CN102712904A - 用于产生和调节iPS细胞的方法及其组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了产生诱导的多能干（iPS）细胞的方法，其与常规方法相比具有提高的诱导效率。所述方法包括：用与改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂和/或p21抑制剂组合的细胞核重新程序化因子处理体细胞。本发明另外提供了通过这样的方法产生的iPS细胞以及这样的iPS细胞的临床和研究用途。

Description

用于产生和调节iPS细胞的方法及其组合物

技术领域

本发明一般地涉及诱导的多能干（iPS）细胞领域，更具体地涉及从体细胞产生这样的细胞的方法以及通过这样的方法产生的iPS细胞的临床和研究用途。

背景技术

诱导的多能干细胞（iPSC）表现出胚胎干（ES）细胞的性质，最初通过4种细胞核重新程序化因子（4F:Oct4、Sox2、Klf4和cMyc）在小鼠体细胞中的异位表达来产生。在人细胞中，除了最初的4种Yamanaka因子以外，iPSC也可以用4种因子的替代集合（例如，Oct4Nanog Lin28和Sox2）来产生。尽管已经证实来自不同组织的许多细胞类型是可重新程序化的，iPSC衍生化和进一步的治疗用途的主要瓶颈是，重新程序化的低效率，通常0.01%至0.2%。尽管大量工作已经聚焦于筛选提高重新程序化效率的小分子以及开发iPSC衍生化的新方法，原代成纤维细胞如何重新程序化为ES-样状态的机制在很大程度上仍然不明。

为了理解细胞重新程序化的机制，已经使用了不同的方案。基于小分子的方法已经鉴定出，通过用Dnmt1抑制剂处理细胞，可以加速重新程序化过程。还已经发现，TGFβ抑制能够更快地且更有效地诱导iPSC，其可以替代Sox2和cMyc。进一步的阵列分析已经证实，当提供用诸如甲基转移酶抑制剂等因子的处理时，可以推动部分地重新程序化的iPSC进一步变成完全重新程序化的。4种重新程序化因子的启动子结合和表达诱导的基因组范围的分析证实，这些因子在iPSC和mES细胞中具有类似的靶标，且可能调节类似的基因集合，并且重新程序化因子的靶向在部分的iPSC中也被改变。

最近，几个研究组已经鉴定出，p53-介导的肿瘤抑制剂途径可以拮抗iPSC诱导。p53和它的下游效应物p21在重新程序化过程中均被诱导，且两种蛋白的减少的表达可以促进iPSC集落形成。由于这些蛋白在表达4种重新程序化因子（4F）的大多数细胞中被增量调节，且据报道cMyc会阻断p21表达，仍然不清楚这4种因子（4F）的异位表达如何克服了针对癌基因/转基因过表达的细胞应答和为什么仅非常小的细胞群体变得完全重新程序化。

微RNA是与称作RNA诱导的沉默复合物（RISC）的蛋白复合物相关的18-24个核苷酸的单链小RNA。这些小RNA经常从基因转录物的非编码区产生，其功能是通过翻译阻遏来抑制基因表达。近年来，已经发现微RNA参与许多不同的重要过程，诸如人ES细胞的自我更新基因表达、胚胎干（ES）细胞的细胞周期控制、选择性剪接、心脏发育以及许多其它过程。此外，最近已经报道，ES细胞-特异性的微RNA可以增强小鼠iPSC衍生化，并在重新程序化过程中替代cMyc的功能。还提示，hES特异性的miR-302会减轻由人成纤维细胞中的4种因子表达导致的衰老应答。但是，由于这些微RNA在重新程序化过程的非常晚期之前不表达，以前仍然不知道微RNA是否在iPSC诱导中起重要作用。

发明内容

本发明是基于下述有潜力的发现，即在iPSC诱导过程中涉及微RNA。微RNA生源说机制的干扰导致重新程序化效率的显著降低。鉴别出在重新程序化早期高度诱导的微RNA簇，且功能实验表明，将这样的微RNA导入体细胞中会提高诱导效率。另外，鉴别出重新程序化细胞使用的关键调节剂，它们可以被有利地靶向，以显著增加重新程序化效率以及指导iPS细胞的分化。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种产生iPS细胞的方法。所述方法包括：使体细胞接触细胞核重新程序化因子，并使所述细胞接触微RNA，所述微RNA改变所述细胞内的RNA水平或活性，从而产生iPS细胞。在一个方面，所述微RNA或RNA被修饰。在另一个方面，所述微RNA是在载体中。在另一个方面，所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR-106a、miR let-7家族成员（例如，let-7a、miR 98）或miR-302b簇中。在另一个方面，所述微RNA是miR-93、miR-106b、miR-21、miR-29a或它们的组合。

在一个方面，所述微RNA具有包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。在另一个方面，所述微RNA具有选自SEQ ID NO:2-11的多核苷酸序列。在另一个方面，所述微RNA调节p21、Tgfbr2、p53或它们的组合的表达或活性。在另一个方面，所述微RNA调节Spry 1/2、p85、CDC42或ERK1/2途径。

在一个方面，所述细胞核重新程序化因子由在载体中包含的基因编码。在另一个方面，所述细胞核重新程序化因子是SOX家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、OCT4、NANOG、LIN28或它们的组合。在另一个方面，所述细胞核重新程序化因子是OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC中的一种或多种。在另一个方面，所述细胞核重新程序化因子包括c-Myc。在另一个方面，诱导效率是没有微RNA时的至少2倍。

在一个方面，在接触微RNA之前、同时或之后，使所述体细胞接触重新程序化因子。在另一个方面，所述体细胞是哺乳动物细胞。在另一个方面，所述体细胞是人细胞或小鼠细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过使体细胞接触细胞核重新程序化因子和p21表达或活性的抑制剂而产生iPS细胞的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过使体细胞接触改变所述细胞内的RNA水平或活性的试剂而产生诱导的多能干（iPS）细胞的方法，其中所述试剂诱导体细胞的多能性，条件是，所述试剂不是细胞核重新程序化因子，从而产生iPS细胞。在不同的实施方案中，所述RNA是非编码RNA（ncRNA），包括微RNA。

在上述方法的一个方面，所述试剂是多核苷酸、多肽或小分子。在另一个方面，所述多核苷酸是反义寡核苷酸、化学修饰的寡核苷酸、锁定的核酸（LNA）或DNA。在另一个方面，所述多核苷酸是RNA。在另一个方面，所述RNA选自：微RNA、dsRNA、siRNA、stRNA或shRNA。在另一个方面，所述体细胞是小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。

在不同的方面，所述改变RNA的试剂可以抑制p21、Tgfbr2、p53或它们的组合的表达或活性。在一个方面，所述试剂可以是多核苷酸、多肽或小分子。在另一个方面，所述试剂或p21、Tgfbr2和/或p53的抑制剂是RNA分子，包括微RNA、dsRNA、siRNA、stRNA或shRNA或反义寡核苷酸。在一个示例性的方面，所述试剂或p21、Tgfbr2和/或p53的抑制剂是微RNA分子，并由在导入所述细胞中的重组载体中包含的多核苷酸编码。

在不同的方面，所述微RNA可以是包括在簇中的微RNA，所述簇在iPSC的诱导或其分化过程中表现出活性或表达的增加或减少。在一个方面，诱导效率是没有所述试剂时的至少2倍。在另一个方面，诱导效率是没有所述试剂时的至少3倍。在另一个方面，诱导效率是没有所述试剂时的至少5倍。在一个方面，所述微RNA可以是miR-17、miR-25、miR-106a或miR-302b簇中的一种或多种微RNA，包括miR-93、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-let-7家族成员（例如，let-7a;miR 98）或它们的组合。在一个有关的方面，所述微RNA具有包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列，该序列已经被确定在不同的微RNA（例如，SEQ ID NO:2-11的那些，它们对应着在miR-17、miR-25、miR-106a和miR-302b簇内的微RNA种类）之间是保守的。在一个方面，所述微RNA具有选自SEQ ID NO:2-11的多核苷酸序列。

在不同的方面，所述细胞核重新程序化因子由在导入所述细胞中的重组载体中包含的基因编码。在另一个方面，所述试剂抑制p21、Tgfbr2、p53或它们的组合的表达或活性。在另一个方面，所述试剂调节Spry 1/2、p85、CDC42或ERK1/2途径。

在不同的方面，所述细胞核重新程序化因子由下述基因中的一个或多个编码：SOX家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、OCT4、NANOG、LIN28或它们的组合。在一个示例性的方面，所述细胞核重新程序化因子是OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC中的一种或多种。在另一个方面，所述至少一种细胞核重新程序化因子包括c-Myc。在另一个方面，c-Myc通过抑制至少一种miRNA至少部分地增强重新程序化。

在另一个实施方案中，本发明提供了iPS细胞或使用本文所述的方法产生的这种细胞的群体。在另一个实施方案中，本发明提供了通过本文所述的方法产生的诱导的多能干（iPS）细胞的富集群体。

类似地，在另一个实施方案中，本发明提供了通过诱导使用本文所述的方法产生的iPSC的分化而衍生出的分化的细胞。在一个方面，通过如下诱导分化而衍生出所述体细胞：使所述iPSC接触RNA分子或反义寡核苷酸。在一个方面，所述RNA分子选自：微RNA、dsRNA、siRNA、stRNA或shRNA。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种使用通过本文所述的方法制备的iPS细胞治疗受试者的方法。所述方法包括：使用本文所述的方法，将受试者的体细胞诱导成诱导的多能干（iPS）细胞，诱导所述iPS细胞的分化，以及将所述分化的细胞导入受试者中，从而治疗病症。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于评价试剂的生理功能的方法，其中使用通过本文所述的方法产生的iPS细胞或它们的来源体细胞。在一个方面，所述方法包括：处理使用本文所述的方法产生的诱导的多能干（iPS）细胞，以及评价由所述试剂引起的至少一种细胞功能的变化。在另一个方面，所述方法包括：用试剂处理分化的细胞，所述细胞通过诱导本文所述的多能干细胞的分化而衍生出，以及评价由所述试剂引起的细胞功能的变化。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种评价化合物的毒性的方法，其中使用通过本文所述的方法产生的iPS细胞或它们的来源体细胞。在一个方面，所述方法包括：用所述化合物处理使用本文所述的方法产生的诱导的多能干（iPS）细胞，以及评价所述化合物的毒性。在另一个方面，所述方法包括：用所述化合物处理分化的细胞，所述细胞通过诱导本文所述的多能干细胞的分化而衍生出，以及评价所述化合物的毒性。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种产生诱导的多能干（iPS）细胞的方法。所述方法包括：使体细胞接触至少一种细胞核重新程序化因子；以及使所述细胞接触p21、Tgfbr2、p53的或它们的组合的表达或活性的抑制剂。在一个方面，所述抑制剂抑制p21的表达和/或活性。在另一个方面，所述抑制剂抑制Tgfbr2的表达和/或活性。在另一个方面，所述抑制剂抑制p53的表达和/或活性。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种产生诱导的多能干（iPS）细胞的方法。所述方法包括：使体细胞接触改变所述细胞内的RNA水平或活性的试剂，其中所述试剂诱导体细胞的多能性，条件是，所述试剂不是细胞核重新程序化因子，从而产生iPS细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者的方法。所述方法包括：通过本文所述的方法，从受试者的体细胞产生诱导的多能干（iPS）细胞；诱导iPS细胞的分化；以及将所述细胞导入受试者中，从而治疗病症。

在另一个实施方案中，本发明提供了微RNA用于提高iPS细胞的产生效率的用途。在一个方面，所述微RNA选自：miR-17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b簇或它们的组合。在另一个方面，所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR-106a或miR-302b簇中。在另一个方面，所述微RNA是miR-93、miR-106b、miR-21、miR-29a或它们的组合。

在另一个实施方案中，本发明提供了选自下述的miR序列的组合：miR-17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b簇、miR let-7家族成员或它们的组合。在另一个方面，所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR-106a或miR-302b簇中。在另一个方面，所述微RNA是miR-93、miR-106b、miR-21、miR-29a或它们的组合。

附图说明

图1显示了RNAi机制在小鼠iPSC诱导中的涉入。图1a、1b和1c分别图解了shRNA对小鼠RNAi机制基因Ago2、Drosha和Dicer的敲除（knock-down）。通过RT-qPCR（如在直方图中所示）和对应的蛋白印迹，分析了靶向的基因的mRNA和蛋白水平。用4种因子+靶向Drosha、Dicer和Ago2的shRNA转导原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。用慢病毒shRNA+4μg/μl聚凝胺转导MEF，并在转导后第3天收获总RNA或蛋白。分别通过RT-qPCR和蛋白印迹法，分析靶向的基因的mRNA和蛋白水平。pLKO是shRNA慢病毒载体的空载体对照。pGIPZ是表达非靶向shRNA的慢病毒载体。图1d表明，Ago2的敲除会减少OSK的iPSC诱导。将集落染色，并在转导后第21天定量AP。误差棒代表来自一式两份的孔的标准差。图1e显示了具有shAgo2的iPSC的GFP+集落定量。在转导后第21天定量GFP+集落。误差棒代表来自一式两份的孔的标准差。图1f表明，Ago2的敲除会急剧减少4F的iPSC诱导。用4种重新程序化因子（OSKM（4F））+shRNA Ago2转导原代MEF。可以在转导后第14天对集落进行碱性磷酸酶染色，所述碱性磷酸酶是mES/iPS细胞的标志物。pLKO和pGIPZ载体充当阴性对照。

图2显示了在重新程序化的早期，微RNA簇miR-17、25、106a和302b的诱导。图2a显示的图解表示描绘了在4种因子转导以后的早期，10个微RNA簇的表达诱导。使用miR RT-qPCR来定量在ES细胞中高度表达的10个簇的代表性微RNA的表达变化。分析了来自起始MEF和在4F转导后第4天的MEF的总RNA。直方图的黑色条显示了感染后第4天的MEF，而空白条显示了起始MEF。星号指示诱导的微RNA。图2b显示了在4F转导后第4天诱导的不同miR簇的种子区对比。类似的种子区标有下划线。图2c显示了微RNA的诱导的图解表示。4种因子的不同组合可以诱导代表性的微RNA。在转导后4天，定量微RNA表达。使用4F、OSK、OS和单一因子来分析哪种因子负责miR表达变化。

图3显示了miR-93和miR-106b对iPSC的增强的诱导。图3a的图形表示显示了重新程序化试验时间线。在第0天和第5天，以50nM的终浓度转染微RNA模仿物。在第11天（对于4F诱导）和第15-20天（对于OSK 3种因子iPSC诱导），定量GFP+集落。图3b的图解表示显示了miR-93和miR-106b模仿物会增强使用4F诱导的iPSC诱导。用50nM指示的微RNA转染Oct4-GFP MEF。在转导后第11天，定量GFP+集落。从使用一式三份的孔的3个独立实验计算出诱导倍数和误差棒。图3c的图解表示显示了使用OSK系统对miR-93和miR-106b的增强作用的鉴别。像在4F实验中一样，转染微RNA模仿物。在第15-20天，定量GFP+集落。误差棒代表来自使用一式三份的孔的3个独立实验的标准差。图3d的图解表示显示了微RNA的抑制对重新程序化效率的影响。miR-93和miR-106b的抑制剂会急剧降低重新程序化效率。也在50nM的终浓度转染微RNA抑制剂，并维持与miR模仿物转染相同的实验时间线。误差棒代表来自使用一式三份的孔的3个独立实验的标准差。

