KR20220158052A - Hepes 함유 배지 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 고농도의 HEPES 완충액을 사용한 경우에, 독성을 띠지 않고 세포 배양 가능한 세포 배양용 배지, 당해 배지의 제조 방법, 및 당해 배지를 사용한 세포 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 30mM 이상의 농도에서 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)을 함유하고, 또한, 삼투압이 220 내지 340mOsm/kg인, 세포 배양용 배지 및 당해 배지를 사용한 세포 배양 방법에 의해, 세포 증식율의 향상이 가능해진다.
Description
본 발명은, 세포 배양용 배지, 특히 HEPES를 함유하는 세포 배양용 배지 및 당해 배지의 제조 방법에 관한 것이다.
세포 배양이란, 생체 조직으로부터 분리한 세포를 배양액 중에서 증식·유지하는 것이고, 개개의 세포에 따른 적절한 배양 환경, 배양액, 기재를 선택하여, 생존 환경을 정비하는 것이 중요하다.
생존 환경은 크게 나누어 물리 화학적 환경(예: 온도, pH, 삼투압, 산소 분압 및 이산화탄소 분압) 및 생리학적 환경(예: 호르몬 및 영양소의 농도)이 있고, 이러한 환경(온도 이외)은, 통상 배지의 성분에 의해 제어할 수 있다.
정상적인 포유류 세포계의 대부분은, pH7.4 전후(pH7.3 내지 7.5)에서 양호하게 생육한다. 일반적으로, 이 완충 작용은 배지 중에 완충제/완충액을 포함함으로써 달성된다.
세포 배양용 배지에 포함되는 완충제/완충액으로서는 여러가지 것이 사용되고 있고, 이산화탄소-중탄산염 베이스의 완충액, 인산 완충액, 아세트산-아세트산 나트륨 베이스의 완충액, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산) 완충액, 시트르산 완충액, 트리스-염산 완충액 등이 단독으로, 또는, 조합하여 사용되고 있다.
이산화탄소-중탄산염 베이스의 완충액은, 5% CO2(세포 배양에서의 상투적인 이산화탄소 농도) 분위기 하에서 pH를 조정하고 있으므로, 세포를 인큐베이터에서 출입시킴으로써 pH가 변동되기 쉽다.
한편, HEPES 완충액은, 기체 분압에 관계 없이, pH6.8 내지 8.2란 일정한 pH를 유지하는 것이 가능하다. 이와 같이 우수한 완충 작용이 있으므로, HEPES 완충액은 다른 완충액, 예를 들어 탄산수소 나트륨의 보조적인 역할로 널리 사용되고 있다. 그러나, 그 독성(비특허문헌 1 내지 5)이 우려되어, 대부분은 10 내지 25mM의 범위의 HEPES 농도에서 사용되고 있다(예, DMEM_Lonza 12-708F, DMEM/F-12_Lomza 12-719F, mTeSR STEMCELL Technologies ST-85850).
최근, 재생 의료의 실용화를 지향하여 고밀도 배양법을 탐색하는 가운데, 종래의 완충액 처방으로는 pH 완충 작용이 불충분해질 가능성이 높은 것이 판명되었다. 또한, iPS 세포와 같이 높은 완충능이 필요한 배지에서의 배양이 요구되는 경우도 증가하고 있다.
비특허문헌 1: Poole CA, et al., In Vitro. 1982 Sep; 18(9):755-65.
비특허문헌 2: Zigler JS Jr, et al., In Vitro Cell Dev Biol. 1985 May; 21(5):282-7.
비특허문헌 3: Bowman CM, et al., In Vitro Cell Dev Biol. 1985 Mar; 21(3 Pt 1):140-2.
비특허문헌 4: Hanrahan JW, et al., J Membr Biol. 1990 Jun; 116(1):65-77.
비특허문헌 5: R Depping, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2019, Volume 411, Issue 4, pp 797-802
본 발명은, 완충화 작용의 강화를 기대하여 종래 사용되어 온 농도 이상의 농도에서 HEPES 완충액을 사용한 경우에, 독성을 띠지 않고 세포 배양 가능한 세포 배양용 배지의 제공을 목적으로 한다. 또한 본 발명은, 그러한 세포 배양용 배지의 제조 방법, 및 당해 배지를 이용한 세포 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 우선, 완충 작용의 강화를 기대하여, 세포 배양에 추천되는 농도보다도 높은 HEPES 농도에서의 세포 배양을 시도하였다. 결과, 우려되던 대로, 세포의 생육이 나빠졌다. 한편, 높은 HEPES 농도에서 배양한 경우에는 세포의 생육이 나빠지는 동시에 배지의 삼투압이 지적(至適; 매우 적합한) 범위를 넘는 것을 알 수 있었다. 이러한 지견에 기초하여, 상기 과제를 감안하여 예의 검토한 결과, 고농도의 HEPES 환경 하에서 배양한 경우에서도 삼투압을 지적 범위 내로 조정함으로써 독성의 발현을 억제하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 30mM 이상의 농도에서 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)을 함유하고, 또한, 삼투압이 340mOsm/kg 이하인, 세포 배양용 배지.
[2] 삼투압이 220mOsm/kg 이상인, 상기 [1]에 기재된 배지.
[3] HEPES 농도가 190mM 이하인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 배지.
[4] HEPES 농도가 30mM 이상 190mM 이하인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[5] 세포가 다능성 줄기세포인, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[6] 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 상기 [5]에 기재된 배지.
[7] 기초 배지에 최종 농도가 30mM 이상이 되도록 HEPES를 첨가하고, 또한 340mOsm/kg 이하가 되도록 삼투압을 조정하는 것을 포함하는, 세포 배양용 배지의 제조 방법.
[8] 삼투압이 220mOsm/kg 이상인, 상기 [7] 기재된 방법.
[9] 삼투압의 조정이, 배지 중의 염화 나트륨 농도의 조정에 의해 실시되는, 상기 [8]에 기재된 방법.
[10] HEPES 농도가 190mM 이하인, 상기 [7] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[11] HEPES 농도가 30mM 이상 190mM 이하인, 상기 [7] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[12] 세포가 다능성 줄기세포인, 상기 [7] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[13] 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 상기 [12]에 기재된 방법.
[14] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 세포의 배양 방법.
[15] 세포가 다능성 줄기세포인, 상기 [14]에 기재된 방법.
[16] 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 상기 [15]에 기재된 방법.
[17] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 배지와 세포를 함유하는, 세포 함유 조성물.
[18] 세포가 다능성 줄기세포인, 상기 [17]에 기재된 조성물.
[19] 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 상기 [18]에 기재된 조성물.
[20] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 배지 중에서 세포를 배양하고 증식하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법.
[21] 세포가 다능성 줄기세포인, 상기 [20]에 기재된 방법.
[22] 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 상기 [21]에 기재된 방법.
본 발명에 의하면, 높은 HEPES 농도에 의한 우수한 완충 작용에 의해 pH의 안정성이 향상된 배지의 제공이 가능해진다. 또한, 본 발명의 세포 배양용 배지 및 세포 배양 방법 등에 의해 세포 증식률의 향상이 가능해지므로, 보다 많은 세포, 특히 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포를 얻을 수 있고, 연구나 의료 등에 사용하기 위해 당해 세포를 대량으로 공급하는 것이 가능해진다.
