KR20120107088A - ⅰＰＳ 세포들의 생산 및 조절 방법 및 그들의 조성물들 - Google Patents

ⅰＰＳ 세포들의 생산 및 조절 방법 및 그들의 조성물들 Download PDF

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Abstract

본 발명은 통상적인 방법들과 비교하여 증가된 유도 효율을 가지는 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포들을 생산하는 방법들을 제공한다. 본 방법은 체세포를 세포 내의 RNA 수준들 또는 활성을 변경시키는 제제 및/또는 p21 저해제와 조합하여 핵 재프로그램화 인자로 처리하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명은 이러한 방법들에 의해 생성된 iPS 세포들뿐만 아니라 이러한 iPS 세포들의 임상적 및 연구적 용도들을 제공한다.

Description

ⅰＰＳ 세포들의 생산 및 조절 방법 및 그들의 조성물들{METHOD FOR GENERATION AND REGULATION OF iPS CELLS AND COMPOSITIONS THEREOF}
본 발명은 일반적으로 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포들의 기술분야에 관한 것이고, 보다 상세하게는 체세포들로부터 나온 이러한 세포들을 생산하는 방법들뿐만 아니라 이러한 방법들에 의해 생산된 iPS 세포들의 임상적 및 연구적 용도들에 관한 것이다.
유도된 다능성 줄기세포들 (induced pluripotent stem cells, iPSCs)는 배아 줄기 (embryonic stem, ES) 세포들의 특징을 나타내고, 본래 마우스 체세포들에서는 네 가지의 핵 재프로그램화 인자들 (4F): Oct4, Sox2, Klf4 및 cMyc의 이소성 (ectopic) 발현에 의해 생성되어 왔다. 인간 세포들에서는 iPSCs가 본래의 네 가지 야마나카 인자들 (Yamanaka factors)을 제외하고, 네 가지의 인자들 예를 들어 Oct4, Nanog, Lin28 및 Sox2 세트의 대안으로도 역시 생성될 수 있다. 서로 다른 조직들로부터 나온 많은 세포 유형들이 재프로그램 가능한 것으로 입증되어 오긴 했지만, iPSC 유도 (derivation) 및 심화된 치료적 용도에 주요 장애물은 전형적으로 0.01%으로부터 0.2%까지에 이르는 재프로그램화 (reprogramming)의 낮은 효율이다. 막대한 노력들이 재프로그램화 효율을 증진하는 소분자를 검색하는 것뿐만 아니라 새로운 iPSC 유도 방법들을 개발하는 것에 중점을 두어왔지만, 일차 섬유모세포들이 ES-유사 상태로 재프로그램화 되는 기작들은 여전히 거의 알려져 있지 않다.
세포성 재프로그램화의 기작을 이해하기 위하여, 다른 접근법들이 사용되어 왔다. 소분자에 근거한 방법들은 세포들을 Dnmt1 저해제들로 처리하여 재프로그램화 공정이 가속될 수 있는 점을 확인시켜 주었다. TGFβ 저해도 역시 Sox2 및 cMyc을 대체할 수 있는 iPSCs의 더 신속하고 더 효율적인 유도를 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다. 또한 어레이 분석법 (array analysis)은 부분적으로 재프로그램화된 iPSCs가 메틸 전이효소 (methy transferase) 저해제들과 같은 인자들로의 처리가 제공될 때, 전적으로 재프로그램화 되도록 더욱 강요될 수 있는 점을 보여주었다. 네 가지의 재프로그램화 인자들에 의한 프로모터 결합 및 발현 유도의 게놈-범위 (genome-wide) 분석은 이들 인자들이 iPSCs 및 mES 세포들에서 유사한 표적들을 가지고, 유사한 유전자들의 세트들을 조절할 것이며, 또한 재프로그램화 인자들의 표적화 (targeting)가 부분적인 iPSCs에서는 변경되는 것을 나타낸다.
보다 최근에는, 여러 연구진들이 p53-매개성 종양 억제인자 경로들이 iPSC 유도 (induction)를 길항할 수 있는 점을 확인하였다. p53 및 그의 하류 효과기 p21 둘 다는 재프로그램화 공정 동안 유도되고 둘 다의 단백질들의 감소된 발현이 iPSC 콜로니 형성을 용이하게 할 수 있다. 이들 단백질들이 네 가지의 재프로그램화 인자들 (4F)을 발현하는 대부분의 세포들에서 상승조절되고 (up-regulated) cMyc은 p21 발현을 차단하는 것으로 보고되어 있기 때문에, 이들 네 가지 인자들 (4F)의 이소성 발현이 종양원유전자 (oncogene) /트랜스유전자들 (transgenes) 과다발현 (overexpression)에 대한 세포성 반응들을 극복하는 방식 및 세포들의 매우 작은 집단만이 전적으로 재프로그램되는 이유는 여전히 분명하지 않다.
마이크로RNAs는 RNA-유도성 침묵화 복합체 (RNA-induced silencing complex, RISC)라고 불리는 단백질 복합체와 연관된 18 내지 24개 뉴클레오타이드의 단일가닥으로 된 작은 RNAs이다. 이들 작은 RNAs는 보통 유전자 전사체들의 비코딩 부위들로부터 생성되고 해독 억제 (translational repression)에 의해 유전자 발현을 억제하도록 기능하고 있다. 최근 수년간, 마이크로RNAs는 많은 다른 것들 중에서도 인간 ES 세포들의 자가-재생 (self-renewal) 유전자 발현, 배아 줄기 (ES) 세포들의 세포 주기 조절, 대안의 스프라이싱, 심장 발생과 같은 서로 다른 많은 중요한 공정들에 관여하는 것으로 밝혀져 왔다. 또한, ES 세포-특이 마이크로RNAs는 마우스 iPSC 유도를 증진하고 재프로그램화 동안 cMyc의 기능을 대체할 수 있는 것으로도 최근에 보고되었다. hES-특이 miR-302도 역시 인간 섬유모세포에서 네 가지 인자 발현으로 인해 노화 (senescence) 반응을 완화하는 것으로 제안되었다. 그러나, 이들 마이크로RNAs가 재프로그램화 공정에서 매우 후기 단계까지 발현되지 않기 때문에, 마이크로RNAs가 iPSC 유도에서 중요한 역할을 담당하는지 여부는 여전히 알려지지 않고 있다.
본 발명은 마이크로RNAs가 iPS 유도과정 동안 관여하는 정액 (seminal) 발견을 근거로 하고 있다. 마이크로RNA 생성 (biogenesis) 기제 (machinery)의 간섭은 재프로그램화 효율의 유의한 감소를 가져온다. 재프로그램화의 초기 단계 동안 높게 유도되는 마이크로RNA 집합들 (clusters)이 확인되었으며, 기능적 시험들은 이러한 마이크로RNAs를 체세포들 내로 도입하는 과정이 유도 효율을 증진시키는 점을 보여준다. 추가적으로, 재프로그램화 세포들에 의해 사용되는 핵심 조절인자들이 유의하게 재프로그램화 효율을 증가시킬 뿐만 아니라 iPS 세포들의 분화를 인도하도록 유익하게 표적될 수 있는 것이 확인되었다.
따라서 한 가지 구현예에서, 본 발명은 iPS 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본 방법은 체세포를 핵 재프로그램화 인자 (nuclear reprogramming factor)와 접촉시키고, 또한 상기 세포를 세포 내의 RNA 수준들 또는 활성을 변경시키는 마이크로RNA와 접촉시켜서 iPS 세포를 생성하는 과정을 포함한다. 한 가지 관점에서, 마이크로RNA 또는 RNA는 변형된다. 또 다른 관점에서, 마이크로RNA는 벡터 내에 들어있다. 또 다른 관점에서, 마이크로RNA는 miR-17, miR-25, miR-106a, miR let-7 패밀리 구성원 또는 miR-302b 집합에 들어있다. 또 다른 관점에서, 마이크로RNA는 miR-93, miR-106b, miR-21, miR-29a, 또는 그들의 조합이다.
한 가지 관점에서, 마이크로RNA는 서열번호 1을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가진다. 또 다른 관점에서, 마이크로RNA는 서열번호 2 내지 11로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가진다. 또 다른 관점에서, 마이크로RNA는 p21, Tgfbr2, p53, 또는 그들의 조합의 발현 또는 활성을 조절한다. 또 다른 관점에서, 마이크로RNA는 Spry 1/2, p85, CDC42, 또는 ERK1/2 경로들을 조절한다.
한 가지 관점에서, 핵 재프로그램화 인자는 벡터 내에 포함되는 유전자에 의해 인코드된다. 또 다른 관점에서, 핵 재프로그램화 인자는 SOX 패밀리 유전자, KLF 패밀리 유전자, MYC 패밀리 유전자, SALL4, OCT4, NANOG, LIN28, 또는 그들의 조합이다. 또 다른 관점에서, 핵 재프로그램화 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC의 하나 이상이다. 또 다른 관점에서, 핵 재프로그램화 인자는 c-Myc을 포함한다. 또 다른 관점에서, 유도 효율은 마이크로RNA 없는 것과 대비하여 적어도 두 배가 된다.
한 가지 관점에서, 상기 체세포는 마이크로RNA와 접촉시키는 과정 이전에, 이와 동시에 또는 이에 이어서 상기 재프로그램화 인자와 접촉시킨다. 또 다른 관점에서, 체세포는 포유동물 세포이다. 추가적인 관점에서, 체세포는 인간세포 또는 마우스 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 체세포를 핵 재프로그램화 인자, 및 p21 발현 또는 활성의 저해제와 접촉시켜서 iPS 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 체세포를 세포 내의 RNA 수준들 또는 활성을 변경시키는 제제와 접촉시켜서 유도된 다능성 줄기 (induced pluripotent stem, iPS) 세포를 생산하는 방법을 제공하고, 여기에서 제제가 핵 재프로그램화 인자가 아니라는 조건으로, 제제는 체세포에서 다능성 (pluripotency)을 유도하여 iPS 세포를 생성한다. 다양한 구현예들에서, 상기 RNA는 마이크로RNA를 포함하는 비-코딩 RNA (ncRNA)이다.
상기 기술된 방법들의 한 가지 관점에서, 제제는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 소분자 (small molecule)이다. 추가적인 관점에서, 폴리뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드들, 폐쇄된 핵산 (locked nucleic acid, LNA), 또는 DNA이다. 또 다른 관점에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다. 추가적인 관점에서, 상기 RNA는 마이크로RNA, dsRNA, siRNA, stRNA, 또는 shRNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 관점에서, 체세포는 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)이다.
다양한 관점들에서, RNA를 변경시키는 제제는 p21, Tgfbr2, p53, 또는 그들의 조합을 저해할 수 있다. 한 가지 관점에서, 제제는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 소분자일 수 있다. 또 다른 관점에서, 제제 또는 p21, Tgfbr2, 및/또는 p53의 저해제는 마이크로RNA, dsRNA, siRNA, stRNA, 또는 shRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 분자이다. 대표적인 관점에서, 제제 또는 p21, Tgfbr2, 및/또는 p53의 저해제는 마이크로RNA 분자이고 세포 내에 도입된 재조합 벡터 내에 포함된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된다.
다양한 관점들에서, 마이크로RNA는 iPSC의 유도 또는 그의 분화과정 동안 활성 또는 발현에서의 증가 또는 감소를 나타내는 집합에 포함되는 마이크로RNA일 수 있다. 한 가지 관점에서, 유도 효율은 제제가 없는 것과 대비하여 적어도 두 배가 된다. 또 다른 관점에서, 유도 효율은 제제가 없는 것과 대비하여 적어도 세 배가 된다. 또 다른 관점에서, 유도 효율은 제제가 없는 것과 대비하여 적어도 다섯 배가 된다. 한 가지 관점에서, 마이크로RNA는 miR-93, miR-106b, miR-21, miR-29a, miR-let-7 패밀리 구성원 (예로, let-7a; miR 98) 또는 그들의 조합을 포함하는, miR-17, miR-25, miR-106a, 또는 miR-302b 집합에서 하나 이상의 마이크로RNAs일 수 있다. 관련된 관점에서, 마이크로RNA는 서열번호 1을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가지고, 이는 다양한 마이크로RNAs 예로 miR-17, miR-25, miR-106a, 및 miR-302b 집합들 내의 마이크로RNA 종 (species)에 해당하는 서열번호 2 내지 11의 것들 사이에 보존되도록 결정되었다. 한 가지 관점에서, 마이크로RNA는 서열번호 2 내지 11로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가진다.
다양한 관점들에서, 핵 재프로그램화 인자는 세포 내에 도입된 재조합 벡터 내에 포함되는 유전자에 의해 인코드된다. 또 다른 관점에서, 제제는 p21, Tgfbr2, p53, 또는 그들의 조합의 발현 또는 활성을 조절한다. 또 다른 관점에서, 제제는 Spry 1/2, p85, CDC42, 또는 ERK1/2 경로들을 조절한다.
다양한 관점들에서, 핵 재프로그램화 인자는 SOX 패밀리 유전자, KLF 패밀리 유전자, MYC 패밀리 유전자, SALL4, OCT4, NANOG, LIN28, 또는 그들의 조합의 하나 이상에 의해 인코드된다. 대표적인 관점에서, 핵 재프로그램화 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC의 하나 이상이다. 또 다른 관점에서, 핵 재프로그램화 인자의 적어도 하나는 c-Myc을 포함한다. 추가적인 관점에서,c-Myc은 적어도 하나의 miRNA를 억제하여 적어도 부분적으로 재프로그램화를 증진시킨다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 생산된 iPS 세포들 또는 이러한 세포들의 집단을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산된 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포들의 농축강화된 집단을 제공한다.
유사하게 또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 생성된 iPSC의 분화를 유도하여 유래된 분화된 세포를 제공한다. 한 가지 관점에서, 체세포는 iPSC를 RNA 분자 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 과정에 의해 분화를 유도하여 유래된다. 한 가지 관점에서, 상기 RNA 분자는 마이크로RNA, dsRNA, siRNA, stRNA, 또는 shRNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체를 본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 생성된 iPS 세포들로 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 개체의 체세포를 본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포로 유도시키고, 상기 iPS 세포의 분화를 유도하고, 또한 상기 분화된 세포를 상기 개체 내로 도입하여 병폐를 치료하는 과정을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생성된 iPS 세포 또는 이로부터 유래된 체세포를 사용하여 제제의 생리학적 기능을 평가하는 방법을 제공한다. 한 가지 관점에서, 본 방법은 본 명세서에서 기술된 방법들을 사용하여 생산된 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포를 처리하고, 또한 상기 제제로부터 유발되는 세포성 기능의 적어도 하나에서의 변화를 평가하는 과정을 포함한다. 또 다른 관점에서, 본 방법은 제제로 본 명세서에서 기술된 다능성 줄기세포의 분화를 유도하여 유래된 분화된 세포를 처리하고, 또한 상기 제제로부터 유발되는 세포성 기능에서의 변화를 평가하는 과정을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생성된 iPS 세포 또는 이로부터 유래된 체세포를 사용하여 화합물의 독성을 평가하는 방법을 제공한다. 한 가지 관점에서, 본 방법은 본 명세서에서 기술된 방법들을 사용하여 생산된 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포를 처리하고, 또한 상기 화합물의 독성을 평가하는 과정을 포함한다. 또 다른 관점에서, 본 방법은 상기 화합물로 본 명세서에서 기술된 다능성 줄기세포의 분화를 유도하여 유래된 분화된 세포를 처리하고, 또한 상기 화합물의 독성을 평가하는 과정을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본 방법은 체세포를 적어도 하나의 재프로그램화 인자와 접촉시키고; 또한 상기 세포를 발현 또는 활성을 위해 p21, Tgfbr2, p53, 또는 그들의 조합의 저해제와 접촉시키는 과정을 포함한다. 한 가지 관점에서, 상기 저해제는 p21의 발현 및/또는 활성을 저해한다. 또 다른 관점에서, 저해제는 Tgfbr2의 발현 및/또는 활성을 저해한다. 또 다른 관점에서, 저해제는 p53의 발현 및/또는 활성을 저해한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본 방법은 체세포를 세포 내의 RNA 수준들 또는 활성을 변경시키는 제제와 접촉시키는 과정을 포함하고, 여기에서 상기 제제는 핵 재프로그램화 인자가 아니라는 조건으로, 제제가 체세포에서 다능성을 유도하여 iPS 세포를 생성한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 개체의 체세포로부터 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포를 생성하고; 상기 iPS 세포의 분화를 유도하고; 또한 상기 세포를 개체 내로 도입하여 병폐를 치료하는 과정을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 iPS 세포들의 생성 효율을 증가시키는 마이크로RNA의 용도를 제공한다. 한 가지 관점에서, 마이크로RNA는 miR-17, miR-25, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-21, miR-29a, miR-302b 집합, 또는 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 관점에서, 마이크로RNA는 miR-17, miR-25, miR-106a, 또는 miR-302b 집합에 들어있다. 또 다른 관점에서, 마이크로RNA는 miR-93, miR-106b, miR-21, miR-29a, 또는 그들의 조합이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 miR-17, miR-25, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-21, miR-29a, miR-302b 집합, miR let-7 패밀리 구성원 또는 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miR 서열들의 조합을 제공한다. 또 다른 관점에서, 마이크로RNA는 miR-17, miR-25, miR-106a, 또는 miR-302b 집합에 들어있다. 또 다른 관점에서, 마이크로RNA는 miR-93, miR-106b, miR-21, miR-29a, 또는 그들의 조합이다.
도 1은 마우스 iPSC 유도에서 RNAi 기제의 관여과정을 나타낸 것이다. 도 1a, 도 1b, 및 도 1c는 마우스 RNAi 기제의 유전자들 Ago2, 드로샤 (Drosha), 및 다이서 (Dicer)의 shRNAs에 의한 녹-다운 (knock-down)을 각각 도시하고 있다. 표적된 유전자들의 mRNA 및 단백질 수준 둘 다는 막대그래프 및 해당하는 웨스턴 블럿에서 나타난 바와 같이 RT-qPCR에 의해 분석된다. 일차 마우스 배아 섬유모세포 (MEFs)는 네 가지 인자들을 더한 드로샤, 다이서 및 Ago2를 표적하는 shRNA로 형질감염된다. MEFs는 4 μg/μL 폴리브렌 (polybrene)을 더한 렌티바이러스성 shRNAs로 형질감염되고 전체 RNAs 또는 단백질들은 형질감염 이후 3일째에 수확된다. 표적된 유전자들의 mRNA 및 단백질 수준들은 RT-qPCR 및 웨스턴 블럿팅에 의해 각각 분석된다. pLKO은 shRNA 렌티바이러스성 벡터들의 경우 빈 벡터 대조군이다. pGIPZ은 비-표적화 shRNA를 발현하는 렌티바이러스성 벡터이다. 도 1d는 Ago2의 녹-다운이 OSK에 의한 iPSC 유도를 감소시키는 것을 나타낸다. 콜로니들은 염색되고 형질감염 이후 21일째에 AP에 대해 정량된다. 오차 막대는 두 벌의 웰들로부터 나온 표준 편차를 나타낸다. 도 1e는 shAgo2으로 iPSC의 GFP+ 콜로니 정량을 나타낸다. GFP+ 콜로니들은 형질감염 이후 21일째에 정량된다. 오차 막대는 두 벌의 웰들로부터 나온 표준 편차를 나타낸다. 도 1f는 Ago2의 녹-다운이 4F에 의한 iPSC 유도를 극적으로 감소시키는 것을 나타낸다. 일차 MEFs는 shRNA Ago2를 더한 재프로그램화 인자들 (OSKM (4F))을 사용하여 형질감염된다. 콜로니들은 형질감염 이후 14일째에 알칼라인 포스파타제에 대해 염색될 수 있고, 이는 mES/iPS 세포들을 위한 마커가 된다. pLKO 및 pGIPZ 벡터들은 음성 대조군들로서 역할을 한다.
도 2는 재프로그램화의 초기 단계 동안 마이크로RNA 집합들 miR-17, 25, 106a 및 302b의 유도를 나타낸 것이다. 도 2a는 네 가지 인자 형질감염 이후 초기 단계에서 10개의 마이크로RNA 집합들의 발현 유도를 도시하는 대표적인 그래프를 나타낸다. miR RT-qPCR는 ES 세포들에서 높게 발현되는 10개 집합들의 대표적인 마이크로RNAs의 발현 변화를 정량하는 데 사용된다. 시작 MEFs 및 4F를 가진MEFs로부터 나온 전체 RNAs가 감염 이후 4일째에 분석된다. 막대그래프의 진한 색 막대들은 감염 4일 이후의 MEFs를 보여주는 한편, 빈 막대들은 시작 MEFs를 보여준다. 별표들은 유도된 마이크로RNAs를 표시한다. 도 2b는 4F 형질감염 이후 4일째에 유도된 서로 다른 miR 집합들의 종자 영역 (seed region) 비교를 나타낸다. 유사한 종자 영역들은 밑줄로 표시된다. 도 2c는 마이크로RNAs 유도의 대표적인 그래프를 나타낸다. 대표적인 마이크로RNAs는 네 가지 인자들의 서로 다른 조합을 사용하여 유도될 수 있다. 마이크로RNA 발현은 형질감염후 4일 경과 이후에 정량된다. 4F, OSK, OS 및 단일 인자들이 miR 발현 변화를 부여하였던 인자들을 분석하는 데 사용된다.
도 3은 miR-93 및 miR-106b에 의한 iPSC의 증진된 유도를 나타낸 것이다. 도 3a는 재프로그램화 검정법의 스케쥴을 보여주는 대표적인 그림이다. 마이크로RNA 모방체 (mimics)가 50 nM의 최종 농도로 0일 및 5일째에 형질전환된다. GFP+ 콜로니들은 4F 유도의 경우 11일째 또한 OSK 세 가지 인자 iPSC 유도의 경우 15 내지 20일째에 정량된다. 도 3b는 miR-93 및 miR-106b 모방체가 4F 유도로 iPSC 유도를 증진시키는 것을 보여주는 대표적인 그래프이다. Oct4-GFP MEFs는 50 nM 표시된 마이크로RNAs로 형질전환된다. GFP+ 콜로니는 형질전환 이후 11일째에 정량된다. 배가-유도 및 오차 막대들은 세 벌의 웰들을 사용하는 세 번의 독립적인 실험들로부터 계산되었다. 도 3c는 OSK 시스템을 사용하여 miR-93 및 miR-106b의 증진효과의 확인을 보여주는 대표적인 그래프이다. 마이크로RNA 모방체들은 4F 실험들에서와 같이 형질전환된다. GFP+ 콜로니는 형질전환 이후 15 내지 20일째에 정량된다. 오차 막대들은 세 벌의 웰들로부터 나온 표준 편차를 나타낸다. 도 3d는 재프로그램화 효율에 미치는 마이크로RNAs의 저해 효과를 보여주는 대표적인 그래프이다. miR-93 및 miR-106b의 저해제들은 재프로그램화 효율을 극적으로 감소시킨다. 마이크로RNA 저해제들도 역시 50 nM의 농도로 형질전환되고 miR 모방체 형질전환과 동일한 실험적 스케쥴을 유지한다. 오차 막대들은 세 벌의 웰들로부터 나온 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 miR 모방체 실험들로부터 유래된 iPSC 클론들의 특성분석을 나타낸 것이고, 여기에서 발현은 서로 다른 내인성 ES 마커들의 RT-PCR에 의해 분석된다. 전체 RNAs는 계대 이후 3일째에 iPS 세포주들로부터 분리되었다. Eras, ECat I, Nanog와 같은 ES 세포-특이 마커들, 및 내인성 Oct4 발현은 RT-PCR에 의해 분석된다.
