CN107589002B - 一种诱导多能干细胞染色体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，包括如下步骤：（1）干细胞的培养；（2）细胞周期同步化；（3）干细胞收获：从培养瓶中提取干细胞获得细胞悬液；（4）滴片；（5）染色。本发明在干细胞核型鉴定时的染色体分辨率高，数量多，所以核型分析成功率高。

Description

一种诱导多能干细胞染色体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种染色体的制备方法，特别涉及一种诱导多能干细胞染色体的制备方法。

背景技术

诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是指体细胞经过重编程，转化为具有胚胎干细胞特性和功能的多能干细胞。对诱导多能干细胞的研究始于2006年，日本Takahashi 等首次以成人成纤维细胞为基础诱导出诱导多能干细胞，并证实获得的细胞具有胚胎干细胞的特性和功能，掀起诱导干细胞研究的热潮。目前证实，诱导多能干细胞与胚胎干细胞类似，可以自我更新并可分化成各种类型的体细胞，不仅在替代疗法上有重要价值，还可用于体外疾病模型的建立，用于疾病机制的研究、药物的监测以及新治疗方法的检验。

研究表明，在现有的体外培养条件下，诱导多能干细胞在多次传代后会发生染色体核型的变异，即染色体的数目发生改变或结构发生异常。已知的影响因素包括培养温度的变化、血清的使用、滋养层细胞的种类和状态、分化抑止因子的加入、传代操作是否涉及到消化酶以及冻存复苏操作等。最常见的染色体异常包括12号、17号和X染色体的三体和结构变异，并且此类细胞在继续培养过程中，会进一步累积二次变异，继发1，2，7，8，9，14，20号染色体的三体等核型变异。研究表明，上述染色体异常与乳腺癌、睾丸生殖细胞等肿瘤的染色体变异相似，同时发现变异的染色体的特定区域含有可能对干细胞增殖起关键调控作用的基因如BIRC5、NANOG、DPPA3、GDF3、TGCT1、KRAS 和SOX5等。进一步的实验证实携带上述12，17，X染色体异常的干细胞在体外培养中具有生长优势，将在后续的5-10次传代中取代正常二倍体细胞成为优势细胞株。有鉴于此，干细胞体外长期传代后获得性的核型变异成为一个备受关注的问题。核型异常的干细胞株已经不是严格意义上的多能干细胞株，一方面多能性受损，无法通过下游分化得到正常的体细胞类型，细胞代谢途径亦变得紊乱，因而不能进一步用于人类疾病模型的建立和机制研究；另一方面具有“癌变”倾向，在体内极易导致畸形、异常甚至肿瘤的发生。因而，对体外培养的多能干细胞株进行长期和规律性的核型监测，在多能干细胞的生物学和临床治疗研究过程中确认使用的细胞株核型正常显得尤为重要。正如Menendez等在讨论多能干细胞应用前景的一篇综述中指出，在诱导多能干细胞体外培养过程中，引入细胞核型的检查环节，以检测细胞核型是否在培养过程发生变异，确保科研实验的正常进行和结论的准确性，是非常重要和必要的。

由于发生变异的细胞和正常的二倍体细胞从形态上无法区分，唯有通过遗传学检测才能确定，目前主要的检测手段有染色体核型分析、荧光原位杂交、基因芯片等，其中最全面、最便捷、成本最低的方法就是染色体的核型分析。

当前诱导多能干细胞的染色体制备和核型鉴定使用的是常规或略经改良的细胞遗传学方法，即通过在培养细胞中加入秋水仙素将细胞阻滞在中期，随后通过低渗、固定、制片、染色等一系列方法获得染色体，并进行核型鉴定，这一方法应用于多能干、外周血等类型的细胞染色体收获中，可获得大量可供分析的400条带分辨率以上的染色体。然而由于细胞种类的差异，该法用于诱导多能干细胞染色体收获时获得的染色体普遍较短（仅有200-320条带）、且可供分析的染色体数量较少，影响细胞核型鉴定的准确性和时效性。因此需要对原有方法进行改良，以适合诱导多能干细胞这一特殊类型细胞。