[도 1] 도 1은 1 웰 내의 세포를 전부 박리하고 1ml의 배지에 현탁하여 계수한 생세포 수를 나타내는 그래프이다. (a) 배지 A1 내지 A3(VTN-N)을 이용한 배양에서의 d6 시점의 계수(n=3), (b) 배지 B1 내지 B4(iMatrix), (c) 배지 C1 내지 C4(VTN-N), (d) 배지 C1 내지 C4(iMatrix)를 이용한 배양에서의 d7 시점의 계수(n=3). 세로축은 생세포 수를, 가로축은 배지의 종류를 나타낸다. VTN-N은 rh-VTN-N을 코트한 배양 용기를, iMatrix는 iMatrix-511를 코트한 배양 용기를 사용한 것을 나타낸다.
[도 2] 도 2는, 배지 교환 직전의 배양 상청의 pH값을 나타낸 그래프이다. 배지 B1 내지 B4를 사용한 배양 결과를 나타낸다. 세로축은 pH값을, 가로축은 배양 시간(h)을 나타낸다.
[도 3] 도 3은, 배지 B1 또는 B3을 이용한 인간 iPS 세포 배양에서의 d7 시점의 CD30 항원 양성율을 나타낸 그래프이다(n=3).
[도 4] 도 4는, 배지 B1 또는 B3을 이용하여 3주간 배양한 인간 iPS 세포를 분화 배지로 전환하여 추가로 2주간 배양해서 얻어진 세포에 대하여 미분화 마커 및 분화 마커의 발현량을 각각 조사한 결과를 나타내는 그래프이다(n=3). 배지 B1에서 배양한 세포의 분화 배양 전의 상태를 기준으로 한 상대 발현량으로 나타낸다. 미분화 표지: Nanog, 분화 마커: SOX1, SNAI2, SST.
[도 5] 도 5는, 배지 B1 및 B3의 pH 완충 용량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 6] 도 6은, 배지 교환 직전의 배양 상청의 pH값을 나타낸 그래프이다. 배지 B1' 또는 B3'을 이용한 부유 배양 결과를 나타낸다. 세로축은 pH값을, 가로축은 배양 시간(h)을 나타낸다.
[도 7] 도 7은, 부유 배양 후의 세포 현탁액을 원심 분리하고 배양 상청을 제거하고, Accumax 처리에 의해 싱글 셀화한 후 배지에서 재현탁하여 계수한 생세포 수를 나타내는 그래프이다. 배지 B1' 또는 B3'을 이용한 배양에서의 d4 시점의 계수(n=3). 세로축은 생세포 수를, 가로축은 배지의 종류를 나타낸다.
[도 8] 도 8은, 배지 B1' 또는 B3'을 이용한 인간 iPS 세포의 부유 배양에서의 d4 시점의 미분화 마커의 발현량을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다(n=3). 항원: CD30 항원, TRA-1-60 항원, SSEA-4 항원.
[도 9] 도 9는, 배지 B1' 또는 B3'을 이용한 인간 iPS 세포의 부유 배양에서의 d4 시점의 각 항원(표면 마커) 양성율을 나타낸 그래프이다(n=3). 미분화 마커: Nanog, POU5F1.
[도 10] 도 10은, iMatrix-511을 코트한 배양 용기에 배지 E1 내지 E4를 이용하여 인간 iPS 세포를 파종하고, 계대 배양을 행하여, 계대별 증가율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 2] 도 2는, 배지 교환 직전의 배양 상청의 pH값을 나타낸 그래프이다. 배지 B1 내지 B4를 사용한 배양 결과를 나타낸다. 세로축은 pH값을, 가로축은 배양 시간(h)을 나타낸다.
[도 3] 도 3은, 배지 B1 또는 B3을 이용한 인간 iPS 세포 배양에서의 d7 시점의 CD30 항원 양성율을 나타낸 그래프이다(n=3).
[도 4] 도 4는, 배지 B1 또는 B3을 이용하여 3주간 배양한 인간 iPS 세포를 분화 배지로 전환하여 추가로 2주간 배양해서 얻어진 세포에 대하여 미분화 마커 및 분화 마커의 발현량을 각각 조사한 결과를 나타내는 그래프이다(n=3). 배지 B1에서 배양한 세포의 분화 배양 전의 상태를 기준으로 한 상대 발현량으로 나타낸다. 미분화 표지: Nanog, 분화 마커: SOX1, SNAI2, SST.
[도 5] 도 5는, 배지 B1 및 B3의 pH 완충 용량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 6] 도 6은, 배지 교환 직전의 배양 상청의 pH값을 나타낸 그래프이다. 배지 B1' 또는 B3'을 이용한 부유 배양 결과를 나타낸다. 세로축은 pH값을, 가로축은 배양 시간(h)을 나타낸다.
[도 7] 도 7은, 부유 배양 후의 세포 현탁액을 원심 분리하고 배양 상청을 제거하고, Accumax 처리에 의해 싱글 셀화한 후 배지에서 재현탁하여 계수한 생세포 수를 나타내는 그래프이다. 배지 B1' 또는 B3'을 이용한 배양에서의 d4 시점의 계수(n=3). 세로축은 생세포 수를, 가로축은 배지의 종류를 나타낸다.
[도 8] 도 8은, 배지 B1' 또는 B3'을 이용한 인간 iPS 세포의 부유 배양에서의 d4 시점의 미분화 마커의 발현량을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다(n=3). 항원: CD30 항원, TRA-1-60 항원, SSEA-4 항원.
[도 9] 도 9는, 배지 B1' 또는 B3'을 이용한 인간 iPS 세포의 부유 배양에서의 d4 시점의 각 항원(표면 마커) 양성율을 나타낸 그래프이다(n=3). 미분화 마커: Nanog, POU5F1.
[도 10] 도 10은, iMatrix-511을 코트한 배양 용기에 배지 E1 내지 E4를 이용하여 인간 iPS 세포를 파종하고, 계대 배양을 행하여, 계대별 증가율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는, 특별히 언급하지 않는 한, 당해 분야에서 통상 사용되는 의미를 갖는다.
1. 세포 배양용 배지 및 그 제조 방법
본 발명은, 30mM 이상의 농도에서 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)을 함유하고, 또한, 삼투압이 340mOsm/kg 이하인, 세포 배양용 배지(이하, 「본 발명의 배지」라고 칭하는 경우가 있음) 및 당해 배지의 제조 방법(이하, 「본 발명의 제조 방법」이라고 칭하는 경우가 있음)을 제공한다. 본 발명의 제조 방법은, 구체적으로는, 기초 배지에 최종 농도가 30mM 이상이 되도록 HEPES를 첨가하고, 또한 340mOsm/kg 이하가 되도록 삼투압을 조정함으로써 실시된다. 기초 배지가, 완충제로서 HEPES를 포함하고 있는 경우에는, 본 발명의 배지 중의 HEPES 농도는 기초 배지 중에 포함되는 HEPES를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 HEPES는 pKa가 7.55(20℃)이고, 약 pH6.8 내지 8.2의 범위에서 완충 작용을 갖는 화합물이다. 장시간 빛에 노출되면 과산화수소에 유래하는 독성을 띠므로(비특허문헌 2), 과산화수소의 발생을 피하고, HEPES 및 HEPES를 포함하는 액체(예, HEPES를 포함하는 배지)는 가능한 한 암소에 보존하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지 중의 HEPES 농도는, 완충 작용에 의한 pH의 안정성의 향상을 기대하여 30mM 이상의 농도인 것을 특징으로 한다. 35mM 이상, 40mM 이상인 것도 바람직하다.