도 5는 miR-93 및 miR-106b에 의한 마우스 p21 및 Tgfbr2의 표적화를 나타낸 것이다. 도 5a는 miR-93 및 106b 형질전환이 p21 단백질 수준들을 감소시키는 것을 나타낸다. Oct4-GFP MEFs는 50 nM miR 모방체들로 형질전환되고 웨스턴 분석을 위해 형질전환 48시간 이후에 수확된다. 액틴이 로딩 대조군으로서 사용된다. 도 5b는 p21이 siRNA에 의해 효율적으로 녹-다운되는 것을 나타낸다. P21 siRNA- 및 대조군-형질전환된 MEFs는 48시간 경과시 수확되고 RT-qPCR 및 웨스턴 블럿팅이 p21 발현을 확인하도록 착수된다. p21 mRNAs는 GAPDH으로 정상화된다. 도 5c는 siRNA에 의한 p21의 녹-다운이 iPSC 유도를 증진시키는 것을 나타낸다. MEFs는 4F 바이러스로 감염되고, siRNAs는 마이크로RNAs 모방체 형질전환과 동일한 스케쥴을 이어서 형질전환된다. GFP+ 콜로니들은 11일째에 정량된다. 오차 막대들은 세 벌의 웰들을 사용한 적어도 두 번의 독립적인 실험들을 나타낸다. 도 5d는 miR-93 및 106b 형질전환이 Tgfbr2 발현을 감소시키는 것을 나타낸다. 형질전환된 세포들은 웨스턴 블럿팅을 위해 48시간 경과 시 수확된다. 도 5e는 Tgfbr2가 siRNAs에 의해 녹-다운되는 것을 나타낸다. 상대적인 Tgfbr2 mRNA 수준들은 Gapdh의 수준으로 정상화된다. 도 5f는 siRNAs에 의한 Tgfbr2의 녹-다운이 iPSC 유도를 증진시키는 것을 나타낸다. 오차 막대들은 세 벌의 웰들을 사용한 적어도 세 번의 독립적인 실험들을 나타낸다.
도 6은 마이크로RNAs에 의한 재프로그램화의 증진을 나타낸 것이다. 도 6a는 miR-17 및 miR-106a가 재프로그램화 효율을 증진시킬 수 있지만 miR-16은 그렇지 않은 것을 나타낸다. MiR-17 및 miR-106a 모방체들은 50 nM의 최종 농도로 MEFs 내로 형질전환된다. GFP+ 콜로니들은 형질감염 이후 11일째에 정량된다. 오차 막대들은 세 벌의 웰들을 사용한 두 번의 독립적인 실험들을 나타낸다. 도 6b는 miR-17 및 106a가 p21을 표적하는 것을 나타낸다. p21 웨스턴 블럿팅은 마이크로RNA 모방체들을 MEFs 내로 형질전환하고 2일 이후에 수행된다. miR-17 및 miR-106a는 Tgfbr2 발현을 표적한다. 마이크로RNA 모방체들은 50 nM의 최종 농도로 MEFs 내로 형질전환된다. 도 6c는 miR-17 및 106a가 Tgfbr2를 표적하는 것을 나타낸다. 웨스턴 블럿팅은 형질전환하고 2일 이후에 수행된다. 도 6d는 iPSC 유도과정 동안 마이크로RNAs의 역할 모델을 나타낸다. miR-17, 25 및 106a 집합들을 포함하는 여러 가지의 마이크로RNAs는 재프로그램화의 초기 단계들 동안 유도된다. 이들 마이크로RNAs는 p21 및 기타 미확인된 단백질들과 같은 공정을 길항하는 인자들을 표적하여 완벽한 재프로그램화를 용이하게 한다. 상승 및 하강은 재프로그램화 공정 동안 서로 다른 잠재적인 단계들 및 장벽들을 나타내고, 점선은 재프로그램화된 세포들에서 마이크로RNAs 유도 시 낮아지는 재프로그램화의 장벽들을 표시한다.
도 7은 마우스 iPSC 유도 시 miR-93 및 miR-106b의 용량 반응을 나타내는 모식적 그래프를 나타낸 것이다. Oct4-GFP MEFs는 마이크로RNAs의 서로 다른 농도들로 (5, 15 및 50 nM) 형질전환된다. 모방체 대조군 siRNA가 대조군으로서 사용된다. GFP+ 콜로니들은 형질감염 이후 11일째에 정량된다. 결과는 12-웰 플레이트들에 있는 세 벌의 웰들을 나타낸다.
도 8은 iPSC 유도 동안 유도된 p21 발현을 나타낸 것이다. 도 8a는 서로 다른 시스템들을 사용하는 p21 발현의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다 (왼쪽부터 오른쪽까지: OSKM, OSK, OS, Klf4, cMyc, 및 MEF 대조군). p21 발현은 Klf4 및 cMyc에 의해 유도된다. 4F, OSK, OS, Klf4 및 cMyc으로 감염된 MEFs는 웨스턴 블럿팅 분석을 위해 형질감염 이후 5일째에 수확되었다. 도 8b는 감염된 MEFs에서 서로 다른 트랜스유전자들의 발현 검증을 보여주는 모식적 그래프를 나타낸다.
도 9는 p21 과다발현에 의해 OSK 세 가지 인자들을 사용한 재프로그램화의 저해를 나타낸 것이다. 도 9a는 OSK 유도 및 p21 과다발현으로부터 나온 iPSC의 Ap+ 콜로니 정량의 모식적 그래프이다. 유도된 세포들은 21일째에 알칼라인 포스파타제에 대해 염색되었다. p21 바이러스는 OSK와 동시에 도입된다. 도 9b는 OSK 유도 및 p21 과다발현으로부터 나온 iPSC의 GFP+ 콜로니 정량의 모식적 그래프이다.
도 10은 miRNAs에 의한 p21 발현의 직접적인 조절을 나타낸 것이다. 도 10a는 p21 mRNA 3'UTR에서 발견되는 두 가지의 잠재적인 부위들을 보여주는 대표적인 그림이다. 돌연변이들이 miR-93 및 106b의 결합 친화도를 파괴하도록 첫 번째 부위 (보존된 부위)에 도입된다. 도 10b는 HeLa 세포들에서 pGL3-p21 루시퍼라제 리포터 발현의 정량을 보여주는 모식적 그래프이다. HeLa 세포들은 pGL3-p21 및 pRL-TK뿐만 아니라 마이크로RNAs로 수확하기 이전에 48시간 동안 형질전환된다. 결과들은 형질전환된 세포들에서 pRL-TK 수준으로 정상화된다.
도 11은 miRNAs에 의한 Tgfbr2 발현의 직접적인 조절을 나타낸 것이다. 도 11a는 Tgfbr2 mRNA 3'UTR에서 발견되는 두 가지의 잠재적인 부위들을 보여주는 대표적인 그림이다. 도 11b는 p21 실험들과 유사하게 수행된 바와 같이 HeLa 세포들에서 루시퍼라제 리포터 발현의 정량을 보여주는 모식적 그래프이다. 결과들은 형질전환된 세포들에서 pRL-TK 수준으로 정상화된다.
도 12는 표시된 바와 같이 다양한 miRNAs의 존재 시 상대적인 Tgfbr2 mRNA 수준들을 나타낸 것이다.
도 13은 shRNA가 shAgo2 감염된 MEFs에서 활발하게 발현되는 것을 나타낸 것이다. 도 13a는 shAgo2 수준들을 나타내고, 도 13b는 shRNA 수준들을 나타낸다. 도 13c는 shAgo2 감염된 MEFs에서 ES-특이 마커들의 발현들을 나타낸다.
도 14는 OSKM 인자들의 형질감염에 이어서 0, 4, 8, 및 12일째에 상대적인 miRNA 발현을 나타낸 것이다.
도 15는 miR-93의 상대적인 수준들에 미치는 miR-93 모방체의 효과들을 나타낸 것이다.
도 16a은 miR 저해제들이 표적 miR 발현들을 감소시킬 수 있는 것을 나타낸 것이다. 도 16b는 재프로그램화 공정의 서로 다른 단계들 동안 miR 저해제의 효과들을 좀 더 나타낸다.
도 17은 miR-93 또는 miR-106b가 도입될 때 내인성 Nanog 좌위의 프로모터 메틸화의 수준들을 나타낸 것이다.
도 18a 및 도 18b는 miR-93 형질전환 시 유의하게 감소된 유전자들이 iPSCs에서 낮게 발현된 유전자들의 세 배 농축강화 (enrichment)를 보여줄 수 있는 한편, miR-93 형질전환 시 증가된 유전자들은 이러한 농축강화를 보여주지 못하는 점을 나타낸 것이다.
도 19a는 miR-93 도입 시 상대적인 Tgfbr2 mRNA 수준들을 mRNA 어레이 또는 RT-qPCR 분석 둘 중 하나를 사용하여 나타낸 것이다. 도 19b는 miR-25, miR-93, 또는 miR-106b의 도입 시 상대적인 mRNA 수준들을 나타낸다.
도 20은 MEF-농축강화된 마이크로RNAs, miR-21 및 miR-29a의 저해가 iPS 세포 재프로그램화 효율을 증진시키는 것을 나타낸 것이다. 도 20a는 miR-29a, miR-21, 및 let7a가 MEFs에서 높게 발현되는 것을 나타낸다. 전체 RNAs가 Oct4-EGFP MEFs 및 마우스 ES 세포들로부터 분리되고, 젤 전기영동에 의해 전개된다. 표시된 miRNAs에 대한 특이적 방사성-표지된 탐침들이 신호들을 검출하는 데 사용된다. U6 snRNA는 로딩 대조군으로서 역할을 한다. 도 20b는 miRNA 저해가 재프로그램화 효율을 증진시키는 것을 나타낸다. Oct4-EGFP MEFs는 OSKM으로 형질감염된다. GFP-양성 콜로니들이 형질감염 이후 14일째에 확인되고 형광 현미경법에 의해 계수된다. GFP+ 콜로니 수는 항 miR-표적화 대조군 처리의 수로 정상화되고 배율 변화로서 보고된다. 오차 막대들은 세 번의 독립적인 실험들의 표준 편차를 나타낸다. * p 값 < 0.05.
도 21은 c-Myc이 MEF-농축강화된 miRNAs의 일차적인 억제인자라는 점을 나타낸 것이다. 도 21a는 재프로그램화 이후 5일째에 선택된 miRNAs의 노던 분석을 나타낸다. Oct4-EGFP MEFs는 표시된 바와 같이 단일한 인자 또는 재프로그램화 인자들의 다양한 조합들로 형질감염된다. 1F, 한 개의 인자; 2F, 두 개의 인자들; 3F, 세 개의 인자들; OSKM: Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc. U6는 로딩 대조군 RNA로서 사용된다. 배아 줄기세포들 (ES)로부터 나온 전체 RNA는 MEF 및 형질감염된 세포들에게 음성 대조군으로서 역할을 한다. 다양한 탐침들이 우측면에 표시된 바와 같이 특이적 miRNAs를 검출하는 데 사용된다. MiR-291 블럿팅은 ES RNA의 양성 대조군이다.
도 21b는 다양한 재프로그램화 인자들의 존재 시 miRNA 발현의 정량적 표현을 나타낸 것이다. 신호 강도는 U6 snRNA의 강도로 정상화된다. 발현 비율은 임의적으로 100% 설정되는 MEFs에서의 발현과 대비하여 각 miRNA의 발현 퍼센트로서 계산된다. 다양한 miRNAs는 (패널 A로부터) 정량되고 우측면에 표시된다.
도 21c는 OSK- 또는 OSKM-재프로그램화와 이어지는 다양한 시점들에서 Oct4-EGFP MEFs에 있는 선택된 miRNAs의 실시간 RT-PCR 분석을 나타낸 것이다. RNA는 형질감염 이후 표시된 날짜 (D)에 실시간 RT-PCR 분석을 위해 분리된다. 신호들은 U6로 정상화되고 임의적으로 100으로 설정되는 MEFs에서 발현되는 miRNA의 퍼센트로서 나타낸다. 오차 막대들은 두 번의 독립적인 실험들의 표준 편차를 나타낸다.
도 22는 miR-21 또는 miR-29a의 저해가 p53 단백질 수준들을 감소시키고 p85α 및 CDC42 경로들을 상승조절하여 iPS 세포 재프로그램화를 증진시키는 것을 나타낸 것이다. 도 22a는 다양한 miRNAs의 저해와 이어지는 p53, CDC42, 및 p85α의 발현의 웨스턴 분석을 나타낸다. 1 x 105개의 Oct4-EGFP MEFs는 표시된 miRNA 저해제들로 형질전환된다. 세포들은 이후 5일째에 수확되고 분석된다. 도 22b는 표시된 miR 저해제들의 존재 시 단백질 발현의 정량적 표현을 나타낸다. 신호 강도는 GAPDH 강도로 정상화되고, 임의적으로 100으로 설정되는 대조군 (NT) 세포들에서 발현과 대비한 퍼센트로서 나타낸다. 오차 막대들은 적어도 세 번의 독립적인 실험들의 표준 편차를 나타낸다. * p 값 < 0.05.
도 22c는 다양한 miRNAs 및 OSKM 형질감염의 저해와 이어지는 p53, CDC42, 및 p85α의 발현의 면역블럿 분석을 나타낸다. 1 x 105개의 Oct4-EGFP MEFs는 표시된 miRNA 저해제들로 형질전환된다. 세포들은 이후 5일째에 수확되고 면역블럿으로 분석된다. 신호 강도는 (B)에 기술된 바와 같이 정상화된다. 오차 막대들은 적어도 세 번의 독립적인 실험들의 표준 편차를 나타낸다. * p 값 < 0.05. 도 22d는 miR-29a 또는 p53를 고갈시키는 것이 재프로그램화 효율을 증진시키는 점을 나타낸다. 4 x 104개의 Oct4-EGFP MEFs가 표시된 siRNAs 및 miRNA 저해제들 뿐만 아니라 OSKM 재프로그램화 인자들로 형질전환된다. GFP-양성 세포들은 형질감염 이후 12일째에 계수된다. 오차 막대들은 적어도 세 번의 독립적인 실험들의 표준 편차를 나타낸다. * p 값 < 0.05.
도 23은 miR-21 및 miR-29a를 고갈시키는 것이 ERK1/2 경로를 저하조절하여 재프로그램화 효율을 촉진시키는 점을 나타낸 것이다. 도 23a는 MEFs에서 다양한 miRNAs의 저해와 이어지는 인산화된 및 전체 ERK1/2의 웨스턴 분석을 나타낸다. 1 x 105개의 Oct4-EGFP MEFs는 표시된 miRNA 저해제들로 형질전환되고, 이후 5일째에 수확되고 면역블럿된다. 신호 강도는 액틴으로 정상화되고, 항 miR NT 대조군의 발현과 대비한 퍼센트로서 나타낸다. 오차 막대들은 적어도 세 번의 독립적인 실험들의 표준 편차를 나타낸다. * p 값 < 0.05; ** p 값 < 0.005. 도 23b는 miR-21 및 miR-29a을 고갈시키는 것이 Spry1 단백질 수준들을 증가시키는 점을 나타낸 것이다. Spry1 발현 비율의 웨스턴 블럿 분석이 보여진다. MEFs는 표시된 바와 같이 다양한 miRNA 저해제들로 형질전환된다. 세포들은 형질전환 이후 5일째에 웨스턴 블럿 분석을 위해 수확된다. 신호 강도는 액틴으로 정상화되고, 도 23a에서 기술된 바와 같이 나타낸다. 오차 막대들은 적어도 세 번의 독립적인 실험들의 표준 편차들을 나타낸다. * p 값 < 0.05; ** p 값 < 0.005.
도 23c는 ERK1/2 또는 GSK3b 녹-다운과 이어지는 재프로그램화 효율에서의 배수 변화를 나타낸 것이다. 4 x 104개의 Oct4-EGFP MEFs는 표시된 siRNAs 뿐만 아니라 OSKM으로 형질전환된다. GFP-양성 세포들은 이후 두 주째에 계수된다. siNT로의 형질전환은 재프로그램화 효율을 위한 대조군으로서 역할을 한다. 오차 막대들은 적어도 세 번의 독립적인 실험들의 표준 편차를 나타낸다. ** p 값 < 0.005. 도 23d는 MEFs에서 다양한 miRNAs의 저해와 이어지는 인산화된 및 전체 ERK1/2의 웨스턴 분석을 나타낸다. 1 x 105개의 Oct4-EGFP MEFs는 표시된 miRNA 저해제들로 형질전환되고, 이후 5일째에 수확되고 면역블럿에 의해 분석된다. 신호 강도는 도 23a에서 기술된 바와 같이 정상화된다. 오차 막대들은 적어도 세 번의 독립적인 실험들의 표준 편차를 나타낸다.
도 24는 c-Myc이 MEF-농축강화된 miRNAs, miR-21 및 miR-29a를 저하조절하여 재프로그램화를 증진시키는 것을 도시하는 모식적 표현을 나타낸 것이다. p53 및 ERK1/2 경로들은 재프로그램화에 대한 장벽들로서 기능하고, miR-21 및 miR-29a는 CDC42, p85a, 및 Spry1를 저하조절하여 이들 경로들을 간접적으로 활성화한다. miR-21/p53 및 miR-29a/ERK1/2 경로들 사이의 교차 관계도 역시 보여진다. c-Myc은 이들 miRNAs의 발현을 억제하고, 다음 순서로 ERK1/2 및 p53이 유도를 저하시킨다. 점선들은 iPS 재프로그램화에 미치는 p53 및 ERK1/2 효과들을 표시한다.
도 25는 miR-21의 저해가 OSK에 의한 iPS 세포 재프로그램화를 증진시키는 점을 나타낸 것이다. miRNAs의 저해제들이 OSK로의 재프로그램화 과정 동안 Oct4-MEFs 내로 도입된다. GFP-양성 콜로니들은 형질감염 이후 다양한 시점들에서 계수된다. 오차 막대들은 두 번의 독립적인 실험들의 표준 편차를 나타낸다.
도 26은 miRNA의 저해가 재프로그램화 과정 동안 세포사멸 또는 증식 비율들을 변경시키지 않는 점을 나타낸 것이다. 도 26a는 miRNA의 저해제들이 OSKM으로의 재프로그램화 과정 동안 Oct4-MEFs 내로 도입되는 것을 나타낸다. 세포들은 형질감염 이후 8 내지 9일째에 수집된다. 세포사멸은 PE 아넥신 V 세포사멸 검출 키트 I (PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I; BD 파미노겐사 (BD Pharmingen); 카탈로그 번호 Cat# 559763) 및 7-아미노-액티노마이신 (7-AAD)를 사용하여 평가된다. 신호는 FACS에 의해 검출된다. 오차 막대들은 세 번의 독립적인 실험들의 표준 편차를 나타낸다. 도 26b는 miRNA의 저해제들이 OSKM으로의 재프로그램화 과정 동안 Oct4-MEFs 내로 도입되는 것을 나타낸다. 세포들은 형질감염 이후 8 내지 9일째에 수집된다. 수집하기 하루 이전에 세포들은 클릭-iT 에듀 영상화 키트들 (Click-iT Edu Imaging Kits; 인비트로겐사 (Invitrogen); 카탈로그 번호 Cat# C10337)을 사용하여 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (Edu)로 처리된다. 신호는 FACS에 의해 검출된다. 오차 막대들은 세 번의 독립적인 실험들의 표준 편차를 나타낸다.
본 발명은 iPSC 유도에 관여하는 핵심 조절 기작들의 발견을 근거로 한다. 핵심 관점은 iPSCs의 유도와 세포성 마이크로RNAs 간의 연관성의 발견이다. 이것은 핵심 마이크로RNA 경로 단백질들의 녹-다운에 의한 마이크로RNA의 생물발생 기제 (biogenesis machinery)의 간섭이 재프로그램화 효율의 유의한 감소를 가져올 수 있는 점의 관찰에 의해 입증된다. 상세하게는, 재프로그램화의 초기 단계들 동안 높게 유도되는 적어도 세 가지의 마이크로RNA 집합들, miR-17~92, 106b~25 및 106a~363이 밝혀져 있다. 매우 유사한 종자 영역들 (seed regions)을 가지는 miR-93 및 miR-106b과 같은 여러 마이크로RNAs는 유래된 클론들이 전적으로 재프로그램된 상태에 도달하도록 허용하는 p21 발현을 표적하여 iPSC 유도를 증진시킨다.
본 발명은 마이크로RNAs가 iPSC 유도에서 직접적으로 기능할 수 있고, 또한 마이크로RNA 생물발생 기제를 사용한 간섭이 재프로그램화 효율을 유의하게 감소시키는 점을 제공한다. 본 발명은 재프로그램화의 초기 단계들 동안 높게 유도되는 마이크로RNAs의 세 가지 집합들, miR-17~92, 106b~25 및 106a~363을 제공한다. 기능적 분석은 이들 마이크로RNAs를 MEFs 내로 도입하는 것이 Oct4-GFP+ iPSC 콜로니 형성을 증진시켰던 점을 보여주었다. 본 발명은 재프로그램화를 저해하는 Tgfbr2 및 p21 둘 다가 이들 마이크로RNAs에 의해 직접적으로 표적되고, 또한 이들의 활성을 차단하는 것이 재프로그램화 효율을 감소시켰던 점도 역시 제공한다. 본 발명은 miR-93 및 miR-106b가 재프로그램화 활성의 핵심 조절인자들이라는 점을 제공한다.
본 발명의 조성물들 및 방법들이 기술되기에 앞서서, 이러한 조성물들, 방법들, 및 조건들은 변화될 수 있기 때문에 본 발명은 특정한 조성물들, 방법들, 및 기술된 실험적인 조건들에 한정되지 않는 점이 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어학 (terminology)은 본 발명의 범위가 단지 첨부된 청구항들에 제한되지 않을 것이기 때문에, 단지 특정한 구현예들을 기술할 목적을 가지며 한정하려는 것이 아니라고 점을 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용되는 바, 단수의 형태들 "하나 (a)", "하나 (an)" 및 "그 (the)"는 문맥상 달리 분명하게 기술되지 않은 경우라면 복수의 내용들 (references)을 포함한다. 따라서 예를 들어, "본 발명 (the method)"에 대한 내용들은 하나 이상의 방법들, 및/또는 본 기재내용을 해독 시 당업자라면 자명하게 될 본 명세서에서 기술된 유형의 단계들을 포함한다.
달리 정의되지 않는 경우라면, 본 명세서에서 기술된 모든 기술적 및 과학적인 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법들 및 재료들이라면 모두가 본 발명의 시행 또는 시험 (test)에 사용될 수는 있지만, 지금은 바람직한 방법들 및 재료들이 기술되고 있다.
본 명세서에서 논의되는 바, 발견은 마이크로RNAs가 재프로그램화 공정에 관여하고 또한 iPSC 유도 효율이 세포들에서 이들 마이크로RNAs의 수준을 조작하여 iPSC 유도를 크게 증진시키는 능력을 유도하는 점이다. 따라서, 본 발명은 기지의 방법들과 대비하여 개선된 유도 효율을 가지는 iPS 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본 방법은 체세포를 핵 재프로그램화 인자, 또한 제제가 핵 재프로그램화 인자가 아니라는 조건으로 세포 내의 마이크로RNAs 수준들 또는 활성을 변경시키는 상기 제제와 접촉시켜서 iPS 세포를 생성하는 과정을 포함한다.
