CN106978398A - 一种外源性小rna制备多能干细胞的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种外源性小RNA制备多能干细胞的方法及其用途，具体地，本发明公开了一种外源性小RNA分子的用途，用于制备促进体细胞或专能干细胞转变为多能干细胞的试剂或试剂盒。本发明公开的小RNA能够调控多种多能干细胞转录因子，促进体细胞和/或专能干细胞向多能干细胞的转化。

Description

一种外源性小RNA制备多能干细胞的方法及其用途
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一种外源性小RNA制备多能干细胞的方法和用途。
背景技术
多能干细胞(pluripotent stem cell)具有分化出多种细胞组织的潜能，它可以分化成体内所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官。因此，多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。
过去人们一直认为多能干细胞只能从人胚胎中获得。但是，2007年，美国和日本科学家发现，应用人和鼠的正常皮肤细胞，导入KLF4、OCT4、SOX2和C-MYC四种基因，即可由正常体细胞转化成多能干细胞。这种基因诱导而产生的多能干细胞称为诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，iPs)。除了皮肤细胞，其他体细胞也可以产生iPs。应用iPs已经成功培养和分化出心肌、神经、胰腺、骨等多种体细胞和不同的组织。iPS技术是干细胞研究领域的一项重大突破，它回避了历来已久的伦理争议，解决了干细胞移植医学上的免疫排斥问题，使干细胞向临床应用又迈进了一大步。但是，过去诱导多能干细胞必须应用逆转录病毒载体才能进行基因组整合。由于基因组整合的随机性，可发生突变，甚至可以引起癌症和遗传疾病。寻找一种高效的促进体细胞向多能干细胞转化的途径是亟待解决的问题。
多能干细胞也成为当前干细胞研究的热点和焦点。有些报道关于诱导iPs方法，利用小分子组合处理使分化的细胞与TGF-beta受体抑制剂，GSK3-beta抑制剂和cAMP激活剂接触，由此所述分化的细胞发生细胞命运重编程，产生诱导多潜能干细胞获得完全重编程的iPSCs，但是该方法的重现性差。日本科学家将从新生小鼠身上分离的细胞暴露在弱酸性的环境中使细胞恢复到未分化状态，并使其具备分化成任何细胞类型的潜能，但是这种纯物理刺激能够使已经分化的细胞恢复到多能状态这一现象的发现受到很大质疑。
因此，目前急需一种高效地、可重现地、制备多能干细胞的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效地、可重现地、制备多能干细胞的方法。
本发明第一方面提供了一种外源性小RNA分子的用途，用于制备促进体细胞或专能干细胞转变为多能干细胞的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的试剂包括转染试剂。
在另一优选例中，所述的体细胞包括：上皮细胞、神经细胞、红细胞、白细胞、血小板、吞噬细胞(噬中性粒细胞、噬碱性粒细胞、噬酸性粒细胞等)、B淋巴细胞、效应B细胞、记忆B细胞、T淋巴细胞、记忆T细胞、效应T细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、肝细胞、肾细胞、腺细胞、内分泌细胞(甲状腺细胞、胸腺细胞、胰岛B细胞、胰岛细胞等)。
在另一优选例中，所述的专能干细胞包括：造血干细胞、胚胎干细胞、骨髓间质干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、成骨干细胞、内胚层干细胞、视网膜干细胞、胰腺干细胞。
在另一优选例中，所述的小RNA分子选自下组：miRNA、siRNA-或其组合。
在另一优选例中，所述小RNA分子包括选自下组(A)的至少2种或全部miRNA：miR-432、miR-320、miR-27b、miR-103。
在另一优选例中，所述小RNA分子还包括选自下组(B)的至少1种或全部miRNA：miR-423、miR-185、miR-378、miR-130b。
在另一优选例中，所述小RNA分子还包括选自下组(C)的至少1种或全部miRNA：let-7g、miR-107。
在另一优选例中，所述小RNA分子包括选自组(A)、组(B)和组(C)的≥4种，较佳地≥6种，更佳地≥7种，最佳地≥8种或全部miRNA。