삼투압 조정의 관점에서, 본 발명의 배지 중의 HEPES 농도는, 190mM 이하인 것이 바람직하다. 180mM 이하, 170mM 이하, 160mM 이하, 150mM 이하, 140mM 이하, 130mM 이하, 120mM 이하, 110mM 이하, 100mM 이하인 것도 바람직하다.
본 발명의 배지 중의 HEPES 농도는 30mM 이상 190mM 이하인 것이 바람직하다. 35mM 이상 180mM 이하, 40mM 이상 170mM 이하, 40mM 이상 160mM 이하, 40mM 이상 150mM 이하, 40mM 이상 140mM 이하, 40mM 이상 130mM 이하, 40mM 이상 120mM 이하, 40mM 이상 100mM 이하인 것도 바람직하다. 특히 바람직하게는 본 발명의 배지 중의 HEPES 농도는 40mM 이상 160mM 이하이다.
본 명세서에 있어서, 「기초 배지」란, 세포 배양에 필수인 탄소원, 질소원 및 무기염 등을 함유시킨 배지를 말한다. 본 발명의 배지에서 그 구성 성분으로서 사용할 수 있는 기초 배지는 특별히 한정되지 않고, 배양하는 세포종에 따라서 적절히 선택하면 좋다. 기초 배지는, 자체 공지의 방법으로 제조해도 좋고, 시판품을 사용해도 좋다.
사용 가능한 기초 배지로서는, 자체 공지의 것을 들 수 있고, 바람직하게는 당분야에서 통상 사용되는 동물 세포 배양 배지이다. 예를 들어, 둘베코 개변 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM), 햄 F12 배지(Ham's Nutrient Mixture F12), DMEM/F12 배지, 맥코이 5A 배지(McCoy's 5A medium), 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium)(MEM), 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM), α 개변형 이글 최소 필수 배지(alpha Modified Eagle's Minimum Essential Medium)(αMEM), 로즈웰 파크 기념 연구소(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI) 1640 배지, 이스코프 개변 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM), MCDB131 배지, 윌리엄 배지 E(William's Medium E), 피셔 배지(Fischer's Medium) 등을 들 수 있다.
또한, 특히 줄기세포(특히 다능성 줄기세포)의 배양용으로서 본 발명의 배지를 제조하는 경우에 사용되는 기초 배지로서는, STEMPRO(등록상표) hESC SFM 배지(Life Technologies사), mTeSR1 배지(STEMCELL Technologies사), TeSR2 배지(STEMCELL Technologies사), TeSR-E8 배지(STEMCELL Technologies사), 필수 8 배지(Life Technologies사), hES 세포용 HEScGRO(상표) 무혈청 배지 (Millipore사), PluriSTEM(상표) 인간 ES/iPS 배지(EMD Millipore사), NutriStem(등록상표) hESC XF 배지(Biological Industries Israel Beit-Haemek사), NutriStem(상표) XF/FF 배양 배지(Stemgent사), AF NutriStem(등록상표) hESC XF 배지(Biological Industries Israel Beit-Haemek사), S-배지(DS 파마 바이오 메디컬 가부시키가이샤), StemFit(등록상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤), hESF9 배지, hESF-FX 배지, CDM 배지, DEF-CS 500 Xeno-Free 3D 회전 타원체 배양 배지(Spheroid Culture Medium)(Cellartis사), StemFlex 배지(Thermo Fisher Scientific사) 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 배지는, 기초 배지에 더하여, 추가로 세포 증식에 바람직한 성분을 첨가할 수도 있다. 이러한 성분으로서는, 예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등의 당; 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민, 글루탐산 등의 아미노산; 알부민, 트랜스페린 등의 단백질; 글리실글리실글리신, 대두 펩타이드 등의 펩타이드; 혈청; 콜린, 비타민 A, 비타민 B군(티아민, 리보플라빈, 피리독신, 시아노코발라민, 비오틴, 엽산, 판토텐산, 니코틴 아미드 등), 비타민 C, 비타민 E 등의 비타민; 올레산, 아라키돈산, 리놀레산 등의 지방산; 콜레스테롤 등의 지질; 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 황산 마그네슘, 인산 이수소나트륨 등의 무기염; 아연, 구리, 셀레늄 등의 미량 원소; N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신(Tricine) 등의 완충제; 암포테리신 B, 카나마이신, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 페니실린 등의 항생 물질; I형 콜라겐, II형 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신 등의 세포 접착 인자 및 세포외 매트릭스 성분; 인터류킨, 섬유아세포 증식 인자(FGF), 간세포 증식 인자(HGF), 트랜스포밍 증식 인자(TGF)-α, 트랜스포밍 증식 인자(TGF)-β, 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 액티빈 A 등의 사이토카인 및 증식 인자; 덱사메타손, 하이드로코르티손, 에스트라디올, 프로게스테론, 글루카곤, 인슐린 등의 호르몬 등을 들 수 있고, 배양하는 세포의 종류에 따라서 적절한 성분을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 배지는, 기초 배지에 최종 농도가 30mM 이상이 되도록 HEPES를 첨가하고, 또한 340mOsm/kg 이하가 되도록 삼투압을 조정함으로써 실시된다. 기초 배지에 완충제로서 HEPES가 포함되어 있는 경우에는, 그 분량을 뺀 양의 HEPES가 첨가된다. 본 발명의 배지는, 기초 배지에 최종 농도가 30mM 이상이 되도록 HEPES를 첨가하여 제조한다. 최종 농도가 35mM 이상, 40mM 이상이 되도록 하는 것도 바람직하다.
삼투압 조정의 관점에서, 기초 배지로의 HEPES의 첨가는, 최종 농도가 190mM 이하가 되도록 실시되는 것이 바람직하다. 180mM 이하, 170mM 이하, 160mM 이하, 150mM 이하, 140mM 이하, 130mM 이하, 120mM 이하, 110mM 이하, 100mM 이하인 것도 바람직하다.
본 발명의 배지는, 기초 배지에 최종 농도가 30mM 이상 190mM 이하가 되도록 HEPES를 첨가함으로써 제조된다. 35mM 이상 180mM 이하, 40mM 이상 170mM 이하, 40mM 이상 160mM 이하, 40mM 이상 150mM 이하, 40mM 이상 140mM 이하, 40mM 이상 130mM 이하, 40mM 이상 120mM 이하, 40mM 이상 100mM 이하인 것도 바람직하다. 특히 바람직하게는 본 발명의 배지는, 기초 배지에 최종 농도가 40mM 이상 160mM 이하가 되도록 HEPES를 첨가함으로써 제조된다.
