KR20180072817A - 세포 주기 차단은 유도된 다능성 줄기 세포 생성 효율을 향상시킨다 - Google Patents

세포 주기 차단은 유도된 다능성 줄기 세포 생성 효율을 향상시킨다 Download PDF

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오리그3엔, 인코포레이티드
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Abstract

세포의 세포 주기를 정지시킨 후 세포를 iPSC로 형질전화시킴으로써 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)를 생성하는 방법이 기재된다.

Description

세포 주기 차단은 유도된 다능성 줄기 세포 생성 효율을 향상시킨다
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2015년 11월 2일 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/249,520에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
줄기 세포는 드물며, 성인 조직으로부터 상당 수로 분리하기 어렵다. 2006년 샤이네 야마나카(Shinye Yamanaka)가 이끄는 연구 팀은 어떻게 분화된 성체 세포가 다능성을 포함하는 줄기 세포의 많은 특성을 나타내도록 다시 프로그래밍될 수 있는지를 기술하는 논물을 발표하였다 (Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell 126:663-676 (2006)). 이러한 "유도된 다능성 줄기 세포" (iPSC)는 본질적으로 무한히 복제될 수 있으며, 이들은 3개의 배아 배엽 층으로부터 유래된 임의의 세포 유형으로 분화되어 인체에서 임의의 세포를 잠재적으로 형성할 수 있다. 따라서, iPSC 방법론의 개발은 개인화 및 재생 의학을 위한 새로운 길을 열었다. iPSC 생성 방법론은 잘 정의되어 있다; 그러나, 이들의 효율은 낮다. 따라서, iPSC 생산 효율을 증가시키는 방법이 바람직할 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 세포를 제공하는 단계; 세포의 세포 주기를 정지시키는 단계; 세포를 형질전환시켜 유도된 다능성 줄기 세포를 생성시키는 단계를 포함하는, 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 또한 복수의 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 복수의 세포를 제공하는 단계; 복수의 세포 중 서브세트를 선택하는 단계로서, 세포 서브세트는 하나 이상의 세포 주기 페이스의 세포가 풍부한 단계; 및 세포 서브세트를 형질전환시켜 복수의 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는 단계를 포함하여, 복수의 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다.
놀랍게도, 본 발명자들은 세포 군의 세포 주기를 동기화하면 후속 형질전환 단계 후 더 높은 수율의 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)를 유도함을 발견하였다. 동기화는 예를 들어, 세포의 세포 주기를 정지시키거나 복수의 세포로부터 하나 이상의 세포 주기 페이스가 풍부한 세포를 선택함으로써 달성될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 세포를 제공하는 단계; 세포의 세포 주기를 정지시키는 단계; 및 세포를 형질전환시켜 유도된 다능성 줄기 세포를 생성시키는 단계를 포함하는, 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다. 세포는 바람직하게는, 줄기 세포가 아니다 (예를 들어, 세포는 분화된 세포일 수 있다). 이러한 방법은 또한 복수의 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 복수의 세포를 제공하는 단계; 복수의 세포 중 서브세트를 선택하는 단계로서, 세포 서브세트는 하나 이상의 세포 주기 페이스의 세포가 풍부한 단계; 및 세포 서브세트를 형질전환시켜 복수의 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는 단계를 포함하여, 복수의 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 세포는 줄기 세포가 아니다. 복수의 세포는 줄기 세포를 포함할 수 있으며, 이러한 복수개는 줄기 세포가 아닌 세포를 또한 포함할 것이다 (예를 들어, 복수개는 또한 분화된 세포를 포함할 것이다).
I. 세포
세포는 진핵 세포 예컨대, 후생동물 세포일 수 있다. 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 세포는 설치류, 토끼류, 고양이, 개, 돼지, 양, 소, 말, 또는 영장류로부터 비롯될 수 있다. 예를 들어, 세포를 인간 세포일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 세포는 체세포이다. 바람직한 구체예에서, 세포는 2배체세포이다.
세포는 분화 세포일 수 있다. 세포는 외배엽, 내배엽 또는 중배엽으로부터 유래될 수 있다. 세포는 상피, 결합 조직, 근육 조직, 또는 신경 조직으로부터 유래할 수 있다. 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 또는 섬유모세포일 수 있다. 세포는 림프구일 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 지방세포이다.
