eficacia del proceso de diferenciación. La FIG. 4 es un conjunto de 15 fotomicrografías de células del endodermo y hepáticas cultivadas en los tres sustratos diferentes, con un aumento de 10x o 20x (indicado por la escala), el día 3 de diferenciación. Las fotomicrografías se organizan en tres columnas, una para cada sustrato (MG, LN-521 y LN-111), y en cinco filas, una para cada marcador (FOXA2, SOX17, AFP, HNF4A y citoqueratina 19 (CK19)). El porcentaje de células positivas y la desviación estándar para cada marcador se enumeran en la tabla a continuación.

FOXA2 se expresó en todos los sustratos el día 3. La mayoría de las células en los sustratos MG, LN-521 y LN-111. La tinción de SOX17 fue más variada en los tres sustratos; fue mínima en MG y máxima en LN-521. A medida que la diferenciación celular progresaba y se especificaba el destino hepático, las células comenzaron a expresar niveles altos de marcadores de hepatoblastos. Se expresaron AFP, HNF4a y CK19 en la mayoría de las células en los tres sustratos. La especificación de hepatoblastos en los tres sustratos pareció equivalente y altamente eficiente, y las diferencias iniciales en la morfología de las hESC observadas en los tres sustratos no parecían afectar a la cinética o a la eficiencia de la diferenciación celular usando este procedimiento. Sin embargo, se observó un aumento de aproximadamente 2 veces en el tamaño celular en hepatocitos diferenciados en los sustratos LN-521 y LN-511 (véase las fotomicrografías CK19). Como se muestra, la especificación de hepatoblastos en las tres matrices pareció equivalente y muy eficiente. Cualquier diferencia inicial en la morfología de las hESC observada en las tres matrices no pareció afectar a la cinética, la eficiencia o la diferenciación celular.

Maduración de hepatocitos

Después de la especificación de hepatoblastos, los cultivos celulares se diferenciaron hacia hepatocitos. La especificación de hepatocitos se evaluó mediante inmunotinción para albúmina (ALB), cadherina E (E CAD), marcador de proliferación celular (Ki67), citocromo p4502D6 (CYP2D6) y citocromo p4503A4 (CYP3A4).

La FIG. 5 es un conjunto de nueve fotomicrografías de células hepáticas el día 18 de diferenciación. Las fotomicrografías se organizan en tres columnas, una para cada sustrato (MG, LN-521 y LN-111), y en tres filas, una para cada marcador (ALB, E CAD y Ki67). El porcentaje de células positivas y la desviación estándar para cada marcador se enumeran en la tabla a continuación.

Se observaron patrones similares de producción de proteínas entre las poblaciones de matrigel y laminina. Se detectó tinción de albúmina en las células de los tres sustratos, con la expresión máxima en el sustrato MG y la mínima en el sustrato LN-521. La cadherina E (E CAD) es importante en la regulación del contacto célula a célula de los hepatocitos y está implicada en la regulación espacial de las células. La expresión fue máxima en los sustratos MG y LN-111. Sin embargo, en el sustrato LN-521 se observaron focos con una tinción más brillante. Aunque los estudios de inmunotinción mostraron una equivalencia entre las poblaciones, se observaron diferencias en la división celular en los distintos sustratos, con una mayor proliferación de células en el sustrato MG en comparación con los sustratos LN-521 y LN-111.

Función de hepatocitos

Dado que la organización y la división celulares son factores importantes en la función de los hepatocitos, se estudió la capacidad metabólica de los hepatocitos in vitro. Los hepatocitos derivados de células madre se examinaron en primer lugar para determinar la expresión del citocromo P450 usando antisueros bien caracterizados. La actividad de CYP3A y CYP1A2 se midieron los días 16-26 usando la tecnología pGlo. La actividad de CYP se expresó como unidades de luz relativa (ULR) por mililitro de medios por miligramo de proteína. Los niveles de significación se midieron mediante el ensayo t de Student.

La FIG. 6 es un conjunto de seis fotomicrografías y dos gráficos de barras de expresión génica en células hepáticas. Las fotomicrografías se organizan en tres columnas, una para cada sustrato (MG, LN-521 y LN-111), y en dos filas, una para cada marcador (CYP2D6 y CYP3A4). El porcentaje de células positivas y la desviación estándar para cada marcador se enumeran en la tabla a continuación.

Todas las células expresaron niveles altos de cada marcador en cada sustrato. Aunque la expresión proteínica pareció equivalente, la función de CYP de hepatocitos de células madre varió drásticamente, como se observa en los dos gráficos de barras. En el sustrato LN-111, la actividad de CYP1A2 aumentó a lo largo del tiempo y fue significativamente superior con respecto al sustrato MG en todos los puntos temporales. En la laminina-521, la actividad de CYP1A2 fue elevada y en todo momento fue significativamente superior en comparación con el control. El día 26, las células en ambos sustratos de laminina demostraron una función de CYP1A2 significativamente superior con respecto a los hepatocitos humanos primarios en cultivo (indicado por la línea de puntos). La función de CYP3A aumentó hasta 25 veces en el sustrato LN-111. Las células sobre ambos sustratos de laminina presentaron una función metabólica significativamente mayor con respecto a las células en el sustrato de control MG y los hepatocitos primarios.

