CN108865969B - Mapk/pkc信号通路激活剂促进人类胆管细胞分化和成熟 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了将定向内胚层干细胞诱导而形成肝内胆管样细胞的方法，所述方法包括使定向内胚层干细胞定向诱导形成肝向内胚层细胞，以及使肝向内胚层细胞在小分子化合物和MAPK/PKC信号通路激活剂的定向作用下，分化形成人类胆管样细胞。本发明还提供了通过所述方法获得的人类胆管样细胞。

Description

MAPK/PKC信号通路激活剂促进人类胆管细胞分化和成熟
技术领域
本发明涉及将人类多能干细胞诱导分化形成肝内胆管样细胞的方法。特别地，本发明涉及将人类诱导多能干细胞定向诱导为定向内胚层干细胞，再进一步诱导而形成肝内胆管样细胞的方法。
背景技术
由于肝内胆管疾病病理研究、药物筛选及疾病治疗的需要，通过将人类多能干细胞高效地诱导得到成熟的、功能完善的肝内胆管样细胞是极其重要且急迫的。
目前多个研究组陆续发表了将人类多能干细胞诱导分化形成肝内胆管样细胞的方案。Sampaziotis F等人从人类诱导多能干细胞(hiPSC)开始，通过加有Activin-A、FGF2、BMP4和Ly294002的CDM培养基诱导3天形成定向内胚层细胞(DE)；随之，更换为含有Activin-A的RPMI培养基，5天后得到前肠前体细胞(FP)；随后在加有SB和BMP4的RPMI培养基定向诱导4天后得到肝母细胞(HB)；肝母细胞经由FGF10、RA和Activin-A的RPMI培养基培养4天后得到胆管前体细胞(CP)；最终，胆管前体细胞在含有EGF的William’s E培养基及细胞外基质Matrigel中培养10天后得到胆管样细胞(参见Sampaziotis F,Cardoso de BritoM,Madrigal P,Bertero A,Saeb-Parsy K,Soares FA,Schrumpf E,et al.Cholangiocytesderived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling anddrug validation.Nat Biotechnol 2015；33:845-852.)。Ogawa M等人从人类多能干细胞开始，在加有Activin和CHIR的RPMI培养基中培养1天，随后在只含有Activin的RPMI培养基中培养6天后形成定向内胚层细胞；在含有bFGF和BMP4的H16DMEM培养基中培养6天后得到肝向内胚层细胞；进一步在含有HGF、Dex和OSM的H16DMEM/Ham’s F12(3:1)培养基中诱导12天后得到肝母细胞；最后，在含有HGF、EGF和TGFβ的H16DMEM/Ham’s F12(3:1)培养基与OP9滋养层细胞共同作用3-9天后得到胆管样细胞(参见Ogawa M,Ogawa S,Bear CE,Ahmadi S,Chin S,Li B,Grompe M,et al.Directed differentiation of cholangiocytes fromhuman pluripotent stem cells.Nat Biotechnol 2015；33:853-861)。这些方案通过逐步利用不同的培养条件、小分子化合物及处理顺序和时间，得到了不同成熟程度的肝内胆管样细胞，其高表达一些胆管细胞标志基因，并且在一定程度上具有类似于体内胆管的功能。
同时，这两个研究小组分别利用各自建立的诱导方案成功地将来自肝内胆管囊性纤维化(CF)病人成纤维细胞重编程所得多能干细胞定向诱导分化形成肝内胆管样细胞，且这些细胞能够在一定程度上模拟囊性纤维化的病理特征，例如囊形成缺陷及胆管腔中氯化物分泌减少等。通过利用这个病理模型，他们发现实验性的囊性纤维化药物VX809能够在一定程度上促进囊形成且增加氯化物向胆管腔中分泌，从而改善囊性纤维化病症。但是，这些肝内胆管样细胞诱导方案及诱导得到的肝内胆管样细胞具有以下不足之处，这也限制了其应用的范围及可靠性。
(1)胆管样细胞诱导分化效率低、纯度低，且所需诱导时间长(>26天)，成本高；(2)胆管样细胞与来自成体肝脏的成熟肝内胆管细胞在基因表达谱上存在明显差异，其高表达未成熟肝内胆管细胞的标志基因，而与成熟肝内胆管细胞相关的基因的表达量低或并不表达；(3)胆管样细胞与来自成体肝脏的成熟肝内胆管细胞相比，其功能并不完善，且并不成熟，包括低酶活性(碱性磷酸酶(ALP)和γ谷氨酰转肽酶(γ-GGT)等)、低CFTR介导的氯化物转运活性及有限的激素(secretin和somatostainin)响应活性等，表明胆管样细胞并不成熟；(4)由于目前已有的肝内胆管样细胞体外诱导方案所采用的小分子化合物种类不同，其添加顺序及处理时间也各异，甚至有的方案还需要加入滋养层细胞，表明这些方案并不是完全模拟肝内胆管正常发育过程而进行的，进而导致诱导分化形成的胆管样细胞并不能完全反映体内胆管的生理及病理特征；(5)胆管样细胞缺少体内(模式动物和人)功能验证。
