CN110381967A - 肝类器官组合物以及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

公开了诱导从如iPSC细胞等前体细胞形成肝类器官的方法。所公开的肝类器官可以用于筛选严重不良事件(SAE)，如肝衰竭和/或药物诱发的肝损伤(DILI)和/或药物毒性。所公开的肝类器官还可以用于治疗患有肝损害的个体或用于识别优选的治疗剂。

Description

肝类器官组合物以及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年11月4日提交的美国临时专利申请62/471,371和2016年6月9日提交的美国临时专利申请62/517,414的优先权和权益，所述每个申请的内容通过引用以其整体并入用于所有目的。
背景技术
肝是一种重要的器官，其为生命提供许多重要的代谢功能，如外源性化合物的解毒和凝血，以及产生脂质、蛋白质、铵和胆汁。体外重建患者的肝可以提供应用，包含再生疗法、药物发现和药物毒性研究。使用肝细胞的现有方法表现出极差的功能，主要是由于缺乏必要的解剖结构，这限制了它们在制药工业中的实际应用。
由于初始筛选中识别的候选药物失败，每年因制药行业的药物开发而损失数十亿美元，并且近三分之一的药物因这种失败而退出市场(Takebe和Taniguchi，2014)。候选药物的失败导致患者治疗机会的巨大损失。临床前研究通常包括体外评估作为识别“命中”化合物的主要功效筛选，然后在体外和体内进行安全性研究以评估代谢和毒理学的机制。这种低效率可以解释为大量缺乏生理学相关的临床前模型，其在评估人类药物诱发的肝损伤(DILI)方面具有高通量，并且因此迫切需要开发用于评估大量的不断增长的化合物库的体外人工筛选模型。
原代肝细胞是高度极化的代谢细胞类型，并形成具有微绒毛衬里通道的胆小管结构，将外周循环与胆汁酸分泌途径分开。DILI的最上游方面包含药物(或其活性代谢物)通过肝细胞解毒和通过转运蛋白如多药耐药相关蛋白(MRP)转运蛋白排泄到胆小管中。这表明需要重建这些独特组织的结构，作为体内肝细胞的关键特性，用于预测DILI病理学。然而，目前的简化培养模型与使用分离的原代人肝细胞或肝细胞系和体内生理学之间的药物毒性特征存在相当大的差异，导致药物翻译失败或停药，如曲格列酮、奈法唑酮和托卡朋的情况(https://livertox.nlm.nih.gov/index.html)。因此，毒理学特性的确定主要依赖于动物作为药物开发的必要步骤，然而，由于人类与动物之间生理学上的显著差异，人类结果显著缺乏忠诚度(Leslie等人，2007；Yang等人，2014)。此外，非常罕见但仍然导致美国约10％到15％的急性肝衰竭(Reuben等人，2010)的特异性DILI(IDILI)的发病几乎无法预测(Kullak-Ublick等人，2017)。总体而言，需要有效的人类细胞模型以筛选用于测试所提出的药物的解毒和排泄的化合物。
尽管人类肝细胞分化方法从多能干细胞(PSC)逐步推进，但使用人类干细胞的培养皿中的临床试验仍然是“炒作”。[除药物筛选的功效和/或毒性外，还需要肝细胞模型例如，用于生物人工肝装置中作为移植的桥梁，并且用于精确(个性化医疗)。本公开旨在解决本领域中的上述需求中的一个或多个。
发明内容
公开了诱导从前体细胞，如iPSC细胞形成肝类器官的方法。所公开的肝类器官可以用于筛选严重不良事件(SAE)，如肝衰竭和/或药物诱发的肝损伤(DILI)和/或药物毒性。所公开的肝类器官还可以用于治疗患有肝损害的个体，或用于识别优选的治疗剂。
附图说明
本领域中的技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明性目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。
专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有一副或多副彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付必要费用后由主管局提供。
图1.从具有管腔结构的iPSC生成人肝类器官。A.用于肝类器官分化方法的概述。B.人肝类器官的相差图像。C.白蛋白(ALB)、IV型胶原(胶原蛋白IV)和ZO-1在类器官中的免疫染色。细胞核用苏木精(蓝色)染色。尺，50μm。D.未分化的iPS细胞，分化的第7天、第11天、第20天和第30天的类器官和原代肝细胞(PH)中甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、视黄醇结合蛋白4(RBP4)、细胞角蛋白19(CK19)、肝细胞核因子6(HNF6)和细胞色素P4503A4(CYP3A4)的定量RT-PCR。将相对表达值与未分化的iPSC(AFP、ALB、RBP4和CK19)或第7天的类器官(HNF6)或第11天的类器官(CYP3A4)进行比较。条形代表平均值±SD，n＝3。E.基于未分化iPS细胞(iPSC)、定形内胚层(DE)、肝特异性细胞(HS)、肝祖细胞(HP)、iPSC衍生胆管细胞(iDC)、正常人胆管细胞(NHC)、iPSC衍生的后部前肠(pFG)、iPSC衍生的人肝类器官、原代肝细胞、胎儿肝组织、肝组织和人肝的右叶中的RNA序列数据的主成分分析。F.第25天到第30天来自类器官的白蛋白(ALB，n＝10)和纤维蛋白原(FBG，n＝4)分泌水平。条形代表平均值±SEM。G.第25天到第30天来自类器官的补体因子分泌水平。FH：因子H、FB：因子B.条形代表平均值±SEM，n＝5。
图2.人iPSC肝类器官中的胆汁酸合成、摄取和排泄。A.单个类器官中多药耐药相关蛋白2(MRP2)和胆汁盐输出泵(BSEP)的免疫染色。尺，50μm。B.示出微绒毛(V)腔内表面的类器官的透射电子显微照片；N:核。尺，10μm。C.未分化的iPSC、分化的第20天(NTCP)和第30天(ABCB11)类器官和原代肝细胞(PH)中ATP结合盒、亚家族B成员11(ABCB11)和牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)的定量RT-PCR。将相对表达值与未分化的iPS细胞(ABCB11)或第11天的类器官(NTCP)进行比较。条形代表平均值±SD，n＝3。D.第27天类器官内的总胆汁酸分泌水平。条形代表平均值±SEM，n＝4。E.在荧光胆汁酸(CGamF)存在下培养30分钟之后，通过类器官摄取胆汁酸。F.衍生自4个iPSC系的类器官上的CLF转运活性。T、W、1和F表示iPS细胞系的克隆名称。绿色：CLF。
图3.波生坦诱导的胆汁淤积特异于CYP2C9*2iPSC-肝类器官。A.在UGT1A1*6中的CYP2C9*2和rs4148323中的rs1799853的代表性等位基因图像分别示出波生坦和伊立替康的DILI风险SNP。表表明在每个iPS细胞系中具有风险等位基因。B.波生坦CLF转运活性和抑制的图像。C.衍生自不同4种iPS细胞系的各个类器官中的CLF强度水平。*：p<0.01，**：p<1E-4，****：p<1E-8，Wilcoxon-Mann-Whitney测试。NS：不重要。在框图中，框的顶部和底部代表第75和第25百分位数，中心线代表中位数。点表示来自每个类器官的数据。
图4.使用类器官的高保真药物诱发的胆汁淤积模型。A.从类器官的外部到内部外排二乙酸荧光素的连续图像。B.二乙酸荧光素外排转运的比较。C.二乙酸荧光素外排转运到类器官的定量。实例左图是定量的类器官内部与外部之间的荧光强度的比率。右图表示使用对照(DMSO)、环孢菌素A(CSA)和链霉素(STP)作为阴性对照的验证研究的结果。条形代表平均值±SD，**：p<0.01,n＝4。D.处理9种训练化合物24小时之后二乙酸荧光素转运抑制的图像。E.训练化合物处理之后的转运抑制的定量，条形代表平均值±SD，*：p<0.05，**：P<0.01，n＝4到6。训练化合物处理之后的MMP变化的定量，条形代表平均值±SD，*：p<0.05，**：P<0.01，n＝4到5。CON：对照样品，STP：链霉素，TOL：托卡朋，DICLO：双氯芬酸，BOS：波生坦，CSA：环孢菌素A。
图5.高保真药物使用类器官诱导线粒体毒性筛选。A.处理9种训练化合物之后TMRM上线粒体膜电位(MMP)的图像。较低：训练化合物处理之后的转运抑制的定量，条形代表平均值±SD，*：p<0.05，**：P<0.01，n＝4到6。C.训练化合物处理之后的MMP变化的定量，条形代表平均值±SD，*：p<0.05，**：P<0.01，n＝4到5。CON：对照样品，STP：链霉素，TOL：托卡朋，DICLO：双氯芬酸，BOS：波生坦，CSA：环孢菌素A，TRO：曲格列酮，NEFA：奈法唑酮，ENTA：恩他卡朋，PIO：吡格列酮。B.一套9种训练化合物(TC)的分类，参见Oorts.等人，2016(Oorts等人，2016)。A类代表具有已知体内DILI的报道的TC，而B类中的那些是具有体内药物诱发的胆汁淤积的报告的TC。还提供了基于文献数据的毒性机制。对于DILI，C类化合物通常被认为是安全的。C.药物治疗之后72小时的活力与双重风险参数、药物诱发的胆汁淤积潜能和线粒体毒性潜力之间的分析。胆汁淤积和线粒体毒性(Mito-tox)指数衍生自图3中的数据。圆圈的大小表明活力的大小降低。
图6.在NAC暴露拯救的脆弱条件下模拟药物诱发的肝损伤。A.评估易受影响的类器官模型上药物诱发的细胞毒性的概述。B.对脂质积累的脆弱模型的分析(蓝色：细胞核，绿色：脂质，红色：F-肌动蛋白)。C ROS产生(蓝色：细胞核，绿色：ROS)和D.线粒体健康(蓝色：细胞核，红色：线粒体)。E.药物治疗之后24小时的类器官图像。F.脂质积累诱导的脆弱类器官模型的活力评估。条形代表平均值±SD，*：P<0.05，n＝5到6。CON：对照，STP：链霉素，TRO：曲格列酮，NAC：N-乙酰半胱氨酸。
图7.基于多重肝类器官的筛选预测毒性
图8.视黄酸治疗方案的优化A.视黄酸治疗的时间和持续时间的方案。RA：视黄酸，HCM：肝细胞培养基。B.在RA治疗的不同持续时间中第25天的类器官中的白蛋白分泌水平。
图9.第20天类器官的形态、第20天类器官的总数量为305。带腔的类器官：216，无腔的类器官：89。
图10.转换公式以确定类器官中的细胞数量A.单个类器官的相差图像。B.每个单一类器官的直径和细胞数量。C.单个类器官中直径与细胞数量的相关性。
图11-补充图4从多个PSC系生成类器官。不同iPS细胞系(317D6和1383D6)衍生的类器官的相差图像和白蛋白分泌水平。
