WO2020203768A1 - 細胞培養用足場材料及び細胞培養用容器 - Google Patents

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WO2020203768A1
WO2020203768A1 PCT/JP2020/014012 JP2020014012W WO2020203768A1 WO 2020203768 A1 WO2020203768 A1 WO 2020203768A1 JP 2020014012 W JP2020014012 W JP 2020014012W WO 2020203768 A1 WO2020203768 A1 WO 2020203768A1
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group
skeleton
cell culture
polydentate
hydrogen
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PCT/JP2020/014012
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博貴 井口
雄太 中村
亮馬 石井
悠平 新井
聡 羽根田
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積水化学工業株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2533/30—Synthetic polymers
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    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture scaffold material used for culturing cells.
  • the present invention also relates to a cell culture container using the above cell culture scaffold material.
  • Animal cells such as humans, mice, rats, pigs, cows and monkeys are used in research and development in academic fields, drug discovery fields, regenerative medicine fields and the like.
  • an adhesive protein such as laminin and vitronectin
  • a natural polymer material such as Matrigel derived from mouse sarcoma are used.
  • Patent Document 1 a cell composed of a molded product made of a polyvinyl acetal compound or a molded product made of the polyvinyl acetal compound and a water-soluble polysaccharide, and the acetalization degree of the polyvinyl acetal compound is 20 to 60 mol%. Culture carriers are disclosed.
  • Patent Document 2 discloses a composition (scaffolding material) containing a first fibrous polymer scaffolding material and in which the fibers of the first fibrous polymer scaffolding material are aligned. Aliphatic polyester and the like are used as the material of this fiber polymer.
  • Patent Document 3 describes a cell culture method for maintaining the undifferentiated state of pluripotent stem cells, which is pluripotent on an incubator having a surface coated with a polyrotaxan block copolymer. A method including the step of culturing stem cells is disclosed.
  • a cell mass may be seeded on a scaffold material and cultured.
  • a natural polymer material as the scaffold material, the colonization of cells after seeding can be enhanced.
  • natural polymer materials are expensive, have large variations between lots because they are naturally derived substances, and have safety concerns due to animal-derived components.
  • the scaffolding material using the synthetic resin as described in Patent Documents 1 to 3 is cheaper than the scaffolding material using the natural polymer material, the variation between lots is small, and the safety is excellent. ..
  • the synthetic resin has a low affinity between the synthetic resin and cells and a highly hydrophilic synthetic resin is used. There is a problem that the resin swells excessively and the seeded cell mass easily peels off from the scaffold material during culturing, resulting in low cell fixability.
  • An object of the present invention is to provide a scaffold material for cell culture having excellent cell colonization. Another object of the present invention is to provide a cell culture container using the above cell culture scaffold material.
  • R represents a group having 50 or less carbon atoms
  • a i represents an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a sulfone group, an imino group, or a thiol group
  • i represents a natural number
  • n represents an integer of 2 or more and 4 or less
  • * represents a bonding position with another atom constituting the graft chain.
  • a i may be the same or different.
  • the polydentate hydrogen bond group is represented by the following formula (2), the following formula (3) or the following formula (4). It is a sex group.
  • R 1 represents a group having a cyclic skeleton and having 50 or less carbon atoms
  • a 1 and A 2 are an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a sulfone group, an imino group, or an imino group, respectively. It represents a thiol group, and * represents a bonding site with other atoms constituting the graft chain.
  • a 1 and A 2 may be the same or different from each other.
  • R 1 represents a group having a cyclic skeleton and having 50 or less carbon atoms
  • R 2 represents a boron atom, a phosphorus atom, a silicon atom, a nitrogen atom, or a metal atom
  • a 1 And A 2 represent an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a sulfone group, an imino group, or a thiol group, respectively, and * represents a bonding site with another atom constituting the graft chain.
  • a 1 and A 2 may be the same or different from each other.
  • R 3 represents a group having a chain skeleton and having 50 or less carbon atoms
  • a 1 and A 2 are an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a sulfone group and an imino group, respectively.
  • it represents a thiol group
  • * represents a bonding site with another atom constituting the graft chain.
  • a 1 and A 2 may be the same or different from each other.
  • the polydentate hydrogen-bonding group is a polydentate hydrogen-bonding group represented by the formula (2) or the formula (3).
  • the polydentate hydrogen bonding group has two or more functional groups of at least one selected from the group consisting of an amino group, a carboxyl group, and a hydroxyl group. ..
  • the polydentate hydrogen binding group comprises a catechol skeleton, a phenylenediamine skeleton, a phenylboronic acid skeleton, a naphthalene boronic acid skeleton, a glycerol skeleton, an ethylene glycol skeleton, and It has at least one skeleton selected from the group consisting of glycine derivative skeletons.
  • the cell culture scaffold material is substantially free of animal-derived material.
  • the ratio of the structural unit having a polydentate hydrogen-bonding group to 100 mol% of the total structural unit of the synthetic resin is 1 mol% or more, 30 mol. % Or less.
  • the synthetic resin is a polyvinyl alcohol derivative or a poly (meth) acrylic acid ester derivative.
  • the synthetic resin has a polyvinyl acetal skeleton or a poly (meth) acrylic acid ester skeleton.
  • the synthetic resin has a polyvinyl acetal skeleton.
  • a cell culture container comprising a container body and the cell culture scaffold material described above, wherein the cell culture scaffold material is arranged on the surface of the container body. Will be done.
  • the present invention it is possible to provide a scaffold material for cell culture having excellent cell colonization. Further, according to the present invention, it is possible to provide a cell culture container using the above-mentioned cell culture scaffold material.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view schematically showing a cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining an estimation mechanism in which cell colonization is improved when cells are cultured using the cell culture scaffold material according to the present invention.
  • the cell culture scaffold material according to the present invention is used for culturing cells.
  • the scaffold material for cell culture according to the present invention has a polydentate hydrogen-bonding group represented by the following formula (1) on the side chain of the graft chain (hereinafter, may be abbreviated as "polydentate hydrogen-bonding group").
  • the polydentate hydrogen bond group is a group capable of forming two or more hydrogen bonds.
  • R represents a group having 50 or less carbon atoms
  • a i represents an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a sulfone group, an imino group, or a thiol group
  • i represents a natural number
  • n represents an integer of 2 or more and 4 or less
  • * represents the bonding position with other atoms constituting the graft chain.
  • Ai may be the same or different.
  • R may be a group having a cyclic skeleton or a group having a chain skeleton. From the viewpoint of further enhancing the cell colonization, R is preferably a group having a cyclic skeleton in the above formula (1).
  • the carbon number of R in the above formula (1) is preferably 45 or less, more preferably 30 or less, still more preferably 20 or less.
  • Ai is an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a sulfone group, an imino group, or a thiol group. It From the viewpoint of exhibiting the effects of the present invention more effectively, in formula (1), A i is at least one functional group amino group, selected from carboxyl group, and the group consisting of hydroxyl group Is more preferable, and at least one functional group selected from the group consisting of an amino group and a hydroxyl group is more preferable, and a hydroxyl group is further preferable.
  • the polydentate hydrogen-bonding group represented by the above formula (1) is at least one selected from the group consisting of an amino group, a carboxyl group, and a hydroxyl group. It is preferable to have one or more functional groups of, and more preferably two or more. From the viewpoint of exerting the effect of the present invention even more effectively, the polydentate hydrogen-bonding group represented by the above formula (1) includes at least one functional group selected from the group consisting of an amino group and a hydroxyl group. It is preferable to have one or more, more preferably one or more hydroxyl groups, and further preferably two or more hydroxyl groups.
  • n is an integer of 2 or more and 4 or less. From the viewpoint of exerting the effect of the present invention more effectively, n is preferably 2 or 3 in the above formula (1), and more preferably 2. Therefore, the multidentate hydrogen bonding group has preferably 2 or 3 and A i, and more preferably has two.
  • the number of atoms present between the above formula (1), and any A i, and its neighboring A i is preferably 4 Below, it is more preferably 3 or less, still more preferably 2 or 1.
  • the number of atoms existing between an arbitrary A i and the adjacent A i means the number of atoms connecting these two A i at the shortest.
  • the number of atoms present between the neighboring A i is two, and the atoms to which one of A i are attached and the other of A i are bound It means that it is bonded to an atom.
  • the fact that the number of atoms existing between an arbitrary A i and the adjacent A i is one means that one A i and the other A i are bonded to the same atom.
  • the polydentate hydrogen-bonding group represented by the above formula (1) is represented by the following formula (2), the following formula (3) or the following formula (4). It is preferably a polydentate hydrogen-bonding group represented by, and more preferably a polydentate hydrogen-bonding group represented by the following formula (2) or the following formula (3).
  • R 1 represents a group having a cyclic skeleton and having 50 or less carbon atoms
  • a 1 and A 2 are an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a sulfone group, an imino group, or an imino group, respectively. It represents a thiol group, and * represents a bonding site with other atoms constituting the graft chain.
  • a 1 and A 2 may be the same or different from each other.
  • examples of R 1 include a group having an aromatic ring and a group having an aliphatic ring.
  • the aliphatic ring may have a double bond in a part of the ring.
  • the group having an aromatic ring examples include a group having a phenyl skeleton, a group having a naphthyl skeleton, and a group having an anthryl skeleton. From the viewpoint of enhancing the adhesiveness with cells, the group having an aromatic ring is preferably a group having a phenyl skeleton or a group having a naphthyl skeleton, and more preferably a group having a phenyl skeleton.
  • Examples of the group having an aliphatic ring include a cyclobutyl group, a cyclopentyl group and a cyclohexyl group. From the viewpoint of enhancing the adhesiveness to cells, the group having an aliphatic ring is preferably a cyclopentyl group or a cyclohexyl group.
  • the number of atoms existing between A 1 and A 2 in the above formula (2) is preferably 4 or less, more preferably 3.
  • the number is less than, more preferably two.
  • the number of atoms present between the A 1 and A 2 which means the number of atoms connecting the A 1 and A 2 in the shortest.
  • the fact that the number of atoms existing between A 1 and A 2 is two means that the atom to which A 1 is bonded and the atom to which A 2 is bonded are bonded. To do.
  • a 1 and A 2 are bonded to two adjacent atoms constituting the cyclic skeleton of R 1 , respectively. Is particularly preferable.
  • Examples of the polydentate hydrogen-bonding group represented by the above formula (2) include a group having a catechol skeleton, a group having a phenylenediamine skeleton, and the like. From the viewpoint of enhancing cell colonization, the polydentate hydrogen-bonding group represented by the above formula (2) is preferably a group having a catechol skeleton.
  • R 1 represents a group having a cyclic skeleton and having 50 or less carbon atoms
  • R 2 represents a boron atom, a phosphorus atom, a silicon atom, a nitrogen atom, or a metal atom
  • a 1 And A 2 represent an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a sulfone group, an imino group, or a thiol group, respectively, and * represents a bonding site with another atom constituting the graft chain.
  • a 1 and A 2 may be the same or different from each other.
  • examples of the metal atom include a platinum atom and an aluminum atom.
  • R 2 is preferably a boron atom, a phosphorus atom, a silicon atom, or a nitrogen atom, and is a boron atom. Is more preferable.
  • Examples of the polydentate hydrogen-bonding group represented by the above formula (3) include a group having a phenylboronic acid skeleton, a group having a naphthalene boronic acid skeleton, and the like. From the viewpoint of enhancing cell colonization, the polydentate hydrogen-bonding group represented by the above formula (3) is preferably a group having a phenylboronic acid skeleton.
  • R 3 represents a group having a chain skeleton and having 50 or less carbon atoms
  • a 1 and A 2 are an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a sulfone group, an imino group, or It represents a thiol group
  • * represents a bonding site with other atoms constituting the graft chain.
  • a 1 and A 2 may be the same or different from each other.
  • R 3 may be a group having a linear backbone is a straight chain, may be a group having a chain backbone having a branched chain. Examples of the R 3 include an alkyl group having 50 or less carbon atoms.
  • the number of atoms existing between A 1 and A 2 in the above formula (4) is preferably 4 or less, more preferably 3.
  • the number is less than, more preferably two.
  • the number of atoms present between the A 1 and A 2 which means the number of atoms connecting the A 1 and A 2 in the shortest.
  • the fact that the number of atoms existing between A 1 and A 2 is two means that the atom to which A 1 is bonded and the atom to which A 2 is bonded are bonded. ..
  • Examples of the polydentate hydrogen-bonding group represented by the above formula (4) include a group having a glycerol skeleton, a group having an ethylene glycol skeleton, and a glycine derivative skeleton (a carboxyl group and an amino group are bonded to the terminal carbon.
  • a group having a structure) and the like can be mentioned.
  • the polydentate hydrogen-bonding group preferably has a cyclic skeleton.
  • the cyclic skeleton include an aromatic ring skeleton and an alicyclic skeleton.
  • the alicyclic skeleton may be a saturated alicyclic skeleton having no double bond, or an unsaturated alicyclic skeleton having a double bond.
  • the cyclic skeleton may contain atoms other than carbon atoms in the atoms constituting the cyclic skeleton.