发明内容
本发明使用的试剂的中文名称及其对应的英文缩写形式如表1所示。
表1：试剂名称中英文对照表
Figure BDA0001292168880000031
本发明的第一方面提供了一种改进的制备人类肝内胆管样细胞的方法，所述方法使用MAPK/PKC信号通路激活剂诱导肝向内胚层细胞分化形成人类肝内胆管样细胞。
本发明的制备人类肝内胆管样细胞的方法，可包括以下步骤：
(i)使定向内胚层干细胞经由小分子化合物的定向诱导形成肝向内胚层细胞；和
(ii)使肝向内胚层细胞在小分子化合物和MAPK/PKC信号通路激活剂的定向作用下，分化形成人类肝内胆管样细胞。
在一个具体实施方案中，其中所述步骤(i)中的小分子化合物为bFGF/BMP4/TGFα/EGF/VEGF/HGF，所述步骤(ii)中的小分子化合物为EGF/TGFβ/HGF。
在一个具体实施方案中，使用本发明的制备人类肝内胆管样细胞的方法得到的人类肝内胆管样细胞是成熟的人类肝内胆管样细胞。
在一个具体实施方案中，本发明方法中使用的MAPK/PKC信号通路激活剂为(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-五二烯酰基氨基)苯并内酰胺(TPPB)。
在一个具体实施方案中，本发明方法中所述定向内胚层干细胞由人类诱导多能干细胞(iPSC)制备得到。
在一个具体实施方案中，本发明方法中使肝向内胚层细胞分化形成人类肝内胆管样细胞以二维或三维的培养方式进行。
本发明另一方面提供了通过本发明改进的方法获得的人类肝内胆管样细胞。
本发明的再一方面提供了MAPK/PKC信号通路激活剂用于制备人类肝内胆管样细胞的用途。
在一个具体实施方案中，其中所述MAPK/PKC信号通路激活剂为(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-五二烯酰基氨基)苯并内酰胺(TPPB)。
附图说明
图1为本发明由定向内胚层干细胞制备人类胆管样细胞的流程图。
图2为通过单细胞转录组测序(单细胞RNA-seq)的主要组分分析(PCA)图，其中PC1和PC2分别为最主要的两个主要组分。
图3为通过实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定的不同标志基因在各类细胞中的表达量。使用TATA盒子结合蛋白(TBP)基因作为内参基因。所述各类细胞分别为：EPC：定向内胚层干细胞；HC：肝向内胚层细胞；CHO：肝内胆管样细胞；HIB：人类原代胆管上皮细胞；ADL：新鲜分离的人类肝实质细胞。
图4为肝内胆管样细胞的免疫荧光染色图。其中第一行从左至右分别表示：DAPI、SOX9、CK7和前三张图的叠加图；第二行从左至右分别表示：DAPI、SOX9、CK19和前三张图的叠加图；第三行从左至右分别表示：DAPI、HNF4A、CK7和前三张图的叠加图；第四行从左至右分别表示：DAPI、ZO-1、CFTR和前三张图的叠加图。
图5为通过荧光显微镜观察到的第6天的肝向内胚层细胞在包含或不包含TPPB的条件下培养9天后的形态特征，其中绿色荧光为所述细胞恒定表达的绿色荧光蛋白(GFP)。
具体实施方式
本发明首先从人类诱导多能干细胞(iPSC)制备定向内胚层干细胞(EP细胞)，然后诱导定向内胚层干细胞，使其分化为肝内胆管样细胞。EP细胞具有以下突出特点，使从EP细胞开始的定向诱导具有优势：(一)在体外无血清培养条件下，具有体外无限增殖的潜力(>1016倍)；(二)所有细胞同步停留在内胚层阶段；(三)在一定的定向诱导条件下可以在体外继续高效分化成各种具有功能的内胚层细胞类群，包括功能胰腺β细胞，功能肝细胞、肝导管细胞、肠上皮细胞、胸腺上皮细胞、肺上皮细胞等；(四)分化成下游内胚层细胞类群的效率远高于直接从PSCs出发的情况；(五)不具有分化成外胚层和中胚层的能力，从而保证了分化成的内胚层细胞类群的纯度，并且有利于研究胚层之间相互作用及体外多胚层共培养的效果；(六)EP细胞及其分化后的细胞类群在体内不成瘤；(七)可以从任何多能干细胞系分化获得；(八)极大程度地降低不同细胞株由于遗传和表观状态的差别造成的分化效率差异。