또한 본 발명은 재프로그램화 공정 및 iPS 유도 효율에 직접적으로 관여하는 조절 단백질들 (regulatory proteins)의 발견을 근거로 한다. 이러한 단백질의 하나인 p21는 단지 165개의 아미노산들을 가지는 작은 단백질이고, p53-의존성 G1 성장 정지를 야기하며 분화 및 세포 노화를 촉진하여 암 발생과정 동안의 암 억제인자로서 오래 동안 알려져 왔다. 본 명세서에서 iPSC 유도과정 동안 마이크로RNAs에 의한 p21 발현의 저해는 유도 효율을 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서 한 가지 구현예에서, 본 발명은 체세포를 핵 재프로그램화 인자, 또한 p21 발현 또는 활성의 저해제와 접촉시켜서 iPS 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
iPS의 생성에서 RNA의 조절적 관여가 주어지는 경우, 핵 재프로그램화 인자들이 아닌 RNA 수준들을 조절하는 제제들을 사용하여 유도가 일어날 수 있는 것으로 참작된다. 따라서, 본 발명은 체세포를 세포 내의 RNA 수준들 또는 활성을 변경시키는 제제와 접촉시켜서 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포를 생산하는 방법을 제공하고, 여기에서 제제가 핵 재프로그램화 인자가 아니라는 조건으로 제제는 체세포에서 다능성 (pluripotency)을 유도하여 iPS 세포를 생성한다. 다양한 구현예들에서, RNA는 마이크로RNA와 같은 비-코딩 RNA (ncRNA)이다.
다양한 구현예들에서, 하나 이상의 핵 재프로그램화 인자들은 난자들, 배아들, 또는 ES 세포들을 사용하지 않고도 분화된 세포의 재프로그램화를 유도하는 데 사용될 수 있다. 유도 공정의 효율은 유도 공정 동안 세포 내의 마이크로RNA 수준들 또는 활성을 변경시키지 않는 제제를 사용하여 증진된다. 본 방법은 ES 세포들의 것들과 유사한 다능성 및 성장 능력을 가지는 유도된 다능성 줄기세포를 편리하게 및 높은 재생산성으로 확립하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵 재프로그램화 인자는 마이크로RNA와 같은 RNA 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터와 함께 핵 재프로그램화 인자를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 세포를 형질감염하여 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 세포는 재조합 벡터 내에 포함되는 유전자의 산물로서 발현되는 핵 재프로그램화 인자를 발현할 뿐만 아니라 재조합 벡터 내에 포함되는 폴리뉴클레오타이드의 산물로서 발현되는 마이크로RNA를 발현할 수 있어, 핵 재프로그램화 인자 단독으로의 사용과 대비하여 증가된 효율로 분화된 세포의 재프로그램화를 유도한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 다능성 세포들은 연장된 기간 (1년 이상) 동안 시험관내에서 분열하는 잠재력을 가지고 또한 내배엽 (endoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 외배엽 (ectoderm)을 포함하는 모두 세 가지의 배아 생식층들 (germ layers)로부터 유래한 세포들로 분화하는 독특한 능력을 가지는 세포들을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 체세포들은 일차 세포들 또는 불멸화 (immortalized) 세포들일 수 있다. 이러한 세포들은 동물로부터 신선하게 분리된 것들과 같은 일차 세포들 (미-불멸화 세포들)일 수 있거나, 세포주 (불멸화 세포들)로부터 유래될 수 있다. 대표적인 관점에서, 체세포들은 예를 들어 인간세포들 또는 마우스 세포들과 같은 포유동물 세포들이다. 그들은 잘-알려진 방법들에 의해, 이에 제한되는 것은 아니지만 피부, 폐, 췌장들, 간, 위장, 십이지장, 심장, 생식 기관들, 방광, 신장, 요도 및 기타 비뇨기관들과 같은 서로 다른 기관들로부터 획득될 수 있다. 본 발명에서 유용한 포유동물 체세포들로는, 예로서 성인 줄기세포들, 세르톨리 세포들 (sertoli cells), 자궁내막 세포들 (endothelial cells), 과립층 상피세포들 (granulosa epithelial cells), 뉴런, 췌장샘 세포들 (pancreatic islet cells), 표피세포들, 상피세포들, 간세포들 (hepatocytes), 모낭세포들 (hair follicle cells), 각질세포들 (keratinocytes), 조혈세포들 (hematopoietic cells), 멜라닌세포들 (melanocytes), 연골세포들 (chondrocytes), 림프구들 (B 및 T 림프구들), 적혈구들, 대식세포들, 단핵구들, 단핵 세포들, 섬유모세포들, 심장근 세포들, 기타 기지의 근육세포들, 및 일반적으로 살아있는 체세포들이라면 모두를 포함한다. 상세한 구현예들에서, 섬유모세포들이 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 체세포는 성인 줄기세포들도 역시 포함하도록 의도한다. 성인 줄기세포는 특정한 조직의 모든 세포 유형들로 발생할 수 있는 세포이다. 대표적인 성인 줄기세포들은 조혈 줄기세포들, 신경 줄기세포들, 및 중간엽 줄기세포들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 재프로그램화는 부분적으로 또는 최종적으로 분화되는 체세포의 분화 상태를 변경시키거나 역전시키는 공정을 말하도록 의도한다. 체세포의 재프로그램화는 체세포의 분화 상태의 부분적 또는 완전한 역전 (reversion)일 수 있다. 대표적인 관점에서, 체세포가 유도된 다능성 줄기세포로 재프로그램화되는 재프로그램화는 완벽하다. 그러나, 덜 분화된 상태라면 모두로의 역전과 같은 재프로그램화는 부분적일 수 있다. 예를 들어, 최종적으로 분화된 세포를 다능성 (multipotent) 세포와 같은 덜 분화된 상태의 세포로 역전시키는 것이다.
본 발명의 다양한 관점들에서, 핵 재프로그램화 인자들은 다능성을 유도하는 유전자들이고 분화되거나 반-분화된 (semi-differentiated) 세포들을 다능성 줄기세포의 표현형과 같은 초기 세포의 것보다 더 원시적인 표현형으로 재프로그램하는 데 사용된다. 이러한 유전자들은 유도 효율을 증가시키도록 세포 내에서 마이크로RNA 수준들 또는 활성들을 변경하고 및/또는 p21 발현 또는 활성을 저해하는 제제들과 함께 사용된다. 이러한 유전자들 및 제제들은 체세포의 게놈 내로 통합되었던 하나 이상의 이러한 유전자들의 발현 시 체세포로부터 다능성 줄기세포를 생성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 다능성을 유도하는 유전자는 다능성과 연관되고 유전자의 통합 및 발현 시 체세포로부터 나온 다능성 줄기세포와 같은 덜 분화된 세포를 생성할 수 있는 유전자를 말하도록 의도한다. 전형적으로, 다능성 유전자의 발현은 다능성 줄기세포들에 한정되고, 다능성 줄기세포들의 기능적 정체성 (identity)에 중요하다.
당업자라면 세포 내에서 마이크로RNA의 수준 또는 활성을 변경시키거나 p21 발현 또는 활성을 저해하는 제제들이 서로 다른 다양한 유형들의 분자들을 포함하는 점을 이해할 것이다. 본 발명의 방법들이라면 모두에서 유용한 제제는, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 펩타이드 모방체 (peptidomimetic), 비닐유래 펩토이드들 (vinylogous peptoids)와 같은 펩토이드들, 유기 분자들 또는 작은 유기 분자들과 같은 화학적 화합물들 등의 분자 유형이라면 모두일 수 있다. 따라서 한 가지 관점에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 RNA 분자와 같은 폴리뉴클레오타이드이다. 다양한 관점들에서, 제제는 마이크로RNA, dsRNA, siRNA, stRNA, 및 shRNA와 같은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 RNA 분자와 같은 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 대표적인 관점들에서, 제제는 세포 내로 도입되어 세포 내의 마이크로RNA의 수준들 및 활성을 증가시고 및/또는 p21을 저해하는 마이크로RNA이다.
마이크로RNAs (miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 단일가닥 RNA 분자들이다. miRNAs는 그들이 전사되는 DNA로부터 나온 유전자들에 의해 인코드되지만, miRNAs는 단백질로 해독되지는 않고; 대신에 각각의 일차적인 전사체 (pri-miRNA)는 프리-miRNA라고 불리는 짧은 스템-루프 (stem-loop) 구조로 프로세싱되고, 최종적으로는 기능적 miRNA가 된다. 성숙한 miRNA 분자들은 하나 이상의 메신저 RNA (mRNA) 분자들에 전적으로 또는 부분적으로 상보적이고, 그들의 주요 기능은 유전자 발현을 저하조절하는 것이다. 마이크로RNAs는 독립적인 유전자들에 의해 인코드될 수 있지만, 인트론들, mRNAs의 3'UTRs, 긴 비코딩 RNAs, snoRNAs 및 트랜스포존들을 포함하는 다양한 서로 다른 RNA 종들로부터 (효소 다이서에 의해) 프로세싱될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 마이크로RNAs는 그들의 내인성 상대방과 동일하거나 실질적으로 동일한 기능을 가지는 세포 내로 외인적으로 도입되는 마이크로RNAs를 의미하도록 의도하는 "모방체 (mimic)" 마이크로RNAs도 역시 포함한다. 따라서, 당업자라면 제제가 외인적으로 도입된 RNA일 수 있는 점을 이해하고 있을 것이며, 제제는 세포에서 마이크로RNA의 발현을 증가시키거나 감소시키는 화합물 등도 역시 포함한다.
다양한 관점들에서, 마이크로RNA는 iPSC의 유도 또는 그의 분화 동안 활성 또는 발현에서의 증가 또는 감소를 나타내는 집합에 포함되는 마이크로RNA일 수 있다. 한 가지 관점에서, 마이크로RNA는 miR-93, miR-106b, 또는 그들의 조합이라면 모두와 같은 miR-17, miR-25, miR-106a, 또는 miR-302b 집합에 들어있는 하나 이상의 마이크로RNAs일 수 있다. miR-17~92, miR-106b~25 및 miR-106a~363 집합들의 유도는 적절한 재프로그램화를 위해 중요한 것으로 보여진다. 이러한 마이크로RNAs는 공정 동안 재프로그램화 장벽를 낮추는 것으로 여겨지고, 따라서 세포들에서 이들 마이크로RNAs의 수준은 재프로그램화 효율을 개선하도록 조작될 수 있다. 마이크로RNAs도 역시 마이크로RNAs가 중요한 조절 분자들인 것으로 보이기 때문에 iPSC의 분화를 인도하도록 조작될 수 있다.
본 명세서에서는 마이크로RNAs의 세 가지 집합들이 iPSC 유도 동안 유도되는 것으로 확인되고, 이들 집합들 내의 여러 마이크로RNAs가 그들이 유사한 mRNAs를 표적하는 것을 표시하는 동일한 뉴클레오타이드 종자 영역 서열들을 가지는 것으로 결정되어 왔다. 또한 동일한 종자 영역의 뉴클레오타이드 서열을 공유하는 이러한 마이크로RNAs는 iPSC 유도를 증진시키면서 p21 발현을 감소시키는 것으로 결정되어 왔다. 따라서 한 가지 관점에서, 마이크로RNA는 다양한 마이크로RNAs 예로 서열번호 2 내지 11의 것들 사이에 보존되는 것으로 결정되어 있었던 서열번호 1, 5'-AAGUGC-3'을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가진다. 따라서 관련된 관점에서, 마이크로RNA는 서열번호 2 내지 11이라면 모두의 뉴클레오타이드 서열을 가진다.
용어 "소간섭 RNA (small interfering RNA)" 및 "siRNA"도 역시 본 명세서에서 다양한 생물학적 역할들을 담당하는 짧은 이중가닥 RNA 분자들의 부류 (class)인 소간섭 RNA 또는 침묵 RNA (silencing RNA)를 말하는 것으로 사용된다. 가장 명확하게, siRNA는 특이적 유전자의 발현을 siRNA가 간섭하는 RNA 간섭 (RNAi) 경로에 관여한다. RNAi 경로에서의 그들의 역할과 더불어, siRNAs는 RNAi-관련 경로들에도 역시 작용하고 있다 (예로, 항바이러스 기작으로서 또는 게놈의 크로마틴 구조를 형성하는 과정).
안티센스 올리고뉴클레오타이드들 및 RNA 분자들과 같은 본 발명의 폴리뉴클레오타이들은 적합한 길이라면 모두를 가질 수 있다. 예를 들어, 당업자라면 유전자 발현을 조절하는 데 사용되도록 안티센스 올리고뉴클레오타이드들 및 RNA 분자에 적합한 길이를 이해할 것이다. 전형적으로 이러한 분자들은 길이가 약 5개로부터 100개까지, 5개로부터 50개까지, 5개로부터 45개까지, 5개로부터 40개까지, 5개로부터 35개까지, 5개로부터 30개까지, 5개로부터 25개까지, 5개로부터 20개까지, 또는 10개로부터 20개까지의 뉴클레오타이드들이다. 예를 들어, 분자는 길이가 약 5개, 10개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 뉴클레오타이드들일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드들은 적어도 약 16개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 16개 뉴클레오타이드들,적어도 약 16개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 17개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 18개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 19개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 20개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 21개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 22개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 23개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 24개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 25개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 26개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 27개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 28개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 29개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 30개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 35개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 40개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 45개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 50개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 55개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 60개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 65개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 70개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 75개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 80개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 85개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 90개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 95개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 100개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 110개 뉴클레오타이드들, 적어도 약 120개 뉴클레오타이드들, 또는 120개 이상의 뉴클레오타이드들을 포함하는, 적어도 약 15개 뉴클레오타이드들로부터 약 120개 이상의 뉴클레오타이드들까지를 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)" 또는 "뉴클레오타이드 서열 (nucleotide sequence)" 또는 "핵산 분자 (nucleic acid molecule)"는 본 명세서에서 포스포디에스테르 결합에 의해 다같이 연결된 둘 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드들 또는 리보뉴클레오타이드들의 서열을 의미하도록 광범위하게 사용된다. 이와 같이, 본 용어들은 유전자 또는 그의 일부분, cDNA, 합성 폴리데옥시리보핵산 서열 등일 수 있고, 또한 단일가닥 또는 이중가닥, 뿐만 아니라 DNA/RAN 하이브리드일 수 있는 RNA 및 DNA를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어들은 세포로부터 분리될 수 있는 자연적으로 생기는 핵산 분자들, 뿐만 아니라 예를 들어 화학적 합성의 방법들에 의해 또는 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의한 것과 같은 효소적 방법들에 의해 제조될 수 있는 합성 폴리뉴클레오타이드들을 포함한다. 서로 다른 용어들은 예를 들어 조성물의 서로 다른 성분들을 구별하도록 논의의 편의성을 위해서만 사용되고 있는 점을 인식하고 있어야 한다.
일반적으로, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드들은 자연적으로 생기는 2'-데옥시리보스에 연결된 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 티민과 같은 데옥시리보뉴클레오타이드들, 또는 리보스에 연결된 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 우라실과 같은 리보뉴클레오타이드들이다. 그러나 용도에 의존하여, 폴리뉴클레오타이드는 비-자연적으로 생기는 합성 뉴클레오타이드들 또는 자연적으로 생기는 변형된 뉴클레오타이드들을 포함하는 뉴클레오타이드 유사체들도 역시 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체들은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있으며 이러한 뉴클레오타이드 유사체들을 포함하는 폴리뉴클레오타이드들과 같이 시판되고 있다. 일반적으로 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드들을 연결하는 공유 결합은 포스포디에스테르 결합이다. 그러나 폴리뉴클레오타이드가 사용될 목적에 의존하여, 공유 결합도 역시 티오디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합, 펩타이드-유사 결합 또는 합성 폴리뉴클레오타이드들을 생산하도록 뉴클레오타이드들을 연결하는 데 유용한 당업자에게 알려져 있는 다른 결합이라면 모두를 포함하는, 무수한 다른 결합들이라면 모두일 수 있다.
자연적으로 생기는 뉴클레오타이드들 및 포스포디에스테르 결합들을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 합성될 수 있거나 적절한 폴리뉴클레오타이드를 주형으로서 사용하는 재조합 DNA 방법들을 사용하여 생산될 수 있다. 비교하여, 뉴클레오타이드 유사체들 또는 포스포디에스테르 결합들이 아닌 공유 결합들을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로, T7 중합효소와 같은 효소가 소정의 유형들의 뉴클레오타이드 유사체들을 폴리뉴클레오타이드 내로 통합시킬 수 있고, 따라서 적절한 주형으로부터 이러한 폴리뉴클레오타이드를 재조합적으로 생산하는 데 사용될 수 있긴 하더라도, 화학적으로 합성될 것이다.
다양한 구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드들 또는 RNA 분자들은 변형들을 포함하는 올리고뉴클레오타이드들을 포함한다. 다양한 변형들이 당해 기술분야에서 알려져 있으며 본 발명에서의 용도를 위해 참작된다. 예를 들어, 변형된 골격들 또는 비-자연적인 뉴클레오사이드 간 연결들 (internucleoside linkages)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드들이 참작된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 변형된 골격들을 가지는 올리고뉴클레오타이드들은 골격 내에 인 (phosphorus) 원자를 보유하는 것들 및 골격 내에 인 원자를 보유하지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적으로 또한 당해 기술분야에서 때로 참조되는 바와 같이, 그들의 뉴클레오사이드 간 골격 내에 인 원자를 가지지 않는 변형된 올리고뉴클레오타이드들도 역시 올리고뉴클레오사이드들인 것으로 고려될 수 있다.
다양한 관점들에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드 골격들은 예를 들어 포스포로티오에이트들 (phosphorothioates), 키랄성 포스포로티오에이트들, 포스포로디티오에이트들, 포스포트리에스테르들, 아미노알킬포스포트리에스테르들, 3'-알킬렌 포스포네이트들, 5'-알킬렌 포스포네이트들, 키랄성 포스포네이트들을 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트들, 포스피네이트들, 3'-아미노 포스포르아미데이트들 및 아미노알킬포스포르아미데이트들을 포함하는 포스포르아미데이트들, 티오노포스포르아미데이트들, 티오노알킬포스포네이트들, 티오노알킬포스포르트리에스테르들, 셀레노포스페이트들 또한 정상적인 3'-5' 연결들을 가지는 보라노-포스페이트들, 이들의 2'-5' 연결된 유사체들, 및 하나 이상의 뉴클레오타이드 간 연결들이 3'에서 3', 5'에서 5' 또는 2'에서 2' 연결들인 역전된 극성을 가지는 것들을 포함한다. 역전된 극성을 가지는 소정의 올리고뉴클레오타이드들은 3'-말단 뉴클레오타이드 간 연결, 예로 비염기성일 수 있는 (핵염기 (nucleobase)가 소실되거나 이를 대신하여 하이드록실기를 가짐) 단일한 역전된 뉴클레오사이드 잔기에서 단일한 3'에서 3' 연결을 포함한다. 다양한 염들, 혼합된 염들 및 자유산 형태들도 역시 포함된다.
다양한 관점들에서, 인 원자를 내부에 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오타이드 골격들은 짧은 사슬 알킬 또는 고리알킬 뉴클레오사이드 간 연결들, 혼합된 헤테로원자들 및 알킬 또는 고리알킬 뉴클레오사이드 간 연결들, 또는 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로고리 뉴클레오사이드 간 연결들에 의해 형성되는 골격들을 가진다. 이들은 몰포리노 (morpholino) 연결들 (뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 골격들; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격들; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격들; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격들; 리보아세틸 골격들; 알켄을 포함하는 골격들; 설파메이트 골격들; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격들; 설포네이트 및 설폰아마이드 골격들; 아마이드 골격들; 또한 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분들의 부분들을 가지는 것들을 포함한다.
다양한 관점들에서, 올리고뉴클레오타이드 모방체들, 뉴클레오타이드 단위들의 당 및 뉴클레오사이드 간 연결, 예로 골격 둘 다는 새로운 그룹으로 치환된다. 염기 단위들은 적절한 핵산 표적 화합물을 사용한 혼성화 (hybridization)를 위해 유지된다. 이러한 올리고머 화합물의 하나인 탁월한 혼성화 특성들을 가지는 것으로 보이는 올리고뉴클레오타이드 모방체는 펩타이드 핵산 (PNA)이라고 말한다. PNA 화합물들에서, 올리고뉴클레오타이드의 당-골격은 골격, 상세하게는 아미노에틸글리신 골격을 포함하는 아마이드로 치환된다. 핵염기들은 보유되고 골격의 아마이드 부분의 아자 질소 원자들에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. 다양한 관점들에서, 올리고뉴클레오타이드들은 포스포로티오에이트 골격들 및 헤테로원자 골격들을 가진 올리고뉴클레오사이드들을 포함할 수 있다. 또한 변형된 올리고뉴클레오타이드들은 하나 이상의 치환된 당 소부분들 (moieties)을 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 올리고뉴클레오타이드들은 2'-위치에서 다음의 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기에서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 상세하게는, O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2가 바람직하고, 여기에서 n 및 m은 1로부터 약 10까지의 범위이다. 기타 다른 올리고뉴클레오타이드들은 2'-위치에서 다음의 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저차 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로고리알킬, 헤테로고리알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 시릴, RNA 절단 그룹, 리포터 그룹, 삽입인자 (intercalator), 올리고뉴클레오타이드의 약물역학적 특성들을 개선하는 그룹, 또는 올리고뉴클레오타이드의 약물동력학적 특성들을 개선하는 그룹, 또한 유사한 특성들을 가지는 기타 다른 치환체들. 또 다른 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE라고도 알려져 있는 2'OCH2CH2OCH3)를 포함한다.
관련된 관점들에서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 증진된 친화도 및 특이도를 가지는 안티센스 핵산들을 생성하도록 폐쇄된 핵산 (LNAs)의 사용을 포함한다. LNAs는 2'-하이드록실 그룹이 당 고리의 3' 또는 4' 탄소에 연결되어 이중고리 당 소부분을 형성하는 핵산이다. 바람직하게, 연결은 n이 1 또는 2인 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 연결하는 메틸렌(-CH2-)n 그룹이다.
기타 다른 변형들로는 2'-메톡시 (2'-O-CH3), 2'-아미노프로폭시( 2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-아릴 (2'-CH-CH-CH2), 2'-O-아릴 (2'-O-CH2-CH-CH2), 2'-플루오로 (2'-F), 2'-아미노, 2'-티오, 2'-O메틸, 2'-메톡시메틸, 2'-프로필 등을 포함한다. 2'-변형은 아라비노 (상) 위치 또는 리보 (하) 위치에 있을 수 있다. 바람직한 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 또한 유사한 변형들이 올리고뉴클레오타이드 상의 다른 위치들, 상세하게는 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 당의 3' 위치에서 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오타이드들 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 만들어질 수 있다. 또한 올리고뉴클레오타이드들은 펜타퓨라노실 당을 대신하여 고리부틸 소부분들과 같은 당 모방체들을 가질 수 있다.
