CN113717850A - 一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立方法，该方法主要是构建了一种基于微流控芯片技术的可灌流的微反应器用于形成多能干细胞(hiPSCs)来源的三维类肝组织，并通过施加游离脂肪酸刺激，模拟非酒精性脂肪肝病的形成。该模型作为新型的体外器官疾病模型，不仅利于直观观察脂肪酸对肝的形态学影响，也可以结合多种检测手段，研究非酒精性脂肪肝病发生发展的分子和细胞水平机制。本发明具有成本低、操作简单、可原位追踪和实时监测等优点，形成具有肝特异性功能的类肝组织，可替代动物模型和传统的二维培养模式，为非酒精性脂肪肝体外模型的建立及非酒精性脂肪肝病的机理研究、药物筛选等提供了有力的技术平台。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术和组织工程领域，具体涉及一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立方法。
背景技术
非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是世界范围内最常见的慢性肝病之一，与肥胖或II型糖尿病患病率的增加密切相关。非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种以肝组织中大量脂肪蓄积、肝细胞发生脂肪变性为特点的脂类代谢性疾病。NAFLD的发展主要经历三个阶段：由单纯的脂肪变性发展为非酒精性脂肪肝炎，最后发展为肝硬化甚至肝癌。肝细胞发生脂肪变性是脂肪肝形成的最初变化和基础，目前，NAFLD的发病机制尚未明确。
肝脏体外模型对NAFLD的研究和药物筛选测试是至关重要的。目前， NAFLD研究主要依赖于动物模型和传统单层细胞培养。由于动物模型具有种间差异性，难以真实地反映人体内病理生理过程。二维细胞培养体系中，常用的细胞包括肝细胞系或原代肝细胞等，由于其肝特异性基因组和功能与正常人肝组织有一定差异性，且原代肝细胞来源有限，因此其应用范围是有限的。此外，二维培养往往缺乏细胞-细胞间相互作用，很难反映人体肝组织特异的结构和功能。因此，开发适当的体外3D人肝组织模型来深入了解NAFLD的病理过程和发病机制是非常有必要的。
类器官是由干细胞(包括成体干细胞、胚胎干细胞以及诱导多能干细胞 hiPSCs)通过特异性分化并自组装成具有多细胞结构的复杂三维组织，能够概括组织器官的关键结构和功能。目前已有的干细胞来源的类器官包括肝，肠，视网膜和大脑等。这些模型在组织器官发育研究、疾病模拟、药物测试和再生医学等方面提供了潜在的平台，有效弥补了传统二维细胞培养模型和动物模型的不足，具有广泛的应用前景。近几年来，类器官芯片技术的发展为类器官在生物医学领域的研究开辟了新的前沿。将类器官与器官芯片技术相结合，通过提供生理相关性的微环境，可以最大限度地发挥类器官的潜力，有望实现更复杂的组织结构和功能，在体外建立更加仿生的器官模型，部分解决现有类器官系统的一些局限。但是目前利用肝类器官芯片模型进行体外研究NAFLD疾病进展和发生机制尚属空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立的方法，该方法使用微流控芯片灌流系统通过三维细胞培养和流体控制等要素，模拟体内肝组织生长的微环境，保证了充分的营养物质交换，不仅有效地实现了类肝组织的原位分化、形成和长期培养，还使形成的类肝组织具备良好的肝功能特征。该方法具有低成本、易操作、可原位示踪和实时监测的特点，为肝脏疾病研究、药物筛选和测试提供了一个新的平台。
本发明提供了一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立的方法，该方法主要是构建了一种基于微流控芯片技术的可灌流的微反应器用于形成hiPSCs来源的三维类肝组织，并通过施加游离脂肪酸刺激，模拟非酒精性脂肪肝病的形成而建立；其步骤主要分为三部分：
(1)微流控芯片的制备；
(2)三维类肝组织在微流控芯片上的产生；
(3)施加游离脂肪酸(FFAs)。
所述步骤(1)微流控芯片主要由培养液入口、灌流通道、柱形阵列、培养液出口组成，液体由培养液入口进入后通过含有柱形阵列的灌流通道，再由出口流出。
所述微流控芯片的灌流通道宽度范围为5mm-10mm，灌流通道高度范围为 1-1.3mm，微柱阵列结构中小柱直径范围为500μm-1mm，小柱高度范围为 500-800μm，小柱间间距范围为50-100μm。
所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物，封接之后，经过高温高压灭菌处理，封接好的芯片用0.1％-2％浓度的PF127修饰4-24小时，用培养基清洗数次浸泡过夜备用。