在另一优选例中，所述小RNA分子包括选自组(A)的至少3种或全部miRNA。。
在另一优选例中，所述小RNA分子包括选自下组(D)的至少4种或全部miRNA：hsa-miR-432-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-378a-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-130b-3p、或其组合。
在另一优选例中，所述小RNA分子包括选自下组(E)的至少4种或全部miRNA：bta-miR-107、bta-miR-432、bta-miR-320a、bta-miR-27b、bta-miR-103、bta-miR-423-3p、bta-miR-423-5p、bta-miR-185、bta-miR-378、bta-let-7g、bta-miR-130b、或其组合。
在另一优选例中，所述小RNA分子包括选自下组(F)的至少4种或全部miRNA：mmu-miR-320-3p、mmu-miR-27b-3p、mmu-miR-103-3p、mmu-miR-423-5p、mmu-miR-185-5p、mmu-let-7g-5p、mmu-miR-130b-3p、或其组合。
在另一优选例中，所述的试剂还用于上调所述细胞中转录因子的表达。
在另一优选例中，所述的转录因子选自下组：Oct4、Sox2、c-Myc、n-Myc、Klf4、Nanog、Lin28、或其组合。
在另一优选例中，所述转录因子选自下组：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、或其组合。
在另一优选例中，所述的小RNA分子是人工合成的、重组的、或天然存在的。
在另一优选例中，所述的小RNA分子来自于人、牛、猪、羊、啮齿动物。
在另一优选例中，所述小RNA分子的大小为12-80nt，较佳地，14-60nt，更佳地，15-30nt，最佳地18-22nt。
在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠。
在另一优选例中，所述转染试剂为pH酸性调节剂。
在另一优选例中，所述的转染试剂为微粒子制剂。
在另一优选例中，所述的微粒子制剂包括微粒子以及被包裹于所述微粒子中的所述小RNA分子。
本发明第二方面提供了一种体外的促进体细胞或专能干细胞转变为多能干细胞的方法，包括步骤：
(i)提供一转染体系，所述转染体系包括：(a)缓冲液和/或培养液；(b)体细胞或专能干细胞；和(c)小分子RNA；
(ii)将所述转染体系置于转染条件下，使得所述的小分子RNA转染入所述的体细胞或专能干细胞；以及
(iii)将上一步骤获得的经转染的体细胞或专能干细胞进行诱导培养，从而使得所述体细胞或所述专能干细胞转变为多能干细胞。
在另一优选例中，所述的转染体系为水性体系。
在另一优选例中，所述的细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述的转染条件包括在酸性pH处理。
在另一优选例中，所述的酸性pH处理指在pH2.5-6.0，较佳地2.8-5.5，更佳地2.9-4.5，最佳地3.0-4.0下处理。
在另一优选例中，所述的酸性pH处理的时间为0.5分钟-24小时。
在另一优选例中，步骤(ii)的处理时间为0.5分钟-24小时，较佳地为1分钟-6小时，更佳地5分钟-2小时，最佳地为0.25-1小时。
在另一优选例中，在步骤(ii)和/或(iii)中，温度为4-50℃，较佳地15-45℃，更佳地25-40℃，最佳地35-39℃。
在另一优选例中，在步骤(iii)中，包括：将上一步骤获得的经转染的体细胞或专能干细胞转入了所述外源核酸的体细胞，并进行诱导，从而获得多能干细胞。
在另一优选例中，在步骤(iii)中，所述的诱导培养包括以下条件：质粒载体介导、磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和聚凝胺、机械法(显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂转染法。
在另一优选例中，所述方法为非治疗非诊断性的。
本发明第三方面提供了一种用于促进体细胞或专能干细胞转变为多能干细胞的组合物或组合，包括：
(i)外源性的小RNA分子；和
(ii)pH酸性调节剂，所述pH酸性调节剂用于提供pH为2.5-6.0的酸性pH。
在另一优选例中，所述小RNA分子包括选自下组(A)的至少2种或全部miRNA：miR-432、miR-320、miR-27b、miR-103。