바람직한 일 양태에 있어서, D-글루코오스 및 5종의 아미노산(트립토판, 세린, 시스테인(또는 시스틴), 메티오닌, 아르기닌)을 추가로 본 발명의 배지에 첨가해도 좋다. 이들 성분의 첨가량은, 이하의 「2. 세포 배양 방법」에서의 대응 기재를 참고로, 배양의 목적이나 각종 배양 조건(예, 세포 밀도, 배지 교환의 빈도) 등에 입각하여 적절히 설정하면 좋다.
또한, 본 발명의 배지를 줄기세포(특히 다능성 줄기세포)에 적용하는 경우, 바람직한 일 양태에 있어서, bFGF 및/또는 콜린을 추가로 본 발명의 배지에 첨가해도 좋다.
본 발명의 배지는, 지금까지 추천되어 온 농도 이상의 농도에서 HEPES를 함유하는 한편으로, 삼투압이 지적 범위로 조정되어 있는 것을 특징으로 한다.
배지의 삼투압의 측정은 자체 공지의 방법을 사용하면 좋지만, 삼투압의 측정 원리에는, 비점 상승법, 증기압 강하법, 빙점 강하법 등이 있다. 측정 장치로서는, 빙점 강하법이나 증기압 강하법에 의한 간접 측정, 격막식의 삼투압 측정 장치가 이용되고 있다. 본 발명의 배지는, 지금까지 추천되어 온 농도 이상의 농도에서 HEPES를 함유하는 한편으로, 삼투압이 지적 범위로 조정되어 있는 한, 삼투압의 측정 원리/측정 장치는 특별히 한정은 되지 않지만, 적어도, 빙점 강하법의 측정 원리에 의해 측정된 삼투압, 구체적으로는, 실시예에 기재된 방법으로 측정된 삼투압이 일정한 범위로 조정되어 있다.
빙점 강하법의 측정 원리에 의해 측정된 본 발명의 배지의 삼투압은, 340mOsm/kg 이하이면 특별히 한정되지 않고, 바람직하게는 330mOsm/kg 이하, 보다 바람직하게는 320mOsm/kg 이하, 특히 바람직하게는 310mOsm/kg 이하, 한층 바람직하게는 300mOsm/kg 이하이다. 또한, 삼투압의 하한은, 상한이 상기와 같다면 특별히 한정되지 않지만, 통상 220mOsm/kg, 바람직하게는 230mOsm/kg, 보다 바람직하게는 240mOsm/kg, 특히 바람직하게는 250mOsm/kg이다. 일 양태에 있어서, 본 발명의 배지의 삼투압은, 통상 220 내지 340mOsm/kg, 바람직하게는 230 내지 330mOsm/kg, 보다 바람직하게는 240 내지 320mOsm/kg, 더욱 바람직하게는 250 내지 310mOsm/kg, 특히 바람직하게는 250 내지 300mOsm/kg으로 할 수 있다. 본 발명의 다른 일 양태에 있어서, 본 발명의 배지의 삼투압은, 238 내지 340mOsm/kg이다.
배지의 삼투압을 조정하기 위해서는, 예를 들어, 삼투압의 상승에 기여하는 배지 성분(HEPES 이외)의 양을 감소시키는 것이 가능한 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 기초 배지 중의 염화 나트륨 등의 성분의 양을 적량 감소시킴으로써, 원하는 레벨까지 삼투압을 저하시키면 좋다. HEPES 이외의 삼투압의 상승에 기여하는 배지 성분으로서 염화 나트륨을 사용한 경우에는 통상 최종 농도 0 내지 150mM의 범위에서 배지에 첨가할 수 있다. 바람직하게는 최종 농도 2 내지 145mM, 보다 바람직하게는 3 내지 140mM, 한층 바람직하게는 3 내지 130mM의 농도 범위에서 염화 나트륨을 사용한다. 혹은, 기초 배지를 적량의 물로 희석함으로써도, 용이하게 삼투압의 조정이 가능하다.
본 발명의 배지를 적용할 수 있는 세포종은 특별히 한정되지 않는다. 이러한 세포종으로서는, 식물 세포 및 동물 세포를 들 수 있고, 바람직하게는 동물 세포이다. 동물 세포로서는, 예를 들어, 정자나 난자 등의 생식 세포, 생체를 구성하는 체세포, 줄기세포(다능성 줄기세포 등), 전구세포, 생체로부터 분리된 암세포, 생체로부터 분리되어 불사화능을 획득하여 체외에서 안정적으로 유지되는 세포(세포주), 생체로부터 분리되어 인위적으로 유전자 개변이 이루어진 세포, 생체로부터 분리되어 인위적으로 핵이 교환된 세포 등이 포함된다. 생체를 구성하는 체세포의 예로서는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, 섬유아세포, 골수세포, B림프구, T림프구, 호중구, 적혈구, 혈소판, 대식세포, 단구, 골세포, 주피세포, 수상세포, 케라티노사이트, 지방세포, 간엽세포, 상피세포, 표피세포, 내피세포, 혈관내피세포, 간 실질세포, 연골세포, 난구세포, 신경계 세포, 글리아 세포, 뉴런, 올리고덴드로사이트, 마이크로글리아, 성상교세포, 심장세포, 식도세포, 근육세포(예를 들어, 평활근 세포 또는 골격근 세포), 췌장 베타 세포, 멜라닌 세포, 조혈 전구세포(예를 들어, 제대혈 유래의 CD34 양성 세포), 및 단핵 세포 등이 포함된다. 당해 체세포는, 예를 들어 피부, 신장, 비장, 부신, 간장, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 대장, 방광, 전립선, 정소, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 조직, 혈액(제대혈을 포함함), 골수, 심장, 눈, 뇌 또는 신경 조직 등의 임의의 조직으로부터 채취되는 세포가 포함된다.
줄기세포란, 자기 자신을 복제하는 능력과 다른 복수 계통의 세포로 분화하는 능력을 겸비한 세포이고, 그 예로서는, 이하로 한정되는 것은 아니지만, 배성 종양세포, 다능성 줄기세포, 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 근 줄기세포, 생식 줄기세포, 장 줄기세포, 암 줄기세포, 모낭 줄기세포 등이 포함된다.
「다능성 줄기세포」란, 자기 복제능 및 분화/증식능을 갖고, 또한 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 다능성 줄기세포로서는, 배성 줄기세포(ES 세포), 배성 생식세포(EG 세포), 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포), 스트레스나 세포 자극에 의해 유도·선발되는 다능성 줄기세포 등을 들 수 있다. 체세포의 핵을 핵이식함으로써 제작된 초기배(early embryos)를 배양함으로써 수립한 줄기세포도, 다능성 줄기세포로서 또한 바람직하다(Nature, 385, 810(1997); Science, 280, 1256(1998); Nature Biotechnology, 17, 456(1999); Nature, 394, 369(1998); Nature Genetics, 22, 127(1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999); Nature Genetics, 24, 109(2000)). 본 발명에 있어서, 다능성 줄기세포로서 바람직한 것은 iPS 세포이다. iPS 세포인 것의 확인은, iPS 세포의 미분화된 성질에 기인하는 미분화 마커를 지표로 하여 행할 수 있다. 미분화 마커로서는, 알칼리포스파타아제, Oct3/4, Sox2, Nanog, ERas, Esgl 등을 들 수 있다. 이들 미분화 마커를 검출하는 방법으로서는, mRNA를 검출하는 방법(프라이머나 프로브의 이용), 면역학적 검출법(항체나 표지의 이용) 등을 들 수 있다.