步骤(2)三维类肝组织在微流控芯片上的产生；具体分为以下几步：
第一步：人多能干细胞在二维培养中的生长密度达到70％-80％时，将原来的商业化mTESR1培养基替换为内胚层诱导培养基，内胚层诱导培养基的基础成份为商业化的RPMI-1640培养基，另外需添加占总体积1％的Knock Out Replacement(KSR)，占总体积1％的B27(100×)，占总体积1％的GlutaMax (100×)，占总体积1％的penicillin-streptomycin(100×)，以及高浓度的 activin-A因子。诱导5天，形成内胚层。其中activin-A因子为商业化的人重组蛋白。
第二步：第5天，诱导肝特异性内胚层分化，将步骤(1)内胚层诱导培养基中的activin-A替换成bFGF和BMP4两种因子混合物，诱导3天。
第三步：第8天，诱导肝前体细胞分化和增殖。将步骤(2)内胚层诱导培养基中的bFGF和BMP4因子替换成HGF，继续诱导培养。
第四步：第10天，将诱导的肝前体细胞消化成单细胞，离心500-800rpm， 3-5min，用肝前体分化培养基重悬细胞至合适的细胞密度，细胞密度范围为2×103～6×106cells/ml，并接种至已制备好的微流控芯片中，静置培养1天，肝前体细胞在微柱阵列中聚集形成3D细胞球。
第五步：第11天，待细胞成球后，将微流控芯片的灌流通道连接注射器和注射泵，设置流速20-40ul/h，将芯片放入培养箱中进行灌流培养，并实时追踪。所用培养基为肝前体分化培养基，灌流培养至第13天。
第六步：第13天，为促进肝细胞进一步成熟，将肝前体分化培养基替换为含有OSM因子和地塞米松(Dex)的肝细胞完全培养基(HCM，商业化)，并连续灌流5天；
第七步：第18天，培养基更换为含Dex的HCM培养基，连续灌流，后续可进行长期的培养，连续培养至30-40天后，经组织形态学和功能鉴定发现可形成具有良好肝功能的异质性肝组织，此方法可模拟肝的分化和形成过程。
以上因子activin-A的浓度范围为80-120ng/ml，bFGF的浓度范围为10-20 ng/ml，BMP4的浓度范围为10-20ng/ml，HGF的浓度范围为20-30ng/ml，OSM 的浓度范围为10-20ng/ml，地塞米松(Dex)的浓度范围为10-7-10-6M。
步骤(3)施加FFAs刺激；具体分为一下几步：
第一步：类肝培养第23天时，施加游离脂肪酸(油酸和棕榈酸)刺激，游离脂肪酸的浓度范围为0.4-1mM，模拟生理情况下的脂肪酸浓度。
第二步：对照组使用的肝细胞培养基HCM(含Dex)，样品组使用含FFAs 的肝细胞培养基HCM(含Dex)，Dex浓度范围为10-7-10-6M；
第三步：FFAs处理至类肝组织30天时，进行后续检测。
本发明构建了一种新型的基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型，是一种基于器官芯片技术的可灌流的微反应器。本发明是将体内肝发育的基本原理和工程化技术结合，更好地模拟了肝生理微环境，并进一步用于NAFLD疾病的模拟。本发明具有成本低、操作简单、可原位追踪和实时监测等优点，可替代动物模型和传统的二维培养方式，在一定程度上模拟肝的形成与发育，为体外模拟肝形成、药物代谢、药物筛选和毒性检测等方面提供了一个强有力的技术支撑。
附图说明
图1器官芯片结构示意图，其中：1为培养液入口，2为灌流通道，3为柱形阵列，4为培养液出口。
图2是肝类器官分化示意图和明场表征图，bars:100μm。
图3是免疫荧光检测肝类器官的基因表达和白蛋白分泌结果图；
其中，(A)肝前体细胞标志物(AFP)、肝细胞标志物(ALB和HNF4A)、细胞色素CYP450标志物(CYP3A4)；(B)胆管细胞标志物(CK7、CK19)、细胞增殖标志物(Ki67)，(C)表示肝类器官分化过程中的白蛋白分泌水平。
图4是无FFAs处理的对照组和有FFAs处理的实验组的肝类器官的脂滴生成、甘油三酯积累和脂肪代谢相关基因的表达情况；
其中，(A)FFAs处理7天后，油红O染色观察肝类器官内脂脂滴生成图，未进行FFAs处理的肝类器官作为对照；(B)FFAs处理肝类器官不同天数的脂肪积累情况，bars:100μm；(C)实时荧光定量PCR检测基因表达情况，包括脂肪酸分解代谢相关基因(CPT2、CPT1A、HADH)、脂质结合蛋白2(APOC2)；(D) 表示PLIN2的表达情况，脂滴包被蛋白Perilipin2(PLIN2)，**p<0.01，***p< 0.001。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
器官芯片上非酒精性脂肪肝体外模型建立
本发明提供了一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立的方法，其步骤主要分为三部分：(1)微流控芯片的制备；(2)三维类肝组织在微流控芯片上的产生；(3)施加游离脂肪酸刺激。