细胞周期同步化（Cell Cycle Synchronization）是一种制备高分辨率染色体的技术，其原理为在细胞培养液中先加入抑制DNA合成的试剂（称为“阻滞”），使大多数细胞停留在合成期（S期）；随后再加入外源性试剂使DNA得以合成（称为“释放”），细胞周期得以继续，此时再用常规方法加秋水仙素进行收获，通过调整释放和收获之间的时间间隔，就可以获得晚前期或前中期的染色体，其分辨率最高可以达到850条带以上，而且通过细胞周期的同步化，大量细胞处于分裂期，可保证核型分析的数量要求。

然而，由于目前国内并无应用细胞周期同步化法收获诱导多能干细胞染色体的报道，由于细胞类型和细胞周期的不一致，收获诱导多能干细胞时所加同步化试剂的最佳终浓度和阻滞、释放、收获之间的最佳时间间隔均无参考资料，需要重新摸索；由于高分辨染色体较长，制片时其分散条件也需要重新优化，以免染色体交叉过多影响核型分析。本发明拟致力于以上问题，建立一种改良的、应用细胞周期同步化法制备诱导多能干细胞染色体的新技术，用于诱导多能干细胞的核型监控和鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，可用于培养人源的诱导多能干细胞染色体制备，进而进行核型鉴定，也可以用于其它哺乳动物如小鼠来源的诱导多能干细胞染色体的制备。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，包括如下步骤：

（1）干细胞的培养：干细胞置于37℃、5%浓度CO₂的培养箱中开放式培养，培养基每日换液；待细胞生长处于指数生长期，细胞生长分裂旺盛时可以考虑收获。

（2）细胞周期同步化：在干细胞收获前一天上午8:00更换新鲜培养基， 上午10:00向培养瓶中加入100微升氟脲嘧啶脱氧核苷，继续放入培养箱培养；次日8:00向培养瓶中加入200µl胸腺嘧啶，继续培养，上午11:00向培养瓶中加入100µl 秋水仙素，混匀后培养箱放置15分钟，取出培养瓶，用于收获干细胞；

本步骤目的是先让处于不同细胞周期的细胞统一停止在合成（S）期，然后再加胸腺嘧啶让所有的细胞统一进入细胞周期，这样可以获得最多的细胞，也可以通过控制加入胸腺嘧啶后的时间来获得长度不同的染色体（时间越短，染色体越长，时间越长，染色体越短）。本步骤是保证干细胞核型鉴定时的染色体分辨率高，数量多，核型分析成功率高的关键。

（3）干细胞收获：从培养瓶中提取干细胞获得细胞悬液。

（4）滴片：将细胞悬液滴于载玻片上。

（5）染色：将固定片染色后得染色体玻片。

作为优选，步骤（2）中，氟脲嘧啶脱氧核苷的浓度为1µg/ml。

作为优选，步骤（2）中，胸腺嘧啶的浓度为2.4mg/ml。

作为优选，步骤（2）中，秋水仙素的浓度为20µg/ml。

作为优选，步骤（3）干细胞收获具体为：

A、将培养瓶中的培养基吸入离心管中，加入生理盐水2ml冲洗培养瓶，冲洗液也吸入离心管中；

B、向培养瓶中加入0.25% EDTA-胰酶消化液1ml，消化5min；将消化下来的细胞吸入离心管中，以生理盐水冲洗培养瓶3-5次，将培养瓶冲洗干净；

C、离心管在1500rpm转速下离心8min；去上清液，向离心管中加入室温（夏天）或37℃预热的0.075mol/L的KCl低渗液0.5ml，置于涡旋振荡器上10-15s，充分混匀；继续加入0.075mol/L的KCl低渗液至10ml刻度，盖紧盖子，颠倒混匀，置37℃水浴箱低渗10分钟；

