CN116783280A

CN116783280A - 细胞培养用微载体和细胞的培养方法

Info

Publication number: CN116783280A
Application number: CN202280012745.2A
Authority: CN
Inventors: 高仓健太; 羽根田聪; 中村雄太
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2022-02-02
Publication date: 2023-09-19
Also published as: CN116829695A

Abstract

本发明提供一种能够抑制细胞的培养过程中的微载体的破损，能够提高细胞的培养效率的细胞培养用微载体。本发明的细胞培养用微载体具备：基材粒子、和包覆所述基材粒子的外表面的包覆层，所述细胞培养用微载体的断裂点强度为1000mN以上。

Description

细胞培养用微载体和细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养用微载体。此外，本发明涉及使用了所述细胞培养用微载体的细胞的培养方法。

背景技术

在学术领域、药物开发领域和再生医疗领域等的研究开发中，使用了人、小鼠、大鼠、猪、牛和猴子等的动物细胞。作为细胞的培养方法，已知有使用微载体的方法。

以往，作为所述微载体，广泛使用了基材粒子被细胞外基体(ECM)包覆而成的微载体。例如，下述专利文献1中记载了具有聚苯乙烯粒子和配置于该聚苯乙烯粒子的外表面的玻连蛋白的微载体。

此外，还已知基材粒子被合成树脂包覆的微载体。例如，下述专利文献2中记载了具备聚苯乙烯粒子和配置于该聚苯乙烯粒子的外表面的合成树脂层的微载体。所述合成树脂层包含键合有肽的合成树脂。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2011/017167A1

专利文献2：WO2011/017050A1

发明内容

发明所要解决的技术问题

专利文献1、2中记载的以往的微载体使用了聚苯乙烯粒子等交联度小的树脂粒子作为基材粒子。因此，在以往的微载体中，在细胞的培养过程中，微载体有时会破损。例如，在以往的微载体中，在培养细胞时微载体彼此碰撞，或者在培养基的更换作业时对微载体施加冲击，有时微载体发生缺损或破裂。在使用大量培养装置以数百升规模以上培养细胞的过程中，特别容易产生这样的微载体的破损。

在微载体发生了破损的情况下，难以将微载体的碎片与细胞分离，因此例如在细胞制剂中有时会混入该碎片。

此外，优选细胞的培养效率高。

本发明的目的在于提供一种能够抑制细胞的培养过程中的微载体的破损，能够提高细胞的培养效率的细胞培养用微载体。此外，本发明的目的还在于提供一种使用了所述细胞培养用微载体的细胞的培养方法。

解决技术问题的技术手段

根据本发明的广泛方面，提供一种细胞培养用微载体(以下，有时简称为微载体)，其具备基材粒子和包覆所述基材粒子的外表面的包覆层，所述细胞培养用微载体的断裂点强度为1000mN以上。

在本发明的微载体的一个特定方面，进行压缩试验时得到的压缩位移曲线在负载700mN以下不具有拐点。

在本发明的微载体的一个特定方面，吸水率为10重量％以下。

在本发明的微载体的一个特定方面，所述包覆层包含合成树脂。

在本发明的微载体的一个特定方面，所述合成树脂具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架。

在本发明的微载体的一个特定方面，所述包覆层包含肽部。

在本发明的微载体的一个特定方面，所述基材粒子为树脂粒子。

在本发明的微载体的一个特定方面，所述基材粒子包含具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物。

在本发明的微载体的一个特定方面，所述具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物是丙烯酸类树脂、二乙烯基苯聚合物或二乙烯基苯共聚物。

在本发明的微载体的一个特定方面，比重为1.0g/cm³以上2.0g/cm³以下。

在本发明的微载体的一个特定方面，平均粒径为100μm以上1500μm以下。

在本发明的微载体的一个特定方面，粒径的CV值为10％以下。

根据本发明的广泛方面，提供一种细胞的培养方法，其具备：将细胞粘附至上述细胞培养用微载体的工序。

发明效果

本发明的细胞培养用微载体具备基材粒子和包覆所述基材粒子的外表面的包覆层，所述细胞培养用微载体的断裂点强度为1000mN以上。在本发明的细胞培养用微载体中，由于具备所述构成，因此能够抑制细胞的培养过程中的微载体的破损，能够提高细胞的培养效率。

附图说明

[图1]图1是示意性地表示本发明的一个实施方式的细胞培养用微载体的截面图。

[图2]图2是在比较例1中观察到的破损的微载体的照片。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

(细胞培养用微载体)

本发明的细胞培养用微载体(以下，有时简称为“微载体”)具备基材粒子和包覆所述基材粒子的外表面的包覆层，所述细胞培养用微载体的断裂点强度为1000mN以上。

在本发明的微载体中，由于具备所述构成，因此能够抑制细胞的培养过程中的微载体的破损，能够提高细胞的培养效率。

现有的微载体的强度相对较小。因此，在以往的微载体中，在细胞培养时微载体彼此碰撞，或者在培养基的更换作业时对微载体施加冲击，有时微载体发生缺损或破裂。这样的微载体的破损在使用大量培养装置培养细胞的过程中特别容易产生，因此有时难以在数百升规模的细胞培养中使用以往的微载体。

与之相对，本发明的微载体的强度较大。因此，在本发明的微载体中，即使在细胞培养时微载体彼此碰撞、或在培养基的更换作业时对微载体施加冲击，微载体也不易缺损或破裂。因此，在本发明的微载体中，例如在细胞制剂中，能够将混入微载体的碎片的风险抑制得较低。

此外，在本发明的微载体中，能够提高细胞的培养效率。

本发明的微载体可以适宜地用于数十毫升规模的细胞培养至数百升规模以上的细胞培养。

此外，在本发明的微载体中，不需要使用细胞外基体(ECM)等天然高分子材料作为材料，因此廉价，批次间的偏差小，安全性优异。

从抑制细胞的培养过程中的微载体的破损的观点出发，所述微载体的断裂点强度为1000mN以上。即，所述微载体在小于1000mN时不具有断裂点强度。

所述微载体的断裂点强度优选为1100mN以上，更优选为1200mN以上，进一步优选为1500mN以上。若所述断裂点强度为所述下限以上，则能够更有效地抑制细胞的培养过程中的微载体的破损。需要说明的是，所述微载体的断裂点强度的上限没有特别限定。所述微载体的断裂点强度可以为10000m N以下。

所述微载体的断裂点强度是压缩微载体时的断裂点强度。所述微载体的断裂点强度是进行下述压缩试验时的断裂点强度。所述微载体的断裂点强度可以如下测定。

使用微小强度评价试验装置，在圆柱(直径500μm，金刚石制)的平滑压头端面，在25℃、以0.3N/秒负载最大试验负载2000mN的条件下进行微载体的压缩试验。将微载体断裂时的负载作为微载体的断裂点强度。作为所述微小强度评价试验装置，例如使用岛津制作所公司制“MICROAUTOGRAPH MST-I”等。

所述微载体的断裂点强度，例如可以通过使用交联度大的树脂作为基材粒子的材料、或使用包含填料的基材粒子作为基材粒子的材料、或使用具有柔软的分子结构的树脂作为基材粒子的材料来进行增大。

在所述微载体中，优选进行压缩试验时得到的压缩位移曲线在负载700m N以下不具有拐点。在该情况下，能够更有效地抑制细胞的培养过程中的微载体的破损。

需要说明的是，用于得到所述压缩位移曲线的所述压缩试验的条件与用于求出所述断裂点强度的所述压缩试验的条件相同。所述压缩位移曲线可以如下得到。

在所述微载体的压缩试验中，测定负载值(mN)和压缩位移(μm)，制备表示压缩位移(x轴)与负载值(y轴)的关系的压缩位移曲线。将得到的压缩位移曲线的切线的斜率从增加转为减少的点作为拐点。确认所得到的压缩位移曲线在负载700mN以下是否具有拐点。