Para determinar si estos grandes cambios en la capacidad metabólica se correlacionaban con un aumento de la producción de proteínas, se cuantificó la producción de albúmina y alfa fetoproteína (AFP) a partir de hepatocitos derivados de hESC y hepatocitos cultivables en crioplacas usando kits de ensayo inmunoenzimático (ELISA) disponibles en el mercado. Los diferentes medios se recogieron en los puntos temporales indicados durante la diferenciación de las hESC, días 20-26. Los medios de hepatocitos primarios se recogió a las 24 horas después del cultivo en placa en un medio disponible en el mercado o en superficies recubiertas con laminina. Las muestras se ejecutaron por triplicado y se midieron en un lector de microplacas multimodo FLUOStar Omega. La producción de proteínas se expresó como ng o pg de proteína por mililitro de medios y por miligramo de proteína. Los resultados se muestran en la FIG. 7 , donde se midió la expresión de estas dos proteínas los días 20, 22, 24 y 26 de diferenciación. A pesar de los grandes cambios en la capacidad metabólica, no se detectó diferencias significativas en la secreción de albúmina o AFP mediante ELISA. Por lo tanto, la hipótesis es que cualquier diferencia probablemente se debe a diferencias de la organización celular en los sustratos.

Organización funcional

La FIG. 8 es un conjunto de nueve fotomicrografías del día 24 de diferenciación. Las fotomicrografías se organizan en tres columnas, una para cada sustrato (MG, LN- 521 y LN-111), y en tres filas.

La fila superior (A) de fotomicrografías muestra imágenes de contraste de fases. Los hepatocitos derivados de células madre cultivados en los sustratos LN-521 y LN-111 mostraron un aspecto más de tipo hepatocitos primarios, frecuentemente binucleados con núcleos muy pronunciados. Las imágenes de contraste de fases también indicaron que los hepatocitos estaban dispuestos en estructuras de tipo lóbulo dentro de la placa de cultivo, lo que recuerda al hígado en regeneración.

La fila central (B) muestra la coinmunotinción para MRP1 y HNF4a. Alrededor de estas estructuras lobulares se detectó una tinción positiva para MRP-1, un marcador importante de la membrana basal. Solo los hepatocitos diferenciados en los sustratos LN-521 y LN-111 presentaron redes de hepatocitos organizados in vitro. Esto contrasta mucho con las células del sustrato MG, que mostraron una tinción más individual y punteada.

Para determinar si estas células eran susceptibles de eflujo biliar, las células se trataron con diacetato de 5(6)-carboxi-2',7'-diclorofluoresceína (CDFDA), que se metabolizó a CDF fluorescente y se sometió a eflujo por la proteína 2 asociada a la resistencia a múltiples fármacos (MRP2). Se incubaron hepatocitos derivados de hESC con 2 pM de diacetato de 5(6)-carboxi-2',7'diclorofluoresceína (CDFDA) durante 30 minutos. Después, los cultivos se lavaron con PBS frío que contenía calcio y magnesio. Las células se recogieron para la formación de imágenes o se retuvieron para la cuantificación del eflujo. Para la cuantificación fluorescente, se reemplazó la maduración hepática y las células se incubaron a 37 grados centígrados durante 30 minutos. El eflujo de CDFDA de las células a los medios se midió mediante espectroscopia de fluorescencia a 485/585 nm usando un lector de microplacas multimodo FLUOStar Omega.

Los resultados se muestran en la fila inferior (C) de las fotomicrografías. En particular, la organización celular fue paralela a un eflujo biliar más activo en las células diferenciadas en los sustratos LN-521 y LN-111 frente al sustrato MG.

Análisis de todo el genoma

Los resultados analizados anteriormente demostraron una mejora en la diferenciación de células madre a hepatocitos en lamininas. Para comprender qué redes reguladoras génicas lo sustentan, se realizó un análisis bioinformático exhaustivo y objetivo. Para este fin, las ESC se diferenciaron en los sustratos MG, LN-521 y LN-511. Hay que recordar que el rótulo “ LN-511” se refiere a un sustrato que contiene una combinación de laminina-521 y laminina-111 en una relación de peso 1:3. Se aplicó el protocolo de diferenciación estándar y se analizaron los perfiles de expresión del genoma completo de tres experimentos independientes. Los datos se compararon con un estudio anterior (Godoy et. al., J. Hepatol., 25 de mayo de 2015, pii: S0168-8278(15)00340-2, doi: 10.1016/j.jhep.2015.05.013) en el que se usaron hepatocitos humanos primarios recién aislados (FH), ESC y células de tipo hepatocito diferenciadas con Matrigel® (HLC, D17 y D21). Después, estos datos se compararon con los hepatocitos derivados de células madre de los ^sustratosmG, ^{LN-521 y LN-511 (D24, L521 y L111, respectivamente).}