  • the number of atoms constituting the cyclic skeleton is preferably 5 or more, more preferably 10 or more, preferably 40 or less, and more preferably 30 or less.
  • the polydentate hydrogen-binding group includes a catechol skeleton, a phenylenediamine skeleton, a phenylboronic acid skeleton, a naphthaleneboronic acid skeleton, a glycerol skeleton, an ethylene glycol skeleton, and It is preferable to have at least one skeleton selected from the group consisting of glycine derivative skeletons.
  • hydrogen bonding functional group (A i) may be directly bonded to atoms constituting the cyclic skeleton may not be directly bonded .
  • the polydentate hydrogen-bonding group has a cyclic skeleton
  • the polydentate hydrogen-bonding group has a hydrogen-bonding functional group directly bonded to the cyclic skeleton, or has one atom in the cyclic skeleton. It is preferable to have a hydrogen-bonding functional group bonded thereto. In this case, the effect of the present invention can be more effectively exerted.
  • the scaffold material for cell culture according to the present invention is a synthetic resin having a main chain and a graft chain, and the graft chain has a polydentate hydrogen-bonding group represented by the above formula (1) in a side chain (hereinafter, , May be referred to as "synthetic resin X"). Therefore, the cell culture scaffold material according to the present invention contains the synthetic resin X.
  • the synthetic resin X may be a composite resin. Only one type of the synthetic resin X may be used, or two or more types may be used in combination. Further, the synthetic resin X may have only one type of the polydentate hydrogen bonding group, or may have two or more types.
  • the polydentate hydrogen-bonding group may be directly bonded to the main chain of the graft chain, or may be bonded to the main chain of the graft chain via another group.
  • the synthetic resin X can be synthesized, for example, by the method (1) or (2) below.
  • a monomer having a polydentate hydrogen-bonding group or a mixed monomer of a monomer having a polydentate hydrogen-bonding group and a monomer having no polydentate hydrogen-bonding group is grafted on the polymer of the main chain. Method of polymerizing.
  • Examples of the monomer having a polydentate hydrogen-bonding group and the monomer not having a polydentate hydrogen-bonding group include a vinyl compound, a (meth) acrylic monomer, and a maleimide compound. Only one type of the above-mentioned monomer may be used, or two or more types may be used in combination. When synthesizing the synthetic resin X, it is preferable to use at least one monomer having a polydentate hydrogen-bonding group represented by the above formula (1).
  • the monomer having a polydentate hydrogen-binding group has at least one selected from the group having a (meth) acryloyl group and consisting of an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a sulfone group, an imino group, and a thiol group.
  • Examples thereof include a monomer having two or more of the above functional groups.
  • Examples of the monomer having such a polydentate hydrogen-bonding group include dopamine acrylamide, 4-methacrylamide phenylboronic acid, glycerol monomethacrylate, DL-2-allylglycine, vinyl catechol, 3-methacrylamide phenylboronic acid, and the like. Examples thereof include 2- [2-hydroxy-5- [2- (methacryloyloxy) ethyl] phenyl] -2H-benzotriazole.
  • the scaffold material for cell culture according to the present invention contains the synthetic resin X having the polydentate hydrogen-bonding group, the polydentate hydrogen-bonding group and cells (for example, membrane protein, phospholipid, sugar chain, glycoprotein) , Extracellular matrix and adherent protein) can be satisfactorily hydrogen-bonded, and the number of hydrogen bonds can be increased. Therefore, in the present invention, the affinity between the synthetic resin X and the cells is enhanced, and as a result, the cells are less likely to be detached from the cell culture scaffold material, and the cell colonization can be enhanced.
  • the synthetic resin X having the polydentate hydrogen-bonding group and cells for example, membrane protein, phospholipid, sugar chain, glycoprotein
  • the cell culture scaffold material according to the present invention is cheaper than the conventional cell scaffold material using a natural polymer, has less variation between lots, and is excellent in safety.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining an estimation mechanism in which cell colonization is improved when cells are cultured using the cell culture scaffold material according to the present invention.
  • the cell 10 has a substance 11 capable of forming a hydrogen bond such as a membrane protein and a compound having a sugar chain on the cell membrane.
  • the scaffold material 20 for cell culture according to the present invention contains the synthetic resin X having the polydentate hydrogen-bonding group.
  • the synthetic resin X having the polydentate hydrogen-bonding group.
  • two or more polydentate hydrogen-bonding groups are used per one polydentate hydrogen-bonding group between the membrane proteins and sugar chains present in the cell membrane.
  • a hydrogen bond 30 is formed.
  • a strong bond is formed between the cell 10 and the cell culture scaffold material 20 via the polydentate hydrogen-bonding group. Therefore, it is considered that the adhesiveness between the cells and the scaffold material for cell culture is improved, and as a result, the cell colonization property is improved.
  • the synthetic resin X since the synthetic resin X has the polydentate hydrogen-bonding group in the side chain of the graft chain, the adhesiveness with cells is easily improved. The details of this mechanism are unknown, but a plurality of the polydentate hydrogen-bonding groups arranged on the same graft chain form clusters, and the cells and the scaffold for cell culture are mediated through the polydentate hydrogen-bonding groups. This is thought to be due to the formation of strong hydrogen bonds with the material.
  • Examples of the synthetic resin X include polyolefin derivatives, polyether derivatives, polyvinyl alcohol derivatives, polyester derivatives, poly (meth) acrylic acid ester derivatives, epoxy resin derivatives, polyamide derivatives, polyimide derivatives, polyurethane derivatives, polycarbonate derivatives, cellulose derivatives, and Examples include a polypeptide derivative.
  • the synthetic resin X is preferably a polyvinyl alcohol derivative or a poly (meth) acrylic acid ester derivative.
  • the polyvinyl alcohol derivative is a synthetic resin synthesized by using at least vinyl alcohol as a monomer.
  • the poly (meth) acrylic acid ester derivative is a synthetic resin synthesized by using at least an acrylic acid ester as a monomer.
  • the polyvinyl alcohol derivative is preferably a resin having a polyvinyl acetal skeleton.
  • the synthetic resin X preferably has a polyvinyl acetal skeleton or a poly (meth) acrylic acid ester skeleton.
  • the synthetic resin X may be a resin having a polyvinyl acetal skeleton, a resin having a poly (meth) acrylic acid ester skeleton, and a polyvinyl acetal skeleton and a poly (meth) acrylic acid ester skeleton. It may be a resin having both of.
  • the synthetic resin X may be a resin having a polyvinyl acetal skeleton or a resin having a polyvinyl acetal skeleton and a poly (meth) acrylic acid ester skeleton.
  • the synthetic resin X is preferably a resin having at least a polyvinyl acetal skeleton.
  • the proportion of the structural unit having the polydentate hydrogen-bonding group (the content of the structural unit having the polydentate hydrogen-bonding group) in 100 mol% of the total structural unit of the synthetic resin X is preferably 1 mol% or more. It is more preferably 5 mol% or more, preferably 30 mol% or less, and more preferably 20 mol% or less. When the above ratio is equal to or more than the above lower limit and not more than the above upper limit, the effect of the present invention can be exhibited even more effectively.
  • the structural unit having a polydentate hydrogen-bonding group is, for example, a structural unit derived from a monomer having a polydentate hydrogen-bonding group.
  • the proportion of structural units having polydentate hydrogen-bonding groups can be measured by 1 H-NMR (nuclear magnetic resonance spectrum).
  • the content of the synthetic resin X in 100% by weight of the scaffold material for cell culture is preferably 70% by weight or more, more preferably 75% by weight or more, still more preferably 80% by weight or more, and particularly preferably 90% by weight or more. Most preferably, it is 100% by weight (total amount). Therefore, the scaffold material for cell culture is most preferably synthetic resin X. When the content of the synthetic resin X is at least the above lower limit, the effect of the present invention can be exhibited even more effectively.
  • the scaffold material for cell culture preferably contains a synthetic resin X having a polyvinyl acetal skeleton.
  • synthetic resin X having a polyvinyl acetal skeleton may be referred to as “polyvinyl acetal resin X”.
  • the polyvinyl acetal resin X is a resin having a polyvinyl acetal skeleton and a polydentate hydrogen bonding group.
  • the polyvinyl acetal resin X has an acetal group, an acetyl group, and a hydroxyl group in the side chain. Further, the polyvinyl acetal resin X has a polydentate hydrogen bonding group.
  • the average degree of polymerization of the polyvinyl acetal resin X or the polyvinyl acetal resin is preferably 100 or more, more preferably 200 or more, still more preferably 500 or more, and particularly preferably 1500. As mentioned above, it is preferably 6000 or less, more preferably 3000 or less, and further preferably 2500 or less.
  • the average degree of polymerization is at least the above lower limit, swelling due to the liquid medium can be effectively suppressed, so that the strength of the scaffold material for cell culture can be maintained satisfactorily. Therefore, cell proliferation can be enhanced. Further, when the average degree of polymerization is not more than the above upper limit, the handleability can be improved and the moldability of the scaffold material for cell culture can be improved.
  • the number average molecular weight (Mn) of the polyvinyl acetal resin X or the polyvinyl acetal resin (before monomer polymerization having a polydentate hydrogen-bonding group) is preferably 10,000 or more, preferably 600,000 or less.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the polyvinyl acetal resin X or the polyvinyl acetal resin (before polymerization of a monomer having a polydentate hydrogen-bonding group) is preferably 2000 or more, preferably 1200,000 or less.
  • the ratio (Mw / Mn) of the weight average molecular weight (Mw) to the number average molecular weight (Mn) is preferable. Is 2.0 or more, preferably 40 or less.
  • Mn, the Mw, and the Mw / Mn are equal to or higher than the lower limit and lower than the upper limit, the strength of the scaffold material for cell culture can be increased.
  • the degree of acetalization (degree of butyralization in the case of polyvinyl butyral resin) of the polyvinyl acetal resin X or the polyvinyl acetal resin (before monomer polymerization having a polydentate hydrogen-binding group) is preferably 60 mol% or more, more preferably. Is 65 mol% or more, preferably 90 mol% or less, and more preferably 85 mol% or less.
  • the degree of acetalization is at least the above lower limit, the colonization of the cells can be further enhanced, and the cells proliferate efficiently.
  • the degree of acetalization is not more than the above upper limit, the solubility in a solvent can be improved.
  • the degree of acetylation (amount of acetyl group) of the polyvinyl acetal resin X or the polyvinyl acetal resin (before monomer polymerization having a polydentate hydrogen bonding group) is preferably 0.0001 mol% or more, preferably 5 mol% or less. Is.
  • the hydroxyl group content (hydroxyl group amount) of the polyvinyl acetal resin X or the polyvinyl acetal resin (before polymerization of a monomer having a polydentate hydrogen-bonding group) is preferably 1 mol% or more, more preferably 10 mol% or more. It is preferably 80 mol% or less, more preferably 60 mol% or less.
  • the degree of acetalization, the degree of acetylation (the amount of acetyl groups) and the amount of hydroxyl groups of the polyvinyl acetal resin X or the polyvinyl acetal resin before monomer polymerization having a polydentate hydrogen bonding group are 1 H-NMR (nuclear magnetic resonance spectrum). ) Can be measured.
  • the polyvinyl acetal resin X can be synthesized, for example, by the following method (1) or (2).
  • (1) A method of graft-polymerizing a polyvinyl acetal resin with a monomer having a polydentate hydrogen-bonding group or a mixed monomer of a monomer having a polydentate hydrogen-bonding group and a monomer having no polydentate hydrogen-bonding group. .. (2) A method in which a polymer having a polydentate hydrogen-bonding group in a side chain is bonded to a polyvinyl acetal resin in a branched manner by condensation or the like.
  • the polyvinyl acetal resin X is a graft copolymer of a polyvinyl acetal resin and a monomer having a polydentate hydrogen-binding group. It is preferable to have. Further, the polyvinyl acetal resin X is more preferably a graft copolymer of a polyvinyl acetal resin, a monomer having a polydentate hydrogen bonding group, and a monomer other than the monomer having a polydentate hydrogen bonding group. In this case, since the polydentate hydrogen-bonding group contained in the polyvinyl acetal resin X easily binds to the cell, the cell colonization can be further enhanced.
  • Examples of the monomer having a polydentate hydrogen bonding group include the above-mentioned monomers.
  • Examples of the monomer other than the monomer having a polydentate hydrogen-bonding group include vinyl compounds having no polydentate hydrogen-bonding group.
  • Examples of the vinyl compound having no polydentate hydrogen-bonding group include ethylene, allylamine, vinylpyrrolidone, maleic anhydride, maleimide, itaconic acid, (meth) acrylic acid having no polydentate hydrogen-bonding group, vinylamine and the like. Examples thereof include (meth) acrylic anhydride having no polydentate hydrogen-bonding group.
  • the vinyl compound having no polydentate hydrogen bonding group only one kind may be used, or two or more kinds may be used in combination. The copolymer of the polyvinyl acetal resin and the (meth) acrylic acid ester will be described later.
  • the scaffold material for cell culture preferably contains a synthetic resin X having a poly (meth) acrylic acid ester skeleton.
  • synthetic resin X having a poly (meth) acrylic acid ester skeleton may be referred to as "poly (meth) acrylic acid ester resin X”.
  • the poly (meth) acrylic acid ester resin X is a resin having a poly (meth) acrylic acid ester skeleton and a polydentate hydrogen bonding group.
  • the poly (meth) acrylic acid ester resin X is obtained by polymerizing the (meth) acrylic acid ester with the monomer having a polydentate hydrogen-bonding group.
  • the poly (meth) acrylic acid ester resin X has the (meth) acrylic acid ester, the monomer having the polydentate hydrogen-bonding group, the (meth) acrylic acid ester, and the polydentate hydrogen-bonding group. It may be a resin obtained by copolymerizing a monomer different from both of the monomers.
  • (meth) acrylic acid ester examples include (meth) acrylic acid alkyl ester, (meth) acrylic acid cyclic alkyl ester, (meth) acrylic acid aryl ester, (meth) acrylamide, (meth) acrylic acid polyethylene glycol, and the like. And phosphorylcholine (meth) acrylate and the like.
  • Examples of the (meth) acrylic acid alkyl ester include methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, n-propyl (meth) acrylate, isopropyl (meth) acrylate, n-butyl (meth) acrylate, and isobutyl (meth) acrylate.