D、低渗时间到后缓慢沿管壁加入0.5ml固定液，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min，用真空吸痰器吸去部分上清液，留高度3-5mm液面，置于涡旋振荡器上10-15s，充分混匀，加入固定液至8ml刻度处，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min；

E、用真空吸痰器吸去固定液，留高度3-5mm液面，再次加入固定液至8ml刻度处，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min，重复本步骤两次；

F、步骤E结束后，吸取离心管内的固定液，留下管底的1-1.5mL固定液，以移液枪转移至另一离心管中。

作为优选，步骤D中，所述固定液为甲醇：冰醋酸=3：1的体积比的混合物。

作为优选，步骤（4）滴片具体为：

滴片前先在载玻片上写好编号，将载玻片浸入蒸馏水中1s，浸没深度5cm，立即取出垂直立于吸水纸上，吸去多余水分，使载玻片表面覆盖一层水膜；立即置于抽屉中，关上抽屉。

以移液枪混匀细胞悬液后吸取细胞悬液，拉开抽屉，在载玻片上端中部滴加30µl悬液，使其均匀流下，加完后关闭抽屉； 载玻片干燥后从抽屉中取出放置于玻片架上，将玻片架放置在65℃烤箱过夜烤片或75℃烤片3h以上。

作为优选，步骤（5）染色具体为：将固定片放置于染色架上，染色架放入第一缸同时计时消化时间，消化1分50秒，时间到后立即取出，浸入第二缸涮洗3次，时间1-2s，在缸沿扣击3-5次，扣去水分，转而浸入第三缸，涮洗3次，时间1-2s，在缸沿扣击3-5次后浸入第4缸，浸入同时开始计时染色时间，染色2.5分钟；染色完成后应放入第5缸中涮洗，涮洗3次，时间1-2s，在缸沿扣击3-5次，扣去水分，或浸入大烧杯涮洗3次，甩干水分，随即用电吹风快速吹干，放入55℃烤箱烘干。

作为优选，第一缸为胰酶消化液：染缸中加入240ml生理盐水或pH7.2磷酸缓冲液、胰酶原液10ml，调节pH值在7.2-7.4之间；

第二缸为生理盐水：染缸中加入生理盐水250ml，加入或不加入2ml小牛血清；

第三缸为生理盐水：染缸中加入生理盐水250ml；

第四缸为吉姆萨染液：染缸中加入蒸馏水180ml，pH6.8磷酸缓冲液原液10×20ml，吉姆萨原液10-12ml；或自来水190ml，吉姆萨原液10-12ml，以塑料吸管充分搅拌混匀；

第五缸为自来水250ml，或以1L大烧杯装满自来水。

本发明的有益效果是：干细胞核型鉴定时的染色体分辨率高，数量多，所以核型分析成功率高。

附图说明

图1是常规方法加秋水仙素2小时的2000倍显微放大图；

图2是本发明的方法加秋水仙素2小时的2000倍显微放大图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1：

一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，包括如下步骤：

（1）干细胞的培养：人源干细胞置于37℃、5%浓度CO₂的培养箱中开放式培养，培养基（市售）每日换液；

（2）细胞周期同步化：在干细胞收获前一天上午8:00更换新鲜培养基， 上午10:00向培养瓶中加入100微升氟脲嘧啶脱氧核苷（浓度1µg/ml），继续放入培养箱培养；次日8:00向培养瓶中加入200µl胸腺嘧啶（浓度2.4mg/ml），继续培养，上午11:00向培养瓶中加入100µl 秋水仙素（浓度20µg/ml），混匀后培养箱放置15分钟，取出培养瓶，用于收获干细胞；