또한 올리고뉴클레오타이드들은 핵염기 변형들 또는 치환들을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, "미변형된" 또는 "자연적인" 핵염기들로는 퓨린 염기들 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 또한 피리미딘 염기들 티민 (T), 사이토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 핵염기들은 5-메틸사이토신, 5-하이드록시메틸 사이토신, 크산틴, 하이폭산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체들, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체들, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실과 사이토신 및 피리미딘 염기들의 기타 다른 알키닐 유도체들, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 다른 8-치환된 아데닌들 및 구아닌들, 5-할로 상세하게는 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 다른 5-치환된 우라실들 및 사이토신들, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자구아닌 또한 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 기타 다른 합성 및 천연의 핵염기들을 포함한다. 좀 더 변형된 핵염기들로는 펜옥사진 사이티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤즈옥사지-n-2(3H)-온), 페노티아진 사이티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤즈티아진-n-2(3H)-온)과 같은 삼중고리 피리미딘들, 치환된 펜옥사진 사이티딘 (예로, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 카바졸 사이티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌사이티딘 (H-피리미도[3'2':4,5]피롤로[2,3-d]피리딘-2-온)과 같은 G-고정자들 (G-clamps)를 포함한다. 또한 변형된 핵염기들은 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로고리들, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 치환되는 것들을 포함할 수 있다. 더 많은 핵염기들이 당해 기술분야에서 알려져 있다. 상세하게 소정의 이들 핵염기들은 본 명세서에서 기술된 올리고머 화합물들의 결합 친화도를 증가시키는 데 유용하다. 이들로는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신을 포함하는 5-치환된 피리미딘들, 6-아자피리미딘들 또한 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린들을 포함한다. 5-메틸사이토신 치환들은 핵산 이중체 안정도를 0.6 내지 1.2 C로 증가시키는 것으로 관찰되었고 현재까지 선호되는 치환들이며, 보다 더 상세하게는 2'-O-메톡시에틸 당 변형들과 조합될 때이다.
본 명세서에서 기술된 안티센스 올리고뉴클레오타이들의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증진시키는 하나 이상의 소부분들 또는 결합체들 (conjugates)을 올리고뉴클레오타이드에 화학적으로 연결하는 것이 관여된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 일차 또는 이차 하이드록실 그룹들과 같은 기능적 그룹들과 공유적으로 결합된 결합체 그룹들을 포함할 수 있다. 결합체 그룹들로는 삽입인자들, 리포터 분자들, 폴리아민들, 폴리아마이드들, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르들, 올리고머들의 약물동력학적 특성들을 증진하는 그룹들, 및 올리고머들의 약물역학적 특성들을 증진하는 그룹들을 포함한다. 전형적인 결합체들 그룹들로는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 바이오틴 (biotin), 펜아진 (phenazine), 폴레이트, 펜안트리딘 (phenanthridine), 안트라퀴논 (anthraquinone), 아크리딘 (acridine), 플루오레신들 (fluoresceins), 로다민들 (rhodamines), 쿠마린들 (coumarines) 및 염색제들을 포함한다. 본 발명의 내용에서 약물동력학적 특성들을 증진하는 그룹들은 올리고머 흡수를 개선하고, 분해에 대한 올리고머 저항성을 증진하고, 및/또는 RNA와의 서열-특이 혼성화를 강화하는 그룹들을 포함한다. 본 발명의 내용에서 약물역학적 특성들을 증진하는 그룹들은 올리고머의 흡수, 분포, 대사 또는 분비를 개선하는 그룹들을 포함한다. 결합체 소부분들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 콜레스테롤 소부분, 콜산, 티오에테르 예로 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬 예로 도데칸디올 또는 운데실 잔기들, 인지질 예로 디헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모니움 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산 (adamantane acetic acid), 팔미틸 소부분, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노카르보닐옥시콜레스테롤 소부분과 같은 지질 소부분들을 포함한다.
여러 가지 유전자들이 다능성과 연관되고 재프로그램화 인자로서의 본 발명의 용도에 적합한 것으로 밝혀져 왔다. 이러한 유전자들은 당해 기술분야에서 알려져 있으며, 예로서 SOX 패밀리 유전자들 (SOX1, SOX2, SOX3, SOX15, SOX18), KLF 패밀리 유전자들 (KLF1, KLF2, KLF4, KLF5), MYC 패밀리 유전자들 (C-MYC, L-MYC, N-MYC), SALL4, OCT4, NANOG, LIN28, STELLA, NOBOX 또는 STAT 패밀리 유전자를 포함한다. STAT 패밀리 구성원들은 예를 들어 STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 (STAT5A 및 STAT5B), 또한 STAT6를 포함할 수 있다. 일정 경우들에서 다능성을 유도하도록 단지 하나의 유전자의 사용이 가능할 수 있는 한편, 일반적으로는 하나 이상의 유전자의 발현이 다능성을 유도하는 데 요구된다. 예를 들어, 둘, 셋, 넷이상의 유전자들이 이러한 유전자들의 동시적 발현을 허용하도록 다중시스트론 제작물 (polycistronic construct)로서 체세포 게놈 내에 통합될 수 있다. 대표적인 관점에서, OCT4, SOX2, KLF4 및 C-MYC을 포함하는 네 가지의 유전자들이 다능성을 유도하는 데 사용된다. 본 발명의 용도에 적합한 재로프로그램화 인자들로서 알려져 있는 추가적인 유전자들은, 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는 미국 특허출원 제 US 10/997,146호 및 미국 특허출원 제 US 12/289,873호에 기재되어 있다.
이들 유전자들 모두는 인간을 포함하는 포유동물들에 공통적으로 존재하고, 따라서 이에 제한되는 것은 아니지만 마우스, 래트, 소, 양, 말, 및 유인원을 포함하는 포유동물들로부터 유래한 유전자들과 같은 포유동물들이라면 모두로부터 나온 동종유래물들 (homologues)은 본 발명에서 사용될 수 있다. 좀 더 나아가, 야생형 유전자 산물들에 덧붙여, 여러 가지 (예로, 1 내지 10개, 1 내지 6개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또한 1개 또는 2개) 아미노산들의 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함하고 야생형 유전자 산물들의 기능과 유사한 기능을 가지는 돌연변이 유전자 산물들도 역시 사용될 수 있다. 또한, 인자들의 조합들은 야생형 유전자들 또는 유전자 산물들의 사용에 제한되지 않는다. 예를 들어, Myc 키메라들 (chimeras) 또는 기타 다른 Myc 변이체들 (variants)이 야생형 Myc을 대신하여 사용될 수 있다.
본 발명은 핵 재프로그램화 인자들의 특정한 조합이라면 모두에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 논의되는 바, 핵 재프로그램화 인자는 하나 이상의 유전자 산물들을 포함할 수 있다. 또한 핵 재프로그램화 인자는 본 명세서에서 논의된 바와 같이 유전자 산물들의 조합도 포함할 수 있다. 각 핵 재프로그램화 인자는 단독으로 또는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 다른 핵 재프로그램화 인자들과 조합으로 사용될 수 있다. 좀 더 나아가, 본 발명의 핵 재프로그램화 인자들은, 예를 들어 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는 미국 특허출원 제 US 10/997,146호에서 논의된 바와 같이 검색 방법들에 의해 확인될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 핵 재프로그램화 인자는 분화, 발생, 증식 등과 관련된 하나 이상의 인자들 및 다른 생리학적 활성들을 가지는 인자들, 뿐만 아니라 핵 재프로그램화 인자로서 기능할 수 있는 기타 다른 유전자 산물들을 포함할 수 있다.
핵 재프로그램화 인자는 단백질 또는 펩타이드를 포함할 수 있다. 단백질은 본 명세서에서 논의된 바와 같이 유전자로부터, 또는 대안으로 또 다른 단백질, 펩타이드 등을 가진 단백질의 융합 유전자 산물의 형태로 생산될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 형광 단백질 및/또는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP)를 가진 융합 단백질 또는 히스티딘 태그와 같은 펩타이드를 가진 융합 유전자 산물도 역시 사용될 수 있다. 좀 더 나아가, HIV 바이러스로부터 유래한 TAT 펩타이드를 가진 융합 단백질을 제조하고 사용하는 과정에 의해 핵 재프로그램화 인자의 세포막들을 통한 세포내 흡수가 촉진될 수 있어, 유전자 형질감염과 같은 복잡한 작동들을 피하면서 단지 융합 단백질을 배지에 첨가하는 과정에 의해서 재프로그램화의 유도가 가능해진다. 이러한 융합 유전자 산물들의 제조 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있기 때문에, 당업자들이라면 목적에 따라서 적절한 융합 유전자 산물을 쉽게 설계하고 제조할 수 있다.
본 명세서에서 논의되는 바, iPSC는 세포 내의 마이크로RNA 수준들 또는 활성을 변경시키는 제제 및/또는 p21 저해제와 조합으로 체세포를 핵 재프로그램화 인자와 접촉시켜서 유도될 수 있다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 체세포로의 전달은 당해 기술분야에서 알려져 있는 적합한 방법이라면 모두에 의해 수행될 수 있다. 한 가지 관점에서, 핵 재프로그램화 인자는 핵 재프로그램화 인자를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 유사하게, 마이크로RNA를 변경시키는 제제들은 마이크로RNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 등과 같은 RNA 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 유사하게, p21의 저해제는 마이크로RNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 등과 같은 펩타이드 저해제 또는 RNA 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 세포는 재조합 벡터 내에 포함되는 유전자의 산물로서 발현되는 핵 재프로그램화 인자를 발현할 뿐만 아니라 재조합 벡터 내에 포함되는 폴리뉴클레오타이드의 산물로서 제제 또는 p21 저해제를 발현할 수 있어, 핵 재프로그램화 인자 단독으로의 사용과 대비하여 증가된 효율로 분화된 세포의 재프로그램화를 유도한다.
재조합 벡터들과 같은 본 발명의 핵산 제작물은 비-바이러스성 기초한 세포의 형질전환 (transfection)과 같은 잘 알려진 다양한 기법들을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 대표적인 관점에서, 제작물은 벡터 내로 통합되고 제작물의 발현을 허용하도록 세포 내로 도입된다. 세포 내로의 도입은, 이에 제한되는 것은 아니지만 전기천공 (electroporation), 칼슘 포스페이트 매개성 전달, 뉴클레오펙션 (nucleofection), 초음파 천공 (sonoporation), 열충격, 자기성 형질전환 (magnetofection), 리포좀 매개성 전달, 미세주입 (microinjection), 마이크로투사 매개성 전달 (나노입자들), 양이온성 중합체 매개성 전달 (DEAE-덱스트란, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등) 또는 세포 융합과 같은 당해 기술분야에 알려져 있는 바이러스성 또는 비-바이러스성 기초한 형질전환에 의해 수행될 수 있다. 형질전환의 기타 다른 방법들은 리포펙타민TM (LipofectamineTM), 도진도 힐리맥스TM (Dojindo Hilymax TM), 퓨진TM (Fugene TM), 제트PEI TM, 이펙텐TM (Effectene TM) 및 드림펙트TM (DreamFect TM)와 같은 특허받은 형질전환 반응액들을 포함한다.
다른 관점들에서, 세포 내의 마이크로RNA 수준들 또는 활성을 변경시키는 제제 및/또는 p21의 저해제와 조합으로 체세포를 유도 동안 핵 재프로그램화 인자와 접촉시키는 과정은 당해 기술분야에서 알려져 있는 방법이라면 모두에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포막을 통한 단백질들, RNA 분자들 등의 직접적인 전달을 들 수 있다.
세포 내의 마이크로RNA 수준들 또는 활성을 변경시키는 제제 및/또는 p21의 저해제와 조합으로 핵 재프로그램화 인자의 사용은 핵 재프로그램화 인자 단독으로의 사용과 대비하여 유도 효율을 증가시킨다. 다양한 관점들에서, 유도 효율은 통상적인 방법들과 대비하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500 퍼센트 이상으로 증가될 수 있다. 예를 들어 유도 효율은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 50 퍼센트 정도일 수 있다 (예로, 시작하는 체세포들의 전체 수와 대비하여 유도된 세포들의 퍼센트).
유도 공정 동안, 체세포는 세포 내의 마이크로RNA 수준들 또는 활성을 변경시키는 제제 및/또는 p21의 저해제로 접촉되기 이전에 또는 이와 동시에 핵 재프로그램화 인자와 접촉될 수 있다. 다양한 관점들에서, 체세포는 세포가 다른 제제 또는 저해제라면 모두로 접촉되기 이전 약 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일째 이상에서 핵 재프로그램화 인자와 접촉된다. 대표적인 관점에서, 체세포는 세포가 다른 제제 또는 저해제라면 모두로 접촉되기 이전 약 1, 2, 3, 4, 또는 5일째에 핵 재프로그램화 인자와 접촉된다.
심화 분석이 재프로그램화된 세포의 다능성 특징들을 평가하도록 수행될 수 있다. 세포들은 서로 다른 성장 특징들 및 배아 줄기세포 유사 형태에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어, 세포들은 특이적 세포 유형들로 분화를 추진하는 것으로 알려져 있는 소정의 성장인자들을 첨가하여 시험관내에서 분화될 수 있다. 신체의 소수 세포 유형들만을 형성할 수 있는 재프로그램화된 세포들은 다능성을 가지는 (multipotent) 한편, 신체의 세포 유형이라면 모두를 형성할 수 있는 재프로그램화된 세포들은 다능성 (pluripotent)을 가진다.
또한 재프로그램화된 체세포들의 다능성 특징들을 평가하는 발현 프로파일 작성도 시행될 수 있다. 또한 다능성과 연관된 개별 유전자들의 발현도 조사될 수 있다. 추가적으로, 배아 줄기세포 표면 마커들의 발현도 분석될 수 있다. 당해 기술분야에서 다능성 줄기세포들과 연관된 것으로 알려져 있는 다양한 유전자들의 검출 및 분석은, 이에 제한되는 것은 아니지만 OCT4, NANOG, SALL4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, 또는 그들의 조합과 같은 유전자들의 분석을 포함할 수 있다. iPS 세포들은 알칼라인 포스파타제 (AP); ABCG2; 단계 특이적 배아 항원-1 (SSEA-1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERas/ECAT5, E-캐드헤린 (E-cadherin); 제 Ⅲ형 β-튜불린; α-민무늬근 액틴 (α-SMA); 섬유모세포 성장인자 4 (FGF4), 크립토 (Cripto), Dax1; 아연 손가락 단백질 296 (Zfp296); N-아세틸전이효소-1 (Nat1); ES 세포 연관 전사체 1 (ECAT1); ESG1/DPPA5/ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthll7; Sall4; 미분화된 배아세포 전사인자 (Utf1); Rex1; p53; G3PDH; TERT를 포함하는 텔로머라제; 침묵하는 X 염색체 유전자들; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-박스 포함하는 단백질 15 (Fbx15); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; 발생적 다능성-관련성 2 (DPPA2); T-세포 림프종 변곡점 1 (Tcl1); DPPA3/Stella; DPPA4; 뿐만 아니라 다능성에 대한 다른 일반적인 마커들 예를 들어 세포를 재프로그램하도록 유도 과정 동안 사용되는 유전자들이라면 모두:를 포함하는 많은 다능성 세포 마커들을 발현할 수 있다. 또한 IPS 세포들은 이로부터 iPS 세포가 유도되는 분화된 세포의 특징적인 마커들의 저하조절에 의해 특성분석될 수 있다.
좀 더 나아가, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 방법들을 사용하여 생산된 iPS 세포들, 뿐만 아니라 이러한 세포들의 집단들을 제공한다. 다양한 세포 유형들로의 분화할 수 있는 본 발명의 재프로그램된 세포들은 다양한 적용들 및 치료적 용도들을 가진다. 줄기세포들의 기본 특성들, 무한하게 자가-재생의 능력 및 신체에서의 모든 세포 유형으로 분화하는 능력은 그들을 치료적 용도들에 이상적인 것으로 만든다.
따라서 한 가지 관점에서, 본 발명은 좀 더 나아가 본 명세서에 기술된 방법들을 사용하여 생성된 유도된 다능성 줄기세포들을 사용하여 개체에서 장애 및/또는 병폐의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 방법은 개체로부터 체세포를 획득하고 본 명세서에서 기술된 방법들을 사용하여 체세포를 유도된 다능성 줄기 (iPS)로 재프로그램하는 과정을 포함한다. 다음으로, 세포는 병폐를 치료하는 데 적합한 원하는 세포 유형으로 세포를 분화하는 데 적합한 조건들 하에서 배양된다. 다음으로 분화된 세포는 병폐를 치료하거나 예방하도록 개체 내로 도입될 수 있다.
한 가지 관점에서, 본 명세서에서 기술된 방법들을 사용하여 생산된 iPS 세포들, 뿐만 아니라 이러한 세포들의 집단들은 세포들 내의 마이크로RNA 수준들 또는 활성들을 변경시키는 제제들과 세포들을 처리하거나 접촉시켜서 시험관내에서 분화될 수 있다. 마이크로RNAs가 iPSC 유도에서 핵심 조절인자들로서 확인되었기 때문에, 개별적 마이크로RNAs 또는 마이크로RNAs의 집단들의 조작이 이러한 iPSCs의 분화를 인도하는 데 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 처리는 특이적 세포 유형들로의 분화를 추진하도록 당해 기술분야에서 알려져 있는 성장인자들 또는 기타 다른 제제들 및 자극과 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 한 가지 장점은 이식에 적합한 동종 (isogenic) 또는 동계 (syngenic) 인간 세포들의 필수적으로 무제한적 공급을 제공하는 것이다. iPS 세포들은 면역 거부를 회피하도록 환자에게 특이적으로 맞춤 제작된다. 따라서, 이것은 현재까지의 이식 방법들과 연관된, 숙주 대비 이식편 또는 이식편 대비 숙주 거부 때문에 발생할 수 있는 이식된 조직의 거부와 같은 중대한 문제점을 없앨 것이다. iPS 세포들의 여러 종류들 또는 건강한 인간들로부터 유래한 체세포들로부터 나온 iPS 세포들로부터 제조되는 전적으로 분화된 체세포들은 세포들의 라이브러리로서 iPS 세포 은행에 보관될 수 있고, 라이브러리에서 iPS 세포들의 하나 이상의 종류들은 줄기세포 치료법을 받아야 할 환자에게 거부가 없는 체세포들, 조직들, 또는 기관들의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 iPS 세포들은 다양한 장애들을 당해 기술분야에서 알려져 있는 방법들에 의해 치료하도록 많은 서로 다른 세포 유형들로 분화될 수 있다. 예를 들어, iPS 세포들은 조혈 줄기세포들, 근육 세포들, 심장근 세포들, 간 세포들, 연골 세포들, 상피세포들, 뇨관 세포들, 신경 세포들 등으로 분화되도록 유도될 수 있다. 다음으로 분화된 세포들은 병폐를 예방하거나 치료하도록 환자의 신체 내로 역이식될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법들은 특정한 세포 유형/조직의 증가 또는 대체 또는 세포성 탈분화가 기대되는 심근 경색 (myocardial infarction), 울혈성 심부전 (congestive heart failure), 뇌졸중 (stroke), 허혈 (ischemia), 말단 혈관 질환, 알코올성 간질환, 간경변, 파킨슨씨 질환, 알츠하이머 질환, 당뇨병, 암, 관절염, 상처 치유, 면역결핍, 재생불량 빈혈, 빈혈, 헌팅턴씨 질환, 근육위축 측삭 경화증 (ALS), 리소좀 저장 질환들, 다발성 경화증, 척수 손상등, 유전적 장애들 및 유사한 질환들을 가진 개체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
다양한 구현예들에서, 본 방법은 조직 또는 기관의 세포들의 수를 해당하는 미치료된 대조군 조직 또는 기관과 대비하여 적어도 약 5%, 10%, 25%, 50%, 또는 75% 이상을 증가시킨다. 보다 또 다른 구현예에서, 방법은 조직 또는 기관의 생물학적 활성을 해당하는 미치료된 대조군 조직 또는 기관과 대비하여 적어도 약 5%, 10%, 25%, 50%, 또는 75% 이상을 증가시킨다. 보다 또 다른 구현예에서, 방법은 조직 또는 기관에서 혈관 형성을 해당하는 미치료된 대조군 조직 또는 기관과 대비하여 적어도 약 5%, 10%, 25%, 50%, 또는 75% 이상을 증가시킨다. 보다 또 다른 구현예에서, 세포는 세포수의 증가를 원하는 부위에서 개체에게 직접 투여된다.
좀 더 나아가, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 방법들에 의해 획득되는 다양한 세포들을 사용하여 제제, 화합물, 약제, 독 등의 생물학적 기능 또는 독성을 평가하는 방법을 제공한다.
체세포들은 유도된 다능성 줄기세포들 (iPSCs)를 만들도록 네 가지의 전사인자들, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 이소성 발현에 의해 ES-유사 상태로 재프로그램될 수 있다. 본 발명은 세포성 마이크로RNAs가 iPSC 생성을 조절하는 점을 제공한다. 핵심 마이크로RNA 경로 단백질들의 녹-다운은 재프로그램화 효율에서 유의한 감소들을 가져올 수 있다. 세 가지의 마이크로RNA 집합들, miR-17~92, 106b~25 및 106a~363은 초기 재프로그램화 단계들 동안 높게 유도되는 것으로 관찰되어 왔다. 매우 유사한 종자 영역들을 가지는 miR-93 및 miR-106b를 포함하는 여러 가지의 마이크로RNAs는 iPSC 유도를 크게 증진시켰고 이들 마이크로RNAs를 저해하는 것은 재프로그램화 효율을 감소시켰다. 더우기, miR-iPSC 클론은 전적으로 재프로그램된 상태에 도달할 수 있었다. 본 발명은 Tgfbr2 및 p21이 이들 마이크로RNAs에 의해 직접적으로 표적되고 따라서 유전자들 둘 다의 siRNA 녹-다운이 iPSC 유도를 증진시켰던 점을 제공하고 있다. 또한 본 발명은 miR-93 및 그의 패밀리 구성원들이 iPSC 재프로그램화를 증진시키도록 제 Ⅱ형 TGF-β 수용체를 직접적으로 표적하는 점도 제공한다. 본 발명은 마이크로RNAs가 재프로그램화 공정에서 기능하고 iPSC 유도 효율이 세포 내의 마이크로RNAs를 조정하여 크게 증진될 수 있는 점을 제공하고 있다.
유도된 다능성 줄기세포들 (iPSCs)가 맞춤-재생성 의약에 대한 큰 전망을 가지고 있긴 하더라도, 재프로그램화의 분자적 근거는 대부분 미지로 남아있다. 세포 정체성들을 유지하는 장벽들을 극복하는 것이 분화된 세포들의 재프로그램화에서 결정적인 단계이다. 마이크로RNAs (miRANs)는 표적 유전자들을 조직-특이적으로 조정하기 때문에, 본 발명은 구별되는 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)-농축강화된 miRNAs가 재프로그램화 장벽들로서 기능하는 단백질들을 후-해독적으로 조정하는 점을 제공한다. 이들 miRNAs를 저해하는 것이 이들 장벽들을 낮추도록 세포 신호전달에 영향을 주어야 한다. 본 발명은 miR-21 및 miR-29a를 고갈시키는 것이 MEFs에서 재프로그램화 효율을 증진시키는 점을 제공한다. 본 발명은 p53 및 ERK1/2 경로들이 miR-21 및 miR-29a에 의해 조절되고 재프로그램화에서 기능하는 점을 제공한다. 본 발명은 c-Myc이 miR-21 및 miR-29a와 같은 MEF-농축강화된 miRNAs를 억제하여 부분적으로 재프로그램화를 좀 더 증진시키는 점을 제공한다. 본 발명은 miRNA가 iPSC 재프로그램화에 관여하는 다수의 신호전달 망들을 조절하는 데 기능하는 점을 제공한다.