需要说明的是，在压缩微载体时，压缩位移曲线的切线的斜率有增加的倾向，但若微载体产生裂纹，则压缩位移曲线的切线的斜率有转为减少的倾向。因此，在所得到的压缩位移曲线在负载700mN以下不具有拐点的情况下，能够更有效地抑制由微载体产生的碎片的混入。

所述微载体的吸水率优选为10重量％以下，更优选为5重量％以下，进一步优选为1重量％以下。若所述吸水率为所述上限以下，则在细胞的粘附时，使得微载体的表面的状态不易变化，因此能够减小细胞接种后的初始固着率的偏差。此外，若所述吸水率为所述上限以下，则在培养基中细胞不易从微载体剥离。需要说明的是，所述微载体的吸水率的下限没有特别限定。所述微载体的吸水率可以为0重量％以上，也可以为0.001重量％以上。

所述微载体的吸水率可以如下测定。

准备在100℃的烘箱中干燥了8小时的微载体。将该微载体100.0mg在温度37℃和相对湿度95％RH的环境下放置24小时。测定放置后的微载体的重量。通过下式计算微载体的吸水率。

吸水率(重量％)＝(W₂-W₁)/W₁×100

W₁：放置前的微载体的重量(mg)

W₂：放置后的微载体的重量(mg)

作为减小所述微载体的吸水率的方法，例如可举出：使用疏水性大的材料制备包覆层的方法。

所述微载体的比重优选为1.0g/cm³以上，更优选为1.05g/cm³以上，进一步优选为1.1g/cm³以上，优选为2.0g/cm³以下，更优选为1.5g/cm³以下，进一步优选为1.3g/cm³以下。若所述比重为所述下限以上，则微载体适当地沉降，能够提高回收效率。若所述比重为所述上限以下，则能够提高搅拌叶片的旋转性。

所述微载体的比重使用真比重计来测定。

所述微载体的平均粒径优选为100μm以上，更优选为150μm以上，进一步优选为200μm以上，进一步优选为250μm以上，特别优选为300μm以上，优选为1500μm以下，更优选为1000μm以下，进一步优选为800μm以下，进一步优选为700μm以下，特别优选为500μm以下。所述微载体的平均粒径优选为100μm以上1500μm以下，更优选为150μm以上1000μm以下，进一步优选为200μm以上800μm以下，进一步优选为250μm以上700μm以下，特别优选为300μm以上500μm以下。若所述平均粒径为所述下限以上，则能够进一步提高细胞的培养效率。若所述平均粒径为所述上限以下，则能够在各微载体的表面上以更均匀的厚度形成细胞块。此外，若所述平均粒径为所述上限以下，则能够进一步增加细胞能够粘附的面积。在以往的微载体中，平均粒径越大，细胞的培养过程中微载体越容易发生破损，但在本发明的微载体中，即使平均粒径较大，也能够抑制细胞的培养过程中微载体的破损。

所述微载体的粒径在所述微载体为正球状的情况下是指直径，在所述微载体为正球状以外的形状的情况下是指假定为与其体积相当的正球状时的直径。

所述微载体的平均粒径优选为数均粒径。所述微载体的平均粒径可以如下求出：用电子显微镜或光学显微镜观察50个任意的微载体，计算各微载体的粒径的平均值，或使用粒度分布测定装置求出。在利用电子显微镜或光学显微镜的观察中，每1个微载体的粒径作为基于等效圆直径的粒径而求出。在利用电子显微镜或光学显微镜的观察中，任意50个微载体的基于等效圆直径的平均粒径与基于等效球直径的平均粒径大致相等。在粒度分布测定装置中，每1个微载体的粒径作为基于等效球直径的粒径而求出。所述微载体的平均粒径优选使用粒度分布测定装置算出。

所述微载体的粒径的变异系数(CV值)优选为10％以下，更优选为8％以下，进一步优选为5％以下，特别优选为3％以下。若所述变异系数(CV值)为所述上限以下，则能够提高沉降速度的均匀性，能够进一步提高细胞的培养效率。需要说明的是，所述微载体的粒径的变异系数(CV值)可以为0％以上，可以为0.1％以上，可以为0.5％以上，也可以为1％以上。所述微载体的粒径的变异系数(CV值)可以为0％以上10％以下，可以为0.1％以上8％以下，可以为0.1％以上5％以下，也可以为1％以上3％以下。

所述微载体的粒径的变异系数(CV值)如下算出。

CV值(％)＝(ρ/Dn)×100

ρ：微载体的粒径的标准偏差

Dn：微载体的平均粒径

作为减小所述微载体的粒径的变异系数(CV值)的方法，可举出：干式分级的方法和湿式分级的方法等。

所述微载体的形状没有特别限定。所述微载体的形状可以为球状，也可以为球状以外的形状，还可以为扁平状等形状。需要说明的是，球状并不限定于正球状，也包含大致球状，例如也包含长径比(长径/短径)为1.5以下的形状。

下面，参照附图，对本发明进行具体说明。

图1是示意性地表示本发明的一个实施方式的细胞培养用微载体的截面图。

图1所示的细胞培养用微载体1具备：基材粒子2和包覆基材粒子2的外表面的包覆层3。包覆层3配置在基材粒子2的表面上，与基材粒子2的表面接触。包覆层3包覆基材粒子2的整个外表面。微载体1的断裂点强度为1000mN以上。

以下，对微载体的其他详细内容进行说明。

需要说明的是，本说明书中，“(甲基)丙烯酸酯”是指“丙烯酸酯”和“甲基丙烯酸酯”中的一者或两者，“(甲基)丙烯酸类”是指“丙烯酸类”和“甲基丙烯酸类”中的一者或两者。

(基材粒子)

就所述基材粒子的材料而言，只要微载体的断裂点强度为1000mN以上就没有特别限定。所述基材粒子的材料可以是有机材料，也可以是无机材料，还可以是有机材料和无机材料这两者。所述基材粒子可以包含树脂，也可以包含无机填料，也可以包含树脂和无机填料，也可以不包含树脂。所述基材粒子可以为树脂粒子，也可以为无机粒子。所述基材粒子优选包含树脂。从进一步抑制细胞的培养过程中的微载体的破损的观点出发，所述基材粒子优选为树脂粒子。所述基材粒子的材料可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。所述树脂可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

作为所述树脂，可举出：聚烯烃树脂、丙烯酸类树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、苯酚甲醛树脂、三聚氰胺甲醛树脂、苯并胍胺甲醛树脂、尿素甲醛树脂、酚醛树脂、三聚氰胺树脂、苯并胍胺树脂、脲醛树脂、环氧树脂、不饱和聚酯树脂、饱和聚酯树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚砜、聚苯醚、聚缩醛、聚酰亚胺、聚酰胺酰亚胺、聚醚醚酮、聚醚砜、二乙烯基苯聚合物、以及二乙烯基苯共聚物等。

在所述基材粒子为树脂粒子的情况下，在存在各种树脂的情况下，优选使用能够将微载体的断裂点强度控制为1000mN以上的树脂。

所述树脂优选为具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物。所述基材粒子优选包含具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物。在该情况下，能够良好地调节基材粒子的比重和强度，其结果，能够将微载体的比重调节为适当的范围，并且能够增大微载体的断裂点强度。

所述具有烯键式不饱和基团的单体优选具有2个以上的该烯键式不饱和基团。所述基材粒子优选包含具有2个以上的烯键式不饱和基团的单体的聚合物。在该情况下，能够更进一步良好地调节基材粒子的比重及强度，其结果，能够将微载体的比重调节为适当的范围，并且能够增大微载体的断裂点强度。

作为所述具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物，例如可举出：丙烯酸类树脂、二乙烯基苯聚合物和二乙烯基苯共聚物等。所述具有烯键式不饱和基团的单体可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

所述具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物优选为丙烯酸类树脂、二乙烯基苯聚合物或二乙烯基苯共聚物。在该情况下，能够良好地调节基材粒子的比重和强度，其结果，能够将微载体的比重调节为适当的范围，并且能够增大微载体的断裂点强度。