（3）干细胞收获：

A、将培养瓶中的培养基吸入离心管中，加入生理盐水2ml冲洗培养瓶，冲洗液也吸入离心管中；

B、向培养瓶中加入0.25% EDTA-胰酶消化液1ml，消化5min；将消化下来的细胞吸入离心管中，以生理盐水冲洗培养瓶3-5次，将培养瓶冲洗干净；

C、离心管在1500rpm转速下离心8min；去上清液，向离心管中加入室温（夏天）0.075mol/L的KCl低渗液0.5ml，置于涡旋振荡器上10-15s，充分混匀；继续加入0.075mol/L的KCl低渗液至10ml刻度，盖紧盖子，颠倒混匀，置37℃水浴箱低渗10分钟；

D、低渗时间到后缓慢沿管壁加入0.5ml固定液（固定液为甲醇：冰醋酸=3：1的体积比的混合物），盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min，用真空吸痰器吸去部分上清液，留高度3-5mm液面，置于涡旋振荡器上10-15s，充分混匀，加入固定液至8ml刻度处，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min；

E、用真空吸痰器吸去固定液，留高度3-5mm液面，再次加入固定液至8ml刻度处，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min，重复本步骤两次；

F、步骤E结束后，吸取离心管内的固定液，留下管底的1-1.5mL固定液，以移液枪转移至另一离心管中获得细胞悬液。

（4）滴片：

滴片前先在载玻片上写好编号，将载玻片浸入蒸馏水中1s，浸没深度5cm，立即取出垂直立于吸水纸上，吸去多余水分，使载玻片表面覆盖一层水膜；立即置于抽屉中，关上抽屉。

以移液枪混匀细胞悬液后吸取细胞悬液，拉开抽屉，在载玻片上端中部滴加30µl悬液，使其均匀流下，加完后关闭抽屉； 载玻片干燥后从抽屉中取出放置于玻片架上，将玻片架放置在65℃烤箱过夜烤片得固定片；

（5）染色：

放置于染色架上，染色架放入第一缸同时计时消化时间，消化1分50秒，时间到后立即取出，浸入第二缸涮洗3次，时间1-2s，在缸沿扣击3-5次，扣去水分，转而浸入第三缸，涮洗3次，时间1-2s，在缸沿扣击3-5次后浸入第4缸，浸入同时开始计时染色时间，染色2.5分钟；染色完成后应放入第5缸中涮洗，涮洗3次，时间1-2s，在缸沿扣击3-5次，扣去水分，随即用电吹风快速吹干，放入55℃烤箱烘干。

第一缸为胰酶消化液：染缸中加入240ml生理盐水、胰酶原液10ml，调节pH值在7.2-7.4之间；

第二缸为生理盐水：染缸中加入生理盐水250ml，加入2ml小牛血清；

第三缸为生理盐水：染缸中加入生理盐水250ml；

第四缸为吉姆萨染液：染缸中加入蒸馏水180ml，pH6.8磷酸缓冲液原液10×20ml，吉姆萨原液10-12ml；以塑料吸管充分搅拌混匀，塑料吸管染为紫红色说明染液有效，吸管不着色或发现染液偏蓝色说明染液无效，需及时更换染液；

第五缸为自来水250ml。

实施例2：

一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，包括如下步骤：

（1）干细胞的培养：干细胞置于37℃、5%浓度CO₂的培养箱中开放式培养，培养基（市售）每日换液；

（2）细胞周期同步化：在干细胞收获前一天上午8:00更换新鲜培养基， 上午10:00向培养瓶中加入100微升氟脲嘧啶脱氧核苷（浓度1µg/ml），继续放入培养箱培养；次日8:00向培养瓶中加入200µl胸腺嘧啶（浓度2.4mg/ml），继续培养，上午11:00向培养瓶中加入100µl 秋水仙素（浓度20µg/ml），混匀后培养箱放置15分钟，取出培养瓶，用于收获干细胞；