네 가지의 재프로그램화 인자들 (4F: Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc)의 하나인 c-Myc은 세포 증식 및 종양 발생에서 결정적인 역할들을 담당한다. C-Myc은 사이클린-의존성 키나제 (CDK) 저해제 p21Cip1의 억제를 통한 세포 색전 (cytostasis) 및 세포 사멸의 핵심 조절인자이다. Miz-1 기능을 없애고 p15INK4b을 억제하여, c-Myc는 일차 세포들의 불멸화에서 결정적인 역할을 담당한다. 많은 c-Myc의 전사 기능들은 Max 또는 Miz-1의 협력을 요구한다. 원시-종양원 유전자 c-Myc은 재프로그램화를 위해 꼭 필요하지는 않더라고 재프로그램화 효율을 크게 증진시킨다. 따라서, 재프로그램화 동안 c-Myc의 하류 분자적 경로들을 정의하는 것은 재프로그램화 효율을 저하시키지 않고도 iPS 세포들의 치료적 적용을 증진할 수 있다.
Oct4-GFP 마우스 배아 섬유모세포들 (MEFs)은 pou5f1의 종결 코돈 (잭슨 랩사 (Jackson Lab), 스톡 번호 #008214) 하류 D13.5에서 IRES-EGFP 융합 카세트를 보유하는 마우스로부터 유래한다. 이들 MEFs는 글루타민 및 NEAA를 더한 10% FBS (인비트로겐사 (Invitrogen))를 가진 DMEM (인비트로겐사, 11995-065)에서 배양된다. iPSC 유도의 경우 0 내지 5회 계대 배양된 MEFs만이 사용된다.
C-Myc은 마이크로RNA (miRNA) 발현을 조절하여 부분적으로 ES 세포 재생을 유지하도록 작용하는 것으로 보고되어 있다. 마이크로RNAs는 전반적인 유전자-침묵 기능을 나타내도록 RNA-유도성 침묵 복합체 (RISC) 내에 로딩되는, 22개-뉴클레오타이드의 비-코딩하는 작은 RNAs이다. miR-141, miR-200, 및 miR-429의 발현은 분화를 길항하도록 ES 세포들에서 c-Myc에 의해 유도된다. c-Myc은 miR-17-92 마이크로RNA 집합을 상승조절하여, 또는 let-7 패밀리, miR-15a/16-1, miR-29 패밀리, 및 miR-34a와 같은 기지의 종양 억제인자들을 억제하여 종양형성화 (tumorigenesis)도 역시 촉진한다.
체세포 정체성을 지키고 Ink4-Arf, p53, 및 p21와 같은 인자들에 의해 매개되는 장벽들을 극복하는 과정은 재프로그램화에서 속도-제한 단계이다. miRNAs가 표적 유전자들을 조직-특이적으로 조정하기 때문에, 본 발명은 구별되는 MEF miRNAs가 재프로그램화 조절인자들로서 기능하는 단백질을 후-전사적으로 조정하는 점을 제공한다. 이들 miRNAs를 저해하는 것이 이들 장벽들을 낮추도록 세포 신호전달에 영향을 줄 수 있다.
본 발명은 MEFs에서 풍부한 miRNAs miR-21 및 miR-29a를 고갈시키는 것이 재프로그램화 효율을 ~ 2.1 내지 2.8배 증진시키는 점을 제공한다. 또한 본 발명은 c-Myc이 MEFs의 재프로그램화를 증진하도록 miRNAs miR-21 및 miR-29a을 억제하는 점을 제공한다. 좀 더 나아가, 본 발명은 miR-21 및 miR-29a가 재프로그램화 공정 동안 p53 수준들 및 ERK1/2 인산화를 간접적으로 저하조절하여 p53 및 ERK1/2 경로들을 조절하는 점을 제공한다.
다음의 실시예들은 본 발명의 구현예들을 좀 더 설명하도록 제공되지만, 본 발명의 범위를 한정하도록 의도하지는 않는다. 그들이 사용될 수 있는 것들의 전형이 되며, 당업자라면 숙지하고 있는 다른 절차들, 방법론들, 또는 기법들이 대안으로 사용될 수 있다.
실시예 1
세포 배양, 벡터들, 및 바이러스 형질감염
Oct4-GFP 마우스 배아 섬유모세포들 (MEFs)은 pou5f1의 종결 코돈 (잭슨 랩사, 스톡 번호 #008214) 하류 D13.5에서 IRES-EGFP 융합 카세트를 보유하는 마우스로부터 유래한다. 이들 MEFs는 글루타민 및 NEAA를 더한 10% FBS (인비트로겐사)를 가진 DMEM (인비트로겐사, 11995-065)에서 배양된다. iPSC 유도의 경우 0 내지 5회 계대 배양된 MEFs만이 사용된다.
플라스미드들 pMXs-Oct4, Sox2, Klf4 및 cMyc는 애드진사 (Addgene)로부터 구입한다. 플라스미드 pMX-HA-p21는 N-말단 태그된-p21을 pMX 벡터의 EcoRI 부위 내로 삽입하여 생성된다. pLKO-shRNAs의 클론들은 오픈-바이오시스템사 (Open-Biosystems)로부터 구입한다.
레트로바이러스를 생성하기 위하여, PLAT-E 세포들은 10 cm 플레이트들에서 접종되고 9 μg의 각 인자들은 다음날 리포펙타민TM (LipofectamineTM) (인비트로겐사, 18324-012) 및 PLUSTM (인비트로겐사, 11514-015)를 사용하여 형질전환된다. 바이러스들은 수확 이후 2일째에 조합된다. iPSC 유도를 위해, MEFs는 12-웰 플레이트들에서 접종되고, 다음날 4 μg/mL 폴리브렌을 사용하여 네 가지 인자 바이러스로 형질감염된다. 형질감염 하루 이후에, 배지는 신선한 MEF 배지로 교환되고 3일 이후에 LIF (밀리포아사 (Millipore), ESG1107)가 보충된 mES 배양 배지로 교환된다. GFP+ 콜로니들은 형질감염 이후 14일째부터 선별되고 성공적으로 증식된 클론들은 LIF, 티오글리세롤, 글루타민 및 NEAA를 더한 15% FBS (하이클론사 (Hyclone))를 가지는 DMEM에서 배양되었다. 방사선 조사된 CF1 MEFs가 mES 및 유래된 iPSC 클론들의 배양을 위한 피더 층으로서 사용된다.
shRNA 렌티바이러스를 생성하기 위하여, shRNA 렌티바이러스 벡터들이 pPACKH1 패키징 시스템 (SBI사, 카탈로그 번호 LV500A-1)과 함께 293FT 세포들 내로 공형질전환된다. 렌티바이러스들은 형질전환 이후 2일째에 수확되고 상온에서 1분 동안 4,000 rpm으로 원심분리된다. 바이러스를 생산하기 위하여, 4 μg의 pLKO 또는 pGIPZ 벡터들 또한 10 μg의 패키징 믹스가 10 cm 배양 플레이트들에 넣은 293FT 세포들 (인비트로겐사) 내로 형질전환되었다. 형질전환 이후 2일째에 바이러스를 포함하는 상청액은 수확되고, 좀 더 나아가 4 μg/μL 폴리브렌으로의 형질감염에 사용된다. ShRNA 바이러스는 1 : 1 : 1 : 1 : 1의 부피 비율로 4가지 인자 바이러스와 함께 첨가된다.
마이크로RNAs, siRNAs 및 MEFs의 형질전환은 다음과 같이 수행된다: 마이크로RNA 모방체들 및 저해제들, siRNAs는 다르마콘사 (Dharmacon)로부터 구입한다. MEFs를 형질전환하기 위하여, 마이크로RNAs 모방체는 원하는 최종 농도로 Opti-MEM (인비트로겐사, 11058-021)에 넣어 희석된다. 다음으로 리포펙타민TM 2000 (인비트로겐사, 11668-019)이 2 μL/웰로 믹스 내에 첨가되고 상온에서 20분 동안 배양된다. 12-웰 형질전환을 위해, 80 μL miR 혼합물이 320 μL의 Opti-MEM과 각 웰로 첨가된다. 세 시간 이후에, 0.8 mL의 바이러스 혼합물 (iPSC의 경우) 또는 신선한 배지가 각 웰에 첨가되고 배지는 다음날 신선한 MEF 배지로 교환된다.
웨스턴 블럿팅은 다음과 같이 수행된다: 전체 세포 용출물들이 얼음 위에서 20분 동안 MPER 완충용액 (피어스사 (PIERCE), 78503)을 사용하여 제조되고 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 분리된다. 동일한 부피의 용출물들이 10% SDS-PAGE 젤들에 로딩되고, 단백질들은 PVDF 막 (바이오-래드사 (Bio-Rad), 1620177)으로 반-건조 시스템 (바이오-래드사)을 사용하여 트랜스퍼된다. 다음으로 PVDF 막들은 TBST에 넣은 5% 밀크로 적어도 1시간 동안 상온에서 또는 4℃에서 하룻밤 동안 차단된다.
사용된 항체들로는 항-p21 (BD, 556430), 항-mNanog (R&D, AF2729), 항-h/mSSEA1 (R&D, MAB2156), 항-HA (로슈사 (Roche), 11867423001), 항-mAgo2 (와코사 (Wako), 01422023), 항-다이서 (anti-Dicer, 앱캠사 (Abcam), ab13502), 항-드로샤 (anti-Drosha, 앱캠사, ab12286), 항-액틴 (써모사 (Thermo), MS1295 P0), 항-AFP (앱캠사, ab7751), 항-제 Ⅲ형 튜불린 (R&D 시스템사, MAB1368), 항-α액티닌 (anti-α actinin, 시그마사 (Sigma), A7811)을 포함한다.
mRNA 및 마이크로RNA RT 및 정량적 PCR이 다음과 같이 수행된다: 전체 RNAs가 트리졸 방법 (인비트로겐사)에 의해 추출된다. 추출 이후에, 1 μg 전체 RNA가 슈퍼스크립트 ⅡTM (Superscript ⅡTM, 인비트로겐사)에 의한 RT에 사용된다. 정량적 PCR은 로슈 라이트사이클러 480 ⅡTM (Roche LightCycler480 ⅡTM) 및 앱진사로부터 나온 사이버그린 (Sybrgreen) 혼합물 (Ab-4166)을 사용하여 수행된다. 마우스 Ago2, 다이서, 도로샤, 그라프 (Graph), 및 p21에 대한 프라이머들은 하기 표 1에 나열되어 있다. 기타 다른 프라이머들은 Takahashi, K. and S. Yamanaka (2006) Cell 126(4): 663-76에 기술되어 왔다.
마이크로 RNA 정량 분석을 위해, 전체 RNA가 상기 기술된 방법을 사용하여 추출된다. 추출 이후에, 1.5 ~ 3 μg의 전체 RNA가 제조사의 프로토콜 (SBI사, RA420A-1)에 따라서 QuantiMirTM 키트를 사용하여 마이크로RNA 역전사에 사용된다. 다음으로 RT 산물들이 정방향 프라이머로서 성숙한 마이크로RNA 서열 및 키트로 제공되는 일반 (universal) 프라이머를 사용하여 정량적 PCR에 사용된다.
면역염색은 다음과 같이 수행된다: 세포들은 PBS로 두 번 세척되고 4% 파라포름알데하이드로 상온에서 20분 동안 고정된다. 고정된 세포들은 0.1% 트리톤 X-100으로 5분 동안 투과되었다. 다음으로 세포들은 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 PBS에 넣은 5% BSA로 상온에서 1시간 동안 차단된다. 일차 항체는 제조사의 제안에 따라 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 2.5% BSA PBS에 넣은 1 : 100로부터 1 : 400까지로 희석된다. 다음으로 세포들은 일차 항체로 1시간 동안 염색된 다음 PBS로 세 번 세척된다. 이차 항체는 1 : 400으로 희석되고 세포들은 상온에서 45분 동안 염색된다.
배아체 (embryoid body, EB) 형성 및 분화 검정법들은 다음과 같이 수행된다: iPS 세포들은 단일 세포 현탁액으로 트립신 처리되고 공중 점적 방법 (hanging drop method)이 배아체들을 생성하는 데 사용된다. 각 점적의 경우, 20 μL EB 분화 배지에 넣은 4,000개의 iPS 세포들이 사용된다. EBs는 젤라틴 코팅된 플레이트들 내에 재접종되기 이전 3일 동안 공중 점적으로 배양된다. 재접종 이후에, 세포들은 착지 영역들이 분명하게 확인될 수 있는 14일까지 좀 더 배양된다.
하기 표 1은 qPCR 분석을 위한 프라이머들을 나타낸다.
Figure pct00001
프로모터 메틸화 분석은 다음과 같이 수행된다: Nanog 및 Pou5f1 프로모터의 CpG 메틸화는 이전에 기술된 동일한 절차를 따라서 분석된다 (Takahashi, K. and S. Yamanaka (2006) Cell 126(4): 663-76). 간략하게, 유래된 클론들의 게놈 DNA가 퀴아젠TM 키트 (QiagenTM kit)를 사용하여 추출된다. 다음으로 1 μg의 DNA가 제조사의 프로토콜에 따라 게놈 변형 분석에 사용된다 (EZ DNA 메틸화 - 다이렉트 키트 (Direct kit), 자이모 리서치사 (Zymo Research), D5020). 변형 이후에, 선택된 영역들의 PCR이 수행되고 산물들은 pCR2.1-TOPOTM (인비트로겐사) 내로 클론된다. 각 유전자를 위해 열 개의 클론들이 서열결정된다.
실시예 2
기형종 형성, 키메라 생성, 및 마이크로어레이 분석
기형종 (teratoma) 형성 및 키메라 생성은 다음과 같이 수행된다: 기형종을 생성하기 위하여, iPS 세포들이 트립신 처리되고 1 x 107개의 세포/mL의 농도로 재현탁된다. 무흉선 누드 마우스는 먼저 아버틴 (Avertin)으로 안락사된 다음 대략 150 μL의 세포 현탁액이 각 마우스 내로 주입된다. 마우스들은 종양에 대해 매주 3 내지 4 주 동안 조사된다. 종양들은 수확되고 파라핀 임베딩 및 H & E 염색 이전에 상온에서 24시간 동안 아연 포르말린 용액으로 고정된다. 키메라들에 기여하는 유래된 iPSC 클론들의 능력을 시험하기 위하여, iPS 세포들은 C57BL/6J-Tyr(C-2J)/J (흰둥이) 포배들 내로 주입된다. 일반적으로, 각 포배는 12 내지 18개의 iPS 세포들을 받아들인다. ICR 수여자 수컷들은 배아 전달에 사용된다. 공여자 iPS 세포들은 기니아 피크 또는 검둥이 색으로 있다.
mRNA 마이크로어레이 분석은 다음과 같이 수행된다: miR-93 및 si대조군이 MEFs 내로 형질전환되고 전체 RNAs가 형질전환 이후 48시간째에 수확된다. mRNA 마이크로어레이는 스탠포드-번햄 연구소 (Sanford-Burnham institute)에서 마이크로어레이 시설에 의해 수행된다. 잠재적인 기능성 표적들 (배수 변화 > 2, p < 0.05) 및 전체 표적들 (배수 변화 > 25%, p < 0.05)을 위한 유전자 리스트들은 볼캐노 지도들을 통하여 여과되어 생성된다. 다음으로 유전자 리스트들은 회사로부터 나온 지침들에 따라 진고 (GeneGo) 소프트웨어를 사용하여 실체론 (ontology) 분석에 사용된다.
이중 루시퍼라제 검정법 (Dual luciferase assay)은 다음과 같이 수행된다: p21 및 Tgfbr2의 3'UTR이 pGL3 대조군 벡터들의 XbaI 부위 내로 클론된다. 12-웰 플레이트들의 각 웰의 경우, 200 ng의 결과로 나온 벡터들 및 50 ng의 pRL-TK (레닐라 루시퍼라제 (renilla luciferase))가 형질전환 하루 이전에 접종된 1 x 105개의 HeLa 세포들 내로 형질전환된다. 50 nM의 마이크로RNAs가 각 처리에 사용되고 세포 용출물들은 형질전환 이후 2일째에 수확된다. 다음으로 2 μL의 용출물들이 제조사의 프로토콜에 따라 이중 루시퍼라제 검정법에 사용된다 (이중-루시퍼라제® 리포터 어세이 시스템, 프로메가사 (Promega), E1910).
세포 증식 검정법이 다음과 같이 수행된다: 3,000개의 MEFs가 96-웰 플레이드의 각 웰 내로 접종되고 4F 바이러스 및 shRNA 렌티바이러스로 형질감염된다 (또는 마이크로RNA 저해제들로 형질전환된다). 형질감염/형질전환 이후 1일째부터 시작하여, 이틀 마다 세포들은 셀타이터 96 수성 용액 (Celltiter 96 Aqueous one solution) (프로메가사, G3580)을 포함하는 mES 배지로 배양된다. 다음으로 490 nm에서 흡광도가 플레이트 해독기를 사용하여 각 웰에서 측정되고 수집된 결과는 기준으로서 형질감염/형질전환 이후 1일째부터 나온 신호를 사용하여 상대적인 증식 곡선을 생성하는 데 사용된다.
실시예 3
후-전사적 조절 경로가 체세포들을 재프로그램화하는 데 관여한다
후-전사적 조절 경로가 MEFs의 iPS 세포들로의 재프로그램화에 관여하는 것으로 결정되었다. iPSC 유도 동안 후-전사적 유전자 조절의 역할을 조사하기 위하여, 마우스 다이서, 드로샤 및 Ago2를 표적하는 렌티바이러스성 shRNA 벡터들이 일차 Oct4-GFP MEFs에서 안정한 녹-다운에 사용된다. 이들 shRNA 제작물들의 녹-다운 효율은 웨스턴 및 RT-qPCR 둘 다에 의해 입증된다 (도 1a, 도 1b, 및 도 1c). 대략 70% 내지 80%의 mRNA 수준 녹-다운 뿐만 아니라 단백질 수준들에서 유의한 감소들이 각 shRNA의 경우에 일상적으로 관찰된다.
다음으로 shRNAs가 네 가지 인자들 OSKM (Oct4, Sox2, Klf4, 및 cMyc)을 1 : 1 : 1 : 1 : 1의 부피 비율로 발현하는 바이러스들로 MEFs를 형질감염하는 데 분리되어 사용된다. 14일 이후에, 콜로니들은 고정되고 ES 세포 마커로서 널리 사용되는 알칼라인 포스파타제 (AP) 활성으로 염색된다. AP+ 콜로니들은 각 처리를 위해 정량되고 핵심 RNAi 기제 단백질들, 다이서, 드로샤 및 Ago2의 녹-다운은 pLKO 및 pGIPZ 대조군들과 대비하여 AP+ 콜로니들의 극적인 감소를 가져온다. 유사한 결과들이 OSK (세 가지 인자들 3F) 형질감염을 사용하여 관찰된다.
GFP+ 및 AP+ 콜로니 정량 둘 다는 Ago2를 녹-다운하는 것이 재프로그램화 효율을 극적으로 감소시키는 한편 형질감염된 섬유모세포들의 증식은 영향을 받지 않는 점을 입증하였다 (도 1d, 도 1e, 및 도 1f). Ago2 녹다운 시 재프로그램화 효율에서의 감소에도 불구하고, shAg2에서 일정 GFP+ 콜로니들은 MEFs를 감염시켰고, 심화된 특성분석은 이들 콜로니들이 shRNAs가 활발하게 발현되는 shRNA 통합에 대해 양성인 점을 결정하였다 (도 13a 및 도 13b). 이들 세포들도 역시 모든 시험된 ES-특이 마커들을 발현하고 내인성 Oct4 좌위를 발현시켰다 (도 13c). 이들 결과들은 후-전사적 조절이, 특히 마이크로RNAs가 재프로그램화 공정에서 결정적인 역할을 담당하는 점을 강하게 제시하였다.
실시예 4
마이크로RNA 집합들이 체세포들의 재프로그램화 동안 유도된다
마이크로RNA miR-17, 25, 106a 및 302b 집합들은 재프로그램화의 초기 단계 동안 유도되는 것으로 결정되었다. 네 가지의 전사인자들이 iPSC 유도 동안 많은 유전자 발현 변화들을 유도하기 때문에, 일정의 ES 특이 마이크로RNAs가 이들 인자들에 의해 유도될 수 있는 것이 추론되고, 이는 MEFs가 성공적으로 재프로그램되도록 도와줄 수 있다. 또한 iPSC 유도를 증진시키는 ES 특이 마이크로RNA에 관한 최근의 출간물도 보고된 마이크로RNAs가 재프로그램화의 아주 후기 단계까지 발현되는 것으로 밝혀져 있지는 않더라도 본 가설을 뒷받침한다. 보고된 결과들을 분석하여, 마우스 ES 세포들에서 높게 발현되는 것으로 결정된 9가지의 마이크로RNA 집합들이 분석을 위해 선별되었고 표 2에 나타낸다.
각 집합으로부터 나온 두 가지의 대표적인 마이크로RNAs가 OSKM 인자들의 형질감염 이후에 0일, 4일, 8일 및 12일을 포함하는 서로 다른 재프로그램화 단계들에서 발현 변화들을 정량하도록 miR qPCR 기초한 방법을 사용하여 평가된다. miR-290 집합 및 miR-293 집합과 같은 많은 ES-특이 마이크로RNAs는 GFP+ 콜로니가 이미 검출가능한 8일까지 유도되지 않는다 (도 14). miR-17~92, 25~106b, 106a~363 및 302b~367를 포함하는 기타 다른 마이크로RNA 집합들은 네 가지 인자 형질감염 이후 4일까지는 다양한 정도들로 발현된다 (도 2a). 이들 네 가지 마이크로RNA 집합들 중에서 MEF의 miR-302b~367 수준이 가장 낮다. 재프로그램화 4일에서 높게 발현된 세 가지 집합들 중에서, 일부가 매우 유사한 종자 영역들을 공유하였고 (도2b), 그들이 재프로그램화에서 기능하고 유전자들의 유사한 세트들을 표적할 수 있는 점을 제시한다.
하기 표 2는 iPSC 실험들에 사용되는 마이크로RNAs의 리스트를 나타낸다.
Figure pct00002
다음으로 분석이 네 가지 인자들의 어느 것이 이들 마이크로RNAs의 유도를 부여하는 지 여부를 결정하도록 수행된다. MEFs를 동일한 용량의 네 가지 인자들의 서로 다른 조합들로 형질감염하여, 전체 RNAs가 miR qPCR 분석을 위해 감염 이후 4일째에 수확된다 (도 2c). 본 분석은 cMyc이 단독으로 miR-17~92, miR-25~106b 및 miR-106a~363 집합들 발현을 유도할 수 있는 점을 입증한다. 그러나 모든 경우들에서, 모든 네 가지의 재프로그램화 인자들의 조합이 마이크로RNA 집합들의 가장 왕성한 발현을 유도하였고, 본 건강한 발현은 가장 높은 재프로그램화 효율과도 상호관련되어 있다 (도 2c).
이들 결과들은 miR-17~92, 25~106b 및 106a~363을 포함하는 세 가지의 마이크로RNA 집합들이 재프로그램화의 초기 단계 동안 유도되고, 좀 더 나아가 이들 마이크로RNAs의 발현이 단일 인자들도 역시 더 적은 정도로 그들의 발현을 유도할 수는 있더라도, 네 가지 인자들 모두에 의해 가장 높게 유도되는 점을 확인해 주었다.