  • examples thereof include (meth) acrylate, lauryl (meth) acrylate, stearyl (meth) acrylate, and isotetradecyl (meth) acrylate.
  • the (meth) acrylic acid alkyl ester may be substituted with a substituent such as an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms and a tetrahydrofurfuryl group.
  • a substituent such as an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms and a tetrahydrofurfuryl group.
  • examples of such (meth) acrylic acid alkyl esters include methoxyethyl acrylate and tetrahydrofurfuryl acrylate.
  • Examples of the (meth) acrylic acid cyclic alkyl ester include cyclohexyl (meth) acrylate and isobornyl (meth) acrylate.
  • Examples of the (meth) acrylic acid aryl ester include phenyl (meth) acrylate and benzyl (meth) acrylate.
  • Examples of the (meth) acrylamides include (meth) acrylamide, N-isopropyl (meth) acrylamide, N-tert-butyl (meth) acrylamide, N, N'-dimethyl (meth) acrylamide, and (3- (meth) acrylamide).
  • Propyl) trimethylammonium chloride 4- (meth) acryloylmorpholine, 3- (meth) acryloyl-2-oxazolidinone, N- [3- (dimethylamino) propyl] (meth) acrylamide, N- (2-hydroxyethyl) ( Examples thereof include meta) acrylamide, N-methylol (meth) acrylamide, and 6- (meth) acrylamide hexane acid.
  • Examples of the (meth) acrylate polyethylene glycols include methoxy-polyethylene glycol (meth) acrylate, ethoxy-polyethylene glycol (meth) acrylate, hydroxy-polyethylene glycol (meth) acrylate, methoxy-diethylene glycol (meth) acrylate, and ethoxy.
  • Examples of the phosphorylcholine (meth) acrylate include 2- (meth) acryloyloxyethyl phosphorylcholine.
  • Examples of the monomer having a polydentate hydrogen bonding group include the above-mentioned monomers.
  • Examples of the monomer different from both the (meth) acrylic acid ester and the monomer having a polydentate hydrogen-bonding group include (meth) acrylic acid, ethylene, vinyl ester and the like.
  • (meth) acrylic means “acrylic” or “methacryl”
  • (meth) acrylate means “acrylate” or “methacrylate”.
  • the number average molecular weight (Mn) of the poly (meth) acrylic acid ester resin X is preferably 100 or more, preferably 200,000 or less.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the poly (meth) acrylic acid ester resin X is preferably 100 or more, preferably 200,000 or less.
  • the scaffold material for cell culture preferably contains a synthetic resin X having a polyvinyl acetal skeleton and a poly (meth) acrylic acid ester skeleton.
  • the synthetic resin X is preferably a composite resin having a polyvinyl acetal skeleton and a poly (meth) acrylic acid ester skeleton.
  • the synthetic resin X having the polyvinyl acetal skeleton and the poly (meth) acrylic acid ester skeleton is a resin having a polyvinyl acetal skeleton, a poly (meth) acrylic acid ester skeleton and a polydentate hydrogen bonding group.
  • the synthetic resin X having the polyvinyl acetal skeleton and the poly (meth) acrylic acid ester skeleton can be obtained, for example, by appropriately combining the above-mentioned method for synthesizing the polyvinyl acetal resin X and the method for synthesizing the poly (meth) acrylic acid ester resin X. Can be synthesized.
  • the synthetic resin X having a polyvinyl acetal skeleton and a poly (meth) acrylic acid ester skeleton is preferably a synthetic resin X obtained by graft-copolymerizing the above-mentioned (meth) acrylic acid ester with the above-mentioned polyvinyl acetal resin.
  • the number average molecular weight (Mn) of the synthetic resin X having a polyvinyl acetal skeleton and a poly (meth) acrylic acid ester skeleton is preferably 10,000 or more, preferably 600,000 or less.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the synthetic resin X having a polyvinyl acetal skeleton and a poly (meth) acrylic acid ester skeleton is preferably 2000 or more, preferably 1200,000 or less.
  • the ratio (Mw / Mn) of the weight average molecular weight (Mw) to the number average molecular weight (Mn) is preferably 2.0 or more. , Preferably 40 or less.
  • the strength of the scaffold material for cell culture can be increased.
  • the scaffold material for cell culture may contain a polymer other than the synthetic resin X.
  • the polymer include polyolefin resin, polyether resin, polyvinyl alcohol resin, polyester, epoxy resin, polyamide resin, polyimide resin, polyurethane resin, polycarbonate resin, cellulose, polypeptide and the like.
  • the content of the polymer in 100% by weight of the scaffold material for cell culture is preferably 20% by weight or less, more preferably 10% by weight or less, still more preferably 5% by weight or less, particularly preferably 1% by weight or less. It is preferably 0% by weight (not contained). Therefore, it is most preferable that the scaffold material for cell culture does not contain a polymer other than the synthetic resin X.
  • the scaffold material for cell culture according to the present invention does not substantially contain an animal-derived raw material. Since it does not substantially contain animal-derived raw materials, it is possible to provide a scaffold material for cell culture, which has little variation between lots and is excellent in cost and safety.
  • substantially free of animal-derived raw materials means that the animal-derived raw materials in the cell culture scaffold material are 3% by weight or less.
  • the animal-derived raw material in the cell culture scaffold material is preferably 1% by weight or less, more preferably 0% by weight. That is, it is more preferable that the cell culture scaffold material does not contain animal-derived raw materials in the cell culture scaffold material.
  • the cell culture scaffold material according to the present invention is used for culturing cells.
  • the cell culture scaffold material according to the present invention is used as a scaffold for the cells when culturing the cells.
  • Examples of the cells include animal cells such as humans, mice, rats, pigs, cows and monkeys.
  • Examples of the cells include somatic cells, stem cells, progenitor cells, differentiated cells and the like.
  • the somatic cells may be cancer cells.
  • stem cells examples include mesenchymal stem cells (MSCs), iPS cells, ES cells, Muse cells, embryonic cancer cells, embryonic reproductive stem cells, mGS cells and the like.
  • the shape of the scaffold material for cell culture is not particularly limited.
  • the shape of the scaffold material for cell culture may be membrane-like or particle-like.
  • the film form includes a film form and a sheet form.
  • the scaffold material for cell culture is preferably used for two-dimensional culture (plane culture), three-dimensional culture or suspension culture of cells, and more preferably for two-dimensional culture (plane culture).
  • the cell culture scaffold material can also be used as a cell culture carrier (medium) containing the cell culture scaffold material and a polysaccharide.
  • the above-mentioned polysaccharide is not particularly limited, and conventionally known polysaccharides can be used.
  • the polysaccharide is preferably a water-soluble polysaccharide.
  • the cell culture scaffold material can also be used as a cell culture fiber including a fiber body and a cell culture scaffold material arranged on the surface of the fiber body.
  • the scaffold material for cell culture is preferably coated on the surface of the fiber body, and is preferably a coated material.
  • a cell culture scaffold material may be present in the fiber body.
  • the cell culture scaffold material can be present in the fiber body by impregnating or kneading the liquid cell culture scaffold material with the fiber body.
  • stem cells have a property of being difficult to adhere to a planar structure and easily adhering to a three-dimensional structure such as a fibrous structure. Therefore, a fiber for cell culture is suitably used for three-dimensional culture of stem cells. Among stem cells, it is preferably used for three-dimensional culture of adipose stem cells.
  • the synthetic resin in the above-mentioned scaffold material for cell culture may be crosslinked.
  • the scaffold material for cell culture containing the crosslinked synthetic resin can effectively suppress the water swelling property and increase the strength.
  • the synthetic resin can be cross-linked.
  • the cell culture container according to the present invention includes a container body and the above-mentioned cell culture scaffold material, and the cell culture scaffold material is arranged on the surface of the container body.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view schematically showing a cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • the cell culture container 1 includes a container body 2 and a cell culture scaffold material 3.
  • the cell culture scaffold material 3 is arranged on the surface 2a of the container body 2.
  • the scaffold material 3 for cell culture is arranged on the bottom surface of the container body 2.
  • the container body may be provided with a second container body such as a cover glass on the bottom surface of the first container body.
  • the first container body and the second container body may be separable.
  • the cell culture scaffold material may be arranged on the surface of the second container body.
  • a conventionally known container body can be used as the container body.
  • the shape and size of the container body are not particularly limited.
  • Examples of the container body include a cell culture plate provided with one or more wells (holes), a cell culture flask, and the like.
  • the number of wells in the plate is not particularly limited.
  • the number of wells is not particularly limited, and examples thereof include 2, 4, 6, 12, 24, 48, 96, and 384.
  • the shape of the well is not particularly limited, and examples thereof include a perfect circle, an ellipse, a triangle, a square, a rectangle, and a pentagon.
  • the shape of the bottom surface of the well is not particularly limited, and examples thereof include a flat bottom, a round bottom, and unevenness.
  • the material of the container body is not particularly limited, and examples thereof include resin, metal, and inorganic materials.
  • the following synthetic resins X1 to X15 and Y1 to Y4 were prepared as materials for the scaffold material for cell culture.
  • Table 1 shows the details of the monomers having polydentate hydrogen-bonding groups used in the synthetic resins X1 to X15.
  • the content of structural units in the obtained synthetic resin was measured by 1 H-NMR (nuclear magnetic resonance spectrum) after dissolving the synthetic resin in DMSO-d6 (dimethylsulfoxide).
  • Tables 2 to 4 show the content of each structural unit of the synthetic resin.
  • the content of polydentate hydrogen-bonding groups is the ratio of structural units having polydentate hydrogen-bonding groups.
  • Synthetic resin X1 Synthesis example X1 To a reactor equipped with a stirrer, 300 parts by weight of polyvinyl alcohol having 2700 mL of ion-exchanged water, an average degree of polymerization of 250 and a saponification degree of 99 mol% was added and dissolved by heating while stirring to obtain a solution. To the obtained solution, 35% by weight hydrochloric acid was added as a catalyst so that the hydrochloric acid concentration was 0.2% by weight. Then, the temperature was adjusted to 15 ° C., and 22 parts by weight of n-butyraldehyde was added with stirring.
  • n-butyraldehyde was added to precipitate a white particulate polyvinyl butyral resin.
  • 35% by weight hydrochloric acid was added so that the hydrochloric acid concentration became 1.8% by weight, and then the mixture was heated to 50 ° C. and maintained at 50 ° C. for 2 hours.
  • the polyvinyl butyral resin was washed with water and dried to obtain a polyvinyl butyral resin (average degree of polymerization 250, acetalization degree (butyralization degree) 71 mol%, hydroxyl group amount 28 mol%, Acetyl group amount 1 mol%) was obtained.
  • the obtained synthetic resin X1 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and a group having a catechol skeleton as a polydentate hydrogen bonding group.
  • the average degree of polymerization is 250
  • the amount of hydroxyl groups in the structural unit having no polydentate hydrogen-bonding group is 38 mol%
  • the amount of acetyl group is 1 mol%
  • the degree of acetalization is 60 mol%
  • the polydentate hydrogen-bonding group The content was 1 mol%.
  • Synthetic resin X2 Synthesis example X2 Synthetic resin in the same manner as in Synthesis Example X1, except that the amount of the polyvinyl butyral resin was changed from 95 parts by weight to 90 parts by weight and the amount of dopamine acrylamide was changed from 5 parts by weight to 10 parts by weight. I got X2.
  • the obtained synthetic resin X2 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and a group having a catechol skeleton as a polydentate hydrogen bonding group.
  • the average degree of polymerization is 250
  • the amount of hydroxyl groups in the structural unit having no polydentate hydrogen-bonding group is 37 mol%
  • the amount of acetyl group is 1 mol%
  • the degree of acetalization is 59 mol%
  • the polydentate hydrogen-bonding group was 3 mol%.
  • Synthetic resin X3 Synthesis example X3 Synthetic resin in the same manner as in Synthesis Example X1, except that the amount of the polyvinyl butyral resin was changed from 95 parts by weight to 80 parts by weight and the amount of dopamine acrylamide was changed from 5 parts by weight to 20 parts by weight. I got X3.
  • the obtained synthetic resin X3 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and also has a group having a catechol skeleton as a polydentate hydrogen bonding group.
  • the average degree of polymerization is 250
  • the amount of hydroxyl groups in the structural unit having no polydentate hydrogen-bonding group is 36 mol%
  • the amount of acetyl group is 1 mol%
  • the degree of acetalization is 57 mol%
  • the polydentate hydrogen-bonding group The content was 7 mol%.
  • Synthetic resin X4 Synthesis example X4 The blending amount of the polyvinyl butyral resin was changed from 95 parts by weight to 90 parts by weight, and 5 parts by weight of dopamine acrylamide and 5 parts by weight of N- (4-hydroxyphenyl) methacrylamide were used at the time of graft polymerization. A synthetic resin X4 was obtained in the same manner as in Synthesis Example X1 except for the above.
  • the obtained synthetic resin X4 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and also has a group having a catechol skeleton as a polydentate hydrogen bonding group.
  • the average degree of polymerization is 250
  • the amount of hydroxyl groups in the structural unit having no polydentate hydrogen-bonding group is 38 mol%
  • the amount of acetyl group is 1 mol%
  • the degree of acetalization is 59 mol%
  • the polydentate hydrogen-bonding group The content was 2 mol%.
  • Synthetic resin X5 Synthesis example X5 A synthetic resin X5 was obtained in the same manner as in Synthesis Example X1 except that 5 parts by weight of 4-methacrylamide phenylboronic acid was used instead of 5 parts by weight of dopamine acrylamide.
  • the obtained synthetic resin X5 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and a group having a boronic acid skeleton (phenylboronic acid skeleton) as a polydentate hydrogen-bonding group.
  • the average degree of polymerization is 250
  • the amount of hydroxyl groups in the structural unit having no polydentate hydrogen-bonding group is 38 mol%
  • the amount of acetyl group is 1 mol%
  • the degree of acetalization is 60 mol%
  • the polydentate hydrogen-bonding group The content was 1 mol%.