图4显示了源自miR模仿物实验的iPSC克隆的表征，其中通过不同的内源ES标志物的RT-PCR，分析了表达。在传代后第3天，从iPS细胞系分离出总RNA。通过RT-PCR，分析ES细胞特异性的标志物诸如Eras、ECat I、Nanog和内源Oct4的表达。

图5显示了miR-93和miR-106b对小鼠p21和Tgfbr2的靶向。图5a表明，miR-93和106b转染会降低p21蛋白水平。用50nM miR模仿物转染Oct4-GFP MEF，并在转染后48小时收获，用于蛋白印迹分析。使用肌动蛋白作为加载对照。图5b表明，siRNA会有效地敲除p21。在48小时时收获P21siRNA和对照转染的MEF，并进行RT-qPCR和蛋白印迹法以证实p21表达。将p21mRNA针对GAPDH标准化。图5c表明，siRNA对p21的敲除会增强iPSC诱导。用4F病毒感染MEF，并按照与微RNA模仿物转染相同的时间线，转染siRNA。在第11天，定量GFP+集落。误差棒代表使用一式三份的孔的至少2个独立实验。图5d表明，miR-93和106b转染会减少Tgfbr2表达。在48小时时，收获转染的细胞用于蛋白印迹。图5e表明，siRNA会敲除Tgfbr2。将相对Tgfbr2mRNA水平针对Gapdh的水平标准化。图5f表明，siRNA对Tgfbr2的敲除会增强iPSC诱导。误差棒代表使用一式三份的孔的至少3个独立实验。

图6显示了微RNA对重新程序化的增强。图6a表明，miR-17和miR-106a可以提高重新程序化效率，但是miR-16不会。以50nM的终浓度，将MiR-17和miR-106a模仿物转染进MEF中。在转导后第11天，定量GFP+集落。误差棒代表使用一式三份的孔的2个独立实验。图6b表明，miR-17和106a靶向p21。在将微RNA模仿物转染进MEF中以后2天，进行p21蛋白印迹法。miR-17和miR-106a靶向Tgfbr2表达。以50nM终浓度，将微RNA模仿物转染进MEF中。图6c表明，miR-17和106a靶向Tgfbr2。在转染后2天，进行蛋白印迹法。图6d显示了微RNA在iPSC诱导过程中的作用的模型。在重新程序化的早期，诱导了几种微RNA，包括miR-17、25和106a簇。这些微RNA会促进完全重新程序化，这通过靶向拮抗该过程的因子（诸如p21）和其它未鉴定的蛋白来实现。向上和向下代表重新程序化过程期间的潜在的不同的阶段和屏障，虚线指示重新程序化的屏障，其在微RNA诱导以后在重新程序化的细胞中降低。

图7的示意图描绘了miR-93和miR-106b对小鼠iPSC诱导的剂量响应。用不同浓度（5、15和50nM）的微RNA转染Oct4-GFP MEF。使用模仿物对照siRNA作为对照。在转导后第11天，定量GFP+集落。数据代表12孔平板中的一式三份的孔。

图8显示了在iPSC诱导过程中诱导的p21表达。图8a显示了使用p21表达的不同系统（从左向右：OSKM、OSK、OS、Klf4、cMyc和MEF对照）的蛋白印迹分析。Klf4和cMyc会诱导P21表达。在转导后第5天，收获用4F、OSK、OS、Klf4和cMyc感染的MEF，用于蛋白印迹法分析。图8b显示的示意图显示了不同的转基因在感染的MEF中的表达确认。

图9显示了p21过表达对使用OSK 3种因子的重新程序化的抑制。图9a是来自OSK诱导和p21过表达的iPSC的AP+集落定量的示意图。在第21天，对诱导的细胞进行碱性磷酸酶染色。在与OSK相同的时间，导入p21病毒。图9b是来自OSK诱导和p21过表达的iPSC的GFP+集落定量的示意图。

图10显示了miRNA对p21表达的直接调节。图10a的图形表示显示了在p21mRNA 3’UTR中发现的2个潜在位点。将突变导入第一个位点（保守位点）中，以破坏miR-93和106b的结合亲和力。图10b的示意图显示了在Hela细胞中的pGL3-p21萤光素酶报道基因表达的定量。用pGL3-p21和pRL-TK以及微RNA转染Hela细胞，在48小时后收获。将结果针对转染的细胞中的pRL-TK水平标准化。

图11显示了miRNA对Tgfbr2表达的直接调节。图11a的图形表示显示了在Tgfbr2mRNA 3’UTR中发现的2个潜在位点。图11b的示意图显示了在Hela细胞中的萤光素酶报道基因表达的定量，其与p21实验类似地进行。将结果针对转染的细胞中的pRL-TK水平标准化。

图12显示了在有指示的不同miRNA存在下的相对Tgfbr2 mRNA水平。

图13表明，shRNA在shAgo2感染的MEF中活跃地表达。图13a显示了shAgo2水平，图13b显示了shRNA水平。图13c显示了ES特异性的标志物在Ago2感染的MEF中的表达。

图14显示了在OSKM因子转导以后第0、4、8和12天时的相对miRNA表达。

图15显示了miR-93模仿物对miR-93的相对水平的影响。

图16a表明，miR抑制剂可以减少靶miR表达。图16b进一步显示了miR抑制剂在重新程序化过程的不同阶段的影响。

图17显示了当导入miR-93或miR-106b时，内源Nanog基因座的启动子甲基化水平。

图18a和18b表明，在miR-93转染以后显著减少的基因可以表现出在iPSC中低表达的基因的3倍富集，而在miR-93转染以后增加的基因不会表现出这样的富集。

图19a显示了使用mRNA阵列或RT-qPCR分析导入miR-93以后的相对Tgfbr2mRNA水平。图19b显示了在导入miR-25、miR-93或miR-106b以后的相对mRNA水平。

图20显示了MEF富集的微RNA、miR-21和miR-29a的抑制会提高iPS细胞重新程序化效率。图20a表明，miR-29a、miR-21和let7a在MEF中高度表达。从Oct4-EGFP MEF和小鼠ES细胞中分离出总RNA，并通过凝胶电泳来分辨。使用针对指示的miRNA的特异性的放射性标记的探针来检测信号。U6snRNA充当加载对照。图20b表明，miRNA抑制会提高重新程序化效率。用OSKM转导Oct4-EGFP MEF。在转导后第14天，通过荧光显微术鉴定和计数GFP阳性的集落。将GFP+集落数针对抗miR非靶向对照处理的数目标准化，并报告为倍数变化。误差棒代表3个独立实验的标准差。＊p值<0.05。

图21表明，c-Myc在重新程序化过程中是MEF富集的miRNA的主要阻抑物。图21a显示了在重新程序化后第5天时选定的miRNA的RNA印迹分析。用指示的单一因子或重新程序化因子的不同组合转导Oct4-EGFP MEF。1F，1种因子；2F，2种因子；3F，3种因子；OSKM：Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。U6用作加载对照RNA。来自胚胎干细胞（ES）的总RNA充当MEF和转导的细胞的阴性对照。使用不同的探针来检测特定miRNA，如在右侧所指示的。MiR-291印迹是ES RNA的阳性对照。

图21b显示了在有不同的重新程序化因子存在下miRNA表达的定量表示。将信号强度针对U6snRNA的强度标准化。将表达比率计算为每种miRNA的表达相对于在MEF中的表达（将其独断地设定为100%）的百分比。定量不同的miRNA（从图A），并指示在右侧。

图21c显示了在OSK-或OSKM-重新程序化以后的不同时间点，在Oct4-EGFP MEF中的选定的miRNA的实时RT-PCR分析。在转导后指定的天（D），分离出RNA，用于实时RT-PCR分析。将信号针对U6标准化，并显示为在MEF中表达的miRNA（将其独断地设定为100）的百分比。误差棒代表2个独立实验的标准差。

图22表明，miR-21或miR-29a的抑制会增强iPS细胞重新程序化，这通过降低p53蛋白水平以及增量调节p85α和CDC42途径来实现。图22a显示了在不同miRNA的抑制以后，p53、CDC42和p85α的表达的蛋白印迹分析。用指示的miRNA抑制剂转染1X10⁵个Oct4-EGFP MEF。在5天后，收获细胞，并进行分析。图22b显示了在有指示的miR抑制剂存在下，蛋白表达的定量表示。将信号强度针对GAPDH强度标准化，并显示为相对于在对照（NT）细胞中的表达（将其独断地设定为100）的百分比。误差棒显示了至少3个独立实验的标准差。*p值<0.05。

图22c显示了在不同的miRNA和OSKM转导的抑制以后，p53、CDC42和p85α表达的免疫印迹分析。用指示的miRNA抑制剂转染1X10⁵个Oct4-EGFP MEF。在5天后，收获细胞，并通过免疫印迹进行分析。如在（B）中所述标准化信号强度。误差棒显示了至少3个独立实验的标准差。*p值<0.05。图22d表明，耗竭miR-29a或p53会提高重新程序化效率。用指示的siRNA和miRNA抑制剂以及OSKM重新程序化因子转染4X10⁴个Oct4-EGFP MEF。在转导后第12天，计数GFP阳性的细胞。误差棒显示了至少3个独立实验的标准差。*p值<0.05。

图23表明，耗竭miR-21和miR-29a会促进重新程序化效率，这通过减量调节ERK1/2途径来实现。图23a显示了在抑制MEF中的不同miRNA以后，磷酸化的和总的ERK1/2的蛋白印迹分析。用指示的miRNA抑制剂转染1X10⁵个Oct4-EGFP MEF，在5天后收获，并进行免疫印迹。将信号强度针对肌动蛋白标准化，并显示为相对于抗miR NT对照表达的百分比。误差棒显示了3个独立实验的标准差。*p值<0.05;＊＊p值<0.005。图23b表明，耗竭miR-21和miR-29a会增加Spry1蛋白水平。显示了Spry1表达比率的蛋白印迹分析。用指示的不同miRNA抑制剂转染MEF。在转染后第5天收获细胞，用于蛋白印迹分析。将信号强度针对肌动蛋白标准化，并显示为图23a所示。误差棒代表3个独立实验的标准差。*p值<0.05;＊＊p值<0.005。

图23c显示了在ERK1/2或GSK3β敲除以后，重新程序化效率的倍数变化。用指示的siRNA以及OSKM转染4X10⁴个Oct4-EGFP MEF。在2周后计数GFP阳性的细胞。使用siNT的转染充当重新程序化效率的对照。误差棒指示3个独立实验的标准差。＊＊p值<0.005。图23d显示了在抑制MEF中的不同miRNA以后，磷酸化的和总的GSK-3β的蛋白印迹分析。用指示的miRNA抑制剂转染1X10⁵个Oct4-EGFP MEF，在5天后收获，并通过免疫印迹进行分析。如在图23a中所述，标准化信号强度。误差棒显示了3个独立实验的标准差。

图24显示的示意图说明，c-Myc会增强重新程序化，这通过减量调节MEF-富集的miRNA、miR-21和miR-29a来实现。p53和ERK1/2途径的功能是作为重新程序化的屏障，且miR-21和miR-29a会通过减量调节CDC42、p85α和Spry1来间接地活化那些途径。也显示了miR-21/p53和miR-29a/ERK1/2途径之间的串扰。c-Myc会抑制这些miRNA的表达，并接着危害ERK1/2和p53的诱导。虚线指示p53和ERK1/2对iPS重新程序化的影响。

图25显示了miR-21的抑制会增强OSK的iPS细胞重新程序化。在用OSK进行重新程序化的过程中，将miRNA的抑制剂导入Oct4-MEF中。在转导后的不同时间点，计数GFP阳性的集落。误差棒代表2个独立实验的标准差。

图26表明，miRNA的抑制不会改变重新程序化过程中的细胞凋亡或增殖速率。图26a表明，在用OSKM进行重新程序化的过程中，将miRNA的抑制剂导入Oct4-MEF中。在转导后8~9天，收集细胞。使用PE膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I（BD Pharmingen；目录号559763）和7-氨基-放线菌素（7-AAD），评价细胞凋亡。通过FACS，检测信号。误差棒代表3个独立实验的标准差。图26b表明，在用OSKM进行重新程序化的过程中，将miRNA的抑制剂导入Oct4-MEF中。在转导后8~9天，收集细胞。在收集前1天，使用Click-iT Edu成像试剂盒（Invitrogen；目录号C10337），用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（Edu）处理细胞。通过FACS，检测信号。误差棒代表3个独立实验的标准差。

具体实施方式

本发明是基于在iPSC诱导中涉及的关键调节机制的发现。一个关键方面是，细胞微RNA与iPSC的诱导之间的连接的发现。这得到下述观察结果的证实：即关键微RNA途径蛋白的敲除对微RNA生源说机制的干扰可以导致重新程序化效率的显著降低。具体地，揭示了至少3个微RNA簇：miR-17~92、106b~25和106a~363，它们在重新程序化的早期被高度地诱导。具有非常类似的种子区的几种微RNA（诸如miR-93和miR-106b）极大地增强iPSC诱导，这通过靶向p21表达、允许被驱动的克隆达到完全重新程序化的状态来实现。

本发明证实，微RNA可以在iPSC诱导中直接起作用，并且微RNA生源说机制的干扰会显著降低重新程序化效率。本发明提供了3个微RNA簇：miR-17~92、miR-106b~25和miR-106a~363，它们在重新程序化的早期被高度地诱导。功能分析证实，将这些微RNA导入MEF中增强了Oct4-GFP+iPSC集落形成。本发明也证实，Tgfbr2和p21（它们二者都抑制重新程序化）被这些微RNA直接地靶向，并且阻断它们的活性显著降低了重新程序化效率。本发明证实，miR-93和miR-106b是重新程序化活性的关键调节剂。

在描述本发明的组合物和方法之前，应当理解，本发明不限于所述的具体组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，无意进行限制，因为本发明的范围仅由所附的权利要求书限定。

如在本说明书和所附的权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指，除非上下文另外清楚地指明。因而，例如，提及的“所述方法”包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤，它们在本领域技术人员阅读本公开内容以后显而易见，诸如此类。

除非另外定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些类似的或等效的任意方法和材料可以用于实践或测试本发明，现在描述优选的方法和材料。

如本文所讨论的，微RNA参与重新程序化过程和iPSC诱导效率的发现，导致通过操纵这些微RNA在细胞中的水平来极大地提高iPSC诱导效率的能力。因此，本发明提供了一种产生iPS细胞的方法，所述方法与已知方法相比具有提高的诱导效率。所述方法包括：使体细胞接触细胞核重新程序化因子和改变所述细胞内的微RNA水平或活性的试剂，条件是，所述试剂不是细胞核重新程序化因子，从而产生iPS细胞。

本发明也基于直接地参与重新程序化过程和iPSC诱导效率的调节蛋白的发现。一种这样的蛋白是p21，即一种具有仅165个氨基酸的小蛋白，其长期以来已知为癌症发展过程中的肿瘤抑制剂，其通过造成p53依赖性的G1生长停滞和促进分化和细胞衰老来起作用。在本文中已经证实，在iPSC诱导过程中微RNA对p21表达的抑制会提高诱导效率。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种通过使体细胞接触细胞核重新程序化因子和p21表达或活性的抑制剂而产生iPS细胞的方法。

鉴于RNA在iPSC的产生中的调节性参与，预见到，使用除了细胞核重新程序化因子以外的调节RNA水平的试剂，可能发生诱导。因此，本发明提供了一种通过使体细胞接触改变所述细胞内的RNA水平或活性的试剂而制备诱导的多能干（iPS）细胞的方法，其中所述试剂诱导体细胞的多能性，条件是，所述试剂不是细胞核重新程序化因子，从而产生iPS细胞。在不同的实施方案中，所述RNA是非编码RNA（ncRNA），诸如微RNA。