在所述基材粒子包含所述具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物的情况下，所述具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物优选具有交联结构。在该情况下，能够良好地调节基材粒子的比重和强度，其结果，能够将微载体的比重调节为适当的范围，并且能够增大微载体的断裂点强度。

作为形成所述交联结构的方法，例如可举出以下的方法。(1)使包含具有2个以上的烯键式不饱和基团的单体的聚合性成分聚合的方法。(2)使具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物与交联剂反应而形成交联结构的方法。

所述(1)的方法中，作为所述具有2个以上的烯键式不饱和基团的单体，例如可举出：二乙烯基苯、多官能(甲基)丙烯酸酯、三烯丙基(异)氰脲酸酯、偏苯三酸三烯丙酯、邻苯二甲酸二烯丙酯和二烯丙基丙烯酰胺等。所述具有2个以上的烯键式不饱和基团的单体可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

此外，在所述(1)的方法中，所述聚合性成分可以包含具有烯键式不饱和基团的其它单体。作为所述具有烯键式不饱和基团的其它单体，例如可举出：苯乙烯、单官能(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸、丙烯腈、氯乙烯等。所述具有烯键式不饱和基团的其他单体可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

作为通过所述(1)的方法得到的聚合物，例如可举出：二乙烯基苯与苯乙烯的共聚物、以及多官能(甲基)丙烯酸酯与单官能(甲基)丙烯酸酯的共聚物等。

作为所述(2)的方法，例如可举出如下方法：将包含在分子内具有烯键式不饱和基团和包含活性氢的官能团的单体的聚合性成分聚合而得到聚合物，接着，使用交联剂将聚合物间交联。

作为所述包含活性氢的官能团，例如可举出：羟基、羧基、氨基和酚基等。作为在分子内具有烯键式不饱和基团和包含活性氢的官能团的单体，例如可举出：含羟基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸和含氨基的(甲基)丙烯酸酯等。所述在分子内具有烯键式不饱和基团和包含活性氢的官能团的单体可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

作为所述交联剂，只要能够与所述包含活性氢的官能团反应就没有特别限定，例如可举出：多官能异氰酸酯化合物、多官能环氧化合物等。所述热交联剂可仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

需要说明的是，只要得到的微载体的断裂点强度为1000mN以上，则形成所述交联结构的方法不限于这些方法。

所述基材粒子，例如可以通过使所述具有烯键式不饱和基团的单体聚合而得到。作为所述的聚合方法，没有特别限定，可举出自由基聚合、离子聚合、缩聚(缩合聚合、缩聚合)、加成缩合、活性聚合和活性自由基聚合等公知的方法。此外，作为其他聚合方法，可举出在自由基聚合引发剂的存在下的悬浮聚合。

所述基材粒子可以包含无机填料。例如，通过组合使用无机填料和比重小的树脂，能够适当地增大基材粒子及微载体的比重。

作为所述无机填料，可举出：炭黑、玻璃填料和金属填料。所述无机填料可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

所述基材粒子100重量％中，所述树脂的含量优选为80重量％以上，更优选为90重量％以上，进一步优选为95重量％以上，进一步优选为97重量％以上，进一步优选为99重量％以上，最优选为100重量％(总量)。需要说明的是，所述基材粒子100重量％中，所述树脂的含量可以为100重量％以下，也可以小于100重量％。

所述基材粒子100重量％中，所述具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物的含量优选为80重量％以上，更优选为90重量％以上，进一步优选为95重量％以上，进一步优选为97重量％以上，进一步优选为99重量％以上，最优选为100重量％(总量)。需要说明的是，所述基材粒子100重量％中，所述具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物的含量可以为100重量％以下，也可以小于100重量％。

在所述基材粒子为所述无机粒子的情况下，作为该无机粒子，可举出石墨粒子、玻璃粒子及金属粒子等。

所述基材粒子的比重优选为1.0g/cm³以上，更优选为1.05g/cm³以上，进一步优选为1.1g/cm³以上，优选为2.0g/cm³以下，更优选为1.5g/cm³以下，进一步优选为1.3g/cm³以下，进一步优选为1.2g/cm³以下，特别优选为1.15g/cm³以下。若所述比重为所述下限以上及所述上限以下，则能够将微载体的比重调节为适当的范围。

所述基材粒子的比重使用真比重计来测定。

所述基材粒子的平均粒径优选为100μm以上，更优选为150μm以上，进一步优选为200μm以上，进一步优选为250μm以上，特别优选为300μm以上，优选为1500μm以下，更优选为1000μm以下，进一步优选为800μm以下，进一步优选为700μm以下，特别优选为500μm以下。所述基材粒子的平均粒径优选为100μm以上1500μm以下，更优选为150μm以上1000μm以下，进一步优选为200μm以上800μm以下，进一步优选为250μm以上700μm以下，特别优选为300μm以上500μm以下。若所述平均粒径为所述下限以上，则能够进一步提高细胞的培养效率。若所述平均粒径为所述上限以下，则能够在各微载体的表面上以更均匀的厚度形成细胞块。此外，若所述平均粒径为所述上限以下，则能够进一步增加细胞能够粘附的面积。

所述基材粒子的粒径在所述基材粒子为正球状的情况下是指直径，在所述基材粒子为正球状以外的形状的情况下是指假定为与其体积相当的正球状时的直径。

所述基材粒子的平均粒径优选为数均粒径。所述基材粒子的平均粒径可以如下求出：用电子显微镜或光学显微镜观察50个任意的基材粒子，算出各基材粒子的粒径的平均值，或使用粒度分布测定装置来求出。在利用电子显微镜或光学显微镜的观察中，每1个基材粒子的粒径作为基于等效圆直径的粒径而求出。在利用电子显微镜或光学显微镜的观察中，任意50个基材粒子的基于等效圆直径的平均粒径与基于等效球直径的平均粒径大致相等。粒度分布测定装置中，每1个基材粒子的粒径作为基于等效球直径的粒径而求出。所述基材粒子的平均粒径优选使用粒度分布测定装置算出。

(包覆层)

所述微载体具备基材粒子和包覆基材粒子的外表面的包覆层。所述包覆层是由与所述基材粒子的成分不同的成分构成的层。作为构成所述包覆层的成分，可举出肽、合成树脂等。所述包覆层优选包含合成树脂。所述合成树脂可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

从提高微载体与细胞的粘附性的观点和将微载体的溶胀度维持得较低的观点出发，所述合成树脂优选具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架。此时，所述合成树脂可以具有聚乙烯醇衍生物骨架，也可以具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架，还可以具有聚乙烯醇衍生物骨架和聚(甲基)丙烯酸酯骨架。

从提高微载体与细胞的粘附性的观点出发，所述包覆层优选包含肽部，更优选包含具有肽部(肽骨架)的合成树脂。即，从提高微载体与细胞的粘附性的观点出发，所述合成树脂更优选具有肽部。需要说明的是，所述包覆层包含肽部的方式不仅包含包覆层包含具有肽部的合成树脂的方式，还包含包覆层仅包含肽的方式。从进一步提高微载体与细胞的粘附性的观点出发，所述合成树脂优选具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架和肽部。

本说明书中，有时将“具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架和肽部的树脂”记载为“含肽树脂。”所述含肽树脂(peptide-conjugated resin)可以具有聚乙烯醇衍生物骨架和肽部，也可以具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架和肽部，还可以具有聚乙烯醇衍生物骨架、聚(甲基)丙烯酸酯骨架和肽部。

在所述具有聚乙烯醇衍生物骨架的含肽树脂中，优选所述聚乙烯醇衍生物骨架与所述肽部经由连接部键合。因此，所述具有聚乙烯醇衍生物骨架的含肽树脂优选具有聚乙烯醇衍生物骨架、肽部和连接部。