II. 세포 주기 정지
일부 양태에서, 본 발명은 세포의 세포 주기를 정지시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 세포의 세포 주기를 정지시키는 것은 유사분열을 억제하는 임의의 공지된 방법을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [BANFALVI, GASPAR, CELL CYCLE SYNCHRONIZATION (Humana Press, 2011)] 및 PCT 특허 출원 공개 번호 WO 2010/118709 참조 (본원에 참조로 인용됨)). 세포 주기의 유사분열 단계 (M 페이스)에 있는 세포는 형질도입 및/또는 형질감염에 대해 더욱 수용적이다. 따라서, 일부 바람직한 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 (예를 들어, 콜키친, 콜세미드, 라족산, 또는 노스카핀과 같은 제제와 세포를 접촉시킴으로써) M 페이스에서 세포 주기를 정지시키는 것을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 세포 주기를 정지시키는 것은 G0 페이스, G1 페이스, S 페이스, 또는 G2 페이스와 같은 간기에서 세포 주기를 정지시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 G1/S 페이스에서 정지될 수 있으며 (예를 들어, 16-24시간 동안 티미딘 예컨대, 4 mM 티미딘을 사용), 방법은 세포를 정지에서 벗어나게 한 후 일정 기간 동안 세포를 인큐베이션한 후 세포를 형절진환시키는 것을 포함할 수 있다 (예를 들어, 세포가 형질전환될 때 M 페이스가 되도록 티미딘 블록으로부터 벗어난 후 12시간).
방법은 복수의 세포의 세포 주기를 정지시키는 것을 포함하며, 이러한 구체예에 있어서, 문구 "세포 주기를 정지시키는"은 "세포 주기를 동기화하는" 것과 동의어이다.
일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 특정 페이스에서 세포 주기를 중단시키지 않지만, 형질전환이 세포 주기를 정지시키지 않은 것보다 더욱 효율적이 되도록 세포 주기가 억제된다. 예를 들어, 아피디콜린 및 노코다졸이 G2/M 페이스에서 세포를 정지시키는데 사용될 수 있으며, 이는 형질전환 효율을 증가시키는데 유용하다. 세포 주기를 정지시키는 것은 세포 주기를 간기, G0 페이스, G0/G1 페이스, 조기 G1 페이스, G1 페이스, 후기 G1 페이스, G1/S 페이스, S 페이스, G2/M 페이스, 또는 M 페이스에서 세포 주기를 정지시키는 것을 포함할 수 있다.
혈청 기아 또는 영양 결핍에 의해 세포 주기를 정지시키는 것은 당업계에 잘 알려져 있으며 세포 주기를 예를 들어, G1 페이스 또는 G0 페이스에서 정지시키는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,993,328 참조; 참조로 본원에 인용됨). 일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 세포 성장을 제한하는 혈청 농도 및/또는 아미노산 농도를 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 세포는 약 1시간 내지 약 10일, 예컨대, 약 1일 내지 약 7일 예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안 세포 성장을 제한하는 혈청 농도 및/또는 아미노산 농도를 포함하는 배지에서 인큐베이션될 수 있다. 기간은 예를 들어, 상이한 세포 및 상이한 세포 배양 조건이 상이한 기간의 세포 주기를 초래하기 때문에 다양한 인자에 의존적일 수 있다. 배지는 예를 들어, 약 0% 내지 약 10%, 예컨대, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 2%, 또는 약 0.1% 내지 약 1.0%의 혈청 농도를 가질 수 있다. 배지는 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만의 혈청 농도를 가질 수 있다. 배지는 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 또는 약 1.0%의 혈청 농도를 가질 수 있다. 배지는 무혈청 배지 (즉, 혈청을 포함하지 않는 배지)일 수 있다. 그 후, 세포 주기는 예를 들어, 제2 혈청 농도 (즉, 세포 성장을 제한하는 혈청 농도보다 높은 혈청 농도)를 포함하는 배지와 세포를 접촉시킴으로써 재시작될 수 있다. 따라서, 방법은 세포를 제2 혈청 농도 및/또는 제2 아미노산 농도를 포함하는 배지에서 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 제2 혈청 농도 및/또는 제2 아미노산 농도는 세포 성장을 제한하는 혈청 농도 또는 아미노산 농도보다 높다. 제2 혈청 농도는 약 2% 내지 약 35% 예컨대, 약 5% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 25%일 수 있다. 제2 혈청 농도는 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20% 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24% 또는 약 25%일 수 있다. 혈청은 예를 들어, 소 태아 혈청일 수 있다.