图12.处理10种化合物之后24小时的细胞活力。脂质积累诱导的脆弱类器官模型的活力评估。CON：对照样品，STP：链霉素，TOL：托卡朋，DICLO：双氯芬酸，AMIO：胺碘酮，BOS：波生坦，CSA：环孢菌素A，TRO：曲格列酮，NEFA：奈法唑酮，ENTA：恩他卡朋，PIO：吡格列酮。条形代表平均值±SD，n＝4到6。
图13.脂毒性肝类器官中ROS的产生和线粒体的形态变化。A.通过800μM油酸(OA)处理，在脂质积累诱导的脆弱类器官模型上，总细胞中产生ROS的细胞数量的比率。B.脆弱类器官模型上类器官中的线粒体的图像。红色：线粒体，紫色：F-肌动蛋白，蓝色：核。C.脆弱类器官模型上线粒体的数量和大小。条形代表平均值±SD，*：P<0.05，n＝5到6。
图14.无细胞基质胶方法的示意图。所示为肝类器官生成方法的示意图，其不使用基质胶生成类器官。
具体实施方式
除非另有说明，否则术语应根据相关领域中普通技术人员的常规用法来理解。
术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定值，例如，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1或大于1的标准偏差内。替代性地，“约”可以表示给定值的多达20％，或多达10％，或多达5％，或多达1％的范围。替代性地，特别是对于生物系统或过程，术语可以表示处于一个数量级内，优选地在值的5倍内，并且更优选地在2倍内。在申请和权利要求中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指处于特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，术语“全能干细胞”(也称为全能干细胞)是可以分化成胚胎和胚胎外细胞类型的干细胞。这种细胞可以构建完整的、有活力的生物体。这些细胞是由卵子和精子细胞融合而成。由受精卵的前几个分裂产生的细胞也是全能的。
如本文所用，术语“多能干细胞(PSC)”涵盖可以分化成身体的几乎所有细胞类型的任何细胞，即衍生自三个胚层(生发上皮)中的任何一个的细胞，包含内胚层(内部胃壁、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)和外胚层(表皮组织和神经系统)。PSC可以是植入前胚泡的内细胞团细胞的后代，或者通过强迫某些基因的表达诱导非多能细胞，如成体体细胞而获得。多能干细胞可以衍生自任何合适的来源。多能干细胞来源的实例包含哺乳动物来源，包含人、啮齿动物、猪和牛。
如本文所用，术语“诱导的多能干细胞(iPSC)”，也通常缩写为iPS细胞，是指通过诱导某些基因的“强制”表达，人工衍生自非正多能细胞，如成体体细胞的一类多能干细胞。hiPSC是指人iPSC。
如本文所用，术语“胚胎干细胞(ESC)”，也通常缩写为ES细胞，是指多能的细胞并且衍生自胚泡的内细胞团，即早期胚胎。出于本发明的目的，术语“ESC”有时也广泛用于涵盖胚胎生殖细胞。
如本文所用，术语“前体细胞”涵盖可以用于本文所述方法中的任何细胞，通过所述细胞，一种或多种前体细胞获得自我更新或分化成一种或多种特化细胞类型的能力。在一些实施例中，前体细胞是多能的或具有变成多能的能力。在一些实施例中，对前体细胞进行外部因子(例如生长因子)的处理以获得多能性。在一些实施例中，前体细胞可以是全能(或全能)干细胞；多能干细胞(诱导或非诱导)；多能干细胞；寡能干细胞和单能干细胞。在一些实施例中，前体细胞可以来自胚胎、婴儿、儿童或成人。在一些实施例中，前体细胞可以是经受处理的体细胞，使得通过遗传操作或蛋白质/肽处理赋予多能性。
在发育生物学中，细胞分化是较不特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。如本文所用，术语“定向分化”描述了一种过程，通过所述过程，较不特化的细胞变成特定的特化靶细胞类型。特化靶细胞类型的特殊性可以通过可以用于定义或改变初始细胞命运的任何适用方法来确定。示例性方法包含但不限于遗传操作、化学处理、蛋白质处理和核酸处理。
衍生自胚胎细胞的多能干细胞
在一些实施例中，一个步骤是获得多能干细胞或可以诱导成为多能干细胞。在一些实施例中，多能干细胞衍生自胚胎干细胞，所述胚胎干细胞又衍生自早期哺乳动物胚胎的全能细胞，并且能够在体外无限制的未分化增殖。胚胎干细胞是衍生自早期胚胎的胚泡内细胞团的多能干细胞。从胚细胞衍生胚胎干细胞的方法是本领域熟知的。人胚胎干细胞H9(H9-hESC)用于本申请中描述的示例性实施例中，但是本领域技术人员将理解，本文描述的方法和系统适用于任何干细胞。
可以用于根据本发明的实施例中的额外的干细胞包含但不限于由旧金山加利福尼亚大学(UCSF)的人类胚胎干细胞研究中心的国立干细胞库(NSCB)主办的数据库；Wi细胞研究所的WISC细胞库；威斯康星大学干细胞与再生医学中心(UW-SCRMC)；Novocell公司(加利福尼亚州圣地亚哥)；Cellartis AB(瑞典哥德堡)；胚胎干细胞国际公司(新加坡)；以色列理工学院以色列理工学院(以色列海法)；以及由普林斯顿大学和宾夕法尼亚大学主办的干细胞数据库提供或描述的那些干细胞。可以用于根据本发明的实施例中的示例性胚胎干细胞包含但不限于SA01(SA001)；SA02(SA002)；ES01(HES-1)；ES02(HES-2)；ES03(HES-3)；ES04(HES-4)；ES05(HES-5)；ES06(HES-6)；BG01(BGN-01)；BG02(BGN-02)；BG03(BGN-03)；TE03(13)；TE04(14)；TE06(16)；UC01(HSF1)；UC06(HSF6)；WA01(H1)；WA07(H7)；WA09(H9)；WA13(H13)；WA14(H14)。
关于胚胎干细胞的更多细节可以在例如Thomson等人，1998，“衍生自人类胚泡的胚胎干细胞系(Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts)，”《科学(Science)》282(5391):1145-1147；Andrews等人，2005，“胚胎干(ES)细胞和胚胎癌(EC)细胞：同一枚硬币的两侧(Embryonic stem(ES)cells and embryonal carcinoma(EC)cells:opposite sides of the same coin)，”《生化学会会刊(Biochem Soc Trans)》33:1526-1530；Martin 1980，“畸胎癌和哺乳动物胚胎发生(Teratocarcinomas and mammalianembryogenesis)”，《科学(Science)》209(4458):768-776；Evans和Kaufman，1981，“小鼠胚胎多能细胞培养的建立(Establishment in culture of pluripotent cells from mouseembryos)”，《自然(Nature)》292(5819):154-156；Klimanskaya等人，2005，“衍生自非饲养细胞的人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells derived without feeder cells)”，《柳叶刀(Lancet)》365(9471):1636-1641中找到；所述参考中的每一个在此以其整体并入本文。
诱导多能干细胞(iPSC)
在一些实施例中，通过将某些干细胞相关联基因转染到非多能细胞，如成体成纤维细胞中衍生iPSC。通常通过病毒载体，如逆转录病毒实现转染。转染的基因包含主转录调节因子Oct-3/4(Pouf51)和Sox2，尽管建议其它基因提高诱导效率。3周到4周之后，少量转染细胞开始在形态学和生物化学上类似于多能干细胞，并且通常通过形态学选择、倍增时间或通过报告基因和抗生素选择分离。如本文所用，iPSC包含但不限于小鼠中的第一代iPSC、第二代iPSC和人诱导的多能干细胞。在一些实施例中，使用四种关键基因：Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，逆转录病毒系统用于将人类成纤维细胞转化成多能干细胞。在替代性实施例中，慢病毒系统用于用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28转化体细胞。表达在iPSC中诱导的基因包含但不限于Oct-3/4(例如，Pou5fl)；Sox基因家族的某些成员(例如，Sox1、Sox2、Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成员(例如，Klf1、Klf2、Klf4和Klf5)，Myc家族的某些成员(例如，C-myc、L-myc和N-myc)，Nanog和LIN28。
在一些实施例中，使用基于非病毒的技术生成iPSC。在一些实施例中，腺病毒可以用于将必需的四种基因转运到小鼠的皮肤和肝细胞的DNA中，产生与胚胎干细胞相同的细胞。由于腺病毒不将其任何自身基因与靶向宿主组合，因此消除了产生肿瘤的危险。在一些实施例中，重编程可以通过质粒完成，而根本没有任何病毒转染系统，尽管效率非常低。在其它实施例中，蛋白质的直接递送用于生成iPSC，因此消除了对病毒或遗传修饰的需要。在一些实施例中，使用类似的方法可以生成小鼠iPSC：用通过聚精氨酸锚定引入细胞中的某些蛋白质重复处理细胞足以诱导多能性。在一些实施例中，还可以通过在低氧条件下用FGF2处理体细胞来增加多能性诱导基因的表达。
关于胚胎干细胞的更多细节可以在例如Kaji等人，2009，“病毒自由诱导多能性和随后切除重编程因子(Virus free induction of pluripotency and subsequentexcision of reprogramming factors)”，《自然(Nature)》458:771-775；Woltjen等人，2009，“piggyBac转座将成纤维细胞重编程为诱导的多能干细胞(piggyBac transpositionreprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells)，”《自然(Nature)》458:766-770；Okita等人，2008，“没有病毒载体的小鼠诱导的多能干细胞的生成(Generationof Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors)”，《科学(Science)》322(5903):949-953；Stadtfeld等人，2008，“无病毒整合生成的诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells Generated without Viral Integration)，”《科学(Science)》322(5903):945-949；和Zhou等人，2009，“使用重组蛋白生成诱导的多能干细胞(Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins)”，《细胞干细胞(Cell Stem Cell)4(5):381-384中找到；所述参考中的每一个在此以其整体并入本文。