La FIG.9A es un análisis de componentes principales creado a través de CellNet de los 1.000 genes con mayor varianza en ESC, FH y HLC diferenciados en medios disponibles en el mercado durante 17, 21 y 24 días y en los sustratos LN-521 y LN-511 durante 24 días. El resultado indicó que la diferenciación dirigida por laminina desplazó a las HLC resultantes hacia hepatocitos frescos (FH). El número de genes expresados diferencialmente en el presente estudio (556 entre los sustratos MG y LN-521, y 664 entre los sustratos MG y LN-111, ajustado a FDR) podría considerarse importante.

La FIG. 9B ilustra el estado de la red reguladora de genes obtenida a partir del perfil de expresión génica en hepatocitos humanos primarios recién aislados (FHs), ESC y células de tipo hepatocito (HLC) diferenciadas de sustrato de control en los tres sustratos diferentes. Las puntuaciones de entrenamiento para ESC, colon e hígado en el extremo izquierdo se muestran en color azul oscuro y representan las puntuaciones máximas para cada célula/tejido. Las puntuaciones de las muestras consultadas (en color azul claro) se calculan con respecto a las puntuaciones máximas específicas de la célula/tejido. Se observó una disminución significativa de la puntuación de GRN-ESC en las puntuaciones de LN-521 y del LN-111 en comparación con las puntuaciones de diferenciación en MG. De las dos lamininas, el sustrato LN-111 mostró un efecto significativamente más fuerte que el del sustrato LN-521. La puntuación de GRN-Colon también disminuyó significativamente entre las HLC de laminina y MG. De nuevo, el sustrato LN-111 mostró un efecto significativamente más fuerte que el del sustrato LN-521. Al contrario que con la supresión deseada de las puntuaciones de GRN-ESC y GRN-Colon, no hubo una mejora significativa de la puntuación de GRN-hígado por los sustratos de laminina en comparación con los sustratos MG de control. Este resultado contrasta con los datos obtenidos para los genes hepáticos individuales (HNF4a, albúmina en la FIG. 3) que mostraron un claro aumento de las HLC de los sustratos de laminina en comparación con el sustrato MG. Esta discrepancia ilustra la importancia de comparar las tendencias de todo el genoma frente a los genes individuales elegidos a mano para evitar interpretaciones erróneas.

La FIG. 9C es un conjunto de gráficos generados después de la obtención de tres supergrupos usando una técnica de agrupamiento difuso descrita en la referencia Godoy 2015. Los genes con patrones de expresión similares en células de tipo hepatocito se agruparon en tres supergrupos asociados a tres funciones diferentes: funciones hepáticas maduras (filas I y II); proliferación (fila III) y matriz extracelular (ECM)/migración (filas IV y V). Con respecto a cada gráfico de grupo de genes individuales (por ejemplo, grupo 2 = 528 genes), se representan seis muestras diferentes para mostrar los niveles de expresión de cada gen. En cada gráfico de grupo de genes, el primer punto (desde la izquierda) es representativo de células madre embrionarias humanas (hESC), el segundo punto corresponde a células de tipo hepatocito (HLC) derivadas de células madre cultivadas en el sustrato MG después de 17 días; el tercer punto corresponde a HLC derivadas de células madre cultivadas en el sustrato MG después de 21 días; el cuarto punto corresponde a HLC derivadas de células madre cultivadas en el sustrato MG después de 24 días; el quinto punto corresponde a HLC derivadas de células madre cultivadas en el sustrato LN-521 después de 24 días; y el sexto punto corresponde a HLC derivadas de células madre cultivadas en el sustrato mixto LN-111 después de 24 días. Por ejemplo, para la fila I, grupo de genes 2 = 528 genes, las hESC tienen un nivel de expresión extremadamente bajo (aproximadamente -1,75) en comparación con el nivel de expresión de las células de tipo hepatocito derivadas de células madre cultivadas en el sustrato LN-521 después de 24 días (aproximadamente 0). Se enumeran a continuación tablas de estos resultados aproximados del nivel de expresión, con el número de fila enumerado entre paréntesis después del nombre del grupo. En la FIG. 9C también se enumeran los motivos biológicos asociados a los genes, una selección de genes representativos, una selección de factores de transcripción representativos y una selección de sitios de unión de factores de transcripción. Como se observa en los gráficos individuales, en los tres grupos asociados a la proliferación, la laminina provocó una supresión de la expresión génica significativamente mayor en las HLC en comparación con los medios de control.