세포 주기를 정지시키는 것은 세포를 제제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 세포를 제제와 접촉시키는 것은 제제를 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 제제는 소분자 또는 생체분자일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "소분자"는 5,000 amu 미만, 예컨대 약 30 내지 약 1000 amu, 약 40 amu 내지 약 800 amu, 또는 약 50 amu 내지 약 750 amu의 분자량을 갖는 분자를 지칭한다. 용어 "생체분자"는 펩티드, 단백질, 핵산, 당, 및/또는 탄수화물을 포함하는 분자를 지칭한다. 생체분자는 예를 들어, 사이토카인 (예를 들어, 형질전환 성장 인자 β)일 수 있다. 제제는 전사 인자, 효소 (예를 들어, 키나제 또는 포스포릴라제) 또는 세포 경로의 억제제일 수 있다. 예를 들어, 제제는 사이클린 의존성 키나제 억제제, 사이클린 의존성 키나제 4 억제제, 사이클린 의존성 키나제 6 억제제, DNA 폴리머라제 억제제, HMG CoA 리덕타제 억제제, 뉴클레오티드 생합성 억제제, 또는 미세소관 중합 억제제일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 제제는 세포 주기의 가역성 억제제이며, 예를 들어, 세포는 제제가 제제를 포함하는 배지로부터 제거된 후 이의 세포 주기를 재시작할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제제는 비독성이며 예를 들어, 세포에 대해 비독성인 제제의 농도는 세포의 세포 주기를 정지시키는데 충분하다. 바람직한 구체예에서, 제제를 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션하는 것은 세포에 대해 비독성인 농도의 제제를 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 제제는 아베마시클립(abemaciclib), 아미노프테린(aminopterin), 아피디콜린(aphidicolin), 블렙비스타틴(blebbistatin), 부티레이트, 카티논(cathinone), 콜세미드(colcemid), 콜키신, 콤팍틴(compactin), 사이토칼라신 D(cytochalasin D), 시토신 아라비노시드, 플루오로데옥시우리딘, 하이드록시우레아, 로바스타틴, 메토트렉세이트, 메비놀린(mevinolin), MG132, 미모신(mimosine), 노코다졸(nocodazole), 노스카핀(noscapine), 팔보시클립(palbociclib), 판토폰(pantopon), 라족산(razoxane), 레베로마이신 A(reveromycin A), RO-3306, 로스코비틴(roscovitine), 리보시클립(ribociclib), 빈크리스틴(vincristine), 또는 보루시클립(voruciclib)일 수 있다.
제제를 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션하는 것은 약 1시간 내지 약 10일, 예컨대, 약 2시간 내지 약 7일 예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안 제제를 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 기간은 예를 들어, 상이한 세포 및 상이한 세포 배양 조건이 상이한 기간의 세포 주기를 초래하기 때문에 다양한 인자에 의존적일 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 예를 들어, 제제를 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션한 후 제제를 포함하지 않는 배지에서 세포를 인큐베이션하여 세포 주기를 재시작하는 것을 포함한다. 예를 들어, 방법은 예를 들어, 세포가 형질전환 동안 M 페이스에 있도록 이중 티미딘 차단 후 약 4시간 내지 약 24시간 동안 제제를 포함하지 않는 배지에서 세포를 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것이 CEK 상호작용 단백질 (cip) 경로, 키나제 억제 단백질 (kip) 경로, 키나제 4 억제제 (INK4a) 경로, 또는 대안적인 해독틀 (ARF) 경로를 조절하는 것을 포함한다. 예를 들어, cip/kip 계열 구성원 p21, p27, 및 p57은 G1 페이스에서 세포 주기를 정지시킨다. 형질전환 성장 인자 β (TGFβ)는 p27을 활성화시키는데 사용될 수 있다. 유사하게는, INK4a/ARF 계열은 p16INK4a를 포함하며, 이는 사이클린 의존성 키나제 4 (CDK4)에 결합하여 G1 페이스에서 세포 주기를 정지시킨다. 일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 p14ARF, p16INK4a, p18, p19, p21, p27, p53, 또는 p57을 활성화시키는 것을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,033,847 참조; 본원에 참조로 통합됨).
일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 사이클린 D 경로를 조절하는 것을 포함한다. 세포 주기를 정지시키는 것은 사이클린 의존성 키나제 4(CDK4) 또는 사이클린 의존성 키나제 6(CDK6)을 억제하는 것을 포함할 수 있다. 세포 주기를 정지시키는 것은 세포를 사이클린 의존성 키나제 억제제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 사이클린 의존성 키나제 억제제는 예를 들어, 사이클린 의존성 키나제 4 억제제 또는 사이클린 의존성 키나제 6 억제제일 수 있다. 팔보시클립은 CDK4 및 CDK6 둘 모두의 선택적 억제제이다. 일부 구체예에서, 사이클린 의존성 키나제 억제제는 팔보시클립, 리보시클립, 보루시클립, 또는 아베마시클립이다 (또한, PCT 특허 출원 공개 번호 WO 2014/109858 참조; 본원에 참조로 인용됨).