所述步骤(1)微流控芯片主要由培养液入口、灌流通道、柱形阵列、培养液出口组成，液体由培养液入口进入后通过含有柱形阵列的灌流通道，再由出口流出。器官芯片结构示意图如图1所示。微流控芯片灌流通道宽度为8mm，灌流通道高度为1mm，柱形阵列结构中小柱直径为800μm，小柱高度为500μm，小柱间间距为50μm。
所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物，封接之后，经过高温高压灭菌处理，封接好的芯片用0.2％浓度的PF127修饰24小时，用培养基清洗数次浸泡过夜备用。
步骤(2)三维类肝组织在微流控芯片上的产生；具体分为以下几步：
第一步：人多能干细胞在二维培养中的生长密度达到80％时，将原来的商业化mTESR1培养基替换为内胚层诱导培养基，内胚层诱导培养基的基础成份为商业化的RPMI-1640培养基，另外需添加占总体积1％的Knock Out Replacement(KSR)，占总体积1％的B27(100×)，占总体积1％的GlutaMax (100×)，占总体积1％的penicillin-streptomycin(100×)，以及高浓度的 activin-A因子。诱导5天，形成内胚层。
第二步：第5天，诱导肝特异性内胚层分化，将步骤(1)内胚层诱导培养基中的activin-A替换成bFGF和BMP4因子，诱导3天。
第三步：第8天，诱导肝前体细胞分化和增殖。将步骤(2)内胚层诱导培养基中的bFGF和BMP4因子替换成HGF，形成肝前体分化培养基，继续诱导。
第四步：第10天，将诱导的肝前体细胞消化成单细胞，离心800rpm，3min，用肝前体分化培养基重悬细胞至合适的细胞密度，细胞密度范围为6×106 cells/ml，并接种至已制备好的微流控芯片中，静置培养1天，肝前体细胞在微柱阵列中聚集形成3D细胞球。
第五步：第11天，待细胞成球后，将微流控芯片的灌流通道连接注射器和注射泵，设置流速20ul/h，将芯片放入培养箱中进行灌流培养，并实时追踪。所用培养基为肝前体分化培养基，灌流培养至第13天。
第六步：第13天，为促进肝细胞进一步成熟，将肝前体分化培养基替换为含有OSM因子和地塞米松(Dex)的肝细胞完全培养基(HCM，商业化)，并连续灌流5天；
第七步：第18天，培养基更换为含Dex的HCM培养基，连续灌流，后续可进行长期的培养，连续培养至30天后，经组织形态学和功能鉴定发现可形成具有良好肝功能的异质性肝组织，此方法可模拟肝的分化和形成过程。图2是肝类器官分化示意图和明场表征图。
以上因子activin-A的浓度为100ng/ml，bFGF的浓度为10ng/ml，BMP4 的浓度为20ng/ml，HGF的浓度为20ng/ml，OSM的浓度为10ng/ml，地塞米松(Dex)的浓度为10-7M。
步骤(3)施加游离脂肪酸刺激；具体分为以下几步：
第一步：类肝培养第23天时，施加游离脂肪酸(油酸和棕榈酸)刺激，游离脂肪酸的浓度为0.6mM。
第二步：对照组使用的肝细胞培养基HCM(含Dex)，样品组使用含游离脂肪酸的肝细胞培养基HCM(含Dex)，Dex浓度为10-7M；
第三步：脂肪酸处理至三维类肝组织30天时，进行后续检测。
实施例2
器官芯片上非酒精性脂肪肝体外模型建立及器官芯片上肝类器官功能表征
本发明提供了一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立的方法，其步骤主要分为三部分：(1)微流控芯片的制备；(2)三维类肝组织在微流控芯片上的产生；(3)施加游离脂肪酸刺激。
所述步骤(1)微流控芯片主要由培养液入口、灌流通道、柱形阵列、培养液出口组成，液体由培养液入口进入后通过含有柱形阵列的灌流通道，再由出口流出。器官芯片结构示意图如图1所示。微流控芯片灌流通道宽度为8mm，灌流通道高度为1mm，柱形阵列结构中小柱直径为800μm，小柱高度为500μm，小柱间间距为50μm。
所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物，封接之后，经过高温高压灭菌处理，封接好的芯片用0.2％浓度的PF127修饰6小时，用培养基清洗数次浸泡过夜备用。
步骤(2)三维类肝组织在微流控芯片上的产生；具体分为以下几步：
第一步：人多能干细胞在二维培养中的生长密度达到70％时，将原来的商业化mTESR1培养基替换为内胚层诱导培养基，内胚层诱导培养基的基础成份为商业化的RPMI-1640培养基，另外需添加占总体积1％的Knock Out Replacement(KSR)，占总体积1％的B27(100×)，占总体积1％的GlutaMax (100×)，占总体积1％的penicillin-streptomycin(100×)，以及高浓度的 activin-A因子。诱导5天，形成内胚层。