在不同的实施方案中，可以使用一种或多种细胞核重新程序化因子来诱导分化的细胞的重新程序化，无需使用卵、胚胎或ES细胞。通过在诱导过程中使用改变所述细胞内的微RNA水平或活性的试剂，会提高诱导过程的效率。所述方法可以用于方便地且高度再现地建立诱导的多能干细胞，所述干细胞具有与ES细胞类似的多能性和生长能力。例如，可以如下将细胞核重新程序化因子导入细胞中：与包含编码RNA分子（诸如微RNA）的多核苷酸的重组载体一起，用包含编码细胞核重新程序化因子的基因的重组载体转导所述细胞。因此，所述细胞可以表达细胞核重新程序化因子（其作为在重组载体中含有的基因的产物而进行表达）以及表达所述微RNA（其作为在重组载体中含有的多核苷酸的产物而进行表达），从而与使用单独的细胞核重新程序化因子相比以提高的效率诱导分化的细胞的重新程序化。

本文使用的多能细胞包括这样的细胞：其具有在体外长时间（大于1年）分裂的潜力，且具有分化成源自所有3个胚胎胚层（包括内胚层、中胚层和外胚层）的细胞的独特能力。

与本发明一起使用的体细胞可以是原代细胞或永生化细胞。这样的细胞可以是原代细胞（未永生化细胞），诸如从动物新鲜分离的那些，或可以源自细胞系（永生化细胞）。在一个示例性的方面，所述体细胞是哺乳动物细胞，例如，人细胞或小鼠细胞。它们可以通过众所周知的方法从不同的器官（例如，但不限于：皮肤、肺、胰腺、肝、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾、尿道及其它泌尿器官）得到，或通常从含有活的体细胞的任意器官或组织得到。可用于本发明中的哺乳动物体细胞包括：作为实例，成年干细胞、塞尔托利细胞、内皮细胞、粒膜上皮细胞、神经元、胰岛细胞、表皮细胞、上皮细胞、肝细胞、毛囊细胞、角质化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞（B和T淋巴细胞）、红细胞、巨噬细胞、单核细胞（monocyte）、单核细胞（mononuclear cell）、成纤维细胞、心肌细胞、其它已知的肌细胞和通常的任意活的体细胞。在具体实施方案中，使用成纤维细胞。本文使用的术语“体细胞”也意图包括成年干细胞。成年干细胞是能够产生特定组织的所有细胞类型的细胞。示例性的成年干细胞包括造血干细胞、神经干细胞和间质干细胞。

本文使用的重新程序化意在表示，改变或逆转部分地或终末地分化的体细胞的分化状态的过程。体细胞的重新程序化可以是体细胞的分化状态的部分或完全逆转。在一个示例性的方面，重新程序化是完全的，其中体细胞被重新程序化成诱导的多能干细胞。但是，重新程序化可以是部分的，诸如逆转至任何更低分化的状态。例如，将终末地分化的细胞逆转成更低分化状态的细胞，诸如多能细胞。

在本发明的不同方面，细胞核重新程序化因子是这样的基因：其诱导多能性，并用于将分化的或半分化的细胞重新程序化成比起始细胞更原始的表型，诸如多能干细胞的表型。这样的基因与改变所述细胞中的微RNA水平或活性和/或抑制p21表达或活性的试剂一起使用，以提高诱导效率。在已经整合进体细胞的基因组中的一个或多个这样的基因表达以后，这样的基因和试剂能够从体细胞产生多能干细胞。本文使用的“诱导多能性的基因”意图表示这样的基因：其与多能性有关，且能够产生更低分化的细胞，诸如在所述基因的整合和表达以后从体细胞产生的多能干细胞。多能性基因的表达通常限于多能干细胞，且对于多能干细胞的功能同一性而言是至关重要的。

本领域技术人员会理解，改变细胞中微RNA的水平或活性或者抑制p21表达或活性的试剂包括多种不同类型的分子。可用于本发明的任意方法中的试剂可以是任意类型的分子，例如，多核苷酸、肽、肽拟似物、类肽诸如插烯类肽（vinylogous peptoid）、化学化合物诸如有机分子或小有机分子等。因此，在一个方面，用于本发明的方法中的试剂是多核苷酸，诸如反义寡核苷酸或RNA分子。在不同的方面，所述试剂可以是多核苷酸，诸如反义寡核苷酸或RNA分子，诸如微RNA、dsRNA、siRNA、stRNA和shRNA。在示例性的方面，所述试剂是这样的微RNA：其被导入所述细胞中，从而增加细胞中的微RNA的水平和活性和/或抑制p21。

微RNA（miRNA）是调节基因表达的单链RNA分子。miRNA由基因编码，它们从所述基因的DNA转录而成，但是miRNA不翻译成蛋白；作为替代，每种前转录物（pri-miRNA）被加工成短茎-环结构，称作pre-miRNA，并最终加工成有功能的miRNA。成熟的miRNA分子与一种或多种信使RNA（mRNA）分子完全地或部分地互补，它们的主要功能是减量调节基因表达。微RNA可以由独立的基因编码，但是也可以从多种不同的RNA种类（包括内含子、mRNA的3'UTR、长非编码RNA、snoRNA和转座子）加工（经由酶Dicer）而成。本文使用的微RNA也包括“拟”微RNA，这意图表示这样的微RNA：其被外源地导入细胞中，具有与它们的内源相似物相同或基本上相同的功能。因而，尽管本领域技术人员会理解，试剂可以是外源地导入的RNA，试剂也包括增加或减少微RNA在细胞中的表达的化合物等。

在不同的方面，所述微RNA可以是这样的微RNA：其被包括在簇中，所述簇在诱导iPSC或其分化的过程中表现出活性或表达的增加或减少。在一个方面，所述微RNA可以是下述中的一种或多种微RNA：miR-17、miR-25、miR-106a或miR-302b簇，诸如miR-93、miR-106b或它们的任意组合。经证实，miR-17~92、miR-106b~25和miR-106a~363簇的诱导对于适当重新程序化而言是重要的。这样的微RNA似乎会降低在该过程中的重新程序化屏障，并因此可以操纵这些微RNA在细胞中的水平，以提高重新程序化效率。也可以操纵微RNA来指导iPSC的分化，因为微RNA被证实是重要的调节分子。

在本文中鉴定出在iPSC诱导过程中被诱导的3个微RNA簇，并且已经确定，在这些簇内的几种微RNA具有相同的核苷酸种子区序列，这指示它们靶向类似的mRNA。还已经确定，这样的共有相同种子区的核苷酸序列的微RNA会增强iPSC诱导，并同时减少p21表达。因而，在一个方面，所述微RNA具有包含SEQ ID NO:1（5’-AAGUGC-3’）的多核苷酸序列，已经确定该序列在不同的微RNA（例如，SEQ ID NO:2-11的那些）之间是保守的。因而，在一个有关的方面，所述微RNA具有SEQ ID NO:2-11中的任一个的核苷酸序列。

术语“小干扰RNA”和“siRNA”也在本文中用于表示短干扰RNA或沉默RNA，它们是一类起多种生物学作用的短的双链RNA分子。最值得注意的是，siRNA涉入RNA干扰（RNAi）途径，其中所述siRNA干扰特定基因的表达。除了它们在RNAi途径中的作用以外，siRNA也在RNAi相关途径中起作用（例如，作为抗病毒机制，或在使基因组的染色质结构成形中）。

本发明的多核苷酸（诸如反义寡核苷酸和RNA分子）可以具有任意合适的长度。例如，本领域技术人员会理解要用于调节基因表达的反义寡核苷酸或RNA分子适用何种长度。这样的分子的长度通常是约5至100、5至50、5至45、5至40、5至35、5至30、5至25、5至20或10至20个核苷酸。例如，所述分子的长度可以是约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45或50个核苷酸。这样的多核苷酸可以包括至少约15个至超过约120个核苷酸，包括至少约16个核苷酸、至少约17个核苷酸、至少约18个核苷酸、至少约19个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约21个核苷酸、至少约22个核苷酸、至少约23个核苷酸、至少约24个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约26个核苷酸、至少约27个核苷酸、至少约28个核苷酸、至少约29个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约35个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约45个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约55个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约65个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约80个核苷酸、至少约85个核苷酸、至少约90个核苷酸、至少约95个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约110个核苷酸、至少约120个核苷酸或大于120个核苷酸。

术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”或“核酸分子”在本文中用于泛指，通过磷酸二酯键连接到一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。这样，这些术语包括RNA和DNA，它们可以是一个基因或其一部分、cDNA、合成的聚脱氧核糖核酸序列等，而且可以是单链或者双链，也可以是DNA/RNA杂交分子。此外，本文使用的术语包括天然存在的核酸分子，它们可以从细胞中分离，也包括合成的多核苷酸，它们可以诸如通过化学合成方法或者通过酶学方法（如通过聚合酶链式反应（PCR））来制备。应当认识到，所用的不同术语仅仅是为了讨论的方便，诸如为了区分组合物的不同组分。

一般而言，组成多核苷酸的核苷酸是天然存在的脱氧核糖核苷酸，诸如连接到2'-脱氧核糖上的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或者核糖核苷酸，诸如连接到核糖上的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。然而，根据用途，多核苷酸还可以含有核苷酸类似物，包括非天然存在的合成的核苷酸或修饰的天然存在的核苷酸。核苷酸类似物是本领域众所周知的且可商业得到的，含有这样的核苷酸类似物的多核苷酸也是如此。多核苷酸中连接核苷酸的共价键通常是磷酸二酯键。然而，根据多核苷酸要应用的目的，所述共价键也可以是众多其它键中的任一种，包括硫代二酯键、硫代磷酸酯键、肽样键或者本领域技术人员已知可用于连接核苷酸以产生合成的多核苷酸的任何其它键。

含有天然存在的核苷酸和磷酸二酯键的多核苷酸或寡核苷酸可以化学合成，或者可以利用适当的多核苷酸作为模板使用重组DNA方法来产生。与此相比，含有核苷酸类似物或者非磷酸二酯键的共价键的多核苷酸通常化学合成，尽管诸如T7聚合酶等酶也可以将某些类型的核苷酸类似物掺入多核苷酸中，并因此可以用于从合适的模板重组地产生这样的多核苷酸。

在不同的实施方案中，反义寡核苷酸或RNA分子包括含有修饰的寡核苷酸。多种修饰是本领域已知的，且被预见到用于本发明中。例如，预见到含有修饰的主链或非天然的核苷间连接的寡核苷酸。本文使用的具有修饰的主链的寡核苷酸包括在主链中保留磷原子的那些以及在主链中没有磷原子的那些。为了本说明书的目的，而且有时候在本领域内参考，在其核苷间主链中没有磷原子的经修饰的寡核苷酸也可认为是寡核苷。

在不同的方面，经修饰的寡核苷酸主链包括，例如，具有正常的3'-5'连接的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯（包括3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯）、次膦酸酯、氨基磷酸酯（包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯）、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，它们的2'-5'连接的类似物，及具有反向极性的那些，其中一个或多个核苷酸间连接是3′到3′、5′到5′、或2′到2′连接。具有反向极性的某些寡核苷酸包含在最3′端核苷酸间连接处的单个3′到3′连接，即可以是无碱基（核苷碱基缺失，或以羟基替代）的单一反向核苷残基。多种盐、混合盐和游离酸形式也包括在内。

在不同的方面，其中不含磷原子的经修饰的寡核苷酸主链具有通过下述核苷间连接形成的主链：短链烷基或环烷基核苷间连接，混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接，或一个或多个短链杂原子的或杂环的核苷间连接。这些包括具有吗啉代连接（部分地由核苷的糖部分形成）的那些主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基（formacetyl）和硫代甲酰基（thioformacetyl）主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；及具有混合的N、O、S和CH₂组成部分的其它主链。

在不同的方面，核苷酸单元的寡核苷酸模拟物（糖和核苷间连接，即主链）被新基团替代。保持碱基单元以与适宜的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物（即已显示出具有卓越杂交特性的寡核苷酸模拟物）称为肽核酸（PNA）。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含酰胺的主链（特别是氨基乙基甘氨酸主链）替代。核苷碱基得到保留，并直接地或间接地结合主链的酰胺部分的氮杂氮原子。在不同的方面，寡核苷酸可以包括硫代磷酸酯主链和具有杂原子主链的寡核苷。经修饰的寡核苷酸还可以含有一个或多个被取代的糖部分。在有些实施方案中，寡核苷酸包含在2'位置处的如下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基和炔基。特别优选的是O[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂和O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂，其中n和m是1至约10。其它优选的寡核苷酸包含在2'位置处的如下之一：C₁至C₁₀低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于提高寡核苷酸的药代动力学性质的基团、或用于提高寡核苷酸的药效动力学性质的基团以及具有相似性质的其它取代基。另一种修饰包括2'-甲氧基乙氧基（2'OCH₂CH₂OCH₃，也称作'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE）。

在有关的方面，本发明包括使用锁定的核酸（LNA）来产生对靶多核苷酸具有增强的亲和力和特异性的反义核酸。LNA是这样的核酸：其中2'-羟基与糖环的3'或4'碳原子相连，从而形成二环糖部分。所述连接优选地是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基（methelyne）(-CH₂-)_n基团，其中n是1或2。

其它修饰包括2'-甲氧基（2'-O-CH₃）、2'-氨基丙氧基（2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂）、2'-烯丙基（2'-CH-CH-CH₂）、2'-O-烯丙基（2'-O-CH₂-CH-CH₂）、2'-氟（2'-F）、2’-氨基、2’-硫代、2’-O甲基、2’-甲氧基甲基、2’-丙基等。2′-修饰可以是在阿拉伯糖（arabino）（上）位或核糖（ribo）（下）位。一种优选的2′-阿拉伯糖修饰是2′-F。也可在寡核苷酸上的其它位置进行类似的修饰，特别是3′末端核苷酸的糖上的3′位置或在2′-5′连接的寡核苷酸中和5′末端核苷酸的5′位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物，诸如用环丁基部分替代呋喃戊糖基糖。

寡核苷酸还可以包括核苷碱基修饰或取代。本文使用的“未修饰的”或“天然的”核苷碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）和嘧啶碱基胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）。经过修饰的核苷碱基包括其它合成的和天然的核苷碱基诸如5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它修饰的核苷碱基包括三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷（1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-n-2(3H)-酮）、吩噻嗪胞苷（1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮）、G-夹子（G-clamp）诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷（2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮）、吡啶并吲哚胞苷（H-嘧啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮）。经修饰的核苷碱基还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环（例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮）替代的那些核苷碱基。其它核苷碱基是本领域已知的。这些核苷碱基中的某些特别适用于提高本文所述的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经证实，5-甲基胞嘧啶取代会将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2C，而且是目前优选的碱基取代，甚至更具体地当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。

本文所述的反义寡核苷酸的另一种修饰包括给寡核苷酸化学地连接一个或多个部分或缀合物，所述部分或缀合物会增强所述寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。反义寡核苷酸可包括与官能团（诸如伯羟基或仲羟基）共价结合的缀合物基团。缀合物基团包括嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、提高寡聚体的药效动力学性质的基团、以及提高寡聚体的药代动力学性质的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸盐、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本发明的上下文中，提高药效动力学性质的基团包括提高寡聚体摄取、增强寡聚体对降解的抗性和/或增强与RNA的序列特异性杂交的基团。在本发明的上下文中，提高药代动力学性质的基团包括提高寡聚体摄取、分布、代谢或排泄的基团。缀合物部分包括、但不限于：脂质部分，诸如胆固醇部分、胆酸，硫醚，例如，己基-5-三苯甲基硫醇、硫代胆固醇，脂族链，例如，十二烷二醇或十一基残基，磷脂，例如，双十六烷基-消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵，聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷醋酸、棕榈基部分、或十八基胺或己基氨基羰氧基胆固醇部分。