本发明以定向内胚层干细胞为出发点，经由小分子化合物bFGF/BMP4/TGFα/EGF/VEGF/HGF的定向诱导6天形成肝向内胚层细胞(Hepatic endoderm)。之后我们采用两种方法制备人类胆管样细胞：1)以二维的贴壁培养方式，在EGF/TGFβ/HGF和MAPK/PKC信号通路激活剂TPPB的定向作用下，肝向内胚层细胞在短短6天内即可形成高纯度人类胆管样细胞，此方法并不依赖高浓度的基质胶(Matrigel)，所得人类胆管样细胞具有更好的人类胆管细胞特性，因此我们能够体外规模化制备人类胆管样细胞；2)以三维的培养方式，在EGF/TGFβ/HGF和TPPB的定向作用下，肝向内胚层细胞在较短的时间内(6天)即可形成人类胆管样细胞，并伴随管状结构的形成，可直接进行胆管体外功能的验证，但此方法依赖高浓度的基质胶，因此规模化制备受限，仅适用于小规模应用。
现有肝内胆管样细胞诱导方案的缺陷主要是由于我们对调控肝内胆管分化与成熟的分子机理的认识并不完善造成的。我们通过利用单细胞测序技术在全转录组水平上对小鼠肝脏早期发育过程中肝胆细胞分化发育研究发现，MAPK/PKC信号通路在肝内胆管分化发育过程中被特异地激活。进一步通过早期胚胎肝脏体外培养及诱导实验证明，MAPK/PKC激活剂的应用能够促进肝内胆管细胞的分化和成熟。因而，我们发现了一条全新的能够促进肝内胆管分化和成熟的信号通路。重要的是，我们通过在肝内胆管样细胞体外诱导体系中加入MAPK/PKC激活剂能够有效、快速地得到更成熟、功能更完善的肝内胆管样细胞，并且证明其在肝内胆管及肝脏损伤修复过程中发挥重要的作用。
本发明以定向内胚层干细胞(EP细胞)为起点进行诱导分化，所述定向内胚层干细胞获得自人类诱导多能干细胞。然而，需要理解的是，定向内胚层干细胞的来源不限于人类诱导多能干细胞，还可来自其他细胞系(例如H9细胞系)。
以下实施例用于示例性地说明本发明。
实施例1：TPPB对小鼠肝内胆管细胞分化和成熟的作用
1)小鼠肝内胆管细胞分化发育
8至12周的C57BL/6品系雌鼠和C3H品系雄鼠来自于维通利华公司(北京)，交配得到的子代小鼠(B6C3F1)用于后续实验。六周左右的B6C3F1雌鼠与八至十二周的B6C3F1雄鼠交配，第二天早上查到阴道栓则记为胚胎发育(E)0.5天。所有小鼠都饲养在23±2℃、12小时昼夜交替的无菌环境中，以高压灭菌过的食物和水喂食。所有小鼠实验都严格按照北京大学实验动物中心管理条例执行。
取小鼠胚胎发育(E)10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5和17.5天总共7个时间点的肝芽或胎肝，用适量0.25％胰蛋白酶-EDTA于37℃消化至单细胞悬液，加入等量体积的胎牛血清(FBS)终止消化；用特定的荧光基团连接的膜表面标志蛋白抗体(DLK-FITC和EpCAM-APC)标记细胞后，通过流式细胞分选的方法收集特定类型的肝胆单细胞于裂解液中；再利用Smart-seq2的方法(Picelli et al.,2014)得到cDNA，用TruePrep DNA Library PrepKit制备单细胞测序文库，通过Illumina HiSeq 2500平台测序得到单端51bp读段；最后通过主要组分分析(PCA)方法确定肝胆细胞类型并确认肝内胆管细胞分化路径及特点。
2)E12.5小鼠肝叶培养及TPPB诱导
取E12.5小鼠肝叶并放置于包含有2ml培养基(RPMI 1640培养基内加入10％FBS、1×青霉素-链霉素、1×ITS-X和50ng/ml EGF，包含或不包含0.5μM TPPB和/或10μM U0126(MAPK/PKC信号通路下游MEK1/2抑制剂))的12孔板中的Nuclepore Track-Etch Membranes(Whatman)上培养2天。然后利用上述1)中的方法进行单细胞测序及分析。
3)结果分析
如图2所示，通过单细胞转录组测序(单细胞RNA-seq)的主要组分分析(PCA)表明，MAPK/PKC信号通路激活剂TPPB促进小鼠肝内胆管细胞分化和成熟。图2中的2个最主要组分分别为PC1和PC2，符号“+”和“×”分别表示胚胎发育(E)10.5-17.5小鼠体内原代肝母细胞/肝实质细胞和原代肝内胆管细胞。TPPB能够促进肝内胆管细胞分化和成熟(黑色圆形)。U0126(MAPK/PKC信号通路下游MEK1/2抑制剂)能够抑制TPPB对肝内胆管发育的促进作用(黑色正方形)，表明TPPB通过MAPK/PKC信号通路发挥作用。
实施例2：人类定向内胚层干细胞的制备和维持培养