在一些实施例中，示例性iPS细胞系包含但不限于iPS-DF19-9；iPS-DF19-9；iPS-DF4-3；iPS-DF6-9；iPS(包皮)；iPS(IMR90)；和iPS(IMR90)。
关于与DE发育相关的信号传导途径的功能的更多细节可以在例如Zorn和Wells，2009，“脊椎动物内胚层发育和器官形成(Vertebrate endoderm development and organformation)，”《细胞和发育生物学的年度评论(Annu Rev Cell Dev Biol)》25:221-251；Dessimoz等人，2006，“FGF信号传导对于在体内沿前后轴建立肠管区域是必要的(FGFsignaling is necessary for establishing gut tube domains along the anterior-posterior axis in vivo)”，《老化和发育机制(Mech Dev)》123:42-55；McLin等人，2007，“在前内胚层中抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导对肝和胰腺发育至关重要(Repression ofWnt/β-catenin signaling in the anterior endoderm is essential for liver andpancreas development)，《发育(Development)》，”134:2207-2217；Wells和Melton，2000，《发育(Development)》127:1563-1572；de Santa Barbara等人，2003，“肠上皮的发育和分化(Development and differentiation of the intestinal epithelium)”，《细胞与分子生命科学(Cell Mol Life Sci)》60(7):1322-1332中找到；所述参考中的每一个在此以其整体并入本文。
从多能细胞(例如，iPSC或ESC)产生定形内胚层的任何方法都适用于本文所述的方法。从多能细胞(例如，iPSC或ESC)产生定形内胚层的任何方法都适用于本文所述的方法。示例性方法公开在例如Wells等人US9719068B2的“通过定向分化将前体细胞转化为肠组织的方法和系统(Methods and systems for converting precursor cells intointestinal tissues through directed differentiation)”和Wells等人US20170240866A1的“通过定向分化将前体细胞转化为胃组织的方法和系统(Methods andsystems for converting precursor cells into gastric tissues through directeddifferentiation)”中。在一些实施例中，多能细胞衍生自桑椹胚。在一些实施例中，多能干细胞是干细胞。在这些方法中使用的干细胞可以包含但不限于胚胎干细胞。胚胎干细胞可以衍生自胚胎内细胞团或衍生自胚胎性腺脊。胚胎干细胞或生殖细胞可以源自多种动物物种，包含但不限于包含人的各种哺乳动物物种。在一些实施例中，人胚胎干细胞用于产生定形内胚层。在一些实施例中，人胚胎生殖细胞用于产生定形内胚层。在一些实施例中，iPSC用于产生定形内胚层。用于获得或产生可以用于本发明中的DE细胞的额外方法包含但不限于D'Amour等人的美国专利号7,510,876；Fisk等人的美国专利号7,326,572；Kubo1等人，2004，“从培养的胚胎干细胞发育定形内胚层(Development of definitive endodermfrom embryonic stem cells in culture)”，《发育(Development)》131:1651-1662；D'Amour等人，2005，“人胚胎干细胞对定形内胚层的有效分化(Efficient differentiationof human embryonic stem cells to definitive endoderm)”，《自然生物工艺学(NatureBiotechnology)》23:1534-1541；和Ang等人，1993，“小鼠中定形内胚层谱系的形成和维持：HNF3/叉头蛋白的参与(The formation and maintenance of the definitive endodermlineage in the mouse:involvement of HNF3/forkhead proteins)”，《发育(Development)》119:1301-1315中描述的那些。
申请人已经发现使用人iPSC产生3D肝结构的方法。结构包括微肝结构，所述微肝结构包含极化肝上皮、星状细胞和小管结构。与现有模型相比，所公开的组合物显示出肝功能、胆汁转运活性和耐久性的改善。3D结构模型可以用作药物筛选测试和/或药物毒性筛选、移植、血清蛋白产品的生产和个性化疗法的开发的新的和稳健的模型。在一个特定的应用中，组合物和方法可以用于筛选药物化合物的肝毒性。
虽然已经报道了3D聚集的肝细胞，但是所公开的组合物具有非常高的功能活性，如白蛋白产生(与使用iPSC衍生的肝细胞的常规最高标准模型相比增加高达10倍)，并且由于内部管腔结构，允许改善氧和/或营养供应，这允许更长的培养(至少超过60天)和用于药物测试的长期测试平台。所公开的组合物还可以用于生产血浆产品如白蛋白，用于治疗低蛋白血症的凝血因子产品以及用于治疗性移植，其中可以移植人iPSC衍生的微型肝以治疗体内病症。最后，所公开的组合物可以用于个性化医疗(治疗个性化)。
在一个方面，公开了诱导从iPSC细胞形成肝类器官的方法。方法可以包括以下步骤
a)使衍生自iPSC细胞的定形内胚层(DE)与FGF途径激活剂和GSK3抑制剂接触足以形成后前肠球状体的时间段，优选地约1天到约3天的时间段，以及b)在视黄酸(RA)存在下培育步骤a的所得后前肠球状体足以形成肝类器官的时间段，优选地约1天到约5天的时间段，优选地约4天的时间段。
成纤维细胞生长因子(FGF)是参与血管生成、伤口愈合和胚胎发育的生长因子家族。FGF是肝素结合蛋白，并且已经示出与细胞表面相关联的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的相互作用对于FGF信号转导是必需的。本领域普通技术人员将容易理解合适的FGF途径激活剂。示例性FGF途径激活剂包含但不限于：选自由以下组成的组的一种或多种分子：FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22和FGF23。在一些实施例中，靶向与FGF信号传导途径相关联的细胞成分的siRNA和/或shRNA可以用于激活这些途径。
在一些实施例中，用本文所述的FGF信号传导途径中的所述一种或多种分子以10ng/ml或更高；20ng/ml或更高；50ng/ml或更高；75ng/ml或更高；100ng/ml或更高；120ng/ml或更高；150ng/ml或更高；200ng/ml或更高；500ng/ml或更高；1,000ng/ml或更高；1,200ng/ml或更高；1,500ng/ml或更高；2,000ng/ml或更高；5,000ng/ml或更高；7,000ng/ml或更高；10,000ng/ml或更高；或15,000ng/ml或更高的浓度处理DE培养物；在一些实施例中，信号分子的浓度在整个治疗期间保持恒定。在其它实施例中，信号传导途径的分子浓度在治疗过程期间变化。在一些实施例中，将根据本发明的信号传导分子悬浮在包括DMEM和胎牛血清丝氨酸(FBS)的培养基中。FBS浓度可以是2％及以上；5％及以上；10％或以上；15％或以上；20％或以上；30％或以上；或50％或以上。本领域技术人员将理解，本文描述的方案适用于本文所述的任何已知的单独或组合的信号传导途径分子，包含但不限于FGF信号传导途径中的任何分子。
本领域普通技术人员将容易理解合适的GSK3抑制剂。示例性GSK3抑制剂包含但不限于：例如Chiron/CHIR99021，其抑制GSK3β。本领域普通技术人员将认识到适合于进行所公开方法的GSK3抑制剂。GSK3抑制剂可以以约1μM到约100μM，或约2μM到约50μM，或约3μM到约25μM的量施用。本领域普通技术人员将容易理解适当的量和持续时间。
在一个方面，干细胞可以是哺乳动物或人iPSC。
在一个方面，前肠球状体可以嵌入基底膜基质中，如例如以商品名称Matrigel销售的市售基底膜基质。
在一个方面，肝类器官的特征可以在于肝类器官可以表达甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、视黄醇结合蛋白(RBP4)、细胞角蛋白19(CK19)、肝细胞核因子6(HNF6)和细胞色素P450 3A4(CYP3A4)、HNF4a、E-钙粘蛋白、DAPI和Epcam。这种表达可以例如在第40天到第50天发生。表达水平可以类似于在人肝细胞中观察到的表达水平，例如，成人肝细胞的表达水平。
在一个方面，肝类器官的特征可以在于肝类器官具有胆汁转运活性。
在一个方面，肝类器官可以衍生自干细胞，并且可以包括管腔结构，其进一步包含内化微绒毛和间充质细胞。管腔结构可以被极化的肝细胞和基底膜包围。肝类器官可以包括功能性星状细胞和功能性库普弗细胞。
在某些方面，肝类器官的特征可以在于，其具有以下中的一种或多种：胆汁产生能力、胆汁转运活性、至少50ng/mL/1xe6个细胞/24小时的补体因子H表达、至少40ng/mL/1xe6个细胞/24小时的补体因子B、至少1000ng/mL/1xe6个细胞/24小时的C3表达；至少1000ng/mL/1xe6个细胞/24小时的C4表达、至少1,000ng/mL/1xe6个细胞/24小时的纤维蛋白原产量以及至少1,000ng/mL/1xe6个细胞/24小时的白蛋白产量。在一个方面，肝类器官的特征可以在于，其具有至少10,000ng/mL 1xe6个细胞/24小时的总肝蛋白表达。肝类器官的特征可以在于它可以表达选自以下的一种或多种基因：PROX1、RBP4、CYP2C9、CYP3A4、ABCC11、CFH、C3、C5、ALB、FBG、MRP2、ALCAM、CD68、CD34、CD31。在一个方面，肝类器官可以包括包括药物代谢细胞色素变体的细胞，如例如CY2C9*2变体。肝类器官可以包括脉管系统，如US20160177270中描述的脉管系统。