실시예 5
마이크로RNAs는 IPSC 유도를 증진시킨다
마이크로RNAs miR-93 및 miR-106b는 마우스 iPSC 유도를 증진하는 것으로 결정된다. 네 가지의 확인된 마이크로RNA 집합들이 유사한 종자 영역들을 가지는 여러 가지의 마이크로RNAs를 포함하고, miR-106b~25 집합은 본 집합이 3가지의 마이크로RNAs (예로, miR-25, miR-93 및 miR-106b)를 포함하기 때문에 좀 더 심화 분석된다. MiR-93 및 miR-106b은 일치하는 종자 영역을 가지고, 또한 둘 다는 네 가지의 재프로그램화 인자들에 의해 높게 유도된다 (도 2a). 이들 마이크로RNAs가 재프로그램된 세포들에서 기능적인 경우라면, iPSC 유도의 증가된 효율이 이들 마이크로RNAs를 공정 동안 도입하는 과정에 의해 예상된다.
마이크로RNA 모방체들을 MEFs 내로 직접적으로 형질전환하는 전략이 이들 유도된 마이크로RNAs의 기능적 시험에 사용된다 (도 3a). 마이크로RNAs는 네 가지 인자 (또는 OSK) 바이러스와 함께 0일 및 5일에 두 번 도입되고, 내인성 Oct4 프로모터의 조절 하에 GFP 발현을 가지는 리포터 MEF가 사용되었다. 예를 들어, 마이크로RNA 모방체들은 Oct-4-GFP를 보유하는 MEFs 내로 0일 및 5일에 모두 네 가지 인자들 (4F, OSKM) 또는 단지 Oct4, Sox2, 및 Klf4 (OSK)만을 발현하는 벡터들로 직접적으로 형질전환되고, GFP 발현을 근거로 하는 재프로그램화를 검정한다. 이들 세포들이 iPSCs 내로 성공적으로 재프로그램될 때, 그들은 GFP 양성(+)이 된다. GFP+ 콜로니들은 재프로그램화 효율을 평가하도록 11일 근방에서 정량된다 (도 3b; 표 3). 따라서, miR-93 및 miR-106b 모방체들의 형질전환은 4F 및 OSK 형질전환 둘 다에서 GFP+ 콜로니들의 약 4 내지 6배 증가를 가져왔고 (도 3c), iPSC 유도 동안 유도되는 이들 마이크로RNAs가 MEF 재프로그램화를 용이하게 하는 것을 입증하고 있다.
하기 표 3은 iPSC 유도를 위한 miRs를 가진 GFP+ 콜로니들의 수를 나타낸다.
Figure pct00003
용량 의존성 실험은 증진된 재프로그램화 효율이 5 내지 15 nM 범위 정도의 낮은 miRS에서 관찰될 수 있는 점을 보여준다 (도 7). 콜로니들이 알칼라인 포스파타제 기질들로 염색될 때, miR 모방체 형질전환들의 경우 AP+ 콜로니들의 유의한 증가가 전혀 없는 것으로 보여지고, miR-93 및 miR-106b가 iPSC 콜로니들의 성숙 공정을 용이하게 할 수 있는 점을 제시한다. 이것은 또한 많은 GFP+ 콜로니들이 miR 모방체 형질전환된 세포들에서 OSK 형질감염 이후 15일째에 보여지는 한편 대조군 웰들은 본 단계에서 성숙한 iPSC 콜로니들을 나타내지 않았던 OSK 시스템을 사용하여 관찰된 현상에 의해 뒷받침된다.
이들 마이크로RNAs가 iPSC 유도에서 중요한 것을 입증하기 위하여, miR 저해제들도 공정 동안 표적된 마이크로RNAs를 녹다운하는 데 역시 사용된다. 시험된 miR 저해제들 모두가 표적 miR 발현을 효율적으로 감소시킬 수 있고 그들의 형질전환은 증식에 영향을 주지 않는다 (도 16a 및 도 16b). miR 모방체 실험들과 일관적으로, miR-93 및 miR-106b 녹-다운은 GFP+ 콜로니들의 극적인 감소를 촉진할 수 있다 (도 3d). miR-25 모방체가 MEF iPSC 유도를 증진하지 않더라도, 본 마이크로RNA를 녹다운하는 것은 재프로그램화 효율을 약 ~ 40% 감소시키고 (도 3d), miR-25도 역시 재프로그램화 공정 동안 기능할 수 있는 점을 제시한다. 대조군으로서, Let7a 저해제는 재프로그램화 효율에 영향을 미치지 않았다. 이들 결과는 miR-93 및 miR-106b가 MEFs의 iPSCs로의 재프로그램화를 촉진하는 것을 강하게 표시한다. 재프로그램화 효율은 iPSC 유도 동안 이들 마이크로RNAs를 조정하여 좀 더 증진될 수 있다.
실시예 6
마이크로RNA-유도성 클론들이 전적으로 다능성을 가진다
유도된 세포들이 전적으로 다능성 상태에 도달하는지 여부를 조사하기 위하여, 각 마이크로RNA 및 miR 대조군의 여러 가지 iPSC 클론들이 유도되고 다능성 마커들의 발현에 대해 분석된다. 모든 클론들은 재활성화된 Oct4 발현의 GFP+ 표시를 나타낸다. 면역염색도 역시 Nanog 및 SSEA1가 모든 클론들에서 활성화되는 것을 입증하였다. Eras, ECat I 및 내인성 Oct4와 같은 다른 mES 마커들에 대한 RT-qPCR은 유사한 결과를 보여준다. 게놈 전부의 mRNA 발현 프로파일 작성도 역시 유도된 클론들이 MEFs보다는 마우스 ES 세포들과 더 유사한 유전자 발현 양상을 나타내는 것을 표시하고 있다. 내인성 Nanog 좌위의 프로모터 메틸화가 분석되어, 모든 시험된 클론들이 마우스 ES 세포들에서 관찰된 바와 같이 탈-메틸화된 프로모터들을 보여주었다 (도 17).
유래된 클론들이 mES 세포들의 전적인 분화 능력을 나타내는지 여부를 조사하기 위하여, 배아체 (EB) 형성이 평가되었다. 모든 유래된 클론들은 효율적인 EB 형성을 보여주고, EBs는 제 Ⅲ형 β-튜불린 (외배엽), AFP (내배엽) 및 α-액티닌 (중배엽)과 같은 계열 마커들에 대한 양성 염색을 보여준다. EBs 조사도 역시 이들 세포들로부터 유래한 것이고, 기능적 심근세포들는 이들 miR-iPSC 클론들로부터 유래될 수 있는 점을 표시한다. 이들 miR-iPSCs가 무흉선 누드 마우스 내로 주입될 때, 기형종이 3 내지 4 주 내에 바로 유도된다. 최종적으로 더 엄격한 시험에서, miR-유래성 iPSC 클론들이 흰둥이/검둥이 B6 포배들 내로 주입되고 키메라 마우스들이 생성된다. 또한, 이들 세포들은 유래된 E13.5 배아들의 생식선 (genital ridge)에 기여할 수 있다. 이들 결과들은 재프로그램화에 미치는 miR-93 및 miR-106b이 효과를 증진하는 것이 유도된 다능성 세포들의 분화 능력을 변경하지 못하고 이들 유래된 클론들이 모두 세 가지의 생식 계열들로 분화할 수 있는 점을 표시한다.
실시예 7
MiR-93 및 MiR-106b는 마우스에서 Tgfbr2 및 P21을 표적한다
재프로그램화 효율의 miR-93 및 miR-106b 증진을 뒷받침하는 기작을 좀 더 이해하기 위하여, 이들 마이크로RNAs의 세포성 표적들이 조사된다. MiR-93가 miR-106b와 동일한 종자 영역을 공유하기 때문에 분석을 위해 먼저 선택된다. MiR-93 모방체들은 MEFs 내로 형질전환되고, 전체 RNAs가 mRNA 발현 프로파일 분석을 위해 2일째에 수확된다. 본 분석은 MEFs 및 iPSCs의 보고된 발현 프로파일들과 비교하여 miR-93의 잠재적인 기능적 표적들을 확인해 준다. miR-93 형질전환 시 유의하게 감소되는 유전자들은 iPSCs에서 낮게 발현되는 유전자들의 세 배의 농축강화를 보여주는 한편 (도 18a), miR-93 형질전환 시 증가되는 유전자들은 이러한 농축강화를 보여주지 않는다. 또한 경로 실체론 분석이 miR-93 형질전환된 MEFs의 발현 프로파일을 위해 수행된다. 흥미롭게도, iPSC 유도의 두 가지 중요한 경로들은 miR-93에 의해 조절된다: TGF-β 신호전달 및 G1/S 전환 (transition) 경로들.
TGF-β 신호전달의 경우, Tgfbr2는 miR-93 형질전환 시 가장 유의하게 감소되는 유전자들의 하나이다. Tgfbr2는 TGF-β 신호전달에서 결정적인 역할을 담당하는 전신적으로 활성을 가진 수용체 키나제이고, 최근의 소분자 검색들은 그의 헤테로이중체 상대방 Tgfbr1의 저해제들이 iPSC 유도를 증진하는 것을 가르키고 있다. 마이크로RNA 표적 부위 예측은 그의 3'UTR에서 miR-93 및 그의 패밀리 마이크로RNAs를 위한 두 개의 보존된 표적화 부위가 존재하는 것을 제시하고 있다. 따라서 miR-93은 심화 조사를 위한 첫 번째 후보 표적으로서 선택된다.
G1/S 전환에 관하여, 인간 종양 시료들 (유방, 결장, 신장, 위장 및 폐) 및 위암 세포주들에서 최근의 결과들이 miR-106b~25 집합들이 CDK 저해제들 p21 및 p57과 같은 세포 주기 조절인자들을 표적하고 인간 및 마우스 p21이 3'UTR에서 보존된 miR-93/106b 표적 부위를 공유하는 것을 표시하기 때문에 잠재적인 표적으로서 선택된다.
또한 miR-290 및 miR-293 집합들을 포함하는 마우스 ES-특이 마이크로RNA 집합들도 역시 p21을 포함하는 여러 가지 G1-S 전환의 음성 조절인자들을 표적하는 것으로 제안되어 왔다. 추가적으로, miR-290 및 293 집합 마이크로RNAs는 miR-93 및 miR-106b와 매우 유사한 종자 영역들을 공유하고 있다. 따라서, p21도 역시 후보 표적으로서 분석된다. 좀 더 나아가, p21은 iPSC 유도의 초기 단계 동안 네 가지 인자들 OSKM에 의해 크게 유도된다 (도 8a). 상세한 분석은 p21의 유도가 Oct4 및 Sox2의 조합들이 p21 수준의 유의한 변화를 보여주지 않기 때문에 주로 Klf4 및 cMyc의 과다발현으로 인하는 것을 보여준다 (도 8a).
마우스 Tgfbr2 및 p21이 miR-93 및 miR-106b에 의해 표적되는지 여부를 확인하기 위하여, miR 모방체들이 MEFs 내로 형질전환되고 전체 세포 용출물들이 웨스턴 블럿팅에 의해 48시간 이후에 분석된다. 따라서, miR-93 및 miR-106b는 Tgfbr2 및 p21 둘 다의 단백질 수준을 효율적으로 감소시키고 (도 5a 및 도 5d) p21 mRNA 수준의 ~ 25 내지 30% 감소 및 Tgfbr2 mRNA 수준의 ~ 60 내지 70% 감소도 역시 가진다 (도 19). p21이 miR-93 및 miR-106b의 직접적인 표적인지 여부를 좀 더 조사하기 위하여, p21 3'UTR 서열을 가진 루시퍼라제 리포터가 개똥벌레 루시퍼라제 코딩 서열의 하류에 삽입되는 곳에서 루시퍼라제 검정법이 수행된다. 루시퍼라제 검정법은 루시퍼라제 활성의 일관적인 ~ 40% 억제가 HeLa 세포들에서 miR 모방체들을 형질전환하여 달성될 수 있는 점을 나타낸다. 마이크로RNA 모방체들의 억제는 돌연변이들을 보존된 p21 3'UTR 표적 부위의 종자 영역 내로 도입될 때 완전하게 파괴될 수 있는 점도 역시 결정하였다 (도 10). Tgfbr2의 경우, 루시퍼라제 검정법도 역시 GL 활성의 ~ 50% 감소를 보여주는 한편 miR-93 돌연변이들은 이러한 효과를 가지지 않는다 (도 11).
p21에 의해 촉진되는 세포 주기 정지는 재프로그램화에 요구되는 후천적 (epigenetic) 변형들을 저해할 수 있는데, 이들 변형들이 증식하는 세포들에서 더욱 즉시 생기기 때문이다. p21 발현이 iPSC 유도를 저하하는지 여부를 결정하기 위하여, HA-태그된 p21 cDNA가 pMX 레트로바이러스 골격 내로 클론되고 MEFs 세포들에서 과다발현된다. HA-p21 바이러스가 네 가지의 OSKM 인자들과 함께 MEFs 내로 도입될 때, 알칼라인 포스파타제 염색 및 Oct4-GFP-양성 콜로니 형성 둘 다를 근거로 하여 iPSC 유도의 거의 완벽한 저해가 관찰된다 (도 9a). 유사한 결과들이 세 가지의 OSK 인자들이 재프로그램화에 사용될 때 획득된다 (도 9b).
분석이 miR-93 및 miR-106b가 Tgfbr2 및 p21 발현 둘 다를 효율적으로 억제하는 것을 표시하기 때문에, Tgfbr2 및 p21은 그들의 활성이 재프로그램화를 길항할 수 있는지 여부가 좀 더 조사된다. Tgfbr2 또는 p21 siRNAs는 마이크로RNA 모방체들을 사용하여 적용된 동일한 실험적 스케줄을 사용하여 MEFs 내로 형질전환된다. 웨스턴 블럿팅 및 RT-qPCR은 단백질 및 mRNA 수준들 둘 다가 바이러스 형질감염이 없는 siRNAs에 의해 효율적으로 각각 녹다운되는 것을 입증한다 (도 5b 및 도 5e). 다음으로 MEF 재프로그램화는 OSKM 형질감염에 의해 개시되고, Oct4-GFP+ 콜로니들이 형질감염 이후 11일째에 정량된다. 각 유전자의 콜로니 수에서 ~ 2배 유도가 관찰된다 (도 5c 및 도 5f). 모두 종합하면, 우리의 결과는 Tgfbr2 및 p21가 miR-93 및 miR-106b의 직접적인 표적이고 이들 유전자들이 저하 조절이 재프로그램화 공정을 증진할 수 있는 점을 확인해 준다.
실시예 8
MiR-93 및 MiR-106b 형질전환으로부터 유래한 IPSC 클론들의 다능성
miR-93 및 106b가 마우스 iPSC 유도를 증진하는 그들의 능력에 대하여 입증하였더라도, 남아있는 의문점은 유도된 세포들이 전적인 다능성 상태에 도달하는지 여부이다. 본 의문점을 해결하기 위하여, 각 마이크로RNA 및 miR 대조군의 여러 가지의 iPSC 클론들이 다능성 마커들 및 분화 능력을 분석하도록 유래된다. 이들 유래된 클론들은 모두 Oct4 좌위의 재활성화를 표시하는 GFP+이다. 면역염색도 역시 Nanog 및 SSEA1가 이들 세포들에서 활성화되는 것을 입증하였다. 다른 mES 마커들에 대한 RT-qPCR은 유사한 결과들을 보여준다. 게놈 전부의 mRNA 발현 프로파일은 다시 이들 유도된 클론들이 MEFs는 아니지만 mES 세포들과 매우 유사한 유전자 발현 양상을 가지는 것을 표시하고 있다. 내인성 Oct4 및 Nanog 좌위의 프로모터 메틸화가 분석되어, 모든 시험된 클론들이 탈-메틸화된 프로모터들을 가지는 것으로 관찰되었다.
이들 유래된 클론들이 mES 세포들의 전적인 분화 능력을 나타내는지 여부를 조사하기 위하여, 배아체 형성이 먼저 초기 시험으로서 사용되었다. 유래된 클론들 모두는 효율적인 EB 형성을 보여주고, 이들 EBs는 계열 마커들 염색의 경우 양성인 것으로 결정된다. EBs 조사도 역시 이들 세포들로부터 유래가능할 수 있다.
마지막으로 더욱 엄격한 시험으로서 이들 유래된 클론들이 그들이 키메라 마우스에 기여하는지 여부를 검토하도록 주입되었다. 그 결과, 키메라들은 시험된 클론들 모두로부터 유래가능하다. 이들 결과들은 재프로그램화에 미치는 miR-93 및 miR-106b의 증진하는 효과가 유도된 세포들의 분화 능력을 변화시키지 못하고, 또한 ES-유사 상태에 도달한 이들 유래된 클론들이 모두 세 가지의 계열들로 분화할 수 있는 점을 입증한다.
실시예 9
다른 마이크로RNAs의 상승조절도 역시 IPSC 유도를 증진시킨다
본 명세서에서 논의된 바, 마이크로RNAs의 세 가지 집합들은 iPSC 유도 동안 네 가지 인자들에 의해 유도되는 것으로 확인되고, 이들 세 가지 집합들 내의 여러 마이크로RNAs가 동일한 종자 영역들을 가지고 유사한 mRNAs를 표적하는 것을 표시하는 것으로 결정되었다 (도 2). miR-93 및 miR-106b와 동일한 종자 영역들을 공유하는 다른 마이크로RNAs가 iPSC 유도를 유사하게 증진시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, miR-93 및 miR-106b의 마이크로RNA 모방체들이 miR-93 모방체 처리 및 iPSC 유도를 위해 상기 기술된 것과 유사한 실험적 절차를 사용하여 시험된다. 그 결과, 이들 마이크로RNAs는 miR-106b~25 집합들로 관찰되는 것과 유사한 방식으로 재프로그램화를 증진하고 (도 6a), 이들 miRs의 형질전환은 모두 감소된 Tgfbr2 및 p21 단백질 수준들을 가져온다 (도 6b 및 도 6c).
종합하여, 이들 결과들은 miR-17~92, miR-106b~25 및 miR-106a~363 집합들의 유도가 적절한 재프로그램화에 중요하고 이들 마이크로RNAs의 상승조절이 iPSC 생성 공정에 대한 재프로그램화 장벽장벽 낮추는 점을 제시하고 있다 (도 6d). 따라서, 세포들에서 이들 마이크로RNAs의 수준은 재프로그램화 효율을 개선하도록 조작될 수 있다.
실시예 10
IPSC 재프로그램화의 기작들
유래된 클론들은 내인성 Oct4-GFP 발현을 활성화하는 것으로 보여진다. 콜로니들은 마이크로RNA 모방체들로 OSKM 형질감염 이후 12일째에 시작하여 선별되고 방사선 조사된 MEF 피더 플레이트들 상에서 유지된다. 녹색 형광이 내인성 pou5f1 좌위로부터 나온 GFP 신호로서 관찰될 수 있다. 클론들은 Nanog 및 SSEA1 염색을 근거로 하는 ES-특이 마커들의 알칼라인 포스파타제 염색 및 면역염색을 사용하여 보여질 수 있다. 획스트 33342 (Hoechst 33342)가 핵 염색을 위해 사용될 수 있다. 세 가지의 배층들로부터 나온 세포들이 유래된 iPSC 클론들을 사용하는 배아체 (EB) 검정법들에서 획득될 수 있다. iPS 세포들은 EB 형성을 위해 4,000개 세포/20 μL 점적으로 3일 동안 배양된 다음, EBs가 심근세포들이 관찰되는 시기인 12 내지 14일까지 심화 배양을 위해 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 재접종된다. 세포들은 외배엽 마커의 경우 제 Ⅲ형 β-튜불린; 내배엽 마커의 경우 AFP; 또한 중배엽 마커의 경우 α-액티닌 (중배엽)을 포함하는 서로 다른 계열 마커들로 면역 염색될 수 있다. 기형종들은 1.5백만 개의 세포들이 각 마우스에 주입된 iPS 세포들로부터 형성될 수 있고, 조양들은 파라핀 임베딩 및 H & E 염색을 위해 주입하고 3 내지 4주 이후에 수확된다. 유래된 클론들도 역시 키메라 마우스를 생성하는 데 사용될 수 있다. iPS 세포들은 흰둥이 또는 검둥이 C57B6 마우스 (NCI)로부터 나온 포배들 내로 주입되고 iPSCs의 작용이 기니아 피그 또는 검둥이 피부색으로 관찰될 수 있다.
12일째에 재프로그램된 세포들은 알칼라인 포스파타제 기질들로 염색될 수 있다. 본 발명은 miR 모방체들 형질전환이 AP+ 콜로니들의 유의한 증가를 야기하지는 않지만 miR-93 및 106b의 녹-다운은 AP+ 콜로니들 뿐만 아니라 GFP+ 콜로니들의 유의한 소실을 가져오는 점을 제공한다. 마이크로RNA 모방체들은 전반적인 AP+ 콜로니 형성에 영향을 주지 않지만 저해제들은 영향을 준다.
MEFs가 iPS 세포들로 재프로그램될 수 있는 점의 발견 이래로, 본 대단한 공정의 근본적인 기작을 이해하도록 많은 노력이 경주되어 왔다. 본 명세서에서 기술된 결과들은 후-전사적 유전자 조절이 재프로그램화 동안 직접적으로 관여하고 RNAi 기제로의 간섭이 재프로그램화 효율을 유의하게 변경할 수 있는 점을 처음으로 확인하였다. 추가적으로 이전의 실시예들에서 나타난 바와 같이, 마이크로RNAs의 세 가지 집합들은 iPS 세포들을 유도하는 데 사용되는 네 가지 인자들에 의해 유의하게 상승조절되고 마찬가지로 이들 집합들에서 마이크로RNAs는 적어도 두 가지의 중요한 경로들을 표적한다: TGF-β 신호전달 및 세포 주기 조절.
본 연구가 계속 추구되고 있었던 한편, 여러 최신의 보고들도 또한 p21과 같은 여러 가지의 하류 종양 억제인자들을 포함하는 p53 경로가 iPSC 유도 동안 주요한 장벽들의 하나라는 점을 확인하였다. 많은 증거는 네 가지 인자들 (OSKM)의 이소성 발현이 p53을 바로 상승조절하고, 세포 주기 정지, 세포사멸, 또는 DNA 손상 반응들과 같은 세포성 방어 프로그램들의 일련의 반응들을 개시시키는 것을 가르킨다. 마찬가지로 이들 방어 반응들은 ~ 0.1% 주변이라고 여겨지는 낮은 재프로그램화 효율을 뒷받침한다. 그러나, 이들 결과는 재프로그램된 세포들이 iPS 세포들이 되도록 성공적으로 이들 세포성 장벽들을 극복하는 방법을 설명하지 못한다. 본 명세서에서 기술된 실시예들은 이들 세포들이 성공적인 재프로그램화를 길항하는 경로들을 표적하는 마이크로RNAs의 발현을 유도하여 이들 장벽들을 전부가 아니면 적어도 부분적으로라도 극복할 수 있는 점을 보여준다. 일차 섬유모세포들에서 마이크로RNAs 수준들을 조정하여, 재프로그램화 효율의 유의한 증가가 달성될 수 있다.