  • Synthetic resin X6 Synthesis example X6 Same as Synthesis Example X5 except that the amount of the polyvinyl butyral resin was changed from 95 parts by weight to 90 parts by weight and the amount of 4-methacrylamidephenylboronic acid was changed from 5 parts by weight to 10 parts by weight. A synthetic resin X6 was obtained.
  • the obtained synthetic resin X6 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and a group having a boronic acid skeleton (phenylboronic acid skeleton) as a polydentate hydrogen-bonding group.
  • the average degree of polymerization is 250
  • the amount of hydroxyl groups in the structural unit having no polydentate hydrogen-bonding group is 37 mol%
  • the amount of acetyl group is 1 mol%
  • the degree of acetalization is 59 mol%
  • the polydentate hydrogen-bonding group The content was 3 mol%.
  • Synthetic resin X7 Synthesis example X7 A synthetic resin X7 was obtained in the same manner as in Synthesis Example X1 except that a polyvinyl butyral resin having an average degree of polymerization of 1700, a butyralization degree of 63 mol%, a hydroxyl group amount of 34 mol%, and an acetylation degree of 3 mol% was used.
  • the obtained synthetic resin X7 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and also has a group having a catechol skeleton as a polydentate hydrogen bonding group.
  • the average degree of polymerization is 1700
  • the amount of hydroxyl groups in the structural unit having no polydentate hydrogen-bonding group is 34 mol%
  • the amount of acetyl group is 3 mol%
  • the degree of acetalization is 62 mol%
  • the polydentate hydrogen-bonding group The content was 1 mol%.
  • Synthetic resin X8 Synthesis example X8 Synthetic resin in the same manner as in Synthesis Example X7, except that the amount of the polyvinyl butyral resin was changed from 95 parts by weight to 90 parts by weight and the amount of dopamine acrylamide was changed from 5 parts by weight to 10 parts by weight. I got X8.
  • the obtained synthetic resin X8 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and also has a group having a catechol skeleton as a polydentate hydrogen bonding group.
  • the average degree of polymerization is 1700
  • the amount of hydroxyl groups in the structural unit having no polydentate hydrogen-bonding group is 33 mol%
  • the amount of acetyl group is 3 mol%
  • the degree of acetalization is 62 mol%
  • the polydentate hydrogen-bonding group The content was 2 mol%.
  • Synthetic resin X9 Synthesis example X9 Synthetic resin in the same manner as in Synthesis Example X7, except that the amount of the polyvinyl butyral resin was changed from 95 parts by weight to 80 parts by weight and the amount of dopamine acrylamide was changed from 5 parts by weight to 20 parts by weight. I got X9.
  • the obtained synthetic resin X9 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and a group having a catechol skeleton as a polydentate hydrogen bonding group.
  • Synthetic resin X9 has an average degree of polymerization of 1700, a hydroxyl group amount of 32 mol%, an acetyl group amount of 3 mol%, an acetalization degree of 60 mol%, and a polydentate hydrogen bond group in a structural unit having no polydentate hydrogen bond group. The content was 5 mol%.
  • Synthetic resin X10 Synthesis example X10 A synthetic resin X10 was obtained in the same manner as in Synthesis Example X7, except that 5 parts by weight of glycerin monomethacrylate was used instead of 5 parts by weight of dopamine acrylamide.
  • the obtained synthetic resin X10 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and a group having an ethylene glycol skeleton as a polydentate hydrogen bonding group.
  • the average degree of polymerization is 1700
  • the amount of hydroxyl groups in the structural unit having no polydentate hydrogen-bonding group is 34 mol%
  • the amount of acetyl group is 3 mol%
  • the degree of acetalization is 62 mol%
  • the polydentate hydrogen-bonding group The content was 1 mol%.
  • Synthetic resin X11 Synthesis example X11 Synthesized in the same manner as in Synthesis Example X10, except that the blending amount of the polyvinyl butyral resin was changed from 95 parts by weight to 90 parts by weight and the blending amount of glycerin monomethacrylate was changed from 5 parts by weight to 10 parts by weight. Resin X11 was obtained.
  • the obtained synthetic resin X11 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and a group having an ethylene glycol skeleton as a polydentate hydrogen bonding group.
  • a polyvinyl acetal skeleton polyvinyl butyral skeleton
  • a group having an ethylene glycol skeleton as a polydentate hydrogen bonding group.
  • the content was 3 mol%.
  • Synthetic resin X12 Synthesis example X12 Synthesized in the same manner as in Synthesis Example X7, except that the blending amount of the polyvinyl butyral resin was changed from 95 parts by weight to 80 parts by weight and the blending amount of glycerin monomethacrylate was changed from 5 parts by weight to 20 parts by weight. Resin X12 was obtained.
  • the obtained synthetic resin X12 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and a group having an ethylene glycol skeleton as a polydentate hydrogen bonding group.
  • the average degree of polymerization is 1700
  • the amount of hydroxyl groups in the structural unit having no polydentate hydrogen-bonding group is 32 mol%
  • the amount of acetyl group is 3 mol%
  • the degree of acetalization is 59 mol%
  • the polydentate hydrogen-bonding group was 6 mol%.
  • Synthetic resin X13 Synthesis example X13 A synthetic resin X13 was obtained in the same manner as in Synthesis Example X11, except that DL-2-allylglycine was changed to 10 parts by weight instead of 10 parts by weight of glycerin monomethacrylate.
  • the obtained synthetic resin X13 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton), and also has an amino group and a carboxyl group as polydentate hydrogen-bonding groups.
  • the average degree of polymerization is 1700
  • the amount of hydroxyl groups in the structural unit having no polydentate hydrogen-bonding group is 33 mol%
  • the amount of acetyl group is 3 mol%
  • the degree of acetalization is 60 mol%
  • the polydentate hydrogen-bonding group The content was 4 mol%.
  • Synthetic resin X14 Synthesis example X14 Synthetic resin X14 was obtained in the same manner as in Synthesis Example X7, except that 5 parts by weight of 4-methacrylamide phenylboronic acid was used instead of 5 parts by weight of dopamine acrylamide.
  • the obtained synthetic resin X14 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and a group having a boronic acid skeleton (phenylboronic acid skeleton) as a polydentate hydrogen-bonding group.
  • a polyvinyl acetal skeleton polyvinyl butyral skeleton
  • a group having a boronic acid skeleton phenylboronic acid skeleton
  • a polydentate hydrogen-bonding group an average degree of polymerization of 1700, a hydroxyl group amount of 33 mol%, an acetyl group amount of 3 mol%, an acetalization degree of 62 mol%, and a polydentate hydrogen bond group in a structural unit having no polydentate hydrogen bond group. The content was 2 mol%.
  • Synthetic resin X15 Synthesis example X15 Similar to Synthesis Example X14, except that the blending amount of the polyvinyl butyral resin was changed from 95 parts by weight to 90 parts by weight and the blending amount of 4-methacrylamidephenylboronic acid was changed from 5 parts by weight to 10 parts by weight. A synthetic resin X15 was obtained.
  • the obtained synthetic resin X15 has a polyvinyl acetal skeleton (polyvinyl butyral skeleton) and a group having a boronic acid skeleton (phenylboronic acid skeleton) as a polydentate hydrogen-bonding group.
  • a polyvinyl acetal skeleton polyvinyl butyral skeleton
  • a group having a boronic acid skeleton phenylboronic acid skeleton
  • a polydentate hydrogen-bonding group an average degree of polymerization of 1700, a hydroxyl group amount of 33 mol%, an acetyl group amount of 3 mol%, an acetalization degree of 61 mol%, and a polydentate hydrogen bond group in a structural unit having no polydentate hydrogen bond group. The content was 3 mol%.
  • Synthetic resin Y1 Synthesis example Y1 To a reactor equipped with a stirrer, 300 parts by weight of polyvinyl alcohol having 2700 mL of ion-exchanged water, an average degree of polymerization of 250 and a saponification degree of 99 mol% was added and dissolved by heating while stirring to obtain a solution. To the obtained solution, 35% by weight hydrochloric acid was added as a catalyst so that the hydrochloric acid concentration was 0.2% by weight. Then, the temperature was adjusted to 15 ° C., and 22 parts by weight of n-butyraldehyde was added with stirring.
  • n-butyraldehyde was added to precipitate a white particulate polyvinyl butyral resin.
  • 35% by weight hydrochloric acid was added so that the hydrochloric acid concentration became 1.8% by weight, and then the mixture was heated to 50 ° C. and maintained at 50 ° C. for 2 hours. Then, the solution was cooled and neutralized, and then the polyvinyl butyral resin was washed with water and dried to obtain a synthetic resin Y1 which is a polyvinyl butyral resin.
  • the obtained synthetic resin Y1 had an average degree of polymerization of 250, a hydroxyl group amount of 57 mol%, an acetyl group amount of 3 mol%, and an acetalization degree of 40 mol%.
  • Synthetic resin Y2 Synthesis example Y2
  • the vinyl acetate monomer was dissolved in methanol, and the mixture was stirred at 65 ° C. for 5 hours while adding an initiator to polymerize.
  • An aqueous sodium hydroxide solution (10%) was added to the obtained vinyl acetate polymer solution, and a saponification reaction was carried out for 60 minutes. It was dried in an oven to obtain a synthetic resin Y2.
  • the obtained synthetic resin Y2 had an average degree of polymerization of 1000, a hydroxyl group content of 98 mol%, and an acetyl group content of 2 mol%.
  • Synthetic resin Y3 Synthesis example Y3 To a reactor equipped with a stirrer, 300 parts by weight of polyvinyl alcohol having 2700 mL of ion-exchanged water, an average degree of polymerization of 250 and a saponification degree of 99 mol% was added and dissolved by heating while stirring to obtain a solution. To the obtained solution, 35% by weight hydrochloric acid was added as a catalyst so that the hydrochloric acid concentration was 0.2% by weight. Then, the temperature was adjusted to 15 ° C., and 22 parts by weight of n-butyraldehyde was added with stirring.
  • n-butyraldehyde was added to precipitate a white particulate polyvinyl butyral resin.
  • 35% by weight hydrochloric acid was added so that the hydrochloric acid concentration became 1.8% by weight, and then the mixture was heated to 50 ° C. and maintained at 50 ° C. for 2 hours. Then, the solution was cooled and neutralized, and then the polyvinyl butyral resin was washed with water and dried to obtain a synthetic resin Y3.
  • the obtained synthetic resin Y3 had an average degree of polymerization of 250, a hydroxyl group amount of 28 mol%, an acetyl group amount of 1 mol%, and an acetalization degree of 71 mol%.
  • Synthetic resin Y4 Synthesis example Y4 To a reactor equipped with a stirrer, 300 parts by weight of polyvinyl alcohol having 2700 mL of ion-exchanged water, an average degree of polymerization of 1700 and a saponification degree of 99 mol% was added and dissolved by heating while stirring to obtain a solution. To the obtained solution, 35% by weight hydrochloric acid was added as a catalyst so that the hydrochloric acid concentration was 0.2% by weight. Then, the temperature was adjusted to 15 ° C., and 22 parts by weight of n-butyraldehyde was added with stirring.
  • n-butyraldehyde was added to precipitate a white particulate polyvinyl butyral resin.
  • 35% by weight hydrochloric acid was added so that the hydrochloric acid concentration became 1.8% by weight, and then the mixture was heated to 50 ° C. and maintained at 50 ° C. for 2 hours. Then, the solution was cooled and neutralized, and then the polyvinyl butyral resin was washed with water and dried to obtain a synthetic resin Y4 which is a polyvinyl butyral resin.
  • the obtained synthetic resin Y4 had an average degree of polymerization of 1700, a hydroxyl group amount of 34 mol%, an acetyl group amount of 3 mol%, and an acetalization degree of 63 mol%.
  • Comparative Example 1 the polystyrene dish itself was used as a cell culture container.
  • TeSR E8 medium manufactured by STEM CELL
  • ROCK-Inhibitor Y27632
  • phosphate buffered saline 1 mL was added to the obtained cell culture vessel, and the mixture was allowed to stand in an incubator at 37 ° C. for 1 hour, and then the phosphate buffered saline was removed from the cell culture vessel.
  • Colonies of h-iPS cells 252G1 in a confluent state were placed on a ⁇ 35 mm dish, 1 mL of 0.5 mM ethylenediamine / phosphate buffer solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 minutes. After removing the ethylenediamine / phosphate buffer solution, pipetting was performed with 1 mL of a liquid medium to obtain a cell mass crushed to a size of 50 ⁇ m to 200 ⁇ m. The resulting cell mass (cell number 1.0 ⁇ 10 5 cells) were clamped seeded into a container for said cell culture.
  • liquid medium and a ROCK-specific inhibitor were added to the cell culture vessel so that the final concentration was 10 ⁇ M.
  • the cells were cultured in an incubator at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%. Every 24 hours, 1 mL of liquid medium was removed, and 1 mL of fresh liquid medium to which no ROCK-specific inhibitor was added was added to replace the medium.
  • Examples 7 to 15 and Comparative Examples 5 to 7 Preparation of cell culture container: 1 part by weight of the synthetic resin shown in Tables 3 and 4 was dissolved in 19 parts by weight of butanol. 150 ⁇ L of the obtained solution was discharged onto the surface of a ⁇ 22 mm cover glass (“22 Maru No. 1” manufactured by Matsunami Co., Ltd.) dust-removed with an air duster, rotated at 2000 rpm for 20 seconds using a spin coater, and then 60. The mixture was heated at ° C. for 60 minutes to obtain a resin film (scaffold material for cell culture) having a smooth surface. A container for cell culture was obtained by arranging the obtained laminate of the resin film and the cover glass on a polystyrene dish having a diameter of 22 mm.
  • MesenCult-ACF Plus Medium manufactured by Stemcell technologies
  • MesenCult-ACF Plus 500X Supplement manufactured by Stemcell technologies
  • L-Glutamine 200 mmol / L (100X) manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • Marrow stromal cells containing MSCs are acclimated in MSC medium and have a purity of 95% or more for MSC positive markers (CD73, CD90, CD105) and less than 5% for MSC negative markers (CD14, CD34, CD45). The cells were used as MSCs.
  • phosphate buffered saline 1 mL was added to the obtained cell culture vessel, and the mixture was allowed to stand in an incubator at 37 ° C. for 1 hour, and then the phosphate buffered saline was removed from the cell culture vessel.
  • ACF Enzymatic Dissociation Solution (Stemcell technologies Inc.) 2 mL, it was 3 minutes to stand at 37 ° C. and 5% CO 2 in an incubator. Further, 2 mL of ACF Enzyme Inhibition Solution (manufactured by Stemcell technologies) was added. After centrifugation at 300 rpm for 8 minutes, the supernatant was removed and suspended in a liquid medium to obtain a cell suspension. The obtained cell suspension (number of cells 8.0 ⁇ 10 4 cells) was seeded in the above cell culture vessel.
  • ⁇ Criteria for cell colonization> Cells adhere to each other on the first day after the start of culture, and maintain adhesion and proliferation even after the fourth day.
  • ⁇ Cells adhere to each other on the first day after the start of culture, and maintain adhesion and proliferation until the third day.
  • ⁇ Cells adhere to each other on the first day after the start of culture, and maintain adhesion even after the third day (does not proliferate).
  • X Cells do not adhere and exfoliation occurs on the first day after the start of culture.