在所述具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架的含肽树脂中，所述聚(甲基)丙烯酸酯骨架与所述肽部可以经由连接部键合，也可以不经由连接部而直接键合。所述具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架的含肽树脂可以具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架、肽部和连接部。

<聚乙烯醇衍生物骨架>

所述聚乙烯醇衍生物骨架为源自聚乙烯醇衍生物的骨架部分。所述聚乙烯醇衍生物是由聚乙烯醇衍生的化合物。从进一步提高微载体与细胞的粘附性的观点出发，所述聚乙烯醇衍生物优选为聚乙烯醇缩醛树脂，所述聚乙烯醇衍生物骨架优选为聚乙烯醇缩醛骨架。即，所述合成树脂优选具有聚乙烯醇缩醛骨架和所述肽部。所述聚乙烯醇衍生物和所述聚乙烯醇缩醛树脂可以分别仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

所述聚乙烯醇衍生物骨架和所述聚乙烯醇缩醛骨架优选在侧链具有缩醛基、羟基和乙酰基。其中，所述聚乙烯醇衍生物骨架和所述聚乙烯醇缩醛骨架例如也可以不具有乙酰基。例如，通过聚乙烯醇衍生物骨架及聚乙烯醇缩醛骨架的乙酰基全部与所述连接体键合，所述聚乙烯醇衍生物骨架和所述聚乙烯醇缩醛骨架可以不具有乙酰基。

聚乙烯醇缩醛树脂可以通过利用醛将聚乙烯醇缩醛化而合成。

聚乙烯醇的缩醛化所使用的所述醛没有特别限定。作为所述醛，例如可举出碳原子数为1～10的醛。所述醛可以具有链状脂肪族基团、环状脂肪族基团或芳香族基团，也可以不具有。所述醛可以为链状醛，也可以为环状醛。所述醛可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

从进一步提高微载体与细胞的粘附性的观点出发，所述醛优选为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛或戊醛，更优选为丁醛。因此，所述聚乙烯醇缩醛树脂更优选为聚乙烯醇缩丁醛树脂，所述聚乙烯醇缩醛骨架更优选为聚乙烯醇缩丁醛骨架，所述合成树脂更优选具有聚乙烯醇缩丁醛骨架。

所述合成树脂中，所述聚乙烯醇衍生物骨架和所述聚乙烯醇缩醛骨架的缩醛化度(聚乙烯醇缩丁醛树脂的情况下为缩丁醛化度)优选为40摩尔％以上，更优选为50摩尔％以上，优选为90摩尔％以下，更优选为85摩尔％以下。若所述缩醛化度为所述下限以上，则能够进一步提高细胞的固着性，使得细胞高效地增殖。若所述缩醛化度为所述上限以下，则能够使在溶剂中的溶解性良好。

所述合成树脂中，所述聚乙烯醇衍生物骨架和所述聚乙烯醇缩醛骨架的羟基含有率(羟基量)优选为15摩尔％以上，更优选为20摩尔％以上，优选为45摩尔％以下，更优选为30摩尔％以下，进一步优选为25摩尔％以下。

所述合成树脂中，所述聚乙烯醇衍生物骨架和所述聚乙烯醇缩醛骨架的乙酰化度(乙酰基量)优选为1摩尔％以上，更优选为2摩尔％以上，优选为5摩尔％以下，更优选为4摩尔％以下。若所述乙酰化度为所述下限以上及所述上限以下，则能够提高聚乙烯醇缩醛树脂与连接体的反应效率。

所述聚乙烯醇衍生物骨架和所述聚乙烯醇缩醛骨架的缩醛化度、乙酰化度和羟基量可以通过¹H-NMR(核磁共振谱)来测定。

<聚(甲基)丙烯酸酯骨架>

所述聚(甲基)丙烯酸酯骨架为源自聚(甲基)丙烯酸酯的骨架部分。所述聚(甲基)丙烯酸酯通过将(甲基)丙烯酸酯聚合而得到。所述聚(甲基)丙烯酸酯骨架具有源自(甲基)丙烯酸酯的骨架。所述聚(甲基)丙烯酸酯可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

作为所述(甲基)丙烯酸酯，可举出(甲基)丙烯酸烷基酯、(甲基)丙烯酸环状烷基酯、(甲基)丙烯酸芳基酯、(甲基)丙烯酸聚乙二醇酯类、(甲基)丙烯酸磷酸胆碱等。所述(甲基)丙烯酸酯可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

作为所述(甲基)丙烯酸烷基酯，可举出(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸正丙酯、(甲基)丙烯酸异丙酯、(甲基)丙烯酸正丁酯、(甲基)丙烯酸异丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯、(甲基)丙烯酸正辛酯、(甲基)丙烯酸异辛酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸壬酯、(甲基)丙烯酸异壬酯、(甲基)丙烯酸癸酯、(甲基)丙烯酸异癸酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯和(甲基)丙烯酸异十四烷酯等。

所述(甲基)丙烯酸烷基酯任选取代有碳原子数1～3的烷氧基和四氢糠基等取代基。作为这样的(甲基)丙烯酸烷基酯的实例，可举出丙烯酸甲氧基乙酯、丙烯酸四氢糠基酯等。

作为所述(甲基)丙烯酸环状烷基酯，可举出(甲基)丙烯酸环己酯和(甲基)丙烯酸异冰片酯等。

作为所述(甲基)丙烯酸芳基酯，可举出(甲基)丙烯酸苯酯和(甲基)丙烯酸苄酯等。

作为所述(甲基)丙烯酸聚乙二醇酯类，例如可举出：甲氧基-聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、乙氧基-聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、羟基-聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、甲氧基-二乙二醇(甲基)丙烯酸酯、乙氧基-二乙二醇(甲基)丙烯酸酯、羟基-二乙二醇(甲基)丙烯酸酯、甲氧基-三乙二醇(甲基)丙烯酸酯、乙氧基-三乙二醇(甲基)丙烯酸酯和羟基-三乙二醇(甲基)丙烯酸酯等。

作为所述(甲基)丙烯酸磷酸胆碱，可举出2-(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱等。

所述合成树脂优选具有源自下述式(A1)或下述式(A2)所示的(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元。所述聚(甲基)丙烯酸酯骨架优选具有源自下述式(A1)或下述式(A2)所示的(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元。由此，能够增大包覆层的疏水性，因此，能够进一步减小微载体的吸水率。因此，能够减小细胞接种后的初始固着率的偏差，并且在培养基中细胞不易从微载体剥离。所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)可以包含下述式(A1)所示的(甲基)丙烯酸酯化合物，也可以包含下述式(A2)所示的(甲基)丙烯酸酯化合物，还可以包含下述式(A1)所示的(甲基)丙烯酸酯化合物和下述式(A2)所示的(甲基)丙烯酸酯化合物这两者。在所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)包含下述式(A1)所示的(甲基)丙烯酸酯化合物和下述式(A2)所示的(甲基)丙烯酸酯化合物这两者的情况下，下述式(A1)中的R与下述式(A2)中的R可以相同，也可以不同。所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。此外，下述式(A1)所示的(甲基)丙烯酸酯化合物及下述式(A2)所示的(甲基)丙烯酸酯化合物可以分别仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

[化学式1]

所述式(A1)中，R表示碳原子数为2以上且18以下的烃基。

[化学式2]

所述式(A2)中，R表示碳原子数为2以上且18以下的烃基。

所述式(A1)中的R和所述式(A2)中的R分别可以为脂肪族烃基，也可以为芳香族烃基。从使所述合成树脂的溶解度良好的观点出发，所述式(A1)中的R和所述式(A2)中的R分别优选为脂肪族烃基。所述脂肪族烃基可以为直链状，可以具有支链结构，可以具有双键，也可以不具有双键。所述式(A1)中的R和所述式(A2)中的R分别可以为烷基，也可以为亚烷基。