第二步：第5天，诱导肝特异性内胚层分化，将步骤(1)内胚层诱导培养基中的activin-A替换成bFGF和BMP4因子，诱导3天。
第三步：第8天，诱导肝前体细胞分化和增殖。将步骤(2)内胚层诱导培养基中的bFGF和BMP4因子替换成HGF，形成肝前体分化培养基，继续诱导。
第四步：第10天，将诱导的肝前体细胞消化成单细胞，离心600rpm，4min，用肝前体分化培养基重悬细胞至合适的细胞密度，细胞密度范围为6×106 cells/ml，并接种至已制备好的微流控芯片中，静置培养1天，肝前体细胞在微柱阵列中聚集形成3D细胞球。
第五步：第11天，待细胞成球后，将微流控芯片的灌流通道连接注射器和注射泵，设置流速20ul/h，将芯片放入培养箱中进行灌流培养，并实时追踪。所用培养基为肝前体分化培养基，灌流培养至第13天。
第六步：第13天，为促进肝细胞进一步成熟，将肝前体分化培养基替换为含有OSM因子和地塞米松(Dex)的肝细胞完全培养基(HCM，商业化)，并连续灌流5天；
第七步：第18天，培养基更换为含Dex的HCM培养基，连续灌流，后续可进行长期的培养，连续培养至30天后，经组织形态学和功能鉴定发现可形成具有良好肝功能的异质性肝组织，此方法可模拟肝的分化和形成过程。
以上因子activin-A的浓度为120ng/ml，bFGF的浓度为20ng/ml，BMP4 的浓度为10ng/ml，HGF的浓度为30ng/ml，OSM的浓度为20ng/ml，地塞米松(Dex)的浓度为10-6M。
步骤(3)施加游离脂肪酸刺激；具体分为一下几步：
第一步：类肝培养第23天时，施加游离脂肪酸(油酸和棕榈酸)刺激，游离脂肪酸的浓度为0.8mM。
第二步：对照组使用的肝细胞培养基HCM(含Dex)，样品组使用含游离脂肪酸的肝细胞培养基HCM(含Dex)，Dex浓度为10-6M；
第三步：脂肪酸处理至三维类肝组织30天时，进行后续检测。在诱导过程中取第20天的类肝组织进行免疫荧光检测，肝类器官的基因表达和白蛋白分泌结果图如图3所示。
实施例3
器官芯片上非酒精性脂肪肝模型建立及表征
取实例2中器官芯片上对照组(无FFAs处理)和实验组(FFAs处理)条件下诱导7天的肝组织进行油红染色表征，如图4中A所示，结果表明FFAs处理后的肝组织有明显的红色脂滴生成。通过对不同处理天数的肝组织胞内甘油三酯积累的定量分析，如图4中B显示甘油三酯水平随着脂肪酸暴露时间延长而显著增加。进一步通过荧光定量PCR鉴定脂肪代谢相关的基因的表达情况，如图 4中C和图4中D结果显示，与对照组相比，实验组细胞的脂肪酸代谢相关基因APOC2,CPT2,CPT1A,HADH，PLIN2表达均显著上调，并且PLIN2的表达升高倍数非常显著。综上，结果表明芯片上的肝类器官在FFAs处理后显示出脂滴形成、甘油三酯积累和脂肪酸代谢相关基因表达异常等变化，证明这一肝类器官芯片系统可在体外模拟非酒精性脂肪肝的病理过程和关键特征。
Claims (8)
1.一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立方法，其特征在于，该方法主要是构建了一种基于微流控芯片技术的可灌流的微反应器用于产生多能干细胞(hiPSCs)来源的三维类肝组织，并通过施加游离脂肪酸刺激，模拟非酒精性脂肪肝病的形成；其主要步骤为：
(1)微流控芯片的制备；
(2)三维类肝组织在微流控芯片上的产生；
(3)施加游离脂肪酸(FFAs)刺激。
2.按照权利要求1所述的一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立方法，其特征在于：步骤(1)中所述的微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，包括：培养液入口(1)、灌流通道(2)、微柱阵列(3)、培养液出口(4)，液体由培养液入口(1)进入后通过含有微柱阵列(3)的灌流通道(2)，再由出口(4)流出。
3.按照权利要求2所述的一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立方法，其特征在于：所述微流控芯片的灌流通道(2)宽度为5mm-10mm，灌流通道(2)高度为1-1.3mm，微柱阵列(3)结构中小柱直径为500μm-1mm，小柱高度为500-800μm，小柱间间距为50-100μm。
4.按照权利要求2所述的一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立方法，其特征在于：所述微流控芯片上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物，封接之后，经过高温高压灭菌处理，封接好的芯片用0.1％-2％浓度的PF127修饰4-24小时，用培养基清洗数次浸泡过夜备用。