已经发现几个基因与多能性有关，且适用于本发明中作为重新程序化因子。这样的基因是本领域已知的，包括：作为实例，SOX家族基因（SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX18）、KLF家族基因（KLF1、KLF2、KLF4、KLF5）、MYC家族基因（C-MYC、L-MYC、N-MYC）、SALL4、OCT4、NANOG、LIN28、STELLA、NOBOX或STAT家族基因。STAT家族成员可以包括：例如STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5（STAT5A和STAT5B）和STAT6。尽管在某些情况下，可能使用仅一个基因来诱导多能性，一般而言，需要表达超过一个基因来诱导多能性。例如，可以将2、3、4或更多个基因作为多顺反子构建体同时掺入体细胞基因组中，以允许这样的基因的同时表达。在一个示例性的方面，使用4个基因来诱导多能性，包括OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC。在美国专利申请号10/997,146和美国专利申请号12/289,873（通过引用并入本文）中公开了其它基因，已知它们是适用于本发明的重新程序化因子。

所有这些基因通常存在于哺乳动物（包括人）中，因而，来自任意哺乳动物的同系物可以用于本发明中，诸如源自包括、但不限于小鼠、大鼠、牛、羊、马和猿等哺乳动物的基因。另外，除了野生型基因产物以外，也可以使用突变型基因产物，其包括几个（例如，1至10、1至6、1至4、1至3和1或2个）氨基酸的置换、插入和/或缺失，并具有与野生型基因产物类似的功能。此外，因子的组合不限于使用野生型基因或基因产物。例如，可以使用Myc嵌合体或其它Myc变体来替代野生型Myc。

本发明不限于细胞核重新程序化因子的任何具体组合。如在本文中所讨论的，细胞核重新程序化因子可以包括一种或多种基因产物。细胞核重新程序化因子也可以包括本文讨论的基因产物的组合。每种细胞核重新程序化因子可以单独使用，或与本文公开的其它细胞核重新程序化因子组合使用。另外，可以通过筛选方法来鉴定本发明的细胞核重新程序化因子，例如，如美国专利申请号10/997,146所讨论的，它通过引用并入本文。另外，本发明的细胞核重新程序化因子可以含有一种或多种与分化、发育、增殖等有关的因子、和具有其它生理活性的因子以及可以起细胞核重新程序化因子的功能的其它基因产物。

所述细胞核重新程序化因子可以包括蛋白或肽。所述蛋白可以从本文所讨论的基因产生，或者，以与所述蛋白与另一种蛋白、肽等的融合基因产物的形式生成。所述蛋白或肽可以是荧光蛋白和/或融合蛋白。例如，也可以使用具有绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白或具有肽（诸如组氨酸标签）的融合基因产物。另外，通过制备和使用具有源自HIV病毒的TAT肽的融合蛋白，可以促进细胞核重新程序化因子穿过细胞膜的细胞内摄取，从而仅通过将所述融合蛋白加入培养基中来实现重新程序化的诱导，因而避免了复杂的操作诸如基因转导。由于这样的融合基因产物的制备方法是本领域技术人员众所周知的，技术人员可以根据目的容易地设计和制备适当的融合基因产物。

如本文所讨论的，通过使体细胞接触与改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂和/或p21的抑制剂相组合的细胞核重新程序化因子，可以诱导iPSC。本领域技术人员会理解，通过本领域已知的任意合适的方法，可以进行向体细胞的递送。在一个方面，使用包含编码细胞核重新程序化因子的基因的重组载体，可以将细胞核重新程序化因子导入细胞中。类似地，使用包含编码RNA分子（诸如微RNA、shRNA、反义寡核苷酸等）的多核苷酸的重组载体，可以将改变微RNA的试剂导入细胞中。类似地，使用包含编码肽抑制剂或RNA分子（诸如微RNA、shRNA、反义寡核苷酸等）的多核苷酸的重组载体，可以将p21的抑制剂导入细胞中。因此，所述细胞可以表达细胞核重新程序化因子（其作为在重组载体中含有的基因的产物而进行表达）以及表达试剂或p21抑制剂（其作为在重组载体中含有的多核苷酸的产物而进行表达），从而与使用单独的细胞核重新程序化因子相比以提高的效率诱导分化的细胞的重新程序化。

使用多种众所周知的技术，诸如基于非病毒的细胞转染，可以将本发明的核酸构建体（诸如重组载体）导入细胞中。在一个示例性的方面，将所述构建体掺入载体中，并导入细胞中，以允许表达所述构建体。通过本领域已知的任意基于病毒的或非病毒的转染，可以导入细胞中，所述转染是：例如，但不限于，电穿孔、磷酸钙介导的转移、核转染、声致穿孔、热激、磁转染、脂质体介导的转移、显微注射、微射弹介导的转移（纳米颗粒）、阳离子型聚合物介导的转移（DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙二醇（PEG）等）或细胞融合。其它转染方法包括专有的转染试剂诸如Lipofectamine^TM、Dojindo Hilymax^TM、Fugene^TM、jetPEI^TM、Effectene^TM和DreamFect^TM。

在其它方面，通过本领域已知的任意方法，可以在诱导过程中使体细胞接触与改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂和/或p21的抑制剂相组合的细胞核重新程序化因子。例如，跨细胞膜直接递送蛋白、RNA分子等。

与使用单独的重新程序化因子相比，与改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂和/或p21的抑制剂组合地使用细胞核重新程序化因子会提高诱导效率。在不同的方面，与常规方法相比，诱导效率可以提高10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400或甚至500%。例如，诱导效率可以高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或50%（例如，诱导的细胞相对于起始体细胞的总数的百分比）。

在诱导过程中，可以在使体细胞接触改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂和/或p21的抑制剂的同时或之前，使所述细胞接触细胞核重新程序化因子。在不同的方面，在使体细胞接触任意其它试剂或抑制剂之前约1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天，使所述细胞接触重新程序化因子。在一个示例性的方面，在使体细胞接触任意其它试剂或抑制剂之前约1、2、3、4或5天，使所述细胞接触重新程序化因子。

可以进行其它分析，以评估重新程序化的细胞的多能性特征。可以分析所述细胞的不同的生长特征和胚胎干细胞样形态学。例如，通过加入已知会驱动分化成特定细胞类型的某些生长因子，可以在体外分化细胞。能够仅形成身体的少数细胞类型的重新程序化细胞是多能的（multipotent），而能够仅形成身体的任意细胞类型的重新程序化细胞是多能的（pluripotent）。

也可以进行重新程序化的体细胞的表达绘谱分析（Expressionprofiling），以评估它们的多能性特征。也可以检查与多能性有关的单个基因的表达。另外，可以分析胚胎干细胞表面标志物的表达。本领域已知的与多能干细胞有关的多种基因的检测和分析，可以包括下述基因的分析：例如，但不限于，OCT4、NANOG、SALL4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81或它们的组合。iPS细胞可以表达任意数目的多能细胞标志物，包括：碱性磷酸酶（AP）；ABCG2；时期特异性的胚胎抗原-1（SSEA-1）；SSEA-3；SSEA-4；TRA-1-60；TRA-1-81；Tra-2-49/6E；ERas/ECAT5，E-钙粘着蛋白；β-微管蛋白III；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）；成纤维细胞生长因子4（FGF4），Cripto，Dax1；锌指蛋白296（Zfp296）；N-乙酰基转移酶-1（Nat1）；ES细胞有关的转录物1（ECAT1）；ESG1/DPPA5/ECAT2；ECAT3；ECAT6；ECAT7；ECAT8；ECAT9；ECAT10；ECAT15-1；ECAT15-2；Fthll7；Sall4；未分化的胚胎细胞转录因子（Utf1）；Rex1；p53；G3PDH；端粒末端转移酶，包括TERT；沉默的X染色体基因；Dnmt3a；Dnmt3b；TRIM28；含有F-框的蛋白15（Fbx15）；Nanog/ECAT4；Oct3/4；Sox2；Klf4；c-Myc；Esrrb；TDGF1；GABRB3；Zfp42，FoxD3；GDF3；CYP25A1；发育多能性相关的2（DPPA2）；T-细胞淋巴瘤断点1（Tcl1）；DPPA3/Stella；DPPA4；以及多能性的其它一般标志物，例如在诱导过程中用于重新程序化细胞的任意基因。通过诱导出iPS细胞的分化细胞特有的标志物的减量调节，也可以表征IPS细胞。

本发明另外提供了使用本文所述的方法产生的iPS细胞以及这种细胞的群体。本发明的能够分化成多种细胞类型的重新程序化的细胞具有多种应用和治疗用途。干细胞的基本性质（无限自我更新的能力和分化成体内的每种细胞类型的能力）使得它们对于治疗用途而言是理想的。

因此，在一个方面，本发明另外提供了一种治疗或预防受试者的障碍和/或病症的方法，其中使用通过本文所述的方法产生的诱导的多能干细胞。所述方法包括：从受试者得到体细胞，以及使用本文所述的方法，将所述体细胞重新程序化成诱导的多能干（iPS）细胞。然后在适合使所述细胞分化成适用于治疗所述病症的所需细胞类型的条件下，培养所述细胞。然后可以将分化的细胞导入所述受试者中，以治疗或预防所述病症。

在一个方面，可以如下在体外分化使用本文所述的方法生产的iPS细胞以及这种细胞的群体：通过用改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂处理或接触所述细胞。由于微RNA已经被鉴别为iPSC诱导中的关键调节剂，预期单个微RNA或微RNA群体的操纵可以用于指导这样的iPSC的分化。这样的处理可以与本领域通常已知会驱动分化成特定细胞类型的生长因子或其它试剂和刺激物组合使用。

本发明的一个优点是，它会提供适用于移植的同基因的或同源的人细胞的基本上无限的供给。针对患者特异性地定制iPS细胞，从而避免免疫排斥。因此，会避免与当前的移植方法有关的重大问题，例如，因为宿主抗移植物或移植物抗宿主排斥而可能发生的移植组织排斥。几类iPS细胞或从iPS细胞（来自源自健康人的体细胞）制备的完全分化的体细胞可以储存在iPS细胞库中作为细胞文库，所述文库中的一类或几类iPS细胞可以用于制备患者不会排斥的体细胞、组织或器官，用于进行干细胞治疗。

通过本领域已知的方法，可以使本发明的iPS细胞分化成许多不同的细胞类型，以治疗多种障碍。例如，可以诱导iPS细胞，以分化成造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、泌尿道细胞、神经元细胞等。然后可以将分化的细胞移植回患者体内，以预防或治疗病症。因而，本发明的方法可以用于治疗具有下述病症的受试者：心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、缺血、外周血管病、酒精性肝病、硬化、帕金森病、阿尔茨海默氏病、糖尿病、癌症、关节炎、伤口愈合、免疫缺陷、再生障碍性贫血、贫血、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化（ALS）、溶酶体贮存疾病、多发性硬化、脊髓损伤、遗传障碍和类似的疾病，其中特定细胞类型/组织或细胞去分化的增加或替换是合乎需要的。

在不同的实施方案中，与对应的未处理的对照组织或器官相比，所述方法会使组织或器官的细胞数目增加至少约5%、10%、25%、50%、75%或更多。在另一个实施方案中，与对应的未处理的对照组织或器官相比，所述方法会使组织或器官的生物活性增加至少约5%、10%、25%、50%、75%或更多。在另一个实施方案中，与对应的未处理的对照组织或器官相比，所述方法会使组织或器官中的血管形成增加至少约5%、10%、25%、50%、75%或更多。在另一个实施方案中，将所述细胞直接地施用于受试者的需要增加细胞数目的部位。

本发明另外提供了一种用于使用通过本文所述的方法得到的不同细胞而评价试剂、化合物、药剂、毒物等的生理功能或毒性的方法。

通过4种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和cMyc的异位表达，可以将体细胞重新程序化至ES-样状态，以建立诱导的多能干细胞（iPSC）。本发明证实，细胞微RNA会调节iPSC产生。关键性的微RNA途径蛋白的敲除可以导致重新程序化效率的显著降低。经证实，3个微RNA簇miR-17~92、106b~25和106a~363在重新程序化早期被高度地诱导。具有非常类似的种子区的几种微RNA（包括miR-93和miR-106b）极大地增强了iPSC诱导，抑制这些微RNA显著降低了重新程序化效率。此外，miR-iPSC克隆可以达到完全重新程序化的状态。本发明证实，这些微RNA直接地靶向Tgfbr2和p21，这2个基因的siRNA敲除实际上增强了iPSC诱导。本发明也证实，miR-93和它的家族成员直接地靶向TGF-β受体II，以增强iPSC重新程序化。本发明证实，微RNA在重新程序化过程中起作用，通过调节细胞中的微RNA水平，可以极大地提高iPSC诱导效率。

尽管诱导的多能干细胞（iPSC）对于定制再生药物而言具有巨大前景，重新程序化的分子基础在很大程度上不明。克服维持细胞同一性的屏障，是分化的细胞的重新程序化中的关键步骤。因为微RNA（miRNA）组织特异性地调节靶基因，本发明证实，不同的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）-富集的miRNA会在转录后调节起重新程序化屏障功能的蛋白。抑制这些miRNA会影响细胞信号传递，以降低那些屏障。本发明证实，耗竭miR-21和miR-29a会提高MEF中的重新程序化效率。本发明证实，p53和ERK1/2途径受miR-21和miR-29a调节，并在重新程序化中起作用。本发明另外证实，c-Myc会增强重新程序化，这部分地通过抑制MEF-富集的miRNA诸如miR-21和miR-29a实现。本发明提供了在调节iPSC重新程序化所涉及的多个信号传递网络中起作用的miRNA。

作为4种重新程序化因子（4F:Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc）之一的C-Myc，在细胞增殖和肿瘤发展中起重要作用。C-Myc是细胞郁滞和细胞凋亡的关键调节剂，其通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂p21^Cip1来起作用。通过废除Miz-1功能和抑制p15^INK4b，c-Myc在原代细胞的永生化中起关键作用。c-Myc的许多转录功能需要与Max或Miz-1协作。作为原癌基因，c-Myc会极大地提高重新程序化效率，尽管它对于重新程序化而言是非必需的。因此，确定在重新程序化过程中位于c-Myc下游的分子途径，可以增强iPS细胞的治疗应用，而不危害重新程序化效率。

在D13.5，从小鼠衍生出Oct4-GFP小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），所述小鼠携带位于pou5f1（Jackson lab,Stock#008214）的终止密码子下游的IRES-EGFP融合盒。在含有10%FBS（Invitrogen）+谷氨酰胺和NEAA的DMEM（Invitrogen,11995-065）中，培养这些MEF。对于iPSC诱导，仅使用在0至4代的MEF。

据报道，C-Myc起维持ES细胞更新的作用，这部分地通过调节微RNA（miRNA）表达来实现。微RNA是22个核苷酸的非编码的小RNA，其被装载进RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，以发挥总体的基因沉默功能。c-Myc会在ES细胞中诱导miR-141、miR-200和miR-429的表达，以拮抗分化。C-Myc也会促进肿瘤发生，这是通过增量调节miR-17-92微RNA簇或通过抑制已知的肿瘤抑制剂（诸如let-7家族、miR-15a/16-1、miR-29家族和miR-34a）来实现。