所述式(A1)中的R的碳原子数和所述式(A2)中的R的碳原子数分别优选为4以上，更优选为6以上，进一步优选为8以上，特别优选为10以上，优选为16以下，更优选为14以下，最优选为12。所述碳原子数为所述下限以上时，能够进一步增大合成树脂的疏水性，因此，能够进一步减小微载体的吸水率。所述碳原子数为所述上限以下时，能够提高将包覆层的材料配置于基材粒子的表面时的涂布性。特别是，所述碳原子数为12时，能够更进一步减小微载体的吸水率，并且能够更进一步提高涂布性。

所述(甲基)丙烯酸烷基酯优选为所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)。

所述具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架的合成树脂可以具有源自(甲基)丙烯酸酯以外的单体的骨架。

作为所述(甲基)丙烯酸酯以外的单体，可举出(甲基)丙烯酰胺类和乙烯基化合物等。所述(甲基)丙烯酸酯以外的单体可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

作为所述(甲基)丙烯酰胺类，可举出(甲基)丙烯酰胺、N-异丙基(甲基)丙烯酰胺、N-叔丁基(甲基)丙烯酰胺、N,N’-二甲基(甲基)丙烯酰胺、(3-(甲基)丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵、4-(甲基)丙烯酰基吗啉、3-(甲基)丙烯酰基-2-噁唑烷酮、N-[3-(二甲基氨基)丙基](甲基)丙烯酰胺、N-(2-羟基乙基)(甲基)丙烯酰胺、N-羟甲基(甲基)丙烯酰胺和6-(甲基)丙烯酰胺己酸等。

作为所述乙烯基化合物，可举出乙烯、烯丙胺、乙烯基吡咯烷酮、马来酸酐、马来酰亚胺、衣康酸、(甲基)丙烯酸和乙烯基胺等。

<肽部>

所述肽部为源自肽的结构部分。所述肽部具有氨基酸序列。构成所述肽部的肽可以是寡肽，也可以是多肽。所述肽可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

所述肽部的氨基酸残基的数量优选为3个以上，更优选为4个以上，进一步优选为5个以上，优选为10个以下，更优选为8个以下，进一步优选为6个以下。若所述氨基酸残基的数量为所述下限以上及所述上限以下，则能够进一步提高与接种后的细胞的粘附性，能够进一步提高细胞的增殖率。其中，所述肽部的氨基酸残基的数量可以超过10个，也可以超过15个。

所述肽部优选具有细胞粘附性的氨基酸序列。需要说明的是，细胞粘附性的氨基酸序列是指通过噬菌体展示法、琼脂糖珠法或平板涂布法而确认了细胞粘附活性的氨基酸序列。作为所述噬菌体展示法，例如可以使用“The Jo urnal of Cell Biology,Volume130,Number 5,September 1995 1189-1196”中记载的方法。作为所述琼脂糖珠法，例如可以使用“蛋白质核酸酶Vol.45No.15(2000)2477”中记载的方法。作为所述平板涂布法，例如可以使用“蛋白质核酸酶Vol.45No.15(2000)2477”中记载的方法。

作为所述细胞粘附性的氨基酸序列，例如可举出RGD序列(Arg-Gly-As p)、YIGSR序列(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)、PDSGR序列(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg)、H AV序列(His-Ala-Val)、ADT序列(Ala-Asp-Thr)、QAV序列(Gln-Ala-Val)、LD V序列(Leu-Asp-Val)、IDS序列(Ile-Asp-Ser)、REDV序列(Arg-Glu-Asp-Val)、IDAPS序列(Ile-Asp-Ala-Pro-Ser)、KQAGDV序列(Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val)和TDE序列(Thr-Asp-Glu)等。此外，作为所述细胞粘附性的氨基酸序列，还可举出“病态生理，第9卷第7号，527～535页，1990年”、以及“大阪府立母子医疗中心杂志，第8卷第1号，58～66页，1992年”中记载的序列等。所述肽部可以仅具有1种所述细胞粘附性的氨基酸序列，也可以具有2种以上。

所述细胞粘附性的氨基酸序列优选具有所述细胞粘附性的氨基酸序列中的至少任一种，更优选至少具有RGD序列、YIGSR序列或PDSGR序列，进一步优选至少具有下述式(1)所示的RGD序列。在该情况下，能够进一步提高与接种后的细胞的粘附性，能够进一步提高细胞的增殖率。

Arg-Gly-Asp-X···式(1)

所述式(1)中，X表示Gly、Ala、Val、Ser、Thr、Phe、Met、Pro或Asn。

所述肽部可以为直链状，也可以具有环状肽骨架。从进一步提高细胞增殖性的观点出发，所述肽部优选具有环状肽骨架。所述环状肽骨架是指由多个氨基酸构成的环状骨架。从更有效地发挥本发明的效果的观点出发，所述环状肽骨架优选由4个以上的氨基酸构成，更优选由5个以上的氨基酸构成，优选由10个以下的氨基酸构成。

在所述含肽树脂中，所述肽部的含有率优选为0.1摩尔％以上，更优选为1摩尔％以上，进一步优选为5摩尔％以上，特别优选为10摩尔％以上，优选为60摩尔％以下，更优选为50摩尔％以下，进一步优选为35摩尔％以下，特别优选为25摩尔％以下。若所述肽部的含有率为所述下限以上，则能够进一步提高与接种后的细胞的粘附性，能够进一步提高细胞的增殖率。此外，若所述肽部的含有率为所述上限以下，则能够抑制制造成本。需要说明的是，所述肽部的含有率(摩尔％)是相对于构成含肽树脂的各结构单元的物质量的总和的所述肽部的物质量。

所述肽部的含有率，例如可以通过NMR、FT-IR或LC-MS来测定。

<连接部>

所述连接部是源自连接体的结构部分。所述连接部通常位于所述聚乙烯醇衍生物骨架或所述聚(甲基)丙烯酸酯骨架与所述肽部之间。所述聚乙烯醇衍生物骨架或所述聚(甲基)丙烯酸酯骨架与所述肽部经由所述连接部而键合。所述连接部由连接体(交联剂)形成。所述连接体可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

所述连接体优选为具有能够与所述肽键合的官能团的化合物，更优选为具有能够与所述肽的羧基或氨基缩合的官能团的化合物。

作为能够与所述肽的羧基或氨基缩合的官能团，可举出羧基、硫醇基、氨基、羟基和氰基等。

从与肽良好地反应的观点出发，所述连接体优选为具有羧基或氨基的化合物，更优选为具有羧基的化合物。

在得到具有聚乙烯醇衍生物骨架的含肽树脂的情况下，作为所述具有羧基的连接体，可举出(甲基)丙烯酸和含羧基丙烯酰胺等。通过使用具有聚合性不饱和基团的羧酸(羧酸单体)作为所述具有羧基的连接体，能够在连接体的导入时通过接枝聚合使该羧酸单体聚合，因此可增加能够与肽反应的羧基的个数。

从使聚乙烯醇衍生物与肽良好地键合的观点出发，所述连接体优选为(甲基)丙烯酸，更优选为丙烯酸。

在得到具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架的含肽树脂的情况下，所述连接体优选具有能够与(甲基)丙烯酸酯键合的官能团。作为所述能够与(甲基)丙烯酸酯键合的官能团，可举出乙烯基、(甲基)丙烯酰基和烯丙基等。所述连接体更优选具有(甲基)丙烯酰基作为所述能够与(甲基)丙烯酸酯键合的官能团，优选为具有羧基或氨基且具有(甲基)丙烯酰基的化合物。

作为得到具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架的含肽树脂时的所述连接体，可举出(甲基)丙烯酸、衣康酸和丙烯酰胺等。

从使聚(甲基)丙烯酸酯与肽良好地键合的观点出发，所述连接体优选为(甲基)丙烯酸或衣康酸，更优选为(甲基)丙烯酸。

<包覆层的其他详细内容>

所述合成树脂的重均分子量优选为1万以上，更优选为5万以上，优选为120万以下，更优选为60万以下。若所述重均分子量为所述下限以上及所述上限以下，则能够更有效地发挥本发明的效果。所述重均分子量为所述上限以下时，能够更有效地提高细胞培养时的细胞的伸展性。