세포주란, 생체 외에서의 인위적인 조작에 의해 무한의 증식능을 획득한 세포이고, 그 예로서는, 이하로 한정되는 것은 아니지만, CHO(차이니즈 햄스터 난소 세포주), HCT116, Huh7, HEK293(인간 태아 신장세포), HeLa(인간 자궁암 세포주), HepG2(인간 간암 세포주), UT7/TPO(인간 백혈병 세포주), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, HT-29, AE-1, 3D9, Ns0/1, Jurkat, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five(등록 상표), Vero 등이 포함된다.
바람직한 일 양태에 있어서 세포는 줄기세포, 특히 다능성 줄기세포이고, 보다 바람직하게는 iPS 세포이다.
본 발명의 배지는, 액체의 상태로 제공되어도 좋고, 또한, 사용 시의 농도보다도 농축된 상태나, 동결 건조된 분말 등의 고체의 상태로 제조하고, 사용시에 물 등의 용매로 희석하고, 또는 물 등의 용매에 용해 또는 분산하여 사용하는 양태로 할 수 있다.
2. 세포의 배양 방법 및 세포의 제조 방법
본 발명은 또한, 본 발명의 배지(상술)에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 세포의 배양 방법(이하, 「본 발명의 배양 방법」이라고 칭하는 경우가 있음)을 제공한다. 본 발명의 배지를 이용함으로써, 세포의 증식 효율을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 배지(상술) 중에서 세포를 배양하고 증식하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법(이하, 「본 발명의 제조 방법」이라고 칭하는 경우가 있음)을 제공한다.
본 명세서에 있어서, 「접착 배양」이란, 배양 용기에 접착시켜서, 배양 중에 배양기를 가볍게 흔들어도 세포가 배양액 중에 떠오르지 않는 상태에서 배양하는 것을 의미하고, 구체적으로는 세포 접착에 적합한 표면 가공을 한 배양 용기 또는 세포외 기질로 코팅 처리된 배양 용기를 이용하여 비계 의존적(scaffold-dependent manner)으로 배양하는 방법을 의미한다. 코팅제로서는, 예를 들어, 매트리겔(BD Biosciences), Synthemax(Corning), 젤라틴, 세포외 단백질(예를 들어, 콜라겐, 라미닌(예를 들어, 라미닌 111, 411 또는 511), 헤파란 황산 프로테오글리칸, 및 엔탁틴 등), 또는 당해 세포외 단백질의 단편, 및 이것들의 조합을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「부유 배양」이란, 배양 용기에 대하여 세포가 접착하지 않은 상태에서 행해지는 세포 배양 방법을 말한다. 부유 배양은 3차원 배양법의 일례이다. 본 발명에 있어서, 부유 배양은, 액체 배지에 대한 외부로부터의 압력이나 진동, 또는, 당해 액체 배지 중에서의 진탕이나 회전 조작을 수반해도 좋고, 수반하지 않아도 좋다. 특별히 한정은 되지 않지만, 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리(예를 들어, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)되어 있지 않은 것, 또는, 인공적으로 접착을 억제하는 처리(예를 들어, 폴리하이드록시에틸메타크릴산(poly-HEMA) 또는 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린의 중합체에 의한 코팅 처리)한 것을 배양 용기로서 사용해서 행할 수 있다.
3차원 배양법으로서는, 부유 배양 외에, 연한천, 메틸셀룰로오스, 콜라겐 겔을 기질로서 사용하는 포매 배양, 홀로파이버형(holofiber-type) 바이오리액터나 래디얼 플로형(radial flow-type) 바이오리액터를 이용한 배양 방법 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「고밀도 배양」이란, 일반적인 세포 배양에 있어서 상정되는 세포 밀도(통상 밀도)와 비교하여 높은 세포 밀도에서의 배양을 행한다. 고밀도의 기준은, 세포끼리가 접촉하고 있으면 좋고, 배양 방법(접착 배양/부유 배양)이나 세포의 종류 등에 따라서도 다를 수 있지만, 예를 들어 iPS 세포를 부유 배양하는 경우, 본 명세서에서는 6×105 세포/mL 이상(바람직하게는 2×106 세포/mL 이상)의 밀도에서의 배양이 예시된다.
세포 배양에서의 배지 교환의 빈도는, 일반적으로, 세포 밀도(통상 밀도/고밀도), 배양 방법(접착 배양/부유 배양), 배양되는 세포종, 배지의 조성, 배양 조건(온도, 가스 농도), 교환되는 배지의 양(전량/일부의 양), 배지의 비용, 작업자의 라이프스타일 등의 다종의 조건을 종합적으로 감안해서 결정되지만, 통상 2~3일마다 1회, 1일에 1회, 또는 1일에 복수회(예, 2회) 정도이고, 본 발명의 방법에서도 이러한 빈도에 의해 배지 교환을 행할 수 있다.
배양되는 세포종에 따라서도 다르지만, 세포가 일정 수 이상, 통상 약 80% 이상 컨플루언트(confluent)하게 된 상태에서 계대(繼代)를 행하지만, 계대 후의 세포 배양에서도 본 발명의 배지를 이용할 수 있고, 또한 이용하는 것이 바람직하다.
한편으로, 배지의 삼투압을 세포 증식에 바람직한 범위로 유지한다는 본 발명의 일 측면에 착안하고, 삼투압이 일정 레벨(340mOsm/kg 이하, 330mOsm/kg 이하, 보다 바람직하게는 320mOsm/kg 이하, 특히 바람직하게는 310mOsm/kg 이하, 한층 바람직하게는 300mOsm/kg 이하; 혹은 220 내지 340mOsm/kg, 바람직하게는 230 내지 330mOsm/kg, 보다 바람직하게는 240 내지 320mOsm/kg, 더욱 바람직하게는 250 내지 310mOsm/kg, 특히 바람직하게는 250 내지 300mOsm/kg; 혹은 238 내지 340mOsm/kg)을 일탈한 시점을 배지 교환의 타이밍으로 설정할 수도 있다.
본 발명의 방법을 적합하게 응용할 수 있는 일 실시형태로서는, 바이오리액터 등을 이용한 고밀도 배양을 들 수 있다. 구체적으로는, 바이오리액터 등을 이용하여 고밀도 배양을 행하는 경우, 다수의 세포의 생명 활동에 기인한 배지의 pH의 저하가 생길 수 있다. 본 발명의 배양 방법에서는, 고농도의 HEPES를 함유하는 완충능이 뛰어난 본 발명의 배지를 이용하는 것을 특징으로 하기 때문에, 종래의 배양법에 비해 pH의 저하가 생기기 어렵다.