在一个方面，肝类器官的特征可以在于肝类器官不包括炎性细胞，例如T细胞或其它炎性分泌蛋白质。
在一个方面，公开了用于筛选严重不良事件(SAE)的方法。SAE可以是肝衰竭和/或药物诱发的肝损伤(DILI)。方法可以包含使感兴趣毒性的感兴趣药物与如本文所述的肝类器官接触的步骤。在一个方面，所述方法可以包括测量二乙酸荧光素(FD)的摄入和/或外排的步骤，其中受损的外排表明所述药物可能诱发严重不良事件。所述感兴趣药物的毒性可以通过测量选自以下的参数来确定：线粒体膜电位、ROS测量、肝线粒体肿胀和其组合，其中对所述线粒体的损伤表明所述药物可能诱发严重不良事件。在一个方面，所述方法包括测定类器官活力的步骤，其中受损或降低的类器官活力表明所述感兴趣药物可能诱发严重不良事件。
在一个方面，公开了治疗患有肝损害的个体的方法，其中所述方法可以包括将如本文所述的肝类器官植入有需要的个体中的步骤。肝损害可以包含例如代谢性肝病、终末期肝病或其组合。
在一个方面，公开了用于识别个体的优选治疗剂的方法。在这方面，方法可以包含使衍生自所关注iPSC的肝类器官与候选化合物接触的步骤，如其中所关注iPSC包括在所述个体中发现的一个或多个突变，或者如其中所述所关注iPSC衍生自所述个体的相同伦理背景，或者进一步，其中所述所关注iPSC衍生自所述个体。
实例
在本研究中，申请人使用二乙酸荧光素测试胆汁转运活性，其通过MRP2跨小管膜排泄到胆小管网络中(Tian等人，2004)。先前已经报道曲格列酮和环孢菌素抑制MRP2(Chang等人，2013；Lechner等人，2010)。此外，外排转运蛋白MRP2介导波生坦的输出(Fahrmayr等人，2013)。虽然没有报道奈法唑酮对MRP2的抑制作用，但奈法唑酮的线粒体应激可能与胆汁转运活性的降低有关，二乙酸荧光素的外排也是如此，因为MRP2是一种ATP依赖性胆汁盐转运蛋白，用于肝细胞中胆汁酸的小管排泄。
用于药物诱发的肝损伤(DILI)的风险化合物的临床前检测仍然是药物开发中的重大挑战，突出了对预测性人体系统的需求。在这里，申请人开发了一种人肝类器官(HLO)模型，用于分析类器官分辨率下的临床DILI病理。来自人iPSC的分化的HLO含有极化的肝细胞，其具有由胆小管样结构排列的内腔，建立单向胆汁酸转运途径。申请人已经通过使用活的类器官成像，称为LoT(基于肝类器官的毒性筛选)对DILI进行建模以利用类器官的结构特征。基于胆汁淤积和/或线粒体毒性，在功能上用10种市售药物和5种不同供体对LoT进行验证。波生坦诱导的胆汁淤积特异于CYP2C9差代谢者供体衍生的HLO。有趣的是，如临床所示，脂肪性类器官易受罗格列酮毒性的影响，随后是大规模类器官死亡的化学拯救。因此，LoT是一种高保真的类器官模型，可以用于分析药物安全性，并且进一步是一个经济有效的平台，促进化合物优化，提供机械研究，并生产个性化医疗以及抗DILI治疗筛查应用。
由于初始筛选中识别的候选药物失败，每年因制药行业的药物开发而损失数十亿美元，并且几乎(三分之一或三分之一)的药物从市场撤回(Takebe和Taniguchi，2014)。尽管疗效很有希望，但候选药物的失败导致患者治疗机会的巨大损失。临床前研究通常包括体外评估作为识别“命中”化合物的主要功效筛选，然后在体外和体内进行安全性研究以评估代谢和毒理学的机制。这种低效率可以解释为在评估人类药物诱发的肝损伤(DILI)方面大量缺乏生理学相关的临床前模型，并且因此迫切需要开发用于评估大量的不断增长的化合物库的体外人工筛选模型。
原代肝细胞是高度极化的代谢细胞类型，并形成具有微绒毛衬里通道的胆小管结构，将外周循环与胆汁酸分泌途径分开。DILI的最上游方面包含药物(或其活性代谢物)通过肝细胞解毒和通过转运蛋白如多药耐药相关蛋白(MRP)转运蛋白排泄到胆小管中。这表明需要重建这些独特组织的结构，作为体内肝细胞的关键特性，用于预测DILI病理学。然而，目前的简化培养模型与使用分离的原代人肝细胞或肝细胞系和体内生理学之间的药物毒性特征存在相当大的差异，导致药物翻译失败或停药，如曲格列酮、奈法唑酮和托卡朋的情况(https://livertox.nlm.nih.gov/index.html)。因此，毒理学特性的确定主要依赖于动物作为药物开发的必要步骤，然而，由于人类与动物之间生理学上的显著差异，人类结果显著缺乏忠诚度(Leslie等人，2007；Yang等人，2014)。此外，非常罕见但仍然导致美国约10％到15％的急性肝衰竭(Reuben等人，2010)的特异性DILI(IDILI)的发病几乎无法预测(Kullak-Ublick等人，2017)。总体而言，热切期望有效的人类细胞模型以筛选用于测试所提出的药物的解毒和排泄的化合物。
尽管人类肝细胞分化方法从多能干细胞(PSC)逐步推进，但使用人类干细胞的培养皿中的临床试验仍然是“炒作”。在某种程度上，这可以通过先前基于细胞的方法中的挑战来解释，包含：(1)克服批次差异，(2)实验批次差异的最小化，(3)测定通量的增加和(4)改善与临床试验数据的相关性。申请人通过使用稳定可扩增的人类干细胞即iPSC开发相对简单且稳健的基于类器官的测试平台来解决这些问题。申请人首先将人PSC导入后肠前体类器官中，然后通过具有限定因子和基质的极化培养进行进行性肝细胞分化。生成的人肝类器官具有由极化的肝细胞包围的腔内结构，并且已经示出能够执行关键的人肝细胞功能，包含蛋白质和胆汁酸的产生以及转运功能。有趣的是，申请人发现基于实时图像的二乙酸荧光素摄取和排泄的动态检测精确地模拟由DILI药物阵列诱导的胆汁淤积，其特征在于具有高水平再现性的胆汁排泄抑制剂。另外，线粒体膜电位评估能够对每种化合物进行独立的风险评估，反映了由临床试验建立的DILI药物的常规分类。更进一步，申请人将方法扩展到由脂毒性应激诱导的模型条件，并通过活性氧(ROS)产生证实了增强的DILI潜力。基于类器官的活力评估证实了N-乙酰半胱氨酸逆转DILI，突出了我们用于抗DILI药物筛选的方法的潜力。总之，这种名为基于肝类器官的毒性筛选(LoT)的稳健测定被认为是人类肝类器官中首次发现的功能性读数，并将有助于诊断、功能研究、药物开发和个性化医疗。
结果
从多种人iPSC生成并表征极化肝类器官
申请人首先通过使用人iPSC衍生的前肠球状体建立了新的肝类器官分化方法(Spence等人，2011)(图1A)。作为第一个步骤，申请人使用BMP和激活素A促进分化为定形内胚层，如前所述(D'Amour等人，2005)。此外，FGF4和GSK3抑制剂(CHIR99021)用于诱导前肠球状体，并观察到芽生的球状体。在通过轻轻吹打将间充质细胞铺在培养皿上分层之后，将类器官包埋在基质胶中。已经报道，视黄酸(RA)增强细胞极性，如胆小管和鞘周鞘的尺寸和复杂性增加所示(Falasca等人，1998)。为了生成适于胆汁运输建模的极化类器官，用RA处理类器官。为了优化类器官生成方法，申请人首先改变RA治疗的持续时间。在D25，RA治疗的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，类器官的白蛋白分泌水平分别是1160ng/mL、1054ng/mL、3092ng/mL、4709ng/mL和3865ng/mL，并且4天-RA治疗方案趋于达到最高水平(图8)。因此，基于白蛋白分泌的水平，将RA的持续时间设置为4天。形态学上，在RA治疗之后约10天，成功地生成了覆盖有上皮细胞的300多个类器官，并且具有管腔结构的类器官的比例为71％(216/305)(图1，板B和图9)。免疫组织化学分析显示白蛋白在类器官上皮细胞中呈阳性，并且有趣的是，IV型胶原蛋白定位于外表面，并且ZO-1(闭锁小带)将管腔内衬染色，表明这些类器官具有极化特性(图1，板C)。
定量聚合酶链反应(qPCR)分析显示，类器官中的细胞显著增加肝标记物基因的表达，如甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、视黄醇结合蛋白4(RBP4)、细胞角蛋白19(CK19)、控制胆管细胞分化的肝细胞核因子6(HNF6)以及分化期间的细胞色素P450 3A4(CYP3A4)(图1，板D)。然而，从大量类器官衍生的RNA提取的大多数肝基因的表达水平在类器官中比在原代肝细胞中低。不旨在受理论的限制，据信这些不同的mRNA谱是部分由于基质谱系的存在，因为大约30％的细胞是通过基质细胞标记物识别的非实质细胞(未公开的观察结果)，使得类器官与原代肝细胞相比更类似于体内肝组织。申请人通过使用RNA序列(RNA-seq)的综合基因表达分析进一步分析了类器官。主成分分析表明，类器官中的基因表达与iPSC衍生的胆管细胞和正常人胆管细胞不类似(图1，板E)。另外，通过ELISA在培养上清液中确认肝细胞特异性蛋白质，如ALB、纤维蛋白原(Fbg)和补体因子(图1，板F到G)。为了定量类器官的肝功能，申请人研究了由细胞数标准化的白蛋白分泌水平(图10)。相对于公开的iPSC-衍生的肝细胞，白蛋白分泌水平是2133ng/天/106个细胞(图1，板F)，并且高于hPSC到HLC(150ng/天/106个细胞到1000ng/天/106个细胞)的2D和3D分化中的其它实验(Miki等人，2011；Song等人，2015；Song等人，2009；Vosough等人，2013)，而原代肝细胞在3D支架中产生30μg/天/106到40μg/天/106个细胞(Davidson等人，2016；Dvir-Ginzberg等人，2003)。这些结果表明，与公开文献中的干细胞衍生的肝细胞相比，肝类器官含有具有合理白蛋白分泌活性的肝细胞。重要的是，这种类器官生成方法是可重复的，并且因此适用于其它PSC系，因为具有白蛋白分泌能力的317D6和1383D6iPS细胞系两者都生成了腔内类器官(图11)。总之，申请人建立了用于生成大量具有肝细胞特性的极化肝类器官的方案。
产生胆汁酸的人iPSC-肝类器官的微观解剖学表征