需要说明的是，所述重均分子量例如可以利用以下的方法进行测定。将所述合成树脂溶解于四氢呋喃(THF)中，制备合成树脂的0.2重量％溶液。接着，使用凝胶渗透色谱(GPC)测定装置(APC系统，Waters公司制)，通过以下的测定条件进行评价。

柱：HSPgel HR MB-M 6.0×150mm

流量：0.5ml/min

柱温：40℃

注入量：10μL

检测器：RI、PDA

标准样品：聚苯乙烯

所述包覆层可以仅包含具有所述聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架的树脂。所述包覆层可以包含具有所述聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架且不具有肽部的树脂、和所述含肽树脂。所述包覆层可以包含不具有所述聚乙烯醇衍生物骨架和聚(甲基)丙烯酸酯骨架这两者的树脂等其它成分。作为所述其它成分，可举出聚烯烃树脂、聚醚树脂、聚酯、环氧树脂、聚酰胺树脂、聚酰亚胺树脂、聚氨酯树脂、聚碳酸酯树脂、纤维素和多肽等。所述其他成分可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

所述包覆层可以仅具有包含具有所述聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架的树脂的层(以下，有时记载为“层X”)。所述包覆层可以具有不含具有所述聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架的树脂的层(以下，有时记载为“层Y”)。所述包覆层可以具有所述层X和所述层Y。在所述包覆层具有所述层X和所述层Y的情况下，优选在所述包覆层中，所述层Y位于基材粒子侧，所述层X位于所述层Y的外侧。在该情况下，能够进一步提高微载体与细胞的粘附性。

所述含肽树脂优选至少存在于所述微载体的外表面。所述微载体的最外层优选为包含所述含肽树脂的层。在该情况下，能够进一步提高微载体与细胞的粘附性。

所述包覆层100重量％中，所述合成树脂的含量优选为90重量％以上，更优选为95重量％以上，进一步优选为97.5重量％以上，特别优选为99重量％以上，最优选为100重量％(总量)。所述合成树脂的含量为所述下限以上时，能够更有效地发挥本发明的效果。所述包覆层100重量％中，所述合成树脂的含量可以为100重量％以下，也可以小于100重量％。

所述包覆层100重量％中，所述具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架的树脂或所述含肽树脂的含量优选为90重量％以上，更优选为95重量％以上，进一步优选为97.5重量％以上，特别优选为99重量％以上，最优选为100重量％(总量)。若所述具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架的树脂或所述含肽树脂的含量为所述下限以上，则能够更有效地发挥本发明的效果。所述包覆层100重量％中，所述具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架的树脂或所述含肽树脂的含量可以为100重量％以下，也可以小于100重量％。

所述基材粒子的总表面积100％中，被所述包覆层包覆的表面积(包覆率)优选为50％以上，更优选为70％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为99％以上，最优选为100％。所述包覆率为所述下限以上时，能够进一步提高微载体与细胞的粘附性，并且能够更有效地发挥本发明的效果。所述包覆率可以为100％以下，可以小于100％，也可以为99％以下。

所述包覆率通过用电子显微镜或光学显微镜观察微载体，算出由包覆层包覆的表面积相对于基材粒子的投影面积的百分率而求出。

所述包覆层的厚度优选为10nm以上，更优选为50nm以上，优选为1000nm以下，更优选为500nm以下。若所述包覆层的厚度为所述下限以上及所述上限以下，则能够进一步提高微载体与细胞的粘附性。此外，若所述包覆层的厚度为所述下限以上及所述上限以下，则能够更有效地发挥本发明的效果。

所述包覆层的厚度，例如可以通过使用扫描型电子显微镜(SEM)观察微载体的截面来测定。关于所述包覆层的厚度，优选将任意5处包覆层的厚度的平均值作为1个微载体的包覆层的厚度而算出，更优选将包覆层整体的厚度的平均值作为1个微载体的包覆层的厚度而算出。所述包覆层的厚度优选通过对任意50个微载体计算各微载体的包覆层的厚度的平均值来求出。

作为得到所述具有聚乙烯醇衍生物骨架的含肽树脂的方法，例如可举出以下的方法。

使聚乙烯醇衍生物(例如聚乙烯醇缩醛树脂)与连接体反应，得到聚乙烯醇缩醛树脂与连接体键合而成的反应物。使得到的反应物与肽反应，得到具有聚乙烯醇衍生物骨架(聚乙烯醇缩醛骨架)的含肽树脂。

作为得到所述具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架的含肽树脂的方法，例如可举出以下的方法。

得到使包含(甲基)丙烯酸酯的单体聚合而成的丙烯酸类树脂。使得到的丙烯酸类树脂、肽和根据需要使用的连接体反应，得到具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架的含肽树脂。

作为得到具有所述聚乙烯醇衍生物骨架和所述聚(甲基)丙烯酸酯骨架的含肽树脂的方法，例如可举出以下的方法。

通过以下的(i)、(ii)或(iii)的方法，得到具有聚乙烯醇衍生物骨架和聚(甲基)丙烯酸酯骨架的树脂。(i)使用共聚有丙烯酸酯的聚乙烯醇合成聚乙烯醇缩醛树脂。(ii)使用聚乙烯醇和共聚有丙烯酸酯的聚乙烯醇合成聚乙烯醇缩醛树脂。(iii)使丙烯酸酯与聚乙烯醇缩醛树脂接枝共聚。使通过所述(i)、(ii)或(iii)的方法得到的树脂、肽和根据需要使用的连接体反应，得到具有所述聚乙烯醇衍生物骨架和所述聚(甲基)丙烯酸酯骨架的含肽树脂。

作为在所述基材粒子的表面配置所述包覆层而得到微载体的方法，例如可举出以下的方法(1)和方法(2)等。

方法(1)：将通过所述方法得到的含肽树脂溶解于溶剂中，得到包含含肽树脂的液体。向基材粒子喷雾包含所述含肽树脂的液体，或者分离含浸于包含所述含肽树脂的液体中的基材粒子，从而能够制备在基材粒子的外表面具备包含含肽树脂的层(包覆层)的微载体。

方法(2)：准备具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架的树脂(肽键合前的树脂)。将该树脂溶解于溶剂中，得到含树脂液。向基材粒子喷雾所述含树脂液，或分离含浸于所述含树脂液的基材粒子，得到在基材粒子的外表面上配置有包含具有聚乙烯醇衍生物或聚(甲基)丙烯酸酯的树脂的层的粒子。对于得到的粒子，通过所述的方法，使该层所含的具有聚乙烯醇衍生物或聚(甲基)丙烯酸酯的树脂、肽和根据需要使用的连接体反应。这样，可以制备在基材粒子的外表面具备包含具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架且不具有肽部的树脂的层和包含含肽树脂的层作为包覆层的微载体。

(微载体的其他细节)

所述微载体用于培养细胞。

作为所述细胞，可举出人、小鼠、大鼠、猪、牛和猴子等的动物细胞。此外，作为所述细胞，可举出体细胞等，例如可举出干细胞、前体细胞和成熟细胞等。所述体细胞可以是癌细胞。

作为所述干细胞，可举出间充质干细胞(MSC)、iPS细胞、ES细胞、Mu se细胞、胚胎癌细胞、胚胎生殖干细胞和mGS细胞。

作为所述成熟细胞，可举出神经细胞、心肌细胞、视网膜细胞和肝细胞。

所述微载体优选用于细胞的三维培养。三维培养是指，相对于在板等平面上培养细胞的二维培养，在纵向上也具有厚度地培养细胞的培养方法。

所述微载体优选用于无血清培养基培养。在所述微载体中，即使是不含饲养细胞、粘附蛋白质的无血清培养基培养，也能够提高细胞的粘附性，特别是能够进一步提高细胞接种后的初始固着率。此外，在所述微载体中，即使是无血清培养基培养，也能够发挥本发明的效果。特别是在所述包覆层包含所述含肽树脂的情况下，即使是无血清培养基培养，也可有效地发挥能够提高细胞的粘附性的效果和提高细胞接种后的初始固着率的效果。