El agrupamiento de los genes con patrones de expresión similares en las HLC generó tres supergrupos que representan los motivos “funciones hepáticas maduras” , “proliferación” y “ matriz extracelular (MEC)/migración” . Los motivos KEGG y GO están sobrerrepresentados en cada grupo de genes. También se indican genes representativos para cada grupo y motivo. Los genes enumerados en cursiva del Grupo V se expresaron en niveles más bajos en las HLC en el sustrato LN-111 en comparación con el sustrato MG de control. Se observaron diferencias significativas en los niveles medios de expresión génica entre el sustrato MG de control y los sustratos LN-521 y LN-111 en los grupos 5, 10 y 6, que corresponden al supergrupo “proliferación” . En los tres grupos asociados a la proliferación, los sustratos de laminina condujeron a una supresión significativamente más fuerte con respecto al sustrato MG (grupos III y IV; Figura 7 c). Dentro de los grupos de “funciones hepáticas maduras” , pueden identificarse varios genes individuales para los que los sustratos de laminina permitieron una mayor expresión en comparación con el sustrato Matrigel® MG de control, por ejemplo, el componente del complemento 3 (C3), el factor del complemento I (CF- I), plasminógeno (PLG) y FXR (NR1H4) (Tabla Suplementaria X), pero como grupo de genes no se obtuvo ninguna diferencia significativa.

La FIG. 10 es un conjunto de cuatro gráficos de barras que ilustran el metabolismo de hepatocitos humanos primarios y la producción de proteínas. Se cultivaron en placa hepatocitos humanos primarios (PHH) de hombres y mujeres en los sustratos MG, LN-521 y LN-111 y se examinaron para determinar su competencia metabólica 48 horas después. La actividad de CYP1A2 y CYP3A aumentó en los sustratos que contenían laminina con respecto al sustrato MG de control tanto en los PHH masculinos (barras de color negro) como en los femeninos (barras de color blanco). Se analizaron la secreción de albúmina y de alfa fetoproteína de PHH mediante ELISA. No se produjo alfa fetoproteína a niveles detectables y la producción de albúmina se potenció en el sustrato LN-521 en PHH femeninos.

Análisis

Se sometieron a ensayo tres sustratos diferentes, uno el sustrato Matrigel® de control y los otros dos que contenían lamininas. Aunque se produjo un número similar de hepatocitos derivados de células madre en los tres sustratos, se observaron diferencias evidentes en su ensamblaje, organización y función celulares. Al imitar los elementos clave del nicho de células hepáticas, usando dos isoformas de laminina, se mejoró drásticamente la diferenciación de hepatocitos, potenciando significativamente la organización y la función celulares. En particular, la función de CYP1A2 y CYP3A fueron equivalentes o superiores a la de los hepatocitos humanos primarios cuando se cultivaron hepatocitos derivados de células madre sobre las lamininas, y permanecieron estables durante varios días en cultivo. La organización potenciada de los hepatocitos en ambas lamininas se evidenció por tinción con MRP1 y dio como resultado una excreción canalicular mejorada de CDFDA, lo que sugiere una característica de madurez de los hepatocitos derivados de células madre in vitro

Estas observaciones eran coherentes con una mejor organización de los hepatocitos y mejores actividades de CYP P450 en las poblaciones celulares diferenciadas en los sustratos que contenían laminina. Dadas las diferentes funciones que desempeña la laminina en la biología del hígado, los estudios se ampliaron a las fuentes actuales de referencia, los hepatocitos primarios de donantes masculinos y femeninos. Notablemente, al igual que en el caso de los hepatocitos hESC, las superficies recubiertas con laminina favorecieron la actividad de CYP p450, pero no mejoraron significativamente la secreción de albúmina.

Puesto que el análisis de algunos marcadores hepáticos seleccionados sugirió una mejora de la diferenciación hepática cuando se usaron sustratos de laminina en comparación con Matrigel®, se realizó un análisis de expresión de todo el genoma. Un primer objetivo era responder si los diferentes sustratos/matrices provocaban cambios drásticos o solo cambios menores en la expresión génica global. Estudios anteriores han demostrado que el tipo de matriz puede provocar alteraciones fenotípicas importantes, tales como diferencias en la polaridad celular y la sensibilidad a la apoptosis. Teniendo en cuenta el número de genes expresados diferencialmente en el presente estudio (556 entre los sustratos Matrigel® y LN-521, y 664 entre los sustratos Matrigel y LN-111 combinados, ajustado a FDR) la diferencia puede considerarse importante. Puede concluirse que los sustratos que contienen laminina aportaron tres características específicas en comparación con el sustrato de control Matrigel®. En primer lugar, se suprimió más eficazmente la expresión de genes de estaminalidad, con una reducción de cuatro veces en los marcadores de células madre LIN28A y c-kit en las lamininas. En segundo lugar, la combinación de laminina-521 y laminina-111 suprimió más eficientemente la expresión de genes asociados a la proliferación. En tercer lugar, la inducción de la expresión génica no deseada asociada al colon y a los fibroblastos, que es un efecto secundario inherente a los protocolos de diferenciación de hepatocitos utilizados actualmente, mejoró con la laminina-111. Por lo tanto, el análisis de todo el genoma identificó claramente la mejora de las HLC diferenciadas en sustratos que contienen laminina. Es importante destacar que pueden identificarse genes individuales en los que la presencia de laminina-111 mejoró la diferenciación de hepatocitos. Por ejemplo, el C3, la haptoglobina, el plasminógeno y el factor de transcripción FXR aumentaron al menos 2 veces en el sustrato que contenía laminina-111 en comparación con el sustrato Matrigel®.