本发明第四方面提供了一种本发明第三方面所述组合物的用途，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于促进体细胞和/或专能干细胞向多能干细胞的转化。
在另一优选例中，所述的试剂盒还用于调控多能干细胞转录因子表达。
本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)一容器，以及位于所述容器内的外源小RNA分子；
(ii)标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于促进体细胞和/或专能干细胞向多能干细胞的转化。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括(iii)pH酸性调节剂，所述pH酸性调节剂用于提供pH为2.5-6.0的酸性pH。
在另一优选例中，所述的pH调节剂为酸。
在另一优选例中，所述的小RNA分子包括3-100种，较佳地4-50种，更佳地5-20种。
在另一优选例中，所述的小RNA分子是独立放置或混合放置的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了不同pH处理的野生型293T细胞内osa-156a相对含量。
图2显示了LipofectamineTM 2000与酸诱导转染FAM siRNA荧光结果示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一种高效的制备多能干细胞的方法。实验表明，通过调整真核细胞培养环境为酸性，可以使小RNA更高效的进入真核细胞中。并且，在酸的作用下，小RNA能够调控多种多能干细胞转录因子，促进体细胞和/或专能干细胞向多能干细胞的转化。本发明的方法操作便捷、高效，无需加入外源载体，并且对细胞的毒性小、转染率高、导入的核酸分子也更稳定。在此基础上，完成了本发明。
小核糖核酸(小RNA)
在本发明中，术语“小核糖核酸(小RNA)”指长度大小为二十几个核苷酸的小片段RNA；根据Steven Buckingham于2003年5月提出的被广泛认同的分类方法，小RNA(small RNAs)是指非编码RNA中除转录RNA(包含核糖体RNA和转移RNA)外的部分，包括微小RNA(microRNAs)、小的干涉RNA(shortinterference RNAs,siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)和小核RNA(snRNA)等。
其中，微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类长约19-23个核苷酸的单链小核糖核酸分子，位于基因组非编码区，进化上高度保守，可以通过抑制靶基因的翻译过程对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。现有研究还证实，植物性miRNA还可以通过摄食进入动物体内，并参与调控活动。
小干扰核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)是一类由20多个核苷酸组成的双链RNA分子，可以通过特异性降解靶基因的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)起到沉默基因表达的作用。这一过程被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。RNA干扰是基因转录后调控的一种方式。siRNA可以对其靶基因进行特异性识别，并能招募被称为沉默复合体(RNA inducedsilencing complex，RISC)的蛋白质复合体。RISC包含核糖核酸酶等，可以通过靶向切割同源性mRNA的方式，特异、高效地抑制基因的表达。由于使用RNA干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于生物医学实验研究及各种疾病的治疗领域。
细胞微粒子
在本发明中，术语“细胞微粒子”、“微粒子”、“微囊泡”可互换使用。
细胞微粒子是机体内细胞在正常和病理状态下都会分泌的直径在30-1000nm之间的膜结构小体，由细胞膜类似的膜结构包裹的、包含细胞内容物的天然小颗粒，包括胞外体(exosome)和脱落微泡(shedding vesicle)两种。体内和体外的实验都证明细胞微粒子可以由红细胞、B细胞、T细胞、树突状细胞、肥大细胞、上皮细胞和肿瘤细胞等多种细胞分泌。细胞把特异的生物活性分子如蛋白质、mRNA等包裹到细胞微粒子中，这些生物活性分子通过细胞微粒子被运输到相应的受体细胞并调节受体细胞的生物功能，这种由细胞微粒子介导的细胞间信息传递在一些生理和病理过程中扮演着十分重要的作用。