본 발명의 배양 방법에 있어서, 본 발명의 배지에 의한 교환은, 사용 중인 배지의 전량을 교환해도 좋고, 일부(예를 들어, 사용 중인 배지의 전량에 대하여, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 등)을 교환해도 좋다. 교환되는 배지량에 대해서는, 배지 교환 후의 삼투압이 세포 배양에 적합한 범위(즉 340mOsm/kg 이하, 330mOsm/kg 이하, 보다 바람직하게는 320mOsm/kg 이하, 특히 바람직하게는 310mOsm/kg 이하, 한층 바람직하게는 300mOsm/kg 이하; 혹은 220 내지 340mOsm/kg, 바람직하게는 230 내지 330mOsm/kg, 보다 바람직하게는 240 내지 320mOsm/kg, 더욱 바람직하게는 250 내지 310mOsm/kg, 특히 바람직하게는 250 내지 30OmOsm/kg; 혹은 238 내지 340mOsm/kg)로 할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다.
바람직한 일 양태에 있어서, D-글루코오스 및 5종의 아미노산(트립토판, 세린, 시스테인(또는 시스틴), 메티오닌, 아르기닌)을 추가로 본 발명의 배지에 첨가해도 좋다.
글루코오스(또는 그 염)는, 글루코오스의 농도로 환산해서 통상 0.1g/L/일 내지 900g/L/일, 바람직하게는 1g/L/일 내지 200g/L/일, 보다 바람직하게는 1g/L/일 내지 20g/L/일가 되도록 본 발명의 배지에 첨가할 수 있다.
또한, 5종의 아미노산(트립토판, 세린, 시스테인(시스틴), 메티오닌 및 아르기닌)은, 배지에 대하여, 트립토판의 농도(유리체의 트립토판으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 11000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 세린의 농도(유리체의 세린으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 425000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 시스테인 혹은 시스틴의 농도(유리체의 시스테인으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 280000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 메티오닌의 농도(유리체의 메티오닌으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 55000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 1000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 100mg/L/일, 아르기닌의 농도(유리체의 아르기닌으로 환산한 농도)로 하여 통상 0.1mg/L/일 내지 150000mg/L/일, 바람직하게는 1mg/L/일 내지 2000mg/L/일, 보다 바람직하게는 1mg/L/일 내지 200mg/L/일이 되도록 본 발명의 배지에 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명의 배양 방법을 줄기세포에 적용할 경우, 바람직한 일 양태에 있어서, bFGF 및/또는 콜린을 추가로 본 발명의 배지에 첨가해도 좋다.
본 발명의 배양 방법에 있어서, 배양 조건은 특별히 한정되지 않고, 세포종, 세포 밀도(통상 밀도/고밀도), 배양 방법(접착 배양/부유 배양 등) 등에 따라서 자체 공지의 방법을 선택하면 좋다. 예를 들어, 배양 온도는, 통상 25℃ 내지 39℃, 바람직하게는 33℃ 내지 39℃일 수 있다. 이산화탄소 농도로서는, 통상 4체적% 내지 10체적%, 바람직하게는 4체적% 내지 6체적%일 수 있다. 산소 농도로서는, 통상 1체적% 내지 25체적%, 바람직하게는 4체적% 내지 20체적%일 수 있다.
3. 세포 함유 조성물
본 발명은 또한, 본 발명의 배지(상술)와 세포를 함유하는, 세포 함유 조성물(이하, 「본 발명의 세포 함유 조성물」이라고 칭하는 경우가 있음)을 제공한다.
여기에서, 포함되는 세포는, 생세포이고, 본 발명의 배지 중에서의 배양의 대상이 되는 세포이다. 당해 세포로서는, 상기 「1. 세포 배양용 배지 및 그 제조 방법」에서 예시한 것을 들 수 있다. 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 줄기세포, 특히 바람직하게는 다능성 줄기세포(특히 iPS 세포)이다. 본 발명의 배지 중에서의 배양 전 및 배양 후 중 어느 세포라도 좋다.
이하에 실시예를 나타내어, 본 발명을 보다 상세히 설명하겠지만, 이것들은 본 발명의 범위를 전혀 한정하는 것은 아니다.
실시예
본 실시예에 있어서 삼투압은, GONOTEC사 OSMOMAT(등록상표) 030을 사용하여 MilliQ수, 100 및 500mOsmol/kg 교정 표준기(GONOTEC사)로 교정을 행한 후 측정하였다. 본 측정 장치는 빙점 강하법의 측정 원리에 기초한다.
실시예 1
(배지 제조)
삼투압 조정하지 않고, HEPES 농도를 변화시킨 배지(표 1)
DMEM/F-12(ThermoFisher SCIENTIFIC, 12500)(10g)과 MilliQ수, Essential 8TM 보충물(ThermoFisher SCIENTIFIC)(10ml)을 혼합하였다. NaHCO3 수용액(Sigma Aldrich)을 최종 농도 20.75mM, HEPES 수용액(Sigma Aldrich)을 최종 농도 15 내지 60mM가 되도록 첨가하였다. 1M 수산화 나트륨 수용액 또는 1M 염산을 사용하여 pH를 7.4±0.15로 조정하였다. pH는 메틀러-톨레도사 SevenExcellence를 이용하여 실온에서 측정하였다.
[표 1]
삼투압 조정을 하여, HEPES 농도를 변화시킨 배지(표 2)
StemFit(등록상표) AK03N(아지노모토 가부시키가이샤)에 HEPES 수용액을 최종 농도 12 내지 153mM이 되도록 첨가하였다. 1M 수산화 나트륨 수용액 또는 1M 염산을 사용하여 pH를 7.4±0.15로 조정하였다. 이 때, 삼투압을 표 2에 나타낸 임의의 값이 되도록 염화 나트륨 농도를 조정하였다.
[표 2]
시험 방법
rh-VTN-N(Gibco(등록상표)) 또는 iMatrix-511(nippi)를 코트한 배양 용기에 피험 배지(A1 내지 A3, B1 내지 B4, C1 내지 C4, D1 내지 D4)(1.5ml/웰), Y-27632(Wako) 10μM을 첨가하고, 인간 iPS 세포(iPS 아카데미아 재팬, 201B7주)를 2.0×104 또는 1.3×104 세포/웰로 파종하였다. 배양은 37℃, 5% CO2의 조건으로 행하였다. 파종으로부터 24시간 후에, Y-27632를 첨가하지 않은 피험 배지로 교환하고, 그 후 1 내지 3일 이내에 1회 배지 교환을 행하였다. 매회, 배지 교환 직전에 배양 상청을 샘플링하여 10분 이내에 실온에서 pH를 측정하였다. 6일째(d6) 또는 7일째(d7)에 각 웰의 세포를 TrypLETM select CTSTM(Gibco(등록상표))를 이용하여 박리하고, 현탁액 중의 세포를 생사세포 오토 애널라이저 Vi-CELL(BECKMAN COULTER)에 의해 계수하였다.