Los presentes resultados demostraron las propiedades de respaldo de las lamininas recombinantes en el contexto de la diferenciación de hepatocitos derivados de células madre y la función metabólica. Los hepatocitos derivados de hESC mostraron una morfología, una organización, una estabilidad y una función celulares mejoradas en lamininas humanas, lo que fue comparable con hepatocitos primarios masculinos y femeninos.

Ejemplo 2

Se produjeron hepatocitos derivados de células madre a partir de células madre embrionarias humanas en tres sustratos diferentes. El primer sustrato fue la laminina-521 pura (LN-521). El segundo sustrato fue una mezcla de laminina-521 y laminina-221 en una relación de peso 1:3 (221 (1:3)), es decir, tres veces más laminina-221. El tercer sustrato fue una mezcla de laminina- 221 y laminina-521 en una relación de peso 1:1 (221 (1:1)). A los 18 días, las células se fijaron y se tiñeron para detectar la proteína 1 de resistencia a múltiples fármacos (MPR1).

La FIG. 11 muestra fotomicrografías de los tres sustratos. Las células cultivadas en placa en el sustrato 221 (1:3) mostraron una organización tisular más compleja que las cultivadas en placa en los sustratos LN-521 o 221 (1:1). Esto también fue paralelo a la función celular, como se observa en la FIG. 12. Los hepatocitos derivados de células madre vueltos a cultivar en placa en el sustrato 221 (1:3) fueron superiores en términos de función en comparación con los otros dos sustratos.

Ejemplo 3

Se produjeron hepatocitos derivados de células madre a partir de células madre embrionarias humanas en tres sustratos diferentes. El primer sustrato fue la laminina-521 pura (LN-521). El segundo sustrato fue una mezcla de laminina-521 y laminina-221 en una relación de peso 1:3 (221 (1:3)). El tercer sustrato fue una mezcla de laminina-221 y laminina-521 en una relación de peso 1:1 (221 (1:1)). El procedimiento de Cameron y el procedimiento de Avior se compararon entre sí.

La FIG. 13 es un conjunto de dos gráficos de barras que muestran la función de hepatocitos de los dos procedimientos. En particular, el procedimiento de Avior reivindica que el uso de dos componentes inductores, la vitamina K (MK4) y el ácido litocólico (LCA), mejoró drásticamente la diferenciación de hepatocitos. Estos beneficios no se observaron usando MK4 ni LCA.

Las células cultivadas en placa en el sustrato 221 (1:3) obtuvieron mejores resultados que las cultivadas en placa en los sustratos LN-521 o 221 (1:1). Notablemente, cuando se midió la función de hepatocitos adultos (CYP1A2), los hepatocitos derivados de células madre a través del procedimiento de Cameron obtuvieron mejores resultados que los suministrados por el procedimiento de Avior. Cuando se midió la función hepática fetal y de adulto (CYP3A), el procedimiento de Avior obtuvo mejores resultados. LCA y MK4 desencadenaron efectos tóxicos importantes en hepatocitos derivados de células madre, dando como resultado muerte celular el día 18 usando el procedimiento de Avior. Típicamente, los hepatocitos derivados de células madre muestran función y viabilidad durante 27 días en el proceso de diferenciación, lo que indica que el procedimiento de Cameron produce poblaciones más estables de tipo hepatocito y adulto in vitro en comparación con el procedimiento de Avior.

Ejemplo de referencia 4

Se cultivaron en placa células MAN 12, una estirpe celular de calidad BPF, en tres sustratos diferentes.

El primer sustrato fue Matrigel® (MG), y sirvió de control. El segundo sustrato se recubrió con 5 microgramos por centímetro cuadrado (pg/cm2) de laminina-521 (LN-521). El tercer sustrato se recubrió con 5 pg/cm2 de una combinación de laminina-521 y laminina-111 en una relación de peso 1:3 (Biolamina, Suecia) (abreviada en la presente descripción como LN-111). Después, las células se diferenciaron de acuerdo con el protocolo de Cameron.

La FIG. 14 es un conjunto de 15 fotomicrografías con un aumento de 10x, organizadas en tres columnas y cinco filas, tomadas el Día 24 de diferenciación. La columna más a la izquierda corresponde al sustrato MG, la columna del medio corresponde al sustrato LN-521 y la columna más a la derecha corresponde al sustrato LN-111. La Fila A es un conjunto de imágenes de contraste de fases de la morfología. Las barras de escala son de 200 pm. La Fila B es un conjunto de fotomicrografías que muestran la tinción inmunofluorescente de albúmina (ALB) en las tres matrices diferentes. La Fila C es un conjunto de fotomicrografías que muestran la tinción inmunofluorescente del citocromo P450 3A (CYP3A). La Fila D es un conjunto de fotomicrografías que muestran la tinción inmunofluorescente de la proteína 1 de resistencia a múltiples fármacos (MRP1). La Fila E es un conjunto de fotomicrografías que muestran la tinción de control de inmunoglobulina G para antisueros de oveja, ratón y conejo.