（3）干细胞收获：

A、将培养瓶中的培养基吸入离心管中，加入生理盐水2ml冲洗培养瓶，冲洗液也吸入离心管中；

B、向培养瓶中加入0.25% EDTA-胰酶消化液1ml，消化5min；将消化下来的细胞吸入离心管中，以生理盐水冲洗培养瓶3-5次，将培养瓶冲洗干净；

C、离心管在1500rpm转速下离心8min；去上清液，向离心管中加入37℃预热的0.075mol/L的KCl低渗液0.5ml，置于涡旋振荡器上10-15s，充分混匀；继续加入0.075mol/L的KCl低渗液至10ml刻度，盖紧盖子，颠倒混匀，置37℃水浴箱低渗10分钟；

D、低渗时间到后缓慢沿管壁加入0.5ml固定液（固定液为甲醇：冰醋酸=3：1的体积比的混合物），盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min，用真空吸痰器吸去部分上清液，留高度3-5mm液面，置于涡旋振荡器上10-15s，充分混匀，加入固定液至8ml刻度处，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min；

E、用真空吸痰器吸去固定液，留高度3-5mm液面，再次加入固定液至8ml刻度处，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min，重复本步骤两次；

F、步骤E结束后，吸取离心管内的固定液，留下管底的1-1.5mL固定液，以移液枪转移至另一离心管中获得细胞悬液。

（4）滴片：

滴片前先在载玻片上写好编号，将载玻片浸入蒸馏水中1s，浸没深度5cm，立即取出垂直立于吸水纸上，吸去多余水分，使载玻片表面覆盖一层水膜；立即置于抽屉中，关上抽屉。

以移液枪混匀细胞悬液后吸取细胞悬液，拉开抽屉，在载玻片上端中部滴加30µl悬液，使其均匀流下，加完后关闭抽屉； 载玻片干燥后从抽屉中取出放置于玻片架上，将玻片架放置在75℃烤片3h以上；

（5）染色：

放置于染色架上，染色架放入第一缸同时计时消化时间，消化1分50秒，时间到后立即取出，浸入第二缸涮洗3次，时间1-2s，在缸沿扣击3-5次，扣去水分，转而浸入第三缸，涮洗3次，时间1-2s，在缸沿扣击3-5次后浸入第4缸，浸入同时开始计时染色时间，染色2.5分钟；染色完成后浸入大烧杯涮洗3次，甩干水分，随即用电吹风快速吹干，放入55℃烤箱烘干。

第一缸为胰酶消化液：染缸中加入240ml pH7.2磷酸缓冲液、胰酶原液10ml，调节pH值在7.2-7.4之间；

第二缸为生理盐水：染缸中加入生理盐水250ml；

第三缸为生理盐水：染缸中加入生理盐水250ml；

第四缸为吉姆萨染液：染缸中加入自来水190ml，吉姆萨原液10-12ml，以塑料吸管充分搅拌混匀，塑料吸管染为紫红色说明染液有效，吸管不着色或发现染液偏蓝色说明染液无效，需及时更换染液；

第五缸为以1L大烧杯装满自来水。

如图1所示，常规方法加秋水仙素2小时，收获到的染色体较短，显带在200条带水平，只能勉强计数，难以清晰辨别每一号染色体；而采用本发明的方法加秋水仙素2小时，收获到的染色体相对较长，显带在400条带水平，染色体可以清晰辨别并可以进一步做核型分析、可供核型鉴定（如图2所示）。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (1)

1.一种诱导多能干细胞染色体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）干细胞的培养：干细胞置于37℃、5%浓度CO₂的培养箱中开放式培养，培养基每日换液；

（2）细胞周期同步化：在干细胞收获前一天上午8:00更换新鲜培养基， 上午10:00向培养瓶中加入100微升氟脲嘧啶脱氧核苷，继续放入培养箱培养；次日8:00向培养瓶中加入200µl胸腺嘧啶，继续培养，上午11:00向培养瓶中加入100µl 秋水仙素，混匀后培养箱放置15分钟，取出培养瓶，用于收获干细胞；