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Abstract

細胞の定着性に優れる細胞培養用足場材料を提供する。　本発明に係る細胞培養用足場材料は、主鎖と、グラフト鎖とを有する合成樹脂を含み、前記グラフト鎖が、下記式（１）で表される多座水素結合性基を側鎖に有する。　＊－Ｒ－（Ａｉ）ｎ　（１）　前記式（１）中、Ｒは炭素数が５０以下である基を表し、Ａｉはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、ｉは自然数を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合位置を表す。Ａｉは、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

Description

細胞培養用足場材料及び細胞培養用容器

　本発明は、細胞を培養するために用いられる細胞培養用足場材料に関する。また、本発明は、上記細胞培養用足場材料を用いた細胞培養用容器に関する。

　学術分野、創薬分野及び再生医療分野等の研究開発において、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ及びサル等の動物細胞が用いられている。動物細胞を培養するために用いられる足場材料として、ラミニン及びビトロネクチン等の接着タンパク質、並びにマウス肉腫由来のマトリゲル等の天然高分子材料が用いられている。

　また、下記の特許文献１～３に示すように合成樹脂を用いた足場材料も知られている。

　下記の特許文献１には、ポリビニルアセタール化合物からなる成形物又は該ポリビニルアセタール化合物と水溶性多糖類とからなる成形物からなり、該ポリビニルアセタール化合物のアセタール化度が２０～６０モル％である細胞培養用担体が開示されている。

　また、下記の特許文献２には、第１の繊維ポリマー足場材を含み、該第１の繊維ポリマー足場材の繊維が整列されている組成物（足場材料）が開示されている。この繊維ポリマーの材料として、脂肪族ポリエステル等が用いられている。

　また、下記の特許文献３には、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養方法であって、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器上で該多能性幹細胞を培養する工程を含む方法が開示されている。

特開２００６－３１４２８５号公報 ＷＯ２００７／０９０１０２Ａ１ 特開２０１７－０２３００８号公報

　動物細胞の培養では、細胞塊を足場材料に播種して培養することがある。足場材料として天然高分子材料を用いることで、播種後の細胞の定着性を高めることができる。しかしながら、天然高分子材料は、高価であったり、天然由来物質であるためロット間のばらつきが大きかったり、動物由来の成分による安全上の懸念があったりする。

　一方、特許文献１～３に記載のような合成樹脂を用いた足場材料は、天然高分子材料を用いた足場材料と比べて、安価であり、ロット間のばらつきが小さく、かつ安全性に優れる。しかしながら、特許文献１～３に記載のような従来の合成樹脂を用いた足場材料では、合成樹脂と細胞との親和性が低かったり、親水性が高い合成樹脂が用いられているために該合成樹脂が過度に膨潤したりして、播種した細胞塊が培養中に足場材料から剥離しやすく、細胞の定着性が低いという問題がある。

　本発明の目的は、細胞の定着性に優れる細胞培養用足場材料を提供することである。また、本発明は、上記細胞培養用足場材料を用いた細胞培養用容器を提供することも目的とする。

　本発明の広い局面によれば、主鎖と、グラフト鎖とを有する合成樹脂を含み、前記グラフト鎖が、下記式（１）で表される多座水素結合性基を側鎖に有する、細胞培養用足場材料が提供される。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005

　前記式（１）中、Ｒは炭素数が５０以下である基を表し、Ａｉはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、ｉは自然数を表し、ｎは２以上、４以下の整数を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合位置を表す。Ａｉは、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記多座水素結合性基が、下記式（２）、下記式（３）又は下記式（４）で表される多座水素結合性基である。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006

　前記式（２）中、Ｒ１は環状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ａ１及びＡ２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。Ａ１及びＡ２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007

　前記式（３）中、Ｒ１は環状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ｒ２はホウ素原子、リン原子、ケイ素原子、窒素原子、又は金属原子を表し、Ａ１及びＡ２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。Ａ１及びＡ２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008

　前記式（４）中、Ｒ３は鎖状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ａ１及びＡ２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。Ａ１及びＡ２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記多座水素結合性基が、前記式（２）又は前記式（３）で表される多座水素結合性基である。

　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記多座水素結合性基が、アミノ基、カルボキシル基、及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基を２個以上有する。

　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記多座水素結合性基が、カテコール骨格、フェニレンジアミン骨格、フェニルボロン酸骨格、ナフタレンボロン酸骨格、グリセロール骨格、エチレングリコール骨格、及びグリシン誘導体骨格からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨格を有する。

　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記細胞培養用足場材料は、動物由来の原料を実質的に含まない。

　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記合成樹脂の全構造単位１００モル％中、前記多座水素結合性基を有する構造単位の割合が、１モル％以上、３０モル％以下である。

　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記合成樹脂が、ポリビニルアルコール誘導体又はポリ（メタ）アクリル酸エステル誘導体である。

　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記合成樹脂が、ポリビニルアセタール骨格又はポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する。

　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記合成樹脂が、ポリビニルアセタール骨格を有する。

　本発明の広い局面によれば、容器本体と、上述した細胞培養用足場材料とを備え、前記容器本体の表面上に、前記細胞培養用足場材料が配置されている、細胞培養用容器が提供される。

　本発明によれば、細胞の定着性に優れる細胞培養用足場材料を提供することができる。また、本発明によれば、上記細胞培養用足場材料を用いた細胞培養用容器を提供することができる。

図１は、本発明の一実施形態に係る細胞培養用容器を模式的に示す断面図である。 図２は、本発明に係る細胞培養用足場材料を用いて細胞を培養した場合に、細胞の定着性が向上する推定メカニズムを説明するための模式図である。

　以下、本発明の詳細を説明する。

　（多座水素結合性基）

　本発明に係る細胞培養用足場材料は、細胞を培養するために用いられる。本発明に係る細胞培養用足場材料は、グラフト鎖の側鎖に下記式（１）で表される多座水素結合性基（以下、「多座水素結合性基」と略記することがある）を有する合成樹脂を含む。上記多座水素結合性基とは、２以上の水素結合を形成可能な基である。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　上記式（１）中、Ｒは炭素数が５０以下である基を表し、Ａｉはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、ｉは自然数を表し、ｎは２以上、４以下の整数を表し、＊は上記グラフト鎖を構成する他の原子との結合位置を表す。上記式（１）中、Ａｉは、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

　上記式（１）中、Ｒは環状骨格を有する基であってもよく、鎖状骨格を有する基であってもよい。細胞の定着性をより一層高める観点から、上記式（１）中、Ｒは環状骨格を有する基であることが好ましい。

　本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）中、Ｒの炭素数は、好ましくは４５以下、より好ましくは３０以下、さらに好ましくは２０以下である。

　上記式（１）中、Ａｉはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基である。本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）中、Ａｉは、アミノ基、カルボキシル基、及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基であることが好ましく、アミノ基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基であることがより好ましく、水酸基であることがさらに好ましい。

　本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）で表される多座水素結合性基は、アミノ基、カルボキシル基、及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基を１個以上有することが好ましく、２個以上有することがより好ましい。本発明の効果を更に一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）で表される多座水素結合性基は、アミノ基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基を１個以上有することが好ましく、水酸基を１個以上有することがより好ましく、水酸基を２個以上有することがさらに好ましい。

　上記式（１）中、ｎは２以上、４以下の整数である。本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）中、ｎは、好ましくは２又は３であり、より好ましくは２である。したがって、上記多座水素結合性基は、Ａｉを２個又は３個有することが好ましく、２個有することがより好ましい。

　また、本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）中、任意のＡｉと、その隣りのＡｉとの間に存在する原子数は、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個又は１個である。

　なお、上記式（１）中、任意のＡｉと、その隣りのＡｉとの間に存在する原子数とは、これら２個のＡｉを最短で結ぶ原子数を意味する。例えば、任意のＡｉと、その隣りのＡｉとの間に存在する原子数が２個であるとは、一方のＡｉが結合している原子と、他方のＡｉが結合している原子とが結合していることを意味する。また、例えば、任意のＡｉと、その隣りのＡｉとの間に存在する原子数が１個であるとは、一方のＡｉと他方Ａｉとが、同一の原子に結合していることを意味する。

　本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）で表される多座水素結合性基は、下記式（２）、下記式（３）又は下記式（４）で表される多座水素結合性基であることが好ましく、下記式（２）又は下記式（３）で表される多座水素結合性基であることがより好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記式（２）中、Ｒ１は環状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ａ１及びＡ２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は上記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。上記式（２）中、Ａ１及びＡ２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

　上記式（２）中、Ｒ１としては、例えば、芳香族環を有する基及び脂肪族環を有する基等が挙げられる。なお、脂肪族環は、環の一部に二重結合を有していてもよい。

　上記芳香族環を有する基としては、例えば、フェニル骨格を有する基、ナフチル骨格を有する基及びアントリル骨格を有する基等が挙げられる。細胞との接着性を高める観点から、上記芳香族環を有する基は、フェニル骨格を有する基又はナフチル骨格を有する基であることが好ましく、フェニル骨格を有する基であることがより好ましい。

　上記脂肪族環を有する基としては、例えば、シクロブチル基、シクロペンチル基及びシクロヘキシル基等が挙げられる。細胞との接着性を高める観点から、上記脂肪族環を有する基は、シクロペンチル基又はシクロへキシル基であることが好ましい。

　また、本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（２）中、Ａ１とＡ２との間に存在する原子数は、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個である。

　なお、上記式（２）中、Ａ１とＡ２との間に存在する原子数とは、Ａ１とＡ２とを最短で結ぶ原子数を意味する。例えば、Ａ１とＡ２との間に存在する原子数が２個であるとは、Ａ１が結合している原子と、Ａ２が結合している原子とが結合していることを意味する。

　本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（２）中、Ａ１及びＡ２は、Ｒ１の環状骨格を構成する２つの隣り合う原子にそれぞれ結合していることが特に好ましい。

　上記式（２）で表される多座水素結合性基としては、例えば、カテコール骨格を有する基、フェニレンジアミン骨格を有する基等が挙げられる。細胞の定着性を高める観点から、上記式（２）で表される多座水素結合性基は、カテコール骨格を有する基であることが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　上記式（３）中、Ｒ１は環状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ｒ２はホウ素原子、リン原子、ケイ素原子、窒素原子、又は金属原子を表し、Ａ１及びＡ２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は上記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。上記式（３）中、Ａ１及びＡ２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

　上記式（３）中、上記金属原子としては、白金原子及びアルミニウム原子等が挙げられる。

　本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（３）中、Ｒ２は、ホウ素原子、リン原子、ケイ素原子、又は窒素原子であることが好ましく、ホウ素原子であることがより好ましい。

　上記式（３）で表される多座水素結合性基としては、例えば、フェニルボロン酸骨格を有する基、ナフタレンボロン酸骨格を有する基等が挙げられる。細胞の定着性を高める観点から、上記式（３）で表される多座水素結合性基は、フェニルボロン酸骨格を有する基であることが好ましい。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　上記式（４）中、Ｒ３は鎖状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ａ１及びＡ２、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は上記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。上記式（４）中、Ａ１及びＡ２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

　上記式（４）中、Ｒ３は、直鎖である鎖状骨格を有する基であってもよく、分岐鎖を有する鎖状骨格を有する基であってもよい。上記Ｒ３としては、例えば、炭素数が５０以下であるアルキル基が挙げられる。

　また、本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（４）中、Ａ１とＡ２との間に存在する原子数は、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個である。