TGF-β 신호전달은 장배형성 (gastrulation), 기관-특이 형태생성 (morphogenesis) 및 조직 항상성과 같이 다양한 공정들에서 기능하는 중요한 경로이다. 정규 TGF-β의 최신 모델은 TGF-β 리간드가 제 Ⅱ형 TGF-β 수용체 (Tgfbr2)와 결합하고, 이는 다음으로 수용체-연관된 Smads를 통하여 신호들을 형질감염하도록 Tgfbr2와 헤테로이중화하는 점을 가르킨다. TGF-β 신호전달은 인간 및 마우스 ES 세포 둘 다의 자가-재생에서 기능하는 것으로 보도되어 있으며, ES 세포 배양에 널리 사용되는 성장인자인 FGF2는 TGF-β 리간드 발현을 유도하고 BMP-유사 활성들을 억제한다. 화학적 저해제들에 의해 제 I형 TGF-β 수용체 패밀리 키나제들을 차단하는 것은 ES 세포 자가-재생을 저하시킨다. 이들 연구들은 이들 저해제들이 재프로그램화 과정 동안 완전히 서로 다른 역할들을 가지는 것으로 여겨지기 때문에 iPSC 유도를 위해 특히 중요하다. 최근의 화학적 검색은 제 I형 TGF-β 수용체 (Tgfbr1)가 실제적으로 iPSC 유도를 증진시키고 Nanog 발현을 유도하여 Sox2에 대한 요구를 대체할 수 있는 점을 보여주었다. 더우기, TGF-β 리간드들로 재프로그램화 세포들을 처리하는 것은 iPSC 유도에 미치는 음성적 효과를 가진다. 따라서, TGF-β 신호전달이 ES 세포 자가-재생에 중요하더라도, 재프로그램화에는 장벽이 된다. 본 발명은 Tgfbr1에 덧붙여, 전신적으로 활성을 가진 Tgfbr2도 역시 재프로그램화를 길항하는 점을 제공한다. 본 발명은 또한 miR-93 및 그의 패밀리 구성원들이 그의 신호전달 및 재프로그램화를 조정하도록 Tgfbr2를 직접적으로 표적하는 점을 제공한다.
p21은 단지 165개의 아미노산들을 가지는 작은 단백질이고, p53-의존성 G1 성장 정지를 야기하고 분화 및 세포 노화를 촉진하여 암 발생과정 동안의 암 억제인자로서 오래 동안 연구되어 왔다. 본 발명은 p21 발현이 네 가지 인자들 (OSKM)이 MEFs 내로 도입될 때 상승조절되고 본 상승조절은 p21의 과다발현이 거의 완벽하게 iPSC 유도를 차단하기 때문에 (도 9), 재프로그램화 공정을 길항하는 점을 제공한다. 재프로그램화 세포들에서 p21의 유도는 Klf4 재프로그램화 인자가 p21 프로모터와 결합하고 p21 전사를 증가시키기 때문에 p53에 의존적이거나 이로부터 독립적일 수 있다.
이것은 동일한 전사인자가 iPSC 유도를 촉진하거나 iPSC 유도를 길항할 수 있기 때문에, 네 가지의 재프로그램화 인자들의 기능에 대한 흥미로운 의문점을 유발한다. 사실상, 현재의 증거들은 p21 유도의 소정의 수준이 재프로그램화 공정에 유익이 될 수 있는 가능성을 배제할 수 없다. p53 의존성 세포 주기 정지에서 그의 잘-알려진 역할 이외에도, p21은 일정의 종양원 유전자 활성들을 가지는 것으로도 역시 보고되어 왔다. 예를 들어, p21은 세포들을 세포 주기 조절에서의 그의 보통의 기능과는 관련되지 않은 기능인 세포사멸로부터 보호작용하는 과정에 의해 종양원 유전자 활성들도 역시 가진다.
재프로그램화에서 p21의 잠재적인 유익은 단백질-단백질 상호작용들을 통하여 유전자 발현을 조절하는 그의 능력에 의존할 수 있다. 예를 들어, p21은 캐스파제 8, 캐스파제 10 및 프로캐스파제 3과 같은 세포사멸에 관여하는 여러 단백질과 직접적으로 결합할 수 있다. 또 다른 예의 경우, p21는 Myc-Max 헤테로이중합 (heterodimerization)을 차단하도록 Myc N-말단과의 연결에 의해 Myc의 전-세포사멸 활성 (pro-apoptotic activity)의 억제인자도 역시 된다. 그 결과, Myc 자체가 MEFs에서 과다발현될 때, 세포 사망의 유의한 증가가 세포 배양에서 관찰될 수 있는 한편, 네 가지 인자 형질감염된 세포들에서는 세포 사망이 Myc 단독의 시료들과 비교하여 최소가 된다. 따라서, p21의 유도는 재프로그램화 공정에 대한 장벽으로서 작용할 수 있을 뿐만 아니라 세포사멸을 감소시키는 데 필요한 소정의 p21 수준들을 유지시켜서 재프로그램화 효율을 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서 제공된 결과들은 또한 miR-93 및 miR-106b의 형질전환이 p21 siRNA 형질전환보다 재프로그램화에 미치는 더 큰 증진하는 효과들을 가지기 때문에 본 가설을 뒷받침하는 부분적 증거로서 볼 수 있고, 여기에서 miR-93 및 miR-106b는 p21 siRNA와 마찬가지로 p21 발현을 억제하지 못하였다. 그러나, 본 효과는 Tgfbr2 및 p21을 포함하는 다수의 단백질을 이들 마이크로RNAs에 의해 표적하는 과정으로 인한 것이라는 사실도 역시 가능하다.
마이크로RNAs는 보통 다수의 세포성 단백질들을 표적하기 때문에, miR-93 및 miR-106b의 증진하는 효과들은 공정을 더 잘 이해하기 위하여 재프로그램화에 관여하는 추가적인 유전자들을 찾도록 기회를 제공한다. 그 결과 p21 이외에도, G1-S 전환의 음성 조절인자들인 것으로 보고된 기타 다른 유전자들도 역시 Rb1, Rbl1, Rbl2 및 Lats2와 같이 mRNA 전사체들의 3'UTR 영역들에서 miR-93 및 miR-106b 표적 부위들을 가진다. 보고되어 있는 miR-93 및 miR-106b의 또 다른 흥미로운 표적은 전사인자 E2F1이고, 이는 빈빈하게 많은 인간 종양 시료들에서 탈조절되고 과다활성화되는 것으로 밝혀져 있다. E2F1의 중요한 기능 하나는 ARF 및 INK4a을 인코드하는 CDKN2A 좌위의 발현을 활성화하는 것이다. Ink4a/Arf 좌위도 역시 재프로그램화 효율을 저해할 수 있다. 따라서, 본 발명은 miR-93 및 miR-106b의 형질전환은 또한 E2F1으로 표적하고 CDKN2A 좌위를 활성화하는 잠재력을 감소시켜서 재프로그램화의 장벽을 감소시킨다.
마지막으로, miR-17~92, miR-106b~25 및 miR-106a~363 집합들은 마우스 및 인간 사이에서 매우 보존되어 있다. 따라서 본 발명은 miR-93 및 miR-106b의 증진하는 효과들도 역시 인간 재프로그램화에 적용될 수 있는 점을 제공한다.
실시예 11
마이크로RNA는 IPS 세포 재프로그램화를 조정한다
마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 유도: Oct4-EGFP MEFs는 위셀 연구소 (WiCell Research Institute)의 웹사이트 (www.wicell.org/) 상에 제공된 프로토콜을 사용하여 마우스 세포주 B6;129S4-Pou5f1 tm2(EGFP)Jae /J (잭슨 연구소 (Jackson Laboratory); 스톡 번호 #008214)로부터 유래된다. Oct4-EGFP MEFs는 MEF 완전 배지 (소듐 피루베이트를 제외한 10% FBS, 비필수 아미노산들, L-글루타민을 가진 DMEM)를 넣은 10% 젤라틴-코팅된 플레이트들 상에서 유지된다.
레트로바이러스를 사용한 재프로그램화: 4 x 104개의 Oct4-EGFP MEFs가 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc (애드진사)을 잘못발현 (misexpress)하도록 pMX 레트로바이러스들로 형질감염된다. 이틀 이후에, 형질감염된 Oct4-EGFP MEFs는 ES 배지 (15% ES-검색된 FBS, 비필수 아미노산들, L-글루타민, 모노티오글리세롤, 및 1000 U/ml LIF를 가진 DMEM)으로 배양되고 배지는 이틀에 한 번 교환된다. 재프로그램된 줄기세포들 (EGFP+ iPSC 콜로니들로서 정의됨)은 형광 현미경법에 의해 달리 언급되지 않은 경우라면 형질감염 이후 ~ 2주째에 점수가 매겨진다. iPSCs를 유도하기 위하여, EGFP+ 콜로니들이 입체 현미경 (라이카사 (Leica)) 하에서 수작업으로 선별된다.
마이크로RNA 저해제 또는 siRNA 형질전환: let-7a, miR-21, 및 miR-29a 마이크로RNAs는 다마콘사로부터 구입한다. 4 x 104개의 Oct4-EGFP MEFs는 리포펙타민 및 저해제들로 제조사 (인비트로겐사)의 지침에 따라 형질전환된다. 셋 내지 다섯 시간 이후에, 배지를 버리고 MEF 완전 배지로 교환된다: 재프로그램화를 위해, 재프로그램화 인자들 (Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc)을 인코딩하는 레트로바이러스가 첨가되고 배지는 다음날 완전 배지로 교환되었다. 저해제들 또는 siRNAs는 형질전환/형질감염 이후 5일째에 달리 언급되지 않은 경우라면 다시 도입된다.
노던 분석을 위해, 1 x 105개의 Oct4-EGFP MEFs가 형질전환되고 5일 이후에 수확된다. 전체 RNA는 트리종 (인비트로겐사)에 의해 분리되고 ~ 9 마이크로그램의 전체 RNA는 14% 변성 폴리아크릴아마이드 젤 (내셔날 다이아그노스틱스사 (National Diagnostics)) 상에서 전개된다. RNAs는 하이본드-XL 막 (Hybond-XL membranes) (GE 헬스케어사 (GE healthcare)) 위로 트랜스퍼되고, 및 마이크로RNAs는 동위원소로-표지된 특이적 DNA 탐침들에 의해 검출된다. 신호 강도는 포스포-영상기 (phospho-imager)에 의해 영상화되고 멀티 게이지 V3.0 (Multi Gauge V3.0) (후지필름사 (FUJIFILM))를 사용하여 분석된다. 마이크로RNA 신호 강도는 U6 snRNA의 강도로 정상화된다. 실험들은 세 벌로 중복 수행된다.
웨스턴 분석을 위해, 1 x 105개의 Oct4-EGFP MEFs가 형질전환되고 5일 이후에 수확된다. 전체 단백질들이 M-PER 완충용액 (피어스사 (Pierce))에 넣어 준비되고, 동일한 양의 전체 단백질이 10% SDS-PAGE 젤 상에서 분리된다. 단백질은 PVDF 막으로 트랜스퍼되고 밴드들이 다음의 항체들을 사용하여 검출된다: GAPDH (산타크루즈사 (Santa Cruz); 카탈로그 번호 sc-20357), p53 (산타크루즈사; 카탈로그 번호 sc-55476), PI3 키나제 p85 (셀 시그널링사 (Cell Signaling); 카탈로그 번호 4257); Cdc42 (산타크루즈사; 카탈로그 번호 sc-8401); p-ERK1/2 (셀 시그널링사; 카탈로그 번호 9101); ERK1/2 (셀 시그널링사; 카탈로그 번호 9102); p-GSK3β (셀 시그널링사; 카탈로그 번호 9323); GSK3b (셀 시그널링사; 카탈로그 번호 9315); β-Actin (써모사이언티픽사 (Thermo Scientific); 카탈로그 번호 MS-1295). 신호 강도는 멀티 게이지 V3.0 (후지필름사)에 의해 정량되고 GAPDH 또는 β-actin으로 정상화된다. 실험들은 세 번 또는 다섯 번 반복 수행된다.
시험관내 분화 및 기형종 형성 검정: 시험관내 분화를 위해, iPSCs가 트립신/EDTA에 의해 분해되고 배아체 (EB) 배지 (15% FBS, 비필수 아미노산들, L-글루타민을 가진 DMEM)에서 5 x 104개 세포/mL의 최종 농도로 재현탁된다. EB 형성을 유도하기 위하여, 20 마이크로리터에 넣은 1,000개의 iPS 세포들이 역전 페트리 디쉬상의 공중 점적들에서 배양된다. 3일 내지 5일 이후에, EBs는 수집되고 웰 당 ~ 10개로 EBs 0.1% 젤라틴-코팅된 6-웰 플레이트 상에 트랜스퍼된다. EBs 형성 이후 2주째에, 심근세포들 (중배엽)의 첨가는 현미경법에 의해 확인되고, 내배엽 및 외배엽으로부터 유래한 세포들은 α-태아단백질 (α-fetoprotein) (R&D; 카탈로그 번호 MAB1368) 및 뉴런 특이 제 Ⅲ형 β-튜불린 (앱캠사; 카탈로그 번호 ab7751) 항체들에 의해 각각 확인된다.
기형종 검정을 위해, 1.5 x 106개의 iPSC가 트립신 처리되고 150 마이크로리터에 재현탁된 다음 아버틴으로 마취된 무흉선 누드 마우스의 등쪽 뒷다리들 내로 피하 주사된다. 삼 주 이후에, 마우스는 기형종을 수집하도록 희생된다. 종양 덩어리들은 고정되고 해부되고 스탠포드-번햄 연구소에 있는 세포 영상화-조직학 (Cell Imaging-Histology) 핵심 시설에서 분석된다.
키메라 분석: iPSC 배지는 수확하기 두 시간 이전에 교환된다. 트립신 처리된 iPSCs는 피더 세포들을 제거하도록 0.1% 젤라틴-코팅된 플레이드들 상에서 30분 동안 배양된다. IPSCs는 E3.5 C57BL/6-cBrd/cBrd 포배들 내로 주입된 다음 유사임신 (pseudopregnant) 수여자 암컷들 내로 전달된다. 출생 이후, iPSCs의 기여도는 새끼의 피부색에 의해 평가된다: 검둥이는 iPSCs로부터 나온다.
면역형광 및 알칼라인 포스파타제 (AP) 염색: iPSCs는 접종되어 0.1% 젤라틴-코팅된 6-웰 플레이트 상에서 배양된다. 4일 이후에, 세포들은 4% 파라포름알데하이드 (전자현미경 사이언스사 (Electron Microscopy Sciences); 카탈로그 번호 15710-S)로 고정된다. 면역형광을 위해, 고정된 세포들은 PBS에 넣은 0.1% 트리톤 X-100으로 투과되고 5% BSA/PBS에서 차단된다. SSEA-1 (R&D; 카탈로그 번호 MAB2155) 및 Nanog (R&D; 카탈로그 번호 AF2729)에 대한 항체들은 ES 마커들로 작용한다. 핵들은 획스트 33342 염색 (인비트로겐사)에 의해 영상화된다. AP 염색을 위해, 고정된 세포들은 제조사의 지침에 따라 (벡터 랩사 (Vector Laboratories); 카탈로그 번호 SK-5100) 알칼라인 포스파타제로 처리된다.
실시예 12
MiR-21 또는 MiR-29α 저해는 재프로그램화 효율을 증진시킨다
마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 유도: Oct4-EGFP MEFs는 위셀 연구소의 웹사이트 (www.wicell.org/) 상에 제공된 프로토콜을 사용하여 마우스 세포주 B6;129S4-Pou5f1 tm2(EGFP)Jae /J (잭슨 연구소; 스톡 번호 #008214)로부터 유래된다. Oct4-EGFP MEFs는 MEF 완전 배지 (소듐 피루베이트를 제외한 10% FBS, 비필수 아미노산들, L-글루타민을 가진 DMEM)를 넣은 10% 젤라틴-코팅된 플레이트들 상에서 유지된다.
MEF-특이 miRNAs를 저해하는 것이 재프로그램화 장벽들을 낮주는지 여부를 결하기 위하여, MEF-농축강화된 miRNAs가 분석되고 마우스 ES (mES) 세포들에서 관찰되는 것들로 그들의 수준들이 비교된다. 도 20에서 나타난 바와 같이, let-7a, miR-21, 및 miR-29a는 mES 세포들과 대비하여 MEFs에서 높게 발현된다. 대조적으로, miR 291는 mES에서는 매우 풍부하지만 MEFs에는 없다 (도 20a). 다음, miRNA 저해제들이 let-7a, miR-21, 및 miR-29a에 대항하여 Oct4-EGFP MEFs (Oct4-EGFP 리포터를 보유하는 MEFs) 내로 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc (OSKM)를 발현하는 레트로바이들과 함께 도입된다. 형질감염 이후 14일째에, miR-21 저해제들로 처리된 세포들은 미-표적화 (NT) 대조군과 대비하여 재프로그램화 효율의 ~ 2.1배 증가를 보여준다 (도 20b). 유사하게, 재프로그램화 효율은 miR-29a의 저해 이후에 ~ 2.8배로 유의하게 증가한다 (도 20b). miR 29a 또는 21 저해에 사용되는 것과 유사한 안타고머 (antagomir) 처리들 하에서, let-7a 저해와 이어지는 OSKM-재프로그램화에 미치는 소수의 효과가 관찰된다 (도 20b). miRNA 저해가 c-Myc의 부재 시 세 가지 인자들로 재프로그램화를 증진하는지 여부를 좀 더 시험하기 위하여, 세포들이 OSK와 함께 miRNA 저해제로 형질감염된고, 이는 세포들을 OSKM보다 훨씬 낮은 효율로 재프로그램화한다. miR-21 저해제의 존재 시 OSK-재프로그램된 iPS 세포 콜로니들의 수는 OSK 단독으로의 처리와 대비하여 증가한다 (도 25). 이들 결과들은 MEF-농축강화된 miRNAs miR-21 및 miR-29의 고갈은 4F-재프로그램화를 유의하게 증진시키고 miR-21를 차단하는 것은 세 가지 인자들 (OSK) 재프로그램화의 효율을 증가시키는 것을 보여준다.
C-Myc은 miRNAs let-7a, miR-16, miR-21, miR-29a, 및 miR-143의 발현을 재프로그램화 동안 억제한다: 최근의 연구는 OSKM 인자들이 후천적 및 전사적 기작들 둘 다를 통하여 세포 정체성을 변경하는 것을 가르키고 있다. 본 발명은 OSKM 재프로그램화 인자들이 MEF-농축강화된 miRNAs를 저하조절할 수 있는 점을 제공한다. miRNA 발현에 미치는 각 재프로그램화 인자의 잠재적인 효과를 평가하기 위하여, MEFs가 OSKM 인자들의 다양한 조합으로 형질전환되고 노던 블럿 분석이 시행된다 (도 21a). 흥미롭게도, Sox2는 단독으로 miR-21, miR-29a, 및 let-7a의 발현 수준을 MEF 대조군과 대비하여 두 배 이상 유도한다 (도 21b, 왼쪽 패널들). Klf4는 소수이지만 Sox2와 유사한 효과들을 이들 선택된 miRNAs에 준다 (도 21b, 왼쪽 패널). Oct4 과다발현 단독으로는, miRNAs가 발현 수준을 변화시키지 않는다 (도 21b, 왼쪽 패널). Oct4, Sox2, 및 Klf4와는 대조적으로, 단일한 인자 c-Myc은 MEFs에서 가장 풍부한 miRNAs인 miR-21 및 miR-29a의 발현을 MEF 대조군의 ~ 70% 저하조절한다 (도 21a 및 도 21b, 왼쪽 패널). 또한 도 21b에서 나타난 두 가지 인자들 (2F)의 다양한 조합들 중에서, c-Myc의 봉합이 miR-21, miR-29a, 및 let-7a을 포함하는 모두 세 가지의 miRNAs에서의 감소를 ~ 25 내지 80% 증진시킬 수 있다 (도 21b, 중간 패널들). miRNAs에 미치는 1F 효과와 유사하게, Oct4를 가진Sox2는 miR-21 및 miR-29a를 MEF 대조군의 1.5배 및 2.3배로 증가시키고 OK 및 SK는 miRNA 발현에 명확한 효과들을 가지지 않는다. 더우기, 다양한 세 가지 인자들 (3F) 조합들 중에서 miRNA-21의 발현은 SKM 및 OKM에서 MEFs에서 관찰된 발현과 대비하여 ~ 70 및 78% 각각 감소하고, 유사하게 miR-29a 발현은 c-Myc을 포함하는 3F 조합들에서 ~ 48 내지 70% 감소한다 (도 21b, 오른쪽 패널들). 3F 조합들에서 c-Myc의 봉합도 역시 let-7a 수준들을 약간 감소시킨다 (도 21b, 오른쪽 패널들). c-Myc이 없는 OSK는 miRNA 발현에 거의 효과를 가지지 않는다 (도 21b, 오른쪽 패널들). 따라서, 이들 결과들은 c-Myc이 재프로그램화 동안 miRNA 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 담당하는 점을 강하게 제시하고 있다.
c-Myc이 miRNA 발현을 길항하는 일차적인 인자라는 점을 좀 더 입증하기 위하여, 세포들은 c-Myc의 존재 또는 부재시 OSK로 형질감염되고, miRNA 발현이 형질감염 이후 다양한 시점들에서 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-qPCR)에 의해 조사된다. OSK와는 대조적으로, OSKM 형질감염은 let-7a, miR-16, miR-21, miR-29a, miR-143의 발현을 재프로그램화 동안 크게 감소시켜서 (도 21c), c-Myc이 가장 풍부한 것들인 let-7a, miR-21, 및 miR-29a을 포함하는 MEF-농축강화된 miRNAs의 발현을 조절하는 데 우세한 역할을 담당하는 점을 가르키고 있다. 이들 결과들도 c-Myc이 miRNA 저하조절 동안 부분적으로 재프로그램화를 추가자극하는 점을 역시 제시하여 준다.
실시예 13
MiRNA 고갈에 의해 유래된 iPS 세포들은 다능성을 획득한다
본 발명은 miR-21 및 miR-29a 저해제들을 사용하여 유래된 마우스 iPS 세포들이 다능성을 가지는 점을 제공한다. OSKM/항 miR-29a iPS 세포들의 ES 세포 마커들을 사용한 염색이 수행될 수 있다. OSKM 및 miR-29a 저해제 처리와 이어서 유래된 GFP+ 콜로니들은 심화 분석을 위해 선별된다. 배아 줄기세포 마커들 Nanog 및 SSEA1을 발현하는 대표적인 콜로니들이 확인된다. 내인성 Oct4도 역시 활성화되고, 이는 EGFP 염색에 의해 표시될 수 있다. 강한 알칼라인 포스파타제 (AP) 활성이 ES 마커의 하나로서 관찰될 수 있다.