接下来，为了测试肝类器官是否具有胆汁转运活性，申请人首先通过将参与胆汁合成和排泄功能的关键蛋白质染色来表征类器官。BSEP和MRP2的免疫荧光染色表明这些蛋白质优先定位于腔内区域中(图2，板A)。胆小管是最小的肝内分泌通道，并且小管腔由由连续肝细胞的相对质膜的修饰的顶端区域形成的空间组成(Cutrin等人，1996；Tsukada等人，1995)。此外，它由紧密连接复合物界定，并且微绒毛定位在小管腔内侧上(Tsukada等人，1995)。已知ZO-1染色染色肝中的小管区域，并且图1，板C表明紧密连接物定位在我们的肝类器官内部。透射电子显微镜显示含有指向内腔的微绒毛的类器官(图2，板B)。与这些解剖学特征一致，qRT-PCR分析显示，类器官具有ABCB11和Na+-牛磺酸盐共转运多肽(NTCP)的基因表达，但是类器官中的水平低于原代肝细胞(图2，板C)。因此，类器官包含通过紧密连接物从内腔分离的极化人肝细胞，其反映了类似于体内肝小管的独特微解剖结构。
接下来，为了确定胆汁酸(BA)的生产能力，申请人对从类器官培养物收集的腔内流体进行了ELISA。腔内流体的总BA量的水平是26.7μg/天/106个细胞(直径是200μm的类器官中大约125μmol/L)(图2，板D)，并且令人惊讶的是，BA浓度与先前报道中衍生自夹心培养物的原代肝细胞的浓度相当(大约40μg/天/106个细胞，培养上清液中10μmol/L)(Ni等人，2016)。因此，类器官不仅具有小管样形态，而且具有胆汁酸产生和分泌活性，这表明胆汁酸转运途径是正确构建的。
人肝类器官中胆汁酸摄入和排泄的动态可视化
胆汁酸排泄是胆汁流动的主要决定因素，因此，此系统中的缺陷可能导致与各种肝病病理相关联的胆汁分泌受损(胆汁淤积)(Nishida等人，1991)。定位于肝细胞顶端(小管)膜中的外排转运蛋白在肝脏消除许多内源性和外源性化合物，包含药物和代谢物中起重要作用(Kock和Brouwer，2012)。BSEP和MRP2介导人体中的小管胆汁盐转运。在表明用于胆汁转运的关键蛋白质的阳性表达之后，申请人接下来想知道类器官是否可以主动将胆汁酸转运到其腔中。首先，为了检查胆汁酸进入类器官的情况，申请人用胆汁盐酰胺-荧光素(CGamF)，一种胆汁盐类似物攻击了类器官(Mork等人，2012)。在从外部处理了CGamF之后，成功确认了CGamF向类器官的内腔中的累积(图2，板E)。类似地，发现荧光胆汁酸胆碱-赖氨酰-荧光素(CLF)可再生地排泄并累积到来自多种人iPSC系的类器官中(图2，板F)。为了确定此测定的特异性，申请人使用基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法已经开发了携带BSEP去功能化等位基因的iPSC系。BSEP负责胆汁转运，并且与此一致，与亲本对照类器官相比，BSEP-KO iPSC-类器官未能累积荧光胆汁酸。总之，这些数据表明，类器官具有从外部摄取胆汁酸并将其排出到类器官内部的能力。
波生坦诱导特异于CYP2C9*2iPSC-肝类器官的胆汁淤积
为了测试基于类器官的胆汁淤积表型分析方法的临床相关性，申请人采用了药物基因组学对我们系统的见解以解决保真度问题。具体地说，已经收集多个iPSC系，其携带众所周知的易感基因变体(即用于波生坦的CYP2C9*2，描述于例如《临床药理学治疗法(ClinPharmacol Ther.)》2013Dec；94(6):678-86.doi:10.1038/clpt.2013.143.Epub 2013年7月17日CYP2C9*2与波生坦诱导的肝损伤的关联中。)(图3，板A)，并且在波生坦存在下比较它们的胆汁淤积潜力(图3，板B)。有趣的是，在CY2C9*2载体类器官中CLF排泄到类器官中严重受损，但在非载体类器官中没有。这与波生坦诱导的胆汁淤积的临床趋势相匹配，如图3，板C中所示，在不存在CYP2C9*2的三种不同的iPSC衍生的类器官中示出。相反，基于伊立替康的胆汁淤积并不特异于CYP2C9*2iPSC系。这些结果表明基于类器官的胆汁淤积测定预测了人类变异的某些方面。
类器官中高通量药物诱发的胆汁淤积评估
考虑到胆汁淤积在药物诱发的DILI中的重要作用，申请人接下来想知道这种类器官模型是否反映了在特定化合物存在下DILI的病理学。在测试多种化合物之前，申请人首先寻求开发基于高通量荧光的测定，因为CLF和CGamF两者由于以下几个问题而不适用于高速成像：1.背景强，需要手动洗涤过程；2.信号强度弱，需要仔细采集设置。替代性地，提出使用二乙酸荧光素(FD)，据报道它是肝细胞中外排转运的有用标记物(Barth和Schwarz，1982；Bravo等人，1998)。极性荧光代谢物荧光素被捕获在细胞中，直到它从细胞主动转运到小管空间中(Malinen等人，2014)。为了确定FD是否可以用于转运能力的实时评估而不更换培养基并调整暴露，通过延时成像进一步研究了按时间顺序排列的肝胆转运活性。将类器官与二乙酸荧光素一起培育45分钟，并在处理之后20分钟在类器官内部观察到腔内聚积(图4，板A、B)。通过将FD微注射到类器官中确定此转运流的相反方向性。在将二乙酸微注射到腔中之后，荧光素保留在内部，并且从未在类器官外部观察到(图4，板C)。总之，这种基于FD的评估模型具有高通量潜力，通过简单的荧光实时成像分析评估肝类器官中的单向外排胆汁转运。
接下来，申请人通过评估10种FDA批准的药物的可行剂量并通过细胞损伤测量任何二次干扰以验证基于FD的测定的保真度。申请人成功地发现了具有可接受活力的九种化合物的最佳剂量。相反，胺碘酮(AMIO)对测试范围内的类器官具有显著毒性，因此AMIO被排除在进一步潜在的DILI评估研究中(图12)。申请人使用FD和九种训练化合物(TC)研究了类器官中的胆汁淤积潜能，这些化合物被归类为基于DILI机制的三种类型之一；没有胆汁淤积的DILI化合物(A类)、具有胆汁淤积的DILI化合物(B类)和未报告为DILI化合物的化合物(C类)(图4，板D)(Oorts等人，2016)。为了量化FD排泄的抑制潜力，申请人通过图像J确定类器官外部与内部之间的荧光强度比，开发了一种简单但稳健的定量方法(图4，板B)。作为验证研究，申请人首先证实了使用环孢菌素A(CSA)评估抑制比率的能力。在FD处理之后5分钟，与对照(DMSO)相比，在用CSA处理24小时的组中观察到显著降低(与对照相比为0.4)(图4，板B)。然后，申请人筛选了多种浓度的9种TC，以评估此方法的保真度。有趣的是，在这个筛选系统中，在TC治疗之后24小时，B类化合物(波生坦、CSA、曲格列酮和奈法唑酮)中FD的外排显著降低(p<0.01或0.05)，与临床观察相似，而在A类和C类化合物中未观察到这种抑制结果(图4，板D，上图和图4，板E)。这些结果表明，肝类器官模型可以用于分类药物开发中候选化合物的胆汁转运抑制效力，与人类表型高度相关。
评估类器官中的线粒体过载
进一步，申请人研究了线粒体健康评估，因为线粒体毒性在与DILI发病相关联的多种机制中在DILI中起重要作用(Pessayre等人，2012)。在这项研究中，为了研究类器官中的线粒体健康，线粒体膜电位(MMP)指数用于监测完整细胞的MMP，作为线粒体健康的直接读数(Li等人，2014)。TC治疗24小时之后，用托卡朋(2倍到8倍变化，p<0.01)、双氯芬酸(7倍到13倍变化，p<0.05或0.01)、CSA(3倍到7倍变化，p<0.01)和奈法唑酮(4倍到42倍变化，p<0.01)治疗，观察到MMP的剂量依赖性增加(图5，板A，下图和表)。此外，曲格列酮还增加了类器官中的MMP(3倍到5倍变化，p<0.05)，尽管没有观察到剂量依赖性。另一方面，在波生坦、恩他卡朋和吡格列酮治疗之后，即使多剂量也未明显观察到MMP的增加。这些结果表明，这种称为基于肝类器官的毒性筛选(LoT)的基于活体图像的测定区分具有线粒体毒性与不具有线粒体毒性的化合物。
重新审视LoT系统对DILI化合物的机械分类
人类DILI的严重表现是多因素的，与特异性地与DILI的已知机制相关的药物效力的组合高度相关联，如线粒体和BSEP抑制(Aleo等人，2014)。然而，目前的体外功能模型难以评估这种多因素贡献。鉴于LoT系统中多重和实时功能读数的优势，申请人试图分析存活、胆汁淤积和线粒体应激之间的关系。值得注意的是，相对于TOL、DICLO和BOS，在24小时具有双重作用的药物(胆汁淤积和线粒体应激)如CSA、TRO和NEFA在72小时处显著降低细胞活力。这些数据与临床数据相当，后者示出双重毒性与DILI的严重程度高度相关联，与以前的报告一致(Aleo等人，2014)(图5，板B、C)。另外，申请人还注意到130μM的恩他卡朋治疗降低了类器官活力(从24小时的85％到72小时的64％)。恩他卡朋需要广泛结合血浆蛋白，主要是白蛋白，以诱导DILI(Fisher等人，2002)。然而，根据现有方法，恩他卡朋对肝有毒性仍然难以捉摸(Oorts等人，2016)。总之，LoT系统是DILI主要机械分类的有利人体模型系统，并且是进一步描述未知复杂机制的有用测试平台。
评估DILI在人类肝类器官中的脆弱性
已知DILI发病率经常被许多宿主因素所混淆。实际上，越来越多的证据表明，由于啮齿动物和人类(APAP)两者中的肥胖和NAFLD会使一些药物，如对乙酰氨基酚的肝毒性风险大大增加(Fromenty，2013；Michaut等人，2016)。因此，即使在亚临床阶段，重要的是预测患者在这种“脆弱”状态下的DILI潜力。在本研究中，申请人通过共同暴露于不饱和脂肪酸、油酸建立了脂毒性类器官模型(图6，板A)。在油酸治疗类器官之后3天，类器官中的脂质积累是强烈的(图6，板B)。脂肪酸的氧化是活性氧(ROS)的重要来源，其导致ATP和烟酰胺二核苷酸的消耗，并诱导脂肪肝中的DNA损伤(Browning和Horton，2004)。与此一致，在脂质治疗的类器官中观察到ROS产生(图6，板C和图13，板A)。另外，脂肪酸诱导肝线粒体的大量肿胀(图6，板D和图13，板B)，类似于公开的表型(Zborowski和Wojtczak，1963)。由于肝线粒体功能障碍在大鼠模型中发生NAFLD之前(Rector等人，2010)，这些结果表明脂毒性类器官在一定程度上模拟体内脂肪肝模型。
认识到这种脂毒性类器官模型是具有增强的ROS产生的脆弱状况，将曲格列酮(0μM到50μM)处理24小时并评估类器官中的细胞活力。通过单独以50μM处理曲格列酮，24小时时细胞活力为85％，而72小时时其降低到67％。然而，在脂毒性条件下治疗曲格列酮之后，由于类器官死亡，观察到类器官的大量碎裂。随后的细胞活力分析证实了此结果(与对照相比为-40％，p<0.05)(图6，板E和图6，板F)。
接下来，申请人研究了是否可以通过潜在的治疗化合物从类似DILI的病状回收类器官。申请人使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)以抑制ROS的产生，因为静脉注射NAC改善非乙酰氨基酚相关急性肝衰竭患者的生存率(Lee等人，2009)，并减少了曲格列酮诱导的细胞毒性(Rachek等人，2009)。如所预期的，NAC显著改善细胞活力，表明NAC甚至在脆弱条件下挽救了类器官中的细胞死亡(图6，板E和图6，板F)。在大多数DILI病例中，唯一的干预措施是在识别后去除致病药物(Polson和Lee，2005)(Bohan等人，2001；Navarro和Senior，2006)。此LoT系统可以是用于识别与多药方案相关的因果药物以及用于治疗DILI的药物发现的有用工具。