　なお、上記式（４）中、Ａ１とＡ２との間に存在する原子数とは、Ａ１とＡ２とを最短で結ぶ原子数を意味する。例えば、Ａ１とＡ２との間に存在する原子数２個であるとは、Ａ１が結合している原子と、Ａ２が結合している原子とが結合していることを意味する。

　上記式（４）で表される多座水素結合性基としては、例えば、グリセロール骨格を有する基、エチレングリコール骨格を有する基、グリシン誘導体骨格（末端の炭素にカルボキシル基とアミノ基が結合している構造）を有する基等が挙げられる。

　本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記多座水素結合性基は、環状骨格を有することが好ましい。上記環状骨格としては、芳香族環骨格、及び脂環式骨格等が挙げられる。該脂環式骨格は二重結合を有しない飽和脂環式骨格であってもよく、二重結合を有する不飽和脂環式骨格であってもよい。また、上記環状骨格は、該環状骨格を構成する原子に、炭素原子以外の原子を含んでいてもよい。

　上記環状骨格を構成している原子の数は、好ましくは５個以上、より好ましくは１０個以上、好ましくは４０個以下、より好ましくは３０個以下である。

　本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記多座水素結合性基は、カテコール骨格、フェニレンジアミン骨格、フェニルボロン酸骨格、ナフタレンボロン酸骨格、グリセロール骨格、エチレングリコール骨格、及びグリシン誘導体骨格からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨格を有することが好ましい。

　上記多座水素結合性基が環状骨格を有する場合に、水素結合性官能基（Ａｉ）は、該環状骨格を構成する原子に直接結合していてもよく、直接結合していなくてもよい。

　上記多座水素結合性基が環状骨格を有する場合に、上記多座水素結合性基は、環状骨格に直接結合した水素結合性官能基を有するか、又は、環状骨格に１個の原子を介して結合した水素結合性官能基を有することが好ましい。この場合には、本発明の効果を更に効果的に発揮することができる。

　（合成樹脂Ｘ）

　本発明に係る細胞培養用足場材料は、主鎖と、グラフト鎖とを有し、上記グラフト鎖が上記式（１）で表される多座水素結合性基を側鎖に有する合成樹脂（以下、「合成樹脂Ｘ」と記載することがある）を含む。したがって、本発明に係る細胞培養用足場材料は、合成樹脂Ｘを含む。合成樹脂Ｘは、複合樹脂であってもよい。上記合成樹脂Ｘは、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。また、上記合成樹脂Ｘは、上記多座水素結合性基を１種のみ有していてもよく、２種以上有していてもよい。

　上記多座水素結合性基は、グラフト鎖の主鎖に直接結合していてもよく、グラフト鎖の主鎖に他の基を介して結合していてもよい。

　合成樹脂Ｘは、例えば、以下の（１）又は（２）の方法により合成することができる。

　（１）主鎖のポリマーに対して、多座水素結合性基を有するモノマー、又は、多座水素結合性基を有するモノマーと多座水素結合性基を有さないモノマーとの混合モノマーをグラフト重合させる方法。

　（２）主鎖のポリマーに対して、側鎖に多座水素結合性基を有するポリマーを縮合等によって枝状に結合させる方法。

　上記多座水素結合性基を有するモノマー及び上記多座水素結合性基を有さないモノマーとしては、ビニル化合物、（メタ）アクリルモノマー及びマレイミド化合物等が挙げられる。上記モノマーは１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。合成樹脂Ｘを合成する際には、上記式（１）で表される多座水素結合性基を有するモノマーを、少なくとも１種用いることが好ましい。

　上記多座水素結合性基を有するモノマーとしては、（メタ）アクリロイル基を有し、かつ、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、及びチオール基からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の官能基を２個以上有するモノマー等が挙げられる。このような多座水素結合性基を有するモノマーとしては、例えば、ドーパミンアクリルアミド、４－メタクリルアミドフェニルボロン酸、グリセロールモノメタクリレート、ＤＬ－２－アリルグリシン、ビニルカテコール、３－メタクリルアミドフェニルボロン酸、２－［２－ヒドロキシ－５－［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］フェニル］－２Ｈ－ベンゾトリアゾール等が挙げられる。

　本発明に係る細胞培養用足場材料は、上記多座水素結合性基を有する合成樹脂Ｘを含むので、該多座水素結合性基と細胞（例えば、膜タンパク質、リン脂質、糖鎖、糖タンパク質、細胞外マトリックス及び接着タンパク質）とを良好に水素結合させることができ、かつ該水素結合の数を多くすることができる。そのため、本発明では、合成樹脂Ｘと細胞との親和性が高められ、その結果、細胞が細胞培養用足場材料から剥離しにくく、細胞の定着性を高めることができる。

　また、本発明に係る細胞培養用足場材料は、従来の天然高分子を用いた細胞足場材料と比べて、安価であり、ロット間のばらつきが小さく、安全性に優れる。

　図２は、本発明に係る細胞培養用足場材料を用いて細胞を培養した場合に、細胞の定着性が向上する推定メカニズムを説明するための模式図である。

　図２に示すように、細胞１０は、細胞膜上に膜タンパク質及び糖鎖を有する化合物等の水素結合を形成可能な物質１１を有する。また、本発明に係る細胞培養用足場材料２０は、上記多座水素結合性基を有する合成樹脂Ｘを含む。細胞を細胞培養用足場材料２０の表面に播種すると、上記多座水素結合性基と、細胞膜に存在する膜タンパク質及び糖鎖との間で、１つの多座水素結合性基あたり、２以上の水素結合３０が形成される。これによって、上記多座水素結合性基を介して、細胞１０と細胞培養用足場材料２０との間に強固な結合が形成される。従って、細胞と細胞培養用足場材料との接着性が向上し、その結果、細胞の定着性が向上するものと考えられる。

　また、本発明では、合成樹脂Ｘがグラフト鎖の側鎖に上記多座水素結合性基を有するので、細胞との接着性が向上しやすくなる。このメカニズムの詳細は不明であるが、同一のグラフト鎖に配置された複数の上記多座水素結合性基がクラスターを形成し、上記多座水素結合性基を介して、細胞と細胞培養用足場材料との間に強固な水素結合を形成するためと考えられる。

　上記合成樹脂Ｘとしては、ポリオレフィン誘導体、ポリエーテル誘導体、ポリビニルアルコール誘導体、ポリエステル誘導体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル誘導体、エポキシ樹脂誘導体、ポリアミド誘導体、ポリイミド誘導体、ポリウレタン誘導体、ポリカーボネート誘導体、セルロース誘導体、及びポリペプチド誘導体等が挙げられる。

　本発明の効果を効果的に発揮させる観点からは、上記合成樹脂Ｘは、ポリビニルアルコール誘導体又はポリ（メタ）アクリル酸エステル誘導体であることが好ましい。上記ポリビニルアルコール誘導体は、少なくともビニルアルコールをモノマーとして用いて合成される合成樹脂である。上記ポリ（メタ）アクリル酸エステル誘導体は、少なくともアクリル酸エステルをモノマーとして用いて合成される合成樹脂である。

　上記ポリビニルアルコール誘導体は、ポリビニルアセタール骨格を有する樹脂であることが好ましい。

　したがって、合成樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格又はポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有することが好ましい。この場合に、合成樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格を有する樹脂であってもよく、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する樹脂であってもよく、ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格との双方を有する樹脂であってもよい。

　本発明の効果を効果的に発揮させる観点からは、合成樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格を有する樹脂であるか、又はポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する樹脂であることが好ましい。合成樹脂Ｘは、少なくともポリビニルアセタール骨格を有する樹脂であることが好ましい。

　合成樹脂Ｘの全構造単位１００モル％中、上記多座水素結合性基を有する構造単位の割合（上記多座水素結合性基を有する構造単位の含有率）は、好ましくは１モル％以上、より好ましくは５モル％以上、好ましくは３０モル％以下、より好ましくは２０モル％以下である。上記割合が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。上記多座水素結合性基を有する構造単位は、例えば、多座水素結合性基を有するモノマーに由来する構造単位である。

　上記多座水素結合性基を有する構造単位の割合は、１Ｈ－ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）により測定することができる。

　細胞培養用足場材料１００重量％中、上記合成樹脂Ｘの含有量は、好ましくは７０重量％以上、より好ましくは７５重量％以上、更に好ましくは８０重量％以上、特に好ましくは９０重量％以上、最も好ましくは１００重量％（全量）である。したがって、上記細胞培養用足場材料は、合成樹脂Ｘであることが最も好ましい。上記合成樹脂Ｘの含有量が上記下限以上であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。

　＜ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂Ｘ＞

　細胞培養用足場材料は、ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂Ｘを含むことが好ましい。

　本明細書において、「ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂Ｘ」を、「ポリビニルアセタール樹脂Ｘ」と記載することがある。

　したがって、ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格及び多座水素結合性基を有する樹脂である。

　ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、側鎖にアセタール基と、アセチル基と、水酸基とを有する。また、ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、多座水素結合性基を有する。

　ポリビニルアセタール樹脂Ｘを合成する際には、ポリビニルアルコールをアルデヒドによりアセタール化する工程を少なくとも備える。

　ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）の平均重合度は、好ましくは１００以上、より好ましくは２００以上、更に好ましくは５００以上、特に好ましくは１５００以上、好ましくは６０００以下、より好ましくは３０００以下、更に好ましくは２５００以下である。上記平均重合度が上記下限以上であると、液体培地による膨潤を効果的に抑えることができるため、細胞培養用足場材料の強度を良好に維持することできる。そのため、細胞増殖性を高めることができる。また、上記平均重合度が上記上限以下であると、取扱性を高めることができ、細胞培養用足場材料の成形性を高めることができる。

　ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）の数平均分子量（Ｍｎ）は、好ましくは１００００以上、好ましくは６０００００以下である。ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）の重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは２０００以上、好ましくは１２０００００以下である。また、ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）において、数平均分子量（Ｍｎ）に対する重量平均分子量（Ｍｗ）の比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、好ましくは２．０以上、好ましくは４０以下である。上記Ｍｎ、上記Ｍｗ、上記Ｍｗ／Ｍｎが上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞培養用足場材料の強度を高めることができる。

　ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）のアセタール化度（ポリビニルブチラール樹脂の場合にはブチラール化度）は、好ましくは６０モル％以上、より好ましくは６５モル％以上、好ましくは９０モル％以下、より好ましくは８５モル％以下である。上記アセタール化度が上記下限以上であると、細胞の定着性をより高めることができ、細胞が効率よく増殖する。上記アセタール化度が上記上限以下であると、溶剤への溶解性を良好にすることができる。

　上記ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）のアセチル化度（アセチル基量）は、好ましくは０．０００１モル％以上、好ましくは５モル％以下である。

　上記ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）の水酸基の含有率（水酸基量）は、好ましくは１モル％以上、より好ましくは１０モル％以上、好ましくは８０モル％以下、より好ましくは６０モル％以下である。

　上記ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、多座水素結合性基を有するモノマー重合前のポリビニルアセタール樹脂のアセタール化度、アセチル化度（アセチル基量）及び水酸基量は、１Ｈ－ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）により測定することができる。

　上記ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、例えば、以下の（１）又は（２）の方法により合成することができる。（１）ポリビニルアセタール樹脂に、多座水素結合性基を有するモノマー、又は、多座水素結合性基を有するモノマーと多座水素結合性基を有さないモノマーとの混合モノマーをグラフト重合させる方法。（２）ポリビニルアセタール樹脂に、側鎖に多座水素結合性基を有するポリマーを縮合等によって枝状に結合させる方法。

　アセタール化度、水酸基量及びアセチル基量等の含有率の調整が容易であることから、ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール樹脂と、多座水素結合性基を有するモノマーとのグラフト共重合体であることが好ましい。また、ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール樹脂と、多座水素結合性基を有するモノマーと、上記多座水素結合性基を有するモノマー以外のモノマーとのグラフト共重合体であることがより好ましい。この場合、ポリビニルアセタール樹脂Ｘに含まれる多座水素結合性基と細胞とが結合しやすくなるため、細胞の定着性をより高めることができる。

　上記多座水素結合性基を有するモノマーとしては、上述したモノマーが挙げられる。

　上記多座水素結合性基を有するモノマー以外のモノマーとしては、多座水素結合性基を有さないビニル化合物等が挙げられる。

　上記多座水素結合性基を有さないビニル化合物としては、エチレン、アリルアミン、ビニルピロリドン、無水マレイン酸、マレイミド、イタコン酸、多座水素結合性基を有さない（メタ）アクリル酸、ビニルアミン及び多座水素結合性基を有さない（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。上記多座水素結合性基を有さないビニル化合物は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。なお、ポリビニルアセタール樹脂と（メタ）アクリル酸エステルとの共重合体については、後述する。

　＜ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する合成樹脂Ｘ＞

　細胞培養用足場材料は、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する合成樹脂Ｘを含むことが好ましい。

　本明細書において、「ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する合成樹脂Ｘ」を、「ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘ」と記載することがある。

　したがって、ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘは、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格及び多座水素結合性基を有する樹脂である。

　上記ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘは、（メタ）アクリル酸エステルと、上記多座水素結合性基を有するモノマーとを重合することにより得られる。なお、上記ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘは、上記（メタ）アクリル酸エステルと、上記多座水素結合性基を有するモノマーと、（メタ）アクリル酸エステル及び多座水素結合性基を有するモノマーの双方とは異なるモノマーとを共重合した樹脂であってもよい。

　上記（メタ）アクリル酸エステルとしては、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸環状アルキルエステル、（メタ）アクリル酸アリールエステル、（メタ）アクリルアミド類、（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類、及び（メタ）アクリル酸ホスホリルコリン等が挙げられる。

　上記（メタ）アクリル酸アルキルエステルとしては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ－プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ｎ－ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔ－ブチル（メタ）アクリレート、ｎ－オクチル（メタ）アクリレート、イソオクチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、イソノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、イソデシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、及びイソテトラデシル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