克服确保体细胞同一性并由诸如Ink4-Arf、p53和p21等因子介导的屏障，是重新程序化的限速步骤。由于miRNA组织特异性地调节靶基因，本发明证实，不同的MEF miRNA会在转录后调节起重新程序化调节剂的功能的蛋白。抑制这些miRNA可以影响细胞信号传递，以降低那些屏障。

本发明证实，耗竭MEF中的丰富的miRNA miR-21和miR-29a会使重新程序化效率提高约2.1至2.8倍。本发明也证实，c-Myc会抑制miRNAmiR-21和miR-29a，以增强MEF的重新程序化。本发明另外证实，miR-21和miR-29a会在重新程序化过程中通过间接地减量调节p53水平和ERK1/2磷酸化来调节p53和ERK1/2途径。

提供下面的实施例来进一步例证本发明的实施方案，但是无意限制本发明的范围。尽管它们是可以使用的那些实施例的典型，但是可以替代性地使用本领域技术人员已知的其它操作、方法或技术。

实施例1

细胞培养、载体和病毒转导

在D13.5，从小鼠衍生出Oct4-GFP小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），所述小鼠携带位于pou5f1（Jackson lab,Stock#008214）的终止密码子下游的IRES-EGFP融合盒。在含有10%FBS（Invitrogen）+谷氨酰胺和NEAA的DMEM（Invitrogen,11995-065）中，培养这些MEF。对于iPSC诱导，仅使用在0至4代的MEF。

质粒pMXs-Oct4、Sox2、Klf4和cMyc购自Addgene。通过将N-端标记的p21插pMX载体的EcoRI位点中，产生质粒pMX-HA-p21。pLKO-shRNA的克隆购自Open-Biosystems。

为了产生逆转录病毒，将PLAT-E细胞接种在10cm平板中，次日使用Lipofectamine^TM（Invitrogen,18324-012）和PLUS^TM（Invitrogen,11514-015）转染9μg的每种因子。2天后，收获病毒，并组合。对于iPSC诱导，将MEF接种在12孔平板中，次日用4μg/ml聚凝胺转导4种因子病毒。转导后1天，将培养基更换为新鲜的MEF培养基，并在3天后更换为补充了LIF（Millipore,ESG1107）的mES培养基。在转导后第14天，挑取GFP+集落，并在含有15%FBS（Hyclone）+LIF、硫代甘油、谷氨酰胺和NEAA的DMEM中培养成功地繁殖的克隆。使用经辐照的CF1MEF作为饲养层，用于培养mES和衍生的iPSC克隆。

为了产生shRNA慢病毒，将shRNA慢病毒载体与pPACKH1包装系统（SBI，目录号LV500A-1）一起共转染进293FT细胞中。在转染后第2天，收获慢病毒，并以4,000rpm在室温离心5min。为了产生病毒，将4μgpLKO或pGIPZ载体和10μg包装混合物转染进在10cm组织培养板中的293FT细胞（Invitrogen）中。转染后2天，收获含有病毒的上清液，并用于使用4μg/μl聚凝胺的进一步转导。以1:1:1:1:1的体积比，与4因子病毒一起加入ShRNA病毒。

如下进行MEF的微RNA、siRNA和转染：微RNA模仿物和抑制剂、siRNA购自Dharmacon。为了转染MEF，在Opti-MEM（Invitrogen,11058-021）中稀释微RNA模仿物至希望的终浓度。然后以2μl/孔，将Lipofectamine^TM 2000（Invitrogen,11668-019）加入混合物中，并在室温温育20min。对于12孔转染，将80μl miR混合物加入含有320μl Opti-MEM的每个孔中。3小时以后，将0.8ml病毒混合物（对于iPSC）或新鲜的培养基加入每个孔中，次日将培养基更换为新鲜的MEF培养基。

如下进行蛋白印迹法：使用在冰上的MPER缓冲液（PIERCE,78503）制备总细胞裂解物20min，并通过以13,000rpm离心10min进行澄清。将等体积的裂解物加载到10%SDS-PAGE凝胶中，并使用半干燥的系统（Bio-Rad）将蛋白转移至PVDF膜（Bio-Rad,1620177）上。然后用在TBST中的5%乳封闭PVDF膜在室温至少1小时或在4℃过夜。

使用的抗体包括：抗-p21（BD,556430）、抗-mNanog（R&D,AF2729）、抗-h/mSSEA1（R&D,MAB2156）、抗-HA（Roche,11867423001）、抗-mAgo2（Wako,01422023）、抗-Dicer（Abcam,ab13502）、抗-Drosha（Abcam,ab12286）、抗-肌动蛋白（Thermo,MS1295P0）、抗-AFP（Abcam,ab7751）、抗-β微管蛋白III（R&D systems,MAB1368）、抗-α辅肌动蛋白（Sigma,A7811）。

如下进行mRNA和微RNA RT和定量PCR：通过Trizol方法（Invitrogen）提取总RNA。提取以后，将1μg总RNA用于通过Superscript II^TM（Invitrogen）进行的RT。使用Roche LightCycler480II^TM和来自Abgene的Sybrgreen混合物（Ab-4166），进行定量PCR。小鼠Ago2、Dicer、Drosha、Graph和p21的引物列出在下面的表1中。其它引物已经描述在：Takahashi,K.和S.Yamanaka（2006）Cell 126（4）:663-76。

对于微RNA定量分析，使用上述的方法提取总RNA。提取后，将1.5~3μg总RNA用于微RNA反转录，其中按照生产商的方案（SBI,RA420A-1）使用QuantiMir^TM试剂盒。然后将RT产物用于定量PCR，其中使用成熟的微RNA序列作为正向引物和与试剂盒一起提供的通用引物。

如下进行免疫染色：用PBS洗涤细胞2次，并用4%低聚甲醛在室温固定20min。用0.1%Triton X-100透化固定的细胞5min。然后在5%BSA（其在含有0.1%Triton X-100的PBS中）中在室温封闭细胞1小时。根据生产商的建议，在含有0.1%Triton X-100的2.5%BSA PBS中，将第一抗体从1:100稀释至1:400。然后用第一抗体将细胞染色1小时，再用PBS洗涤3次。以1:400稀释第二抗体，并将细胞在室温染色45min。

如下进行胚状体（EB）形成和分化试验：用胰蛋白酶将iPS细胞制成单细胞悬浮液，并使用悬滴方法来产生胚状体。对于每一滴，使用在20μlEB分化培养基中的4000个iPS细胞。在悬滴中培养EB 3天，然后重新接种到明胶包被的平板中。重新接种以后，进一步培养细胞，直到第14天，这时可以鉴别出明显的搏动区。

表1.用于qPCR分析的引物

mmuAgo2       正向        5'-gcgtcaacaacatcctgct-3'

              反向        5'-ctcccaggaagatgacaggt-3'

mmuDrosha     正向        5'-cgtctctagaaaggtcctacaagaa-3'

              反向        5'-ggctcaggagcaactggtaa-3'

mmuDicer1     正向        5’-gggctgtatgagagattgctgatg-3’

              反向        5’-cacggcagtctgagaggatttg-3’

mmuP21        正向        5'-tccacagcgatatccagaca-3'

              反向        5'-ggacatcaccaggattggac-3'

mmuGAPDH      正向        5’-atcaagaaggtggtgaagcggaa-3’

              反向        5’-tggaagagtgggagttgctgttga-3’

如下进行启动子甲基化分析：按照以前描述的相同规程（Takahashi,K.和S.Yamanaka（2006）Cell 126（4）:663-76），分析Nanog和Pou5f1启动子的CpG甲基化。简而言之，使用Qiagen^TM试剂盒，提取衍生的克隆的基因组DNA。然后按照生产商的方案（EZ DNA甲基化–直接试剂盒,Zymo Research,D5020），将1μg DNA用于基因组修饰分析。修饰以后，进行选定区域的PCR，并将产物克隆进pCR2.1-TOPO^TM（Invitrogen）中。对于每个基因，测序10个克隆。

实施例2

畸胎瘤形成、嵌合体产生和微阵列分析

如下进行畸胎瘤形成和嵌合体制备：为了产生畸胎瘤，用胰蛋白酶处理iPS细胞，并以1x10⁷细胞/ml的浓度重新悬浮。首先用阿佛丁麻醉无胸腺的裸鼠，然后将大约150μl细胞悬浮液注射进每只小鼠中。每周检查小鼠的肿瘤，持续3~4周。收获肿瘤，并在锌福尔马林溶液中在室温固定24小时，然后进行石蜡包埋以及苏木精和伊红染色。为了测试衍生的iPSC克隆对嵌合体做出贡献的能力，将iPS细胞注射进C57BL/6J-Tyr^（C-2J)/J（白变种）胚泡中。通常，每个胚泡接受12-18个iPS细胞。将雌性ICR受体用于胚胎转移。供体iPS细胞是刺鼠色或黑色。

如下进行mRNA微阵列分析：将miR-93和siControl转染进MEF中，并在转染后48小时收获总RNA。通过在Sanford-Burnham研究所的微阵列设备，进行mRNA微阵列。通过经由火山图（volcano map）过滤，产生潜在功能靶标（倍数变化>2，p<0.05）和总靶标（倍数变化>25%，p<0.05）的基因列表。然后将基因列表用于本体论分析，其中按照公司的指南使用GeneGo软件。

如下进行双萤光素酶试验：将p21和Tgfbr2的3’UTR克隆进pGL3对照载体的XbaI位点中。对于12孔平板的每个孔，将200ng得到的载体和50ng pRL-TK（renilla萤光素酶）转染进1x10⁵个Hela细胞中，所述细胞在转染前1天接种。将50nM微RNA用于每次处理，并在转染后第2天收获细胞裂解物。然后按照生产商的方案（

报道试验系统Promega,E1910），将20μl裂解物用于双萤光素酶试验。

如下进行细胞增殖试验：将3000MEF接种在96孔平板的每个孔中，并用4F病毒和shRNA慢病毒转导（或用微RNA抑制剂转染）。从转导/转染后第1天开始，每2天，在组织培养箱中用mES培养基温育细胞1小时，所述mES培养基含有Celltiter 96Aqueous one溶液（Promega,G3580）。然后使用平板读数器，测量每个孔在490nm的吸光度，并将收集的数据用于产生相对增殖曲线，其中使用来自转导/转染后第1天的信号作为参照。

实施例3

在重新程序化体细胞中涉及转录后调节途径

经测定，转录后调节途径涉入MEF向iPS细胞的重新程序化。为了研究转录后基因调节在iPSC诱导过程中的作用，使用靶向小鼠Dicer、Drosha和Ago2的慢病毒shRNA载体进行原代Oct4-GFP MEF的稳定敲除。通过蛋白印迹和RT-qPCR，验证这些shRNA构建体的敲除效率（图1a、1b和1c）。常规地观察到每种shRNA的大约70%-80%的mRNA水平敲除以及蛋白水平的显著降低。

然后以1:1:1:1:1的体积比，将所述shRNA单独地用于与表达4种因子OSKM（Oct4、Sox2、Klf4和cMyc）的病毒一起转导MEF。14天以后，固定集落，并进行碱性磷酸酶（AP）活性染色，该酶是广泛使用的ES细胞标志物。定量每次处理的AP+集落，关键RNAi机制蛋白Dicer、Drosha和Ago2的敲除导致与pLKO和pGIPZ对照相比AP+集落的急剧减少。通过使用OSK（3种因子3F）转导，观察到类似的结果。

GFP+和AP+集落定量证实，敲除Ago2会急剧降低重新程序化效率，而转导的成纤维细胞的增殖不受影响（图1d、1e和1f）。尽管在Ago2敲除以后重新程序化效率降低，在shAgo2中的有些GFP+集落是感染的MEF，并且进一步的表征确定，这些集落是shRNA整合阳性的，其中活跃地表达shRNA（图13a和13b）。这些细胞也表达所有测试的ES特异性的标志物，且已经开启内源Oct4基因座（图13c）。这些数据强烈地提示，转录后调节（特别是微RNA）在重新程序化过程中起重要作用。

实施例4

在体细胞的重新程序化过程中诱导了微RNA簇

经测定，微RNA miR-17、25、106a和302b簇在重新程序化的早期被诱导。由于这4种转录因子在iPSC诱导过程中诱导大量基因表达变化，推论出这些因子可能诱导一些ES特异性的微RNA，它们将有助于MEF成功地重新程序化。最近的关于ES特异性的微RNA增强iPSC诱导的公开也支持该假设，尽管在重新程序化的非常晚期之前没有发现表达报道的微RNA。通过分析公开的结果，选择9个经确定在小鼠ES细胞中高度表达的微RNA簇用于分析，并如表2所示。

使用基于miR qPCR的方法，评价来自每个簇的2个代表性的微RNA，以定量在不同的重新程序化阶段（包括OSKM因子转导后第0天、第4天、第8天和第12天）的表达变化。在第8天之前，没有诱导许多ES特异性的微RNA，诸如miR-290簇和miR-293簇（图14），在该阶段，GFP+集落已经可检测到。在4种因子转导后第4天之前，几种其它的微RNA簇（包括miR-17~92、25~106b、106a~363和302b~367）以不同的程度表达（图2a）。在这4个微RNA簇中，miR-302b~367在MEF中的水平最低。第4天在重新程序化时高度诱导的3个簇中，一些共有非常类似的种子区（图2b），这提示，它们在重新程序化中起作用，并可以靶向类似的基因集合。

表2.用于iPSC实验的微RNA的列表

然后进行分析，以确定4种因子中的哪一种负责诱导这些微RNA。通过用相同剂量的4种因子的不同组合转导MEF，在转导后第4天收获总RNA，用于miR qPCR分析（图2c）。该分析证实，单独的cMyc可以诱导miR-17~92、miR-25~106b和miR-106a~363簇表达。但是，在所有情况下，所有4种重新程序化因子的组合诱导了微RNA簇的最丰富表达，并且稳健表达与最高的重新程序化效率相关联（图2c）。

这些结果鉴定出，在重新程序化的早期诱导3个微RNA簇（包括miR-17~92、25~106b、106a~363），且进一步，4种因子一起最高度地诱导这些微RNA的表达，尽管单一因子也可以在较低的程度上诱导它们的表达。

实施例5

微RNA增强IPSC诱导

经测定，微RNA miR-93和miR-106b会增强小鼠iPSC诱导。由于所述4种鉴定的微RNA簇含有几个具有类似种子区的微RNA，进一步分析miR-106b~25簇，因为该簇包括3个微RNA（即，miR-25、miR-93和miR-106b）。MiR-93和miR-106b具有相同的种子区，且二者被4种重新程序化因子高度地诱导（图2a）。假定，如果这些微RNA在重新程序化的细胞中起作用，通过在该过程中诱导这些微RNA，预见到提高的iPSC诱导效率。

使用将微RNA模仿物直接转染进MEF中的策略，进行这些诱导的微RNA的功能测试（图3a）。在第0天和第5天与4种因子（或OSK）病毒一起导入微RNA 2次，并使用具有在内源Oct4启动子控制下的GFP表达的报道MEF。例如，在第0和5天，用表达所有4种因子（4F，OSKM）或仅表达Oct4、Sox2和Klf4（OSK）的载体，将微RNA模仿物直接转染进携带Oct-4-GFP的MEF中，并基于GFP表达来测定重新程序化。当这些细胞被成功地重新程序化成iPSC时，它们变成GFP阳性的（+）。在约第11天，定量GFP+集落，以评价重新程序化效率（图3b；表3）。实际上，miR-93和miR-106b模仿物的转染导致GFP+集落在4F和OSK转导中增加约4~6倍（图3c），这证实了在iPSC诱导过程中诱导的这些微RNA会促进MEF重新程序化。