使用Gadue等人在WO 2012/178215 A1中公开的方法，从人类诱导多能干细胞(iPSC)制备定向内胚层干细胞(EP细胞)。将人类诱导多能干细胞(iPSC)(购自上海中乔新舟生物科技有限公司)在含有谷氨酰胺(2mM)、MTG(4.5×10-4M)、激活素A(100ng/ml)和CHIR99021(2M)的RPMI培养基内诱导1天，随后在含有谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸(50g/ml)、MTG(4.5×10-4M)、bFGF(5ng/ml)和激活素A(100ng/ml)的RPMI培养基内定向诱导2天，最后在含有谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸(50g/ml)、MTG(4.5×10-4M)、bFGF(5ng/ml)和激活素A(100ng/ml)的SFD培养基内定向诱导2天。利用流式细胞分选的方法分选出CXCR4+/CD117+细胞，即得到人类定向内胚层干细胞。
将所得的定向内胚层干细胞在用基质胶原液(BD Biosciences)包被且以小鼠成纤维细胞(Swiss Webster)做为滋养细胞(50万/58cm2)的培养皿上，在含有BMP4(50ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、VEGF(10ng/ml)和EGF(10ng/ml)的SFD培养基(73％IMDM、25％Ham’sF12、1％B27、0.5％N2和0.5％BSA)中扩增，同时保持内胚层的相关特性。
实施例3：定向内胚层干细胞的肝向内胚层定向分化
定向内胚层干细胞以悬浮培养方式进行肝向分化，细胞密度为100万/ml分化培养基(含有BMP4(50ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、VEGF(10ng/ml)、EGF(10ng/ml)、TGFα(10ng/ml)、HGF(25ng/ml)、Dex(40ng/ml)、谷胺酰胺(2mM)、抗坏血酸(50g/ml)和MTG(4.5×10-4M)的SFD培养基)，于每3ml培养基内加入100μl基质胶原液和预冷的细胞悬液进行充分混匀后置于低吸附培养皿内定向分化，分化时长6天，每2天更换培养基一次。
实施例4：肝向内胚层的肝内胆管样细胞二维定向分化
将第6天所得的肝向内胚层细胞在含有EGF(50ng/ml)、TGFβ(5ng/ml)、HGF(25ng/ml)、TPPB(0.5μM)、Dex(40ng/ml)、谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸(50g/ml)和MTG(4.5×10-4M)的BDM培养基(William’s E培养基内加入10mM烟酰胺、17mM碳酸氢钠、6.3mM丙酮酸钠、14mM葡萄糖、20mM HEPES和ITS+premix)，以二维贴壁的方式移入由基质胶(1:3)包被的培养皿内，进行为期3-9天的定向分化，每2天更换培养基一次。
实施例5：肝向内胚层的肝内胆管样细胞三维定向分化
将包裹于40％基质胶的第6天的肝向内胚层细胞置于12孔transwell内(200μl/孔)，37℃固化2小时，随后在含有EGF(50ng/ml)、TGFβ(5ng/ml)、HGF(25ng/ml)、TPPB(0.5μM)、Dex(40ng/ml)、谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸(50g/ml)和MTG(4.5×10-4M)的BDM培养基内，进行为期3-9天的定向分化，每2天更换培养基一次。
实施例6：肝内胆管样细胞的实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)鉴定
通过RT-qPCR对二维定向分化得到的肝内胆管样细胞进行分析。总RNA利用RNA微量提取试剂盒(Ambion)制备，并取用500ng-1μg RNA，利用随机引物及Oligo(dT)进行cDNA反转录。使用以下表2中的引物，利用SYBR Green荧光染料(Roche)插入的方法进行各标志基因的RT-qPCR鉴定。所得结果利用管家基因TATA盒子结合蛋白(TBP)基因进行均一化。
表2：使用的引物的序列
Figure BDA0001292168880000081
Figure BDA0001292168880000091
实验结果如图3所示，实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)结果显示本发明二维定向分化所得的肝内胆管样细胞几乎不表达肝母细胞基因AFP及肝实质细胞基因ALB和HNF4A，而高表达肝内胆管细胞基因SOX9、CK19、NOTCH2、CK7和AQP1，并且表达水平与原代胆管上皮细胞相近。TBP为内参基因。