　なお、上記（メタ）アクリル酸アルキルエステルは、炭素数１～３のアルコキシ基及びテトラヒドロフルフリル基等の置換基で置換されていてもよい。このような（メタ）アクリル酸アルキルエステルの例としては、メトキシエチルアクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート等が挙げられる。

　上記（メタ）アクリル酸環状アルキルエステルとしては、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、及びイソボルニル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

　上記（メタ）アクリル酸アリールエステルとしては、フェニル（メタ）アクリレート、及びベンジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

　上記（メタ）アクリルアミド類としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ジメチル（メタ）アクリルアミド、(３－（メタ）アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、４－（メタ）アクリロイルモルホリン、３－（メタ）アクリロイル－２－オキサゾリジノン、Ｎ－[３－(ジメチルアミノ)プロピル]（メタ）アクリルアミド、Ｎ－(２－ヒドロキシエチル)（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メチロール（メタ）アクリルアミド、及び６－（メタ）アクリルアミドヘキサン酸等が挙げられる。

　上記（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類としては、例えば、メトキシ－ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ－ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ－ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ－ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ－ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ－ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ－トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、エトキシ－トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、及びヒドロキシ－トリエチレングルコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。

　上記（メタ）アクリル酸ホスホリルコリンとしては、２－（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等が挙げられる。

　上記多座水素結合性基を有するモノマーとしては、上述したモノマーが挙げられる。

　上記（メタ）アクリル酸エステル及び多座水素結合性基を有するモノマーの双方とは異なるモノマーとしては、（メタ）アクリル酸、エチレン、ビニルエステル等が挙げられる。

　なお、本明細書において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」又は「メタクリル」を意味し、「（メタ）アクリレート」とは、「アクリレート」又は「メタクリレート」を意味する。

　ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘの数平均分子量（Ｍｎ）は、好ましくは１００以上、好ましくは２０００００以下である。ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１００以上、好ましくは２０００００以下である。

　＜ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘ＞

　細胞培養用足場材料は、ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘを含むことが好ましい。上記合成樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する複合樹脂であることが好ましい。

　上記ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格及び多座水素結合性基を有する樹脂である。

　上記ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘは、例えば、上述したポリビニルアセタール樹脂Ｘの合成方法及びポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘの合成方法を適宜組み合わせることにより合成することができる。

　ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘは、上述したポリビニルアセタール樹脂に上述した（メタ）アクリル酸エステルがグラフト共重合された合成樹脂Ｘであることが好ましい。

　ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘの数平均分子量（Ｍｎ）は、好ましくは１００００以上、好ましくは６０００００以下である。ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは２０００以上、好ましくは１２０００００以下である。また、ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘにおいて、数平均分子量（Ｍｎ）に対する重量平均分子量（Ｍｗ）の比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、好ましくは２．０以上、好ましくは４０以下である。上記Ｍｎ、上記Ｍｗ、上記Ｍｗ／Ｍｎが上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞培養用足場材料の強度を高めることができる。

　合成樹脂Ｘ以外のポリマー：

　上記細胞培養用足場材料は、合成樹脂Ｘ以外のポリマーを含んでいてもよい。該ポリマーとしては、ポリオレフィン樹脂、ポリエーテル樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリエステル、エポキシ樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリカーボネート樹脂、セルロース、及びポリペプチド等が挙げられる。

　本発明の効果を効果的に発揮させる観点からは、合成樹脂Ｘ以外のポリマーの含有量は少ないほどよい。上記細胞培養用足場材料１００重量％中、該ポリマーの含有量は、好ましくは２０重量％以下、より好ましくは１０重量％以下、更に好ましくは５重量％以下、特に好ましくは１重量％以下、最も好ましくは０重量％（未含有）である。したがって、細胞培養用足場材料は、合成樹脂Ｘ以外のポリマーを含まないことが最も好ましい。

　本発明に係る細胞培養用足場材料は、動物由来の原料を実質的に含まないことが好ましい。動物由来の原料を実質的に含まないことにより、ロット間のばらつきが少なく、コスト、安全性に優れる細胞培養用足場材料を提供することができる。なお、「動物由来の原料を実質的に含まない」とは、細胞培養用足場材料中における動物由来の原料が、３重量％以下であることを意味する。本発明に係る細胞培養用足場材料は、細胞培養用足場材料中における動物由来の原料が、１重量％以下であることが好ましく、０重量％であることがより好ましい。すなわち、上記細胞培養用足場材料は、細胞培養用足場材料中に動物由来の原料を含まないことがより好ましい。

　（細胞培養用足場材料の他の詳細）

　本発明に係る細胞培養用足場材料は、細胞を培養するために用いられる。本発明に係る細胞培養用足場材料は、細胞を培養する際の該細胞の足場として用いられる。

　上記細胞としては、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ及びサル等の動物細胞が挙げられる。また、上記細胞としては、体細胞、幹細胞、前駆細胞及び分化細胞等が挙げられる。上記体細胞は、癌細胞であってもよい。

　上記幹細胞としては、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、胚性がん細胞、胚性生殖幹細胞、及びｍＧＳ細胞等が挙げられる。

　上記細胞培養用足場材料の形状は特に限定されない。上記細胞培養用足場材料の形状は、膜状であっても、粒子状であってもよい。膜状には、フィルム状、シート状が含まれる。

　上記細胞培養用足場材料は、細胞の二次元培養（平面培養）、三次元培養又は浮遊培養に用いられることが好ましく、二次元培養（平面培養）に用いられることがより好ましい。

　また、上記細胞培養用足場材料は、該細胞培養用足場材料と、多糖類とを含む細胞培養用担体（媒体）として用いることもできる。上記多糖類は、特に限定されず、従来公知の多糖類を用いることができる。上記多糖類は、水溶性多糖類であることが好ましい。

　また、上記細胞培養用足場材料は、繊維本体と、該繊維本体の表面上に配置された細胞培養用足場材料とを備える細胞培養用繊維として用いることもできる。この場合、細胞培養用足場材料は、繊維本体の表面に塗布されていることが好ましく、塗布物であることが好ましい。この細胞培養用繊維では、繊維本体中に細胞培養用足場材料が存在していてもよい。例えば、繊維本体を液状の細胞培養用足場材料に含浸したり、練り込んだりすることにより細胞培養用足場材料を繊維本体中に存在させることができる。幹細胞は、一般に、平面構造には接着しにくく、線維状構造などの立体構造には接着しやすい性質を有するため、細胞培養用繊維は、幹細胞の三次元培養に好適に用いられる。幹細胞のなかでも、脂肪幹細胞の三次元培養により好適に用いられる。

　上記細胞培養用足場材料における合成樹脂は、架橋されていてもよい。架橋された合成樹脂を含む細胞培養用足場材料は、水膨潤性が効果的に抑制され、強度を高めることができる。架橋剤を用いることにより、合成樹脂を架橋させることができる。

　（細胞培養用容器）

　本発明に係る細胞培養用容器は、容器本体と、上述した細胞培養用足場材料とを備え、上記容器本体の表面上に、該細胞培養用足場材料が配置されている。

　図１は、本発明の一実施形態に係る細胞培養用容器を模式的に示す断面図である。

　細胞培養用容器１は、容器本体２と、細胞培養用足場材料３とを備える。容器本体２の表面２ａ上に細胞培養用足場材料３が配置されている。容器本体２の底面上に細胞培養用足場材料３が配置されている。細胞培養用容器１に液体培地を添加し、また、細胞塊等の細胞を細胞培養用足場材料３の表面に播種することで、細胞を平面培養することができる。

　なお、容器本体は、第１の容器本体の底面上にカバーガラス等の第２の容器本体を備えていてもよい。第１の容器本体と第２の容器本体とは分離可能であってもよい。この場合、第２の容器本体の表面上に、該細胞培養用足場材料が配置されていてもよい。

　上記容器本体として、従来公知の容器本体（容器）を用いることができる。上記容器本体の形状および大きさは特に限定されない。

　上記容器本体としては、１個又は複数個のウェル（穴）を備える細胞培養用プレート、及び細胞培養用フラスコ等が挙げられる。上記プレートのウェル数は特に限定されない。該ウェル数としては、特に限定されないが、例えば、２、４、６、１２、２４、４８、９６、３８４等が挙げられる。上記ウェルの形状としては、特に限定されないが、真円、楕円、三角形、正方形、長方形、五角形等が挙げられる。上記ウェル底面の形状としては、特に限定されないが、平底、丸底、凹凸等が挙げられる。上記容器本体の材質は特に限定されないが、樹脂、金属及び無機材料が挙げられる。

　以下に実施例及び比較例を掲げて本発明を更に詳しく説明する。本発明はこれら実施例のみに限定されない。

　細胞培養用足場材料の材料として、以下の合成樹脂Ｘ１～Ｘ１５、Ｙ１～Ｙ４を用意した。合成樹脂Ｘ１～Ｘ１５に用いた多座水素結合性基を有するモノマーの詳細を、表１に示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013

　なお、得られた合成樹脂における構造単位の含有率は、合成樹脂をＤＭＳＯ－ｄ６（ジメチルスルホキサイド）に溶解した後、１Ｈ-ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）により測定した。合成樹脂が有する各構造単位の含有率を表２～４に示した。なお、表中、多座水素結合性基の含有率は、多座水素結合性基を有する構造単位の割合である。

　合成樹脂Ｘ１：合成例Ｘ１

　攪拌装置を備えた反応機に、イオン交換水２７００ｍＬ、平均重合度２５０、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを３００重量部投入し、攪拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。得られた溶液に、触媒として、塩酸濃度が０．２重量％となるように３５重量％塩酸を添加した。次いで、温度を１５℃に調整し、攪拌しながらｎ－ブチルアルデヒド２２重量部を添加した。次いで、ｎ－ブチルアルデヒド１４８重量部を添加し、白色粒子状のポリビニルブチラール樹脂を析出させた。析出してから１５分後に、塩酸濃度が１．８重量％になるように３５重量％塩酸を添加した後、５０℃に加熱し、５０℃で２時間保持した。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラール樹脂を水洗し、乾燥させて、ポリビニルブチラール樹脂（平均重合度２５０、アセタール化度（ブチラール化度）７１モル％、水酸基量２８モル％、アセチル基量１モル％）を得た。

　このポリビニルブチラール樹脂９５重量部を、２０重量％の溶液となるようにテトラヒドロフランに溶解させ、開始剤としてイルガキュア１８４を０．１重量部及びドーパミンアクリルアミド５重量部を添加し、グラフト重合を行うことで、合成樹脂Ｘ１を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ１は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３８モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度６０モル％、多座水素結合性基の含有率１モル％であった。

　合成樹脂Ｘ２：合成例Ｘ２

　ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及びドーパミンアクリルアミドの配合量を５重量部から１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ１と同様にして、合成樹脂Ｘ２を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ２は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ２において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３７モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度５９モル％、多座水素結合性基の含有率３モル％であった。

　合成樹脂Ｘ３：合成例Ｘ３

　ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から８０重量部に変更したこと、及びドーパミンアクリルアミドの配合量を５重量部から２０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ１と同様にして、合成樹脂Ｘ３を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ３は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ３において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３６モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度５７モル％、多座水素結合性基の含有率７モル％であった。

　合成樹脂Ｘ４：合成例Ｘ４

　ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及びグラフト重合する際に、ドーパミンアクリルアミド５重量部と、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド５重量部とを用いたこと以外は、合成例Ｘ１と同様にして、合成樹脂Ｘ４を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ４は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ４において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３８モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度５９モル％、多座水素結合性基の含有率２モル％であった。

　合成樹脂Ｘ５：合成例Ｘ５

　ドーパミンアクリルアミド５重量部に代えて、４－メタクリルアミドフェニルボロン酸５重量部を用いたこと以外は、合成例Ｘ１と同様にして、合成樹脂Ｘ５を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ５は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてボロン酸骨格（フェニルボロン酸骨格）を有する基を有する。合成樹脂Ｘ５において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３８モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度６０モル％、多座水素結合性基の含有率１モル％であった。

　合成樹脂Ｘ６：合成例Ｘ６

　ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及び４－メタクリルアミドフェニルボロン酸の配合量を５重量部から１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ５と同様にして、合成樹脂Ｘ６を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ６は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてボロン酸骨格（フェニルボロン酸骨格）を有する基を有する。合成樹脂Ｘ６において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３７モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度５９モル％、多座水素結合性基の含有率３モル％であった。

　合成樹脂Ｘ７：合成例Ｘ７

　平均重合度１７００、ブチラール化度６３モル％、水酸基量３４モル％、アセチル化度３モル％のポリビニルブチラール樹脂を用いたこと以外は、合成例Ｘ１と同様にして、合成樹脂Ｘ７を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ７は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ７において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３４モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６２モル％、多座水素結合性基の含有率１モル％であった。

　合成樹脂Ｘ８：合成例Ｘ８

　ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及びドーパミンアクリルアミドの配合量を５重量部から１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ７と同様にして、合成樹脂Ｘ８を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ８は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ８において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３３モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６２モル％、多座水素結合性基の含有率２モル％であった。

　合成樹脂Ｘ９：合成例Ｘ９

　ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から８０重量部に変更したこと、及びドーパミンアクリルアミドの配合量を５重量部から２０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ７と同様にして、合成樹脂Ｘ９を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ９は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ９において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３２モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６０モル％、多座水素結合性基の含有率５モル％であった。

　合成樹脂Ｘ１０：合成例Ｘ１０

ドーパミンアクリルアミド５重量部に代えて、グリセリンモノメタクリレート５重量部を用いたこと以外は、合成例Ｘ７と同様にして、合成樹脂Ｘ１０を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ１０は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてエチレングリコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１０において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３４モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６２モル％、多座水素結合性基の含有率１モル％であった。