일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 세포에서 뉴클레오티드 생합성을 억제하는 것을 포함한다. 세포에서 뉴클레오티드 생합성을 억제하는 것은 세포를 뉴클레오티드 생합성 억제제와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 하이드록시우레아 또는 티미딘을 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 하이드록시우레아 및 티미딘은 DNA의 주요 구조적 단위체인 자유 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)의 감소를 초래한다. DNA 복제의 억제는 G1 페이스와 S 페이스 사이의 전이에서 세포를 정지시킨다. 이 방법의 이점은 복제 억제제로의 반복된 노출에 의해 균일한 동기화된 세포 집단에 도달할 가능성 및 복제 억제제가 저렴하다는 점을 포함한다.
일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 세포에서 미세소관 중합을 억제하는 것을 포함한다. 미세소관 중합을 억제하는 것은 세포를 미세소관 중합 억제제 예컨대, 나코다졸과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 세포에서 HMG CoA 리덕타제를 억제시키는 것을 포함한다. HMG CoA 리덕타제를 억제하는 것은 세포를 HMG CoA 리덕타제 억제제 예컨대, 로바스타틴과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 세포에서 DNA 폴리머라제를 억제하는 것을 포함한다. DNA 폴리머라제를 억제하는 것은 세포를 DNA 폴리머라제 억제제 예컨대, 아피디콜린과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 세포를 아베마시클립, 아미노프테린, 아피디콜린, 블렙비스타틴, 부티레이트, 카티논, 콜세미드, 콜키신, 콤팍틴, 사이토칼라신 D, 시토신 아라비노시드, 플루오로데옥시우리딘, 하이드록시우레아, 로바스타틴, 메토트렉세이트, 메비놀린, MG132, 미모신, 노코다졸, 노스카핀, 팔보시클립, 판토폰, 라족산, 레베로마이신 A, RO-3306, 로스코비틴, 리보시클립, 빈크리스틴, 또는 보루시클립과 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 세포 주기를 정지시키는 것은 세포를 저온에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 저온은 예를 들어, 약 35℃ 미만, 34℃ 미만, 33℃ 미만, 32℃ 미만, 31℃ 미만, 또는 30℃ 미만일 수 있다. 저온은 약 20℃ 내지 약 35℃ 예를 들어, 약 27℃ 내지 약 33℃일 수 있다. 저온은 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 또는 약 33℃일 수 있다. 세포는 약 1시간 내지 약 10일, 예컨대, 약 1일 내지 약 7일 예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안 저온에서 인큐베이션될 수 있다. 기간은 예를 들어, 상이한 세포 및 상이한 세포 배양 조건이 상이한 기간의 세포 주기를 초래하기 때문에 다양한 인자에 의존적일 수 있다.
특정 구체예에서, 방법은 혈청 기아 또는 영양 결핍, 세포와 제제의 접촉, 세포와 하나 초과의 제제와의 접촉, 세포 경로 조절, 및 저온에서의 세포 인큐베이션을 포함하는, 본원에 기술된 방법중 하나 초과를 이용하여 세포 주기를 정지시키는 것을 포함한다.
III. 세포 주기의 페이스에서 세포 선택
일부 양태에서, 본 발명은 복수의 세포 중 서브세트를 선택하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 세포 서브세트는 하나 이상의 세포 주기의 페이스의 세포가 풍부하다. 방법은 예를 들어, 서브세트를 선택하기 전에 본원에 기술된 임의의 방법을 이용하여 복수의 세포에 대해 세포 주기를 정지시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 유사하게는, 방법은 예를 들어, 서브세트를 선택한 후에 본원에 기술된 임의의 방법을 이용하여 세포 서브세트에 대해 세포 주기를 정지시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
방법은 G0 페이스, G0/G1 페이스, 조기 G1 페이스, G1 페이스, 후기 G1 페이스, G1/S 페이스, S 페이스, G2/M 페이스, 또는 M 페이스 세포가 풍부한 복수의 세포 중의 서브세트를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 M 페이스 세포가 풍부한 세포의 서브세트를 선택하는 것을 포함한다.