包含肝衰竭的严重不良事件(SAE)是临床开发或市售药物停药期间药物磨损的主要原因。特别地，DILI是药物开发中的关键挑战，其中由转运活性的抑制诱导的药物诱发的胆汁淤积是一个主要原因。使用人原代肝细胞的夹心培养物是目前药物中的最佳选择。尽管最近的报道示出了使用来自人成纤维细胞的转分化细胞的基于肝细胞的胆汁淤积模型的希望(Ni等人，2016)，但这些测定平台仍然具有重现性挑战以及通量问题，因为人肝细胞来源可变且有限，并且需要复杂的定量算法。此外，HepaRG细胞，一种人肝癌细胞系，也可以用于评估胆汁淤积特征，但它们的低BSEP(胆汁盐输出泵，或ABCB11，胆汁酸排泄的重要转运蛋白，以及胆汁淤积剂的主要目标)活性和耗时的分化程序限制其使用(Le Vee等人，2013)。更重要的是，缺乏必要的解剖结构限制了它们在制药工业中的实际应用。替代性地，所述方法允许简单、稳健和高通量的系统在测试化合物存在下通过活荧光成像测量胆汁转运活性。LoT测定的主要优点包含：1.成本效益(每50个类器官$12.35；每384个孔$94.85)，2.测定通量(单个类器官可测量)和3.用于分析其它因素之间相互作用的多重读数，如线粒体应激。特别是，如上所述，回顾性研究显示多细胞应激电位与DILI的发病率相关联(Aleo等人，2014)，并且LoT测定示出与此研究相当的结果，因为细胞活力随着双重读数而降低；线粒体和胆汁淤积应激。氧化应激在细胞死亡中起重要作用，并已经与胆汁淤积性肝损伤的发展有关(Serviddio等人，2004)。疏水性胆汁酸在胆汁淤积期间在细胞内积累并干扰正常线粒体电子转运，抑制呼吸复合物I和III的活性，并且从而减少三磷酸腺苷的合成(Krahenbuhl等人，1994)，导致线粒体功能障碍诱导的细胞凋亡(Bernardi，1996)。与这些发现一致，申请人对这些双重读数的相关性分析表明，与线粒体应激相比，胆汁淤积应激是肝损伤的更主要因素，如图5所示。因此，LoT系统可以用作研究DILI机制的模型系统。
此外，鉴于最近建立了iPSC小组的群体，对个体中不同易感性的潜在评估也很有希望(Inoue等人，2014)。在常规体外测定系统中预测SAE通常不关注个体差异，然而，SAE通常发生在SAE倾向小的患者亚组中(Stevens和Baker，2009)。将LoT系统应用于不同的人群iPSC小组将提供先前无法访问的对SAE的不同易感性。鉴于DILI的极为罕见的性质，使用具有特定基因组或种族因子的患者细胞将有助于阐明目前未知的DILI特异性机制。因此，通过提供最小化DILI潜力的基本见解，LoT可以作为制药行业改变游戏规则的策略(图7)。
此类器官模型中的一个限制是缺乏免疫反应。由过敏反应引起的免疫效应是特异性DILI的一种可能机制。虽然使用肝细胞系Huh7和THP-1细胞的体外共培养模型增加了曲格列酮诱导的细胞毒性的敏感性，但是通过药物评估过敏反应的体外模型有限(Edling等人，2009)。因此，通过关注免疫谱系推进LoT平台将有助于评估肝细胞炎症。然而，LoT测试平台在从单个类器官生成可重复的和大的数据集方面似乎是优越的，因为在此测定中可重复地观察到多种FDA批准的药物对胆汁外排功能的抑制。考虑到胆汁淤积是由广泛的肝病诱导的，包含药物诱发、脂毒性、感染性和先天性病状(Chatterjee等人，2014)，基于类器官的LoT测定可以用于分析各种情况下的肝内胆汁淤积、具有机械研究的潜力以及DILI以外的药物筛选应用。
用LoT测定研究脆弱的人类肝状况
已知如肥胖等宿主因素显著影响DILI的发病(Heidari等人，2014)，但由于其复杂的性质，它们在临床环境中经常被忽略不计。肥胖或脂肪肝的存在可能使患者容易受到由异生素和无毒化学物质(例如药物)诱导的肝脏损伤，并且在存在风险因素的情况下，这些可能在较低剂量下变成肝毒性(Fromenty，2013)。尽管如此，目前的临床试验系统并非设计用于在脆弱的肝条件下对具有少量生物标志物(ALT，AST)水平的志愿者进行分层。由于脂肪变性患者的数量是亚临床的，在给药之前没有可检测的生物标志物，因此在进入临床阶段之前预测这种脆弱状况中的结果至关重要。
为了在早期药物筛选阶段，如铅化合物生成/优化中推进LoT系统以评估这些脆弱条件下的毒性，申请人对肝类器官施加了脂毒性应激，并证明了抗糖尿病药物曲格列酮对DILI的夸大协同作用。实际上，类器官系统通过示出大量肝细胞死亡成功地反映了这一特征，所述肝细胞死亡是由甘油三酯积聚到类器官中的肝细胞中促进的。DILI在肥胖中的机制之一可以解释谷胱甘肽(GSH)水平的降低(Michaut等人，2016)。药物诱发的氧化应激可能具有几个起源，特别是通过GSH耗竭和线粒体呼吸链的抑制(Begriche等人，2011；Pessayre等人，2010)。脆弱的模型可能反映了细胞内GSH水平的降低和曲格列酮通过线粒体功能障碍引起的氧化应激恶化，通过提供NAC得到改善。考虑到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患病率的急剧上升，值得注意的是，仍有一小部分药物用于加重已存在的NAFLD或更频繁地诱导急性肝炎。另外，体外还原系统提供了先前无法预见的窗口以研究先前未测试的宿主因子，因为分离的宿主因子可以有效地部署到类器官中。
基于LoT的精准医学
从个性化医疗的角度来看，使用LoT选择最佳药物治疗将是诊所的主要兴趣。例如，根据精神病人群中肝病症的不可忽视的发病率，在选择抗精神病剂时考虑的策略必须考虑到肝脏耐受性；16％可能的DILI剂是神经精神药物(Dumortier等人，2002)。鉴于NASH常伴有如抑郁症等心理障碍，需要选择抗抑郁药物(三环类剂或SSRI)、情绪稳定剂和精神安定药物的更安全的组合(Dumortier等人，2002)。此外，由于慢性病状与年龄相关联的增加，多种药物使用(即多种药物)是为老年人提供医疗保健的常见后果(Marcum和Gellad，2012)，因此当怀疑DILI时很难识别致病药物。由于患者衍生的iPSC-类器官提供了无限且可重复的来源，LoT可以作为小组以对患者中DILI的潜力进行分层，并提供从个性化角度选择更安全药物的信息。
基于LoT的DILI的新药物发现
同样重要的是使用LoT系统可能用于抗DILI治疗化合物筛选。大量药物对肝和DILI具有有害作用，并且它是主要的临床问题。实际上，对乙酰氨基酚约占美国DILI病例的一半(Russo等人，2004)。在世界其它地区，例如在发展中国家，其它药物如抗结核药物可能是DILI的主要原因(Bell和Chalasani，2009)。但是，只有几种可用的对症治疗方法。这里，作为概念验证实验，申请人建立了类器官存活实验，以评估化合物抵抗DILI毒性机制的治疗效果，如曲格列酮所证实。虽然NAC是对乙酰氨基酚过量的主要治疗选择(Makin等人，1995；Verma和Kaplowitz，2009)，但最近，研究重点已经转向研究非对乙酰氨基酚DILI中NAC的使用(Chughlay等人，2016)。LoT系统可以用于评估非对乙酰氨基酚药物对DILI的NAC疗效。此外，这种更高通量的方法将成为筛选体外恢复DILI样症状的大规模化合物库的有力工具。结合此处描述的方法可以用于识别和研究与临床DILI表型相关联的细胞内在和外在因素，并且将促进先导化合物优化、机械研究和精确医学以及抗DILI疗法筛选应用。
方法
PSC的维护
本研究中使用的具有CYP2C9*2变体人iPSC克隆的TkDA3由K.Eto和H.Nakauchi友情提供。其它合适的系包含由京都大学赠送的人iPSC系并且从Coriell Biorepository购买的那些如前所述进行维护。(Takahashi等人，2007)。在mTeSR1培养基(加拿大温哥华干细胞技术)中在无饲养细胞条件下维持未分化的hiPSC。其它合适的培养基包含来自Lonza的E8，或来自Aijinomoto Co的StemFit。在37℃下具有5％CO2/95％空气hPSC维护的培养箱中，用1/30稀释的基质胶(Corning Inc.，New York，NY，USA)涂覆平板。代替基质胶，可以使用来自Mippi Co或Biolamina Co的Laminin511、Laminin411。
肝类器官的生产(HLO)
使用先前描述的具有若干修改的方法诱导hiPSC向定形内胚层的分化(Spence等人，2011)。简言之，在Accutase(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA)中分离hiPSC的菌落，并将150000个到300000个细胞接种在基质胶或层粘连蛋白包被的组织培养24孔板(VWR Scientific Products，West Chester，PA)上。当细胞变成高密度(超过覆盖孔的细胞的90％)时，在第1天将培养基更换为含有100ng/mL激活素A(R&D Systems，Minneapolis，MN)和50ng/mL骨形态发生蛋白4(BMP4；R&D Systems)的RPMI 1640培养基(Life Technologies，Carlsbad，CA)，在第2天将培养基更换为含有100ng/mL激活素A和0.2％胎牛血清(FCS；Thermo Fisher Scientific Inc.)的培养基，并且在第3天将培养基更换为含有100ng/mL激活素A和2％FCS的培养基。对于第4天到第6天，将细胞在含有500ng/ml成纤维细胞生长因子(FGF4；R&D Systems)的B27(Life Technologies)和N2(Gibco，Rockville，MD)和3μM CHIR99021(Stemgent，Cambridge，MA，USA)的Advanced DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific Inc.)中培养。将细胞分化培养物维持在37℃，5％CO2/95％空气的气氛中，并且每天更换培养基。分化的定形内胚层在第7天示出在平板上出芽。如果球状体不足以嵌入基质胶中，则再次加入第4天到第6天的培养基并在37℃下培育过夜。
分化为肝类器官。三种方法可以用于将DE分化为肝类器官：“基质胶滴法”、“基质胶夹心法”和“无基质胶方法”，所述方法中的每一种都在下面描述。