La FIG. 15 es un conjunto de cuatro gráficos de barras. La primera fila de dos gráficos muestran la secreción de proteínas de hepatocitos para alfa fetoproteína y albúmina, analizada por ELISA el día 24 de diferenciación (n=3). No se observaron diferencias significativas entre las tres matrices. La segunda fila de dos gráficos muestran la función metabólica de la actividad de CYP p450 los días 18, 20 y 24 para la actividad de CYP1A2 y CYP3A. El porcentaje de células positivas y la desviación estándar para dos marcadores se enumeran en la tabla a continuación.

Ejemplo de referencia 5

Se cultivaron en placa células MAN11, otra estirpe celular de calidad BPF, en tres sustratos diferentes. El primer sustrato fue Matrgel® (MG), y sirvió de control. El segundo sustrato se recubrió con 5 microgramos por centímetro cuadrado (pg/cm2) de laminina-521 (LN-521). El tercer sustrato se recubrió con 5 pg/cm2 de una combinación de laminina-521 y laminina-111 en una relación de peso 1:3 (Biolamina, Suecia) (abreviada en la presente descripción como LN-111). Después, las células se diferenciaron de acuerdo con el protocolo de Cameron.

La FIG. 16 es un conjunto de 15 fotomicrografías a un aumento de 10x, organizadas en tres columnas y cinco filas. La columna más a la izquierda corresponde al sustrato MG, la columna del medio corresponde al sustrato LN-521 y la columna más a la derecha corresponde al sustrato LN-111. La Fila A es un conjunto de imágenes de contraste de fases de la morfología. Las barras de escala son de 200 pm. La Fila B es un conjunto de fotomicrografías que muestran la tinción inmunofluorescente de albúmina (ALB) en las tres matrices diferentes. La Fila C es un conjunto de fotomicrografías que muestran la tinción inmunofluorescente del citocromo P450 3A (CYP3A). La Fila D es un conjunto de fotomicrografías que muestran la tinción inmunofluorescente de la proteína 1 de resistencia a múltiples fármacos (MRP1). La Fila E es un conjunto de fotomicrografías que muestran la tinción de control de inmunoglobulina G para antisueros de oveja, ratón y conejo. Todas estas fotos se tomaron el Día 18. El porcentaje de células positivas y la desviación estándar para dos marcadores se enumeran en la tabla a continuación.

La FIG. 17 es un conjunto de cuatro gráficos de barras. La primera fila de dos gráficos muestra la secreción de proteínas de hepatocitos para alfa fetoproteína y albúmina, analizada por ELISA el día 18 de diferenciación (n=3). Se observó una reducción significativa de la alfa fetoproteína (AFP) tanto en LN 521 (p=2,01091E-06) como en LN 111 (p=1,20688E-06). La albúmina aumentó significativamente en LN 521 (p=1,23378E-05). La segunda fila de dos gráficos muestran la función metabólica de la actividad de CYP p450 el día 18 para la actividad de CYP1A2 y CYP3A. No se observaron diferencias significativas entre las tres matrices.

En el Ejemplo 4 y en el Ejemplo 5, las células MAN11 y MAN12 se diferenciaron eficientemente en los tres sustratos, expresando la mayoría de las células (>80 %) albúmina y CYP3A, como se detectó mediante inmunotinción. También se demostró el mismo nivel de organización celular en los tres sustratos, aunque morfológicamente las células estaban más definidas en los sustratos que contenían laminina y mostraban una morfología hexagonal distinta. Además, las HLC en los sustratos LN-521 y LN- 111 mostraron redes de tinción de MRP1; lo que indica que estas poblaciones celulares estaban más polarizadas. Cabe destacar que los hepatocitos derivados de H9 mostraron un perfil metabólico más parecido al de los hepatocitos primarios que los hepatocitos derivados de MAN11 y MAN12. Sin embargo, tanto el sustrato LN-512 como el LN-111 mejoraron la actividad metabólica de los hepatocitos derivados de MAN12 y redujeron significativamente la secreción de proteínas fetales en los hepatocitos derivados de MAN11, lo que demuestra un progreso significativo.

Ejemplo de referencia 6

Diferenciación de células madre pluripotentes hacia hepatocitos.