방법은 세포 집단을 염료와 접촉시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 세포의 서브세트를 선택하는 것은 유사량의 염료를 포함하는 세포를 선택하는 것을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "염료"는 적외선, 가시선, 또는 자외선 파장에서 광을 흡수하거나 방출할 수 있는 분자 또는 입자 예컨대, 클로모포어 또는 플루오로포어를 지칭한다. 예를 들어, 염료는 플루오레세인, Alexa Fluor® 488, 피코에리트린(phycoerythrin), R-피코에리트린, Texas Red®, 시아닌 5 (Cy5), 비스벤즈이미다졸 (Hoechst 33342), 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI), 악티노마이신, 미트라마이신, 안트라퀴논, TO-PRO-3, 또는 프로피디움 아이오다이드를 포함할 수 있다. 염료는 세포 구성요소 예컨대, 핵산, 이중 가닥 핵산, DNA, 크로마틴, 또는 미세소관에 결합할 수 있다 (예를 들어, 특이적으로 결합할 수 있다). 염료는 세포 표면 상의 분자에 결합할 수 있다. 염료는 삽입제(intercalating agent) 예컨대, 프로피디움 아이오다이드일 수 있다. 특정 구체예에서, 세포 주기의 한 단계에서 세포는 세포 주기의 다른 단계의 세포보다 염료 (예를 들어, DNA 또는 미세소관)에 특이적으로 결합하는 분자를 더 포함하며, 따라서 염료는 다른 단계의 세포의 분화는 허용한다. 예를 들어, DNA에 결합하는 염료는 세포 주기의 다른 단계에서의 세포 분화는 허용하는데 왜냐하면 G2 및 M 페이스 세포가 G0 또는 G1 페이스 세포보다 2배 만큼 많은 DNA를 함유하고, S 페이스 세포는 중간 양의 DNA를 함유하기 때문이다.
일부 구체예에서, 방법은 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)을 포함한다 (예를 들어, PCT 특허 출원 공개 번호 WO 2014/109713 및 WO 2010/118709 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 인용됨).
일부 구체예에서, 방법은 세포 집단을 염료와 접촉시키는 것을 포함하지 않는다. 예를 들어, FACS 시스템의 전방 산란 및 측방 산란 채널은 세포 주기의 상이한 단계에서 세포를 분화시키는데 사용될 수 있다 (예를 들어, "형광 활성화된 세포 분류"는 형광보다는 전방 산란 및 측방 산란에 의존적일 수 있다). 유사하게는, 원심분리 정화 및 유사분열 쉐이크-오프와 같은 방법은 염료에 의존적이지 않다.
복수의 세포 중 서브세트를 선택하는 것은 원심분리 정화를 포함할 수 있다 (예를 들어, PCT 특허 출원 공개 번호 WO 2013/067038 및 WO 2003/093469 참조; 이들 각각은 본원에 참조로 인용됨). 원심분리 정화 시스템은 원심력 및 반대 벌크 매질 흐름이 구배를 발생시키는 특수 원심분리 로터로 구성되며, 더 작은 세포는 상단에 그리고, 더 큰 세포는 하단에 있게 된다. 로터 속도 또는 매질 흐름은 크기-분리된 세포의 구배가 상단으로 밀려가고, 구배 상단의 작은 세포는 최종적으로 정화 챔버 밖 수집 용기 내로 밀려 나가도록 조작된다. 로터 속도 및 매질 흐름의 추가적 조작으로, 점진적으로 더 큰 세포가 정화 챔버 밖으로 밀려 나간다. G1 세포가 유사 분열 또는 후기 G2 세포의 크기의 대략 반이기 때문에, 원심분리 정화를 사용하여 세포 주기에서 이들의 위치에 따라 세포를 선택할 수 있다.
복수의 세포에서 서브세트를 선택하는 것은 유사분열 쉐이크-오프를 포함할 수 있다 (예를 들어, PCT 특허 출원 공개 번호 WO 2010/118709; 미국 특허 번호 5,710,022; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0273870 참조; 이들 각각은 본원에 참조로 인용됨). 유사분열 쉐이크-오프는 구형의 유사분열 (M) 페이스 세포의 선택을 허용하며, 이들 세포는 G0 페이스, G1 페이스, S 페이스, 및 G2 페이스 세포보다 표면에 덜 단단하게 부착된다. 따라서, 부착 세포의 진탕 배양은 다른 페이스의 세포로부터 M 페이스 세포의 분리를 허용한다.
IV. 세포 형질전환
방법은 우선적으로 세포 또는 세포들을 형질전환시켜 유도된 다능성 줄기 세포(들)를 생산하는 것을 포함한다. 세포 또는 세포들을 형질전환시키는 것은 세포(들)를 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 벡터, 및/또는 하나 이상의 소분자로 형질전환시키는 것을 포함할 수 있다.