OSKM/항 miR-29a iPS 세포들의 시험관내 분화가 수행될 수 있다. 배아체들은 시험관내에서 형성되고 2주 동안 배양될 수 있다. 세포들은 고정되고 항-α 태아단백질 (중배엽의 경우) 및 항-베타 제 Ⅲ형 튜불린 (외배엽의 경우)으로 염색될 수 있다. 핵은 획스트 염색에 의한 역 (counter) 염색으로서 관찰될 수 있다. OSKM/항 miR-29a iPS 세포들의 기형종 형성 분석도 역시 수행될 수 있다. 1.5 x 106개의 iPSCs가 무흉선 누드 마우스 암컷 내로 피하 주입된다. 종양 덩어리들은 주입 이후 3주째에 수집되고 조직병리학적 분석을 위해 고정된다. 세 가지의 배아층들로부터 유래한 창자-유사 상피 (내배엽), 지방 조직, 연골,및 근육 (중배엽), 및 신경 조직 및 표피 (외배엽)를 포함하는 다양한 조직들이 확인될 수 있다. OSKM/항 miR-29a 및 OSK/항 miR-21 iPS 세포들의 키메라 분석도 역시 수행될 수 있다. 8 내지 14개의 iPS 세포들이 E3.5 마우스 포배들 내로 주입될 수 있다. 각 키메라에 대한 iPS 세포 기여도는 검둥이 피부색을 평가하여 추정될 수 있고 배분율로서 관찰될 수 있다.
miR-21 또는 miR-29a를 차단하는 것이 iPS 세포 다능성을 저하하는지 여부를 조사하기 위하여, OSKM/항 miR-29a 또는 OSK/항 miR-21를 가진 iPS 세포들이 다능성에 대해 평가된다. 먼저, 세포들은 재프로그램화 이후 대략 2주째에 수작업으로 선별되고 ES-특이 마커들의 형태 및 발현을 조사하도록 증식된다. 세포들은 ES-유사 형태 및 높게 발현된 Oct4-EGFP를 나타낸다 (내인성 ES 세포 신호전달의 확립을 표시함). 또한 OSKM/항 miR-29a 또는 OSK/항 miR-21 iPS 세포들은 Nanog 및 SSEA1을 포함하는 ES 세포-특이 마커들을 발현하고, 알칼라인 포스파타제 활성을 나타낸다. 이들 iPS 세포들이 정상적으로 유래된 iPS 세포들과 비교가능한 잠재적인 다능성을 나타내는지 여부를 시험하기 위하여, OSKM/항 miR-29a 및 OSK/항 miR-21 iPS 세포들은 배아체들 (EBs)를 형성하도록 유도되거나 누드 마우스 내로 주입되고 다양한 조직들로 분화하도록 허용된다. 시험관내 분화의 2주 이후에, 세 가지 배층들 모두로부터 유래한 전형적인 세포 유형들이 관찰된다. 주입 이후 3주째에 형성된 기형종 종양들은 조직병리학적 분석이 진행된다. 세 가지 배층들 모두로부터 기원하는 다양한 조직들이 생성되어, iPS 세포들이 다능성을 획득한 점을 입증해준다. 다능성의 가장 엄격한 시험을 사용하기 위하여, iPS 세포들이 키메라 마우스들을 만들도록 E3.5 포배들 내로 주입된다. miR-고갈된 iPS 세포들로부터 유래한 마우스는 iPS 세포들이 원인을 제공한 ~ 15% 내지 25%의 유의한 검둥이 피부색을 보여준다. 이들 결과들은 miR-21 및 miR-29a를 고갈시키는 것이 유래된 iPS 세포들의 다능성에 전혀 역효과를 주지 않는 점을 보여준다.
실시예 14
MiR-29a은 P85α 및 CDC42 경로들을 통해 P53을 저하조절한다
재프로그램화에 미치는 miR-29a의 효과를 뒷받침하는 기작들을 이해하기 위하여, p85α 및 CDC42의 발현이 조사되는 데, p85α 및 CDC42는 HeLa 세포들에서 miR-29의 직접적인 표적이라고 보고되어 있다. 이와 같이 시행하기 위하여, miRNA 저해제들이 MEFs 내로 형질전환되고 p85α 및 CDC42 단백질 발현이 형질전환 이후 5일째에 웨스턴 블럿에 의해 평가된다. p85α 및 CDC42 단백질 수준들은 miR-29a 차단 이후에 약간 증가하는 한편, let-7a 저해제는 거의 효과가 없다 (도 22a 및 도 22b). 형질전환 관련 단백질 53 (Trp53 또는 p53)도 역시 p85α 및 CDC42의 직접적인 표적이라고 보고되어 있다. 따라서, p53는 마찬가지로 이것이 MEFs에서 miR-29a에 의해 간접적으로 조절되는지 여부가 조사되었다. 이를 시험하기 위하여, MEFs가 miRNA 제해제들로 형질전환되고 면역블럿팅으로 p53의 발현을 평가하도록 5일째에 수확된다. p53 단백질 수준들은 miR-29a 저해 이후에 ~ 30% 감소되지만 NT 대조군에 의해 또는 let-7a 저해에 의해 변경되지 않는다. 유의하게, miR-21를 고갈시키는 것도 역시 p85α 및 CDC42 단백질 억제를 유발하고 결과적으로 p85α 및 CDC42의 수준들이 증가하여 p53 발현의 저하조절을 ~ 25%까지 가져온다.
p53 수준들이 재프로그램화 동안 miR-21 또는 miR-29a의 저해로 감소하는 점으 좀 더 입증하기 위하여, p53 발현이 웨스턴 블럿 분석에 의해 재프로그램화 5일째에 조사된다. 재프로그램화를 개시하기 위하여, miRNA 저해제들이 OSKM와 함께 도입된다. MEFs 단독으로의 관찰들과 일치하여, p53 단백질 수준들은 재프로그램화 동안 miR-21 또는 miR-29a 고갈 이후 OSKM 대조군들과 대비하여 각각 ~ 25% 또는 ~ 40% 감소된다 (도 22c). 요약하면, 우리의 결과들은 miR-29a를 차단하는 것이 재프로그램 동안 p85α 및 CDC42 경로들을 통하여 p53 단백질 수준들을 ~ 30 내지 40% 감소시켰던 점을 보여준다. 또한, miR-21의 고갈은 p85α 및 CDC42 둘 다에 유사한 효과를 가지는 p53 단백질 수준들을 ~ 25% 내지 ~ 30% 낮추었다.
miR-29a의 저해는 p53 저하조절을 통하여 재프로그램화 효율을 증진시킨다: p53 고갈은 재프로그램화 효율을 크게 증가시킬 수 있는 것으로 보고되어 있다. miR-29a을 고갈시키는 것이 p53 수준들을 감소시키고 재프로그램화 효율을 ~ 2.8배로 증가시키기 때문에, 본 발명은 miR-29a 녹다운의 효과가 p53 저하조절에 의해 일차적으로 매개되는 점을 제공한다. 본 목적으로, p53 siRNA 및/또는 miR-29a 저해제가 재프로그램화를 개시하도록 OSKM과 함께 Oct4-EGFP MEFs 내로 형질전환된다. siRNA에 의한 p53의 저하조절 (~ 80%)은 miR-29a 저해가 하는 것과 유사한 재프로그래화에 미치는 양성 효과를 가진다 (도 22d). 재프로그램화 효율에서의 증가는 miR 저해제들이 p53 siRNA의 존재 시 첨가될 때 전혀 관찰되지 않는다 (도 22d). 이들 결과들은 miR-29a의 저해가 재프로그램화 효율을 증가하도록 p53의 저하조절을 통하여 부분적으로 작용하는 점을 제시하고 있다.
실시예 15
재프로그램화를 증진하도록 MiR-21 및 MiR-29a의 저해가 ERK1/2의 인산화를 증가시키지만 GSK3β는 아니다
MiR21는 심장 섬유모세포들에서 새싹 상동체 (sprouty homologue 1, Spry1)의 저해를 통해 MAPK/ERK를 활성화하는 것으로 보고되어 있다. MAPK/ERK 활성을 차단하는 것은 신경 줄기세포들의 재프로그램화를 촉진시키고 ESC 자가-재생의 기저 상태를 보호한다. 따라서, 본 발명은 miRNA 저해제들의 도입 이후에 MEFs에서 ERK1/2의 인산화를 평가하여, miR-21이 재프로그램화 동안 MAPK/ERK 경로를 조절하는 점을 제공한다. 이를 시험하기 위하여, MEFs가 miRNA 저해제들로 형질전환된 다음 웨스턴 블럿 분석으로 인산화된 ERK1/2 수준을 결정하도록 수확된다. 웨스턴 블럿 분석은 miR-21을 차단하는 것이 NT 대조군과 대비하여 ERK1/2 인산화를 ~ 45% 유의하게 감소시키는 한편 let-7a 저해제들은 이러한 효과가 전혀 없는 점을 보여준다 (도 23a). 흥미롭게도, miR-29a의 MEFs를 고갈시키는 것도 역시 NT 대조군과 대비하여 ERK1/2 인산화를 ~ 60% 유의하게 감소시킨다 (도 23a). 또한 본 발명은 miR-21 및 miR-29a가 SpryI 수준들을 변경시켜서 ERK1/2 인산화에 영향을 줄 수 있는 점을 제공한다. MiR-21 또는 miR-29a는 다양한 miRNA 저해제들을 형질전환하여 MEF에서 고갈되고 Spry1 발현 수준들은 면역블럿팅에 의해 정량되고 또한 그 결과들은 miR-21 및 miR-29a를 저해하는 것이 Spry1 발현 수준들을 증진시켰던 점을 보여준다 (도 23b). 따라서, miR-21 및 miR-29a를 고갈시키는 것은 SpryI 단백질 수준들을 조정하여 ERK1/2의 인산화를 저하조절한다.
ERK1/2 저하조절이 재프로그램화 효율을 증진시키는지 여부를 설명하기 위하여, ERK1 또는 ERK2를 표적하는 siRNAs가 4F-재프로그램화의 과정에서 Oct4-EGFP MEFs 내로 도입된다. 이들 중 하나의 고갈은 성숙한 iPS 세포들의 생성을 증진한다 (도 23c). 본 발명은 miR-21을 차단하는 것이 ERK1/2 인산화를 감소시키기 때문에, miR-21는 MEFs에서 ERK1/2 인산화의 유도인자 (inducer)로서 작용하는 점을 제공한다. miR-21을 고갈시키는 것도 역시 ERK1/2 인산화를 유의하게 감소시킨다. 이들 결과들은 miR-21 및 miR-29a가 재프로그램화 효율을 증진시키도록 ERK1/2 활성을 조절하는 점을 제시하고 있다 (도 23a, 도 23b, 및 도 23c).
GSK3β 경로도 역시 ES 자가-재생 및 신경 줄기세포들의 재프로그램화를 억제한다. GSK3β를 고갈시키는 것은 성숙한 iPS 세포 생성을 크게 증가시킨다 (도 23c). 본 발명은 miRNA 고갈이 GSK3β 활성화를 조절하였던 점을 제공한다. 면역블럿팅은 Oct4-EGFP MEFs에서 miRNAs가 GSK3β 활성화에 미치는 유의한 효과가 전혀 없는 것을 보여준다 (도 23d). 본 발명은 세포 생존도 및 복제율을 평가하도록 유동 세포측정법을 사용하여 miRNA 고갈이 재프로그램화 동안 세포사멸 또는 세포 증식을 변경시키는 점을 제공한다. OSKM으로 재프로그램화 동안 miRNAs 21, 29a, 또는 let-7을 차단하는 것이 세포사멸 또는 증식율을 변경하지 않는다 (도 26). 전반적으로는, miR-29a 및 miR-21가 iPS 세포 재프로그램화 효율을 조절하도록 p53 및 ERK1/2 경로들을 조정한다.
실시예 16
C-Myc은 MiR-21 및 MiR-29a 저하조절을 통하여 P53 수준들을 감소시키고 ERK1/2 활성화를 길항하여 재프로그램화를 위한 역치를 감소시킨다
현재까지 유도된-재프로그램화에 사용되는 트랜스유전자들의 대안들을 개발하기 위하여, 신호전달 경로들이 이들 인자들에 의해 조절되는 방법을 이해하는 것이 중요하다. 본 발명은 c-Myc이 miR-21, let-7a, 및 miR-29a와 같은 MEF-농축강화된 miRNAs를 재프로그램화 동안 억제하는 점을 제공한다 (도 20). 저해제들로 miR-29a를 고갈시키는 것은 가장 가능성 있게는 p85α 및 CDC42 억제를 완화하여 p53 단백질 수준들을 감소시킨다 (도 22). 또한, miR-21를 고갈시키는 것은 ERK1/2 인산화를 감소시킨다 (도 23). 본 발명은 miR-21 저해가 p53 단백질 수준들을 감소시키고 miR-29a을 저해시키는 것도 역시 ERK1/2 인산화 수준을 감소시키는 점을 제공한다. p53 및 ERK1/2 신호전달 둘 다는 재프로그램화를 길항한다. miR-21 및 miR-29a을 차단하는 것 또는 p53 및 ERK1/2의 녹당운은 재프로그램화 효율을 증진시킨다 (도 22 및 도 23). 본 발명은 c-Myc이 p53 수준들의 유도 및 ERK1/2 인산화의 유도를 통하여 재프로그램화 장벽들로서 작용하는 MEF-농축강화된 miRNAs, miR-21 및 miR-29a를 억제하여 부분적으로 재프로그램화를 용이하게 하는 점을 제공한다 (도 24).
miR-290 패밀리의 ES-특이 miRNAs의 강요된 발현은 재프로그램화를 촉진하도록 c-Myc을 대체할 수 있다. C-Myc도 역시 miR-290 집합의 프로모터 영역과 결합한다. 그러나, c-Myc 트랜스유전자의 조기 발현이 재프로그램화를 개시하는 데 효과적이지만 miR-290 집합들이 발현하기 시작하는 성숙한 iPS 세포들에서 전환 단계 이상에서는 없어도 된다. 따라서, c-Myc이 miR-290 패밀리를 활성화하는 것을 통하여 재프로그램화의 초기 단계들을 촉진하는 것이 가능하다.
본 발명은 miR-29a, miR-21, miR-143 및 let-7a를 포함하는 MEF-농축강화된 miRNAs의 발현 수준이 c-Myc이 재프로그램화를 위해 도입될 때 감소하는 점을 제공한다. C-Myc은 종양형성화를 촉진하고 다능성의 기저 상태를 유지하는 데 있어 miRNAs에 미치는 중요한 전사적 효과를 가진다. 따라서, miRNA 발현의 c-Myc 억제는 재프로그램화를 뒤받침하는 가능성 있는 기작이다.
MiR-21는 둘 다가 재프로그램화 및 ES 세포 기저 상태에 영향을 주는 것으로 관찰되었던 TGFb1 및 ERK1/2 경로들을 통하여 섬유화 활성을 증진시키는 양성 매개인자로서 작용한다. 명확하게, 입증된 miR-29a 표적들 중에서 p53은 miR-29a에 의해 양성적으로 조절된다. 또한, 최신의 연구들은 Ink4-Arf/p53/p21 경로가 재프로그램화를 저하시키고 p53 고갈은 재프로그램화 효율을 크게 증진시키는 점을 보여준다. 따라서, 이들 신호전달 경로들은 재프로그램화 공정에 일차적인 장벽들일 가능성이 있다.
c-Myc-표적된 miRNAs, miR-21 및 miR-29a을 고갈시키는 것이 재프로그램화 효율을 ~ 2.1 내지 ~ 2.8배 증진시키고 (도 20), MEF-농축강화된 miRNAs도 역시 재프로그램화 장벽들로서 기능하는 점을 제시하고 있다. 최근에 Let-7 저해는재프로그램화를 증진하는 것으로 보고되어 왔지만, 여러 번의 시도들에 의해 재프로그램화에서는 단지 소수의 효과만이 let-7이 안타고머들 (antagomirs)에 의해 저해될 때 관찰된다 (도 20). 더우기, 본 발명은 재프로그램화 동안 p53의 유도가 miR-29a 저해에 의해 저하되는 점을 제공한다. 유사하게, 재프로그램화는 miR-21 또는 ERK1/2의 둘 중 하나를 고갈시키는 것에 의해 크게 촉진된다. C-Myc은 재프로그램화의 초기 단계에 주요한 기여인자이고 전환 및 후기 단계들에서 공정을 유지하는 데 요구되지는 않으며, c-Myc-조절된 miRNAs가 높은 효율의 재프로그램화를 개시하도록 사용될 수 있다.
C-Myc은 miR-29a 프로모터와 직접적으로 결합하고 이를 억제하는 것으로 보고되어 있다. 본 발명은 c-Myc이 miR-21을 고갈시키는 것에 의해 단지 부분적으로 대체될 수 있는 점을 제공하고, c-Myc이 재프로그램화에서 다른 기능들을 가지는 점을 제시한다. 따라서, 다수의 경로들의 조절 또는 MEF-농축강화된 miRNAs의 광범위한 억제가 재프로그램화 동안 c-Myc기능을 대체하도록 요구될 수 있다.
본 발명은 c-Myc이 miR-21 및 miR-29a 저하조절을 통하여 p53 수준들을 감소시키고 ERK1/2 활성화를 길항하여 재프로그램화를 위한 역치를 감소시키는 점을 제공한다. 추가적으로, c-Myc의 하류 인자들이 재프로그램화를 개선하도록 siRNA, miRNA, 또는 소분자들에 의한 조작의 표적으로서 작용할 수 있다. 이들 접근법들은 네 가지 재프로그램화 인자들 모두를 대체하는 것으로 확장될 수 있다.
본 발명이 상기 실시예를 참조하여 기술되어 왔더라도, 변형들 및 변화들은 본 발명의 정신 및 범위 내에 속하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 단지 다음의 청구항들에 의해서 한정되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> SANFORD-BURNHAM MEDICAL RESEARCH INSTITUTE RANA, Tariq M. <120> METHOD FOR GENERATION AND REGULATION OF IPS CELLS AND COMPOSITIONS THEREOF <130> BURN1410-1WO <150> US 61/260,330 <151> 2009-11-11 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 1 aagugc 6 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 2 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 3 uaaagugcuu auagugcagg uag 23 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 4 caaagugcug uucgugcagg uag 23 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 5 uaaagugcug acagugcaga u 21 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 6 caaagugcua acagugcagg uag 23 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 7 caaagugcuc auagugcagg uag 23 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 8 uaagugcuuc cauguuuuag uag 23 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 9 aagugcuucc auguuucagu gg 22 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 10 uaagugcuuc cauguuuugg uga 23 <210> 11 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 11 uaagugcuuc cauguuugag ugu 23 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 12 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 13 cauugcacuu gucucggucu ga 22 <210> 14 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 14 cuaugaccug uucgugcagg uag 23 <210> 15 <211> 12 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 aatagcactt tg 12 <210> 16 <211> 12 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 aataggtcat ag 12 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 gcgtcaacaa catcctgct 19 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 ctcccaggaa gatgacaggt 20 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 cgtctctaga aaggtcctac aagaa 25 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ggctcaggag caactggtaa 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 gggctgtatg agagattgct gatg 24 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 cacggcagtc tgagaggatt tg 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 tccacagcga tatccagaca 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 ggacatcacc aggattggac 20 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 atcaagaagg tggtgaagcg gaa 23 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 tggaagagtg ggagttgctg ttga 24

Claims (39)

  1. a) 체세포를 핵 재프로그램화 인자와 접촉시키고: 또한
    b) 상기 a)의 세포를 세포 내의 RNA 수준들 또는 활성을 변경시키는 마이크로RNA와 접촉시켜서 iPS 세포를 생성하는:
    단계를 포함하는 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포를 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA 또는 RNA는 변형되는, 방법
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 벡터 내에 들어있는, 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 miR-17, miR-25, miR-106a, miR let-7 패밀리 구성원 또는 miR-302b 집합에 들어있는, 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 miR-93, miR-106b, miR-21, miR-29a, 또는 그들의 조합인, 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 서열번호 1을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가지는, 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 서열번호 2 내지 11로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가지는, 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 p21, Tgfbr2, p53, Ago2, 또는 그들의 조합의 발현 또는 활성을 조절하는, 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 Spry 1/2, p85, CDC42, 또는 ERK1/2 경로들을 조절하는, 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 핵 재프로그램화 인자는 벡터 내에 포함되는 유전자에 의해 인코드되는, 방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 핵 재프로그램화 인자는 SOX 패밀리 유전자, KLF 패밀리 유전자, MYC 패밀리 유전자, SALL4, OCT4, NANOG, LIN28, 또는 그들의 조합인, 방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 핵 재프로그램화 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC의 하나 이상인, 방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 핵 재프로그램화 인자는 c-Myc을 포함하는, 방법.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 체세포는 마이크로RNA와 접촉시키는 과정 이전에, 이와 동시에 또는 이에 이어서 상기 재프로그램화 인자와 접촉시키는, 방법.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 체세포는 포유동물 세포인, 방법.
  16. 제 1항의 방법을 사용하여 생산된 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포.
  17. 제 1항의 방법에 의해 생산된 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포의 농축 강화된 집단.
  18. 제 1항의 방법을 사용하여 생산된 다능성 줄기세포의 분화를 유도하여 유래된 분화된 세포.
  19. a) 제 1항의 방법에 의해 개체의 체세포로부터 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포를 생성하고;
    b) 상기 단계 a)의 iPS 세포의 분화를 유도하고; 또한
    c) 상기 단계 b)의 세포를 개체 내로 도입하여 병폐를 치료하는:
    단계를 포함하는 개체를 치료하는 방법.
  20. iPS 세포들의 생성 효율을 증가시키는 마이크로RNA의 용도.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 miR-17, miR-25, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-21, miR-29a, miR-302b 집합, miR let-7 패밀리 구성원 또는 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.
  22. miR-17, miR-25, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-21, miR-29a, miR-302b 집합, miR let-7 패밀리 구성원 또는 그들의 조합의 적어도 둘 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miR 서열들의 조합.
  23. a) 체세포를 핵 재프로그램화 인자와 접촉시키고: 또한
    b) 상기 a)의 세포를 마이크로RNA의 저해제와 접촉시켜서 iPS 세포를 생성하는:
    단계를 포함하는 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포를 생산하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 miR-17, miR-25, miR-106a, miR let-7 패밀리 구성원 또는 miR-302b 집합에 들어있는, 방법.
  25. 제 23항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 miR-93, miR-106b, miR-21, miR-29a, 또는 그들의 조합인, 방법.
  26. 제 23항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 서열번호 1로 나타내는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가지는, 방법.
  27. 제 23항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 서열번호 2 내지 11로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가지는, 방법.
  28. 제 23항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 p21, Tgfbr2, p53, Ago2, 또는 그들의 조합의 발현 또는 활성을 조절하는, 방법.
  29. 제 23항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 Spry 1/2, p85, CDC42, 또는 ERK1/2 경로들을 조절하는, 방법.
  30. 제 23항에 있어서,
    상기 핵 재프로그램화 인자는 벡터 내에 포함되는 유전자에 의해 인코드되는, 방법.
  31. 제 23항에 있어서,
    상기 핵 재프로그램화 인자는 SOX 패밀리 유전자, KLF 패밀리 유전자, MYC 패밀리 유전자, SALL4, OCT4, NANOG, LIN28, 또는 그들의 조합인, 방법.
  32. 제 23항에 있어서,
    상기 핵 재프로그램화 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC의 하나 이상인, 방법.
  33. 제 23항에 있어서,
    상기 재프로그램화 효율은 상기 마이크로RNA의 저해제를 사용하지 않는 대조군과 대비하여 적어도 두 배인, 방법.
  34. 제 23항에 있어서,
    상기 체세포는 섬유모세포를 포함하는, 방법.
  35. 제 23항에 있어서,
    상기 체세포는 상기 마이크로RNA의 저해제와 접촉시키는 과정 이전에, 이와 동시에 또는 이에 이어서 상기 재프로그램화 인자와 접촉시키는, 방법.
  36. 제 23항에 있어서,
    상기 체세포는 포유동물 세포인, 방법.
  37. 제 23항의 방법을 사용하여 생산된 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포.
  38. 제 23항의 방법에 의해 생산된 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포의 농축 강화된 집단.
  39. 제 38항의 다능성 줄기세포의 분화를 유도하여 유래된 분화된 세포.
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