表3.用于iPSC诱导的具有miR的GFP+集落的数目

*4x10⁴个MEF/孔，在12孔平板（用明胶包被）中

剂量依赖性的实验表明，在低至5-15nM范围的miR，可以看到提高的重新程序化效率（图7）。当用碱性磷酸酶底物对集落染色时，对于miR模仿物转染而言，似乎不存在AP+集落的显著增加，这提示，miR-93和miR-106b可以促进iPSC集落的成熟过程。这也得到使用OSK系统所观察到的现象的支持，在该现象中，许多GFP+集落在OSK转导后第15天出现在miR模仿物转染的细胞中，而对照孔在该阶段没有表现出任何成熟的iPSC集落。

为了证实这些微RNA在iPSC诱导中是重要的，还使用miR抑制剂来敲除在该过程中被靶向的微RNA。测试的所有miR抑制剂都可以有效地减少靶miR表达，且它们的转染不会影响增殖（图16a和16b）。与miR模仿物实验相一致，miR-93和miR-106b敲除可以促进GFP+集落的急剧减少（图3d）。尽管miR-25模仿物没有增强MEF iPSC诱导，敲除该微RNA会使重新程序化效率降低约~40%（图3d），这提示，miR-25也可以在重新程序化过程中起作用。作为对照，Let7a抑制剂对重新程序化效率没有任何影响。这些数据强烈地提示，miR-93和miR-106b会促进MEF重新程序化为iPSC。通过在iPSC诱导过程中调节这些微RNA，可以进一步提高重新程序化效率。

实施例6

微RNA衍生的克隆是完全多能的

为了检查诱导的细胞是否达到完全多能的状态，衍生出几个iPSC克隆（对于每种微RNA）以及miR对照，并分析多能性标志物的表达。所有克隆是GFP+的，这指示重新活化的Oct4表达。免疫染色证实，Nanog和SSEA1也在所有克隆中活化。其它mES标志物（诸如Eras、ECat I和内源性的Oct4）的RT-qPCR表明类似的结果。全基因组mRNA表达图谱绘制也指示，衍生出的克隆表现出比MEF更类似于小鼠ES细胞的基因表达谱。分析了内源性的Nanog基因座的启动子甲基化，所有测试的克隆表现出去甲基化的启动子，正如在小鼠ES细胞中观察到的（图17）。

为了研究衍生出的克隆是否表现出mES细胞的完全分化能力，评价了胚状体（EB）形成。所有衍生出的克隆都表现出有效的EB形成，且EB表现出谱系标志物（诸如β-微管蛋白III（外胚层）、AFP（内胚层）和α-辅肌动蛋白（中胚层））的阳性染色。也从这些细胞衍生出搏动的EB，这指示，从这些miR-iPSC克隆可以衍生出有功能的心肌细胞。当将这些miR-iPSC注射进无胸腺的裸鼠中时，在3-4周中容易地衍生出畸胎瘤。最后，作为最严谨的实验，将miR衍生的iPSC克隆注射进白变种/黑色B6胚泡中，并产生嵌合体小鼠。此外，这些细胞可以为衍生的E13.5胚胎的生殖脊做出贡献。这些结果提示，miR-93和miR-106b对重新程序化的增强作用没有改变诱导的多能细胞的分化能力，并且那些衍生出的克隆可以分化成所有3个种系。

实施例7

MiR-93和MiR-106b靶向小鼠中的Tgfbr2和P21

为了进一步理解miR-93和miR-106b提高重新程序化效率的基本机制，研究了这些微RNA的细胞靶标。首先选择MiR-93用于分析，因为它具有与miR-106b相同的种子区。将MiR-93模仿物转染进MEF中，并在第2天收获总RNA，用于mRNA表达谱分析。与MEF和iPSC的公开的表达谱相比，该分析鉴定出miR-93的潜在功能靶标。在miR-93转染后显著减少的基因表现出在iPSC中低表达的基因的3倍富集（图18a），而在miR-93转染后增加的基因没有表现出这种富集。另外，进行miR-93转染的MEF的表达谱的途径本体论分析。令人感兴趣地，2个对于iPSC诱导而言重要的途径受miR-93:TGF-β信号传递和G1/S转换途径的调节。

对于TGF-β信号传递，Tgfbr2是在miR-93转染后最显著减少的基因之一。Tgfbr2是一种组成活性型的受体激酶，其在TGF-β信号传递中起关键作用，且最近的小分子筛选指示，它的异源二聚的配偶体Tgfbr1的抑制剂会增强iPSC诱导。微RNA靶位预测提示，在它的3’UTR中存在miR-93和它的家族微RNA的2个保守靶向位点。因此，选择miR-93作为第一候选靶标用于进一步研究。

关于G1/S转换，选择p21作为潜在靶标，因为在人实体瘤样品（乳房、结肠、肾、胃和肺）和胃癌细胞系中的最新结果指示，miR-106b~25簇可以靶向细胞周期调节剂，诸如CDK抑制剂p21和p57，且人和小鼠p21在3’UTR中具有保守的miR-93/106b靶位。

此外，还已经提出，小鼠ES细胞特异性的微RNA簇（包括miR-290和miR-293簇）靶向几种G1-S转换阴性的调节剂，包括p21。另外，miR-290和293簇微RNA具有与miR-93和miR-106b非常类似的种子区。因此，也分析p21作为候选靶标。此外，在iPSC诱导的早期，4种因子OSKM极大地诱导p21（图8a）。详细分析揭示，p21的诱导主要是由于Klf4和cMyc的过表达，因为Oct4和Sox2的组合没有表现出p21水平的显著变化（图8a）。

为了验证小鼠Tgfbr2和p21是否被miR-93和miR-106b靶向，将miR模仿物转染进MEF中，并在48小时以后通过蛋白印迹法分析总细胞裂解物。实际上，miR-93和miR-106b有效地降低Tgfbr2和p21的蛋白水平（图5a和5d），并且还使p21mRNA水平降低~25-30%，使Tgfbr2mRNA水平降低~60-70%（图19）。为了进一步研究p21是否是miR-93和miR-106b的直接靶标，进行了萤光素酶试验，其中将具有p213’UTR序列的萤光素酶报道基因插入在萤火虫萤光素酶编码序列的下游。所述萤光素酶试验揭示，通过在Hela细胞中转染miR模仿物，可以实现萤光素酶活性的一致的~40%抑制。还确定，当将突变导入保守的p213’UTR靶位的种子区中时，可以完全破坏微RNA模仿物的抑制（图10）。关于Tgfbr2，萤光素酶试验也显示出GL活性的~50%降低，而miR-93突变体不具有这样的效应（图11）。

由p21促进的细胞周期停滞可以抑制重新程序化所需的后天修饰，因为那些修饰更容易发生于增殖细胞中。为了确定p21表达是否危害iPSC诱导，将具有HA标签的p21cDNA克隆进pMX逆转录病毒主链中，并在MEF细胞中过表达。当将HA-p21病毒与4种OSKM因子一起导入MEF中时，观察到iPSC诱导的几乎完全抑制，这基于碱性磷酸酶染色和Oct4-GFP阳性的集落形成（图9a）。当使用3种OSK因子进行重新程序化时，得到类似的结果（图9b）。

由于分析指示，miR-93和miR-106b有效地抑制Tgfbr2和p21表达，因此进一步检查了Tgfbr2和p21的活性是否可以拮抗重新程序化。使用与微RNA模仿物所用的相同实验时间线，将Tgfbr2或p21siRNA转染进MEF中。蛋白印迹法和RT-qPCR证实，在没有病毒转导的情况下，siRNA分别有效地敲除了蛋白和mRNA水平（图5b和5e）。然后通过OSKM转导，启动MEF重新程序化，并在转导后第11天定量Oct4-GFP+集落。观察到每个基因的集落数的约2倍诱导（图5c和5f）。总之，我们的数据鉴别出，Tgfbr2和p21是miR-93和miR-106b的直接靶标，且这些基因的减量调节可以增强重新程序化过程。

实施例8

源自MiR-93和MiR-106b转染的IPSC克隆的多能性

尽管已经证实了miR-93和106b的增强小鼠iPSC诱导的能力，剩下的一个问题是，诱导的细胞是否达到完全多能状态。为了回答该问题，衍生出几种iPSC克隆（对于每种微RNA）以及miR对照，以分析多能性标志物和分化能力。这些衍生出的克隆都是GFP+，这指示Oct4基因座的重新活化。免疫染色也证实，Nanog和SSEA1也在这些细胞中活化。其它mES标志物的RT-qPCR表现出类似的结果。全基因组mRNA表达谱又指示，这些衍生出的克隆具有与mES（但不与MEF）非常类似的基因表达谱。也分析了内源性的Oct4和Nanog基因座的启动子甲基化，观察到所有测试的克隆都具有去甲基化的启动子。

为了研究那些衍生出的克隆是否具有mES细胞的完全分化能力，首先使用胚状体形成作为初步试验。衍生出的克隆都产生EB的有效形成，并测定出那些EB是谱系标志物染色阳性的。也可从这些细胞衍生出搏动的EB。

最后，作为更严谨的实验，注射这些衍生出的克隆，以检查它们是否对嵌合体小鼠做出贡献。实际上，从所有测试的克隆都可衍生出嵌合体。这些结果证实，miR-93和miR-106b对重新程序化的增强作用不会改变诱导的细胞的能力，并且已经达到ES-样状态的衍生出的克隆可以分化成所有3个谱系。

实施例9

其它微RNA的增量调节也会增强IPSC诱导

如本文所讨论的，鉴别出3个微RNA簇在iPSC诱导过程中被4种因子诱导，且已经确定这些簇中的几个微RNA具有相同的种子区，这指示它们靶向类似的mRNA（图2）。为了研究具有与miR-93和miR-106b相同的种子区的其它微RNA是否可以类似地增强iPSC诱导，使用与上面关于miR-93模仿物处理和iPSC诱导所述的规程类似的实验规程，测试miR-17和miR-106a的微RNA模仿物。实际上，这些微RNA以与用miR-106b~25簇所看到的类似的方式增强重新程序化（图6a），这些miR的转染都导致降低的Tgfbr2和p21蛋白水平（图6b和6c）。

这些结果一起提示，miR-17~92、miR-106b~25和miR-106a~363簇的诱导对于适当重新程序化而言是重要的，并且这些微RNA的增量调节会降低对iPSC产生过程的重新程序化屏障（图6d）。因此，可以操纵这些微RNA在细胞中的水平，以提高重新程序化效率。

实施例10

IPSC重新程序化的机制

经证实，衍生出的克隆会活化内源性的Oct4-GFP表达。在与微RNA模仿物一起进行OSKM转导后第12天，开始挑选集落，并维持在经辐照的MEF饲养平板上。可以观察到绿色荧光作为来自内源性的pou5f1基因座的GFP信号。使用碱性磷酸酶染色和ES特异性的标志物的免疫染色（基于Nanog和SSEA1染色），可以证实克隆。可以使用Hoechst 33342进行细胞核染色。使用衍生出的iPSC克隆，可以在胚状体（EB）试验中得到来自所有3个胚层的细胞。以~4000个细胞/20μl滴，培养用于EB形成的iPS细胞3天，然后将EB重新接种在明胶包被的平板上，用于进一步培养至第12-14天，这时观察到搏动的心肌细胞。可以用不同的谱系标志物对细胞进行免疫染色，所述标志物包括：β-微管蛋白III作为外胚层标志物；AFP作为内胚层标志物；和α-辅肌动蛋白作为中胚层标志物。从注射的iPS细胞可以形成畸胎瘤，其中将150万个细胞注射进每只小鼠中，并在注射后3~4周收获肿瘤以用于石蜡包埋以及苏木精和伊红染色。衍生出的克隆也可以用于产生嵌合的小鼠。将iPS细胞注射进来自白变种或黑色C57B6小鼠（NCI）的胚泡中，可以通过刺鼠或黑色毛色观察iPSC的贡献。

可以用碱性磷酸酶底物对第12天的重新程序化的细胞染色。本发明证实，miR模仿物转染不会造成AP+集落的显著增加，但是，miR-93和106b的敲除导致AP+集落以及GFP+集落的显著损失。微RNA模仿物没有影响总的AP+集落形成，而抑制剂则影响。

由于发现了MEF可以重新程序化成iPS细胞，大量工作已经指向理解该动人过程的根本机制。本文描述的结果已经首次鉴别出，在重新程序化过程中直接地涉及转录后基因调节，并且RNAi机制的干扰可以显著改变重新程序化效率。另外，如在以前的实施例中所证实的，通过使用的4种因子会显著地增量调节3个微RNA簇以诱导iPS细胞，且这些簇中的微RNA可能靶向至少2个重要的途径：TGF-β信号传递和细胞周期控制。

尽管已经从事了该工作，几项最近的报告还已经鉴别出，p53途径（它包括几个下游肿瘤抑制剂诸如p21）是在iPSC诱导过程中的主要屏障之一。大量证据指示，4种因子（OSKM）的异位表达会容易地增量调节p53，并启动细胞防御程序的系列反应，诸如细胞周期停滞、细胞凋亡或DNA损伤应答。这些防御应答可能成为低重新程序化效率（认为在~0.1%左右）的基础。但是，这些数据没有解释成功地重新程序化的细胞如何操作以克服那些细胞屏障，以便变成iPS细胞。本文描述的实施例表明，通过诱导微RNA（其靶向拮抗成功的重新程序化的途径）的表达，这些细胞可能克服那些屏障（如果不是完全地，也是至少部分地）。通过调节原代成纤维细胞中的微RNA水平，可以实现重新程序化效率的显著提高。

TGF-β信号传递是在诸如原肠胚形成、器官特异性的形态发生和组织体内稳态等多种过程中起作用的重要途径。规范的TGF-β转导的当前模型指示，TGF-β配体会结合TGF-β受体II（Tgfbr2），其然后与Tgfbr1异源二聚体化，以通过受体结合的Smads转导信号。据报道，TGF-β信号传递在人和小鼠ES细胞自我更新中起作用，FGF2（用于ES细胞培养的广泛使用的生长因子）会诱导TGF-β配体表达，并抑制BMP-样活性。用化学抑制剂阻断TGF-β受体I家族激酶会危害ES细胞自我更新。这些发现对于iPSC诱导而言是特别重要的，因为那些抑制剂似乎在重新程序化过程中具有完全不同的作用。最近的化学筛选已经证实，通过诱导Nanog表达，TGF-β受体I（Tgfbr1）的小分子抑制剂实际上增强iPSC诱导，且可以替代对Sox2的需求。此外，用TGF-β配体处理重新程序化细胞对iPSC诱导具有负面效应。因此，尽管TGF-β信号传递对于ES细胞自我更新而言是重要的，它是重新程序化的障碍。本发明证实，除了Tgfbr1以外，组成活性型的激酶Tgfbr2的活性也会拮抗重新程序化。本发明也证实，miR-93和它的家族成员直接地靶向Tgfbr2，以调节它的信号传递和重新程序化。

p21（它是一种具有仅165个氨基酸的小蛋白）长期以来被发现是癌症发展过程中的肿瘤抑制剂，其通过造成p53依赖性的G1生长停滞和促进分化和细胞衰老来起作用。本发明证实，当将4种因子（OSKM）导入MEF细胞中时，会增量调节p21表达，且该增量调节会拮抗重新程序化过程（图8），因为p21的过表达会几乎完全地阻断iPSC诱导（图9）。重新程序化细胞中p21的诱导可以依赖于或独立于p53，因为Klf4重新程序化因子会结合p21启动子并增加p21转录。