유도된 다능성 줄기 세포를 생성시키는 것은 세포를 Oct 계 유전자, Klf 계 유전자, Sox 계 유전자, Myc 계 유전자, Lin 계 유전자, 및 Nanog 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자로 형질도입시키는 것을 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0227032 참조; 본원에 참조로 인용됨). 예를 들어, 유도된 다능성 줄기 세포를 생성시키는 것은 Oct 계 유전자, Klf 계 유전자, Sox 계 유전자, Myc 계 유전자, Lin 계 유전자, 및 Nanog 유전자로 세포를 형질도입하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포를 Kruppel-유사 인자 4(Klf4), 옥타머-결합 전사 인자 3/4(Oct-3/4), 옥타머-결합 전사 인자 4(Oct-4), SRY(성 결정 영역 Y)-박스 2(Sox2), 및/또는 c-Myc에 대한 유전자로 형질도입시키는 것을 포함할 수 있다. 다능성 줄기 세포를 생성시키는 것은 세포를 Oct3/4, Oct4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 큰 T 항원, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, Glis1, Esrrb, 및/또는 Esrrg에 대한 유전자로 형질도입시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 다능성 줄기 세포를 생성시키는 것은 세포를 Klf4, Oct-3/4, Oct-4, Sox2, 및 c-Myc에 대한 유전자로 형질도입시키는 것을 포함한다.
세포를 형질도입시키는 것은 세포를 적어도 하나의 벡터로 형질도입시키는 것을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 적어도 하나의 벡터는 Klf4, Oct-3/4, Oct-4, Sox2, 및/또는 c-Myc에 대한 유전자를 포함한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 전이가능한 요소, 또는 나노입자를 포함할 수 있다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터 예컨대, 센다이 바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 세포를 형질도입시키는 것은 세포를 적어도 하나의 센다이 바이러스 벡터로 형질도입시키는 것을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 적어도 하나의 센다이 바이러스 벡터는 Klf4, Oct-3/4, Oct-4, Sox2, 및/또는 c-Myc에 대한 유전자를 포함한다.
세포로부터 다능성 줄기 세포를 생성시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0223669 및 2013/0065311에 기술된 것을 포함하며, 이들 각각은 본원에 참조로 인용된다.
일부 구체예에서, 방법은 세포를 글리코겐 합성효소 키나제 억제제, TGFP 수용체 억제제, 시클릭 AMP 아고니스트, S-아데노실 호모시스테인 가수분해효소 억제제, 및 히스톤 아세틸화를 촉진하는 제제 중 적어도 하나로 형질전환시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 세포를 소분자 예컨대, 발프로산, BIX-01294, SB431412, 또는 PD0325901로 형질전환시키는 것을 포함한다. 방법은 세포를 발프로산, BIX-01294, SB431412, 및 PD0325901로 형질전환시키는 것을 포함할 수 있다. 핵산보다는 소분자를 사용하여 체세포로부터 다능성 줄기 세포를 생성시키는 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, PCT 특허 출원 공개 번호 2015/003643 (참조로 인용됨); 및 문헌 [Hou, P. et al, Science 341:651-54 (2013)] 참조). 하나 이상의 소분자가 본원에 기술된 하나 이상의 유전자, 또는 이의 유전자 생성물 대신에 또는 이와 조합되어 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 세포를 하나 이상의 마이크로RNA로 형질전환시키는 것을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,852,941 참조; 본원에 참조로 인용됨).
일부 구체예에서, 방법은 유도된 다능성 줄기 세포(들)를 분화시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 iPSC(들)를 섬유모세포(들), B 세포(들), T 세포(들), 조혈 세포(들), 대식세포(들), 단핵구(들), 단핵 세포(들), 수지상 세포(들), 근육세포(들), 각질세포(들), 멜라닌세포(들), 지방세포(들), 상피 세포(들), 표피 세포(들), 연골 세포(들), 신경 세포(들), 신경 아교세포(들), 별아교세포(들), 심장 세포(cardiac cell)(들), 심근 세포(cardiomyocyte)(들), 식도 세포(들), 위 세포(들), 췌장 세포(들), 간세포(들), 난구세포(들), 또는 생식모세포(들)로 분화시키는 것을 포함한다. 줄기 세포 예컨대, iPSC를 분화시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0227032 참조; 본원에 참조로 통합됨).