所述微载体优选实质上不含源自动物的原料。通过不包含源自动物的原料，能够提供安全性高，并且制造时品质的偏差少的微载体。需要说明的是，“实质上不含源自动物的原料”是指微载体中的源自动物的原料为3重量％以下。在所述微载体中，微载体中的源自动物的原料优选为1重量％以下，最优选为0重量％。即，所述微载体最优选完全不包含源自动物的原料。

(细胞培养方法)

可以使用所述微载体培养细胞。本发明的细胞的培养方法是使用所述微载体的细胞的培养方法。作为所述细胞，可举出所述细胞。

所述细胞的培养方法优选具备使细胞粘附于所述微载体的工序。所述细胞可以是细胞块。所述细胞块可以通过在成为汇合的培养容器中添加细胞剥离剂，利用移液器均匀地进行破碎处理而得到。作为细胞剥离剂，没有特别限定，优选乙二胺/磷酸缓冲溶液。细胞块的大小优选为50μm～200μm。

以下，通过描述实施例和比较例，更具体地说明本发明。本发明并不只限于这些实施例。

需要说明的是，得到的树脂中的结构单元的含有率如下测定：将合成树脂溶解于DMSO-d6(二甲基亚砜)后，通过¹H-NMR(核磁共振谱)进行测定。

(实施例1)

(1)基材粒子A的制备

将二乙烯基苯(纯度57％)800重量份和苯乙烯200重量份混合，得到混合液。在得到的混合液中加入过氧化苯甲酰20重量份，搅拌至均匀溶解，得到单体混合液。将使分子量约1700的聚乙烯醇溶解于纯水而成的2重量％水溶液4000重量份放入反应釜中。接着，在反应釜中加入得到的单体混合液，搅拌4小时，由此调节粒径以使单体的液滴成为给定的粒径。接着，在85℃的氮气氛下进行9小时反应，进行单体液滴的聚合反应，得到粒子。将得到的粒子分别用热水、甲醇和丙酮各清洗数次后，进行分级操作，得到平均粒径100μm、粒径的CV值1％的基材粒子A。基材粒子A是二乙烯基苯共聚物(表中记载为DVB)的树脂粒子。

(2)聚乙烯醇缩醛树脂的制备

在具备搅拌装置的反应器中投入离子交换水2700mL、平均聚合度1700、皂化度99摩尔％的聚乙烯醇300重量份，边搅拌边加热溶解，得到溶液。在得到的溶液中添加35重量％盐酸作为催化剂，并使得盐酸浓度为0.2重量％。接着，将温度调节为15℃，边搅拌边添加正丁醛22重量份。接着，添加正丁醛148重量份，使白色粒子状的聚乙烯醇缩醛树脂(聚乙烯醇缩丁醛树脂)析出。析出后15分钟后，以盐酸浓度成为1.8重量％的方式添加35重量％盐酸后，加热至50℃，在50℃下保持2小时。接着，将溶液冷却、中和后，将聚乙烯醇缩丁醛树脂水洗、干燥，得到聚乙烯醇缩醛树脂(聚乙烯醇缩丁醛树脂，平均聚合度1700，缩醛化度(缩丁醛化度)70摩尔％，羟基量27摩尔％，乙酰化度3摩尔％)。

(3)连接部的形成

将得到的聚乙烯醇缩醛树脂99重量份和丙烯酸(连接体)1重量份溶解于T HF(四氢呋喃)300重量份中，在光自由基聚合引发剂的存在下，在紫外线照射下反应20分钟，使聚乙烯醇缩醛树脂与丙烯酸接枝共聚，由此形成连接部。

(4)形成有连接部的聚乙烯醇缩醛树脂包覆粒子的制备

使形成有连接部的聚乙烯醇缩醛树脂1重量份溶解于丁醇19重量份中。在所得到的溶液中添加1重量份基材粒子A并搅拌后，进行过滤，利用纯水进行清洗，在60℃下真空干燥5小时，由此得到形成有连接部的聚乙烯醇缩醛树脂包覆粒子。

(5)微载体的制备

准备具有Gly-Arg-Gly-Asp-Ser的氨基酸序列的直链状肽(氨基酸残基数为5个)。将该肽1重量份和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(缩合剂)1重量份以该肽的终浓度成为1mM的方式添加到不包含钙和镁这两者的磷酸缓冲生理盐水中，制备含肽液。在得到的含肽液20重量份中加入形成有连接部的聚乙烯醇缩醛树脂包覆粒子1重量份，由此将连接部的羧基与肽的Gly的氨基脱水缩合。将得到的悬浮液过滤并使用纯水清洗，在60℃下真空干燥5小时，由此得到微载体。需要说明的是，表中，将通过所述方法得到的具有聚乙烯醇衍生物骨架(聚乙烯醇缩醛骨架)的含肽树脂记载为树脂X1。树脂X1具有Gly-Arg-Gly-Asp-Ser的氨基酸序列作为肽部。

(实施例2)

(1)基材粒子B的制备

与实施例1同样地进行聚合反应，得到粒子。通过对得到的粒子进行分级操作，得到平均粒径200μm、粒径的CV值1％的基材粒子B。

(2)微载体的制备

除了使用得到的基材粒子B以外，与实施例1同样地制备微载体。

(实施例3)

(1)基材粒子C的制备

与实施例1同样地进行聚合反应，得到粒子。通过对得到的粒子进行分级操作，得到平均粒径300μm、粒径的CV值1％的基材粒子C。

(2)微载体的制备

除了使用得到的基材粒子C以外，与实施例1同样地制备微载体。

(实施例4)

(1)基材粒子D的制备

与实施例1同样地进行聚合反应，得到粒子。通过对得到的粒子进行分级操作，得到平均粒径400μm、粒径的CV值1％的基材粒子D。

(2)微载体的制备

除了使用得到的基材粒子D以外，与实施例1同样地制备微载体。

(实施例5)

(1)基材粒子E的制备

将二乙烯基苯的配合量从800重量份变更为30重量份，将苯乙烯的配合量从200重量份变更为970重量份，除此以外，与实施例1同样地得到粒子。通过对得到的粒子进行分级操作，得到平均粒径300μm、粒径的CV值5％的基材粒子E。基材粒子E是聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(表中记载为PS97％/DVB3％)的树脂粒子。

(2)微载体的制备

除了使用得到的基材粒子E以外，与实施例1同样地制备微载体。

(实施例6)

作为基材粒子，使用基材粒子C。

(2)丙烯酸类树脂的制备

使丙烯酸十二烷基酯10重量份和丙烯酸2.7重量份溶解于四氢呋喃27重量份，得到丙烯酸类单体溶液。在得到的丙烯酸类单体溶液中溶解Irgacur e184(BASF公司制)0.0575重量份，将得到的液体涂布在PET膜上。在25℃下，使用UV输送装置(EYE GRAPHICS公司制“ECS301G1”)，以累积光量2000mJ/cm²照射波长365nm的光，由此得到(甲基)丙烯酸共聚物溶液。将得到的(甲基)丙烯酸共聚物溶液在80℃下真空干燥3小时，得到具有连接部的丙烯酸类树脂。

(3)丙烯酸类树脂包覆粒子的制备

将得到的丙烯酸类树脂1重量份溶解于丁醇19重量份中。在该溶液中加入基材粒子1重量份并搅拌后，过滤并使用纯水清洗，在60℃下真空干燥5小时，由此得到丙烯酸类树脂包覆粒子。