同样，对通过三维培养方式得到的肝内胆管样细胞进行RT-qPCR鉴定，得到与上述结果相同的实验结果。
实施例7：肝内胆管样细胞的免疫荧光染色鉴定
对于二维定向分化产生的肝内胆管样细胞，吸去培养皿中的培养基，加入37℃预热过的PBS，洗三次，每次20分钟；用4％多聚甲醛(PFA)37℃固定过夜；吸去固定液，用PBS洗三次，随后用0.3％Triton-X100室温通透30分钟；吸去通透液，用PBS洗三次；此后，用3％BSA室温封闭2小时；吸去封闭液，加入按比例稀释过的一抗(下表3中1-6的抗体，所用抗体均稀释于加入0.2％BSA+0.05％Triton-X100的PBS中)，室温过夜；用PBS洗过后，加入按比例稀释过的二抗(下表3中7-11的抗体)，室温处理2小时；用PBS洗过后，加入DAPI(ProlongGold Antifade reagent with DAPI，Invitogen)，10分钟后洗去；最后，用倒置荧光显微镜观察、记录。实验中使用的具体抗体信息见下表3。
表3：免疫荧光染色中使用的抗体
Figure BDA0001292168880000101
实验结果如图4所示，免疫荧光染色结果显示本发明所得的肝内胆管样细胞高表达胆管命运和功能相关蛋白SOX9、CK19、CK7、ZO-1和CFTR，并且具有正确的细胞定位，但不表达肝实质细胞蛋白HNF4A。
同样，对通过三维培养方式得到的肝内胆管样细胞进行免疫荧光染色鉴定，得到与上述结果相同的实验结果。
实施例8：肝内胆管样细胞形态观察
为了直接观察胆管样细胞在诱导过程中的形态变化，并探究TPPB在胆管样细胞诱导分化中的作用，我们首先构建了恒定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人类诱导多能干细胞，具体步骤包括：依据替代人基因组内AAVS位点编码区内序列来设计基因靶向载体，该基因靶向载体包括绿色荧光蛋白(GFP)编码及SV40聚腺嘌呤序列，同时含有由TK启动子控制的新霉素筛选基因，在此盒子5’和3’两端各含有2k长度的同源臂序列用于定点整合；将此靶向载体与含有导向RNA的CAS9剪切质粒同时以脂质体方式转入人类诱导多能干细胞内，次日进行阳性克隆药物筛选；12天后，挑取细胞单克隆进行分离与扩增，并利用聚合酶链式反应(PCR)与DNA原位杂交(Southern blot)方法验证所得克隆的正确性。得到绿色荧光蛋白基因修饰的人类诱导多能干细胞后，我们将按照上述二维定向分化方法进行肝内胆管样细胞诱导实验，得到绿色荧光蛋白基因修饰的肝内胆管样细胞。使用倒置荧光显微镜进行观察。
实验结果如图5所示，与对照组相比，TPPB显著增加了第6天肝向内胚层细胞在二维培养条件下培养9天后诱导形成的胆管样细胞的数目，并促进了胆管样细胞管状结构的形成。
同样，对于通过三维培养方式得到的绿色荧光蛋白基因修饰的肝内胆管样细胞，可观察到相同的结果。
讨论
我们在已有的肝内胆管样细胞诱导方案中加入MAPK/PKC信号通路激活剂TPPB。初步结果表明，MAPK/PKC信号通路的激活能够有效地促进更成熟的胆管样细胞的分化形成及形态建成(图3-5)，并极大地缩短了诱导所需时间。
特别地，我们是以定向内胚层干细胞为起始细胞向胆管样细胞诱导的。实验表明，几乎所有类型的人类多能干细胞都能够被诱导形成定向内胚层干细胞。并且，定向内胚层干细胞能够更便捷、更高效地向胆管样细胞分化，从而提高了诱导效率。
此外，已有的肝内胆管样细胞诱导方案必须是在三维培养条件下实现的。但通过三维培养可得到的细胞数目有限，只可用于小规模实验，限制了其应用。我们发现，TPPB能够促进二维培养下胆管样细胞的形成，且这些细胞具有和三维培养得到的胆管样细胞相似的基因表达水平和性质。因此，我们能够通过TPPB在二维培养条件下实现胆管样细胞的规模化生产，这对于肝内胆管发育学研究、胆管疾病模型的构建和药物筛选、以及大规模制备胆管样细胞用于3D打印肝脏器官有重要的意义。
序列表
<110> 北京大学
中国科学院上海生命科学研究院
<120> MAPK/PKC信号通路激活剂促进人类胆管细胞分化和成熟
<130> CP1170290P/CB
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> AFP-F
<400> 1
ctacctgcct ttctggaaga actttg 26
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> AFP-R
<400> 2
gatcgatgct ggagtgggct tt 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> ALB-F