5.按照权利要求1所述的一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立方法，其特征在于：步骤(2)三维类肝组织在微流控芯片上的产生；具体步骤为：
(1)人多能干细胞在二维培养中的生长密度达到70％-80％时，将原来的商业化mTESR1培养基替换为内胚层诱导培养基，内胚层诱导培养基的基础成份为商业化的RPMI-1640培养基，另外需添加占总体积1％的Knock Out Replacement(KSR)，占总体积1％的B27(100×)，占总体积1％的GlutaMax(100×)，占总体积1％的penicillin-streptomycin(100×)，以及高浓度的activin-A因子，诱导5天，形成内胚层；
(2)第5天，诱导肝特异性内胚层分化，将步骤(1)内胚层诱导培养基替换为bFGF和BMP4因子的诱导培养基，诱导3天；
(3)第8天，诱导肝前体细胞分化和增殖，将步骤(2)诱导培养基替换为HGF的诱导培养基，继续培养；
(4)第10天，将诱导的肝前体细胞消化成单细胞，离心500-800rpm，3-5min，用肝前体分化培养基重悬细胞至合适的细胞密度，细胞密度范围为2×103～6×106cells/ml，并接种至已制备好的微流控芯片中，静置培养1天，肝前体细胞在微柱阵列中聚集形成3D细胞球；
(5)第11天，待细胞成球后，将微流控芯片的灌流通道(2)连接注射器和注射泵，设置流速20-40ul/h，将芯片放入培养箱中进行灌流培养，并实时追踪，所用培养基为肝前体分化培养基，灌流培养至第13天；
(6)第13天，为促进肝细胞进一步成熟，将肝前体分化培养基替换为含有OSM因子和地塞米松(Dex)的肝细胞完全培养基(HCM，商业化)，并连续灌流5天；
(7)第18天，培养基更换为含Dex的HCM培养基，连续灌流，后续可进行长期的培养，连续培养至30-40天后，经组织形态学和功能鉴定发现可形成具有良好肝功能的异质性肝组织，此方法可模拟肝的分化和形成过程。
6.按照权利要求5所述的一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立方法，其特征在于：所述因子activin-A的浓度范围为80-120ng/ml，bFGF的浓度范围为10-20ng/ml，BMP4的浓度范围为10-20ng/ml，HGF的浓度范围为20-30ng/ml，OSM的浓度范围为10-20ng/ml，地塞米松(Dex)的浓度范围为的10-7-10-6M。
7.按照权利要求1所述的一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立方法，其特征在于：步骤(3)施加游离脂肪酸(FFAs)刺激；具体步骤为：类肝培养第23天时，施加游离脂肪酸(油酸和棕榈酸)刺激。
8.按照权利要求7所述一种基于三维类肝芯片的非酒精性脂肪肝体外模型建立方法，其特征在于：FFAs的浓度范围为0.4-1mM。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN117051072A (zh) * | 2023-10-11 | 2023-11-14 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 基于肝类器官芯片的缓解非酒精性脂肪肝活性成分筛选方法及其应用 |
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| US20150175962A1 (en) * | 2013-12-20 | 2015-06-25 | The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads | Generating hepatocytes |
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| CN110885779A (zh) * | 2018-09-07 | 2020-03-17 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于器官芯片的三维类肝组织模型构建方法 |
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2020
- 2020-05-26 CN CN202010453269.0A patent/CN113717850A/zh active Pending
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