Se disociaron hESC cultivadas en pocillos recubiertos con laminina-521 pura en células individuales y se resuspendieron en mTeSRl suplementado con inhibidor de ROCK. Para fabricar esferoides de tamaño aleatorio, se transfirieron 2 ml de suspensión de 1x106 células a placas de 6 pocillos recubiertas con poli-metacrilato de hidroxietil metilo (poli-HEMA) y se incubaron en condiciones estáticas durante la noche (FIG. 18A). El recubrimiento de la placa con poli-HEMA crea una superficie ultrabaja/no adherente que fuerza la autoagregación de las células y la formación de esferoides en el cultivo en suspensión. Para fabricar esferoides de tamaño uniforme, se añadieron 190 microlitros (pl) de suspensión celular 1x106, 2x106 y 4x106/ml en microplacas de agarosa preformadas y se incubaron durante la noche para formar esferoides de 50 pm a 100 pm de diámetro (FIG. 18B), de 100 pm a 150 pm de diámetro (FIG. 18C) y de 150 pm a 200 pm de diámetro (FIG. 18D), respectivamente. Al igual que el cultivo en suspensión, el molde de agarosa proporciona una superficie no adherente que fuerza la autoagregación de las células en pocillos individuales, sin embargo, el tamaño de los esferoides puede controlarse cambiando la densidad de siembra. La FIG. 18E compara los intervalos de tamaño. Veinticuatro horas después de volver a cultivar en placa, se inició la diferenciación usando un procedimiento por etapas libre de suero para derivar células de tipo hepatocito a partir de las estirpes celulares H9 y Man12.

Análisis de la expresión génica

Para analizar la expresión génica, se recogieron los esferoides en los puntos temporales indicados y se extrajo ARNm. Ambos procedimientos suministraron poblaciones celulares de H9 (estirpe de calidad de investigación) y Man12 (estirpe de calidad BPF) que transitaron de la pluripotencia, a través del endodermo definitivo, a células de tipo hepatoblasto y, posteriormente, a hepatocitos, como se demostró por PCR cuantitativa. Se detectó expresión de FOXA2 desde los días 3-18 (FIG. 19A). Se detectó un nivel alto de expresión de HNF4A el Día 8 con un pico y disminuyó a medida que las células maduraban en el cultivo (FIG. 19B). La expresión de alfa fetoproteína (AFP) se reguló positivamente el Día 8 de diferenciación con un pico de expresión el Día 18 (FIG. 19C). Se detectaron niveles bajos de albúmina (ALB) el Día 8, seguido de un aumento significativo el Día 18 (FIG. 19D).

Maduración de hepatoesferas derivadas de células madre embrionarias humanas

Para evaluar la maduración de las hepatoesferas 3D, se tiñeron marcadores hepáticos tales como el factor nuclear hepático 4A (HNF4A) y la cadherina E (Ecad) el día 18 para determinar su expresión (FIG. 20A). A esto le siguió la inmunotinción el Día 30 para los marcadores de hepatocitos maduros albúmina (verde) y HNF4a (naranja) en la FIG. 20B. ZO-1 es un marcador importante de polaridad celular y se detectó el contacto célulacélula en hepatoesferas grandes y pequeñas (FIG. 21 ). Notablemente, se observaron un menor número de células que expresaban Ki67, un marcador de proliferación celular, en las hepatoesferas más pequeñas en comparación con las hepatoesferas más grandes, (FIG. 21). Para evaluar el nivel de proteínas específicas del hígado secretadas, se midieron los niveles de AFP y ALB por ELISA. Los resultados indicaron que la producción de AFP se redujo por la maduración adicional de las hepatoesferas y cayó por debajo del límite de detección el día 44 de diferenciación, mientras que la producción de ALB continuó hasta el día 50 (FIG. 22A y FIG. 22B).

Función metabólica de hepatocitos derivados de células madre embrionarias humanas

Para evaluar la competencia metabólica de hepatoesferas derivadas de células madre humanas, se examinó la expresión del citocromo P450 usando antisueros. Se detectaron la expresión de CYP3A y CY2D6 en todas las hepatoesferas 3D (FIG. 23A y FIG. 23B). Además, se evaluaron la funcionalidad P450 de las hepatoesferas. La función de CYP3A fue respetable y se mantuvo en cultivo durante al menos 33 días (FIG. 23C). De forma adicional, se midió la función metabólica de Cyp2D6 usando un compuesto farmacéutico conocido como BMS-827278. Este compuesto se activa metabólicamente hasta un punto final tóxico y, por lo tanto, la reducción de la viabilidad celular (barra de color naranja) es proporcional a la actividad enzimática (FIG. 23D).

Función de hepatocitos derivados de células madre embrionarias humanas in vivo

Para evaluar la competencia de los hepatocitos derivados de células madre bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) para respaldar la función hepática murina, se empleó el modelo de hepatectomía parcial de función hepática reducida. Se trasplantaron 2 millones de hepatocitos 2D o 3D por vía intraportal o intraperitoneal, respectivamente. Para las células 2D, 48 horas después del trasplante se realizó una hepatectomía parcial del 30 %. Para las células 3D, se trasplantaron células al peritoneo al mismo tiempo que se realizaba la hepatectomía. 7 días después de la hepatectomía parcial se registró el peso corporal del ratón. El peso corporal aumentó significativamente en ambos grupos de trasplante en comparación con el control de solo vehículo. El control tenía aproximadamente el 91 % del peso corporal inicial, mientras que el grupo 2D tenía aproximadamente el 95 % del peso corporal inicial, y el grupo 3D tenía aproximadamente el 100 % del peso corporal inicial.