형태 관찰
삼투압 조정을 하지 않고 HEPES 농도를 변화시킨 배지(A1 내지 A3)를 이용한 경우, 및 염화 나트륨 농도에 의해 삼투압 조정을 하여 HEPES 농도를 변화시킨 배지(B1 내지 B4, C1 내지 C4, D1 내지 D4)를 이용한 경우에 대하여, 공초점 현미경(OLYMPUS CKX41)에 의한 관찰로부터, 어느 그룹에서도 세포나 콜로니의 형태에 큰 이상은 보이지 않았다.
생세포 수
배지 A1 내지 A3을 이용한 배양에서의 d6 시점의 생세포 수를 도 1(a)에 나타내었다. HEPES 농도를 높임에 따라, 즉 삼투압 상승에 따라 생세포 수가 감소하려는 경향이 보였다. HEPES를 60mM 첨가한 배지(A3)에서는, 삼투압이 351mOsm/kg까지 상승하였다.
다양한 삼투압으로 조정한 배지 B1 내지 B4, C1 내지 C4, D1 내지 D4를 이용한 배양에서의 d7 시점의 생세포 수를 도 1(b), (c) 및 (d)에 나타내었다.
삼투압을 낮게 유지하면서 제조한 경우, HEPES를 43, 73mM 첨가한 배지(B2, B3)에 있어서, 12mM(B1)보다도 높은 생세포 수가 얻어졌다. HEPES를 153mM 첨가한 배지 (B4)에서도 삼투압은 310mOsm/kg으로 억제되고, 충분히 높은 생세포 수가 얻어졌다. 이상으로부터 배지에 고농도의 HEPES를 첨가해도, 삼투압을 조절함으로써, 세포 독성을 억제하고 pH 안정화 효과에 의해 세포 증식률이 향상되는 것이 실증되었다.
높은 삼투압 373mOsm/kg을 나타내는 배지 D4에서는, 다른 그룹과 비교하여 세포 증식률이 낮았다.
pH 변화
배지 B1 내지 B4를 이용한 세포 배양에 있어서, 배지 교환 직전의 배양 상청의 pH를 측정하고, 배양 시간에 대하여 플롯한 것을 도 2에 나타내었다. HEPES 농도가 높아질수록 배양 시간에 대하여 pH값이 안정되는 모습이 보였다. 일반적으로 세포 수가 많아질수록 젖산 생산량이 증대하고 pH는 저하되지만, 가장 생세포 수가 많았던 B2, B3 배지에서도 안정된 pH값을 나타내고 있고, 높은 완충 작용이 확인되었다.
미분화율의 평가
iMatrix-511(nippi)를 코트한 6-웰 플레이트에 배지 B1 및 B3(1.5 mL/웰), Y-27632(10μM)를 첨가하고, 인간 iPS 세포(201B7주)를 1.3×104 세포/웰로 파종하였다. 배양은 37℃, 5% CO2의 조건 하에서, n=3에서 실시하였다. 파종으로부터 24시간 후에, Y-27632를 첨가하지 않은 배지에 교환하고, 그 후 1 내지 3일 이내에 1회 배지 교환을 행하였다. 7일째에, 다음의 수순에 따라 표면 마커 분석을 행하였다. 아쿠타아제(Accutase)를 이용하여 각 웰의 세포를 박리하고, 가려낸 2.0×105 세포를 버퍼로 세정한 후, 5배 희석한 PE 마우스 항-인간 CD30(BD PharmingenTM) 또는 PE 마우스 IgG1, κ 이소타입 Ctrl(ICFC) 항체(Biolegend)을 20μL 첨가하고, 20분간 정치하였다. 그 후 버퍼로 복수 세정하고 Guava(등록상표) easyCyteTM 플로 사이토미터(Luminex)를 이용하여 분석하였다. 얻어진 CD30 항원 양성율(도 3)로부터, 배지 B1 및 B3에서 배양한 세포는 모두 높은 미분화율을 유지하고 있는 것이 나타났다.
3배엽 분화 포텐셜의 평가
배지 B1 및 B3을 이용하여 3주간 배양한 iPS 세포(201B7주)를 분화 배지로 전환하여 추가로 2주간 배양해서 얻어진 세포에 대하여, 미분화 마커 및 분화 마커 발현량의 변화를 평가하였다. 분화 배양은 다음의 수순에 따라서 실시하였다. 분화 배지에는 분화용 범용 분화 배지 StemFit(아지노모토 가부시키가이샤, AS401)과 DMEM/F12(1:1)(Thermo Fisher Scientific)를 1:4의 체적비로 혼합한 것을 이용하였다. 96-웰 플레이트(스미토모 베이크라이트 가부시키가이샤, PrimeSurface(등록상표) 96 Slit-well Plate)에 Y-27632를 10μM 포함하는 분화 배지에 현탁한 세포를 2×104 세포/웰이 되도록 첨가함으로써 배엽체를 형성시키고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 2주간 배양하였다. 배양은 n=3에서 실시하였다. 파종으로부터 2일 후에 Y-27632를 첨가하지 않은 분화 배지에 7할 교환하고, 그후 1 내지 3일 이내에 1회 7할 배지 교환을 행하였다. 분화 배양 전의 세포 및 분화 배양 14일째(d14)에 얻어진 배엽체로부터, Maxwell(등록상표) 16 LEV simplyRNA 정제 키트(Promega)을 이용하여 RNA를 추출 및 정제하였다. 또한 PrimeScript(등록상표) RT Master Mix(타카라 바이오)를 이용하여 역전사를 행하였다. 미분화 마커로서 Nanog, 3배엽 분화 마커로서 SOX1, SNAI2, SST의 SYBR(등록 상표) Green용 프라이머를 사용하고, 실시간 PCR 써멀 사이클러에 의해 각 유전자의 발현량을 평가하였다. 배지 B1에서 배양된 세포의 분화 배양 전의 상태를 기준으로 한 상대 발현량을 도 4에 나타내었다.
도 4로부터 분화 배양 전에 배지 B3에서 배양된 세포는, 배지 B1에서 배양한 세포와 같은 정도의 미분화 마커를 발현하고 있는 것이 나타났다. 또한 배엽체를 형성시킨 분화 배양에 의해 미분화 마커가 감소하고 3배엽 분화 마커가 상승하는 경향이 확인되었다. 이상으로부터 배지 B3에서 3주간 배양한 세포는 배지 B1과 동일한 미분화도 및 3배엽 분화 포텐셜을 갖고 있는 것이 시사되었다.
pH 완충 용량(완충능)의 비교
50mL 측량한 배지 B1 또는 B3에 대하여, 자동 적정 장치(히라누마 산교, COM-1600)를 이용하여 0.1N 염산(쥰세이 카가쿠)에 의한 적정을 행하였다. 염산 적하량에 대한 pH값의 변화를 도 5에 나타내었다. pH 7.4에서 6.6까지의 범위에서, 염산 적하량에 대하여 pH는 직선적으로 감소하고 있고, 그 기울기로부터 배지 B3는 B1의 약 3.5배의 pH 완충 용량을 갖고 있는 것이 시사되었다.
실시예 2
부유 배양
실시예 1과 동일한 수법으로, 삼투압 조정을 하여, HEPES 농도를 변화시킨 배지 B1' 및 B3'를 제작하였다.