本发明所述细胞微粒子包括各种大小在10-500nm之间，由细胞分泌的，具有脂质双层膜的天然生物囊泡，包括胞外体(exosome)、脱落微泡(sheddingvesicle)以及针对各种细胞分泌的脱落微泡(shedding vesicle)的特称。
试剂盒
本发明提供了一种用于促进体细胞和/或主案能干细胞向多能干细胞转化的试剂盒，所述试剂盒包括:
(i)一容器，以及位于所述容器内的外源小RNA分子；
(ii)标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于促进体细胞和/或专能干细胞向多能干细胞的转化。
在一优选实施方式中，所述的试剂盒还包括(iii)pH酸性调节剂，所述pH酸性调节剂用于提供pH为2.5-6.0的酸性pH。
在一优选实施方式中，所述的pH调节剂为酸。
在一优选实施方式中，所述的小RNA分子包括3-100种，较佳地4-50种，更佳地5-20种。
在一优选实施方式中，所述的小RNA分子是独立放置或混合放置的。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的方法通过调整细胞培养环境为酸性，提高了小RNA转染细胞的效率。
(b)本发明的方法毒性小、转染率高，导入的小RNA分子稳定性高。
(c)本发明的方法操作便捷、高效，大大简化了实验室操作的时间和步骤。
(d)本发明首次发现在酸作用下，小RNA分子能够调控至少3种多能干细胞转录因子，促进体细胞和/或专能干细胞向多能干细胞的转化。
(e)本发明首次发现在细胞微粒子的介导下，小RNA分子能够调控至少3种多能干细胞转录因子，促进体细胞向多能干细胞的转化。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1向野生型293T细胞中导入osa-miRNA156a
在本实施例中，实验方法如下：
1)PDL包被
配制250ml 0.01％的多聚赖氨酸：
容器及操作设备灭菌，多聚赖氨酸购自sigma公司。
用移液管将少量PBS加到多聚赖氨酸的小塑料瓶中，然后将溶解的多聚赖氨酸加到200ml左右PBS中。
最后加PBS达250ml，过滤除菌分装于小瓶中，存于4℃备用，长期应保存于-20℃。
2)铺板
使用12孔板，将配制好的0.01％的多聚赖氨酸加入每一孔中，每孔3-4滴，全部加完后将12孔板盖好，置入37℃，5％CO2培养箱中孵育2-4h。
孵育结束后，取出12孔板，用吸管将多聚赖氨酸吸出。换吸管，加PBS，，每孔内3-4滴，冲洗三次。重复上述步骤三次。
12孔板放于培养箱待用。
3)细胞培养
向2个12孔板中铺入293T细胞
培养条件：DMEM培养液(10％FBS,1％双抗)，37℃，5％CO2培养24h。
4)酸性培养液的配制
首先配制实验中使用的DMEM培养液(2％FBS,1％双抗)，并测得其pH7.65，后用盐酸将该培养液调到pH值3.15备用。
5)核酸的转入
转入的核酸选用外源合成的水稻单链microRNA，osa-miR156a(吉玛公司合成，序列UGACAGAAGAGAGUGAGCAC(SEQ ID NO.:12))，水稻osa-miR156a与转入的人源293T细胞差异性大，可以有效避免动物细胞中自有microRNA的干扰，降低实验结果中产生误差的可能性。
分别向pH7.65和pH3.15的培养液中加入osa-miR156a，终浓度为40pmol/ml。
从培养箱取出铺有293T细胞的12孔板，撤去原有培液，在2个12孔板中分别加入上述加有外源miRNA的两种pH值的培养液，37℃孵育0.5h。
上述孵育期间，配制RNase消化液：向DMEM培养液(2％FBS，1％双抗)中加入RNase A(购自Thermo)，体积比例为2μl/ml，即>100u/ml。
上述孵育时间结束后，撤去加有外源miRNA的两种pH值的培养液，PBS洗一遍，加入已配好的RNase消化液，37℃孵育1h，撤去后PBS洗三遍。
用TRI Regent(购自Sigma)裂解细胞，提取总RNA，方法如下：
室温裂解5min；加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡，室温静置5min；16000g、4℃离心15min；将上清液小心吸出，加入2倍体积的异丙醇，混匀，-20℃静置1h或过夜；16000g，4℃，离心15min；弃去上清，加入1ml 75％的乙醇(DEPC水配制)清洗沉淀，16000g，4℃，离心15min；倒掉上清，待沉淀干燥后，加入适量的DEPC水溶解沉淀；计算OD260/OD280以鉴定总RNA浓度和纯度。