예시
실시예 1. 말초혈 단핵 세포의 수확
12 mL의 LeucoSep™ 튜브를 3 mL의 LeucoSep™ 분리 배지(Greiner Bio One)로 채웠다. 튜브를 실온에서 1000 rcf로 30초 동안 원심분리하여 튜브에서 다공성 장벽 아래에 분리 매질을 위치시켰다.
4 mL의 포스페이트 완충된 염수(PBS; 칼슘 및 마그네슘 불포함)를 15 mL의 원추형 튜브에 첨가하였다. 4 mL의 진공채혈기의 인간 혈액을 10회 뒤집어 혈액을 혼합하였다. 이후 혈액을 PBS를 함유하는 원추형 튜브에 첨가하고, 혈액 및 PBS를 혼합하였다. 이후 혈액 및 PBS 혼합물을 LeucoSep™ 튜브에 부었다.
LeucoSep™ 튜브를 Labnet 원심분리기에서 1250 rcf(또는 Beckman 스윙 버킷 원심분리기에서 2100 rpm)로 30분 동안 실온에서 원심분리시켰다. 다공성 장벽 위의 혈장 상청액 및 풍부화된 세포 분획 둘 모두를 새로운 15 mL의 원심분리 튜브에 부어서, 림프구 및 말초혈 단핵 세포를 함유하는 풍부화된 세포 분획을 수집하였다. 세포를 Labnet 원심분리기에서 10분 동안 500 rcf(또는 Beckman 원심분리기에서 10분 동안 1100 rpm으로)로 펠렛화하고, 상청액을 버렸다.
펠렛을 1 mL의 동결 배지(열-불활성화된 우태아 혈청 중 10% DMSO)에 재현탁시켰다. 1 mL의 샘플을 2개의 0.5 mL 분취량으로 나누고, -80℃ 냉동장치에서 동결시켰다. 각각의 0.5 mL 분취량은 약 1,000,000개의 말초혈 단핵 세포를 함유하였다.
실시예 2. 말초혈 단핵 세포의 형질도입
말초혈 단핵 세포의 0.5 mL 분취량을 15 mL의 원추형 바이알에 배치된 0.5 mL의 증식 배지로 세척 하였다. 세포를 250 rcf에서 7분 동안 펠렛화하고, 상청액을 따라 내고, 약 100 μL의 배지를 튜브에 남겼다.
0.4 mL의 StemPro-34 Lance 배지; 5 μL hKOS; 5 μL hc-Myc; 3 μL h-Klf4; 물 중 2 μL 폴리브렌(1 mg/mL 희석액); 및 폴리브렌 시약(10 mg/mL)을 함유하는 형질도입 배지를 제조하였다.
동결된 CytoTune 바이러스 바이알을 8초 동안 37℃ 배쓰에 두어, 시약을 녹인 다음, 4℃ 저온 블록에 두었다. 바이러스를 PBMC 증식 배지로 혼합시켰다.
이후 형질도입 배지를 15 mL의 원추형 바이알에 배치하여 세포 펠렛을 재현탁하였다. 형질도입 배지 및 세포를 24-웰 플레이트의 한 웰에 넣고, 5% CO2의 가습 대기에서 37℃로 밤새 인큐베이션하였다.
참조에 의한 포함
본원에 인용된 각각의 특허, 공개된 특허 출원, 및 비-특허 문헌은 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
균등물
당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대한 다수의 균등물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등물은 하기 청구 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (40)

  1. 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는 방법으로서,
    줄기 세포가 아닌 세포를 제공하는 단계;
    세포의 세포 주기를 정지시키는 단계; 및
    세포를 형질전환시켜 유도된 다능성 줄기 세포를 생성시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 세포 성장을 제한하는 혈청 농도 또는 아미노산 농도를 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션시키는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 CEK 상호작용 단백질 (cip) 경로, 키나제 억제 단백질 (kip) 경로, 키나제 4 억제제 (INK4a) 경로, 또는 대안적인 해독틀 (ARF) 경로를 조절하는 것을 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 p14ARF, p16INK4, p21, p27, p53 또는 p57을 활성화시키는 것을 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 사이클린 D 경로를 조절하는 것을 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 사이클린 의존성 키나제 4 또는 사이클린 의존성 키나제 6을 억제하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 세포를 사이클린 의존성 키나제 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 사이클린 의존성 키나제 억제제가 사이클린 의존성 키나제 4 억제제 또는 사이클린 의존성 키나제 6 억제제인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 사이클린 의존성 키나제 억제제가 팔보시클립, 리보시클립, 보루시클립, 또는 아베마시클립인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 티미딘을 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션시키는 것을 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 세포에서 미세소관 중합을 억제시키는 것을 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 미세소관 중합을 억제시키는 것이 세포를 미세소관 중합 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 세포에서 뉴클레오티드 생합성을 억제시키는 것을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 세포에서 뉴클레오티드 생합성을 억제시키는 것이 세포를 뉴클레오티드 생합성 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 세포에서 HMG CoA 환원효소를 억제시키는 것을 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, HMG CoA 환원효소를 억제시키는 것이 세포를 HMG CoA 환원효소 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 