基质胶滴法：在第7天到第8天，将具有接种细胞的定形内胚层类器官轻轻移液以从培养皿分层。将分离的球状体以800rpm离心3分钟，并且去除上清液之后，将100％基质胶滴入培养皿中。将板置于37℃，5％CO2/95％空气的气氛中5分钟到15分钟。在基质胶固化之后，向Advanced DMEM/F12加入2μM的B27、N2和视黄酸(RA；Sigma，St.Louis，MO)，持续1天到5天。培养基每隔一天更换一次。在RA处理之后，将嵌入基质胶滴中的类器官在具有10ng/mL肝细胞生长因子(HGF；PeproTech，Rocky Hill，NJ)，0.1μM地塞米松(Dex；Sigma)和20ng/mL制瘤素M(OSM；R&D Systems)的肝细胞培养基(HCM Lonza，Walkersville，MD)中培养。将细胞分化培养物维持在37℃，5％CO2/95％空气的气氛中，并且每3天更换一次培养基。在第20天到第30天左右，通过刮擦和轻柔移液分离嵌入基质胶滴中的类器官，用于任何分析。
基质胶夹心法：在第7天到第8天，将具有接种细胞的定形内胚层类器官轻轻移液以从培养皿分层。将分离的球状体以800rpm离心3分钟，并且去除上清液之后，将它们与100％基质胶混合。同时，将具有所有补充物的肝细胞培养基与相同体积的100％基质胶混合。将HCM和基质胶混合物平铺到培养皿底部以在板上形成厚涂层(0.3cm到0.5cm)，并在37℃下在5％CO2/95％空气的气氛中放置15分钟到30分钟。在基质胶固化之后，将与基质胶混合的球状体接种在基质胶厚涂层上。将板置于37℃，5％CO2/95％空气的气氛中5分钟。向Advanced DMEM/F12加入2μM的B27、N2和视黄酸(RA；Sigma，St.Louis，MO)，持续1天到5天。培养基每隔一天更换一次。在RA处理之后，将嵌入基质胶滴中的类器官在具有10ng/mL肝细胞生长因子(HGF；PeproTech，Rocky Hill，NJ)，0.1μM地塞米松(Dex；Sigma)和20ng/mL制瘤素M(OSM；R&D Systems)的肝细胞培养基(HCM Lonza，Walkersville，MD)中培养。将细胞分化培养物维持在37℃，5％CO2/95％空气的气氛中，并且每3天更换一次培养基。在第20天到第30天左右，通过刮擦和轻柔移液分离嵌入基质胶滴中的类器官，用于任何分析。
无基质胶方法：在第7天到第8天，具有接种细胞的定形内胚层类器官在AdvancedDMEM/F12(Thermo Fisher Scientific Inc.)中用2μM B27(Life Technologies)和N2(Gibco，Rockville，MD)视黄酸(RA；Sigma，St.Louis，MO)继续平面培养4天。培养基每隔一天更换一次。在4天平面培养之后，类器官开始萌芽，而2D细胞分化成肝细胞。在具有10ng/mL肝细胞生长因子(HGF；PeproTech，Rocky Hill，NJ)，0.1μM地塞米松(Dex；Sigma)和20ng/mL制瘤素M(OSM；R&D Systems)的10天的肝细胞培养基(HCM Lonza，Walkersville，MD)下，可以将类器官和肝细胞两者维持超过60天。对于类器官测定，可以在超低附着多孔板6孔板中收集漂浮的类器官，并在适当时用于随后的测定。将细胞分化培养物维持在37℃，5％CO2/95％空气的气氛中，并且每3天更换一次培养基。
H&E染色和免疫组织化学
从基质胶收集肝类器官，在4％多聚甲醛中固定并包埋在石蜡中。切片进行H&E和免疫组织化学染色。使用以下一级抗体：抗人白蛋白抗体(1:200稀释，英国剑桥abcam)、抗IV型胶原抗体(1:200稀释，美国加利福尼亚圣迭戈eBioscience)、抗ZO-1抗体(1:200稀释BD Transduction Laboratories(San Jose，CA，USA)和抗MRP2抗体(1:200稀释NovusBiologicals，Littleton，CO)。将染料缀合的二级抗体、Alexa Fluor 568-缀合的驴抗兔免疫球蛋白(IgG；1:1000；Invitrogen，A10042)在室温下施用于类器官2小时。在室温下用10μg/mL Hoechst 33342(Sigma)对细胞核染色10分钟，之后用洗涤缓冲液再次洗涤类器官三次。在荧光显微镜或明视场下观察样品。对于整体免疫组织化学染色，将肝类器官在4％多聚甲醛中固定30分钟并在室温下用2.5％Tween 20(Sigma)透化之后，将类器官在4℃下与在PBS中稀释的以下一级抗体培育过夜：多克隆抗BSEP抗体(1:200Sigma)。将荧光染料缀合的二级抗体、Alexa Fluor 568-缀合的驴抗兔免疫球蛋白(IgG；1:500；Invitrogen，A10042)在室温下施用于类器官2小时。反应之后，用洗涤缓冲液(含有0.5％Triton-X 100[Sigma]和0.5％牛血清白蛋白[BSA；Sigma]的PBS)洗涤细胞三次。在室温下用10μg/mLHoechst 33342(Sigma)对细胞核染色10分钟，之后用洗涤缓冲液再次洗涤类器官三次。在Nikon A1Rsi倒置共聚焦显微镜上进行共聚焦成像下观察样品。
RNA分离，RT-qPCR
使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)分离RNA。使用SuperScriptIII First-Strand Sysnthesis Systen for RT-PCR(Invitrogen，CA，USA)根据制造商的方案进行逆转录。在QuantStudio3实时PCR系统(Thermo)上使用TaqMan基因表达主混合物(Applied Biosystmes)进行qPCR。每个靶基因的所有引物和探针信息均自Universal ProbeLibrary Assay Design Center(https://qpcr.probefinder.com/organism.jsp)获得。
RNA-seq数据的主成分分析
先前描述了RNA分离、cDNA合成、Illumina HiSeq 2500上的测序(Asai等人，2017)。使用TopHat(第2.0.13版)将RNA-Seq读数与人类基因组(GRCh37/hg19)比对。来自Tophat的比对数据被馈送到汇编程序Cufflinks(第2.2.1版)，以将比对的RNA-Seq读数汇编成转录物。注释的转录物自UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu)和Ensembl数据库获得。在每百万片段映射的外显子的片段每千克碱基(FPKM)中测量转录物丰度。
为了比较pHLO的谱系，申请人将内部RNA-seq数据(pFG和类器官)与预处理的公共数据组合如下：iPSC、DE、HS、HP、iDH和NHC的转录物丰度自GSE86007获得(Jalan-Sakrikar等人，2016)；儿童肝组织、成人肝组织、成人右叶组织、胎儿肝组织和原代肝细胞中的多个自ENCODE(ENCFF418BVF、ENCFF804QWF、ENCFF965IQH、ENCFF918SJO、ENCFF367FJJ、ENCFF029IUF、ENCFF280YNO、ENCFF347TXW、ENCFF724CQI、ENCFF624LQL、ENCFF962SOD、ENCFF170AEC)获得(Consortium，2012；Sloan等人，2016)和GSE85223(Asai等人，2017)。如果所有数据集在可能的数据预处理之后具有相同的基因符号，则使用基因。申请人在log2空间中对FPKM+1和RPKM+1数据进行分位数归一化，然后在中值表达水平的前10000内选择基因。通过使用R package FactoMineR(第1.35版)(2008)使用缩放的基因表达水平进行主成分分析。
蛋白质分泌分析
为了测量白蛋白、纤维蛋白原和补体因子分泌的类器官水平，收集200μL超低附着96孔板(Corning)上的类器官培养上清液。收集培养上清液并储存在-80℃下直到使用。根据制造商的说明书，用人白蛋白ELISA定量装置(Bethyl Laboratories，Inc.，TX，USA)和纤维蛋白原(Thermo Fisher Scientific)测定上清液。为了分析补体因子，根据制造商的说明书，用Luminex System(Luminex Corporation，Austin，TX)测量上清液。为了计算每个细胞数的白蛋白产量，使用细胞数量与类器官直径的线性回归方程。为了测量总胆汁酸分泌水平的管腔内类器官，使用显微注射Nanoject II(Drummond Scientific，Broomall，PA，USA)吸收类器官内的流体。吸收的流体在PBS中稀释，并用Total Bile Acid ELISA试剂盒(Antibodies-online，Inc.，GA，USA)测定。为了计算总胆汁酸的体积，使用线性回归方程以与白蛋白产生相同的方式计算类器官中的细胞数，并且使用胆酸的分子量进行计算并与先前报道中的体积进行比较。
透射电子显微镜
对于透射电子显微镜，简言之，将类器官在3％戊二醛中在4℃下固定过夜，在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中洗涤，并在4％四氧化锇中培育1小时。随后将它们洗涤，然后在乙醇系列中脱水，并且最后包埋在环氧丙烷/LX112中。然后将组织切片并用2％乙酸铀酰染色，然后用柠檬酸铅染色。在Hitachi透射电子显微镜上观察图像。
CGamF测定
简言之，将类器官与转运缓冲液(118mM NaCl、23.8mM NaHCO3、4.83mM KCl、0.96mM KH2PO4、1.20mM MgSO4、12.5mM HEPES、5mM葡萄糖、1.53mM CaCl2，调节到pH 7.4)预培育30分钟。接下来，通过10μM荧光标记的胆汁酸(CGamF；霍夫曼博士的友好礼物)处理类器官1小时，然后之后，用PBS洗涤类器官三次。在荧光显微镜BZ-X710(Keyence，Osaka，Japan)上捕获图像。
评估胆汁转运抑制
二乙酸荧光素用于评估类器官中的胆汁转运活性。在第25天左右，用PBS冲洗类器官，并将二乙酸荧光素在培养基中处理成类器官。另外，为了研究转运方向，使用NanojectIII(Drummond Scientific)将二乙酸荧光素注射到类器官。在处理或注射二乙酸荧光素之后，在荧光显微镜BZ-X710(Keyence)上捕获图像。接下来，为了检查测试系统的可行性，将10mg/mL HCM中的二乙酸荧光素(Sigma)与20μM环孢菌素A(CSA；Sigma)一起加入45分钟，并使用荧光显微镜BZ-9000(Keyence)依次捕获图像。为了评估胆汁转运抑制，在处理二甲基亚砜(DMSO；Sigma)、链霉素(STP；Sigma)作为阴性对照、托卡朋(Tol；Sigma)、双氯芬酸(Diclo；Sigma)、波生坦(BOS；Sigma)、CSA、曲格列酮(Tro；Sigma)、奈法唑酮(Nefa；Sigma)、恩他卡朋(Enta；Sigma)和吡格列酮(PIO，Sigma)之后，将10mg/mL HCM中的二乙酸荧光素加入。培育5分钟之后，用PBS冲洗类器官三次，并使用荧光显微镜BZ-X710依次捕获图像。通过使用Imagej 1.48k软件(Wayne Rasband，NIHR，USA，http：//imagej.nih.gov/ij)计算外部与内部类器官强度之间的比率来进行分析。处理期间亮度或对比度的变化跨整个图像均匀地应用。