　合成樹脂Ｘ１１：合成例Ｘ１１

　ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及びグリセリンモノメタクリレートの配合量を５重量部から１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ１０と同様にして、合成樹脂Ｘ１１を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ１１は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてエチレングリコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１１において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３３モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６１モル％、多座水素結合性基の含有率３モル％であった。

　合成樹脂Ｘ１２：合成例Ｘ１２

　ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から８０重量部に変更したこと、及びグリセリンモノメタクリレートの配合量を５重量部から２０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ７と同様にして、合成樹脂Ｘ１２を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ１２は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてエチレングリコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１２において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３２モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度５９モル％、多座水素結合性基の含有率６モル％であった。

　合成樹脂Ｘ１３：合成例Ｘ１３

　グリセリンモノメタクリレート１０重量部に代えて、ＤＬ－２－アリルグリシン１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ１１と同様にして、合成樹脂Ｘ１３を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ１３は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてアミノ基とカルボキシル基を有する。合成樹脂Ｘ１３において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３３モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６０モル％、多座水素結合性基の含有率４モル％であった。

　合成樹脂Ｘ１４：合成例Ｘ１４

　ドーパミンアクリルアミド５重量部に代えて、４－メタクリルアミドフェニルボロン酸５重量部を用いたこと以外は、合成例Ｘ７と同様にして、合成樹脂Ｘ１４を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ１４は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてボロン酸骨格（フェニルボロン酸骨格）を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１４において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３３モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６２モル％、多座水素結合性基の含有率２モル％であった。

　合成樹脂Ｘ１５：合成例Ｘ１５

　ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及び４－メタクリルアミドフェニルボロン酸の配合量を５重量部から１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ１４と同様にして、合成樹脂Ｘ１５を得た。

　得られた合成樹脂Ｘ１５は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてボロン酸骨格（フェニルボロン酸骨格）を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１５において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３３モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６１モル％、多座水素結合性基の含有率３モル％であった。

　合成樹脂Ｙ１：合成例Ｙ１

　攪拌装置を備えた反応機に、イオン交換水２７００ｍＬ、平均重合度２５０、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを３００重量部投入し、攪拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。得られた溶液に、触媒として、塩酸濃度が０．２重量％となるように３５重量％塩酸を添加した。次いで、温度を１５℃に調整し、攪拌しながらｎ－ブチルアルデヒド２２重量部を添加した。次いで、ｎ－ブチルアルデヒド１４８重量部を添加し、白色粒子状のポリビニルブチラール樹脂を析出させた。析出してから１５分後に、塩酸濃度が１．８重量％となるように３５重量％塩酸を添加した後、５０℃に加熱し、５０℃で２時間保持した。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラール樹脂を水洗し、乾燥させて、ポリビニルブチラール樹脂である合成樹脂Ｙ１を得た。

　得られた合成樹脂Ｙ１は、平均重合度２５０、水酸基量５７モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度４０モル％であった。

　合成樹脂Ｙ２：合成例Ｙ２

　酢酸ビニルモノマーをメタノールに溶解させ、開始剤を添加しながら６５℃、５時間攪拌させ、重合した。得られた酢酸ビニルポリマー溶液に水酸化ナトリウム水溶液（１０％）を添加し、６０分間けん化反応を行った。オーブンにて乾燥させ、合成樹脂Ｙ２を得た。

　得られた合成樹脂Ｙ２は、平均重合度１０００、水酸基量９８モル％、アセチル基量２モル％であった。

　合成樹脂Ｙ３：合成例Ｙ３

　攪拌装置を備えた反応機に、イオン交換水２７００ｍＬ、平均重合度２５０、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを３００重量部投入し、攪拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。得られた溶液に、触媒として、塩酸濃度が０．２重量％となるように３５重量％塩酸を添加した。次いで、温度を１５℃に調整し、攪拌しながらｎ－ブチルアルデヒド２２重量部を添加した。次いで、ｎ－ブチルアルデヒド１４８重量部を添加し、白色粒子状のポリビニルブチラール樹脂を析出させた。析出してから１５分後に、塩酸濃度が１．８重量％になるように３５重量％塩酸を添加した後、５０℃に加熱し、５０℃で２時間保持した。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラール樹脂を水洗し、乾燥させて、合成樹脂Ｙ３を得た。

　得られた合成樹脂Ｙ３は、平均重合度２５０、水酸基量２８モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度７１モル％であった。

　合成樹脂Ｙ４：合成例Ｙ４

　攪拌装置を備えた反応機に、イオン交換水２７００ｍＬ、平均重合度１７００、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを３００重量部投入し、攪拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。得られた溶液に、触媒として、塩酸濃度が０．２重量％となるように３５重量％塩酸を添加した。次いで、温度を１５℃に調整し、攪拌しながらｎ－ブチルアルデヒド２２重量部を添加した。次いで、ｎ－ブチルアルデヒド１４８重量部を添加し、白色粒子状のポリビニルブチラール樹脂を析出させた。析出してから１５分後に、塩酸濃度が１．８重量％となるように３５重量％塩酸を添加した後、５０℃に加熱し、５０℃で２時間保持した。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラール樹脂を水洗し、乾燥させて、ポリビニルブチラール樹脂である合成樹脂Ｙ４を得た。

　得られた合成樹脂Ｙ４は、平均重合度１７００、水酸基量３４モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６３モル％であった。

　（実施例１～６及び比較例１～４）

　細胞培養用容器の作製：

　表２に示す合成樹脂１重量部をブタノール１９重量部に溶解させた。得られた溶液１５０μＬを、エアダスターで除塵したφ２２ｍｍのカバーガラス（松浪社製「２２丸Ｎｏ．１」）の表面上に吐出し、スピンコーターを用いて２０００ｒｐｍ、２０秒回転させた後、６０℃で６０分間加熱して、表面が平滑な樹脂膜（細胞培養用足場材料）を得た。得られた樹脂膜とカバーガラスとの積層体を、φ２２ｍｍのポリスチレンディッシュに配置することにより細胞培養用容器を得た。

　なお、比較例１では、ポリスチレンディッシュ自体を細胞培養用容器として用いた。

　細胞塊の播種及び培養：

　以下の液体培地及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）特異的阻害剤を用意した。

　ＴｅＳＲ　Ｅ８培地（ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬ社製）

　ＲＯＣＫ－Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２）

　得られた細胞培養用容器にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて３７℃のインキュベーター内で１時間静置後、細胞培養用容器からリン酸緩衝生理食塩水を除去した。

　φ３５ｍｍディッシュにコンフルエント状態になったｈ－ｉＰＳ細胞２５２Ｇ１のコロニーを配置し、０．５ｍＭエチレンジアミン／リン酸緩衝溶液１ｍＬを加え、室温で２分静置した。エチレンジアミン／リン酸緩衝溶液を除去した後、液体培地１ｍＬでピペッティングすることにより５０μｍ～２００μｍの大きさに砕かれた細胞塊を得た。得られた細胞塊（細胞数１．０×１０５ｃｅｌｌｓ）を上記の細胞培養用容器にクランプ播種した。

　播種時は１．５ｍＬの液体培地と、終濃度が１０μＭとなるようにＲＯＣＫ特異的阻害剤とを細胞培養用容器に添加した。また、３７℃及びＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養を行った。２４時間毎に、液体培地を１ｍＬ除去し、ＲＯＣＫ特異的阻害剤を添加していない新鮮な液体培地を１ｍＬ加えることで培地交換を行った。

　（評価）

　（１）細胞塊の定着性

　播種から２４時間毎の培地交換の後に、顕微鏡で写真を撮影した。得られた顕微鏡写真から、播種した細胞塊が、細胞培養用足場材料から剥離するまでの日数を確認した。

　＜細胞塊の定着性の判定基準＞

　○○○：培養開始後、５日目以降に細胞塊の剥離が生じる

　○○：培養開始後、４日目に細胞塊の剥離が生じる

　○：培養開始後、３日目に細胞塊の剥離が生じる

　×：培養開始後、１、２日目に細胞塊の剥離が生じる

　詳細及び結果を下記の表２に示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014

　（実施例７～１５及び比較例５～７）

　細胞培養用容器の作製：

　表３，４に示す合成樹脂１重量部をブタノール１９重量部に溶解させた。得られた溶液１５０μＬを、エアダスターで除塵したφ２２ｍｍのカバーガラス（松浪社製「２２丸Ｎｏ．１」）の表面上に吐出し、スピンコーターを用いて２０００ｒｐｍ、２０秒回転させた後、６０℃で６０分間加熱して、表面が平滑な樹脂膜（細胞培養用足場材料）を得た。得られた樹脂膜とカバーガラスとの積層体を、φ２２ｍｍのポリスチレンディッシュに配置することにより細胞培養用容器を得た。

　細胞の播種及び培養：

　以下の液体培地及び添加剤を用意した。液体培地であるＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ　Ｐｌｕｓ　Ｍｅｄｉｕｍに終濃度が１Ｘとなるように、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ　Ｐｌｕｓ　５００Ｘ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及びＬ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　２００ｍｍｏｌ／Ｌ（１００Ｘ）を加えた。

　ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ　Ｐｌｕｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）

　ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ　Ｐｌｕｓ　５００Ｘ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）

　Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　２００ｍｍｏｌ／Ｌ（１００Ｘ）（富士フイルム和光純薬社製）

　以下の細胞を間葉系幹細胞（ＭＳＣ）として用意した。ＭＳＣを含む骨髄間質細胞をＭＳＣ用培地で馴化し、ＭＳＣの陽性マーカー（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）が９５％以上、ＭＳＣの陰性マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５）が５％未満の純度である細胞をＭＳＣとして使用した。

　Ｈｕｍａｎ　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　ｉｎ　ＡＣＦ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）

　得られた細胞培養用容器にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて３７℃のインキュベーター内で１時間静置後、細胞培養用容器からリン酸緩衝生理食塩水を除去した。

　φ３５ｍｍディッシュにコンフルエント状態になったＭＳＣを配置し、ＡＣＦ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）２ｍＬを加え、３７℃及びＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で３分静置した。さらに、ＡＣＦ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）２ｍＬを加えた。３００ｒｐｍで８分間遠心後、上清を除去して、液体培地で懸濁し細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液（細胞数８．０×１０４ｃｅｌｌｓ）を上記の細胞培養用容器に播種した。

　播種時は１．５ｍＬの液体培地を細胞培養用容器に添加した。また、３７℃及びＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養を行った。

　（評価）

　（１）細胞の定着性

　播種から１日後、３日後、４日後、５日後に、顕微鏡で写真を撮影した。得られた顕微鏡写真から、播種した細胞が、細胞培養用足場材料に接着し、増殖する日数を確認した。

　＜細胞の定着性の判定基準＞

　○○○：培養開始後、１日目に細胞が接着し、４日目を超えても接着及び増殖を維持する

　○○：培養開始後、１日目に細胞が接着し、３日目まで接着及び増殖を維持する

　○：培養開始後、１日目に細胞が接着し、３日目を超えても接着を維持する（増殖はしない）

　×：培養開始後、１日目に細胞が接着せず剥離が生じる

　詳細及び結果を下記の表３，４に示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016

　１…細胞培養用容器

　２…容器本体

　２ａ…表面

　３…細胞培養用足場材料

　１０…細胞

　１１…水素結合を形成可能な物質

　２０…細胞培養用足場材料

　３０…水素結合

Claims (11)


  1. 　主鎖と、グラフト鎖とを有する合成樹脂を含み、

    　前記グラフト鎖が、下記式（１）で表される多座水素結合性基を側鎖に有する、細胞培養用足場材料。

    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    　前記式（１）中、Ｒは炭素数が５０以下である基を表し、Ａｉはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、ｉは自然数を表し、ｎは２以上、４以下の整数を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合位置を表す。Ａｉは、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

  2. 　前記多座水素結合性基が、下記式（２）、下記式（３）又は下記式（４）で表される多座水素結合性基である、請求項１に記載の細胞培養用足場材料。

    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    　前記式（２）中、Ｒ１は環状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ａ１及びＡ２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。Ａ１及びＡ２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    　前記式（３）中、Ｒ１は環状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ｒ２はホウ素原子、リン原子、ケイ素原子、窒素原子、又は金属原子を表し、Ａ１及びＡ２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。Ａ１及びＡ２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    　前記式（４）中、Ｒ３は鎖状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ａ１及びＡ２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。Ａ１及びＡ２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

  3. 　前記多座水素結合性基が、前記式（２）又は前記式（３）で表される多座水素結合性基である、請求項２に記載の細胞培養用足場材料。

  4. 　前記多座水素結合性基が、アミノ基、カルボキシル基、及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基を２個以上有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。

  5. 　前記多座水素結合性基が、カテコール骨格、フェニレンジアミン骨格、フェニルボロン酸骨格、ナフタレンボロン酸骨格、グリセロール骨格、エチレングリコール骨格、及びグリシン誘導体骨格からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨格を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。

  6. 　動物由来の原料を実質的に含まない、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。

  7. 　前記合成樹脂の全構造単位１００モル％中、前記多座水素結合性基を有する構造単位の割合が、１モル％以上、３０モル％以下である、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。

  8. 　前記合成樹脂が、ポリビニルアルコール誘導体又はポリ（メタ）アクリル酸エステル誘導体である、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。

  9. 　前記合成樹脂が、ポリビニルアセタール骨格又はポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。

  10. 　前記合成樹脂が、ポリビニルアセタール骨格を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。

  11. 　容器本体と、

    　請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料とを備え、

    　前記容器本体の表面上に、前記細胞培養用足場材料が配置されている、細胞培養用容器。
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