세포에서 DNA 중합효소를 억제시키는 것을 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, DNA 중합효소를 억제시키는 것이 세포를 DNA 중합효소 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 세포를 로바스타틴, 콤팍틴, 메비놀린, 미모신, 아피디콜린, 아미노프테린, 하이드록시우레아, 콜키신, 콜세미드, 라족산, 로스코비틴, 빈크리스틴, 카티논, 판토폰, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 플루오로데옥시우리딘, 부티레이트, 시토신 아라비노시드, MG132, RO-3306, 노스카핀, 블렙비스타틴, 레베로마이신 A, 사이토칼라신 D, 또는 노코다졸과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 세포를 저온에서 인큐베이션시키는 것을 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 세포가 약 27℃ 내지 약 33℃에서 인큐베이션되는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 주기를 정지시키는 단계가 세포 주기를 간기, G0 페이스, G0/G1 페이스, 조기 G1 페이스, G1 페이스, 후기 G1 페이스, G1/S 페이스, S 페이스, G2/M 페이스, 또는 M 페이스에 정지시키는 것을 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 세포 주기가 M 페이스에서 정지되는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 복수의 유도된 다능성 줄기 세포가 생성되는 방법.
  25. 복수의 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는 방법으로서,
    줄기 세포가 아닌 복수의 세포를 제공하는 단계;
    복수의 세포 중 서브세트를 선택하는 단계로서, 세포의 서브세트는 하나 이상의 세포 주기 페이스(phase)의 세포가 풍부한, 단계; 및
    세포 서브세트를 형질전환시켜 복수의 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 세포의 세브세트가 G0 페이스, G0/G1 페이스, 조기 G1 페이스, G1 페이스, 후기 G1 페이스, G1/S 페이스, S 페이스, G2/M 페이스, 또는 M 페이스에서 풍부한 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 복수의 세포를 핵산에 결합하는 염료와 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 세포의 서브세트를 선택하는 것이 유사한 양의 염료를 포함하는 세포를 선택하는 것을 포함하는 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 형광 활성화된 세포 분류에 의해 선택되는 방법.
  29. 제25항 또는 제26항에 있어서, 세포가 원심분리 정화 또는 유사분열 쉐이크-오프(shake-off)에 의해 선택되는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포(들)를 형질전환시키는 단계가 세포(들)를 Oct 계 유전자, Klf 계 유전자, Sox 계 유전자, Myc 계 유전자, Lin 계 유전자, 및 Nanog 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자로 형질도입시키는 것을 포함하는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포(들)를 형질전환시키는 단계가 세포(들)를 Oct3/4, Oct4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 큰 T 항원, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, Glis1, Esrrb, 및 Esrrg로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자로 형질도입시키는 것을 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 세포(들)를 형질전환시키는 단계가 세포(들)를 Klf4, Oct-3/4, Oct-4, Sox2, 및 c-Myc로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자로 형질도입시키는 것을 포함하는 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포(들)를 형질도입시키는 단계가 세포(들)를 적어도 하나의 유전자를 포함하는 벡터로 형질도입시키는 것을 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 벡터가 플라스미드, 바이러스, 전이가능한 요소, 또는 나노입자를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 벡터가 바이러스를 포함하고, 바이러스가 센다이 바이러스 또는 아데노바이러스인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포(들)를 형질전환시키는 단계가 세포(들)를 발프로산, BIX-01294, SB431412 또는 PD0325901과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포(들)를 형질전환시키는 단계가 세포(들)를 글리코겐 합성효소 키나제 억제제, TGFP 수용체 억제제, 사이클릭 AMP 아고니스트, S-아데노실 호모시스테인 가수분해효소 억제제, 및 히스톤 아세틸화를 촉진하는 제제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포(들)가 체세포(들)인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포(들)가 포유동물 세포(들)인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 세포(들)가 인간 세포(들)인 방법.
KR1020187015171A 2015-11-02 2016-10-27 세포 주기 차단은 유도된 다능성 줄기 세포 생성 효율을 향상시킨다 KR20180072817A (ko)

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