<400> 3
gtgaaacaca agcccaaggc aaca 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> ALB-R
<400> 4
tcctcggcaa agcaggtctc 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> HNF4A-F
<400> 5
tccaacccaa cctcatcctc cttct 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> HNF4A-R
<400> 6
tcctctccac tccaagttcc tgtt 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> SOX9-F
<400> 7
gagctcgaaa ctgactggaa a 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> SOX9-R
<400> 8
cttctcttct cctcctgcaa ag 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> CK19-F
<400> 9
tttgtgtcct cgtcctcct 19
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> CK19-R
<400> 10
ggttctgcat ggttagcttc t 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> NOTCH2-F
<400> 11
gcctgagcct ttgaagca 18
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> NOTCH2-R
<400> 12
ttctcggtcg cctcctc 17
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> CK7-F
<400> 13
catccctgct tggactgaaa 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> CK7-R
<400> 14
ggccaccttt ctctgctg 18
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> AQP1-F
<400> 15
ccatactgta gacactctga caag 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> AQP1-R
<400> 16
cccataagag gcttgaccat 20
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> TBP-F
<400> 17
ttgctgagaa gagtgtgctg gagatg 26
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<223> TBP-R
<400> 18
cgtaaggtgg caggctgttg tt 22

Claims (7)

1.一种制备人类肝内胆管样细胞的方法，所述方法使用MAPK/PKC信号通路激活剂诱导肝向内胚层细胞分化形成人类肝内胆管样细胞，其中所述MAPK/PKC信号通路激活剂为(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-五二烯酰基氨基)苯并内酰胺(TPPB)。
2.权利要求1的方法，包括以下步骤：
(i)使定向内胚层干细胞经由小分子化合物的定向诱导形成肝向内胚层细胞；和
(ii)使肝向内胚层细胞在小分子化合物和MAPK/PKC信号通路激活剂的定向作用下，分化形成人类肝内胆管样细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述步骤(i)中的小分子化合物为bFGF、BMP4、TGFα、EGF、VEGF和HGF，所述步骤(ii)中的小分子化合物为EGF、TGFβ和HGF。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述人类肝内胆管样细胞是成熟的人类肝内胆管样细胞。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述定向内胚层干细胞由人类诱导多能干细胞(iPSC)制备得到。