这会产生关于4种重新程序化因子的功能的一个有趣的问题，因为相同的转录因子可以促进iPSC诱导和拮抗iPSC诱导。实际上，当前的证据不能排除特定水平的p21诱导可以有益于重新程序化过程的可能性。除了它在p53依赖性的细胞周期停滞中的众所周知的作用以外，还已经报道p21具有一些致癌活性。例如，p21也通过保护细胞免于细胞凋亡（与它在细胞周期控制中的常见功能无关的一种功能）而具有致癌活性。

p21在重新程序化中的一种潜在益处可能取决于它的通过蛋白-蛋白相互作用来调节基因表达的能力。例如，p21可以直接地结合几种参与细胞凋亡的蛋白，诸如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶10和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶前体3。对于另一个实施例，p21也是Myc的促细胞凋亡活性的抑制剂，其通过与Myc N-端结合来阻断Myc-Max异源二聚化。实际上，当Myc自身在MEF中过表达时，可以在细胞培养物观察到细胞死亡的显著减少，而在4种因子转导的细胞中，细胞死亡相对于仅myc的样品而言是微小的。因此，p21的诱导不仅可以充当重新程序化过程的障碍，而且可以维持特定水平的p21，该水平是减少细胞凋亡并从而提高重新程序化效率所必需的。

本文提供的数据也可以视作支持该假设的部分证据，因为与p21siRNA转染相比，miR-93和miR-106b的转染对重新程序化具有更大的增强效应，其中miR-93和106b不会象p21siRNA那样多地抑制p21表达。但是，该效应也可能是由于这些微RNA对多种蛋白（包括Tgfbr2和p21）的靶向导致的。

由于微RNA经常靶向多种细胞蛋白，miR-93和miR-106b的增强效应会提供发现参与重新程序化中的其它基因的机会，以便更好地理解该过程。实际上，除了p21以外，据报道是G1-S转换的负调节剂的几种其它基因也具有在mRNA转录物（诸如Rb1、Rbl1、Rbl2和Lats2）的3’UTR区中的miR-93和miR-106b靶位。miR-93和miR-106b的另一个令人感兴趣的报道的靶标是转录因子E2F1，经常在许多人肿瘤样品中发现它失调和过度活化。E2F1的一种深奥的功能是，活化CDKN2A基因座（其编码ARF和INK4a）的表达。Ink4a/Arf基因座也可以抑制重新程序化效率。因而，本发明证实，miR-93和miR-106b的转染也可以靶向E2F1，并减少活化CDKN2A基因座的潜力，并从而减少重新程序化的屏障。

最后，miR-17~92、miR-106b~25和miR-106a~363簇在小鼠和人中是十分保守的。因此，本发明证实，miR-93和miR-106b的增强效应也可以适用于人重新程序化。

实施例11

微RNA会调节IPS细胞重新程序化

小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)衍生化：使用在WiCell Research Institute网站（www.wicell.org/）上提供的方案，从小鼠品系B6;129S4-Pou5f1^{tm2(EGFP） Jae}/J（Jackson Laboratory；储备号008214）衍生出Oct4-EGFP MEF。在0.1%明胶包被的平板上在MEF完全培养基（含有10%FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、但是不含丙酮酸钠的DMEM）上维持Oct4-EGFPMEF。

使用逆转录病毒的重新程序化：用pMX逆转录病毒转导4X10⁴个Oct4-EGFP MEF，以错误表达Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc（Addgene）。2天后，用ES培养基（含有15%ES筛选的FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、单硫代甘油和1000U/ml LIF的DMEM）饲喂转导的Oct4-EGFPMEF，每隔日更换培养基。除非另有说明，在转导后~2周，通过荧光显微术对重新程序化的干细胞（定义为EGFP+iPSC集落）评分。为了衍生出iPSC，在立体显微镜（Leica）下手工地挑选EGFP+集落。

微RNA抑制剂或siRNA转染：let-7a、miR-21和miR-29a微RNA的抑制剂购自Dharmacon。根据生产商的说明书（Invitrogen），用Lipofectamine和抑制剂转染4X10⁴个Oct4-EGFP MEF。3至5小时后，抛弃培养基，并用MEF完全培养基替换；为了重新程序化，加入编码重新程序化因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）的逆转录病毒，次日将培养基更换为完全培养基。除非另有说明，在转染/转导后第5天，再次导入抑制剂或siRNA。

对于RNA印迹分析，转染1X10⁵个Oct4-EGFP MEF，并在5天后收获。通过TRIZOL（Invitrogen），分离出总RNA，并在14%变性聚丙烯酰胺凝胶（National Diagnostics）上分辨~9微克总RNA。将RNA转移到Hybond-XL膜（GE healthcare）上，并通过放射性标记的特异性的DNA探针检测微RNA。通过磷酸成像仪，使信号强度显影，并使用Multi GaugeV3.0（FUJIFILM）进行分析。将微RNA信号强度针对U6snRNA的信号强度标准化。一式三份地进行实验。

对于蛋白印迹分析，转染1X10⁵个Oct4-EGFP MEF，并在5天后收获。在M-PER缓冲液（Pierce）中制备总蛋白，并在10%SDS-PAGE凝胶上分离等量的总蛋白。将蛋白转移至PVDF膜，并使用下述抗体检测带：GAPDH（Santa Cruz；目录号sc-20357）、p53（Santa Cruz；目录号sc-55476）、PI3激酶p85（Cell Signaling；目录号4257）；Cdc42（SantaCruz；目录号sc-8401）；p-ERK1/2（Cell Signaling；目录号9101）；ERK1/2（Cell Signaling；目录号9102）；p-GSK3β（Cell Signaling；目录号9323）；GSK3β（Cell Signaling；目录号9315）；β肌动蛋白（Thermo Scientific；目录号MS-1295）。通过Multi Gauge V3.0（FUJIFILM），定量信号强度，并针对GAPDH或β肌动蛋白标准化。重复实验3至5次。

体外分化和畸胎瘤形成试验：对于体外分化，用胰蛋白酶/EDTA离解iPSC，并重新悬浮于胚状体（EB）培养基（含有15%FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺的DMEM）中至5X10⁴个细胞/ml的终浓度。为了诱导EB形成，在倒置培养皿盖上的悬滴中，培养在20微升中的1000个iPS细胞。3至5天后，收集EB，并以约10个EB/孔转移到0.1%明胶包被的6孔平板上。在EB形成后2周，通过显微术鉴定搏动的心肌细胞（中胚层），并分别通过α甲胎蛋白（R&D；目录号MAB1368）和神经元特异性的βIII-微管蛋白（abcam；目录号ab7751）抗体鉴定源自内胚层和外胚层的细胞。

对于畸胎瘤试验，用胰蛋白酶处理1.5X10⁶个iSPC，并重新悬浮于150微升中，然后皮下地注射进用阿佛丁麻醉的无胸腺裸鼠的背侧后肢中。3周后，处死小鼠以收集畸胎瘤。固定肿瘤块，切细，并在位于Sanford-Burnham Institute的细胞成像-组织学核心设备（CellImaging-Histology core facility）中进行分析。

嵌合体分析：在收获前2小时，更换iPSC培养基。在0.1%明胶包被的平板上培养胰蛋白酶处理过的iPSC 30min，以去除饲养细胞。将IPSC注射进E3.5C57BL/6-cBrd/cBrd胚泡中，然后转移进假妊娠的雌性受体中。出生后，通过幼崽毛色评价iPSC的贡献：黑色是来自iPSC。

免疫荧光和碱性磷酸酶（AP）染色：在0.1%明胶包被的6孔平板上接种和培养iPSC。4天后，在4%低聚甲醛（Electron Microscopy Sciences；目录号15710-S）中固定细胞。对于免疫荧光染色，用在PBS中的0.1%Trixton X-100透化固定的细胞，并在5%BSA/PBS中封闭。针对SSEA-1（R&D；目录号MAB2155）和Nanog（R&D；目录号AF2729）的抗体充当ES标志物。通过Hoechst 33342染色（Invitrogen），使细胞核显影。对于AP染色，按照生产商的说明书（Vector Laboratories；目录号SK-5100），用碱性磷酸酶底物处理固定的细胞。

实施例12

MiR-21或MiR-29a的抑制会提高重新程序化效率

小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)衍生化：使用在WiCell Research Institute网站（www.wicell.org/）上提供的方案，从小鼠品系B6;129S4-Pou5f1^{tm2(EGFP） Jae}/J（Jackson Laboratory；储备号008214）衍生出Oct4-EGFP MEF。在0.1%明胶包被的平板上在MEF完全培养基（含有10%FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、但是不含丙酮酸钠的DMEM）上维持Oct4-EGFPMEF。

为了确定抑制MEF-特异性的miRNA是否会降低重新程序化屏障，分析了MEF富集的miRNA，并将它们的水平与在小鼠ES（mES）细胞中观察到的那些相对比。如图20a所示，与mES细胞相比，let-7a、miR-21和miR-29a都在MEF中高度表达。与此相比，miR 291在mES中高度富集，但是在MEF中缺少（图20a）。接着，将针对let-7a、miR-21和miR-29a的miRNA抑制剂与表达Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc（OSKM）的逆转录病毒一起导入Oct4-EGFP MEF（携带Oct4-EGFP报告物的MEF）中。在转导后第14天，与非靶向（NT）对照相比，用miR-21抑制剂处理过的细胞表现出重新程序化效率的~2.1倍提高（图20b）。类似地，在抑制miR-29a以后，重新程序化效率明显提高了~2.8倍（图20b）。在与miR 29a或21抑制所用类似的antagomir处理下，观察到在let-7a抑制以后对OSKM-重新程序化的微小影响（图20b）。为了进一步测试miRNA抑制是否会增强在没有c-Myc存在下3种因子的重新程序化，与OSK一起用miRNA抑制剂转导细胞，这会以比OSKM远远更低的效率重新程序化细胞。与用单独的OSK处理相比，在有miR-21抑制剂存在下，OSK重新程序化的iPS细胞集落的数目增加（图25）。这些结果证实，MEF富集的miRNA miR-21和miR-29的耗竭会显著增强4F-重新程序化，并且阻断miR-21会适度提高3种因子（OSK）重新程序化的效率。

C-Myc会抑制miRNA let-7a、miR-16、miR-21、miR-29a和miR-143在重新程序化过程中的表达：最近的工作指示，OSKM因子会通过后生的和转录的机制来改变细胞同一性。本发明证实，OSKM重新程序化因子可以减量调节MEF富集的miRNA。为了评价每种重新程序化因子对miRNA表达的潜在效应，用OSKM因子的不同组合转导MEF，并进行RNA印迹分析（图21a）。令人感兴趣地，与MEF对照相比，单独的Sox2会诱导miR-21、miR-29a和let-7a的表达水平超过2倍（图21b，左图）。Klf4对那些选定的miRNA具有微小的、但是与Sox2类似的效应（图21b，左图）。仅利用Oct4过表达，miRNA不会改变表达水平（图21b，左图）。与Oct4、Sox2和Klf4相比，单一因子c-Myc会使miR-21和miR-29a（在MEF中最丰富的miRNA）的表达减量调节MEF对照的~70%（图21a和21b，左图）。此外，在图21b所示的2种因子（2F）的不同组合中（中图），c-Myc的包括可以使所有3种miRNA（包括miR-21、miR-29a和let-7a）的减少增强~25-80%（图21b,中图）。与1F对miRNA的效应类似，Sox2和Oct4会使miR-21和miR-29a增加MEF对照的1.5倍和2.3倍，OK和SK对miRNA表达没有明显的效应。此外，在不同的3因子（3F）组合中，与在MEF中看到的表达相比，miRNA-21在SKM和OKM细胞中的表达分别减少了~70和78%，类似地，在含有c-Myc的3F组合中，miR-29a表达减少了~48-70%（图21b，右图）。c-Myc在3F组合中的包括也轻微降低let-7a水平（图21b，右图）。OSK在没有c-Myc存在下对miRNA表达几乎没有影响（图21b，右图）。因此，这些结果强烈地提示，在重新程序化过程中，c-Myc在调节miRNA表达中起重要作用。

为了进一步证实，c-Myc是拮抗miRNA表达的主要因子，在有或没有c-Myc存在下用OSK转导细胞，并在转导后的不同时间点，通过实时定量反转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）检查miRNA表达。与OSK相比，OSKM转导极大地减少let-7a、miR-16、miR-21、miR-29a、miR-143在重新程序化过程中的表达（图21c），这指示，c-Myc在调节MEF富集的miRNA（包括最丰富的那些，let-7a、miR-21和miR-29a）的表达中起主要作用。这些数据也提示，c-Myc会增强重新程序化，这部分地通过miRNA减量调节来实现。

实施例13

经由MiRNA耗竭衍生出的IPS细胞会获得多能性

本发明证实，用miR-21和miR-29a抑制剂衍生出的小鼠iPS细胞是多能的。可以用OSKM/抗miR-29a iPS细胞的ES细胞标志物进行染色。挑选在OSKM和miR-29a抑制剂处理以后衍生出的GFP+集落，用于进一步分析。鉴别出表达胚胎干细胞标志物Nanog和SSEA1的代表性集落。内源性的Oct4也被活化，这可以由EGFP染色来指示。强碱性磷酸酶(AP）活性可以观察为ES标志物之一。

可以进行OSKM/抗miR-29a iPS细胞的体外分化。可以在体外形成胚状体，并培养2周。可以固定细胞，并用抗-α甲胎蛋白（对于中胚层）和抗-β微管蛋白III（对于外胚层）染色。可以将细胞核观察为通过Hoescht染色进行的复染色。也可以进行OSKM/抗miR-29a iPS细胞的畸胎瘤形成分析。将1.5X10⁶个iPSC皮下地注射进无胸腺的雌性裸鼠中。在注射后3周收集肿瘤块，并固定，用于组织病理学分析。可以鉴别出源自3个胚层的不同组织，包括肠样上皮（内胚层）、脂肪组织、软骨和肌肉（中胚层）和神经组织和表皮（外胚层）。也可以进行OSKM/抗miR-29a和OSK/抗miR-21iPS细胞的嵌合体分析。可以将8至14个iPS细胞注射进E3.5小鼠胚泡中。通过评估黑色毛色，可以估测iPS细胞对每个嵌合体的贡献，并可以观察为百分比。

为了研究阻断miR-21或miR-29a是否会危害iPS细胞多能性，评价了具有OSKM/抗miR-29a或OSK/抗miR-21的iPS细胞的多能性。首先，在重新程序化后大约2周，手工地挑选细胞，并繁殖，以检查ES特异性的标志物的形态学和表达。细胞表现出ES-样形态学，并高度表达Oct4-EGFP（这指示内源性的ES细胞信号传递的建立）。另外，OSKM/抗miR-29a或OSK/抗miR-21iPS细胞会表达ES细胞-特异性的标志物，包括Nanog和SSEA1，并表现出碱性磷酸酶活性。为了测试那些iPS细胞是否表现出与正常衍生的iPS细胞相当的多能潜力，诱导OSKM/抗miR-29a和OSK/抗miR-21iPS细胞以形成胚状体（EB），或者注射进裸鼠中，并允许分化成不同的组织。在体外分化2周后，观察到源自所有3个胚层的典型细胞类型。对注射后3周形成的畸胎瘤肿瘤进行组织病理学分析。产生了源自所有3个胚层的不同组织，从而证实iPS细胞获得多能性。为了使用最严谨的多能性测试，将iPS细胞注射进E3.5胚泡中，以建立嵌合小鼠。源自miR耗竭的iPS细胞的小鼠表现出明显的~15%至25%的可归因于iPS细胞的黑色毛色。这些数据表明，耗竭miR-21和miR-29a对衍生的iPS细胞的多能性没有不良作用。