(4)微载体的制备

使用得到的丙烯酸类树脂包覆粒子。此外，准备作为肽的具有Arg-Gly-Asp-Phe-Lys的氨基酸序列的环状肽(氨基酸残基数为5个，通过Arg与Lys键合而形成环状骨架，Phe为D体)。使用该肽，使源自丙烯酸类树脂的丙烯酸的结构单元中的羧基与肽的Lys的氨基脱水缩合，除此以外，与实施例1同样地得到微载体。需要说明的是，表中，将通过所述方法得到的具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架的含肽树脂记载为树脂X2。树脂X2具有Arg-Gly-Asp-Phe-Lys的氨基酸序列(环状肽骨架)作为肽部。

(实施例7)

(1)基材粒子F的制备

准备MICROPEARL GS-L300(积水化学工业公司制，平均粒径300μm，粒径的CV值7％，多官能丙烯酸类树脂粒子)。通过对该粒子进行分级操作，得到平均粒径300μm、粒径的CV值1％的基材粒子F。基材粒子F是丙烯酸类树脂(表中记载为ACR)的树脂粒子。

(2)微载体的制备

除了使用得到的基材粒子F以外，与实施例1同样地制备微载体。

(比较例1)

(1)基材粒子G的制备

对CORNING公司制“无处理微载体”(基材粒子为聚苯乙烯粒子，表中记载为PS)进行分级操作，将粒径的CV值为1％的粒子用作基材粒子G。

(2)微载体的制备

除了使用基材粒子G以外，与实施例1同样地制备微载体。

(比较例2)

将得到的基材粒子C自身用作微载体。

(评价)

(1)基材粒子及微载体的比重

在干燥状态和氩气气氛下使用真比重计(岛津制作所公司制“ACCUPYC II”)测定得到的基材粒子和微载体的比重。

(2)微载体的平均粒径和粒径的变异系数(CV值)

用扫描型电子显微镜观察得到的微载体。算出任意50个微载体的基于等效圆直径的平均粒径及粒径的变异系数(CV值)。

(3)包覆层的厚度

用扫描型电子显微镜观察得到的微载体的截面。对任意50个微载体分别测定包覆层的厚度，将其平均值作为微载体的包覆层的厚度。

(4)微载体的断裂点强度

通过所述方法测定得到的微载体的断裂点强度。需要说明的是，作为微小强度评价试验装置，使用岛津制作所公司制“MICRO AUTO GRAPH MST-I。”需要说明的是，表中，“>2000”是指微载体在2000mN以下不具有断裂点强度，即微载体的断裂点强度超过2000mN。

(5)压缩位移曲线在拐点处的负载

在得到的微载体中，用所述方法进行压缩试验。测定此时的负载值(mN)及压缩位移(μm)，制备表示压缩位移(x轴)与负载值(y轴)的关系的压缩位移曲线。求出所得到的压缩位移曲线的拐点，算出该拐点处的负载。需要说明的是，压缩位移曲线在负载700mN以下不具有拐点的情况下，在表中用“-”表示。

(6)微载体的吸水率

将得到的微载体在100℃的烘箱中干燥8小时。称量该微型载体100.0mg，在温度37℃和相对湿度95％RH的环境下放置24小时。测定放置后的微载体的重量，通过下式算出微载体的吸水率。

吸水率(重量％)＝(W₂-W₁)/W₁×100

W₁：放置前的微载体的重量(mg)

W₂：放置后的微载体的重量(mg)

(7)细胞的培养评价(细胞数)

作为培养板，使用12孔板(CORNING公司制，平底无处理)。此外，准备以下的液体培养基和ROCK(Rho结合激酶)特异性抑制剂。

STEMFIT培养基(AJINOMOTO HEALTHY SUPPLY公司制造)

ROCK-Inhibitor(Y27632)

在培养皿中加入3.8×10⁴个成为汇合状态的h-iPS细胞201B7和1mL的0.5mM乙二胺四乙酸/磷酸缓冲溶液，在室温下静置5分钟。除去乙二胺四乙酸/磷酸缓冲溶液后，用1mL液体培养基进行移液，由此得到细胞悬浮液。在放入有所得到的微载体(以表面积换算为60cm²)和4mL的液体培养基的培养板中添加全部所得到的细胞悬浮液。将该培养板设置于振荡机中，在37℃、CO₂浓度5％、46rpm的条件下进行振荡培养。

从振荡培养开始经过3天后，将4ml的上清液的液体培养基更换为4ml的新的液体培养基。从振荡培养开始经过5天后，从培养板中除去4ml的上清液的液体培养基。接着，在培养板中添加TryPLE Express剥离液1.0mL，进行移液操作而悬浮。将悬浮液连同微载体一起添加到细胞粗滤器(pluriStrai ner)中，分离微载体和细胞悬浮液。使用细胞计数器(Chemometec公司制“Nu cleoCounter NC-3000”)求出所得到的细胞悬浮液中所含的细胞数。

<细胞的培养评价的判定基准>

AA：细胞数为1.6×10⁵个以上

A：细胞数为1.2×10⁵个以上且小于1.6×10⁵个

B：细胞数为3.8×10⁴个以上且小于1.2×10⁵个

C：细胞数小于3.8×10⁴个

(8)微载体的破损

用相位差显微镜观察所述“(7)细胞的培养评价”的评价后的微载体，确认微载体是否产生破损。在表中，在观察到产生了破损的微载体的情况下记载为“有”，在未观察到产生了破损的微载体的情况下记载为“无”。此外，在比较例1中，观察到如图2所示的破损了的微载体。

将详细内容和结果示于下述表1、2。

[表1]

[表2]

符号说明

1…细胞培养用微载体

2…基材粒子

3…包覆层

序列表

<110> 积水化学工业株式会社

<120> 细胞培养用微载体和细胞的培养方法

<130> F3236PCT

<150> JP 2021-015724

<151> 2021-02-03

<150> JP 2021-141461

<151> 2021-08-31

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 1

Arg Gly Asp Gly

1

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 2

Arg Gly Asp Ala

1

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 3

Arg Gly Asp Val

1

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 4

Arg Gly Asp Ser

1

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 5

Arg Gly Asp Thr

1

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 6

Arg Gly Asp Phe

1

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 7

Arg Gly Asp Met

1

<210> 8

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 8

Arg Gly Asp Pro

1

<210> 9

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 9

Arg Gly Asp Asn

1

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 10

Tyr Ile Gly Ser Arg

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 11

Pro Asp Ser Gly Arg

1 5

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 12

Arg Glu Asp Val

1

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 13

Ile Asp Ala Pro Ser

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 14

Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞粘附肽

<400> 15

Gly Arg Gly Asp Ser

1 5

Claims

1.一种细胞培养用微载体，其具备：

基材粒子、和

包覆所述基材粒子的外表面的包覆层，

所述细胞培养用微载体的断裂点强度为1000mN以上。

2.根据权利要求1所述的细胞培养用微载体，其中，

进行压缩试验时得到的压缩位移曲线在负载700mN以下不具有拐点。

3.根据权利要求1或2所述的细胞培养用微载体，其吸水率为10重量％以下。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞培养用微载体，其中，

所述包覆层包含合成树脂。

5.根据权利要求4所述的细胞培养用微载体，其中，

所述合成树脂具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞培养用微载体，其中，

所述包覆层包含肽部。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞培养用微载体，其中，

所述基材粒子为树脂粒子。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞培养用微载体，其中，

所述基材粒子包含具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物。

9.根据权利要求8所述的细胞培养用微载体，其中，

所述具有烯键式不饱和基团的单体的聚合物为丙烯酸类树脂、二乙烯基苯聚合物或二乙烯基苯共聚物。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的细胞培养用微载体，其比重为1.0g/cm³以上2.0g/cm³以下。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的细胞培养用微载体，其平均粒径为100μm以上1500μm以下。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的细胞培养用微载体，其粒径的C V值为10％以下。

13.一种细胞的培养方法，其具备：

将细胞粘附至权利要求1～12中任一项所述的细胞培养用微载体的工序。