（3）干细胞收获：从培养瓶中提取干细胞获得细胞悬液；

（4）滴片：将细胞悬液滴于载玻片上并固定得固定片；

（5）染色：将固定片染色后得染色体玻片；

步骤（2）中，氟脲嘧啶脱氧核苷的浓度为1µg/ml；步骤（2）中，胸腺嘧啶的浓度为2.4mg/ml；步骤（2）中，秋水仙素的浓度为20µg/ml；

步骤（3）干细胞收获具体为：

A、将培养瓶中的培养基吸入离心管中，加入生理盐水2ml冲洗培养瓶，冲洗液也吸入离心管中；

B、向培养瓶中加入0.25% EDTA-胰酶消化液1ml，消化5min；将消化下来的细胞吸入离心管中，以生理盐水冲洗培养瓶3-5次，将培养瓶冲洗干净；

C、离心管在1500rpm转速下离心8min；去上清液，向离心管中加入室温或37℃预热的0.075mol/L的KCl低渗液0.5ml，置于涡旋振荡器上10-15s，充分混匀；继续加入0.075mol/L的KCl低渗液至10ml刻度，盖紧盖子，颠倒混匀，置37℃水浴箱低渗10分钟；

D、低渗时间到后缓慢沿管壁加入0.5ml固定液，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min，用真空吸痰器吸去部分上清液，留高度3-5mm液面，置于涡旋振荡器上10-15s，充分混匀，加入固定液至8ml刻度处，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min；

E、用真空吸痰器吸去固定液，留高度3-5mm液面，再次加入固定液至8ml刻度处，盖紧盖子，颠倒混匀，1500rpm转速下离心8min，重复本步骤两次；

F、步骤E结束后，吸取离心管内的固定液，留下管底的1-1.5mL固定液，以移液枪转移至另一离心管中；

步骤D中，所述固定液为甲醇：冰醋酸=3：1的体积比的混合物；

步骤（4）滴片具体为：

滴片前先在载玻片上写好编号，将载玻片浸入蒸馏水中1s，浸没深度5cm，立即取出垂直立于吸水纸上，吸去多余水分，使载玻片表面覆盖一层水膜；立即置于抽屉中，关上抽屉；

以移液枪混匀细胞悬液后吸取细胞悬液，拉开抽屉，在载玻片上端中部滴加30µl悬液，使其均匀流下，加完后关闭抽屉； 载玻片干燥后从抽屉中取出放置于玻片架上，将玻片架放置在65℃烤箱过夜烤片或75℃烤片3h以上；

步骤（5）染色具体为：将固定片放置于染色架上，染色架放入第一缸同时计时消化时间，消化1分50秒，时间到后立即取出，浸入第二缸涮洗3次，时间1-2s，在缸沿扣击3-5次，扣去水分，转而浸入第三缸，涮洗3次，时间1-2s，在缸沿扣击3-5次后浸入第4缸，浸入同时开始计时染色时间，染色2.5分钟；染色完成后应放入第5缸中涮洗，涮洗3次，时间1-2s，在缸沿扣击3-5次，扣去水分，或浸入大烧杯涮洗3次，甩干水分，随即用电吹风快速吹干，放入55℃烤箱烘干；

第一缸为胰酶消化液：染缸中加入240ml生理盐水或pH7.2磷酸缓冲液、胰酶原液10ml，调节pH值在7.2-7.4之间；

第二缸为生理盐水：染缸中加入生理盐水250ml，加入或不加入2ml小牛血清；

第三缸为生理盐水：染缸中加入生理盐水250ml；

第四缸为吉姆萨染液：染缸中加入蒸馏水180ml，pH6.8磷酸缓冲液原液10×20ml，吉姆萨原液10-12ml；或自来水190ml，吉姆萨原液10-12ml，以塑料吸管充分搅拌混匀；

第五缸为自来水250ml，或以1L大烧杯装满自来水。

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