实施例14

抑制MiR-29a会通过P85α和CDC42途径减量调节P53

为了理解miR-29a对重新程序化的影响的根本机制，检查了p85α和CDC42的表达，其中据报道，p85α和CDC42指向HeLa细胞中的miR-29的靶标。为此，将miRNA抑制剂转染进MEF中，并在转染后第5天，通过蛋白印迹评价p85α和CDC42蛋白表达。在miR-29a阻断以后，P85α和CDC42蛋白水平稍微增加，而let-7a抑制剂几乎没有影响（图22a和22b）。据报道，转化有关的蛋白53（Trp53或p53）也是p85α和CDC4的直接靶标。因此，检查了p53在MEF中是否也受miR-29a间接地调节。为了测试，用miRNA抑制剂转染MEF，并在5天后收获用于免疫印迹法，以评价p53的表达。在miR-29a抑制以后，P53蛋白水平降低了~30%（图22a和22b），但是NT对照或let-7a抑制却没有改变P53蛋白水平。重要的是，耗竭miR-21也会缓解p85α和CDC42蛋白抑制，所以，p85α和CDC42的水平增加，这导致p53表达减量调节了~25%（图22a和22b）。

为了进一步证实，在重新程序化过程中抑制miR-21或miR-29a会降低p53水平，在重新程序化第5天，通过蛋白印迹分析检查p53表达。为了启动重新程序化，将miRNA抑制剂与OSKM一起导入。与在单独的MEF中的观察结果相一致，在重新程序化过程中，在miR-21或miR-29a耗竭以后，p53蛋白水平与OSKM对照相比分别降低了~25%或~40%（图22c）。总之，我们的数据表明，在重新程序化过程中，阻断miR-29a会通过p85α和CDC42途径使p53蛋白水平降低~30-40%。另外，miR-21的耗竭对p85α和CDC42均具有类似的效应，并使p53蛋白水平降低~25%至~30%。

miR-29a的抑制会通过p53减量调节来提高重新程序化效率：据报道，p53缺乏可以极大地提高重新程序化效率。由于耗竭miR-29a会显著降低p53水平，并使重新程序化效率增加~2.8倍，本发明证实，miR-29a敲除的效应主要由p53减量调节来介导。为此目的，将p53siRNA和/或miR-29a抑制剂与OSKM一起转染进Oct4-EGFP MEF中，以启动重新程序化。siRNA对p53的减量调节（~80%）对重新程序化效率具有类似的正效应，miR-29a抑制也是如此（图22d）。当在有p53siRNA存在下添加miR抑制剂时，没有观察到重新程序化效率的提高（图22d）。这些结果提示，miR-29a的抑制部分地通过p53的减量调节来起作用，以提高重新程序化效率。

实施例15

MiR-21和MiR-29a的抑制会降低ERK1/2的磷酸化（但是GSK3β不 会）以增强重新程序化

据报道，MiR21会通过抑制心脏成纤维细胞中的sprouty同系物1（Spry1）来活化MAPK/ERK。阻断MAPK/ERK活性会促进神经干细胞的重新程序化，并确保ESC自我更新的基态。因此，本发明通过评价在导入miRNA抑制剂以后MEF中的ERK1/2磷酸化来证实，miR-21会在重新程序化过程中调节MAPK/ERK途径。为了对此进行测试，用miRNA抑制剂转染MEF，然后收获用于蛋白印迹分析，以测定磷酸化的ERK1/2水平。蛋白印迹分析表明，阻断miR-21会使ERK1/2磷酸化与NT对照相比显著减少~45%，而let-7a抑制剂没有这样的效应（图23a）。令人感兴趣地，耗竭MEF的miR-29a也会使ERK1/2磷酸化与NT对照相比显著减少60%（图23a）。本发明也证实，miR-21和miR-29a可以通过改变Spry1水平来影响ERK1/2磷酸化。通过转染不同的miRNA抑制剂，耗竭MEF中的MiR-21或miR-29a，并通过免疫印迹法来定量Spry1表达水平，结果表明，抑制miR-21和miR-29a会增强Spry1表达水平（图23b）。因此，耗竭miR-21和miR-29a会通过调节Spry1蛋白水平来减量调节ERK1/2的磷酸化。

为了论述ERK1/2减量调节是否会提高重新程序化效率，在4F-重新程序化过程中将靶向ERK1或2的siRNA导入Oct4-EGFP MEF中。它们任一种的耗竭会增强成熟的iPS细胞的产生（图23c）。本发明证实，miR-21会起MEF中的ERK1/2活化的诱导物的作用，因为阻断miR-21会减少ERK1/2磷酸化。耗竭miR-29a也会显著减少ERK1/2磷酸化。这些结果强烈地提示，miR-21和miR-29a会调节ERK1/2活性以提高重新程序化效率（图23a、23b和23c）。

GSK3β途径也会抑制ES自我更新和神经干细胞的重新程序化。耗竭GSK3β会极大地增加成熟的iPS细胞产生（图23c）。本发明证实，miRNA耗竭会调节GSK3β活化。免疫印迹法表明，阻断Oct4-EGFP MEF中的miRNA对GSK3β活化没有显著影响（图23d）。本发明通过使用流式细胞术来评估细胞生存和复制速率，证实miRNA耗竭会在重新程序化过程中改变细胞凋亡或细胞增殖。在重新程序化过程中用OSKM阻断miRNA21、29a或let-7不会改变细胞凋亡或增殖速率（图26）。总之，miR-29a和miR-21会调节p53和ERK1/2途径以调节iPS细胞重新程序化效率。

实施例16

C-Myc会通过降低P53水平和拮抗ERK1/2活化（通过MiR-21和 MiR-29a减量调节）来降低重新程序化的阈值

为了开发目前用于诱导的重新程序化的转基因的替代方案，重要的是，理解这些因子如何调节信号传递途径。本发明证实，c-Myc会在重新程序化过程中抑制MEF富集的miRNA，诸如miR-21、let-7a和miR-29a（图20）。使用抑制剂耗竭miR-29a，最可能通过释放p85α和CDC42抑制来降低p53蛋白水平（图22）。另外，耗竭miR-21会减少ERK1/2磷酸化（图23）。本发明证实，miR-21抑制会降低p53蛋白水平，并且抑制miR-29a也会降低ERK1/2磷酸化水平。p53和ERK1/2信号传递都会拮抗重新程序化。阻断miR-21和miR-29a或敲除p53和ERK1/2可以提高重新程序化效率（图22和23）。本发明证实，c-Myc会促进重新程序化，这部分地通过抑制MEF富集的miRNA、miR-21和miR-29a来实现，它们通过p53蛋白水平和ERK1/2活化的诱导来起重新程序化屏障的作用（图24）。

miR-290家族的ES特异性的miRNA的强迫表达可以替代c-Myc，以促进重新程序化。C-Myc也结合miR-290簇的启动子区域。但是，c-Myc转基因的早期表达可以有效地启动重新程序化，但是在成熟的iPS细胞中（其中miR-290簇开始表达）在转换期或以后是非必需的。因此，c-Myc不可能通过活化miR-290家族来促进重新程序化的早期。

本发明证实，当导入c-Myc来进行重新程序化时，MEF富集的miRNA（包括miR-29a、miR-21、miR-143和let-7a）的表达水平会降低。C-Myc在促进肿瘤发生或维持多能性基态中对miRNA具有深远的转录影响。因此，c-Myc对miRNA表达的抑制可能是重新程序化的根本机制。

MiR-21通过TGFβ1和ERK1/2途径起增强纤维发生活性的积极介质的作用，但是所述两种途径均已经被证实会影响重新程序化和ES细胞基态。值得注意的是，在经验证的miR-29a靶标中，p53受miR-29a正调节。另外，最近的研究表明，Ink4-Arp53/p21途径会危害重新程序化，并且p53缺乏会极大地提高重新程序化效率。因而，这些信号传递途径可能是重新程序化过程的主要屏障。

耗竭c-Myc靶向的miRNA（miR-21和miR-29a）会使重新程序化效率提高~2.1至~2.8倍（图20），这提示，MEF富集的miRNA也起重新程序化屏障的功能。最近已经报道，Let-7抑制会增强重新程序化，但是，通过几次尝试，当用antagomir抑制let-7时，仅观察到在重新程序化中的微小效应（图20）。此外，本发明证实，miR-29a抑制会危害在重新程序化过程中p53的诱导，这会提高重新程序化效率。类似地，通过耗竭miR-21或ERK1/2，可以极大地促进重新程序化。C-Myc是对重新程序化早期的主要贡献因素，且不需要它即可将该过程维持处于转换和晚期阶段，这指示，可以采用c-Myc调节的miRNA来启动高效率的重新程序化。

据报道，C-Myc直接地结合并抑制miR-29a启动子。本发明证实，耗竭miR-21仅可以部分地替代c-Myc，并提示，c-Myc在重新程序化中具有其它功能。因而，可能需要多个途径的调节或MEF富集的miRNA的宽泛抑制来替代c-Myc在重新程序化过程中的功能。

本发明证实，c-Myc会通过降低p53水平和拮抗ERK1/2活化（通过miR-21和miR-29a减量调节）来降低重新程序化的阈值。另外，c-Myc的下游因子可以充当siRNA、miRNA或小分子操纵的靶标，以提高重新程序化。可以扩展这些方案，以替代所有4种重新程序化因子。

尽管已经参照上述实施例描述了本发明，但是应该理解，在本发明的精神和范围内包括改进和变动。因此，本发明仅由下述的权利要求书来限定。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种产生诱导的多能干（iPS）细胞的方法，所述方法包括：

a）使体细胞接触细胞核重新程序化因子；以及

b）使（a）的所述细胞接触改变所述细胞内的RNA水平或活性的微RNA，从而产生iPS细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA或RNA经过修饰。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA是在载体中。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR-106a、miR let-7家族成员或miR-302b簇中。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA是miR-93、miR-106b、miR-21、miR-29a或它们的组合。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA具有包含SEQ IDNO:1的多核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA具有选自SEQ IDNO:2-11的多核苷酸序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA调节p21、Tgfbr2、p53、Ago2或它们的组合的表达或活性。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA调节Spry 1/2、p85、CDC42或ERK1/2途径。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子由在载体中包含的基因编码。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子是SOX家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、OCT4、NANOG、LIN28或它们的组合。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子是OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC中的一种或多种。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子包括c-Myc。

14.根据权利要求1所述的方法，其中在接触所述微RNA之前、同时或之后，使所述体细胞接触所述重新程序化因子。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述体细胞是哺乳动物细胞。

16.一种使用根据权利要求1所述的方法产生的诱导的多能干（iPS）细胞。

17.一种根据权利要求1所述的方法产生的诱导的多能干（iPS）细胞的富集群体。

18.通过诱导根据权利要求1所述的方法产生的多能干细胞的分化而衍生出的分化的细胞。

19.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：

a）通过根据权利要求1所述的方法，从所述受试者的体细胞产生诱导的多能干（iPS）细胞；

b）诱导步骤（a）的所述iPS细胞的分化；以及

c）将（b）的所述细胞导入所述受试者中，从而治疗病症。

20.微RNA用于提高iPS细胞的产生效率的用途。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述微RNA选自：miR-17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b簇、miR let-7家族成员或它们的组合。

22.miR序列的一种组合，其选自下述的至少2种或更多种：miR-17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b簇、miR let-7家族成员或它们的组合。

23.一种产生诱导的多能干（iPS）细胞的方法，所述方法包括：

a）使体细胞接触细胞核重新程序化因子；以及

b）使（a）的所述细胞接触微RNA的抑制剂，从而产生iPS细胞。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR-106a、miR let-7家族成员或miR-302b簇中。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述微RNA是miR-93、miR-106b、miR-21、miR-29a或它们的组合。

26.根据权利要求23所述的方法，其中所述微RNA具有在SEQ IDNO:1中所述的多核苷酸序列。

27.根据权利要求23所述的方法，其中所述微RNA具有选自SEQID NO:2-11的多核苷酸序列。

28.根据权利要求23所述的方法，其中所述微RNA调节p21、Tgfbr2、p53、Ago2或它们的组合的表达或活性。

29.根据权利要求23所述的方法，其中所述微RNA调节Spry 1/2、p85、CDC42或ERK1/2途径。

30.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子由在载体中包含的基因编码。

31.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子是SOX家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、OCT4、NANOG、LIN28或它们的组合。

32.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子是OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC中的一种或多种。

33.根据权利要求23所述的方法，其中所述重新程序化效率是不使用微RNA的抑制剂的对照的至少2倍。

34.根据权利要求23所述的方法，其中所述体细胞包括成纤维细胞。

35.根据权利要求23所述的方法，其中在接触所述微RNA的抑制剂之前、同时或之后，使所述体细胞接触所述重新程序化因子。

36.根据权利要求23所述的方法，其中所述体细胞是哺乳动物细胞。

37.一种使用根据权利要求23所述的方法产生的诱导的多能干（iPS）细胞。

38.根据权利要求23所述的方法产生的诱导的多能干（iPS）细胞的富集群体。

39.一种通过诱导根据权利要求38所述的多能干细胞的分化而衍生出的分化的细胞。

Claims (22)

1.一种产生诱导的多能干（iPS）细胞的方法，所述方法包括：

a）使体细胞接触细胞核重新程序化因子；以及

b）使（a）的所述细胞接触改变所述细胞内的RNA水平或活性的微RNA，从而产生iPS细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA或RNA经过修饰。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA是在载体中。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR-106a、miR let-7家族成员或miR-302b簇中。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA是miR-93、miR-106b、miR-21、miR-29a或它们的组合。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA具有包含SEQ IDNO:1的多核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA具有选自SEQ IDNO:2-11的多核苷酸序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA调节p21、Tgfbr2、p53或它们的组合的表达或活性。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA调节Spry 1/2、p85、CDC42或ERK1/2途径。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子由在载体中包含的基因编码。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子是SOX家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、OCT4、NANOG、LIN28或它们的组合。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子是OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC中的一种或多种。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子包括c-Myc。

14.根据权利要求1所述的方法，其中在接触所述微RNA之前、同时或之后，使所述体细胞接触所述重新程序化因子。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述体细胞是哺乳动物细胞。

16.一种使用根据权利要求1所述的方法产生的诱导的多能干（iPS）细胞。

17.一种根据权利要求1所述的方法产生的诱导的多能干（iPS）细胞的富集群体。

18.一种通过诱导根据权利要求1所述的方法产生的多能干细胞的分化而衍生出的分化的细胞。

19.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：

a）通过根据权利要求1所述的方法，从所述受试者的体细胞产生诱导的多能干（iPS）细胞；

b）诱导步骤（a）的所述iPS细胞的分化；以及

c）将（b）的所述细胞导入所述受试者中，从而治疗病症。

20.微RNA用于提高iPS细胞的产生效率的用途。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述微RNA选自：miR-17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b簇、miR let-7家族成员或它们的组合。

22.miR序列的一种组合，其选自下述的至少2种或更多种：miR-17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b簇、miR let-7家族成员或它们的组合。

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