6)结果的检测
利用qRT-PCR技术定量检测细胞中的miRNA含量：
实时荧光定量PCR技术，是在PCR的反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累从而实时监测整个PCR进程。鉴于miRNA 21bp的长度，针对每一miRNA均设计一个含相同茎环结构(stem-loop structure)的基因特异性反向引物，逆转得到特异性的cDNA，最后再进行PCR反应。
将上述提取好的RNA和其它反应所需试剂配成逆转录反应体系，按照如下条件进行反应，逆转录反应条件：
步骤1：16℃ 30min
步骤2：42℃ 30min
步骤3：85℃ 5min
步骤4：4℃ forever
按照如上反应获得相应的cDNA后，再将其和其它反应所需试剂配成PCR反应体系，按照如下条件进行反应，获取荧光信号值，实时荧光定量PCR反应条件：
步骤1：95℃ 5min
步骤2：95℃ 15s
步骤3：60℃ 1min
步骤2-步骤3：50个循环
数据的处理使用相对比较法，也被认为是ΔΔCt法。Ct设为反应达到域值时的循环数，而ΔCt＝Ct样品-Ct内参。酸处理的外源microRNA相对于对照野生型植株的表达量可以用方程2-ΔCT表示。
结果如下：
图1显示了两种pH培养基转入细胞内osa-miR156a的相对值，其中pH7.65对照组的相对值为1，结果显示，pH3.15组外源microRNA转化后细胞中外源microRNA含量明显高于pH7.65对照组。
实施例2通过LipofectamineTM 2000与酸诱导转染FAM siRNA
在本实施例中，实验方法如下：
1)LipofectamineTM 2000转染
LipofectamineTM 2000购自Invitrogen，FAM siRNA购自吉玛公司，FAMsiRNA带有荧光基团，转染后可通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪进行检测。操作步骤按照说明书进行，大致步骤如下，
转染前一天接种细胞至12孔板，每孔加入含10％小牛血清的DMEM培养基((不含双抗)400μl，转染时细胞密度应达到90％。
转染前4-6小时更换无血清的培养基(Opti-MEM Ι)，培养4-6小时后，用LipofectamineTM 2000将siRNA转染至细胞，具体步骤入下：
把100pmol的siRNA稀释到45μl的Opti-MEM Ι中，轻轻混匀。
轻轻混匀LipofectamineTM 2000，然后取1μl稀释到49μl的Opti-MEM Ι中，轻轻混匀，室温温育5分钟。
把稀释的siRNA与LipofectamineTM 2000轻轻混匀，室温孵育20分钟，形成复合物。
每孔加入100μl的复合物，前后左右平移培养板使复合物与细胞混匀。
转染后4～6小时(可适当延长此时间)换成含血清的培养液。
2)酸诱导转染FAM siRNA
酸诱导转染FAM siRNA的方法与实施例1所述方法相同。
3)转染效率的检测
FAM是一种绿色荧光基团，有蓝光激发，激发波长480nm，发射波长520nm。
LipofectamineTM 2000转染6小时后可以检测，检测前的细胞处理过程需要避光。检测时，可先使光路对准没有转染FMA siRNA的孔，调好焦距打开激发光。观察时间不宜过长，以避免荧光被猝灭。
成功转染的细胞可见FAM绿色荧光，分散在细胞质中。
结果如下：
图2是LipofectamineTM 2000与酸诱导转染FAM siRNA荧光结果示意图，可见二者转染效率相当，说明酸处理组同样具备高效转染siRNA的能力。
实施例3胎牛血清中富含miRNA
通过solexa测序的方法检测胎牛血清的表达谱。solexa测序的具体操作步骤包括：
(1)收集胎牛血清样本；
(2)通过Trizol试剂提取样本总RNA；
(3)进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子；
(4)将接头引物(adaptor primer)酶联在小RNA分子的3’与5’端；
(5)纯化的DNA直接用于集群生成，利用Illumina Genome Analyzer进行测序分析。
结果表明，胎牛血清中存在大量高表达的动物miRNA(》100拷贝/5ml)，包括miR-432、miR-320、miR-27b、miR-103、miR-423、miR-185、miR-378、miR-130b、let-7g、miR-107。