6.权利要求2或3的方法，其中步骤(ii)以二维或三维的培养方式进行。
7.MAPK/PKC信号通路激活剂用于制备人类肝内胆管样细胞的用途，其中所述MAPK/PKC信号通路激活剂为(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-五二烯酰基氨基)苯并内酰胺(TPPB)。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111304147A (zh) * 2018-12-11 2020-06-19 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 利用内胚层干细胞规模化制备功能性胆管细胞的方法及其应用
CN111394297A (zh) * 2018-12-17 2020-07-10 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 内胚层干细胞规模化制备功能性肝母细胞与肝实质细胞的方法及其应用
CN111334462B (zh) * 2018-12-18 2023-03-21 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 抑制egf信号通路促进内胚层干细胞所得肝实质细胞的终末成熟
CN113637630B (zh) * 2020-05-11 2024-03-29 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 一种胰岛样细胞团及其制法和应用
CN112831461B (zh) * 2021-02-26 2023-08-08 澳门大学 一种诱导干细胞分化成中胚层谱系或滋养细胞谱系的方法及药物

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684454A (zh) * 2008-09-25 2010-03-31 中国科学院上海生命科学研究院 一种定型内胚层细胞的制备和分离方法
CN101962628A (zh) * 2009-07-24 2011-02-02 北京大学 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法
CN105121632A (zh) * 2013-02-18 2015-12-02 大学健康网络 由多能干细胞生成肝细胞和胆管细胞的方法
WO2017048193A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 Agency For Science, Technology And Research (A*Star) Derivation of liver organoids from human pluripotent stem cells

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684454A (zh) * 2008-09-25 2010-03-31 中国科学院上海生命科学研究院 一种定型内胚层细胞的制备和分离方法
CN101962628A (zh) * 2009-07-24 2011-02-02 北京大学 肝脏内胚层细胞及其制备和纯化方法
CN105121632A (zh) * 2013-02-18 2015-12-02 大学健康网络 由多能干细胞生成肝细胞和胆管细胞的方法
WO2017048193A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 Agency For Science, Technology And Research (A*Star) Derivation of liver organoids from human pluripotent stem cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation;Fotios Sampaziotis1 et al.;《Nat Biotechnol》;20160226;第页 845–852 *
人胚胎干细胞向肝脏样细胞诱导分化中限定性内胚层分化的研究进展;孙博等;《国际生殖健康/计划生育杂志》;20130131;第34-37页 *

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