[표 3]
30-mL 바이오 리액터(Biott, BWV-S03A)에 배지 B1' 및 B3'(30mL), Y-27632(10μM)를 첨가하고 iPS 세포(1210B2주)를 1.8×107 세포로 파종하였다. 37℃, 5% CO2 조건 하에서 120rpm의 속도로 교반 배양하였다. 배양은 n=3에서 실시하였다. 파종으로부터 2일 후 및 3일 후에 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지를 이용하여 7할 배지 교환을 행하였다. 2일째의 배지 교환시에 배양 상청의 pH를 계측하였다(도 6). 파종으로부터 4일 후에 원심 분리에 의해 배양 상청을 제거하고, Accumax 처리에 의해 싱글 셀화한 후 배지에서 재현탁하고, Vi-CELL에 의해 생세포 수를 계측하였다(도 7). 파종으로부터 4일 후의 세포에 대하여, 다음의 수순에 따라 표면 마커 분석을 행하였다. 가려낸 세포 샘플 2×105 세포를 버퍼로 세정한 후, 10배 희석한 PE 마우스 항-인간 CD30(BD PharmingenTM), PE 마우스 IgG1, κ 이소타입 Ctrl(ICFC) 항체(Biolegend), 5배 희석한 Alexa Fluor(등록상표) 647 마우스 항-인간 TRA-1-60 항원(BD PharmingenTM), Alexa Fluor(등록상표) 647 마우스 IgG1 κ 이소타입 대조군(BD PharmingenTM)을 각각 20μL 첨가하고 20분간 정치하였다. 그 후 버퍼로 수회 세정하고 Attune NxT 플로사이토미터(Flow Cytometer)(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 분석하였다. 별도, 가려낸 세포 샘플 2×105 세포를 버퍼로 세정한 후, BD Cytofix/CytopermTM 고정/투과 키트(Fixation/Permeablization kit)를 이용하여 고정 처리를 행하고, 10배 희석한 Alexa Fluor(등록상표) 647 마우스 항-SSEA-4(BD PharmingenTM), Alexa Flour(등록상표) 647 마우스 IgG1 κ 이소타입 대조군(BD PharmingenTM)을 각각 20μL 첨가하고 20분간 정치하였다. 그 후 버퍼로 수회 세정하고, 동일하게 분석을 행하였다. 각 마커 양성율을 도 8에 나타내었다. qPCR 측정에 대해서는, 미분화 마커로서 Nanog 및 POU5F1의 TaqMan 프로브를 이용하여 전 항와 동일한 수순으로 실시하였다. 배지 B1'을 기준으로 한 각 대상 유전자의 상대 발현량을 도 9에 나타내었다.
도 7로부터 4일간의 배양에서 HEPES를 고농도 포함하는 배지 (B3')를 이용함으로써 B1의 약 1.9배의 생세포 수가 얻어지는 것이 나타났다. 또한 도 6으로부터 2일째 시점에서 배지 B3'은 B1'보다도 상청의 pH가 높게 유지되어 있는 것이 나타났다.
도 8 내지 9로부터 배지 B1'과 B3'의 각 표면 마커 양성율이 같은 정도인 것, 및 미분화 유전자 발현량이 같은 정도인 것으로부터, HEPES 고농도화에 의한 미분화율에 대한 영향은 없는 것이 시사되었다.
실시예 3
완충능을 증강한 Essential 8
TM
Essential 8TM의 기초 배지 대신에 DMEM/F-12(NaCl, HEPES, NaHCO3 불포함)(Thermo Fisher Scientific)를 이용하고, 이것에 Essential 8TM 보충물을 첨가함으로써 저삼투압 Essential 8TM 배지를 제조하였다. 탄산수소 나트륨을 최종 농도 21mM가 되도록 첨가하였다. 또한 표 4에 나타낸 HEPES 최종 농도, 삼투압이 되도록 HEPES 및 염화 나트륨을 첨가하여, 배지 E1 내지 E4를 얻었다.
[표 4]
iMatrix-511을 코트한 6-웰 플레이트에 배지 E1 내지 E4(1.5mL/웰), Y-27632(10μM)를 첨가하고, 인간 iPS 세포(201B7주)를 1.3×104 세포/웰 파종하였다. 배양은 37℃, 5% CO2 조건 하에서, n=3에서 실시하였다. 파종으로부터 24시간 후에, Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에 교환하고, 그 후 1 내지 3일 이내에 1회 배지 교환을 행하였다. 7일 후에 각 웰의 세포를 TrypLETMselect CTSTM을 이용하여 박리하고, 새로운 6-웰 플레이트에 파종함으로써 계대하였다.
계대별 증가 배율(도 10)로부터, HEPES를 75mM 포함하는 배지 E3는, 15mM 포함하는 배지 E1보다도 높은 증가 배율을 나타내고 있고, 3계대 누계로 약 7.6배의 생세포 수가 얻어졌다. 이상으로부터 HEPES 농도의 증가에 의해 세포 증식률이 향상되는 것이 시사되었다.
본 발명에 의하면, 높은 HEPES 농도에 의한 우수한 완충 작용에 의해 pH의 안정성이 향상된 배지의 제공이 가능해진다. 또한, 본 발명의 세포 배양용 배지 및 세포 배양 방법 등에 의해 세포 증식률의 향상이 가능해지므로, 보다 많은 세포, 특히 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포를 얻을 수 있고, 연구나 의료 등에 사용하기 위해 당해 세포를 대량으로 공급하는 것이 가능해진다.
본 출원은, 2020년 3월 25일자로 출원된 일본 특원2020-054572를 기초로 하고 있고, 여기서 언급함으로써 그 내용은 전부 본 명세서에 포함된다.
Claims (22)
- 30mM이상의 농도에서 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)을 함유하고, 또한, 삼투압이 340mOsm/kg 이하인, 세포 배양용 배지.
- 제1항에 있어서, 삼투압이 220mOsm/kg 이상인, 배지.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, HEPES 농도가 190mM 이하인, 배지.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HEPES 농도가 30mM 이상 190mM 이하인, 배지.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 다능성 줄기세포인, 배지.
- 제5항에 있어서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 배지.
- 기초 배지에 최종 농도가 30mM 이상이 되도록 HEPES를 첨가하고, 또한 340mOsm/kg 이하가 되도록 삼투압을 조정하는 것을 포함하는, 세포 배양용 배지의 제조 방법.
- 제7항에 있어서, 삼투압이 220mOsm/kg 이상인, 방법.
- 제8항에 있어서, 삼투압의 조정이, 배지 중의 염화 나트륨 농도의 조정에 의해 실시되는, 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, HEPES 농도가 190mM 이하인, 방법.
- 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, HEPES 농도가 30mM 이상 190mM 이하인, 방법.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 다능성 줄기세포인, 방법.
- 제12항에 있어서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 세포의 배양 방법.
- 제14항에 있어서, 세포가 다능성 줄기세포인, 방법.
- 제15항에 있어서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 배지와 세포를 함유하는, 세포 함유 조성물.
- 제17항에 있어서, 세포가 다능성 줄기세포인, 조성물.
- 제18항에 있어서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 배지 중에서 세포를 배양하고 증식하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 세포가 다능성 줄기세포인, 방법.
- 제21항에 있어서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, 방법.
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