Los inventores han desarrollado un sistema 3D para derivar células de tipo hepatocito funcionales con un fenotipo estable. Ambos protocolos dieron como resultado la producción eficiente de esferoides a partir de hPSC cultivadas y mantenidas en laminina 521, sin embargo, el control del tamaño de los esferoides formados fue un reto usando la metodología en suspensión. En cambio, el tamaño de los esferoides puede controlarse usando la plataforma de microplacas con una pequeña variación en el tamaño de los esferoides.

Las hepatoesferas 3D mostraron un fenotipo más estable y una funcionalidad metabólica prolongada hasta el día 60 de diferenciación. Además, las células de tipo hepatocito derivadas en condiciones 3D mostraron estructuras altamente polarizadas evidentes por la expresión de cadherina e y ZO-1. Notablemente, se observó un número menor de células proliferativas en las hepatoesferas pequeñas el día 18, mientras que se detectó un número mayor en los esferoides más grandes, lo que indica la importancia del tamaño en la regulación del comportamiento celular. Es importante destacar que las hepatoesferas 3D demostraron una función adecuada in vitro y también respaldaron la función hepática de mamífero in vivo.

La presente descripción se ha descrito con referencia a realizaciones ilustrativas. Obviamente, a otros se les ocurrirán modificaciones y alteraciones tras leer y comprender la descripción detallada anterior.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un método de producción de hepatocitos, que comprende:

sembrar en placa células madre humanas pluripotentes en un sustrato de cultivo celular que comprende

(i) una primera laminina que es laminina-521 y

(ii) una segunda laminina que es laminina-221, en donde la laminina-521 y la segunda laminina son cada una ya sea una proteína intacta o un fragmento de proteína; y cultivar las células madre humanas pluripotentes para obtener los hepatocitos.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la relación de peso de la laminina-521 con respecto a la segunda laminina es de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 1:1.
3. El método de la reivindicación 1, en donde el cultivo de las células madre humanas pluripotentes se realiza:

cultivando las células en un medio de diferenciación del endodermo que contiene activina A y Wnt3a; cultivando las células en un medio de diferenciación de hepatoblastos; y

cultivando las células en un medio de maduración de hepatocitos que contiene hidrocortisona (HC), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y oncostatina m (OSM).
4. El método de la reivindicación 3, en donde las células se cultivan en el medio de diferenciación del endodermo durante un período de aproximadamente 60 horas a aproximadamente 84 horas, o en el medio de diferenciación de hepatoblastos durante un período de aproximadamente 73 horas a aproximadamente 180 horas, o en el medio de maduración de hepatocitos durante al menos 216 horas.
5. El método de la reivindicación 3, en donde la activina A está presente en el medio de diferenciación del endodermo en una cantidad de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml.
6. El método de la reivindicación 3, en donde el Wnt3a está presente en el medio de diferenciación del endodermo en una cantidad de aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml.
7. El método de la reivindicación 3, en donde el medio de diferenciación del endodermo incluye RMPI 1640 y B27.
8. El método de la reivindicación 3, en donde el medio de diferenciación de hepatoblastos se compone de KO- DMEM, Reemplazo de Suero al 20 %, aminoácidos no esenciales al 1 %, beta-mercaptoetanol 0,1 mM y sulfóxido de dimetilo al 1 %.
9. El método de la reivindicación 3, en donde el factor de crecimiento de hepatocitos está presente en el medio de maduración de hepatocitos en una cantidad de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml.
10. El método de la reivindicación 3, en donde la oncostatina m está presente en el medio de maduración de hepatocitos en una cantidad de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml.
11. El método de la reivindicación 1, en donde el cultivo de las células madre humanas pluripotentes se realiza de acuerdo con el procedimiento de Avior o el procedimiento de Cameron.
12. El método de la reivindicación 1, en donde los hepatocitos resultantes presentan una actividad de CYP1A2 de al menos 600.000 ULR/mg/ml.
13. El método de la reivindicación 1, en donde los hepatocitos resultantes presentan una actividad de CYP3A de al menos 800.000 ULR/mg/ml.
14. El método de la reivindicación 1, en donde el sustrato de cultivo celular comprende además una cadherina.
15. El método de la reivindicación 14, en donde la relación de peso de (la primera laminina la segunda laminina) con respecto a la cadherina es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 15:1.
16. El método de la reivindicación 1, en donde el sustrato de cultivo celular no contiene inhibidores de la diferenciación, células alimentadoras, inductores de la diferenciación o inhibidores de la apoptosis.
17. El método de la reivindicación 1, en donde las células madre humanas pluripotentes tienen una estructura tridimensional antes del cultivo.