线粒体毒性潜力评估
在每种培养条件下在超低附着多孔板6孔板上培养之后，拾取类器官并接种在Microslide 8Well Glass Bottom(Ibidi，WI，USA)中。为了评估线粒体膜电位(MMP)，在处理二甲基亚砜(DMSO；Sigma)、链霉素(STP；Sigma)作为阴性对照、托卡朋(Tol；Sigma)、双氯芬酸(Diclo；Sigma)、波生坦(BOS；Sigma)、环孢菌素A(CSA；Sigma)、曲格列酮(Tro；Sigma)、奈法唑酮(Nefa；Sigma)、恩他卡朋(Enta；Sigma)和吡格列酮(PIO，Sigma)24小时之后，加入250nM四甲基罗丹明、甲基酯、高氯酸盐(TMRM；Thermo Fisher Scientific)。培育30分钟之后，用PBS冲洗类器官三次，并使用60x水浸物镜在Nikon A1倒置共聚焦显微镜(日本)上扫描图像。通过IMARIS8(Bitplane AG，Switzerland)将咏叹调和TMRM的强度计算为MMP。为了评估胆汁淤积和线粒体应激，通过在药物处理之后24小时使用每个类器官的CellTiter-发光细胞活力测定法(Promega，Mannheim，Germany)测量细胞活力，并确认不降低每个剂量中的活力以避免由于细胞对死亡的损害导致的继发性改变。
类器官中细胞活力与线粒体和胆汁淤积应激关系的分析
为了证明细胞活力与线粒体和胆汁淤积应激的关系，首先，使用下式设定指数；基于线粒体和胆汁淤积应激测定提供的值“指数＝-(样品值-对照值)×100”。为了分析与线粒体和胆汁淤积应激相关联的细胞损伤，在药物处理之后72小时，使用CellTiter-发光细胞活力测定法(Promega)确定每个类器官的ATP含量。这些数据如图4所示，板B使用Infogr.am(http://infogr.am)：免费的，基于网络的工具。
脆弱状态下类器官活力的评估
如图5A所示进行实验。在从基质胶排除并洗涤之后，在超低附着多孔板6孔板(Corning)上将类器官用800μM油酸处理3天。接下来，用或不用50μM NAC处理50μM曲格列酮24小时。通过使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(Promega)进行细胞活力。使用荧光显微镜BZ-9000依次捕获图像。
脂质诱导线粒体应激评估
在每种培养条件下在超低附着多孔板6孔板上培养之后，拾取二十个类器官并接种在Microslide 8Well Glass Bottom(Ibidi，WI，USA)中并进行活细胞染色。使用以下试剂或试剂盒：用于脂质的493/503(Thermo Fisher Scientific)和用于细胞骨架的SiR肌动蛋白试剂盒(USA Scientific，FL，USA)，用于ROS的绿色试剂(Fisher Scientific)，用于线粒体的TMRM(Thermo Fisher Scientific)。使用60x水浸物镜在Nikon A1倒置共聚焦显微镜(日本)上观察并扫描类器官。通过IMARIS8分析ROS产生、线粒体大小和数量。
统计
使用非配对Student t测试或单向方差分析和Dunnett多重比较事后测试确定统计学显著性。P<0.05被认为是显著的。
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除非另有说明，否则所有百分比和比例均按重量计算。
除非另有说明，否则所有百分比和比例均基于总组合物计算。
应当理解的是，本说明书中给出的每个最大数值限制包含每个较低的数值限制，如同这种较低的数值限制在本文中明确写出一样。本说明书中给出的每个最小数值限制将包含每个较高的数值限制，如同这种较高的数值限制在本文中明确写出一样。本说明书中给出的每个数值范围将包含落入这种较宽的数值范围内的每个较窄的数值范围，如同这种较窄的数值范围在本文中明确写出一样。
本文所公开的尺寸和值不应理解为严格地受限于所叙述的准确数值。相反，除非另有指定，否则每个这种尺寸都旨在指所叙述值和围绕那个值的功能上等效的范围。例如，公开为“20mm”的尺寸旨在指“约20mm”。
除非明确排除或以其它方式限制，否则本文引用的每篇文献，包含任何交叉引用的或相关的专利或申请，均通过引用以其整体在此并入本文。任何文献的引用都不承认其是关于本文所公开或所要求的任何发明的现有技术，或其单独地或以与任何其它参考或参考组合的形式教示、表明或公开任何这种发明。进一步，在本文献中的术语的任何意义或定义与通过引用并入的文献中的相同术语的任何意义或定义相冲突的情况下，应当以在本文献中所赋予术语的意义或定义为准。
虽然已经说明并描述了本发明的特定实施例，但本领域的技术人员应显而易知，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下作出各种其它改变和修改。因此，旨在在所附权利要求书中覆盖在本发明的范围内的所有这种改变和修改。

Claims (23)

1.一种诱导从iPSC细胞形成肝类器官的方法，其包括以下步骤：
a)使衍生自所述iPSC细胞的定形内胚层(DE)与FGF途径激活剂和GSK3抑制剂接触足以形成后前肠球状体的时间段，优选地约1天到约3天的时间段；
b)在视黄酸(RA)存在下培育步骤a的所述后前肠球状体足以形成所述肝类器官的时间段，优选地约1天到约5天的时间段，优选地约4天。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是人iPSC。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述前肠球状体嵌入基底膜基质，优选地基质胶中。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HLO的特征在于所述HLO表达甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、视黄醇结合蛋白(RBP4)、细胞角蛋白19(CK19)、肝细胞核因子6(HNF6)、以及细胞色素P450 3A4(CYP3A4)、HNF4a、E-钙粘蛋白、DAPI和Epcam，优选地当在第40天到第50天测量表达时。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HLO的特征在于所述HLO具有胆汁转运活性。
6.一种衍生自干细胞的肝类器官，其包括管腔结构，所述管腔结构包括内化微绒毛，所述内化微绒毛包括间充质细胞，其中所述管腔结构被极化的肝细胞和基底膜包围。
7.根据权利要求6所述的肝类器官，其中所述干细胞是人iPSC。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的肝类器官，其中所述肝类器官包括功能性星状细胞和功能性库普弗细胞。
9.根据权利要求6到8中任一项所述的肝类器官，其中所述肝类器官的特征在于，其具有以下中的一种或多种：胆汁产生能力、胆汁转运活性、至少50ng/mL/1xe6个细胞/24小时的补体因子H表达、至少40ng/mL/1xe6个细胞/24小时的补体因子B、至少1000ng/mL/1xe6个细胞/24小时的C3表达；至少1000ng/mL/1xe6个细胞/24小时的C4表达、至少1,000ng/mL/1xe6个细胞/24小时的纤维蛋白原产量以及至少1,000ng/mL/1xe6个细胞/24小时的白蛋白产量。
10.根据权利要求6到9中任一项所述的肝类器官，其中所述肝类器官的特征在于，其具有至少10,000ng/mL1xe6个细胞/24小时的总肝蛋白表达。
11.根据权利要求6到10中任一项所述的肝类器官，其中所述肝类器官表达选自以下的一个或多个基因：PROX1、RBP4、CYP2C9、CYP3A4、ABCC11、CFH、C3、C5、ALB、FBG、MRP2、ALCAM、CD68、CD34、CD31。
12.根据权利要求6到11中任一项所述的肝类器官，其中所述HLO包括药物代谢细胞色素变体，优选地CY2C9*2变体。
13.根据权利要求6到12中任一项所述的肝类器官，其中所述肝类器官是游离的，不包括炎性细胞，例如T细胞或其它炎性分泌蛋白质。
14.一种筛选严重不良事件(SAE)、优选地肝衰竭和/或药物诱发的肝损伤(DILI)的方法，其包括使所关注药物与前述权利要求中任一项所述的肝类器官接触的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法包括测量二乙酸荧光素(FD)的摄入和/或外排的步骤，其中受损的外排表明所述药物可能诱发严重不良事件。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述所关注药物的毒性通过测量选自以下的参数来确定：线粒体膜电位、ROS测量、肝线粒体肿胀和其组合，其中对所述线粒体的损伤表明所述药物可能诱发严重不良事件。
17.根据权利要求14到16中任一项所述的方法，其中所述方法包括测定类器官活力的步骤，其中受损的类器官活力测定表明所述药物可能诱发严重不良事件。
18.一种治疗患有肝损害的个体的方法，其包括将根据前述权利要求中任一项所述的肝类器官植入到所述个体中。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述肝损害选自代谢性肝病、终末期肝病或其组合。
20.一种识别用于个体的优选治疗剂的方法，其包括使衍生自所关注iPSC的肝类器官与候选化合物接触。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述所关注iPSC包括在所述个体中发现的一个或多个突变。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述所关注iPSC衍生自所述个体的相同伦理背景。
23.根据权利要求20到22中任一项所述的方法，其中所述所关注iPSC衍生自所述个体。
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