之前，干细胞中胎牛血清的miRNAs的相关研究几乎没有，胎牛血清在培养过程中，这些循坏miRNA，外源性小RNA很有可能会被吸收进入细胞和组织而发挥作用。
实施例4循环miRNA调控多能干细胞的转录因子
利用生物信息学的方法预测调控多能干细胞的miRNA。
结果表明，有243种microRNA可能参与调控多能干细胞的转录因子。
其中，促进iPSC的miRNA包括：miR-291-3p、miR-294、miR-295、miR-302b、miR-372、miR-200c、miR-302s、miR-369s；促进Wisp1的miRNA包括：miR-486；促进p21的miRNA包括：miR-423-5p；促进AOF1的miRNA包括：miR-320a、miR-130；促进MECP2-1的miRNA包括：miR-185、miR-432、miR-107、miR-103、miR-378、miR-27b、miR-423-3p、miR-877、let-7g。
调控iPSC的转录因子包括：Oct4、MET、Sox2、c-Myc、n-Myc、Klf4、Nanog、Lin28、AOF1、AOF2、MECP1-p66、MECP2、MBD2、p21、p53、Wisp1、ZEB2。
通过生物信息学预测发现胎牛血清中富含的miRNA可以抑制诸如p21,p53等可以阻止体细胞变为多功能干细胞的基因，这提示胎牛血清中富含的miRNA可能会诱导体细胞变为多功能干细胞。
之后，发明人通过大量研究发现，在胎牛血清中表达量较多的miRNAs也存在于干细胞中。通过大量筛选，筛选出11种在干细胞中高表达的miRNA，结果如表1所示。
表1
实施例5通过外源性小RNA制备多能干细胞
通过酸介导、细胞微粒子介导、质粒载体介导等刺激外源性小RNA诱导体细胞转化为多能干细胞，从而来高效制备多能干细胞。
5.1酸介导外源性小RNA制备多能干细胞
利用流式细胞仪技术从小鼠体内分离CD45+造血干细胞，转移106个CD45+造血干细胞于含20％胎牛血清的HBSS培养液(利用盐酸使其PH＝5.7)，在37℃培养25min，随后1000rpm室温离心5min。取部分细胞提取RNA,并利用qRT-PCR技术检测胎牛血清中富含的可能会诱导体细胞变为多功能干细胞的miRNA在酸(如磷酸、硫酸、或醋酸)的处理下是否进入了细胞。
取另一部分细胞定植于没有细胞黏着剂的培养皿中，利用加入1000U白血病抑制因子(Leukaemia Inhibitor Factor,LIF)，2％B27的DMEM/F12培养基培养，在1-10天，每天分离部分细胞检测诸如OCT4等多功能干细胞特异性基因的表达情况，观察并统计多功能干细胞的诱导率。
结果表明，酸介导的外源性小RNA能够调控多功能干细胞特异性基因的表达，并显著增加多功能干细胞的诱导率。
5.2通过质粒转染刺激外源性小RNA制备多能干细胞
利用流式细胞仪技术从小鼠体内分离CD45+造血干细胞，转移106个CD45+造血干细胞于含有1000U白血病抑制因子(Leukaemia Inhibitor Factor,LIF)，2％B27的DMEM/F12培养基中，随后利用脂质体将能够过表达胎牛血清中富含的可能会诱导体细胞变为多功能干细胞的miRNA的质粒装染入细胞中，随后在1-10天，每天分离部分细胞检测诸如OCT4等多功能干细胞特异性基因的表达情况，观察并统计多功能干细胞的诱导率。
在本发明中，多能干细胞的miRNA的质粒表达载体没有特别限制，包括市售的或用常规制备的表达载体。代表性的例子包括(但并不限于)：pcDNATM6.2-GW/miR、pcDNA3、pMIR-REPORT miRNA、pAdTrack-CMV、pCAMBIA3101+pUC-35S、pCMVp-NEO-BAN、pBI121、pBin438、pCAMBIA1301、pSV2、CMV4表达载25体、pmiR-RB-ReportTM、pshOK-basic、mmu-mir 300-399 miRNASelectTM、pshRNA-copGFP Lentivector、GV317、GV309、GV253、GV250、GV249、GV234、GV233、GV232、GV201、GV159或其他GV系列表达载体。
结果表明，质粒介导的外源性小RNA能够调控多功能干细胞特异性基因的表达，并显著增加多功能干细胞的诱导率。
5.3通过细胞微粒子介导刺激外源性小RNA制备多能干细胞
通过超高速离心(100000g,70min),分离胎牛血清中的微囊泡(MV)。然后利用qRT-PCR技术检测MV中miRNA。qRT-PCR具体操作步骤包括：
取100微升血清中的MV，加入300微升DEPC水，混匀后加入200微升水饱和酚，剧烈震荡后加入200微升氯仿，充分震荡，16000g室温下离心15分钟；离心结束后小心吸取上清(约400微升)，加入2倍体积异丙醇，在-20℃静置60分钟，之后16000g，4℃离心20分钟；离心结束后弃上清，加入75％乙醇，轻柔颠倒，16000g，4℃离心20分钟；离心结束后弃上清，加入20微升DEPC水溶解。取2微升RNA进行反转录，之后取1微升cDNA进行real-time PCR检测目标小核酸表达。
将原代细胞培养至合适密度，在培养基中加入胎牛血清中的微囊泡(MV)，细胞培养条件下孵育10-30min，连续培养并观察，直至确认出现干细胞。分离部分细胞检测诸如OCT4等多功能干细胞特异性基因的表达情况，观察并统计多功能干细胞的诱导率。
结果表明，胎牛血清中富含的可能会诱导体细胞变为多功能干细胞的miRNA存在于MV中。细胞微粒子介导刺激胎牛血清miRNA促进体细胞向多能干细胞转化。
本发明提高外源小RNA表达水平或刺激小RNA促进体细胞向多能干细胞转化的方法还包括磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和聚凝胺、机械法(显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂转染法等。
实施例6试剂盒
制备一用于促进体细胞和/或专能干细胞向多能干细胞转化的试剂盒，所述试剂盒包括:
(i)一容器，以及位于所述容器内的外源小RNA分子；
(ii)标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于促进体细胞和/或专能干细胞向多能干细胞的转化。和
(iii)pH酸性调节剂，所述pH酸性调节剂用于提供pH为2.5-6.0的酸性pH。
其中，所述的小RNA分子包括3-100种，较佳地4-50种，更佳地5-20种，优选表1所示的miRNA的一种或一种以上的组合。所述的外源小RNA分子是独立放置或混合放置的。
用上述试剂盒能够调控多能干细胞转录因子的表达；和/或用于促进体细胞和/或专能干细胞向多能干细胞的转化。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种外源性小RNA分子的用途，其特征在于，用于制备促进体细胞或专能干细胞转变为多能干细胞的试剂或试剂盒。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括转染试剂。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述转染试剂为pH酸性调节剂。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的转染试剂为微粒子制剂。
5.一种体外的促进体细胞或专能干细胞转变为多能干细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供一转染体系，所述转染体系包括：(a)缓冲液和/或培养液；(b)体细胞或专能干细胞；和(c)小分子RNA；
(ii)将所述转染体系置于转染条件下，使得所述的小分子RNA转染入所述的体细胞或专能干细胞；以及
(iii)将上一步骤获得的经转染的体细胞或专能干细胞进行诱导培养，从而使得所述体细胞或所述专能干细胞转变为多能干细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中，所述的转染条件包括在酸性pH处理。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(iii)中，包括：将上一步骤获得的经转染的体细胞或专能干细胞转入了所述外源核酸的体细胞，并进行诱导，从而获得多能干细胞。
8.一种用于促进体细胞或专能干细胞转变为多能干细胞的组合物或组合，其特征在于，包括：
(i)外源性的小RNA分子；和
(ii)pH酸性调节剂，所述pH酸性调节剂用于提供pH为2.5-6.0的酸性pH。
9.一种权利要求8所述组合物的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于促进体细胞和/或专能干细胞向多能干细胞的转化。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i)一容器，以及位于所述容器内的外源小RNA分子；
(ii)标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于促进体细胞和/或专能干细胞向多能干细胞的转化。
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